ES2390789B1 - Method for the selection of neuronal cells based on their differentiation by exposure to flubendiamide. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación, a través del establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de flubendiamida a varios grupos de células neuronales. De aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc, y en terapias antitumorales o neuro-regenerativas.The present invention relates to a method for the selection of neuronal cells in culture based on their differentiation, through the establishment of a dose-response relationship by adding different concentrations of flubendiamide to several groups of neuronal cells. Applicable in those sectors that require the detection, identification and quantification of the population of neuronal cells in differentiation for research and / or therapeutic purposes, such as in research on the effect of factors or substances in the environmental, agri-food, chemical field , pharmacist, etc., and in antitumor or neuro-regenerative therapies.

Description

MÉTODO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS NEURONALES EN FUNCIÓN DE SU DIFERENCIACIÓN MEDIANTE EXPOSICIÓN A FLUBENDIAMIDA METHOD FOR THE SELECTION OF NEURON CELLS IN FUNCTION OF YOUR DIFFERENTIATION BY EXPOSURE A FLUBENDIAMIDE

5 La presente invención se refiere a un método para la selección de células neuronales en función de su nivel de diferenciación. The present invention relates to a method for the selection of neuronal cells based on their level of differentiation.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la The invention is applicable in those sectors that require the detection, identification and quantification of the population of neuronal cells in differentiation for research and / or therapeutic purposes, as for example in the

1 O investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc., y en terapias antitumorales o neuro-regenerativas. 1 Or research on the effect of environmental or agri-food, chemical, pharmaceutical, etc. factors or substances, and on antitumor or neuro-regenerative therapies.

ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE

15 Las células neuronales adultas representan el grado máximo de diferenciación celular. Durante el proceso de diferenciación, adquieren todas las propiedades que, oportunamente integradas, permiten el funcionamiento del sistema nervioso. El proceso de diferenciación neuronal es consecuentemente un momento crítico para el correcto funcionamiento del sistema nervioso y, particularmente en el ser humano, 15 Adult neuronal cells represent the maximum degree of cell differentiation. During the differentiation process, they acquire all the properties that, opportunely integrated, allow the nervous system to function. The process of neuronal differentiation is consequently a critical moment for the proper functioning of the nervous system and, particularly in humans,

20 para el desarrollo de sus facultades mentales. Fallos en la diferenciación neuronal durante el desarrollo embrionario humano conllevan importantes deficits cognitivos en la vida posnatal cuando ésta es posible, y fallos en la diferenciación neuronal de células madres del sistema nervioso central adulto pueden dar lugar a la formación de tumores particularmente agresivos e incapacitantes. 20 for the development of their mental faculties. Failures in neuronal differentiation during human embryonic development lead to significant cognitive deficits in postnatal life when this is possible, and failures in neuronal differentiation of stem cells of the adult central nervous system can lead to the formation of particularly aggressive and disabling tumors.

Existen múltiples técnicas para la selección de células en función de su grado de diferenciación. Cada técnica aprovecha metodologías diferentes (fisicas, biofisicas, químicas, farmacológicas, inmunológicas, etc.) asociadas con peculiares características génicas, bioquímicas, fisiológicas, que pueden satisfacer muchas necesidades experimentales. Sin embargo es laborioso y complejo aislar poblaciones There are multiple techniques for cell selection based on their degree of differentiation. Each technique takes advantage of different methodologies (physical, biophysical, chemical, pharmacological, immunological, etc.) associated with peculiar genetic, biochemical, physiological characteristics that can meet many experimental needs. However, it is laborious and complex to isolate populations

30 de células neuronales durante su desarrollo in vitro ya que se necesitan aparatos 30 neuronal cells during their in vitro development since devices are needed

específicos, tales como un quot;cell-sorterquot;, que no están siempre al alcance de todos los laboratorios, y esto obliga los investigadores de varios grupos a compartir los aparatos disponibles aumentando los problemas técnicos inherentes (limpieza, esterilidad, calibración, etc) y el tiempo necesario para conseguir la población neuronal deseada. specific, such as a `` cell-sorterquot ;, that are not always available to all laboratories, and this forces researchers from several groups to share the available devices by increasing the inherent technical problems (cleaning, sterility, calibration, etc.) and the time needed to achieve the desired neuronal population.

5 Además, esto se obtiene sólo en células neuronales que todavía no se hayan adherido a una superficie de cultivo y no hayan iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico, de tal manera que no es posible aprovechar estos factores en la selección de las células neuronales . 5 In addition, this is only obtained in neuronal cells that have not yet adhered to a culture surface and have not started their morphological, biochemical and physiological development, so that it is not possible to take advantage of these factors in the selection of neuronal cells .

1 O DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 1 OR DESCRIPTION OF THE INVENTION

A los efectos de la presente invención y su descripción, la flubendiamida es 3-iodo-N'-(2-mesil-1, 1-dimetiletil)-N-{ 4-[ 1 ,2,2,2-tetrafluoro-1-(trifluorometil)etil]-o-tolil} ftalimida. For the purposes of the present invention and its description, flubendiamide is 3-iodo-N '- (2-mesyl-1, 1-dimethylethyl) -N- {4- [1, 2,2,2-tetrafluoro-1 - (trifluoromethyl) ethyl] -o-tolyl} phthalimide.

El método objeto de la presente invención se basa en que la exposición a la The method object of the present invention is based on the exposure to

15 flubendiamida de una población de células nerviosas con distinto grado de diferenciación, induce la muerte de las células neuronales menos diferenciadas. Con este método es posible: 1) determinar el número de células nerviosas que consigue una diferenciación más rápida en respuesta a distintos tratamientos físicos, químicos y farmacológicos; 2) obtener cultivos neuronales más homogéneos en sus propiedades 15 flubendiamide from a population of nerve cells with different degrees of differentiation, induces the death of less differentiated neuronal cells. With this method it is possible to: 1) determine the number of nerve cells that achieve a faster differentiation in response to different physical, chemical and pharmacological treatments; 2) obtain more homogeneous neuronal cultures in their properties

20 fisiológicas; 3) reducir la variabilidad de la respuesta celular a la exposición a sustancias de interés fármaco-toxicológico; 4) seleccionar poblaciones neuronales resistentes a la flubendiamida para el estudio de los mecanismos de resistencia con el fin de aprovecharlos terapéuticamente. 20 physiological; 3) reduce the variability of the cellular response to exposure to substances of drug-toxicological interest; 4) select flubendiamide-resistant neuronal populations to study resistance mechanisms in order to take advantage of them therapeutically.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar células 25 neuronales en función de su grado de diferenciación que comprende los siguientes parámetros y etapas: The present invention relates to a method for selecting neuronal cells based on their degree of differentiation comprising the following parameters and steps:

• Parámetros: • Parameters:

1) número de días del cultivo primario. 1) number of days of the primary crop.

2) tiempo de exposición a flubendiamida. 2) exposure time to flubendiamide.

30
30

3) concentraciones de flubendiamida. 3) concentrations of flubendiamide.

• Etapas: • Stages:

a) Establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su primer, 2°, 4°, 6° y 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A', Aquot;; a) Establishment of 5 groups (A, B, C, D, E) of neuronal cells, on their first, 2nd, 4th, 6th and 8th day in culture respectively, where each group must consist of not less than 2 plates of the same crop (A ', Aquot ;;

B' Bquot;· C' Cquot;· D' Dquot;· E' Equot;)B 'Bquot; · C' Cquot; · D 'Dquot; · E' Equot;)

' ' ' ' ' ' ' . '' '' '' '.

b) Establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 ¡..tM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que, siguiendo el esquema indicado en la Tabla I como ejemplo para el grupo A, se obtienen los grupos: A,[0],12, A,[0],24, A,[0],48, A,[0],72, A,[0],96; A,[1],12, A,[1],24, A,[1],48, A,[1],72, A,[1],96 ... etc. hasta E,[20],96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida. b) Establishment of toxicological kinetics by exposure of groups of cells of the same age in culture at the same micromolar concentration of flubendiamide that should vary between O, 1, 2, 5, 10 and 20 ... mt, for 12h, 24h , 48h, 72h and 96h from the moment of the addition of flubendiamide, so that, following the scheme indicated in Table I as an example for group A, the groups are obtained: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. to E, [20], 96, where the number in square brackets indicates the concentration of flubendiamide.

e) Detección de los efectos citotóxicos inducidos por la flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos. e) Detection of the cytotoxic effects induced by flubendiamide in each cell group and quantification of cell viability levels through the use of effective protocols or methods for these purposes.

d) Identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células y al tiempo de exposición en cultivo, para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación. d) Identification of the concentration of flubendiamide that produces the maximum toxic effect in relation to the age of the cells and the time of exposure in culture, for its subsequent use in the selection of neuronal cell populations in cultures destined for research.

e) Interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica.
e) Interruption of flubendiamide treatment in cultures intended for research by washing previously treated cells using a physiological solution.

Tabla 1: Ejemplo, para el grupo A, de organización de grupos en función del tiempo de exposición a la flubendiamida y la concentración de la misma. Table 1: Example, for group A, of group organization based on the time of exposure to flubendiamide and its concentration.

Grupo A Group A

Tiempo de exposición a la flubendiamida (h) Exposure time to flubendiamide (h)

Concentración de flubendiamida (~M) Flubendiamide concentration (~ M)

12 24 48 72 96 12 24 48 72 96

o or

A[0]12 A[0]24 A[0]48 A[0]72 A[0]96 A [0] 12 A [0] 24 A [0] 48 A [0] 72 A [0] 96

1 one

A[1]12 A[1]24 A[1]48 A[1]72 A[1]96 A [1] 12 A [1] 24 A [1] 48 A [1] 72 A [1] 96

2 2

A[2]12 A[2]24 A[2]48 A[2]72 A[2]96 A [2] 12 A [2] 24 A [2] 48 A [2] 72 A [2] 96

5 5

A[5]12 A[5]24 A[5]48 A[5]72 A[5]96 A [5] 12 A [5] 24 A [5] 48 A [5] 72 A [5] 96

10 10

A[10]12 A[10]24 A[10]48 A[10]72 A[10]96 A [10] 12 A [10] 24 A [10] 48 A [10] 72 A [10] 96

20 twenty

A[20]12 A[20]24 A[20]48 A[20]72 A[20]96 A [20] 12 A [20] 24 A [20] 48 A [20] 72 A [20] 96

5 5

En una realización preferida, las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario. En una realización más preferida, las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata. In a preferred embodiment, the neuronal cells are neurons of the central nervous system in primary culture. In a more preferred embodiment, the central nervous system neurons in primary culture are rat cerebellum granular neurons.

1 O 15 1 or 15

En una realización específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase. En una realización más específica. En una realización más específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia. En una realización aún más específica, la detección de los efectos citotóxicos y la cuantificación de los niveles de viabilidad celular se realizan transcurridas 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde la adición de flubendiamida. In a specific embodiment, the detection of cytotoxic effects and quantification of cell viability are performed by observing cell cultures with phase contrast microscopy. In a more specific embodiment. In a more specific embodiment, the detection of cytotoxic effects and quantification of cell viability are performed using vital dyes and epifluorescence microscopy. In an even more specific embodiment, the detection of cytotoxic effects and the quantification of cell viability levels are performed after 12h, 24h, 48h, 72h and 96h since the addition of flubendiamide.

En otra realización específica, la progresión de los efectos del tratamiento con flubendiamida se interrumpe mediante lavado de las células con medio de cultivo. En una realización más específica, el lavado de las células se realiza utilizando medio de cultivo procedente de células no tratadas de la misma edad. In another specific embodiment, the progression of the effects of flubendiamide treatment is interrupted by washing the cells with culture medium. In a more specific embodiment, the washing of the cells is performed using culture medium from untreated cells of the same age.

20 twenty

su La aplicación del presente método para la selección de neuronas en función de diferenciación requiere una inversión mínima ya que la mayor parte de los    its The application of the present method for the selection of neurons as a function of differentiation requires a minimal investment since most of the

laboratorios en la actualidad dispone de instalaciones para cultivos celulares dotadas de: Laboratories currently have facilities for cell cultures equipped with:

-Una campana de flujo laminar. -A laminar flow hood.

-Un incubador de C02. -A C02 incubator.

5 5

-Un microscopio de contraste de fases con epifluorescencia. -A phase contrast microscope with epifluorescence.

1 O 1 o

El procedimiento de la presente invención se sitúa entre las técnicas que se aprovechan del uso de compuestos químicos. Utiliza el compuesto flubendiamida que nunca ha sido utilizado para el fin que aquí se propone, y permite seleccionar poblaciones de células neuronales que hayan ya iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico en un quot;networkquot; in vitro, tras adherirse a la superficie de la placa de cultivo; de suerte que el proceso de selección no altera el patrón de crecimiento y diferenciación general de las neuronas en cultivo. The process of the present invention is among the techniques that take advantage of the use of chemical compounds. It uses the flubendiamide compound that has never been used for the purpose proposed here, and allows to select populations of neuronal cells that have already begun their morphological, biochemical and physiological development in a quot; networkquot; in vitro, after adhering to the surface of the culture plate; so that the selection process does not alter the pattern of growth and general differentiation of neurons in culture.

15 fifteen

Las ventajas de este método se encuentran en: 1) la obtención de una población neuronal seleccionada organizada en cultivo en un quot;networkquot;; 2) la especificidad celular de los efectos, que se detectan en células neuronales; 3) la especificidad cronológica de sus efectos, que se manifiestan particularmente durante el desarrollo neuronal; 4) la progresividad de sus efectos que pueden ser controlados suspendiendo el tratamiento, lo cual permite realizar la selección de una población de células que en su mayoría serán viables. The advantages of this method are found in: 1) obtaining a selected neuronal population organized in culture in a quot; networkquot ;; 2) the cellular specificity of the effects, which are detected in neuronal cells; 3) the chronological specificity of its effects, which are manifested particularly during neuronal development; 4) the progressivity of its effects that can be controlled by suspending the treatment, which allows the selection of a population of cells that are mostly viable.

20 twenty

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores vinculados a: 1) Tecnología bio-sanitaria que precise de la utilización de una población celular en la que se haya eliminado la presencia de células neuronales con un grado de diferenciación inferior. The invention is applicable in those sectors linked to: 1) Bio-sanitary technology that requires the use of a cell population in which the presence of neuronal cells with a lower degree of differentiation has been eliminated.

25 25

2) Tecnología bio-sanitaria que precise de la utilización de una población celular en la que se haya eliminado la presencia de células neuronales en las que se asocie la toxicidad de flubendiamida con un grado de diferenciación inferior. 2) Bio-sanitary technology that requires the use of a cell population in which the presence of neuronal cells in which the toxicity of flubendiamide is associated with a lower degree of differentiation has been eliminated.

3) Control de calidad de la producción industrial de moléculas cuyos efectos farmaco-toxicológicos puedan determinarse en poblaciones celulares seleccionadas por grado de diferenciación. 3) Quality control of the industrial production of molecules whose pharmaco-toxicological effects can be determined in cell populations selected by degree of differentiation.

30 4) Control de la presencia de contaminantes en alimentos y otros productos relacionados con la salud humana y animal en cuya determinación se utilicen
30 4) Control of the presence of contaminants in food and other products related to human and animal health in whose determination they are used

poblaciones celulares seleccionadas por su grado de diferenciación. cell populations selected for their degree of differentiation.

EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE EXPLANATION OF A PREFERRED EMBODIMENT

5 5

Para una mejor comprensión de la presente invención, se expone el siguiente ejemplo de realización preferente, descrito en detalle, que debe entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención. For a better understanding of the present invention, the following preferred embodiment example is described, described in detail, which should be understood without limitation of the scope of the invention.

1O 1O

La preparación de los cultivos de neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario se llevó a cabo mediante el procedimiento previamente establecido que se describe a continuación: The preparation of the cerebellar granular neuron cultures of rat in primary culture was carried out by the previously established procedure described below:

Se prepararon las siguientes soluciones: The following solutions were prepared:

Solución 1 Solution 1

15 fifteen

NaCl 124 mM, KCl 5,37 mM, NaH2P04 1 mM, D-glucosa 14,5 mM, Hepes 25 mM, rojo fenol 27 J.!M, MgS04 1 ,2 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 3 mg/mL. La solución se equilibró a pH 7,4 con NaOH. 124 mM NaCl, 5.37 mM KCl, 1 mM NaH2P04, 14.5 mM D-glucose, 25 mM Hepes, 1.2 mM phenol red, 1.2 mM MgS04, bovine serum albumin (BSA) 3 mg / mL. The solution was equilibrated to pH 7.4 with NaOH.

Solución JI JI solution

Solución I suplementada con 0,25 mg/mL de tripsina. Solution I supplemented with 0.25 mg / mL trypsin.

Solución /JI Solution / JI

20 twenty

Solución I suplementada con 80 J..tg/mL de Desoxirribonucleasa I (DNAsa I), 0,52 mg/mL de inhibidor de tripsina y MgS04 elevado a 2,8 mM. Solution I supplemented with 80 J..tg / mL of Deoxyribonuclease I (DNAse I), 0.52 mg / mL of trypsin inhibitor and MgS04 raised to 2.8 mM.

Solución IV Solution IV

Solución I suplementada con 25,6 J..lg/mL de DNAsa I, 166,4 J..tg/mL de inhibidor de tripsina y MgS04 elevado a 1,7 mM. Solution I supplemented with 25.6 J..lg / mL DNAse I, 166.4 J..tg / mL trypsin inhibitor and MgS04 raised to 1.7 mM.

Solución V Solution V

25 25

Solución I suplementada con O, 1 mM de CaCh y elevada a 2,5 mM de MgS04. Solution I supplemented with O, 1 mM CaCh and raised to 2.5 mM MgS04.

A continuación se extrajeron por disección 8-13 cerebelos procedentes de crías de rata de 8 días de edad y se depositaron en 2 mL de solución l. Con ayuda de unas pinzas, se eliminó la meninge que individualiza el cerebelo de otras partes del cerebro    Then 8-13 cerebellums from 8-day-old rat pups were dissected and deposited in 2 mL of solution l. With the help of tweezers, the meninge that individualizes the cerebellum of other parts of the brain was removed

y lo separa del hueso del cráneo. Los cerebelos se desmenuzaron mediante cortes and separates it from the skull bone. The cerebellums crumbled through cuts

ortogonales con una cuchilla, y los pequeños fragmentos de tejido se resuspendieron orthogonal with a blade, and small tissue fragments were resuspended

en 30 mL de solución I. Tras una centrifugación a baja velocidad, el tejido se in 30 mL of solution I. After low speed centrifugation, the tissue is

resuspendió en 30 mL de solución II y se incubó a 3 7 °C durante 1 O min con agitación resuspended in 30 mL of solution II and incubated at 3-7 ° C for 1 O min with stirring

5 5

con el fin de producir la tripsinización del mismo. La reacción se detuvo añadiendo 15 in order to produce trypsinization thereof. The reaction was stopped by adding 15

mL de la solución IV. La suspensión se agitó ligeramente durante 1 minuto y después mL of solution IV. The suspension was stirred slightly for 1 minute and then

se centrifugó. El precipitado obtenido se resuspendió en 2 mL de solución III. It was centrifuged. The precipitate obtained was resuspended in 2 mL of solution III.

El tejido se sometió entonces a una disgregación mecánica, disociando por The tissue was then subjected to mechanical disintegration, dissociating by

aspiración-expulsión con una pipeta Pasteur, y se añadieron 5 mL de solución V. La aspiration-expulsion with a Pasteur pipette, and 5 mL of solution V was added.

1 O 1 o

suspensión se agitó y se dejó reposar verticalmente durante 5-1 O min con el fin de suspension was stirred and allowed to stand vertically for 5-1 O min in order to

permitir la sedimentación de posibles grumos de células no disociadas. Las células en allow sedimentation of possible lumps of undissociated cells. Cells in

suspensión se recogieron por centrifugación a baja velocidad durante 5 min y el suspension were collected by low speed centrifugation for 5 min and the

precipitado obtenido se resuspendió en medio de cultivo Basal Eagle's Medium precipitate obtained was resuspended in Basal Eagle's Medium culture medium

suplementado con 1 O % de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56 oc durante supplemented with 1 O% fetal calf serum (heat inactivated at 56 oc during

15 fifteen

30 min), 100 J.tg/mL de gentamicina, 2 mM de glutamina y 25 mM de KCL 30 min), 100 J.tg/mL of gentamicin, 2 mM glutamine and 25 mM KCL

Los grumos de células no disociadas se sometieron a un nuevo tratamiento de The lumps of non-dissociated cells underwent a new treatment of

trituración con una pipeta Pasteur, y las células disociadas así obtenidas se añadieron a trituration with a Pasteur pipette, and the dissociated cells thus obtained were added to

las anteriores. Las células se sembraron a una densidad de 2,5 x 105 células/cm2 sobre previous. The cells were seeded at a density of 2.5 x 105 cells / cm2 on

placas Petri de plástico pretratadas con poli-L-lisina (5 J.tg/mL). Los cultivos se Plastic Petri dishes pretreated with poly-L-lysine (5 J.tg/mL). The crops are

20 twenty

incubaron a 3 7 oc, en una atmósfera de C02 al 5 % y una humedad del 95 %.Tras este incubated at 3-7 oc, in an atmosphere of 5% CO2 and a humidity of 95%.

proceso se obtuvieron 10-12 placas de cultivo de 35 mm de diámetro por cerebelo, y process were obtained 10-12 culture plates 35 mm in diameter per cerebellum, and

la preparación se llevó a cabo en aproximadamente 3 h. La utilización de placas de The preparation was carried out in approximately 3 h. The use of plates

menor diámetro permitió aumentar considerablemente el rendimiento sin perjudicar la smaller diameter allowed to significantly increase the performance without damaging the

sensibilidad del método. sensitivity of the method

25 25

Con objeto de impedir la replicación de las células no neuronales se añadió, al In order to prevent the replication of non-neuronal cells was added, when

cabo de 20-24 h, un agente citostático (arabinofuranósido de citosina, 10 J.!M). Las after 20-24 h, a cytostatic agent (cytosine arabinofuranoside, 10 J.! M). The

células pudieron mantenerse varias semanas en cultivo añadiendo periódicamente cells were able to maintain several weeks in culture by periodically adding

glucosa (5,6 mM) al medio de cultivo y reponiendo la pérdida de agua debida a la glucose (5.6 mM) to the culture medium and replenishing the loss of water due to the

evaporación. Después de ocho días en cultivo, más del 95 % de la población neuronal evaporation. After eight days in culture, more than 95% of the neuronal population

30 30

pudo ser identificada morfológicamente como perteneciente al tipo de neurona could be morphologically identified as belonging to the type of neuron

granular, siendo el 5 % restante neuronas GABAérgicas fundamentalmente. La    granular, with the remaining 5% being GABAergic neurons primarily. The

proporción de astrocitos no superó el 3 %. Astrocyte ratio did not exceed 3%.

5 5

Se establece una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 J.!M, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que indicando con las letras A, B, C, D, E los grupos de células de distinta edad en cultivo y siguiendo el esquema indicado en la Tabla I, se obtienen los grupos: A,[0],12, A,[0],24, A,[0],48, A,[0],72, A,[0],96; A,[1],12, A,[1],24, A,[1],48, A,[1],72, A,[1],96 ... etc. hasta E,[20],96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida. Los Toxicological kinetics is established by exposure of groups of cells of the same age in culture at the same micromolar concentration of flubendiamide that should vary between O, 1, 2, 5, 10 and 20 J.! M, for 12h, 24h, 48h , 72h and 96h from the moment of the addition of flubendiamide, so that by indicating with the letters A, B, C, D, E the groups of cells of different ages in culture and following the scheme indicated in Table I, the groups obtain: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. to E, [20], 96, where the number in square brackets indicates the concentration of flubendiamide. The

1O 1O

tratamientos fueron añadidos al medio de cultivo y las neuronas fueron mantenidas en el incubador en las condiciones ya descritas. treatments were added to the culture medium and the neurons were maintained in the incubator under the conditions already described.

La cuantificación de la supervivencia neuronal siguiente protocolo: Quantification of neuronal survival following protocol:

se llevó a cabo usando el be I wear to out using the

-Se aspiró el medio de cultivo. -The culture medium was aspirated.

15 fifteen

-Se adicionó 1 mL de la solución de Locke modificada (NaC1130 mM, CaC12 2.3 mM, KC15.6 mM, MgC12 1 mM, Hepes 8.4 mM, glucosa 5.6 mM, pH 7.4. - 1 mL of the modified Locke solution (NaC1130 mM, CaC12 2.3 mM, KC15.6 mM, MgC12 1 mM, Hepes 8.4 mM, glucose 5.6 mM, pH 7.4 was added.

-Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de la misma solución. -I aspirated and added 1 mL of the same solution again.

-Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de solución Locke modificada que contiene 150 J.lg/mL de diacetato de fluoresceína. - 1 mL of modified Locke solution containing 150 J.lg / mL of fluorescein diacetate was aspirated and added again.

-Se incubó 4 mina 37°C. -4 mine 37 ° C was incubated.

20 twenty

-Se visualizó en un microscopio de epifluorescencia. -It was visualized in an epifluorescence microscope.

25 25

Mediante esta técnica, las células vivas aparecieron perfectamente teñidas con el colorante fluorescente, y morfológicamente identificables, mientras que los núcleos de las células muertas se visualizaron como puntos rojos. Se fotografiaron al azar varios campos representativos del cultivo y se procedió al recuento tanto de las células vivas (de color verde), como de las muertas (de color rojo), calculando finalmente el porcentaje de supervivencia neuronal al dividir el número de neuronas vivas entre el número total de neuronas (vivas y muertas) en cada fotografia. Se evidenció la disminución de la mortalidad neuronal tras tratamiento con flubendiamida al aumentar By this technique, living cells appeared perfectly stained with the fluorescent dye, and morphologically identifiable, while the dead cell nuclei were visualized as red dots. Several representative fields of the culture were photographed at random and both live (green) and dead (red) cells were counted, finally calculating the percentage of neuronal survival by dividing the number of living neurons by the total number of neurons (live and dead) in each photograph. The decrease in neuronal mortality after treatment with flubendiamide was evidenced by increasing

la edad en cultivo.    The crop age.

Claims (5)

REIVINDICACIONES l. Procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación, que comprende las siguientes etapas: l. Procedure for the selection of neuronal cells in culture based on their differentiation, which comprises the following stages: a) establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su 1 er, 2°, 4°, 6°, 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A' Aquot;· B' Bquot;· C' Cquot;· D' Dquot;· E'a) establishment of 5 groups (A, B, C, D, E) of neuronal cells, on their 1st, 2nd, 4th, 6th, 8th day in culture respectively, where each group must consist of not less of 2 plates of the same crop (A 'Aquot; · B' Bquot; · C 'Cquot; · D' Dquot; · E ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '' '' '' '' ' Equot;); Equot;); b) establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 J..LM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que se obtienen los grupos: A,[0],12, A,[0],24, A,[0],48, A,[0],72, A,[0],96; A,[1],12, A,[1],24, A,[1],48, A,[1],72, A,[1],96 ... etc. hasta E,[20],96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida. b) establishment of toxicological kinetics by exposure of groups of cells of the same age in culture at the same micromolar concentration of flubendiamide that should vary between O, 1, 2, 5, 10 and 20 J..LM, for 12h, 24h , 48h, 72h and 96h from the moment of the addition of flubendiamide, so that the groups are obtained: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. to E, [20], 96, where the number in square brackets indicates the concentration of flubendiamide. e) detección de los efectos citotóxicos inducidos por flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos; e) detection of the cytotoxic effects induced by flubendiamide in each cell group and quantification of cell viability levels through the use of effective protocols or methods for these purposes; d) identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células en cultivo y al tiempo de exposición para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación; d) identification of the concentration of flubendiamide that produces the maximum toxic effect in relation to the age of the cells in culture and the time of exposure for later use in the selection of neuronal cell populations in cultures intended for research; e) interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica. e) discontinuation of flubendiamide treatment in cultures intended for research by washing previously treated cells using a physiological solution.

2. 2.

Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario. Method according to claim 1, characterized in that the neuronal cells are neurons of the central nervous system in primary culture.

3. 3.

Procedimiento, según reivindicación 2, caracterizado por que las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata. Method according to claim 2, characterized in that the neurons of the central nervous system in primary culture are granular neurons of rat cerebellum.

4. Four.

Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase. Method according to claim 1, characterized in that the detection of cytotoxic effects and quantification of cell viability are performed by observing cell cultures with phase contrast microscopy.

5 5. Procedimiento, según reivindicación 4, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia. Method according to claim 4, characterized in that the detection of cytotoxic effects and quantification of cell viability are performed using vital dyes and epifluorescence microscopy. 6. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que el lavado de las 6. Method according to claim 1, characterized in that the washing of the
células se realiza utilizando medio de cultivo procedente de células no tratadas 1 O de la misma edad.
cells are made using culture medium from untreated 1 O cells of the same age.