ES2390276T3

ES2390276T3 - Modified viral vector particles

Info

Publication number: ES2390276T3
Application number: ES05738378T
Authority: ES
Inventors: Stefan Kochanek; Florian Kreppel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-05-03
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2012-11-08
Anticipated expiration: 2025-05-02
Also published as: DE102004021584A1

Abstract

Procedimiento para la generación de una partícula de un vector adenovírico, que comprende las etapas:a) generación de una partícula de un vector adenovírico en líneas celulares de empaquetamiento quecomprenden proteínas de la cápside, comprendiendo dichas proteínas de la cápside un sitio de fijación parala modificación específica de la partícula del vector adenovírico, comprendiendo dicho sitio de fijación almenos un residuo de cisteína que está ubicado en un dominio expuesto al disolvente de dicha proteína de lacápside;b) lisado de las células de empaquetamiento y la subsiguiente purificación de dichas partículas de vectoresadenovíricos en tampones con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exentos de cationes metálicos divalentes, en elque dicho tampón es(i) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2, o(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósferade Ar, He, N2 o CO2;c) poner en contacto los compañeros de acoplamiento con dichas partículas de vectores adenovíricos yrealizar una reacción de acoplamiento de los compañeros de acoplamiento a los residuos de cisteína a travésde enlaces tioéter, disulfuro o tioéster mediante la adición de reactivos alquilantes que comprenden gruposmaleimida, grupos ditiopiridilo o grupos yodoacetilo en un tampón con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exento decationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es(i) un tampón que comprende reactivos reductores, o(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósferade Ar, He, N2 o CO2.Method for the generation of a particle of an adenoviral vector, comprising the steps: a) generation of a particle of an adenovirus vector in packaging cell lines comprising capsid proteins, said capsid proteins comprising a fixation site for modification specific for the adenoviral vector particle, said fixation site comprising at least one cysteine residue that is located in a domain exposed to the solvent of said lapside protein; b) lysate of the packaging cells and the subsequent purification of said adenoviral vector particles in buffers with a pH from 5.0 to 9.0 and free of divalent metal cations, in which said buffer is (i) a buffer with little or no oxygen in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2, or ( ii) a buffer with little or no oxygen supplemented with reducing reagents in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2; c) p contacting the coupling partners with said adenoviral vector particles and carrying out a coupling reaction of the coupling partners to the cysteine residues through thioether, disulfide or thioester bonds by the addition of alkylating reagents comprising maleimide groups, dithiopyridyl groups or groups iodoacetyl in a buffer with a pH from 5.0 to 9.0 and free of divalent metal decations, wherein said buffer is (i) a buffer comprising reducing reagents, or (ii) a buffer with low oxygen or no supplemented oxygen with reducing reagents in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2.

Description

Partículas modificadas de vectores víricos Modified viral vector particles

La presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de partículas de vectores adenovíricos que comprende las etapas enumeradas en la reivindicación 1. Adicionalmente, la invención se refiere a partículas de vectores adenovíricos según se define en la reivindicación 6. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de estas partículas de vectores adenovíricos como un medio terapéutico o diagnóstico. The present invention relates to a process for the generation of adenoviral vector particles comprising the steps listed in claim 1. Additionally, the invention relates to adenoviral vector particles as defined in claim 6. Additionally, the invention is refers to the use of these adenoviral vector particles as a therapeutic or diagnostic means.

Las partículas de vectores víricos tales como vectores adenovíricos de transferencia génica se usan in vitro e in vivo con objeto de transferir genes a células vivas con propósitos terapéuticos (terapia génica), con propósitos de vacunación y para estudios funcionales. Las partículas de vectores adenovíricos pueden producirse con altos títulos, su genoma es altamente estable y tienen la capacidad de transducir células proliferativas en reposo. Se pueden distinguir entre diferentes tipos de partículas de vectores adenovíricos: por ejemplo, están las denominadas partículas de vectores de primera generación (las funciones de E1 están delecionadas), las partículas de vectores de segunda generación (deleción adicional de las funciones de E2 y/o E4), partículas de vectores de alta capacidad (deleción de la mayoría o de todos los genes víricos). Además, también hay partículas de vectores adenovíricos de replicación competente (habitualmente denominados adenovirus oncolíticos), que se usan por ejemplo en la terapia tumoral. Adicionalmente también hay partículas de vectores de adenovirus quiméricos, en los que se han combinado las cápsides de diferentes serotipos. Un ejemplo es la sustitución de la proteína de fibra 5 del serotipo natural por una proteína de fibra derivada de un serotipo diferente, tal como por ejemplo, el serotipo 17 o el serotipo 9. Viral vector particles such as adenoviral gene transfer vectors are used in vitro and in vivo in order to transfer genes to living cells for therapeutic purposes (gene therapy), for vaccination purposes and for functional studies. Adenoviral vector particles can be produced with high titers, their genome is highly stable and they have the ability to transduce resting proliferative cells. Different types of adenoviral vector particles can be distinguished: for example, there are so-called first generation vector particles (the functions of E1 are deleted), the second generation vector particles (additional deletion of the functions of E2 and / or E4), high capacity vector particles (deletion of most or all viral genes). In addition, there are also competent replication adenoviral vector particles (usually referred to as oncolytic adenoviruses), which are used for example in tumor therapy. Additionally there are also chimeric adenovirus vector particles, in which the capsids of different serotypes have been combined. An example is the replacement of the fiber protein 5 of the natural serotype with a fiber protein derived from a different serotype, such as, for example, serotype 17 or serotype 9.

Se han encontrado adenovirus en numerosas especies. Se conocen más de 50 serotipos humanos diferentes, por ejemplo, Ad12 (Subgénero A), Ad3 y Ad7 (Subgénero B), Ad2 y Ad5 (Subgénero C), Ad8 (Subgénero D), Ad4 (Subgénero E), Ad40 (Subgénero F) (Wigand, 1986). Aparte de detectarse en seres humanos, también se han encontrado adenovirus en la mayoría de los vertebrados incluyendo chimpancés, ganado, cerdos, ratones y pollos. La mayoría de las partículas de vectores usadas actualmente para la transferencia génica se basan en adenovirus del tipo 5 (Ad5), aunque numerosos laboratorios también están trabajando en el desarrollo de partículas de vectores que o bien se basan en un serotipo diferente de un patógeno humano o bien son aisladas a partir de chimpancés, ganado u otras especies. Adenoviruses have been found in numerous species. More than 50 different human serotypes are known, for example, Ad12 (Subgenus A), Ad3 and Ad7 (Subgenus B), Ad2 and Ad5 (Subgenus C), Ad8 (Subgenus D), Ad4 (Subgenus E), Ad40 (Subgenus F ) (Wigand, 1986). Apart from being detected in humans, adenoviruses have also been found in most vertebrates including chimpanzees, cattle, pigs, mice and chickens. Most of the vector particles currently used for gene transfer are based on adenovirus type 5 (Ad5), although numerous laboratories are also working on the development of vector particles that are either based on a different serotype of a human pathogen or they are isolated from chimpanzees, cattle or other species.

La transducción de las células por parte de las partículas de vectores de Ad5 tiene lugar a través de al menos dos receptores. Inicialmente, las partículas del vector se unen al dominio Knob de la proteína de fibra de la cápside del receptor de Coxsackie y de Adenovirus (CAR). Esta interacción induce modificaciones estructurales menores en la partícula del vector que permiten una interacción entre la proteína de la base pentona de las partículas del vector con las integrinas de la superficie celular. Finalmente, hay una captación mediada por integrina de las partículas del vector en la célula a través de una endocitosis mediada por receptor. Durante la captación de las partículas del vector, en el endosoma temprano tiene lugar un desensamblaje regulado y gradual de las partículas del vector mediante una participación sustancial de la proteasa de cisteína vírica p23, y que se completa después de abandonar el endosoma temprano y durante la entrada al núcleo. Este proceso depende del estado redox de la proteasa de cisteína p23. De este modo el ADN es transportado a los poros nucleares, siendo liberado de los remanentes de cápsides y finalmente translocado al núcleo en la última etapa del proceso de transducción. The transduction of the cells by the Ad5 vector particles takes place through at least two receptors. Initially, the vector particles bind to the Knob domain of the Coxsackie and Adenovirus receptor capsid fiber protein (CAR). This interaction induces minor structural modifications in the vector particle that allow an interaction between the pentone base protein of the vector particles with the cell surface integrins. Finally, there is an integrin-mediated uptake of the vector particles in the cell through a receptor-mediated endocytosis. During the uptake of the particles of the vector, in the early endosome a gradual and gradual disassembly of the particles of the vector takes place through a substantial participation of the viral cysteine protease p23, which is completed after leaving the endosome early and during the core entry. This process depends on the redox state of the p23 cysteine protease. In this way the DNA is transported to the nuclear pores, being released from the capsid remnants and finally translocated to the nucleus in the last stage of the transduction process.

Una de las limitaciones de las partículas de vectores adenovíricos para la transferencia génica es que muchos tejidos que representan un posible objetivo para la transferencia génica terapéutica con partículas de vectores adenovíricos no expresan el receptor CAR ni/o las integrinas necesarias. Las partículas de vectores adenovíricos transducen mal dichos tejidos incluso cuando se aplican a dosis altas. Por lo tanto, no es posible la transferencia génica terapéutica. Como ejemplos, pueden mencionarse aquí las células del sistema hematopoyético, la mayoría de los tipos de células tumorales, células neuronales, células musculares y células endoteliales. Además, el uso de vectores adenovíricos derivados de adenovirus aislados a partir de especies distintas a la que se va a tratar con el vector podría verse dificultada debido a las bajas eficacias de transducción. One of the limitations of adenoviral vector particles for gene transfer is that many tissues that represent a possible target for therapeutic gene transfer with adenoviral vector particles do not express the CAR receptor or / or the necessary integrins. Adenoviral vector particles transduce these tissues poorly even when applied at high doses. Therefore, therapeutic gene transfer is not possible. As examples, the cells of the hematopoietic system, most types of tumor cells, neuronal cells, muscle cells and endothelial cells can be mentioned here. In addition, the use of adenoviral vectors derived from adenoviruses isolated from species other than the one to be treated with the vector could be hampered due to the low transduction efficiencies.

Una limitación adicional de las partículas de vectores adenovíricos para la transferencia génica se hace apreciable después de la administración sistémica de las partículas del vector en el torrente sanguíneo. Por un lado hay interacciones con componentes sanguíneos celulares y no celulares tales como eritrocitos, plaquetas, el complemento o anticuerpos que son capaces de neutralizar las partículas víricas o que son responsables de reacciones tóxicas, y por otro lado también hay una captación mediada por CAR-/integrinas en los tejidos que no son el objetivo pretendido de aplicación de la partícula del vector. Igualmente limitantes son las interacciones de las partículas del vector con los componentes celulares del sistema inmunitario tales como las células de Kupffer, que pueden dar lugar a una neutralización de las partículas del vector y pueden inducir efectos secundarios indeseables. An additional limitation of adenoviral vector particles for gene transfer becomes noticeable after systemic administration of the vector particles in the bloodstream. On the one hand there are interactions with cellular and non-cellular blood components such as erythrocytes, platelets, complement or antibodies that are capable of neutralizing viral particles or that are responsible for toxic reactions, and on the other hand there is also a CAR-mediated uptake. / integrins in tissues that are not the intended purpose of applying the vector particle. Equally limiting are the interactions of vector particles with cellular components of the immune system such as Kupffer cells, which can result in neutralization of vector particles and can induce undesirable side effects.

El estándar de conocimiento actual incluye dos estrategias diferentes mediante las cuales se puede intentar modificar el tropismo de las partículas del vector vírico o se pueden evitar las interacciones indeseables de las partículas del vector vírico con, por ejemplo, anticuerpos. The current knowledge standard includes two different strategies by which one can attempt to modify the tropism of the viral vector particles or undesirable interactions of the viral vector particles with, for example, antibodies can be avoided.

La primera estrategia, denominada subsiguientemente como "estrategia genética", consiste en una modificación genética definida de las áreas expuestas al disolvente de varias proteínas de la cápside (por ejemplo, fibra, proteína IX, Hexona). Aquí se intenta mejorar la transferencia génica en las células objetivo mediante la inserción genética de ligandos peptídicos en, por ejemplo, el dominio Knob de la proteína de fibra del Ad5 (Dmitriev, 1998). Esta estrategia genética presenta muchos inconvenientes concretos: (i) existe una significativa limitación con respecto al tamaño de los ligandos que se van a usar, ya que los ligandos grandes interfieren con el correcto plegamiento de las proteínas de la cápside modificadas. (ii) No es posible predecir si es posible la producción de las partículas del vector incluso después de la inserción genética de ligandos pequeños, debido a que el correcto plegamiento proteico puede verse alterado. Además, la estructura y la función biológica de los ligandos peptídicos en el contexto de las proteínas de la cápside del vector no son predecibles, y los ligandos peptídicos pequeños habitualmente sólo muestran una afinidad limitada por el receptor objetivo sobre la superficie de las células objetivo. (iii) Las sustanciales modificaciones genéticas, necesarias para una modificación exitosa del tropismo de las partículas del vector adenovíricos, dan lugar a un menor rendimiento en la producción de la partícula del vector. (iv) Para la producción de partículas de vectores modificadas genéticamente con un nuevo tropismo, especialmente cuando las mutaciones adicionales eliminan la interacción con el CAR, es necesario generar una nueva producción de línea celular para cada ligando. Esto es un obstáculo considerable e inhibe el eficiente cribado de los ligandos potenciales. (v) Todos los procedimientos genéticos están limitados por naturaleza a ligandos proteicos/peptídicos para la modificación del tropismo. Los péptidos que contienen aminoácidos no naturales no pueden aplicarse. Además, no pueden aplicarse otras sustancias distintas a las proteínas, por ejemplo, esteroides, otros compuestos aromáticos o carbohidratos y otros. The first strategy, subsequently referred to as "genetic strategy", consists of a definite genetic modification of the areas exposed to the solvent of several capsid proteins (for example, fiber, protein IX, Hexone). Here, attempts are made to improve gene transfer in target cells by genetic insertion of peptide ligands in, for example, the Knob domain of the Ad5 fiber protein (Dmitriev, 1998). This genetic strategy has many specific drawbacks: (i) there is a significant limitation with respect to the size of the ligands to be used, since large ligands interfere with the correct folding of the modified capsid proteins. (ii) It is not possible to predict whether the production of vector particles is possible even after the genetic insertion of small ligands, because the correct protein folding can be altered. In addition, the structure and biological function of peptide ligands in the context of vector capsid proteins are not predictable, and small peptide ligands usually only show limited affinity for the target receptor on the surface of the target cells. (iii) The substantial genetic modifications, necessary for a successful modification of the tropism of the adenoviral vector particles, lead to a lower yield in the production of the vector particle. (iv) For the production of genetically modified vector particles with a new tropism, especially when additional mutations eliminate interaction with CAR, it is necessary to generate a new cell line production for each ligand. This is a considerable obstacle and inhibits the efficient screening of potential ligands. (v) All genetic procedures are limited by nature to protein / peptide ligands for tropism modification. Peptides containing unnatural amino acids cannot be applied. In addition, other substances than proteins cannot be applied, for example, steroids, other aromatic compounds or carbohydrates and others.

Una segunda estrategia, denominada subsiguientemente como "estrategia química", consiste en modificaciones químicas inespecíficas de todas las proteínas de la cápside expuestas al disolvente de la partícula del vector. Aquí se usan reacciones químicas con objeto de acoplar ligandos a grupos amino primarios naturales de la superficie de las partículas del vector. Este procedimiento modifica inespecíficamente todas las proteínas de la cápside y se lleva a cabo en condiciones oxidativas a un pH fisiológico o ligeramente superior (7,4-8,5). (Documento EP0694071B1 y Fisher, 2001). Las limitaciones de la estrategia química son: (i) las reacciones químicas con grupos éster activados para formar enlaces amida o con aldehídos para generar bases de Schiff que se usaron hasta ahora, se dirigen a grupos amino de la superficie de todas las proteínas de la cápside. Las proteínas individuales de la cápside pueden por lo tanto no ser modificadas específicamente. (ii) Debido a la ausencia de especificidad de ciertas proteínas de la cápside, la mayoría de los ligandos muestran una significativa reticulación con las proteínas de la cápside durante el acoplamiento. Consecuentemente, lo natural y para una transferencia génica eficiente necesariamente el desensamblaje de las partículas del vector puede verse gravemente deteriorado tras la captación celular de las partículas modificadas del vector. (iii) El acoplamiento químico de ligandos por ésteres activados en grupos amino primarios de la superficie de la cápside con la formación de enlaces amida estables comediante grupos aldehído con la formación de bases de Schiff no es reversible en condiciones biológicas. Mediante esto, la partícula del vector endosmolítico funciona, es decir, funciona para el escape endosómico después de la endocitosis mediada por receptor puede ser inhibida, y puede dar lugar a una baja eficacia en la transferencia génica. A second strategy, subsequently referred to as "chemical strategy", consists of nonspecific chemical modifications of all capsid proteins exposed to the solvent of the vector particle. Here chemical reactions are used in order to couple ligands to natural primary amino groups of the surface of the particles of the vector. This procedure unspecifically modifies all capsid proteins and is carried out under oxidative conditions at a physiological pH or slightly higher (7.4-8.5). (Document EP0694071B1 and Fisher, 2001). The limitations of the chemical strategy are: (i) chemical reactions with activated ester groups to form amide bonds or with aldehydes to generate Schiff bases that were used so far, are directed to surface amino groups of all the proteins in the capsid The individual proteins of the capsid may therefore not be specifically modified. (ii) Due to the absence of specificity of certain capsid proteins, most ligands show significant cross-linking with the capsid proteins during coupling. Consequently, the natural and for efficient gene transfer necessarily the disassembly of the particles of the vector can be severely deteriorated after the cellular uptake of the modified particles of the vector. (iii) The chemical coupling of ligands by esters activated in primary amino groups of the capsid surface with the formation of stable amide bonds by aldehyde groups with the formation of Schiff bases is not reversible under biological conditions. By this, the particle of the endosmolytic vector works, that is, it works for endosomal escape after receptor-mediated endocytosis can be inhibited, and can lead to low efficiency in gene transfer.

El uso de residuos de cisteína para un acoplamiento específico de tiol es un procedimiento que se está usando en varias aplicaciones. Por ejemplo, Stubenrauch y col. publicaron un artículo que describe el acoplamiento de anticuerpos recombinantes a partículas pseudovíricas de polioma (VLP) con la ayuda de un residuo de cisteína como sitio de unión (Stubenrauch, 2001). Un ejemplo adicional del uso de residuos de cisteína para la formación de enlaces covalentes es el documento US 2003-219459 A1, que también describe un procedimiento para el acoplamiento de proteínas recombinantes a VLPs, mediante el cual el sitio de unión en la VLP no es un residuo de cisteína, sino que el compañero de acoplamiento porta un residuo de cisteína para la unión a la VLP. Importantemente, por oposición a las partículas de vectores víricos según se describen en este documento, las VLPs son partículas elaboradas sintéticamente y se ensamblan in vitro, es decir, fuera de las células vivas y su ensamblaje es totalmente independiente de elementos celulares tales como factores de transcripción o sistemas de chaperona y totalmente independientes de procesos celulares tales como la replicación del ADN. Por lo tanto, no son capaces, por ejemplo, de infecciones productivas, lo que significa que no son capaces de replicarse y multiplicarse en ciertas condiciones. The use of cysteine residues for a specific thiol coupling is a procedure that is being used in several applications. For example, Stubenrauch et al. They published an article describing the coupling of recombinant antibodies to polysexual pseudoviral particles (VLP) with the help of a cysteine residue as a binding site (Stubenrauch, 2001). A further example of the use of cysteine residues for the formation of covalent bonds is US 2003-219459 A1, which also describes a procedure for coupling recombinant proteins to VLPs, whereby the binding site in the VLP is not a cysteine residue, but the coupling partner carries a cysteine residue for binding to the VLP. Importantly, as opposed to viral vector particles as described herein, VLPs are synthetically made particles and are assembled in vitro, that is, outside living cells and their assembly is completely independent of cellular elements such as cell factors. transcription or chaperone systems and totally independent of cellular processes such as DNA replication. Therefore, they are not capable, for example, of productive infections, which means that they are not able to replicate and multiply under certain conditions.

Recientemente, Wang y col. describieron mutantes del virus del mosaico de Cowpea (CPMV) que portan residuos de cisteína expuestos al disolvente modificados genéticamente en la superficie de la cápside (Wang, 2002). Estos mutantes sólo se produjeron con objeto de proporcionar bloques de construcción supramoleculares para la síntesis química. La producción del virus vegetal mutante sólo se consiguió bajo una rigurosa observación de las condiciones reductoras. Una desviación de estas condiciones condujo a una agregación y precipitación irreversibles mediante la formación de puentes de disulfuro interparticulares. Las partículas de estos virus mutantes simplemente servían como un elemento para la síntesis química, y las funciones biológicas no se analizaron. Recently, Wang et al. described cowpea mosaic virus (CPMV) mutants bearing cysteine residues exposed to the genetically modified solvent on the capsid surface (Wang, 2002). These mutants were only produced in order to provide supramolecular building blocks for chemical synthesis. The production of the mutant plant virus was only achieved under a rigorous observation of the reducing conditions. A deviation from these conditions led to irreversible aggregation and precipitation through the formation of interparticular disulfide bridges. The particles of these mutant viruses simply served as an element for chemical synthesis, and the biological functions were not analyzed.

Tras la aplicación de reactivos reductores y reactivos alquilantes sobre partículas del virus Ad5 no sólo se modificarán los tioles introducidos genéticamente expuestos al disolvente, sino también la proteasa de cisteína vírica p23 del adenovirus (Greber, 1996). Greber y col. mostraron que, para el serotipo 2 de adenovirus natural, después de la reducción de partículas víricas con ditíotreitol (DTT) y la subsiguiente alquilación/esterificación específica de tiol mediante diversos reactivos tales como N-etilmaleimida (NEM) o yodoacetamida (IAA), la proteasa de cisteína vírica p23 se convirtió en su forma reducida activa y subsiguientemente se alquiló. Además, Greber y col. demostraron que la proteasa que ha sido alquilada/esterificada de este modo era inactiva, y como consecuencia el adecuado desensamblaje de las cápsides después de la entrada en las células objetivo estaba dificultado de tal forma que el ADN vírico no podía translocarse al núcleo. Greber y col. demostraron que la infectividad de la partícula se había reducido en 20 veces alquilando p23, por oposición a las partículas de control no tratadas. Además, Greber y col. demostraron un alquilación significativa pero inespecífica de las proteínas de la cápside que contienen cisteína Hexona, base Pentona y fibra, así como de la proteína del núcleo pV con NBM tras una reducción con DTT. Además, Jömvall y Philipson describieron un residuo de cisteína reactivo en una región accesible al disolvente de la proteína de la cápside Hexona que podía ser alquilada mediante reactivos basados en maleimida (Jörnvall, 1980). After the application of reducing reagents and alkylating reagents on particles of the Ad5 virus, not only the thiols introduced genetically exposed to the solvent will be modified, but also the viral cysteine protease p23 of the adenovirus (Greber, 1996). Greber et al. showed that, for serotype 2 of natural adenovirus, after the reduction of viral particles with dithiotreitol (DTT) and the subsequent specific alkylation / esterification of thiol by various reagents such as N-ethylmaleimide (NEM) or iodoacetamide (IAA), Viral cysteine protease p23 became its active reduced form and subsequently was rented. In addition, Greber et al. they demonstrated that the protease that has been rented / esterified in this way was inactive, and as a consequence the adequate disassembly of the capsids after entry into the target cells was hindered so that the viral DNA could not be translocated to the nucleus. Greber et al. showed that the infectivity of the particle had been reduced by 20 times by renting p23, as opposed to untreated control particles. In addition, Greber et al. demonstrated a significant but nonspecific alkylation of the capsid proteins containing cysteine Hexone, Pentona base and fiber, as well as of the pV core protein with NBM after a reduction with DTT. In addition, Jömvall and Philipson described a reactive cysteine residue in a solvent-accessible region of the Hexone capsid protein that could be rented by maleimide-based reagents (Jörnvall, 1980).

El objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento mediante el cual las partículas de vectores adenovíricos pueden ser modificadas químicamente específicamente de una forma tal que se mantengan sus funciones biológicas naturales mediadas por las proteínas de la cápside y del núcleo, sólo pueden alterarse las funciones de unión al receptor y/o de fusión a la membrana. Un objetivo adicional de esta invención es proporcionar partículas de vectores adenovíricos que fueron producidas con este procedimiento. The objective of this invention is to provide a method by which adenoviral vector particles can be chemically modified specifically in such a way that their natural biological functions mediated by the capsid and core proteins are maintained, only the functions of receptor binding and / or membrane fusion. A further objective of this invention is to provide adenoviral vector particles that were produced with this procedure.

La presente invención se refiere a partículas de vectores adenovíricos que comprenden proteínas de la cápside que comprenden un sitio de fijación para la modificación química específica de dichas partículas de vectores, comprendiendo dicho sitio de unión al menos un residuo de cisteína introducido genéticamente que no existe de forma natural en las proteínas de la cápside. Dichas partículas de vector comprenden adicionalmente un compañero de acoplamiento acoplado a dicho sitio de fijación. Dicho sitio de unión puede ser un residuo de cisteína que exista de forma natural en una proteína de la cápside. Las partículas del vector vírico pueden comprender uno o más compañeros de acoplamiento diferentes. Uno de dichos compañeros de acoplamiento puede tener uno o más sitios de fijación. The present invention relates to adenoviral vector particles comprising capsid proteins that comprise a binding site for the specific chemical modification of said vector particles, said binding site comprising at least one genetically introduced cysteine residue that does not exist. natural form in the proteins of the capsid. Said vector particles further comprise a coupling partner coupled to said fixation site. Said binding site may be a cysteine residue that exists naturally in a capsid protein. The viral vector particles may comprise one or more different coupling partners. One of said coupling partners may have one or more fixing sites.

El (los) compañero(s) de acoplamiento está(n) acoplado(s) en dicho sitio de fijación a través de un enlace de disulfuro, tioéster y/o tioéter. El (los) compañero(s) de acoplamiento pueden ser ligandos específicos celulares, polímeros, especialmente derivados de PEG o derivados de HPMA, partículas de nanooro, pigmentos fluorescentes, sustancias magnéticas o sustancias bioquímicamente/catalíticamente activas. The coupling partner (s) is coupled to said fixation site through a disulfide, thioester and / or thioether bond. The coupling partner (s) may be cell-specific ligands, polymers, especially PEG derivatives or HPMA derivatives, nanooro particles, fluorescent pigments, magnetic substances or biochemically / catalytically active substances.

La invención se refiere adicionalmente a partículas de vectores adenovíricos, en las que el sitio de unión tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó más residuos de cisteína, y en las que dos o más residuos de cisteína son consecutivos o están separados por 1, 2, 3 o más residuos de aminoácidos que son diferentes a la cisteína. Los sitios de unión comprenden preferiblemente los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2 o la ID. SEC. Nº: 3. The invention further relates to adenoviral vector particles, in which the binding site has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more cysteine residues, and in which two or more cysteine residues are consecutive or are separated by 1, 2, 3 or more amino acid residues that are different from cysteine. The binding sites preferably comprise amino acids according to the ID. SEC. Nº: 1, the ID. SEC. Nº: 2 or the ID. SEC. Nº: 3.

Las partículas de vectores adenovíricos de la presente invención derivan de vectores de transferencia génica basados en adenovirus. Las proteínas de la cápside se eligen de entre proteína de fibra, Hexona, base Pentona y proteína IX. La proteína de fibra comprende preferiblemente los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 13, la ID. SEC. Nº: 14 o la ID. SEC. Nº: 15. The adenoviral vector particles of the present invention are derived from adenovirus-based gene transfer vectors. Capsid proteins are chosen from fiber protein, Hexone, Pentona base and protein IX. The fiber protein preferably comprises amino acids according to the ID. SEC. Nº: 13, the ID. SEC. No.: 14 or the ID. SEC. Nº: 15.

La partícula del vector de adenovirus se puede obtiener mediante el procedimiento según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. The adenovirus vector particle can be obtained by the method as defined in any one of claims 1 to 5.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de una partícula de un vector adenovírico según la presente invención, que comprende las etapas según se enumeran en la reivindicación 1. En particular, dicho procedimiento comprende las etapas de: i) generación de una partícula de un vector adenovírico o en líneas celulares de empaquetamiento, que comprende proteínas de la cápside que comprenden un sitio de fijación para la modificación específica de las partículas del vector, comprendiendo dicho de sitio de fijación al menos un residuo de cisteína; ii) lisado de las células de empaquetamiento y la subsiguiente purificación de dichas partículas de vectores víricos en tampones con un pH desde 5,0 hasta 9,0, preferiblemente desde 6,8 hasta 7,4, y más a 7,3, en tampones con poco oxígeno o sin oxígeno opcionalmente complementados con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2; iii) poner en contacto los compañeros de acoplamiento con dichas partículas de vectores víricos y realizar una reacción de acoplamiento con la formación de un enlace de tioéter, disulfuro o tioéster en tampones con poco oxígeno/sin oxígeno complementados con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2. Another aspect of the present invention relates to a process for generating a particle of an adenoviral vector according to the present invention, comprising the steps as listed in claim 1. In particular, said method comprises the steps of: i) generation of a particle of an adenoviral vector or in packaging cell lines, comprising capsid proteins comprising a binding site for the specific modification of the vector particles, said fixing site comprising at least one cysteine residue; ii) lysate of the packaging cells and the subsequent purification of said viral vector particles in buffers with a pH from 5.0 to 9.0, preferably from 6.8 to 7.4, and more to 7.3, in buffers with little or no oxygen optionally supplemented with reducing reagents in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2; iii) contacting the coupling partners with said viral vector particles and performing a coupling reaction with the formation of a thioether, disulfide or thioester bond in low oxygen / oxygen free buffers supplemented with reducing reagents in an Ar atmosphere , He, N2 or CO2.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de partículas de vectores adenovíricos según la presente invención como un medio terapéutico, profiláctico o diagnóstico en seres humanos, primates y otros vertebrados tales como ganado, cerdos, aves, peces o roedores. A further aspect of the present invention relates to the use of adenoviral vector particles according to the present invention as a therapeutic, prophylactic or diagnostic means in humans, primates and other vertebrates such as cattle, pigs, birds, fish or rodents.

Las siguientes figuras explican la invención. The following figures explain the invention.

La Fig. 1 representa los resultados del alquilación del mismo número de partículas de vectores Ad1Cys, Ad3Cys, Ad5Cys, así como de un vector de control no modificado genéticamente con partículas de monomaleimida-nanooro y la subsiguiente separación de las proteínas de la cápside mediante SDS-PAGE seminatural con una tinción de plata específica para oro. (+) significa preincubación con el reactivo reductor TCEP (clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina) (10 mM, (-) significa sin preincubación con agente reductor, "KV" significa partículas de vector de control no modificadas genéticamente incubadas con monomaleimidananooro, "Ad1Cys" significa partículas del vector Ad1Cys incubadas con monomaleimida-nanooro, "Ad3Cys" significa partículas del vector Ad3Cys incubadas con monomaleimida-nanooro, "Ad5Cys" significa partículas del vector Ad5Cys incubadas con monomaleimida-nanooro, "Ad1Cys sin oro" significa partículas del vector Ad1Cys no incubadas con monomaleimida-nanooro. Fig. 1 depicts the results of alkylation of the same number of Ad1Cys, Ad3Cys, Ad5Cys vector particles, as well as a control vector not genetically modified with monomaleimide-nanooro particles and subsequent separation of capsid proteins by SDS - Seminatural page with a specific silver stain for gold. (+) means preincubation with the reducing reagent TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) (10 mM, (-) means without preincubation with reducing agent, "KV" means unmodified control vector particles incubated with monomaleimidananooro , "Ad1Cys" means particles of the Ad1Cys vector incubated with monomaleimide-nanooro, "Ad3Cys" means particles of the Ad3Cys vector incubated with monomaleimide-nanooro, "Ad5Cys" means particles of the Ad5Cys vector incubated with monomaleimide-nanooro, "Ad1Cys without gold" means particles of the Ad1Cys vector not incubated with monomaleimide-nanooro.

La Fig.2 demuestra la modificación química con éxito de grupos tiol introducidos genéticamente en el vector Ad1Cys tras la protección mediante una amino-PEGilación de las partículas del vector. Se muestran los resultados típicos de la citometría de flujo para analizar la expresión de la EGFP en células K562. "pMOI" significa partícula MOI (número de partículas físicas del vector usado para transducir las células K562). "Ad1Cys no modificado" es el vector Ad1Cys no modificado químicamente. "Af1Cys + SPA-PEG" significa vector Ad1Cys aminoPEGilado. "Ad1Cy + SPA-PEG + Tf-Mal" significa vector Ad1Cys aminoPEGilado que, después de la modificación con amina, fue modificado específicamente con tiol con maleimida-transferrina (Tf-Mal). Fig. 2 demonstrates the successful chemical modification of thiol groups genetically introduced into the Ad1Cys vector after protection by an amino-PEGylation of the particles of the vector. Typical results of flow cytometry to analyze the expression of EGFP in K562 cells are shown. "pMOI" means MOI particle (number of physical particles of the vector used to transduce K562 cells). "Ad1Cys not modified" is the Ad1Cys vector not chemically modified. "Af1Cys + SPA-PEG" means aminoPEGylated Ad1Cys vector. "Ad1Cy + SPA-PEG + Tf-Mal" means aminoPEGylated Ad1Cys vector which, after modification with amine, was specifically modified with thiol with maleimide-transferrin (Tf-Mal).

El término "partícula de vector" o "partícula de vector vírico" o "partícula de vector de virus" según se usa aquí se refiere a constructos víricos naturales o artificiales para la captación, multiplicación, expresión o transporte de ácidos nucleicos en células. El término no incluye ninguna partícula de vector producida sintéticamente, es decir, partículas producidas sin la ayuda de funciones y procesos celulares que van más allá de la expresión de las proteínas de la cápside. Algunos ejemplos de partículas de vector son virus con un alto grado de complejidad, tales como adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, lentivirus o baculovirus. Las partículas de vectores están diseñadas detal forma que contienen al menos un polinucleótido terapéutico o analítico. Éste puede ser expresado y/o replicado. Las partículas del vector también pueden incluir secuencias de polinucleótidos que pueden tener características reguladoras. Además, el término partícula de vector también puede incluir partículas de vectores que sean capaces de una replicación lítica en células distintas a las de producción. El término "ácido nucleico terapéutico" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que, tras su administración a una célula de un organismo, confiere un beneficio terapéutico, profiláctico o diagnóstico. The term "vector particle" or "viral vector particle" or "virus vector particle" as used herein refers to natural or artificial viral constructs for the uptake, multiplication, expression or transport of nucleic acids in cells. The term does not include any synthetically produced vector particles, that is, particles produced without the help of cellular functions and processes that go beyond the expression of capsid proteins. Some examples of vector particles are viruses with a high degree of complexity, such as adenoviruses, adeno-associated viruses, retroviruses, lentiviruses or baculoviruses. The vector particles are designed in detail that contain at least one therapeutic or analytical polynucleotide. This can be expressed and / or replicated. Vector particles may also include polynucleotide sequences that may have regulatory characteristics. In addition, the term vector particle may also include vector particles that are capable of lytic replication in cells other than those of production. The term "therapeutic nucleic acid" refers to a sequence of polynucleotides that, after administration to a cell in an organism, confers a therapeutic, prophylactic or diagnostic benefit.

El término "modificación genética" según se usa aquí, se refiere modificaciones de ácidos nucleicos de las secuencias de polinucleótidos de las proteínas de la cápside naturales de las partículas del vector vírico, que dan como resultado secuencias de aminoácidos modificadas de estas proteínas. Estas modificaciones se realizan mediante procedimientos estándar de biología molecular. Dicha modificación genética puede pasarse al genoma de replicación después de la replicación de la partícula del vector, y con esto también a las partículas del vector replicante. Además, las secuencias de polinucleótidos modificadas también pueden ser parte de una línea celular de producción transfectada de forma estable con la secuencia de polinucleótidos modificada, o parte de un plásmido de producción que no está presente en la preparación del vector purificado según se usa para la modificación química. The term "genetic modification" as used herein refers to nucleic acid modifications of the polynucleotide sequences of the natural capsid proteins of the viral vector particles, which result in modified amino acid sequences of these proteins. These modifications are made by standard molecular biology procedures. Said genetic modification can be passed to the replication genome after replication of the vector particle, and with this also to the particles of the replicating vector. In addition, the modified polynucleotide sequences can also be part of a production cell stably transfected with the modified polynucleotide sequence, or part of a production plasmid that is not present in the preparation of the purified vector as used for chemical modification

El término "modificación química" según se usa aquí se refiere a la modificación de las proteínas de la cápside en partículas de vector estructuralmente intactas en ausencia de células de producción mediante reacciones químicas y con la formación de enlaces químicos covalentes. Dicha modificación química no se pasa al genoma de replicación tras la replicación de la partícula de vector, y con esto tampoco a las partículas de vector replicadas. The term "chemical modification" as used herein refers to the modification of capsid proteins in structurally intact vector particles in the absence of production cells by chemical reactions and with the formation of covalent chemical bonds. Said chemical modification is not passed to the replication genome after the replication of the vector particle, and with this also to the replicated vector particles.

El término "tropismo" según se usa aquí se refiere a la capacidad de las partículas de vector de infectar/transducir ciertas células según su composición superficial. The term "tropism" as used herein refers to the ability of vector particles to infect / transduce certain cells according to their surface composition.

El término "modificación del tropismo" según se usa aquí se refiere a un procedimiento para alterar la capacidad de las partículas del vector de infectar/transducir ciertas células según su composición superficial. Con objeto de modificar el tropismo de la partícula del vector, a las partículas se les proporcionan ciertas características tales como ciertas afinidades por los receptores en la superficie de las células objetivo que no poseen por naturaleza. Además, tras la modificación del tropismo naturalmente inherente, pueden reducirse o eliminarse características tales como la afinidad por ciertos receptores celulares, por ejemplo, la afinidad por CAR en el caso de Ad5. The term "tropism modification" as used herein refers to a procedure to alter the ability of vector particles to infect / transduce certain cells according to their surface composition. In order to modify the tropism of the vector particle, the particles are given certain characteristics such as certain affinities for the receptors on the surface of the target cells that they do not possess by nature. In addition, following naturally inherent tropism modification, characteristics such as affinity for certain cell receptors, for example, CAR affinity in the case of Ad5, can be reduced or eliminated.

El término "proteína de la cápside" según se usa aquí se refiere al grupo de proteínas que está implicado de forma natural en la formación de la cápside de la partícula del vector y es accesible por el disolvente cuando la partícula del vector está en disolución, por ejemplo, la proteína de fibra o la Hexona de las partículas del vector Ad, o VP2 de partículas de vectores AAV. En el caso de partículas de vectores víricos con cubierta se refiere a los componentes proteicos de la partícula que son accesibles por el disolvente circundante cuando la partícula está en disolución, por ejemplo, los dominios extramembranales de las proteínas de la envoltura de las partículas del vector de retrovirus. The term "capsid protein" as used herein refers to the group of proteins that is naturally involved in the formation of the capsid of the vector particle and is accessible by the solvent when the vector particle is in solution, for example, the fiber protein or the Hexone of the particles of the Ad vector, or VP2 of AAV vector particles. In the case of viral vector particles with cover it refers to the protein components of the particle that are accessible by the surrounding solvent when the particle is in solution, for example, the extramembrane domains of the envelope proteins of the vector particles of retroviruses.

El término "acoplamiento" según se usa aquí, se refiere a la modificación química específica de tiol de grupos tiol en la superficie de partículas de vectores modificadas genéticamente con la formación de enlaces químicos covalentes. Como ejemplo se pueden mencionar la formación de enlaces tíoéter mediante la reacción de grupos tiol reducidos en la superficie de la partícula del vector con grupos maleimida. Además, el acoplamiento se refiere a un procedimiento que mantiene la integridad estructural de las partículas del vector y las funciones naturales de sus proteínas de la cápside y del núcleo. Sólo pueden alterarse las características de unión al receptor y/o de fusión a la membrana. The term "coupling" as used herein refers to the thiol specific chemical modification of thiol groups on the surface of genetically modified vector particles with the formation of covalent chemical bonds. As an example, the formation of thioether bonds by the reaction of reduced thiol groups on the surface of the vector particle with maleimide groups can be mentioned. In addition, the coupling refers to a procedure that maintains the structural integrity of the vector particles and the natural functions of their capsid and core proteins. Only the characteristics of receptor binding and / or membrane fusion can be altered.

El término "compañero de acoplamiento" según se usa aquí, se refiere a moléculas que están fijadas covalentemente y específicamente con tiol a partículas de vectores modificadas genéticamente (acoplamiento). Las funciones de los compañeros de acoplamiento pueden ser la introducción de nuevos grupos reactivos adicionales en la superficie de la partícula del vector, la introducción de nuevas especificidades de receptor o la protección de las partículas del vector, o la introducción de nuevas propiedades catalíticas o físicas. Adicionalmente, los compañeros de acoplamiento son moléculas que en la segunda o en las subsiguientes etapas del proceso de acoplamiento, se fijan a otro compañero de acoplamiento que ya ha sido fijado a la superficie de la partícula del vector. The term "coupling partner" as used herein refers to molecules that are covalently and specifically bound with thiol to genetically modified vector particles (coupling). The functions of the coupling partners may be the introduction of additional new reactive groups on the surface of the vector particle, the introduction of new receptor specificities or the protection of the vector particles, or the introduction of new catalytic or physical properties . Additionally, the coupling partners are molecules that in the second or subsequent stages of the coupling process, are attached to another coupling partner that has already been fixed to the surface of the vector particle.

El término "dominios expuestos al disolvente" según se usa aquí se refiere a dominios de las proteínas de la cápside de partículas de vectores víricos estructuralmente intactos en disolución que están en contacto físico con el disolvente. El contacto físico con el disolvente puede generarse mediante la aplicación de reactivos reductores o de un tratamiento enzimático. The term "domains exposed to the solvent" as used herein refers to domains of the capsid proteins of structurally intact viral vector particles in solution that are in physical contact with the solvent. Physical contact with the solvent can be generated by the application of reducing reagents or an enzymatic treatment.

El término "número de oxidación" según se usa aquí se refiere al número romano formal que describe el estado de oxidación del átomo de azufre de un residuo de cisteína y de derivados de un residuo de cisteína según se obtienen mediante modificaciones químicas, y se calcula mediante la fórmula: 6-("número de electrones asignados al átomo de azufre del residuo/derivado de cisteína") = número de oxidación. El número de electrones asignado al átomo de azufre del residuo/derivado de cisteína se determina según las asunciones formales de que 1) el átomo de azufre y el átomo de carbono � de un residuo/derivado de cisteína tienen la misma electronegatividad, y que 2) los átomos de azufre tienen una electronegatividad mayor que los átomos de hidrógeno. Por lo tanto, el número de oxidación del azufre en un grupo tiol reducido de un residuo de cisteína según se usa aquí es de -I y en un enlace de disulfuro 0. The term "oxidation number" as used herein refers to the formal Roman numeral describing the oxidation state of the sulfur atom of a cysteine residue and derivatives of a cysteine residue as obtained by chemical modifications, and is calculated by the formula: 6 - ("number of electrons assigned to the sulfur atom of the residue / cysteine derivative") = oxidation number. The number of electrons assigned to the sulfur atom of the cysteine residue / derivative is determined according to the formal assumptions that 1) the sulfur atom and the carbon atom � of a cysteine residue / derivative have the same electronegativity, and that 2 ) Sulfur atoms have an electronegativity greater than hydrogen atoms. Therefore, the oxidation number of sulfur in a reduced thiol group of a cysteine residue as used herein is -I and in a disulfide bond 0.

Un aspecto de esta invención se refiere a vectores de adenovirus que comprenden proteínas de la cápside con un sitio de fijación para la modificación química específica de las partículas del vector, mediante la cual el sitio de fijación es un residuo de cisteína que no existe de forma natural en la proteína de la cápside. Dichas partículas de vectores víricos comprenden compañeros de acoplamiento fijados a un sitio de fijación, mediante lo cual el sitio de fijación puede ser un residuo de cisteína existente de forma natural o un residuo de cisteína que fue introducido en la proteína de la cápside mediante la tecnología del ADN recombinante. One aspect of this invention relates to adenovirus vectors comprising capsid proteins with a binding site for specific chemical modification of the vector particles, whereby the binding site is a cysteine residue that does not exist in a manner. Natural in the capsid protein. Said viral vector particles comprise coupling partners attached to a binding site, whereby the binding site can be a naturally occurring cysteine residue or a cysteine residue that was introduced into the capsid protein by technology. of recombinant DNA.

Las partículas del vector pueden producirse mediante una combinación de procedimientos genéticos y químicos. Los grupos tiol reactivos se introducen a través de residuos de cisteína en los dominios de la proteína de la cápside expuestos al disolvente, por ejemplo, el dominio de la fibra Knob de Ad5, mediante modificaciones genéticas. Estas modificaciones genéticas permiten el uso de líneas/sistemas celulares de producción convencionales y habitualmente no limitan el rendimiento de la producción. Los grupos tiol introducidos genéticamente se mantienen o se transforman en un reactivo, es decir, en estado reducido por agentes reductores. Los tipos y las concentraciones de los reactivos reductores no afectan a la intensidad de las partículas del vector. Los grupos tiol reactivos expuestos al disolvente obtenidos en las proteínas de la cápside se usan para un acoplamiento químico específico y covalente de cualquier molécula, tal como ligandos para la modificación del tropismo y/o polímeros para la protección de las partículas del vector y/o moléculas marcadoras para marcar partículas del vector y/o enzimas para ciertas actividades catalíticas de la superficie de la partícula del vector. Se forman enlaces covalentes bioirreversibles (tioéter, tioéster o biorreversibles, es decir, en las condiciones reductoras del endosoma o el citosol enlaces covalentes reversibles (disulfuros) entre el compañero de acoplamiento y la partícula del vector eligiendo diferentes reactivos químicos para el acoplamiento. Además, puede usarse una combinación de diferentes compañeros de acoplamiento diferentes proporciones y/o diferentes reactivos químicos para acoplarnos al mismo tiempo. Además, los compañeros de acoplamiento pueden introducir nuevos sitios de fijación sobre los cuales pueden fijarse los compañeros de acoplamiento durante rondas adicionales de acoplamiento. Vector particles can be produced by a combination of genetic and chemical procedures. The thiol reactive groups are introduced through cysteine residues in the capsid protein domains exposed to the solvent, for example, the Ad5 Knob fiber domain, by genetic modifications. These genetic modifications allow the use of conventional production cell lines / systems and usually do not limit production performance. Genetically introduced thiol groups are maintained or transformed into a reagent, that is, in a reduced state by reducing agents. The types and concentrations of the reducing reagents do not affect the intensity of the vector particles. The thiol reactive groups exposed to the solvent obtained in the capsid proteins are used for a specific and covalent chemical coupling of any molecule, such as ligands for the modification of tropism and / or polymers for the protection of the particles of the vector and / or marker molecules to label vector particles and / or enzymes for certain catalytic activities of the surface of the vector particle. Bio-reversible covalent bonds (thioether, thioester or bioreversible, that is, under the reducing conditions of the endosome or cytosol, reversible covalent bonds (disulfides) are formed between the coupling partner and the vector particle by choosing different chemical reagents for coupling. a combination of different coupling partners, different proportions and / or different chemical reagents can be used to couple at the same time In addition, the coupling partners can introduce new fixing sites on which the coupling partners can be fixed during additional coupling rounds.

Un aspecto adicional se refiere a la producción de las partículas de vectores adenovíricos según la presente invención, que comprende las siguientes etapas: i) producción de la partícula del vector vírico en líneas de producción celulares, que comprenden un sitio de fijación para la modificación específica de dicha partícula de vector vírica, mediante lo que el sitio de fijación consiste en al menos un residuo de cisteína, ii) lisis celular y/o purificación de la partícula del vector en sistemas tamponantes con poco oxígeno/sin oxígeno que están opcionalmente complementados con un reactivo reductor y saturados con Ar, He, N2 o CO2, iii) poner en contacto las partículas del vector vírico de la etapa ii) con un compañero de acoplamiento y realizar una reacción de acoplamiento con la formación de enlaces tioéter, disulfuro o tioéster en sistemas tamponantes con poco oxígeno/sin oxígeno que estén complementados con reactivos reductores y saturados con Ar, He, N2 o CO2 con un pH en el intervalo desde 5,0 hasta 9,0, preferiblemente desde 6,8 hasta 7,4, y más preferiblemente a 7,3. Las partículas del vector aislado pueden almacenarse antes de un procesado adicional en los anteriormente enumerados tampones. A further aspect relates to the production of adenoviral vector particles according to the present invention, which comprises the following steps: i) production of the viral vector particle in cell production lines, which comprise a binding site for specific modification of said viral vector particle, whereby the fixation site consists of at least one cysteine residue, ii) cell lysis and / or purification of the vector particle in low oxygen / oxygen free buffering systems that are optionally supplemented with a reducing reagent and saturated with Ar, He, N2 or CO2, iii) contacting the particles of the viral vector of step ii) with a coupling partner and performing a coupling reaction with the formation of thioether, disulfide or thioester bonds in low oxygen / oxygen free buffer systems that are supplemented with reducing reagents and saturated with Ar, He , N2 or CO2 with a pH in the range of 5.0 to 9.0, preferably 6.8 to 7.4, and more preferably 7.3. The particles of the isolated vector may be stored before further processing in the above-listed buffers.

La base del procedimiento descrito es la introducción genética de uno o más grupos tiol reactivos en dominios expuestos al disolvente de las proteínas de la cápside las partículas del vector vírico a través de residuos de cisteína con los aminoácidos adecuados en su adyacencia que permiten el control del estado redox de los residuos de cisteína, así como una eficiente alquilación/esterificación. Si se está insertando más de un residuo de cisteína, dos o más residuos de cisteína pueden ser consecutivos o pueden estar separados por aminoácidos distintos a cisteína. Se prefieren los motivos de secuencias (i) LIGGGCGGGID ("1Cys") (ID. SEC. Nº: 1), (ii) LIGCGCGCGID ("3Cys") (ID. SEC. Nº: 2), (iii) LICCCCCID ("5Cys") (ID. SEC. Nº: 3). El experto en la materia puede identificar con facilidad que también pueden usarse motivos con diferentes cifras de cisteínas (por ejemplo, 2, 4, 6 o más) y/o motivos de secuencia más largos. Además, es evidente que también pueden usarse motivos con aminoácidos intercalados y flanqueantes distintos a glicina, serina, alamina, leucina, ácido aspártico o combinaciones de los mismos. The basis of the described procedure is the genetic introduction of one or more reactive thiol groups in domains exposed to the solvent of the capsid proteins the viral vector particles through cysteine residues with the appropriate amino acids in their adjacency that allow the control of the redox state of cysteine residues, as well as efficient alkylation / esterification. If more than one cysteine residue is being inserted, two or more cysteine residues may be consecutive or may be separated by amino acids other than cysteine. Sequence motifs are preferred (i) LIGGGCGGGID ("1Cys") (SEQ ID NO: 1), (ii) LIGCGCGCGID ("3Cys") (SEQ ID NO: 2), (iii) LICCCCCID (" 5Cys ") (SEQ ID NO: 3). The person skilled in the art can easily identify that motifs with different cysteine numbers (eg, 2, 4, 6 or more) and / or longer sequence motifs can also be used. In addition, it is clear that motifs with intercalated and flanking amino acids other than glycine, serine, allamine, leucine, aspartic acid or combinations thereof can also be used.

Además, es obvio que el procedimiento de modificación genética también puede incluir secuencias que contienen cisteína con especificidad intrínseca de receptor o cargas, por ejemplo, secuencias que son capaces de fijarse en los receptores de superficie de las células y/o facilitar el proceso de purificación de las partículas del vector. In addition, it is obvious that the genetic modification procedure can also include sequences containing cysteine with intrinsic specificity of receptor or charges, for example, sequences that are capable of being fixed on the cell surface receptors and / or facilitating the purification process of vector particles.

Los residuos de cisteína pueden insertarse, por ejemplo, en el bucle HI del dominio Knob expuesto al disolvente de la proteína de fibra de la cápside del serotipo 5 del adenovirus. El experto en la materia puede identificar con facilidad que junto con los dominios expuestos al disolvente del bucle HI de la proteína de fibra, también hay áreas expuestas al disolvente en otras regiones de la proteína de fibra, así como regiones expuestas al disolvente en las proteínas de la cápside tales como Hexona, base Pentona y Proteína IX son adecuadas para la inserción de los anteriormente mencionados activos o similares. Además, es obvio que no sólo pueden usarse vectores adenovíricos, y en los virus usados pueden modificarse cisteínas que existen potencialmente de forma natural son accesibles, con el procedimiento según se describe en este documento. Como un ejemplo, pueden mencionarse las proteínas Up2 y Up3 del virus Adeno-asociado (AAV) y sus subtipos, así como la proteína de la envoltura de retrovirus. Cysteine residues can be inserted, for example, in the HI loop of the Knob domain exposed to the solvent of the adenovirus serotype 5 capsid fiber protein. The person skilled in the art can easily identify that along with the domains exposed to the solvent of the HI loop of the fiber protein, there are also areas exposed to the solvent in other regions of the fiber protein, as well as regions exposed to the solvent in the proteins of the capsid such as Hexone, Pentona base and Protein IX are suitable for the insertion of the aforementioned active or similar. In addition, it is obvious that not only adenoviral vectors can be used, and cysteines that potentially naturally exist can be modified in the viruses used, with the procedure as described herein. As an example, the Up2 and Up3 proteins of the Adeno-associated virus (AAV) and its subtypes, as well as the retrovirus envelope protein can be mentioned.

Adicionalmente, los procedimientos se aplican a vectores adenovíricos que son modificados de tal forma que ya no portan de forma natural la proteína de fibra sino otras proteínas trimerizantes para la sustitución parcial o completa de la fibra homotrimérica. Además, los procedimientos se aplican a vectores híbridos formados por proteínas de la cápside derivadas de diferentes tipos de virus, por ejemplo, vectores híbridos formados por proteínas de adenovirus y reovirus. Además, el procedimiento se aplica a vectores quiméricos que han sido formados con diferentes serotipos de Ad. Además, el procedimiento se aplica a vectores que carecen de los componentes naturales de la cápside, por ejemplo, vectores de Ad que carecen de la proteína de fibra o de partes de la proteína de fibra. Además, el procedimiento se aplica a vectores víricos quiméricos distintos de los adenovirus que están formados por diferentes serotipos y a vectores pseudotipados retro y lentivíricos. Additionally, the procedures are applied to adenoviral vectors that are modified in such a way that they no longer naturally carry the fiber protein but other trimerizing proteins for partial or complete replacement of the homotrimeric fiber. In addition, the procedures apply to hybrid vectors formed by capsid proteins derived from different types of viruses, for example, hybrid vectors formed by adenovirus and reovirus proteins. In addition, the procedure applies to chimeric vectors that have been formed with different Ad serotypes. In addition, the procedure is applied to vectors that lack the natural components of the capsid, for example, Ad vectors that lack the fiber protein or parts of the fiber protein. In addition, the procedure is applied to chimeric viral vectors other than adenoviruses that are formed by different serotypes and to retro and lentiviral pseudotyped vectors.

La cisteínas pueden incorporarse en las partículas del vector mediante procedimientos establecidos de la tecnología del ADN recombinante. Para este propósito, se están incorporando secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los motivos de secuencias de cisteína en secuencias de polinucleótidos que codifican para la proteína de la cápside de la partícula del vector que se va a modificar. Las secuencias de polinucleótidos así modificadas se usan para la producción de las partículas del vector en líneas celulares de producción, por ejemplo, en células N52E6, en células 293 o en células PER C6, por ejemplo, en el caso de partículas de vector de Ad. El experto en la materia está familiarizado con líneas celulares y procedimientos de producción que se usan para la producción que vectores adenovíricos y para la producción de otros vectores víricos tales, por ejemplo, vectores basados en virus adenoasociados, retrovirus o lentivirus. En el caso de partículas del vector de Ad, el ácido nucleico es en primer lugar transfectado en las células de producción (por ejemplo, mediante el procedimiento de Ca-fosfato). Subsiguientemente, las líneas celulares de producción producen partículas del vector que pueden ser recogidas mediante lisis en un tampón de lisis que habitualmente está saturado con oxígeno atmosférico, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o en medio de cultivo celular. Dado que las cantidades de las partículas de vector obtenido son habitualmente relativamente bajas en esta primera etapa de producción, las partículas del vector obtenidas mediante lisis se usan de nuevo para infectar líneas celulares de producción con objeto de obtener mayores cantidades de partículas del vector. Esto se realiza añadiendo las partículas del vector obtenidas mediante lisis, y opcionalmente purificado y/o concentrado, a las células de producción que se van a infectar. Este procedimiento se repite con unas cifras de células de producción crecientes en hasta 15 veces (preferiblemente 3-10 veces). Este proceso se denomina amplificación en serie. Los tampones que se usan para lisar las células pueden contener reactivos reductores tales como tris-(2-carboxietil)-fosfina TCEP (1-10 mM), ditiotreitol DTT (1-10 mM), ascorbato (10-100 mM) u otros. Adicionalmente durante las amplificaciones en serie, justo antes de la inyección de las células de producción con las partículas del vector, pueden añadirse reactivos antioxidantes tales como ascorbato (50-100 mM) o vitamina E (1-100 mM) al medio de cultivo celular con objeto de evitar la formación de agregados de partículas del vector antes de la inyección en el medio oxidativo del medio de cultivo celular. Cysteines can be incorporated into vector particles by established procedures of recombinant DNA technology. For this purpose, nucleic acid sequences encoding the reasons for cysteine sequences are being incorporated into polynucleotide sequences encoding the capsid protein of the vector particle to be modified. The polynucleotide sequences thus modified are used for the production of the vector particles in production cell lines, for example, in N52E6 cells, in 293 cells or in PER C6 cells, for example, in the case of Ad vector particles. . The person skilled in the art is familiar with cell lines and production methods that are used for the production of adenoviral vectors and for the production of other viral vectors such as, for example, vectors based on adeno-associated viruses, retroviruses or lentiviruses. In the case of particles of the Ad vector, the nucleic acid is first transfected into the production cells (for example, by the Ca-phosphate method). Subsequently, the production cell lines produce particles of the vector that can be collected by lysis in a lysis buffer that is usually saturated with atmospheric oxygen, such as phosphate buffered saline (PBS) or in cell culture medium. Since the quantities of the vector particles obtained are usually relatively low in this first stage of production, the vector particles obtained by lysis are again used to infect production cell lines in order to obtain larger quantities of vector particles. This is done by adding the particles of the vector obtained by lysis, and optionally purified and / or concentrated, to the production cells to be infected. This procedure is repeated with increasing production cell numbers up to 15 times (preferably 3-10 times). This process is called serial amplification. Buffers used to lyse the cells may contain reducing reagents such as tris- (2-carboxy ethyl) -phosphine TCEP (1-10 mM), dithiothreitol DTT (1-10 mM), ascorbate (10-100 mM) or others . Additionally during serial amplifications, just before injection of the production cells with the vector particles, antioxidant reagents such as ascorbate (50-100 mM) or vitamin E (1-100 mM) can be added to the cell culture medium in order to avoid the formation of aggregates of particles of the vector before injection into the oxidative medium of the cell culture medium.

Alternativamente al uso de tampones de lisis y saturados con oxígeno atmosférico opcionalmente complementados con reactivos reductores, durante las amplificaciones en serie pueden usarse sistemas tamponantes desgasificados, que pueden obtenerse a vacío, por aplicación de ultrasonidos o por una combinación de ambos. Además, pueden usarse sistemas tamponantes que han sido deplecionados en oxígeno o reducidos en oxígeno mediante la aplicación de argón, dióxido de carbono, nitrógeno o helio. También pueden añadirse agentes reductores a los tampones desgasificados. Obviamente pueden aplicarse todas las combinaciones de los procedimientos mencionados. Alternatively to the use of lysis buffers and saturated with atmospheric oxygen optionally supplemented with reducing reagents, during serial amplifications degassed buffer systems can be used, which can be obtained under vacuum, by application of ultrasound or by a combination of both. In addition, buffering systems that have been depleted in oxygen or reduced in oxygen by the application of argon, carbon dioxide, nitrogen or helium can be used. Reducing agents can also be added to degassed buffers. Obviously all combinations of the mentioned procedures can be applied.

Los sistemas tamponantes que se usan para la lisis celular también pueden usarse para todos los procedimientos de purificación y concentración después de la lisis de las células de producción durante y después de las amplificaciones en serie de las partículas de vector con cápside modificada genéticamente. Esto también incluye todos los procedimientos de purificación y de intercambio del tampón previos a la modificación química de las partículas del vector (por ejemplo, centrifugación en gradiente por etapas con CsCl, desalinización con tamices, diálisis). Se debe tener especial cuidado en la aplicación de materiales y sistemas tamponantes que estén exentos de iones metálicos divalentes tales como Mg2+ o Mn2+ con objeto de asegurar la estabilidad y la reactividad de los grupos tiol de las partículas. Pueden añadirse agentes quelantes tales como EDTA o EGTA a los tampones. Todos los sistemas tamponantes mencionados también se usan para el almacenamiento de las partículas del vector, así como para la purificación y el almacenamiento de las partículas del vector modificadas químicamente o parcialmente modificadas químicamente. Buffer systems used for cell lysis can also be used for all purification and concentration procedures after lysis of the production cells during and after serial amplifications of the genetically modified capsid vector particles. This also includes all buffer purification and exchange procedures prior to chemical modification of the vector particles (eg, step gradient centrifugation with CsCl, sieve desalination, dialysis). Special care should be taken in the application of buffering materials and systems that are free of divalent metal ions such as Mg2 + or Mn2 + in order to ensure the stability and reactivity of the thiol groups of the particles. Chelating agents such as EDTA or EGTA may be added to the buffers. All of the aforementioned buffer systems are also used for the storage of the vector particles, as well as for the purification and storage of the chemically modified or partially chemically modified vector particles.

Mediante procedimientos químicos específicos de tiol, se fijan diversas moléculas (denominadas en lo sucesivo compañeros de acoplamiento) a las partículas del vector mediante la formación de enlaces químicos covalentes (denominados en lo sucesivo “acoplamiento"). Aquí es esencial que se mantenga la integridad de las partículas del vector así como las funciones naturales de las partículas del vector mediadas por las proteínas del núcleo y de la cápside; sólo pueden alterarse las funciones naturales de unión al receptor y/o de fusión a la membrana. Igualmente es esencial mantener la integridad estructural de los compañeros de acoplamiento. By specific thiol chemical procedures, various molecules (hereinafter referred to as coupling partners) are attached to the particles of the vector by the formation of covalent chemical bonds (hereinafter referred to as "coupling"). Here it is essential that integrity be maintained of the particles of the vector as well as the natural functions of the particles of the vector mediated by the proteins of the nucleus and of the capsid; only the natural functions of receptor binding and / or membrane fusion can be altered. structural integrity of the coupling partners.

Las modificaciones químicas se llevan a cabo en sistemas tamponantes con un intervalo de pH de 5,0 hasta 9,0, preferiblemente desde pH 6,8 hasta 7,4, y más preferiblemente a 7,3. Las modificaciones químicas se llevan a cabo en el sistema tamponante mencionado previamente. El sistema tamponante preferido es un tampón exento de oxígeno y de cationes metálicos que contiene disolución salina tamponada con fosfato 100 mM (PBS). El experto en la materia está familiarizado con el uso de otros sistemas tamponantes inertes tales como los basados en HEPES. Además, las reacciones químicas que se realizan sin modificar el pH también pueden realizarse en agua. El sistema tamponante usado y el tubo de reacción usado deben estar exentos de cationes metálicos divalentes sales tales como Mg2+ o Mu2+ con objeto de asegurar la estabilidad de los grupos tiol reducidos. Alternativamente, pueden aplicarse quelantes tales como EDTA con objeto de detener interacciones indeseables entre los grupos tiol y los cationes metálicos divalentes. Chemical modifications are carried out in buffer systems with a pH range of 5.0 to 9.0, preferably from pH 6.8 to 7.4, and more preferably to 7.3. Chemical modifications are carried out in the buffer system mentioned above. The preferred buffer system is an oxygen and metal cation free buffer containing 100 mM phosphate buffered saline (PBS). The person skilled in the art is familiar with the use of other inert buffer systems such as those based on HEPES. In addition, chemical reactions that are performed without modifying the pH can also be performed in water. The buffer system used and the reaction tube used must be free of divalent metal cations such as Mg2 + or Mu2 + in order to ensure the stability of the reduced thiol groups. Alternatively, chelants such as EDTA may be applied in order to stop undesirable interactions between thiol groups and divalent metal cations.

El acoplamiento con tioles insertados genéticamente de las partículas del vector tiene lugar a través de la formación de enlaces tioéter o tioéster (covalentes bioirreversibles) o mediante la formación de disulfuro (biorreversible). La formación de tioéteres tiene lugar con reactivos que comprenden grupos maleimida, la formación de los enlaces de disulfuro mediante reacción de intercambio de disulfuro con grupos ditiopiridilo. El experto en la materia está familiarizado con los mecanismos y velocidades de reacción. Este conocimiento permite variantes del procedimiento de acoplamiento según los requisitos específicos de los compañeros de acoplamiento. Coupling with genetically inserted thiols of the vector particles takes place through the formation of thioether or thioester bonds (bio-reversible covalent) or by the formation of disulfide (bioreversible). The formation of thioethers takes place with reagents comprising maleimide groups, the formation of the disulfide bonds by disulfide exchange reaction with dithiopyridyl groups. The person skilled in the art is familiar with the mechanisms and reaction rates. This knowledge allows variants of the coupling procedure according to the specific requirements of the coupling partners.

Los compañeros de acoplamiento pueden acoplarse directamente a las partículas del vector haciendo uso de características naturales intrínsecas del compañero de acoplamiento. Esto puede tener lugar, por ejemplo, usando grupos tiol reducidos existentes de forma natural presentes en el compañero de acoplamiento o añadiendo reactivos reductores al compañero de acoplamiento para obtener grupos tiol reducidos, por ejemplo, a partir de puentes de disulfuro presentes en el compañero de acoplamiento. Además, las reacciones de intercambio de disulfuro pueden aplicarse para el acoplamiento directo de los compañeros de acoplamiento. The coupling partners can be directly coupled to the particles of the vector making use of intrinsic natural characteristics of the coupling partner. This can take place, for example, by using naturally occurring reduced thiol groups present in the coupling partner or by adding reducing reagents to the coupling partner to obtain reduced thiol groups, for example, from disulfide bridges present in the coupling partner. coupling In addition, disulfide exchange reactions can be applied for direct coupling of the coupling partners.

Adicionalmente, también se pueden aplicar compañeros de acoplamiento modificados genéticamente tales como proteínas recombinantes para su acoplamiento específico de tiol con partículas del vector, que recibieron mediante codificación genética cisteínas individuales o puentes de disulfuro para el acoplamiento a través de enlace de disulfuro o de reacciones de intercambio de disulfuro. Additionally, genetically modified coupling partners such as recombinant proteins can also be applied for their specific thiol coupling with vector particles, which received individual cysteines or disulfide bridges for genetic coding through disulfide bonding or reaction reactions. disulfide exchange.

Los compañeros de acoplamiento también pueden acoplarse a los tioles de la superficie de las partículas del vector tras la modificación química covalente del compañero de acoplamiento. Aquí los compañeros de acoplamiento son modificados químicamente de una forma tal que, después de esta modificación, poseen grupos reactivos específicos de tiol acoplados covalentemente que, en una etapa subsiguiente, son aplicados para el acoplamiento específico con los grupos tiol de las partículas del vector. Los grupos reactivos específicos de tiol que son insertados mediante una modificación química del compañero de acoplamiento son grupos maleimida para la formación de grupos tioéter, The coupling partners can also be coupled to the thiols of the surface of the particles of the vector after the covalent chemical modification of the coupling partner. Here the coupling partners are chemically modified in such a way that, after this modification, they possess specific covalently coupled thiol reactive groups that, in a subsequent step, are applied for specific coupling with the thiol groups of the vector particles. The specific thiol reactive groups that are inserted by a chemical modification of the coupling partner are maleimide groups for the formation of thioether groups,

o ditiopiridilo para la formación de puentes de disulfuro, o derivados de yodoacetilo para la formación de tioésteres.Éstos pueden insertarse en el compañero de acoplamiento mediante reactivos de acoplamiento tales como éster de N-[E-maleimidacaproiloxi]suocinimida (EMCS) o succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionainido]hexanoato (SPDP). El experto en la materia está familiarizado con la aplicación de reactivos adicionales. or dithiopyridyl for the formation of disulfide bridges, or iodoacetyl derivatives for the formation of thioesters. These can be inserted into the coupling partner by coupling reagents such as N-[E-maleimidacaproyloxy] suocinimide (EMCS) ester or succinimidyl- 6- [3- (2-Pyridyldithio) -propionainido] hexanoate (SPDP). The person skilled in the art is familiar with the application of additional reagents.

La modificación química de los compañeros de acoplamiento para el acoplamiento con los tioles de la superficie de la partícula del vector también puede usarse para insertar grupos químicos que no están directamente implicados en el proceso de acoplamiento y que sirven como separadores entre los compañeros de acoplamiento y las partículas del vector. Un ejemplo es el uso N-hidroxisuccinimid-polietilenglicol-3400-maleimida (NHS-PEG3400-Mal). El uso de separadores en la modificación química de uno o más compañeros de acoplamiento puede servir para aumentar la eficacia de reacción mediante la reducción de los impedimentos estéricos, así como para aumentar la potencia del compañero de acoplamiento al exponer eficazmente sus dominios de unión al receptor o al introducir grupos reactivos adicionales para un acoplamiento continuado. Obviamente, aparte del NHS-PEG-3400-Mal, también pueden usarse otros separadores. The chemical modification of the coupling partners for coupling with the thiols of the vector particle surface can also be used to insert chemical groups that are not directly involved in the coupling process and that serve as separators between the coupling partners and Vector particles. An example is the use of N-hydroxysuccinimid-polyethylene glycol-3400-maleimide (NHS-PEG3400-Mal). The use of separators in the chemical modification of one or more coupling partners can serve to increase the reaction efficiency by reducing steric hindrances, as well as to increase the power of the coupling partner by effectively exposing its receptor binding domains. or by introducing additional reactive groups for continued coupling. Obviously, apart from the NHS-PEG-3400-Mal, other separators can also be used.

Claramente, también se pueden usar compañeros de acoplamiento que porten, por sí mismos, grupos reactivos para el acoplamiento de un segundo compañero de acoplamiento en orden cronológico. Además, es obvio que también puede ocurrir el acoplamiento simultáneo de varios compañeros de acoplamiento diferentes en las partículas del vector. Clearly, coupling partners can also be used that carry, on their own, reactive groups for coupling a second coupling partner in chronological order. In addition, it is obvious that simultaneous coupling of several different coupling partners can also occur in the particles of the vector.

Los compañeros de acoplamiento para el acoplamiento específico de tiol en las partículas pueden realizar diferentes funciones. Coupling partners for specific thiol coupling in the particles can perform different functions.

La primera función consiste en la mediación de nuevas especificidades de receptor para un remarcaje de las partículas del vector que fueron modificadas de esta forma. Para este propósito pueden aplicarse proteínas como la transferrina, mediante lo cual las características de los compañeros de acoplamiento relativas a la unión al receptor son transferidas a las partículas del vector mediante un acoplamiento covalente. Para el experto en la materia es obvio que no sólo pueden usarse aquí proteínas con ciertas especificidades de receptor (por ejemplo, transferrina, factor de crecimiento epidérmico EGF, factor básico de crecimiento de los fibroblastos bFGF), sino también moléculas de otras categorías de sustancias. Como un ejemplo pueden mencionarse aquí mono o polisacáridos tales como galactosa, que pueden mediar en la unión específica al receptor. Un ejemplo adicional para la aplicación de los compañeros de acoplamiento diferentes de las proteínas son las hormonas esteroideas, que también pueden mediar en la especificidad del receptor. Además, pueden usarse para el acoplamiento de moléculas con características de unión al receptor que fueron diseñadas con procedimientos racionales tales como Modelado Molecular o derivados de éstas, y moléculas que han sido sintetizadas químicamente o que han sido aisladas a partir de materiales naturales. También pueden usarse moléculas más complejas formadas por numerosas subunidades que pueden estar unidas covalentemente o incluso no covalentemente, por ejemplo, virus o partículas de vectores víricos, como compañeros de acoplamiento para acoplarse con grupos tiol de la superficie de la partícula del vector. Los vectores según la presente invención también pueden acoplarse con compañeros de acoplamiento, mediante lo cual desarrollan un tropismo para más de un tipo celular. El acoplamiento de los compañeros de acoplamiento a residuos de cisteína en la superficie de la partícula del vector también puede realizarse antes, al mismo tiempo o después de las modificaciones químicas de la superficie de la partícula del vector que implican grupos reactivos distintos a los tioles. Por ejemplo, antes, al mismo tiempo o después de la aminoPEGilación con éteres activados electrofílicamente reactivos con aminas, o antes, al mismo tiempo o después de la modificación superficial con HPMA reactivo con aminas, y las partículas del vector así obtenidas podrían someterse a una modificación del tiol. The first function is the mediation of new receptor specificities for a remarking of vector particles that were modified in this way. For this purpose, proteins such as transferrin can be applied, whereby the characteristics of the coupling partners related to receptor binding are transferred to the particles of the vector by covalent coupling. It is obvious to the person skilled in the art that not only proteins with certain receptor specificities (for example, transferrin, EGF epidermal growth factor, basic growth factor of bFGF fibroblasts) can be used here, but also molecules of other substance categories . As an example, mono or polysaccharides such as galactose, which can mediate specific receptor binding, can be mentioned here. An additional example for the application of different mating partners of proteins are steroid hormones, which can also mediate receptor specificity. In addition, they can be used for coupling molecules with receptor binding characteristics that were designed with rational procedures such as Molecular Modeling or derivatives thereof, and molecules that have been chemically synthesized or that have been isolated from natural materials. More complex molecules formed by numerous subunits that can be covalently or even non-covalently linked, for example, viruses or viral vector particles, can also be used as coupling partners to mate with thiol groups on the surface of the vector particle. The vectors according to the present invention can also be coupled with coupling partners, whereby they develop a tropism for more than one cell type. Coupling of the coupling partners to cysteine residues on the surface of the vector particle can also be performed before, at the same time or after chemical modifications of the surface of the vector particle involving reactive groups other than thiols. For example, before, at the same time or after aminoPEGylation with electrophilically activated ethers reactive with amines, or before, at the same time or after surface modification with HPMA reactive with amines, and the particles of the vector thus obtained could be subjected to thiol modification.

La segunda función consiste en una protección estérica de las partículas del vector modificadas químicamente mediante los compañeros de acoplamiento, con objeto de evitar, por ejemplo, interacciones indeseadas con anticuerpos o con el sistema complemento o con componentes celulares del sistema inmunitario. Para este propósito pueden aplicarse derivados de polímeros sintéticos tales como polietilenglicol (PEG) con diferentes pesos moleculares y longitudes de cadena. Un ejemplo adicional de un polímero sintético cuyos derivados son adecuados para la protección de las partículas del vector y pueden ser acoplados específicamente mediante uno de los mecanismos descritos anteriormente sobre las partículas del vector modificadas genéticamente es pHPMA (Fisher, 2001). Además, pueden usarse moléculas que confieran nuevas especificidades de receptor, como las propias proteínas, para proteger las partículas del vector. The second function consists of steric protection of chemically modified vector particles by the coupling partners, in order to avoid, for example, unwanted interactions with antibodies or with the complement system or with cellular components of the immune system. For this purpose, derivatives of synthetic polymers such as polyethylene glycol (PEG) with different molecular weights and chain lengths can be applied. A further example of a synthetic polymer whose derivatives are suitable for the protection of vector particles and can be specifically coupled by one of the mechanisms described above on the genetically modified vector particles is pHPMA (Fisher, 2001). In addition, molecules that confer new receptor specificities, such as proteins themselves, can be used to protect vector particles.

Las funciones de mediación de nuevas especificidades de receptor o mediante un compañero de acoplamiento y la protección pueden unificarse mediante el acoplamiento simultáneo o cronológico de dos o más compañeros de acoplamiento en la misma partícula del vector, mediante lo que por un lado se crea un tropismo y por otro lado se crea protección. Aquí es obvio que ambos compañeros de acoplamiento pueden acoplarse directamente sobre los grupos tiol reactivos de la superficie de la cápside, o que un compañero de acoplamiento ofrece grupos reactivos para el acoplamiento específico del segundo compañero de acoplamiento con el primero. Estos grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, grupos tiol, amino o carboxilo. Además, es obvio que también puede usarse un único compañero de acoplamiento que combine ambas funciones de remarcaje y de protección. The mediation functions of new receptor specificities or by means of a coupling partner and protection can be unified by the simultaneous or chronological coupling of two or more coupling partners in the same particle of the vector, by which on the one hand a tropism is created and on the other hand protection is created. Here it is obvious that both coupling partners can be coupled directly on the thiol reactive groups of the capsid surface, or that one coupling partner offers reactive groups for the specific coupling of the second coupling partner with the first. These reactive groups can be, for example, thiol, amino or carboxyl groups. In addition, it is obvious that a single coupling partner that combines both remarking and protection functions can also be used.

Una tercera función de los compañeros de acoplamiento puede ser el marcaje de las partículas del vector, por ejemplo, para la transferencia analítica de genes, por ejemplo, con un pigmento fluorescente o con partículas de nanooro como marcadores analíticos. A third function of the coupling partners may be the labeling of the particles of the vector, for example, for the analytical transfer of genes, for example, with a fluorescent pigment or with nanooro particles as analytical markers.

Una cuarta función puede ser la posibilidad de alterar las propiedades físicas de las partículas del vector, por ejemplo, mediante el acoplamiento magnético de compañeros de acoplamiento a las partículas del vector y usando las nuevas propiedades físicas como el magnetismo para, por ejemplo, procedimientos de transducción física o procedimientos de purificación basados en las propiedades físicas conferidas por el compañero de acoplamiento en particular. A fourth function may be the possibility of altering the physical properties of the vector particles, for example, by magnetic coupling of coupling partners to the vector particles and using new physical properties such as magnetism for, for example, methods of physical transduction or purification procedures based on the physical properties conferred by the particular coupling partner.

Una quinta función puede ser la posibilidad de alterar las propiedades bioquímicas de las partículas del vector aparte de su unión al receptor, es decir, conferir actividades enzimáticas a la partícula del vector mediante el acoplamiento de enzimas o de fragmentos catalíticamente activos de enzimas como recombinasas o proteasas de ADN en las partículas del vector, y transportar estas actividades enzimáticas o catalíticas a las células objetivo. A fifth function may be the possibility of altering the biochemical properties of the vector particles apart from their binding to the receptor, that is, conferring enzymatic activities to the vector particle by coupling enzymes or catalytically active enzyme fragments such as recombinases or DNA proteases in vector particles, and transport these enzymatic or catalytic activities to the target cells.

Un prerrequisito para la modificación relevante de la invención de las partículas del vector es la disponibilidad de residuos de cisteína en dominios expuestos al disolvente de la superficie y/o proteínas de la cápside. Aquí es irrelevante si el virus tiene cubierta o no. Es crucial que mediante la reducción y/o la alquilación/esterificación de los grupos tiol, ninguna de las funciones biológicas del vector se vea afectada, únicamente pueden alterarse las características de unión al receptor y/o de fusión a la membrana. A prerequisite for the relevant modification of the invention of the vector particles is the availability of cysteine residues in domains exposed to the surface solvent and / or capsid proteins. Here it is irrelevant whether the virus is covered or not. It is crucial that by reducing and / or alkylating / esterifying the thiol groups, none of the biological functions of the vector is affected, only the characteristics of receptor binding and / or membrane fusion can be altered.

La modificación de las partículas del vector mediante el acoplamiento específico de ligandos en los grupos tiol que han sido insertados genéticamente en dominios expuestos al disolvente según se describe en este documento, puede conseguirse para todos los vectores víricos. El experto en la materia está familiarizado con la existencia de vectores que se basan en un gran número de diferentes virus. Los virus pueden encontrarse en libros de texto accesibles habitualmente tales como, por ejemplo, Fields, Virology. Actualmente son especialmente interesantes para la terapia génica vectores que están basados en adenovirus, virus adenoasociados (AAV) o retrovirus y lentivirus, y existen en diferentes, con algunos virus como el AAV en muchos tipos y serotipos. Para la modificación relevante para la invención se requiere que los grupos tiol que se han insertado genéticamente en dominios expuestos al disolvente de las proteínas de la cápside y/o que están disponibles de forma natural, se mantengan en Modification of the vector particles by specific coupling of ligands in the thiol groups that have been genetically inserted in domains exposed to the solvent as described herein, can be achieved for all viral vectors. The person skilled in the art is familiar with the existence of vectors that are based on a large number of different viruses. Viruses can be found in routinely accessible textbooks such as, for example, Fields, Virology. Currently, vectors that are based on adenovirus, adeno-associated virus (AAV) or retrovirus and lentivirus are especially interesting for gene therapy, and exist in different, with some viruses such as AAV in many types and serotypes. For the modification relevant to the invention, it is required that the thiol groups that have been genetically inserted in domains exposed to the solvent of the capsid proteins and / or that are naturally available, be maintained in

5 un estado reducido y reactivo con reactivos reductores suaves, y/o mediante los anteriormente mencionados sistemas tamponantes, o que sean transferidos en este estado. 5 a reduced and reactive state with mild reducing reagents, and / or by means of the aforementioned buffer systems, or that are transferred in this state.

Las respectivas regiones adecuadas para el acoplamiento específico de tiol están posicionadas en los dominios expuestos al disolvente de las proteínas de la cápside vírica, de forma que pueda realizarse el acoplamiento de los compañeros de acoplamiento. The respective regions suitable for the specific thiol coupling are positioned in the domains exposed to the solvent of the viral capsid proteins, so that the coupling partners can be coupled.

10 Algunos ejemplos de sitios de fijación adicionales para la inserción genética en ciertos loci de las proteínas de la cápside del adenovirus del tipo 5 se enumeran en la siguiente tabla: 10 Some examples of additional binding sites for genetic insertion in certain loci of adenovirus capsid type 5 proteins are listed in the following table:

Proteína Protein: Locus Sitio de inserción Locus Insertion site

base Pentona Pentona base: M22141, nt 435-2150 ID de la proteína: AAA42519.1 Sustitución de la secuencia AA: HAIRGDTFAT M22141, nt 435-2150 Protein ID: AAA42519.1 AA sequence replacement: HAIRGDTFAT

pIX/C Terminal pIX / C Terminal: AY339865, nt 3609-4031 ID de la proteína: AAQ19289.1 Fijado al C terminal de la secuencia AA: SSPPNAV AY339865, nt 3609-4031 Protein ID: AAQ19289.1 Fixed to C terminal of sequence AA: SSPPNAV

Hexona/bucle L1 Hexone / loop L1: AY339865, nt 18842-21700 ID de la proteína: AAQ19298.1 Sustitución de la secuencia wt-AA-: TIEAAAGNGDNLT AY339865, nt 18842-21700 Protein ID: AAQ19298.1 Replacing the wt-AA- sequence: TIEAAAGNGDNLT

Las partículas del vector adenovírico modificadas según la presente invención pueden aplicarse especialmente para propósitos terapéuticos para la terapia génica o para la vacunación, o para un análisis funcional y diagnóstico in vivo en seres humanos, primates u otros vertebrados como ganado, cerdos, aves, peces o roedores, o in vitro en cultivos 15 tisulares o celulares que comprenden células de vertebrados, en particular de seres humanos y primates como ganado, cerdos, aves, peces o roedores. Pueden heredarse alteraciones, alteraciones que están causadas, por ejemplo, por una mutación en un gen. Además, las partículas de vectores adenovíricos modificadas según la presente invención pueden usarse para el tratamiento de alteraciones adquiridas tales como, por ejemplo, enfermedades tumorales o alteraciones del sistema nervioso central tales como el síndrome de Parkinson. En estas 20 situaciones, es decir, en alteraciones genéticas o en alteraciones adquiridas, las partículas de vectores adenovíricos modificadas según la invención y portadoras de uno o más ácidos nucleicos se usan para permitir una transducción mejorada y/o selectiva de células in vitro e in vivo, con objeto de permitir la expresión de uno o más ácidos nucleicos terapéuticos en estas células. El experto en la materia está familiarizado con el uso de vectores víricos para el tratamiento de alteraciones genéticas o adquiridas, y pueden consultarse libros de texto y publicaciones para la 25 selección de ácidos nucleicos específicos para el tratamiento de alteraciones genéticas o adquiridas. El experto en la materia está familiarizado con las formas de administrar partículas de vectores víricos modificadas a individuos/animales, tales como, por ejemplo, mediante su administración por vía sistémica (por vía intravenosa, intraarterial), mediante su administración a través de orificios corporales o mediante una inyección local o una inyección con catéter en un tejido u órgano. Adicionalmente, las partículas de vectores adenovíricos modificadas 30 relevantes para la invención también pueden aplicarse como vacunas, por ejemplo, para la vacunación profiláctica frente al VIH u otras enfermedades infecciosas, o como vacuna tumoral. De hecho, el uso de partículas víricas modificadas para la vacunación profiláctica o terapéutica frente a infecciones o alteraciones neoplásicas es una aplicación preferida. Entre la comunidad científica se conoce bien que el uso de vectores víricos para la vacunación está frecuentemente alterado o incluso impedido por una inmunidad preexistente mediada por linfocitos B o T que The modified adenoviral vector particles according to the present invention can be applied especially for therapeutic purposes for gene therapy or for vaccination, or for a functional analysis and in vivo diagnosis in humans, primates or other vertebrates such as cattle, pigs, birds, fish or rodents, or in vitro in tissue or cell cultures comprising vertebrate cells, in particular from humans and primates such as cattle, pigs, birds, fish or rodents. Alterations, alterations that are caused, for example, by a mutation in a gene can be inherited. In addition, modified adenoviral vector particles according to the present invention can be used for the treatment of acquired disorders such as, for example, tumor diseases or alterations of the central nervous system such as Parkinson's syndrome. In these situations, that is, in genetic alterations or acquired alterations, the modified adenoviral vector particles according to the invention and carriers of one or more nucleic acids are used to allow an improved and / or selective transduction of cells in vitro and in alive, in order to allow the expression of one or more therapeutic nucleic acids in these cells. The person skilled in the art is familiar with the use of viral vectors for the treatment of genetic or acquired alterations, and textbooks and publications for the selection of specific nucleic acids for the treatment of genetic or acquired alterations can be consulted. The person skilled in the art is familiar with the ways of administering modified viral vector particles to individuals / animals, such as, for example, by administration systemically (intravenously, intraarterially), by administration through body orifices. or by a local injection or a catheter injection into a tissue or organ. Additionally, the modified adenoviral vector particles relevant to the invention can also be applied as vaccines, for example, for prophylactic vaccination against HIV or other infectious diseases, or as a tumor vaccine. In fact, the use of modified viral particles for prophylactic or therapeutic vaccination against neoplastic infections or alterations is a preferred application. Among the scientific community it is well known that the use of viral vectors for vaccination is frequently altered or even prevented by a pre-existing immunity mediated by B or T lymphocytes that

35 está dirigida contra el vector en particular que se usa para administrar el gen en particular. También, incluso si en un individuo no hay anticuerpos preexistentes contra el vector vírico que se usa para la vacunación, tras una primera aplicación del vector, habitualmente se desencadena una fuerte respuesta inmunitaria que impide una segunda administración del mismo vector vírico. 35 is directed against the particular vector that is used to administer the particular gene. Also, even if in an individual there are no pre-existing antibodies against the viral vector that is used for vaccination, after a first application of the vector, a strong immune response is usually triggered that prevents a second administration of the same viral vector.

La presente invención permite estrategias para sortear estos problemas mediante el acoplamiento específico de tiol The present invention allows strategies to overcome these problems by specific thiol coupling.

40 de reactivos protectores tales como polietilenglicol o de ligandos de marcaje, o de ambos, a la superficie de la partícula del vector vírico, evitando así el reconocimiento de estructuras de la superficie del vector vírico por parte del sistema inmunitario, y marcando al mismo tiempo el vector para las células y/u órganos de interés. 40 of protective reagents such as polyethylene glycol or labeling ligands, or both, to the surface of the viral vector particle, thus preventing recognition of viral vector surface structures by the immune system, and marking at the same time the vector for cells and / or organs of interest.

Los transgenes que pueden ser expresados por el genoma de la partícula del vector son críticos para la invención. Aquí puede tratarse, por ejemplo, de proteínas musculares, factores de coagulación, proteínas de membrana o Transgenes that can be expressed by the genome of the vector particle are critical to the invention. Here it can be, for example, muscle proteins, coagulation factors, membrane proteins or

45 proteínas reguladoras del ciclo celular. Un ejemplo de una proteína muscular es la distrofina, un ejemplo de una proteína secretada es el factor de coagulación VIII, un ejemplo de una proteína de membrana es la proteína reguladora transmembranal de la fibrosis quística (CFTR). Además, puede tratarse de genes que se originan en patógenos tales como, por ejemplo, el virus VIH del SIDA o virus o parásitos animales, y están siendo expresados por la partícula del vector vírico como una vacuna. 45 cell cycle regulatory proteins. An example of a muscular protein is dystrophin, an example of a secreted protein is coagulation factor VIII, an example of a membrane protein is the transmembrane cystic fibrosis regulatory protein (CFTR). In addition, it may be genes that originate from pathogens such as, for example, the HIV virus of AIDS or animal viruses or parasites, and are being expressed by the viral vector particle as a vaccine.

50 El uso de las partículas de vectores adenovíricos modificados relevantes para la invención puede producirse in vitro o in vivo. La transferencia génica in vitro se produce fuera del cuerpo, por ejemplo, añadiendo partículas del vector a un tejido o a las células de un cultivo celular. En la transferencia génica in vivo, las partículas se están aplicando de formas diferentes, dependiendo del tejido que va a ser transducido. Algunos ejemplos de las formas en las que las partículas del vector pueden aplicarse son inyección en el sistema de vasos arteriales o venosos, inyección directa en el tejido apropiado (por ejemplo, pulmón, hígado, cerebro, músculo), instilación en el órgano apropiado (por ejemplo, pulmón o tracto gastrointestinal) o aplicación directa en una superficie (por ejemplo, piel o vejiga). Las partículas del vector usadas para este propósito están modificadas químicamente con, por ejemplo, el ligando o el polímero protector mediante un acoplamiento específico de tiol del ligando en la superficie de la partícula del vector, de una forma tal que permite la interacción específica del ligando con su receptor objetivo y la subsiguiente captación de la partícula. The use of modified adenoviral vector particles relevant to the invention can occur in vitro or in vivo. In vitro gene transfer occurs outside the body, for example, by adding vector particles to a tissue or cells of a cell culture. In gene transfer in vivo, the particles are being applied in different ways, depending on the tissue to be transduced. Some examples of the ways in which vector particles can be applied are injection into the system of arterial or venous vessels, direct injection into the appropriate tissue (for example, lung, liver, brain, muscle), instillation in the appropriate organ ( for example, lung or gastrointestinal tract) or direct application on a surface (for example, skin or bladder). The vector particles used for this purpose are chemically modified with, for example, the ligand or the protective polymer by a specific thiol coupling of the ligand on the surface of the vector particle, in such a way that it allows the specific interaction of the ligand. with its target receptor and subsequent particle uptake.

La base de este procedimiento es la combinación relevante para la invención de modificaciones genéticas químicas de un dominio expuesto al disolvente de una proteína de la cápside de vectores adenovíricos, mediante lo que la modificación química se produce por la formación de enlaces covalentes y opcionalmente biorreversibles. Un aspecto central del procedimiento es mantener la integridad y las funciones biológicas naturales mediadas por las proteínas del núcleo y de la cápside de las partículas del vector modificadas; sólo deben alterarse las características de unión al receptor/características de fusión a la membrana. Las ventajas básicas se resumen como sigue: (i) producción de partículas de vectores para la modificación química de la cápside con procedimientos convencionales con altos rendimientos (ii) elevada flexibilidad con el uso de compañeros de acoplamiento, protección de la partícula, marcaje o aportación de nuevas características físicas o bioquímicas/catalíticas (iii) elevada especificidad de las modificaciones químicas de la cápside con una biorreversibilidad opcional. The basis of this procedure is the relevant combination for the invention of chemical genetic modifications of a domain exposed to the solvent of a capsid protein of adenoviral vectors, whereby the chemical modification is produced by the formation of covalent and optionally bioreversible bonds. A central aspect of the procedure is to maintain the integrity and natural biological functions mediated by the core and capsid proteins of the modified vector particles; only the receptor binding characteristics / membrane fusion characteristics should be altered. The basic advantages are summarized as follows: (i) production of vector particles for the chemical modification of the capsid with conventional procedures with high yields (ii) high flexibility with the use of coupling partners, particle protection, marking or contribution of new physical or biochemical / catalytic characteristics (iii) high specificity of the chemical modifications of the capsid with an optional bioreversibility.

También es ventajoso 1) la inserción genética selectiva de grupos tiol reactivos en la superficie de la cápside antes de la modificación química de las partículas del vector, (2) el potencial curso de secuencias para la modificación genética de las cápsides del vector sin características de unión al receptor conocidas, (3) las modificaciones químicas covalentes y opcionalmente biorreversibles post-produccionales, de al menos una parte de las cisteínas introducidas genéticamente, (4) la posibilidad de un acoplamiento covalente, y por lo tanto, estable, (5) el uso de secuencias para las modificaciones genéticas como base para la modificación química para la cual no hay una función natural descrita, (6) el uso de procedimientos que pueden usar específica y únicamente los grupos tiol reactivos introducidos genéticamente sin modificar covalentemente ningún aminoácido natural existente, (7) el uso de procedimientos que modifican específicamente el estado oxidativo de las partículas del vector (8) la evitación de la reticulación con la cápside a través de la elevada especificidad de las reacciones químicas usadas, (9) la posibilidad de la formación de enlaces (disulfuro) biorreversibles, es decir, reversibles en el medio reductor del endosoma o del citosol, (10) el uso de grupos reactivos pequeños (por ejemplo, maleinimidas) para la modificación química de las partículas del vector mediante la formación de enlaces covalentes, (11) la posibilidad de usar compañeros de acoplamiento no peptídicos /no proteicos, (12) la posibilidad de proteger las partículas del vector mediante la elección de los compañeros de acoplamiento apropiados. It is also advantageous 1) the selective genetic insertion of reactive thiol groups on the capsid surface before the chemical modification of the vector particles, (2) the potential sequence course for the genetic modification of the vector capsids without characteristics of known receptor binding, (3) the covalent and optionally bioreversible post-production chemical modifications of at least a portion of the genetically introduced cysteines, (4) the possibility of a covalent, and therefore, stable coupling, (5) the use of sequences for genetic modifications as a basis for chemical modification for which there is no natural function described, (6) the use of procedures that can be used specifically and only genetically introduced thiol reactive groups without covalently modifying any existing natural amino acid , (7) the use of procedures that specifically modify the oxidative state of the particles of the vector (8) the avoidance of cross-linking with the capsid through the high specificity of the chemical reactions used, (9) the possibility of the formation of bioreversible (disulfide) bonds, that is, reversible in the reducing medium of the endosome or cytosol, (10) the use of small reactive groups (eg, maleinimides) for the chemical modification of the vector particles through the formation of covalent bonds, (11) the possibility of using non-peptide coupling partners / non-protein, (12) the possibility of protecting vector particles by choosing the appropriate coupling partners.

Para la invención es esencial que con el presente procedimiento para la modificación de las partículas del vector para la transferencia génica se mantengan completamente las funciones biológicas naturales mediadas por proteínas de la cápside y del núcleo; sólo pueden alterarse las características de unión al receptor y/o de fusión a la membrana. For the invention it is essential that with the present process for the modification of the vector particles for gene transfer the natural biological functions mediated by capsid and core proteins be fully maintained; only the characteristics of receptor binding and / or membrane fusion can be altered.

La posibilidad de usar grupos tiol de residuos de cisteína que habían sido introducidos genéticamente en la partícula del vector para la modificación química de las partículas del vector modificando su estado oxidativo y manteniendo su integridad y función era inesperada y sorprendente por las siguientes razones: los procedimientos relevantes para la invención permiten la aplicación de reactivos reductores con la subsiguiente alquilación de los grupos tiol reducidos para la modificación química específica de los residuos de cisteína expuestos al disolvente de las partículas del vector modificadas genéticamente. Sorprendentemente, los inventores de la presente solicitud no pudieron observar la alquilación de la proteasa de cisteína vírica p23 de Ad5 ni en las partículas del vector con residuos de cisteína que fueron introducidos genéticamente en las proteínas de la cápside ni en las partículas de vector no modificadas genéticamente tras una reducción química y alquilación con partículas de nanooro monomaleimida. Además, no se detectaron cambios en la infectividad de las partículas habían sido reducidas y subsiguientemente tratadas con reactivos alquilantes en comparación con las partículas de control no tratadas. Según el presente estándar de conocimientos, se habría esperado que después de aplicar reactivos reductores y reactivos alquilantes se habrían alquilado no sólo los tioles expuestos al disolvente que fueron insertados genéticamente, sino adicionalmente también los tioles existentes de forma natural presentes en las proteínas de la cápside Hexona, base Pentona y Fibra, así como pV de la proteína del núcleo. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que tras la reducción de las partículas del vector adenovírico sin modificaciones genéticas, ninguna de estas proteínas era alquilada por las partículas de nanooro monomaleimida. Sin embargo, los residuos de cisteína introducidos genéticamente expuestos al disolvente pudieron ser alquilados con el mismo eficazmente y altamente específico. La alquilación selectiva y específica de los residuos de cisteína insertados genéticamente es una de las labores centrales del procedimiento aquí descrito. Los siguientes ejemplos explican la invención y no deberían considerarse como restrictivos. Si no se menciona de otro modo, se usaron procedimientos estándar de biología molecular, tales como los descritos por Sambrook y col., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. The possibility of using thiol groups of cysteine residues that had been genetically introduced into the vector particle for the chemical modification of the vector particles by modifying their oxidative state and maintaining their integrity and function was unexpected and surprising for the following reasons: the procedures Relevant to the invention allow the application of reducing reagents with the subsequent alkylation of the reduced thiol groups for the specific chemical modification of the cysteine residues exposed to the solvent of the genetically modified vector particles. Surprisingly, the inventors of the present application were unable to observe the alkylation of the viral cysteine protease p23 of Ad5 or in the particles of the vector with cysteine residues that were genetically introduced into the capsid proteins or in the unmodified vector particles genetically after a chemical reduction and alkylation with monomaleimide nanooro particles. In addition, no changes in the infectivity of the particles had been detected and subsequently treated with alkylating reagents compared to untreated control particles. According to the present standard of knowledge, it would have been expected that after applying reducing reagents and alkylating reagents, not only the thiols exposed to the solvent that were genetically inserted, but also the naturally occurring thiols present in the capsid proteins would have been also rented Hexone, base Pentona and Fiber, as well as pV of the core protein. Surprisingly, the inventors discovered that after the reduction of adenoviral vector particles without genetic modifications, none of these proteins were alkylated by the monomaleimide nanooro particles. However, the cysteine residues introduced genetically exposed to the solvent could be rented with it efficiently and highly specific. The selective and specific alkylation of genetically inserted cysteine residues is one of the central tasks of the process described here. The following examples explain the invention and should not be considered as restrictive. If not mentioned otherwise, standard molecular biology procedures were used, such as those described by Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

1. Producción de plásmidos pAd1Cys, pAd3Cys, pAd5Cys 1. Plasmid production pAd1Cys, pAd3Cys, pAd5Cys

Los plásmidos pAd1Cys, pAd3Cys, pAd5Cys son plásmidos infecciosos de vectores de primera generación que codifican para partículas de vectores adenovíricos que expresan EGFP delecionados en E1. Su producción se lleva a cabo en varias etapas que se describen como sigue. Plasmids pAd1Cys, pAd3Cys, pAd5Cys are infectious plasmids of first generation vectors encoding adenoviral vector particles expressing EGFP deleted in E1. Its production is carried out in several stages that are described as follows.

a) Producción de pFKG a) Production of pFKG

El pFKG está basado en el pEGFP-N1 (Clontech) y contiene un casete de expresión para el gen EGFP bajo el control del promotor del CMV humano. Para las subsiguientes etapas de clonación, fue necesario delecionar un sitio de restricción BstBI del casete de expresión con la formación del plásmido pFKG. Para esto se digirieron 10 µg de pEGFP-N1 (Clontech) 3 h a 37°C con 100 U de endonucleasa de restricción SalI en un volumen total de 100 µl de tampón de restricción A (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9). El ADN de la digestión se precipitó con etanol, se lavó durante 5 min a temperatura ambiente con etanol al 70% y se resuspendió en 95 µl de tampón de restricción B (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9). Se pipetearon 100 U de la endonucleasa de restricción XhoI en un volumen de 5 µl en la disolución y se incubaron 37°C durante 3 h. Esto fue seguido por una extracción de la disolución con fenol/cloroformo, una precipitación con etanol, y el ADN se resuspendió en 50 µ de Tris-HCl (Tris 10 mM, pH 7,5). Se disolvieron 100 ng del ADN con 400 U de ligasa T4 de ADN en un volumen total de 10 µl de tampón de ligación (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM, 25 µg/ml de albúmina sérica bovina) y se incubaron durante 12 h a temperatura ambiente. Se transformaron XL2-blue de Escherichia coli competentes en transformación (Stratagene) con 1 µl de esta disolución y se incubaron durante 14 h en placas de agar a 37°C. La preparación del ADN a partir de los clones se llevó a cabo con procedimientos estándar (Sambrook y col., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). The pFKG is based on pEGFP-N1 (Clontech) and contains an expression cassette for the EGFP gene under the control of the human CMV promoter. For subsequent cloning steps, it was necessary to delete a BstBI restriction site from the expression cassette with the formation of plasmid pFKG. For this, 10 µg of pEGFP-N1 (Clontech) 3 h at 37 ° C were digested with 100 U of SalI restriction endonuclease in a total volume of 100 µl of restriction buffer A (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, MgCl2 10 mM, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9). The digestion DNA was precipitated with ethanol, washed for 5 min at room temperature with 70% ethanol and resuspended in 95 µl of restriction buffer B (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, dithiothreitol 1 mM, pH 7.9). 100 U of the XhoI restriction endonuclease in a volume of 5 µl in the solution was pipetted and incubated 37 ° C for 3 h. This was followed by an extraction of the solution with phenol / chloroform, a precipitation with ethanol, and the DNA was resuspended in 50 µ of Tris-HCl (10 mM Tris, pH 7.5). 100 ng of the DNA was dissolved with 400 U of T4 DNA ligase in a total volume of 10 µl of ligation buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 25 µg / ml albumin bovine serum) and incubated for 12 h at room temperature. Competent transformation Escherichia coli XL2-blue (Stratagene) were transformed with 1 µl of this solution and incubated for 14 h in agar plates at 37 ° C. DNA preparation from the clones was carried out with standard procedures (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

b) Producción de pGS 109 b) Production of pGS 109

El pGS109 es un plásmido del vector Ad infeccioso de primera generación que codifica para partículas de adenovirus delecionadas en El y que portan el casete de expresión para EGFP de pFKG. Para la clonación del casete de expresión para EGFP de pFKG se usó el sitio único Pac I de pGS66 (Schiedner, 2000). Para esto se digirieron 10 µg de pGS66 con 100 U de tampón de endonucleasa de restricción Pac I en 100 µl de volumen total en tampón de restricción C durante 3 h a 37°C (Bis-Tris-Propan-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9). La disolución se extrajo con fenol/cloroformo, el ADN se precipitó con etanol, se resuspendió en 95 µl de tampón de polimerasa (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, dATP 50 µM, dTTP 50 µM, dCTP 50 µM, dGTP 50 µM, pH 7,9). Se añadieron 15 U de polimerasa de ADN T4 a la disolución en un volumen total de 5 µl y la disolución se incubó durante 15 min a 12°C. Subsiguientemente se llevaron a cabo una extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con etanol. El ADN se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 99 µl de tampón de restricción C. Se añadieron 10 U de CIP y se incubaron durante 1 h a 37°C. Subsiguientemente se llevaron a cabo una extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con etanol. El ADN se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 40 µl de Tris-HCl pH 7,9. Este ADN se denominó en lo sucesivo pGS66-Pac. Con objeto de clonar el casete de expresión para EGFP de pFKG en el sitio PacI con extremos romos, se digirieron 10 µg de pFKG en un volumen total de 100 µl de tampón de restricción D (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9) con 50 U de AflIII durante 5 h a 37°C y subsiguientemente se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 95 µl de tampón de restricción B. Se añadieron 100 U de AflIII al ADN (volumen total de la reacción: 100 l) y se digirieron durante 3 h a 37°C. Se añadieron dATP, dTTP, dCTP, dGTP a unas concentraciones finales de 33 µM cada uno y se añadieron 10 U de polimerasa de ADN I (Fragmento Klenow). La disolución se incubó durante 20 min a 30°C y los fragmentos de ADN resultantes se separaron mediante electroforesis en gel (gel de agarosa al 1%). El fragmento de AflII/III que contenía el casete de expresión para EGFP (longitud 1697 pb) se cortó del gel y se purificó mediante el kit de extracción en gel de Qiagen (Qiagen, Hilden), se precipitó con etanol y se resuspendió en 40 µl de Tris-HCl a pH 7,5. Para la ligación de este fragmento en el sitio Pac I de extremos romos de pGS66 se disolvieron 25 ng de los fragmentos con 100 ng de pGS66-Pac en un volumen total de 10 µl de tampón de ligación con 400 U de ligasa de ADN T4 y se incubaron durante 12 h a temperatura ambiente con la formación de pGS109. Se transformaron XL2-blue de Escherichia coli competentes en transformación (Stratagene) con 1 µl de esta disolución y se incubaron durante 14 h en placas de agar a 37°C. La preparación del ADN a partir de los clones se llevó a cabo con procedimientos estándar. Sólo se usó el ADN de un clon en las subsiguientes etapas, con lo que la orientación transcripcional del casete de expresión de EGFP en el clon usado subsiguientemente era paralela al promotor tardío principal del genoma del adenovirus. PGS109 is a first generation infectious Ad plasmid vector that encodes adenovirus particles deleted in El and carrying the expression cassette for EGFP of pFKG. For the cloning of the expression cassette for EGFP of pFKG, the single Pac I site of pGS66 was used (Schiedner, 2000). For this, 10 µg of pGS66 was digested with 100 U of Pac I restriction endonuclease buffer in 100 µl of total volume in restriction buffer C for 3 h at 37 ° C (10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM dithiothreitol, pH 7.9). The solution was extracted with phenol / chloroform, the DNA was precipitated with ethanol, resuspended in 95 µl of polymerase buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 50 µM dATP, 50 dTTP µM, 50 µM dCTP, 50 µM dGTP, pH 7.9). 15 U of T4 DNA polymerase was added to the solution in a total volume of 5 µl and the solution was incubated for 15 min at 12 ° C. Subsequently, an extraction with phenol / chloroform and a precipitation with ethanol were carried out. The DNA was washed with 70% ethanol and resuspended in 99 µl of restriction buffer C. 10 U of CIP was added and incubated for 1 h at 37 ° C. Subsequently, an extraction with phenol / chloroform and a precipitation with ethanol were carried out. The DNA was washed with 70% ethanol and resuspended in 40 µl of Tris-HCl pH 7.9. This DNA was referred to hereafter as pGS66-Pac. In order to clone the expression cassette for EGFP of pFKG at the PacI site with blunt ends, 10 µg of pFKG was digested in a total volume of 100 µl of restriction buffer D (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, MgCl2 10 mM, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9) with 50 U of AflIII for 5 h at 37 ° C and subsequently precipitated with ethanol and resuspended in 95 µl of restriction buffer B. 100 U of AflIII was added to the DNA ( total reaction volume: 100 l) and digested for 3 h at 37 ° C. DATP, dTTP, dCTP, dGTP were added at final concentrations of 33 µM each and 10 U of DNA I polymerase (Klenow Fragment) were added. The solution was incubated for 20 min at 30 ° C and the resulting DNA fragments were separated by gel electrophoresis (1% agarose gel). The AflII / III fragment containing the expression cassette for EGFP (length 1697 bp) was cut from the gel and purified by the Qiagen gel extraction kit (Qiagen, Hilden), precipitated with ethanol and resuspended in 40 µl of Tris-HCl at pH 7.5. For ligation of this fragment at the blunt-end Pac I site of pGS66, 25 ng of the fragments were dissolved with 100 ng of pGS66-Pac in a total volume of 10 µl of ligation buffer with 400 U of T4 DNA ligase and they were incubated for 12 h at room temperature with the formation of pGS109. Competent transformation Escherichia coli XL2-blue (Stratagene) were transformed with 1 µl of this solution and incubated for 14 h in agar plates at 37 ° C. DNA preparation from the clones was carried out with standard procedures. Only the DNA of one clone was used in subsequent stages, whereby the transcriptional orientation of the EGFP expression cassette in the subsequent clone was parallel to the main late promoter of the adenovirus genome.

c) Producción de pGS110 c) Production of pGS110

El pGS110 es un plásmido infeccioso de primera generación que codifica para partículas infecciosas de adenovirus, porta el casete de expresión para EGFP de pFKG y permite la inserción de secuencias de oligonucleótidos en el gen de la fibra. El gen de la fibra tiene, después del nt 32665 del adenovirus natural (Locus AY339865, gi: 33465857) una inserción con la secuencia TTAATTAAGACTAGTACAATCGAT, que permitió una simple clonación de inserciones adicionales a través de los sitios de restricción PacI y ClaI. Para la producción se digirieron 10 µg de pGS109 con 50 U de BstBI en un volumen total de 100 µl de tampón de restricción E (K-Acetat 50 mM, Tris-Acetat 20 mM, Mg-Acetat 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9) durante 2 h a 65°C. Después de enfriar hasta 37°C se añadieron 50 U de PmeI y se digirieron durante 4 h a 37°C. Los fragmentos se separaron en un gel de agarosa al 0,8% y el fragmento de 10 kB, que contiene el casete de expresión para EGFP de pFKG, se aisló del gel mediante el kit de extracción en gel de Qiagen (Qiagen, Hilden), se precipitó con etanol y se resuspendió en Tris-HCl 40 µl a pH 7,5. Este fragmento se denominó en lo sucesivo Ad-left-EGFP. Se digirieron 10 µg de pVB4 (Biermann, 2001) con 50 U de BstBI en un volumen total de 100 µl de tampón de restricción E durante 2 h a 65°C. Después de enfriar hasta 37°C se añadieron 50 U de PmeI y se digirieron durante 4 h a 37°C. Se añadieron 10 U de CIP y incubaron durante 1 h a 37°C. Los fragmentos se separaron en un gel de agarosa al 0,8% y el fragmento de 25 kB se aisló del gel mediante electroelución, se precipitó con etanol y se resuspendió en Tris-HCl 40 µl a pH 7,5. Este fragmento se denominó en lo sucesivo inserción Ad-right-Fiber. Se disolvieron 100 ng del fragmento inserción Ad-right-Fiber y 120 ng del fragmento Ad-left-EGFP en un volumen total de 10 µl de tampón de ligasa con 400 U de ligasa de ADN T4 y se incubaron durante 12 h a temperatura ambiente con la formación de pGS110. Se transformaron XL2-blue de Escherichia coli (Stratagene) con 1 µl de esta disolución y se incubaron durante 14 h en placas de agar a 37°C. La preparación del ADN a partir de los clones se llevó a cabo con procedimientos estándar. PGS110 is a first-generation infectious plasmid that encodes infectious adenovirus particles, carries the expression cassette for EGFP of pFKG and allows the insertion of oligonucleotide sequences into the fiber gene. The fiber gene has, after nt 32665 of the natural adenovirus (Locus AY339865, gi: 33465857) an insertion with the sequence TTAATTAAGACTAGTACAATCGAT, which allowed a simple cloning of additional insertions through the PacI and ClaI restriction sites. For production, 10 µg of pGS109 was digested with 50 U of BstBI in a total volume of 100 µl of restriction buffer E (50 mM K-Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9) for 2 h at 65 ° C. After cooling to 37 ° C, 50 U of PmeI was added and digested for 4 h at 37 ° C. The fragments were separated on a 0.8% agarose gel and the 10 kB fragment, which contains the expression cassette for pFKG EGFP, was isolated from the gel by the Qiagen gel extraction kit (Qiagen, Hilden) , was precipitated with ethanol and resuspended in 40 µl Tris-HCl at pH 7.5. This fragment was referred to as Ad-left-EGFP. 10 µg of pVB4 (Biermann, 2001) was digested with 50 U of BstBI in a total volume of 100 µl of restriction buffer E for 2 h at 65 ° C. After cooling to 37 ° C, 50 U of PmeI was added and digested for 4 h at 37 ° C. 10 U of CIP were added and incubated for 1 h at 37 ° C. The fragments were separated on a 0.8% agarose gel and the 25 kB fragment was isolated from the gel by electroelution, precipitated with ethanol and resuspended in 40 µl Tris-HCl at pH 7.5. This fragment was referred to as the Ad-right-Fiber insert. 100 ng of the Ad-right-Fiber insert fragment and 120 ng of the Ad-left-EGFP fragment were dissolved in a total volume of 10 µl of ligase buffer with 400 U of T4 DNA ligase and incubated for 12 h at room temperature with the formation of pGS110. Escherichia coli (Stratagene) XL2-blue was transformed with 1 µl of this solution and incubated for 14 h in agar plates at 37 ° C. DNA preparation from the clones was carried out with standard procedures.

d) Producción de pAd1Cys d) Production of pAd1Cys

Para la producción de pAd1Cys, un plásmido de un vector infeccioso de primera generación que codifica para partículas de vectores adenovíricos delecionadas en E1, que porta un casete de expresión para EGFP y que porta la secuencia de oligonucleótidos 5’-TTAATTGGCGGCGGATGCGGTGGCGGCATCGAT-3’ (ID. SEC. Nº: 4), que codifica para la secuencia de aminoácidos LIGGGCGGGID insertada después del aminoácido (aa) 543 de la fibra del adenovirus natural (AAQ19310.1)), se digirieron 10 µg de pGS110 en un volumen total de 100 µl de tampón de restricción C con 100 U de PacI durante 2 h. El ADN se precipitó con etanol y se resuspendió en 90 µl de tampón de restricción E. Se añadieron 50 U de ClaI en un volumen de 10 µl y la mezcla se incubó durante 3 h a 37°C. Se añadieron 10 U de CIP, se incubaron durante 1 h a 37°C, el ADN se sometió a una extracción con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 40 µl de Tris-HCl a pH 7,5. Este ADN se denominó en lo sucesivo GS110-CIP. Se hirvieron 1 µg de los los oligodesoxirribonucleótidos 5’-fosforilados producidos sintéticamente 1Cys-seq (5’-TGGCGGCGGATGCGGTGGCGGCAT-3’) (ID. SEC. Nº: 7) así como 1Cysrev (5’-CGATGCCGCCACCGCATC-CGCCGCCAAT-3’) (ID. SEC. Nº: 8) en 40 µl de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM durante 5 min en un baño de agua y se enfriaron lentamente hasta la temperatura ambiente. El ADN bicatenario así formado se denominó en lo sucesivo OligolCys. Se ligaron 100 ng de GS110-CIP en un total of 10 µl de tampón de ligación con 1 ng de Oligo1Cys y 400 U de ligasa de ADN T4 con la formación de pAd1Cys. Se transformaron XL2blue de Escherichia coli (Stratagene) competentes con 1 µl de esta disolución y se incubaron durante 14 h en placas de agar a 37°C. La preparación del ADN a partir de los clones se llevó a cabo con procedimientos estándar. For the production of pAd1Cys, a first generation infectious vector plasmid encoding particles of adenoviral vectors deleted in E1, carrying an expression cassette for EGFP and carrying the 5'-TTAATTGGCGGCGGATGCGGTGGCGGCATCGAT-3 'oligonucleotide sequence. SEC No.: 4), which codes for the LIGGGCGGGID amino acid sequence inserted after amino acid (aa) 543 of the natural adenovirus fiber (AAQ19310.1)), 10 µg of pGS110 was digested in a total volume of 100 µl of restriction buffer C with 100 U of PacI for 2 h. The DNA was precipitated with ethanol and resuspended in 90 µl of restriction buffer E. 50 U of ClaI was added in a volume of 10 µl and the mixture was incubated for 3 h at 37 ° C. 10 U of CIP were added, incubated for 1 h at 37 ° C, the DNA was subjected to a phenol / chloroform extraction, precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol and resuspended in 40 µl of Tris-HCl at pH 7.5. This DNA was hereinafter referred to as GS110-CIP. 1 µg of the synthetically produced 5'-phosphorylated oligodeoxyribonucleotides 1Cys-seq (5'-TGGCGGCGGATGCGGTGGCGGCAT-3 ') (SEQ ID NO: 7) as well as 1Cysrev (5'-CGATGCCGCCAC-CCGCATCCCCCCCG) SEQ ID NO: 8) in 40 µl of 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA for 5 min in a water bath and slowly cooled to room temperature. The double stranded DNA thus formed was hereinafter referred to as OligolCys. 100 ng of GS110-CIP were ligated into a total of 10 µl of ligation buffer with 1 ng of Oligo1Cys and 400 U of T4 DNA ligase with the formation of pAd1Cys. Competent Escherichia coli (Stratagene) XL2blue were transformed with 1 µl of this solution and incubated for 14 h in agar plates at 37 ° C. DNA preparation from the clones was carried out with standard procedures.

e) Producción de pAd3Cys e) Production of pAd3Cys

La producción de pAd3Cys, un plásmido de un vector infeccioso de primera generación que codifica para partículas de vectores adenovíricos delecionadas en E1, que porta un casete de expresión para EGFP y la secuencia de oligonucleótidos 5’-TTAATT-GGCTGCGGATGCGGTTGCGGCATCGAT-3’ (ID. SEC. Nº: 5) que codifica para la secuencia de aminoácidos LIGCGCGCGID (insertada después del aa 543 de la fibra del adenovirus natural (AAQ19310.1)), se corresponde en sus procedimientos con la producción de pAd1Cys, pero se usaron los oligodesoxirribonucleótidos 5’-fosforilados 3Cys-seq (5’-TGGCTGCGGATGCGGTTGCGGCAT-3’)(ID. SEC. Nº: 9) y 3Cys-rev (5’-CGATGCCGCAACCGCATCCGCAGCCAAT-3’) (ID. SEC. Nº: 10) en lugar de 1Cys-seq y 1Cys-rev. The production of pAd3Cys, a first generation infectious vector plasmid encoding particles of adenoviral vectors deleted in E1, which carries an expression cassette for EGFP and the oligonucleotide sequence 5'-TTAATT-GGCTGCGGATGCGGTTGCGGCATCGAT-3 '(ID. SEC. Nº: 5) which codes for the amino acid sequence LIGCGCGCGID (inserted after aa 543 of the natural adenovirus fiber (AAQ19310.1)), corresponds in its procedures with the production of pAd1Cys, but oligodeoxyribonucleotides 5 were used '-phosphorylated 3Cys-seq (5'-TGGCTGCGGATGCGGTTGCGGCAT-3') (SEQ ID NO: 9) and 3Cys-rev (5'-CGATGCCGCAACCGCATCCGCAGCCAAT-3 ') (SEQ ID NO: 10) instead of 1Cys -seq and 1Cys-rev.

f) Producción de pAd5Cys f) Production of pAd5Cys

La producción de pAd5Cys, un plásmido de un vector infeccioso de primera generación que codifica para partículas de vectores adenovíricos delecionadas en E1, que porta un casete de expresión para EGFP y la secuencia de oligonucleótidos 5’-TTAATTT-GCTGTTGTTGCTGCATCGAT-3’ (ID. SEC. Nº: 6), que codifica para la secuencia de aminoácidos LICCCCCID (insertada después del aa 543 de la fibra del adenovirus natural (AAQ19310.1)), se corresponde en sus procedimientos con la producción de pAd1Cys, pero se usaron los oligodesoxirribonucleótidos 5’-fosforilados 5Cys-seq (5’-TTGCTGTTGTTGCTGCAT-3’) (ID. SEC. Nº: 11) y 5Cys-rev (5’-CGATGCAGCAACAACAGCAAAT-3’) (ID. SEC. Nº: 12) en lugar de 1Cys-seq y 1Cys-rev. The production of pAd5Cys, a first generation infectious vector plasmid encoding particles of adenoviral vectors deleted in E1, which carries an expression cassette for EGFP and the oligonucleotide sequence 5'-TTAATTT-GCTGTTGTTGCTGCATCGAT-3 '(ID. SEQ. No. 6), which codes for the amino acid sequence LICCCCCID (inserted after aa 543 of the natural adenovirus fiber (AAQ19310.1)), corresponds in its procedures with the production of pAd1Cys, but oligodeoxyribonucleotides were used 5'-phosphorylated 5Cys-seq (5'-TTGCTGTTGTTGCTGCAT-3 ') (SEQ ID NO: 11) and 5Cys-rev (5'-CGATGCAGCAACAACAGCAAAT-3') (SEQ ID NO: 12) instead of 1Cys-seq and 1Cys-rev.

2. Producción de partículas de vector 2. Production of vector particles

Para la producción de las partículas del vector, se linealizaron los plásmidos pAd1Cys, pAd3Cys y pAd5Cys con SwaI y se transfectaron 4-6 µg de los plásmidos linealizados mediante procedimientos de transfección estándar en células 1-2E+06 N52E6. Estas plásmidos son plásmidos lanzadera adenovíricos infecciosos para la producción de partículas de vector de primera generación delecionadas en E1, que se replican en líneas celulares transcomplementarias de E1 tales como N52E6 y pueden producir partículas del vector. El experto en la materia está familiarizado con los procedimientos para la producción de las correspondientes partículas del vector Ad. Debería mencionarse que los tampones usados para la lisis celular estaban invariablemente saturados con oxígeno atmosférico. La purificación de las partículas del vector se llevó a cabo mediante un gradiente de densidad por etapas en CsCl seguido por dos gradientes de densidad continuos en CsCl. For the production of the vector particles, plasmids pAd1Cys, pAd3Cys and pAd5Cys were linearized with SwaI and 4-6 µg of the linearized plasmids were transfected by standard transfection procedures in 1-2E + 06 N52E6 cells. These plasmids are infectious adenoviral shuttle plasmids for the production of first-generation vector particles deleted in E1, which replicate in transcomplementary E1 cell lines such as N52E6 and can produce vector particles. The person skilled in the art is familiar with the procedures for the production of the corresponding particles of the Ad vector. It should be mentioned that the buffers used for cell lysis were invariably saturated with atmospheric oxygen. Purification of the particles of the vector was carried out by a step density gradient in CsCl followed by two continuous density gradients in CsCl.

Tras la observación de agregados macroscópicos en el gradiente por etapas en CsCl con Ad5Cys estos agregados se retiraron del gradiente, se trataron durante 1 h con DTT 10 mM o TCEP 10 mM o ascorbato 50 mM y se añadieron las mismas concentraciones del mismo reactivo reductor al subsiguiente gradiente de densidad continuo de CsCl. Alternativamente, para Ad5Cys, el tampón en el que las células fueron lisadas antes de cargar el gradiente por etapas en CsCl, también se complementó con los anteriormente mencionados reactivos reductores. El experto en la materia está familiarizado con las técnicas de centrifugación en gradiente de densidad continuo y por etapas en CsCl. La desalinización de las partículas del vector después del segundo gradiente por etapas continuo en CsCl se llevó a cabo con tamices moleculares basados en Sephadex G-25. El experto en la materia está familiarizado con estas técnicas de desalinización. After observation of macroscopic aggregates in the CsCl stage gradient with Ad5Cys, these aggregates were removed from the gradient, treated for 1 h with 10 mM DTT or 10 mM TCEP or 50 mM ascorbate and the same concentrations of the same reducing reagent were added to the subsequent gradient of continuous density of CsCl. Alternatively, for Ad5Cys, the buffer in which the cells were lysed before loading the gradient in steps in CsCl was also supplemented with the aforementioned reducing reagents. The person skilled in the art is familiar with continuous density gradient centrifugation techniques and CsCl stages. Desalination of vector particles after the second continuous step gradient in CsCl was carried out with molecular sieves based on Sephadex G-25. The person skilled in the art is familiar with these desalination techniques.

Las partículas del vector se almacenaron en TBS o PBS más un 10% de glicerol a -80°C. Para Ad5Cys se añadieron los reactivos reductores TCEP 10 mM o DTT 10 mM o ascorbato 50 mM. Los rendimientos de las partículas del vector se determinaron tras la purificación y la desalinización con procedimientos estándar con los que está familiarizado el experto en la materia (midiendo la densidad óptica tras la lisis de la partícula, midiendo el contenido en proteínas, midiendo las unidades infecciosas con un ensayo basado en ADN, midiendo el número total de partículas con un ensayo basado en ADN). Aquí pudo apreciarse que, en comparación con las partículas de vector de primera generación no modificadas, la inserción genética de residuos de cisteína en la superficie de la cápside no tuvo efectos negativos relativos a los rendimientos. Las bioactividades invertidas de las preparaciones de las partículas del vector no mostraron diferencias significativas en comparación con las preparaciones de partículas del vector con la cápside sin modificar. Vector particles were stored in TBS or PBS plus 10% glycerol at -80 ° C. For Ad5Cys, 10 mM TCEP or 10 mM DTT or 50 mM ascorbate reducing reagents were added. The yields of the particles of the vector were determined after purification and desalination with standard procedures with which the person skilled in the art is familiar (measuring the optical density after the lysis of the particle, measuring the protein content, measuring the infectious units with a DNA based assay, measuring the total number of particles with a DNA based assay). Here it could be seen that, compared to unmodified first generation vector particles, the genetic insertion of cysteine residues on the capsid surface had no negative effects on yields. The inverted bioactivities of the vector particle preparations showed no significant differences compared to the vector particle preparations with the unmodified capsid.

3.3.: Medición de los agregados Aggregate Measurement

La identificación de la formación espontánea de agregados en tampones que estaban saturados con oxígeno atmosférico se llevó a cabo con una espectroscopia de correlación fotónica PCS. Se tomó el índice de polidispersidad (PI) de los ensayos individuales como una medida de la existencia de partículas con tamaños ampliamente diferentes, y por lo tanto de la existencia de agregación de partículas. El experto en la materia está familiarizado con este procedimiento. Pudo demostrarse por tanto que las partículas de los vectores Ad1Cys y Ad3Cys formaban espontáneamente agregados pequeños pero solubles (PI: 0,5-1,0, vector de control no modificado: 0,05), que sorprendentemente no interferían con la purificación y las funciones biológicas mediadas por las proteínas del núcleo y de la cápside de la partícula del vector, incluyendo la unión al receptor. Además, también pudo demostrarse que añadiendo reactivos reductores, la formación de los agregados es reversible. La formación controlable y reversible de agregados de partículas sirve como ejemplo del acoplamiento biorreversible, es decir, reversible en las condiciones reductoras del endosoma/citosol, de las moléculas a través de puentes de disulfuro. The identification of spontaneous formation of aggregates in buffers that were saturated with atmospheric oxygen was carried out with a PCS photonic correlation spectroscopy. The polydispersity index (PI) of the individual tests was taken as a measure of the existence of particles with widely different sizes, and therefore of the existence of particle aggregation. The person skilled in the art is familiar with this procedure. It could therefore be shown that the particles of the Ad1Cys and Ad3Cys vectors spontaneously formed small but soluble aggregates (PI: 0.5-1.0, unmodified control vector: 0.05), which surprisingly did not interfere with purification and biological functions mediated by the nucleus and capsid proteins of the vector particle, including receptor binding. In addition, it could also be demonstrated that by adding reducing reagents, the formation of the aggregates is reversible. The controllable and reversible formation of particle aggregates serves as an example of the bioreversible coupling, that is, reversible under the reducing conditions of the endosome / cytosol, of the molecules through disulfide bridges.

4.Four.: Medición de las funciones biológicas mediadas por las proteínas del núcleo y de la cápside de partículas de vectores modificadas, oxidadas y reducidas. Measurement of biological functions mediated by nucleus and capsid proteins of modified, oxidized and reduced vector particles.

Se verificó la función biológica de las partículas del vector en el sentido de una eficiente transferencia génica en experimentos de transducción con células A549 y análisis basados en citometría de flujo de la expresión transgénica (EGFP). Aquí pudo demostrarse que tanto con como sin la aplicación de reactivos reductores, las funciones biológicas mediadas por las proteínas del núcleo y de la cápside de las partículas del vector no estaban inhibidas. Tras una reducción con diferentes reactivos reductores (TCEP 10 mM, DTT 10 mM, ascorbato 50 mM), las partículas del vector modificadas eran capaces de transducir la mencionada línea celular con la misma eficacia de las partículas del vector de control sin tratar modificadas y no modificadas. The biological function of the vector particles was verified in the sense of efficient gene transfer in transduction experiments with A549 cells and analyzes based on transgenic expression flow cytometry (EGFP). Here it could be demonstrated that both with and without the application of reducing reagents, the biological functions mediated by the nucleus and capsid proteins of the vector particles were not inhibited. After a reduction with different reducing reagents (10 mM TCEP, 10 mM DTT, 50 mM ascorbate), the modified vector particles were capable of transducing said cell line with the same efficiency of the modified untreated control vector particles and not modified.

5.5.: Marcaje con oro Gold marking

A alquilados específicos de tiol y mediados por maleimida las partículas del vector modificadas genéticamente el mismo número de partículas de las diferentes preparaciones de partículas del vector (Ad1Cys Ad3Cys, Ad5Cys, partículas de vector de control no modificadas) se incubó con un exceso molar de 100 veces de partículas de nanooro monomaleimida (Sondas Moleculares) durante 24h a 4°C con y sin la adición de TCEP 10 mM. La reacción se detuvo mediante la adición de cisteína 1 µmol. El análisis del acoplamiento se llevó a cabo mediante SDS-PAGE seminatural con la subsiguiente tinción de plata específica para oro. Aquí fue inesperado y muy sorprendente observar que el acoplamiento del oro se producía sólo con las proteínas de fibra modificadas genéticamente y no con la proteasa vírica p23, la proteína del núcleo V o las proteínas de la cápside Hexona o base Pentona. Este acoplamiento específico se corresponde con las bandas a 270 kDa. Este tamaño se pone junto con el de los trímeros de fibra (aprox. 200 kDa) más tres partículas de oro por trímero de fibra (conjuntamente aprox. 70 kDa). Después de la purificación de la partícula del vector, sorprendentemente pudo observarse también especificidad para la región de los pesos moleculares pequeños. Además, fue sorprendente observar que incluso sin la aplicación de reactivos reductores, las preparaciones de partículas del vector Ad1Cys y Ad3Cys mostraron grupos tioles reducidos expuestos al disolvente que eran accesibles para una alquilación eficiente (hasta tres partículas de oro por trímero de fibra). At specific thiol alkylated and maleimide mediated particles of the genetically modified vector the same number of particles of the different vector particle preparations (Ad1Cys Ad3Cys, Ad5Cys, unmodified control vector particles) was incubated with a molar excess of 100 times of monomaleimide nanooro particles (Molecular Probes) for 24 hours at 4 ° C with and without the addition of 10 mM TCEP. The reaction was stopped by the addition of 1 µmol cysteine. Coupling analysis was carried out by seminatural SDS-PAGE with subsequent gold-specific silver staining. Here it was unexpected and very surprising to observe that the coupling of gold occurred only with the genetically modified fiber proteins and not with the viral protease p23, the V-core protein or the Hexone capsid or Pentona base proteins. This specific coupling corresponds to the 270 kDa bands. This size is put together with that of the fiber trimers (approx. 200 kDa) plus three gold particles per fiber trimmer (together approx. 70 kDa). After purification of the vector particle, surprisingly, specificity for the region of small molecular weights could also be observed. In addition, it was surprising to note that even without the application of reducing reagents, the Ad1Cys and Ad3Cys vector particle preparations showed reduced thiol groups exposed to the solvent that were accessible for efficient alkylation (up to three gold particles per fiber trimer).

6.6.: Acoplamiento de transferrina sobre partículas del vector Ad1Cys no reducidas como ejemplo de una alquilación específica con efecto de remarcaje Transferrin coupling on unreduced Ad1Cys vector particles as an example of a specific alkylation with a remarking effect

Para modificar específicamente los grupos tiol introducidos genéticamente en la superficie de la partícula del vector To specifically modify the thiol groups genetically introduced into the surface of the vector particle

Ad1Cys mediante una alquilación mediada por maleimida con derivados de transferrina, se incubó 1 mg de apotransferrina con 0,021 mg de N-hidroxisuccinimid-polietilenglicol-3400-maleimida en un volumen total 200 µl de PBS desgasificado y subsiguientemente saturado con argón durante 4 h a temperatura ambiente. Se añadió un µl de esta reacción a partículas del vector 1E+011 Ad1Cys en un volumen de 80 µl de PBS/10% de glicerol. Esta reacción 5 de alquilación se incubó en una atmósfera de argón durante 20 h a temperatura ambiente. Tras la alquilación, se usó la preparación de partículas del vector modificadas para transducir células 5E+05 K562 con cifras de partículas crecientes de 100, 1000 y 5000 partículas por célula. Inmediatamente antes de la transducción se añadieron 3 µl de una disolución de citrato de Fe(III) 1 mM por 350 µl medio de cultivo celular, con objeto de reconstituir la transferrina que se había acoplado a las partículas del vector. Como controles se usaron las mismas cifras de partículas del 10 vector no alquiladas y partículas no alquiladas mezcladas con transferrina libre, así como las mismas cifras de partículas de un vector con la cápside no modificada. Se determinó el número de células que expresaban EGFP mediante citometría de flujo 30 h después de la transducción. La Tabla 1 aporta una visión global del porcentaje de células positivas en EGFP en los experimentos individuales. Se enumeran las medias de 4 experimentos independientes. Los datos demuestran que los autores tuvieron sorprendentemente éxito para alquilar las cisteínas Ad1Cys by a maleimide-mediated alkylation with transferrin derivatives, 1 mg of apotransferrin was incubated with 0.021 mg of N-hydroxysuccinimid-polyethylene glycol-3400-maleimide in a total volume 200 µl of degassed PBS and subsequently saturated with argon for 4 h at room temperature . One µl of this reaction was added to particles of vector 1E + 011 Ad1Cys in a volume of 80 µl of PBS / 10% glycerol. This alkylation reaction was incubated in an argon atmosphere for 20 h at room temperature. After alkylation, the preparation of modified vector particles was used to transduce 5E + 05 K562 cells with increasing particle numbers of 100, 1000 and 5000 particles per cell. Immediately before transduction, 3 µl of a 1 mM Fe (III) citrate solution was added by 350 µl cell culture medium, in order to reconstitute the transferrin that had coupled to the vector particles. As controls were used the same figures of particles of the non-alkylated vector and non-alkylated particles mixed with free transferrin, as well as the same figures of particles of a vector with unmodified capsid. The number of cells expressing EGFP was determined by flow cytometry 30 h after transduction. Table 1 provides an overview of the percentage of positive cells in EGFP in individual experiments. The averages of 4 independent experiments are listed. The data show that the authors were surprisingly successful in renting the cysteines

15 libres sobre la superficie de las partículas del vector mediante la transferrina modificada con maleimida incluso sin reducción e incluso después de identificar pequeños agregados de partículas del vector mediante espectroscopia de correlación fotónica. Además, mediante esta reacción de alquilación específica se alteraron con éxito las características de unión al receptor de las partículas. Esto no era obvio a partir de los datos publicados. 15 free on the surface of vector particles by maleimide modified transferrin even without reduction and even after identifying small aggregates of vector particles by photonic correlation spectroscopy. In addition, through this specific alkylation reaction, the receptor binding characteristics of the particles were successfully altered. This was not obvious from the published data.

Tabla 1: Table 1:

Partículas del vector Vector particles: 100 partículas/célula 1000 partículas/célula 5000 partículas/célula 100 particles / cell 1000 particles / cell 5000 particles / cell

Partículas libres de vector de control no modificadas sin Tf Free unmodified control vector particles without Tf: 11,87% 45,49% 79,65% 11.87% 45.49% 79.65%

Ad1Cys libre sin Tf Ad1Cys free without Tf: 9,17% 47,42% 83,02% 9.17% 47.42% 83.02%

Ad1Cys libre con Tf libres Ad1Cys free with free Tf: 9,30% 47,47% 83,51% 9.30% 47.47% 83.51%

Ad1Cys con Tf acoplada por maleimida Ad1Cys with Tf coupled by maleimide: 46,73% 90,49% 94,42% 46.73% 90.49% 94.42%

20 7. Ejemplo de una alquilación tras la reducción: el acoplamiento de transferrina a partículas reducidas del vector Ad5Cys no interfiere con la infectividad de la partícula del vector 20 7. Example of an alkylation after reduction: transferrin coupling to reduced particles of the Ad5Cys vector does not interfere with the infectivity of the vector particle

Se usó el mismo procedimiento según se describió anteriormente para alquilar con transferrina partículas del vector 1E+010 Ad5Cys que habían sido reducidas con TCEP 10 mM. Se transdujeron K562 y 36 h después de la transducción las células se analizaron mediante citometría de flujo. La Tabla 2 muestra los resultados (medias de 2 The same procedure as described above was used to rent with transferrin particles of the 1E + 010 Ad5Cys vector that had been reduced with 10 mM TCEP. K562 were transduced and 36 h after transduction the cells were analyzed by flow cytometry. Table 2 shows the results (averages of 2

25 experimentos independientes). Esto muestra sorprendentemente que tras la reducción y la alquilación no se produce pérdida en la infectividad de las partículas del vector. Esto se correlaciona bien con los resultados de los experimentos de marcaje con oro que no mostraron alquilación de la proteasa vírica. No pudo observarse un efecto de marcaje significativo en este experimento porque en condiciones reductoras la transferrina se redujo y no fue capaz de unir el hierro, y por lo tanto perdió su capacidad de unirse al receptor de transferrina 25 independent experiments). This surprisingly shows that after reduction and alkylation there is no loss in the infectivity of the vector particles. This correlates well with the results of the gold labeling experiments that showed no alkylation of the viral protease. A significant labeling effect could not be observed in this experiment because under reducing conditions transferrin was reduced and was not able to bind iron, and therefore lost its ability to bind to transferrin receptor

30 Tabla 2: 30 Table 2:

Ad5Cys reducido, sin Tf Ad5Cys reduced, without Tf: 3,88% 32,29% 63,91% 3.88% 32.29% 63.91%

Ad5Cys reducido, con Tf libre Ad5Cys reduced, with free Tf: 5,78% 42,75% 75,33% 5.78% 42.75% 75.33%

8. Ejemplo de modificación química específica de grupos tiol introducidos genéticamente tras la modificación de la superficie de las partículas del vector mediante PEGilación con un derivado de PEG activado electrofílicamente reactivo con aminas. 8. Example of specific chemical modification of thiol groups genetically introduced after the modification of the surface of the particles of the vector by PEGylation with an electrophilically activated activated PEG derivative with amines.

Para la aminoPEGilación, se usó mPEG2000-SPA (Nektar Therapeutics). A partículas físicas 5E+010 de Ad1Cys en For aminoPEGylation, mPEG2000-SPA (Nektar Therapeutics) was used. A 5E + 010 physical particles of Ad1Cys in

35 un volumen total de 100 µl de tampón HEPES 50 mM burbujeado con argón, pH 7,3, se añadieron 0,3 mg de mPEG2000-SPA y se hicieron reaccionar en argón durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se extinguió mediante la adición de un exceso de 1,5 veces de lisina libre sobre moléculas de mPEG-SPA reactivas y la incubación a temperatura ambiente durante 2 h en una atmósfera de argón. Finalmente, para fijar la transferrina a los tioles de las partículas del vector PEGiladas, se añadió transferrina modificada con NHS-PEG3400-Mal en un A total volume of 100 µl of 50 mM HEPES buffer bubbled with argon, pH 7.3, 0.3 mg of mPEG2000-SPA was added and reacted in argon for 3 h at room temperature. The reaction was quenched by the addition of a 1.5-fold excess of free lysine on reactive mPEG-SPA molecules and incubation at room temperature for 2 h under an argon atmosphere. Finally, to fix the transferrin to the thiols of the PEGylated vector particles, NHS-PEG3400-Mal modified transferrin was added in a

40 exceso molar de 5 veces sobre los residuos de cisteína y se hizo reaccionar hasta el día siguiente en argón (véase el ejemplo 6). Tras un día de reacción, las partículas se usaron para transducir células K562 de la misma forma según se describe en el ejemplo 6 y 24 h después se determinó el número de células que expresaban EGFP mediante citometría de flujo. La Figura 2 muestra un resultado típico para un vector no modificado químicamente (Ad1Cys), un vector aminoPEGilado sin modificación específica de tiol ("Ad1Cys + SPA-PEG") y un vector 40 molar excess of 5 times on the cysteine residues and reacted until the next day under argon (see example 6). After one day of reaction, the particles were used to transduce K562 cells in the same manner as described in example 6 and 24 h later the number of cells expressing EGFP was determined by flow cytometry. Figure 2 shows a typical result for a chemically unmodified vector (Ad1Cys), an aminoPEGylated vector without specific thiol modification ("Ad1Cys + SPA-PEG") and a vector

45 aminoPEGilado y subsiguientemente modificado en tiol portador de transferrina fijada covalentemente a los grupos tiol introducidos genéticamente ("Ad1Cys + SPA-PEG + Tf-Mal"). El vector aminoPEGilado mostró una eficacia de transducción significativamente reducida en comparación con el vector Ad1Cys no modificado. Sorprendentemente, tras la modificación adicional del vector aminoPEGilado con maleimida-transferrina reactiva frente a tiol (véase el ejemplo 6), las partículas del vector mostraron un incremento significativo en la eficacia de transducción en células K562. Esto demuestra que 1) tras la aminoPEGilación con un PEG reactivo frente a aminas, los grupos tiol introducidos genéticamente en la superficie de las partículas del vector permanecen accesibles para el acoplamiento químico, y 2) que esto puede usarse para el remarcaje de dichas partículas de vector PEGiladas portadoras de tiol en la vía del receptor de transferrina mediante el acoplamiento químico de transferrina a la superficie de la partícula del vector. Fue inesperado y muy sorprendente que los grupos tiol permanecieran accesibles para la modificación química con compañeros de acoplamiento grandes como la transferrina tras la modificación de la superficie de las partículas del vector con un reactivo protector como mPEG-SPA2000. AminoPEGylated and subsequently modified in transferrin-carrying thiol covalently bound to the genetically introduced thiol groups ("Ad1Cys + SPA-PEG + Tf-Mal"). The aminoPEGylated vector showed significantly reduced transduction efficiency compared to the unmodified Ad1Cys vector. Surprisingly, after further modification of the aminoPEGylated vector with maleimide-transferrin reactive to thiol (see example 6), the particles of the vector showed a significant increase in transduction efficiency in K562 cells. This demonstrates that 1) after aminoPEGylation with a reactive PEG against amines, the thiol groups genetically introduced into the surface of the vector particles remain accessible for chemical coupling, and 2) that this can be used for the remarking of said particles of PEGylated vector carrying thiol in the transferrin receptor pathway by chemical transferrin transfer to the surface of the vector particle. It was unexpected and very surprising that the thiol groups remained accessible for chemical modification with large coupling partners such as transferrin after the modification of the surface of the vector particles with a protective reagent such as mPEG-SPA2000.

Referencias References

Las siguientes referencias, hasta el grado en que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a los establecidos en este documento, se incorporan específicamente al presente documento como referencia: The following references, to the extent that they provide exemplary procedures or other complementary details to those established in this document, are specifically incorporated herein by reference:

Biermann V, Volpers C, Hussmann S, Stock A, Kewes H, Schiedner G, Herrmann A, Kochanek S. Targeting of high-capacity adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 12: 1757-69 (2001). Biermann V, Volpers C, Hussmann S, Stock A, Kewes H, Schiedner G, Herrmann A, Kochanek S. Targeting of high-capacity adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 12: 1757-69 (2001).

Dmitriev I, Krasnykh V, Miller CR, Wang M, Kashentseva E, Mikheeva G, Belousova N, Curiel DT. An adenovirus vector with genetically modified Fibers demonstrates expanded tropsim via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism. J Virol. 72: 9706-13 (1998). Dmitriev I, Krasnykh V, Miller CR, Wang M, Kashentseva E, Mikheeva G, Belousova N, Curiel DT. An adenovirus vector with genetically modified Fibers demonstrates expanded tropsim via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism. J Virol. 72: 9706-13 (1998).

Fields y col., Fields Virology, 3ª edición, Lippincott-Raven Publishers Filadelfia, Filadelfia (1996). Fields et al., Fields Virology, 3rd edition, Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, Philadelphia (1996).

Fisher KD, Stallwood Y, Green NK, Ulbrich K, Mautner V, Seymour LW. Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralising antibodies. Gene Ther. 8: 341-8 (2001). Fisher KD, Stallwood Y, Green NK, Ulbrich K, Mautner V, Seymour LW. Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralizing antibodies. Gene Ther. 8: 341-8 (2001).

Greber UF, Webster P, Weber J, Helenius A. The role of adnocirus protease on virus entry into cells. EMBO J. Greber UF, Webster P, Weber J, Helenius A. The role of adnocirus protease on virus entry into cells. EMBO J.

15: 1766-77 (1996). 15: 1766-77 (1996).

Jörnvall H, Philipson L. Limited proteolysis and a reactive cysteine residue define accessible regions in the native conformation of the adenovirus hexon protein. Eur J Biochem. 104: 237-47 (1980). Jörnvall H, Philipson L. Limited proteolysis and a reactive cysteine residue define accessible regions in the native conformation of the adenovirus hexon protein. Eur J Biochem. 104: 237-47 (1980).

Schiedner G, Hertel S, Kochanek S. Efficient transformation of primary human amniocytes by E1 functions of Ad5: generation of new cell lines for adenoviral vector production. Hum Gene Ther. 11: 2105-16 (2000). Schiedner G, Hertel S, Kochanek S. Efficient transformation of primary human amniocytes by E1 functions of Ad5: generation of new cell lines for adenoviral vector production. Hum Gene Ther. 11: 2105-16 (2000).

Stubenrauch K, Gleiter S, Brinkmann U, Rudolph R, Lilie H. Conjugation of an antibody Fv fragment to a virus coat protein: cell-specific targeting of recombinant polyoma-virus-like particles. Biochem J. 356: 867-73 (2001). Stubenrauch K, Gleiter S, Brinkmann U, Rudolph R, Lilie H. Conjugation of an antibody Fv fragment to a virus coat protein: cell-specific targeting of recombinant polyoma-virus-like particles. Biochem J. 356: 867-73 (2001).

Wang Q, Lin T, Johnson JE, Finn MG. Natural supramolecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus. Chem Biol. 9: 813-9 (2002). Wang Q, Lin T, Johnson JE, Finn MG. Natural supramolecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus. Chem Biol. 9: 813-9 (2002).

Wigand y col., en: Adenovirus DNA, Doerfler, Ed., Martinus Nijhoff Publishing, Boston, págs. 408-441 (1986). Wigand et al., In: Adenovirus DNA, Doerfler, Ed., Martinus Nijhoff Publishing, Boston, p. 408-441 (1986).

LISTADO DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

<110> Kochanek, Stefan Kreppel, Florian <110> Kochanek, Stefan Kreppel, Florian

<120> Partículas modificadas de vectores víricos <120> Modified particles of viral vectors

<130> KOC-001 PCT <130> KOC-001 PCT

<140> desconocido <140> unknown

<141> 2005-05-02 <141> 2005-05-02

<150> DE 10 2004 021 584.7 <150> DE 10 2004 021 584.7

<151> 2004-05-03 <151> 2004-05-03

<150> US 60/601 902 <150> US 60/601 902

<151> 2004-08-16 <151> 2004-08-16

<160> 15 <160> 15

<170> PatentIn versión 3.1 <170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <210> 1

<211> 11 <211> 11

<212> PRT <212> PRT

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<223> sitio de fijación <223> fixing site

<400> 1 <400> 1

<210> 2 <210> 2

<211> 11 <211> 11

<212> PRT <212> PRT

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<223> sitio de fijación <223> fixing site

<400> 2 <400> 2

<210> 3 <210> 3

<211> 9 <211> 9

<212> PRT <212> PRT

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<223> sitio de fijación <223> fixing site

<400> 3 <400> 3

<210> 4 <210> 4

<211> 33 <211> 33

<212> ADN <212> DNA

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<223> secuencia codificante para el sitio de fijación <223> coding sequence for the fixation site

<400> 4 ttaattggcg gcggatgcgg tggcggcatc gat 33 <400> 4 ttaattggcg gcggatgcgg tggcggcatc gat 33

<210> 5 <210> 5

<211> 33 <211> 33

<212> ADN <212> DNA

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<400> 5 ttaattggct gcggatgcgg ttgcggcatc gat 33 <400> 5 ttaattggct gcggatgcgg ttgcggcatc gat 33

<210> 6 <210> 6

<211> 27 <211> 27

<212> ADN <212> DNA

<213> secuencia artificial <213> artificial sequence

<220> <220>

<400> 6 ttaatttgct gttgttgctg catcgat <400> 6 ttaatttgct gttgttgctg catcgat: 27 27

<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

<400> 7 tggcggcgga tgcggtggcg gcat <400> 7 tggcggcgga tgcggtggcg gcat: 24 24

<210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

<400> 8 cgatgccgcc accgcatccg ccgccaat <400> 8 cgatgccgcc accgcatccg ccgccaat: 28 28

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

<400> 9 tggctgcgga tgcggttgcg gcat <400> 9 tggctgcgga tgcggttgcg gcat: 24 24

<210> 10 <211> 28 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

<400> 10 cgatgccgca accgcatccg cagccaat <400> 10 cgatgccgca accgcatccg cagccaat: 28 28

<210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

<400> 11 ttgctgttgt tgctgcat <400> 11 ttgctgttgt tgctgcat: 18 18

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> secuencia artificial <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence

<220> <223> Cebador <220> <223> Primer

5 5: <400> 12 cgatgcagca acaacagcaa at 22 <400> 12 cgatgcagca acaacagcaa at 22

10 10: <210> 13 <211> 592 <212> PRT <213> secuencia artificial <210> 13 <211> 592 <212> PRT <213> artificial sequence

15 fifteen: <220> <223> Ad1Cys de fibra <220> <223> Ad1Cys fiber

<400> 13 <400> 13

<210> 14 <210> 14

<211> 592 <211> 592

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Ad3Cys de fibra <223> Fiber Ad3Cys

<210> 15 <210> 15

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Ad5Cys de fibra 10 <223> Ad5Cys fiber 10

<400> 15 <400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la generación de una partícula de un vector adenovírico, que comprende las etapas: 1. Procedure for the generation of a particle of an adenoviral vector, comprising the steps:

a) generación de una partícula de un vector adenovírico en líneas celulares de empaquetamiento que comprenden proteínas de la cápside, comprendiendo dichas proteínas de la cápside un sitio de fijación para la modificación específica de la partícula del vector adenovírico, comprendiendo dicho sitio de fijación al menos un residuo de cisteína que está ubicado en un dominio expuesto al disolvente de dicha proteína de la cápside; b) lisado de las células de empaquetamiento y la subsiguiente purificación de dichas partículas de vectores adenovíricos en tampones con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exentos de cationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es a) generation of a particle of an adenoviral vector in packaging cell lines comprising capsid proteins, said capsid proteins comprising a fixation site for specific modification of the adenoviral vector particle, said fixation site comprising at least a cysteine residue that is located in a domain exposed to the solvent of said capsid protein; b) lysate of the packaging cells and the subsequent purification of said adenoviral vector particles in buffers with a pH from 5.0 to 9.0 and free of divalent metal cations, wherein said buffer is

(i) (i): un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2, o a buffer with little or no oxygen in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2, or

(ii)(ii): un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2; a buffer with little or no oxygen supplemented with reducing reagents in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2;

c) poner en contacto los compañeros de acoplamiento con dichas partículas de vectores adenovíricos y realizar una reacción de acoplamiento de los compañeros de acoplamiento a los residuos de cisteína a través de enlaces tioéter, disulfuro o tioéster mediante la adición de reactivos alquilantes que comprenden grupos maleimida, grupos ditiopiridilo o grupos yodoacetilo en un tampón con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exento de cationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es c) contacting the coupling partners with said adenoviral vector particles and performing a coupling reaction of the coupling partners to the cysteine residues through thioether, disulfide or thioester bonds by the addition of alkylating reagents comprising maleimide groups , dithiopyridyl groups or iodoacetyl groups in a buffer with a pH from 5.0 to 9.0 and free of divalent metal cations, wherein said buffer is

(i)(i): un tampón que comprende reactivos reductores, o a buffer comprising reducing reagents, or

(ii)(ii): un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2. a buffer with little or no oxygen supplemented with reducing reagents in an atmosphere of Ar, He, N2 or CO2.

2.2.: Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tampón de la etapa b) y/o de la etapa c) tiene un pH desde 6,8 hasta 7,4. Process according to claim 1, wherein the buffer of step b) and / or of step c) has a pH from 6.8 to 7.4.

3.3.: Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tampón de la etapa b) y/o de la etapa c) tiene un pH de 7,3. Process according to claim 1 or 2, wherein the buffer of step b) and / or of step c) has a pH of 7.3.

4. Four.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los cationes metálicos divalentes son Mg2+ oMn2+. Process according to any one of claims 1 to 3, wherein the divalent metal cations are Mg2 + orMn2 +.

5.5.: Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente después de la etapa b) o al mismo tiempo que o después de la etapa c) modificaciones químicas adicionales de las proteínas de la cápside que no implican residuos de cisteína como compañeros de reacción Method according to any one of claims 1 to 4, further comprising after stage b) or at the same time as or after stage c) additional chemical modifications of the capsid proteins that do not involve cysteine residues as partners of reaction

6.6.: Partícula de vector adenovírico que comprende proteínas de la cápside, en la que dichas proteínas de la cápside comprenden al menos un residuo de cisteína como sitio de fijación, que está unido a través de un enlace de disulfuro, tioéter o tioéster a un compañero de acoplamiento y puede obtenerse mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. Adenoviral vector particle comprising capsid proteins, wherein said capsid proteins comprise at least one cysteine residue as a binding site, which is linked through a disulfide, thioether or thioester bond to a coupling partner. and can be obtained by the method of any one of claims 1 to 5.

7.7.: Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 6, en el que las proteínas de la cápside están modificadas químicamente mediante reacciones químicas que no implican grupos tiol como compañeros de reacción para la reacción de modificación. An adenoviral vector particle according to claim 6, wherein the capsid proteins are chemically modified by chemical reactions that do not involve thiol groups as reaction partners for the modification reaction.

8.8.: Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 6 ó 7, que comprende al menos dos compañeros de acoplamiento diferentes. Adenoviral vector particle according to claim 6 or 7, comprising at least two different coupling partners.

9.9.: Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la cual un compañero de acoplamiento tiene uno o más sitios de fijación. An adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 8, wherein a coupling partner has one or more fixation sites.

10.10.: Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la cual dicho(s) compañero(s) de acoplamiento es/son ligandos específicos celulares, polímeros, especialmente derivados de PEG o derivados de HPMA, partículas de nanooro, pigmentos fluorescentes, sustancias magnéticas o sustancias bioquímicamente/catalíticamente activas. Adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 9, wherein said coupling partner (s) is / are cell-specific ligands, polymers, especially PEG derivatives or HPMA derivatives, nanooro particles, pigments fluorescent, magnetic substances or biochemically / catalytically active substances.

11.eleven.: Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la cual dicho sitio de fijación tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más residuos de cisteína, y en la cual dos o más de dichos residuos de cisteína son consecutivos o están separados por 1, 2, 3 o más residuos de aminoácidos que son diferentes de la cisteína. Adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 10, wherein said fixation site has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more cysteine residues, and in which two or more of said residues of Cysteine are consecutive or separated by 1, 2, 3 or more amino acid residues that are different from cysteine.

12.12.: Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 11, comprendiendo dicho sitio de fijación los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2 o la ID. SEC. Nº: 3. Adenoviral vector particle according to claim 11, said fixation site comprising amino acids according to ID. SEC. Nº: 1, the ID. SEC. Nº: 2 or the ID. SEC. Nº: 3.

13.13.: Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la cual las proteínas de la cápside del adenovirus se eligen de entre proteína de fibra, Hexona, base Pentona y proteína IX. An adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 12, wherein the adenovirus capsid proteins are chosen from fiber protein, Hexone, Pentone base and protein IX.

14.14.: Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 13, comprendiendo dicha proteína de fibra los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 13, la ID. SEC. Nº: 14 o la ID. SEC. Nº: 15. Adenoviral vector particle according to claim 13, said fiber protein comprising amino acids according to ID. SEC. Nº: 13, the ID. SEC. No.: 14 or the ID. SEC. Nº: 15.

15.fifteen.: Uso de dicha partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 como medio diagnóstico en vertebrados, en particular, en seres humanos y primates. Use of said adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 14 as a diagnostic medium in vertebrates, in particular, in humans and primates.

5 16. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 para su uso como medio terapéutico o profiláctico en vertebrados, en particular, en seres humanos y primates. 16. An adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 14 for use as a therapeutic or prophylactic medium in vertebrates, in particular in humans and primates.

17. Uso de dicha partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 in vitro como un medio terapéutico, profiláctico o diagnóstico en cultivos tisulares o celulares que comprenden células de vertebrados, en particular, de seres humanos y primates. 17. Use of said adenoviral vector particle according to any one of claims 6 to 14 in vitro as a therapeutic, prophylactic or diagnostic means in tissue or cell cultures comprising vertebrate cells, in particular, of humans and primates.