ES2387292B1 - Combinacion de snps para determinar el riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular - Google Patents

Abstract

Combinación de SNPs para determinar el riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular.#La presente invención se refiere a la detección de una predisposición a enfermedades neurovasculares en un individuo, y en particular al ictus. La presente invención se refiere a un método y un kit para la detección del riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus, en un individuo, que comprende la detección de una combinación de al menos dos polimorfismos de nucleótido único (SNPs), seleccionados del grupo que consiste en los SNPs rs7956957, rs310585, rs2276109, rs10275136, rs5742912 y rs10947803, así como a la propia combinación, los polinucleótidos que comprenden estos SNPs y sus usos.

Description

COMBINACIÓN DE SNPS PARA DETERMINAR EL RIESGO DE SUFRIR

UNA ENFERMEDAD NEUROVASCULAR

Campo de la invención

5

La presente invención se refiere a la detección de una

predisposición a enfermedades neurovasculares en un

individuo, y en particular al ictus. La presente invención

se refiere a un método y un kit para la detección del

riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en

10

particular ictus, en un individuo, que comprende la

detección de una combinación de al menos dos polimorfismos

de nucleótido único (SNPs), seleccionados del grupo que

consiste en los SNPs rs7956957, rs310585,

rs2276109, rs10275136, rs5742912 y rs10947803, así como a

15

la propia combinación, los polinucleótidos que comprenden

estos SNPs y sus usos.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades neurovasculares suponen una carga enorme

para el sistema de salud pública en todo el mundo. La

20

patología neurovascular, en particular ictus, es la

tercera causa de muerte y primera causa de discapacidad,

ejerciendo un impacto negativo no sólo en la calidad de

vida del paciente afectado, sino también en su familia,

con un gran número de pacientes que sufren dependencia

25

funcional más de un año después del evento [1]. Por otra

parte, el coste para los sistemas de salud es grave porque

incluye costes directos (hospitalización, rehabilitación,

transporte, vigilancia médica, consumo de fármacos, etc.),

y costes indirectos (pérdida de productividad de los

3 O

pacientes y cuidadores, pérdida de actividad, mortalidad

prematura, etc.). En general, el coste estimado del ictus

en España es de 13.826 € el primer año, 8.945 € el segundo

año y 7. 739 € el tercer año por paciente [2]. Por lo

tanto, existe una necesidad de detectar y prevenir estos

35

accidentes cerebrovasculares.

Los presentes inventores han decidido estudiar la prevención de enfermedades neurovasculares desde el punto de vista genético. De hecho, existe una importante implicación genética en las enfermedades neurovasculares,

5 descubierta en los años noventa en estudios con gemelos y estudios de agregación familiar, pero los genes responsables de esta herencia siguen siendo en gran parte sin ser determinados [3]. Por ejemplo, los estudios de análisis de ligamiento clásico o de asociación de genes

10 candidatos han demostrado la asociación de los genes PDE4D, ALOX5AP, ApoE, IL6, TNFa o MTHFR con los ictus isquémicos, pero la replicación de estos resultactos ha sido muy inconsistente [ 4] . Por otra parte, los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han revelado la

15 asociación de dos SNPs con ictus en el cromosoma 12p13 en población caucásica, sugiriendo un papel del gen NINJ2 [5], una asociación que ha sido contradicha posteriormente

[6] Además, un meta-análisis de GWAS en ictus isquémico en poblaciones caucásicas identificó una asociación del 20 gen ZFHX3 en el cromosoma 16q22 con ictus [7]. Los genes PRKCH y CELSR1 se han asociado también con ictus isquémico en la población japonesa [8-9], pero estos marcadores deben ser validados en nuevos estudios. En cualquier caso, todos los estudios revelaron asociaciones con un pequeño 2 5 efecto sobre la predicción global de la enfermedad. Del mismo modo, los factores de riesgo genético para el ictus hemorrágico aún no están definidos [3]. Sin embargo, la base genética de todas las enfermedades neurovasculares es probablemente idéntica ya que todos los genes candidatos 30 identificados hasta la fecha están involucrados en los procesos fisiopatológicos comunes a todas las enfermedades neurovasculares, como la inflamación, angiogénesis, fibrinólisis, coagulación, hipertensión, enfermedad coronaria, angiogénesis, el metabolismo lipídico o la

35 diabetes [3]. Además, las enfermedades neurovasculares

comparten los mismos factores de riesgo demográficos y

clínicos

como la presencia de ataques isquémicos

transitorios,

hipertensión, dislipidemia, diabetes,

fibrilación

auricular, enfermedad cardiaca, angiopatía

amiloide,

obesidad, consumo o abuso de drogas, estilo de

vida sedentaria, tabaquismo, medicación, consumo de alcohol y/o antecedentes familiares [3]. Basado en el hecho que las enfermedades neurovasculares son enfermedades complejas causadas por múltiples factores genéticos y ambientales, los inventores pensaron que la combinación de varios marcadores genéticos y variables clínicas tal vez podría revelar relaciones más sólidas con la enfermedad. Los inventores han divulgado en algunas conferencias (por ejemplo, "Predecir el riesgo genético de accidente cerebrovascular isquémico: Estudio de 250 polimorfismos en 1080 casos y controles", Conferencia de Genética Humana Europea, Viena el 23/5/2009) la posibilidad de que 5 SNPs localizados en los genes NOS3, LRP, SCNN1A y MMP12 podrían estar asociados con un mayor riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular isquémico en población española, aunque nunca se reveló la identidad de los SNPs implicados en dichos genes, ni se menciona ni sugiere utilizar estos SNPs en combinación como una herramienta de detección de riesgo de enfermedad cerebrovascular. Del mismo modo, el uso de una combinación de marcadores genéticos con factores de riesgo de enfermedad cerebrovascular con el fin de detectar personas con un elevado riesgo de ictus isquémico no se mencionó ni sugirió. Además, los inventores publicaron el artículo "KCNK17 genetic variants in ischemic stroke", en la revista Atherosclerosis ( 2 O O 9) [ 1 O] , donde se reveló que el alelo A del SNP rs10947803 en el gen KCNK17 podría ser un marcador de riesgo para el accidente cerebrovascular isquémico, con un OR de 1, 48, pero no se revelo ni se sugirió usar este SNP en asociación con otros SNPs para

predecir el riesgo de accidente cerebrovascular. El SNP rs5742912 del gen SCNN1A fue descrito en el artículo 11 Impact of eNaC Polymorphisms on the Risk of Ischemic Cerebrovascular Events: A Multicenter Case-Control Study", en la revista Clinical Chemistry (2005) [11], como marcador de riesgo para el accidente cerebrovascular isquémico, con un OR de 3,26 en mujeres jóvenes homocigóticas para esta mutación. Sin embargo, no se realizó ninguna mención del uso de este SNP en asociación con otros marcadores para el diagnóstico de ictus isquémico, y ninguna mención del uso de este SNP como herramienta predictiva en asociación con otros marcadores para mejorar la detección de ictus. Varios artículos han sido publicados sobre accidentes cerebrovasculares en la población española (por ejemplo, 11 Human Vitamin K-Dependent GA86: Gene Structure, Allelic Variation and Association with Stroke", Human Mutation (2004) [12], o 11Alpha (1)-antichymotrypsin polymorphism: a risk factor for hemorrhagic stroke in normotensive subjects", Stroke (2001) [13]). Sin embargo, no hay ninguna divulgación en estos artículos de los polimorfismos descritos en la presente invención, ni de la posibilidad de combinar varios marcadores y factores de riesgo para crear un modelo predictivo de infarto. Por último, el artículo 11Association of three-gene interaction among MTHFR, ALOX5AP and NOTCH3 with thrombotic stroke: a multicenter case-control study", Human Genetics ( 2 O O 9) [14], describe un estudio genético de accidentes cerebrovasculars isquémicos en la población China, y sugiere que tres SNPs en los genes MTHFR, ALOX5AP y NOTCH3 podrían combinarse para mejorar el pronóstico de un accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, este artículo sólo llega a predecir con una OR de 3,16 y no menciona los SNPs o genes descritos en la presente invención. En vista de los conocimientos en el estado de la técnica, es necesario dar

a conocer una nueva herramienta para determinar el riesgo de sufrir enfermedades neurovasculares, en particular ictus. Un primer objetivo de la presente invención es dar a conocer nuevos marcadores genéticos para la prevención de las enfermedades neurovasculares, en particular ictus. Un segundo objetivo de la presente invención es dar a conocer un nuevo método y un nuevo kit para determinar la probabilidad de sufrir un accidente neurovascular, en particular ictus. En respuesta a estos objetivos, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que una combinación de los SNPs descritos en la presente invención es útil para determinar el riesgo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus, y por lo tanto se puede desarrollar un método y un kit de uso de dicha combinación.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a una combinación de al menos dos polimorfismos de nucleótido único (SNPs), seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo para sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus. La presente invención se refiere también a un método para la determinación de una predisposición genética de enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo, que comprende la detección de los alelos de al menos dos SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de acido nucleico aislado de un individuo. La presente invención se refiere además a un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus. La presente invención se refiere también al uso de la combinación mencionada anteriormente.

Breve descripción de las figuras Figura l. Curvas ROC del modelo con los factores de riesgo clásicos de accidente cerebrovascular (edad, sexo masculino, hipertensión, tabaquismo y diabetes) con y sin adicción de las 6 variantes genéticas. Figura 2. Porcentaje de controles y casos de accidentes cerebrovasculares en función del número de variantes genéticas. Figura 3. Porcentaje de controles y casos de accidentes cerebrovasculares en función del número total de factores de riesgo. Figura 4. Distribución de controles y casos de ictus por cada puntuación. Figura 5. Porcentaje de controles y casos de accidente cerebrovascular en cada categoría propuesta por el modelo de riesgo de ictus.

Descripción detallada de la invención 1.-Definiciones y terminología

Las siguientes abreviaturas y siglas se utilizan en la presente invención: ACM: arteria cerebral media ADN: ácido desoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero CADASIL: arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) CeGen: centro de genotipado nacional

CI: intervalo de confianza TCD: Doppler transcraneal ECG: electrocardiograma EDTA: acido etilendiaminotetraacético GWAS: genome-wide association studies o estudio de asociación de genoma entero

eNaC: canal de sodio epitelial

FDR: tasa de falsos positivos (False Discovery Rate)

HI: infarto hemorrágico

HT: transformación hemorrágica

HWE: equilibrio de Hardy-Weinberg

IPA: Ingenuity Pathways Analysis

MAF: frecuencia de alelo minoritario

MELAS: Miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis

láctica e ictus

MRI: imágenes de resonancia magnética

mRS: escala de Rankin modificada

MMP: metaloproteinasa de matriz

NIHSS: National Institute of Health Stroke Scale

OCSP: Oxfordshire Community Stroke Project

OR: odds ratio

ROC: Característica operativa del receptor

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PH: hematoma parenquimatoso

RMA: Robust Multiarray Averaging

SNP: single nucleotide polymorphism o polimorfismo de

nucleótido único

SPSS: paquete estadístico para las ciencias sociales

TC: tomografia craneal

TOAST: Prueba de ORG 10172 en el tratamiento del accidente

cerebrovascular agudo

t-PA: activador tisular del plasminógeno

Nombres

de genes:

p38-MAPK:

proteína quinasa activada por mitógeno p38

ALOX5AP:

Proteína activadora de Araquidonato 5-

lipoxigenasa

ALOX12:

araquidonato 12-lipoxigenasa

APOE:

apolipoproteína E

C4a:

componente de complemento 4A

C4b:

componente de complemento 4B

eDKNlA: inhibidor quinasa dependiente de ciclina lA (cyclin-dependent kinase inhibitor lA)

eELSRl: cadherin EGF lag seven-pass G-type receptor 1

eLEe4e: e-type lectin domain family 4, member e

GOS2: GO/Gl switch 2 IL6: interleucina 6 ITGB3: integrina beta 3

KeNK17: canal de potasio, subfamilia K, miembro 17

LRP: proteína relacionada con el receptor de lipoproteína

de baja densidad

MMP: metaloproteinasa de matriz

MMP12: metaloproteinasa de matriz 12

MPL. Oncogén del virus de la leucemia mieloproliferativa

MTHFR: 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa

NEKl: NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 1

NFkB: factor nuclear kappa-E

NINJ2: proteína inducida por lesión nerviosa 2

NOS3: óxido nítrico sintasa 3

PDE4D: fosfodiesterasa 4D

PITX2: paired-like homeodomain transcription factor 2

PPIA: ciclofilina A

PRKeH: proteína quinasa e, eta

seNNlA: canal de sodio, no neuronal (nonvoltage-gated) 1,

subunidad alfa

TNFa: factor de necrosis tumoral alfa ZFHX3: dedos de zinc homeobox 3

T: timina

e: citosina

A: adenina

G: guanina El término ualelo", como se utiliza aquí, se refiere a una variante en la secuencia del gen.

Los términos "polimórficos" y "polimorfismo", como se usan aquí, se refieren a la condición en la cual dos o más variantes de una secuencia genómica específica, o la secuencia de aminoácidos codificados, se encuentran en una población. Los términos hacen referencia a la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos codificados, el uso se desprende del contexto. La región polimórfica o el sitio polimórfico se refieren a una región del ácido nucleico, donde se produce la diferencia de nucleótidos que distingue a las variantes, o, para las secuencias de aminoácidos, una región de la secuencia de aminoácidos donde se produce la diferencia de aminoácidos que distingue a las variantes de la proteína. Como se utiliza aquí, un 11polimorfismo de nucleótido único" o "SNP", se refiere a un sitio polimórfico que consiste en una posición de un solo nucleótido.

El término "genotipo" se refiere a la descripción de los alelos de un gen o genes contenidos en un individuo o una muestra. Como se u t i 1 i z a aquí , no se hace distinción entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una muestra procedente de este mismo individuo. Aunque normalmente se determina un genotipo a partir de muestras de células diploides, un genotipo puede determinarse a partir de una muestra de células haploides, como por ejemplo una célula espermatozoica.

El término "odds ratio" o "OR" se refiere a la proporción entre la probabilidad de sufrir la enfermedad en personas con el marcador o polimorfismo en relación a la probabilidad de sufrir la enfermedad en individuos sin el marcador o polimorfismo.

El término "ácido polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado", como se usa aquí, se refiere a un polinucleótido que está separado y/o recuperado de un ácido nucleico de secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean la molécula de ácido nucleico y/o ha sido completamente o parcialmente purificado a partir de otro material biológico (por ejemplo, proteínas) que normalmente se asocian con el ácido nucleico. Asimismo,

dicho "ácido polinucleótido aislado" comprende variantes de polinucleótido donde han llevado a cabo una o más inserciones, delecciones y/o sustituciones.

Por "oligonucleótido" se entiende un polimero de 5 nucleótidos de cadena simple compuesta por más de 2 subunidades de nucleótidos unidas covalentemente.

El término "gen", como se utiliza aqui, se refiere no sólo a la parte estrictamente de codificación, sino también a las partes no codificantes.

1 O El termino "combinación", a menos que se indique lo contrario, se refiere aqui a la combinación o asociación de al menos dos SNPs seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y

rs5742912,

indicativos de riesgo de enfermedad

15

neurovascular, en particular ictus, de un individuo, en

donde

dichos SNPs están incluidos en una secuencia de

polinucleótidos aislados como se define en este documento.

Cuando se hace referencia a los SNPs de esta invención y a los polinucleótidos que los comprenden, el 20 termino "una combinación de al menos dos" y en consecuencia el nómero exacto de "tres", "cuatro", "cinco"

o "seis", no se pretende significar un grupo cerrado de un máximo de 6 SNPs o polinucleótidos correspondientes, sino también pueden incluir combinaciones con más SNPs o 25 polinucleótidos correspondientes. En estas combinaciones, uno o más SNPs o polinucleótidos correspondientes pueden estar localizados o no en genes asociados a enfermedades neurovasculares, en particular accidentes cerebrovasculares, siempre y cuando dicho "al menos dos",

30 "tres", "cuatro", "cinco" o "seis" corresponda a los SNPs y polinucleótidos correspondientes divulgados en la presente invención.

Por uvariable clinica" se entiende la utilización de los datos demográficos indicativos de enfermedad 35 neurovascular, en particular ictus, como la raza o el

origen étnico, edad, sexo y antecedentes familiares de enfermedad neurovascular, en particular ictus, así como el

uso

de la información clínica, tal como la presencia de

ataques

isquémicos transitorios,

hipertensión,

dislipidemia, diabetes, fibrilación

auricular, enfermedad cardíaca, angiopatía amiloide, obesidad, consumo o abuso de drogas, estilo de vida sedentaria, tabaquismo, medicamentos, consumo de alcohol y antecedentes de enfermedad neurovascular, en particular ictus,.

Por 11genes asociados a enfermedad neurovascular" se entiende los genes que se ha descrito que están asociados a cualquiera de las enfermedades neurovasculares definidas más adelante en la presente invención.

Por " genes asociados a ictus" o 11genes asociados a accidentes cerebrovasculares" se entiende los genes que se ha descrito que están asociados a la patología de ictus y/o a procesos relacionados funcionalmente con accidentes cerebrovasculares, tales como inflamación, fibrinólisis, coagulación, hipertensión, enfermedades del corazón, angiogénesis, metabolismo lipídico y diabetes.

El término "enfermedades neurovasculares" se refiere a enfermedades complejas del cerebro, de la médula espinal y1o de los vasos sanguíneos y a los factores de riesgo asociados a enfermedades complejas del cerebro, de la médula espinal y1o de los vasos sanguíneos, tales como pueden ser: ictus (también denominado de forma equivalente en la presente invención como 11accidente(s) cerebrovascular(es)"), derrame cerebral, malformaciones arteriovenosas, trombosis, CADASIL, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma, disección, hiper/hipotensión, encefalopatías, síndromes lacunares, Fabry, homocistinuria/homocisteinemia, hiper/hipoglucemia, hiper/hypolipidemia, diabetes, MELAS, acidemia metilmalónica, displasia fibromuscular, síndrome de Foix-

Alajouanine, lesión por reperfusión, accidente cerebrovascular hemorrágico, accidente cerebrovascular isquémico, cardioembolismo, aterotrombismo, malformaciones vasculares, amnesia global transitoria, ataques isquémicos

transitorios,

traumatismos, infecciones neurológicas,

convulsiones,

trastornos degenerativos, epilepsia,

cardiopatía,

dolor de cabeza y migrañas, tumores,

inflamación,

desmielinización, alteraciones de la

circulación,

neurodegeneración, demencia, Alzheimer,

Parkinson, síndrome de Down, afasia, apraxia, trastornos psiquiátricos, trastornos de abuso de sustancias y drogas, trastornos cognitivos, esquizofrenia, trastornos del sueño.

Por "población mediterránea" se entiende las personas originarias o residentes de cualquier de los siguientes estados o territorios: España, Francia, Italia, Portugal, Mónaco, Malta, Eslovenia, Croacia, Bosnia y Herzegovina, Montenegro, Albania, Grecia, Turquía, Chipre, Siria, Líbano, Israel, Palestina, Egipto, Libia, Túnez, Argelia, Marruecos, Creta, Eubea, las Islas Pelagia, Gibraltar, Rodas, Lesbos, Ceuta, Melilla, Quíos, Cefalonia, Corfú, Naxos, Andros, Cerdeña, Córcega, Cres, Krk, Brac , Hvar, Pag, Korcula, Akrotiri y Dhekelia, Andorra, Jordania, San Marino, Ciudad del Vaticano, Macedonia y Serbia.

2.-Descripción

La presente invención se refiere a una combinación de al menos dos SNPs seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en particular ictus.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en tres SNPs. En una realización más preferida, dicha combinación consiste en cuatro SNPs.

En una realización más preferida, dicha combinación consiste en cinco SNPs. En una realización la más preferida, dicha combinación consiste en seis SNPs.

En una realización particular, dichos al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con uno o más de los SNPs rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733.

En otra realización, dichos polimorfismos de nucleótido único de acuerdo a las realizaciones anteriores se combinan con una o más variables clínicas asociadas a enfermedades neurovasculares. Preferiblemente, dicha variable clínica se selecciona entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia.

Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular en las realizaciones anteriores es el ictus.

Como dichos SNPs están por naturaleza comprendidos en un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico aislado, la presente invención se refiere también a la

combinación

de al menos dos polinucleótidos aislados

incluidos

en genes asociados a enfermedades

neurovasculares,

comprendiendo cada uno de dichos

polinucleótidos

un SNP seleccionado entre los SNPs

rs2276109, rs10275136 , rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a la SEC ID N o 1 a

6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

SEC ID N o 1 indica la posición del polimorfismo rs2276109 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido A o G, siendo G el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs2276109 se encuentra en el contig humano NT 033899.7 en la posición cromosómica 102251001 del

cromosoma 11.

SEe ID N o 2 indica la posición del polimorfismo rs10275136 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido T o e, siendo el alelo e el asociado con la enfermedad neurovascular. rs10275136 se encuentra en el contig humano NT 007914.14 en la posición cromosómica 150514825 del cromosoma 7.

SEe ID N o 3 indica la posición del polimorfismo rs310585 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido G o A, siendo A el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs310585 se encuentra en el contig humano NT 007914.14 en la posición cromosómica 150526188 del cromosoma 7.

SEe ID N o 4 indica la posición del polimorfismo rs7956957 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o G, siendo G el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs7956957 se encuentra en el contig humano NT 029419.11 en la posición cromosómica 55889082 del cromosoma 12.

o

SEe ID N 5 indica la posición del polimorfismo rs10947803, también llamado rs9471058, y su secuencia

adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o A, siendo A el alelo asociado con la enfermedad neurovascular. rs1094 7803 se encuentra en el contig humano NT_007592.14 en la posición cromosómica 39378588 del cromosoma 6.

SEe ID N o 6 se indica la posición del polimorfismo rs5742912 y su secuencia adyacente, donde el nucleótido N es el SNP en la posición 21 y puede ser un nucleótido e o T, siendo el alelo T el asociado con la enfermedad neurovascular. rs5742912 se encuentra en el contig humano NT_009759 .15, en la posición cromosómica 6328611 del

cromosoma 12. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular en las SEC ID N o 1-6 es el ictus.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en tres polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en cuatro polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en cinco polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

En una realización preferida, dicha combinación consiste en seis polinucleótidos aislados incluidos en

genes asociados a enfermedades neurovasculares, comprendiendo cada uno de dichos polinucleótidos un SNP seleccionado entre los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N o 1 a 6. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

En otra realización particular, los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas de otros marcadores o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y 1o LRP. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

En una realización particular, dicha combinación de SNPs o los correspondientes polinucleótidos aislados se encuentran en un individuo perteneciente a la población mediterránea. En una realización más particular, dicho individuo pertenece a la población española. Preferiblemente, dicha enfermedad neurovascular es el ictus.

Como se demostrará más adelante en la sección de métodos y resultados, dicha combinación de SNPs o los correspondientes polinucleótidos aislados, se puede aplicar a un nuevo modelo o método para determinar el

riesgo

genético de que un individuo pueda sufrir una

enfermedad

neurovascular, preferiblemente un ictus, y un

kit para

la aplicación de dicho método.

2.1.-Métodos

El objetivo de este estudio fue crear un modelo genético predictivo para el accidente cerebrovascular o ictus, aunque perfectamente ampliable a una enfermedad neurovascular tal como se define en este documento,

mediante

el hallazgo de nuevos marcadores genéticos a

través

de uno de los estudios más grandes de asociación de

genes

candidatos realizado hasta ahora en el accidente

cerebrovascular,

incluyendo una réplica y un análisis

funcional

de los resultados obtenidos.

2.1.1.-Población de estudio

El diseño de estudio fue de un estudio caso-control, donde se utilizaron casos y controles de ictus recogidos como se describe a continuación. El tamaño de la muestra se calculó con el programa Ene 2.0 para obtener una potencia de 0,80 con un nivel de significancia de 0,05 y una diferencia del 6% entre las frecuencias de los alelos de casos y controles.

531 pacientes consecutivos con ictus isquémico en el territorio vascular de las arterias cerebrales basilar

o media (ACM) y admitido en el servicio de urgencias de un hospital universitario en las primeras 3 horas después de la aparición de síntomas fueron reclutados. El inicio del accidente cerebrovascular se define como la última vez que se determina que el paciente estuvo sin ningún tipo de déficit neurológico. Todos los pacientes fueron sometidos a examinaciones urgentes por ecografía carotídea y Doppler transcraneal (TCD). Recibieron t-PA por vía intravenosa en una dosis estándar de 0.9-mg/kg (bolo 10%, 90% en infusión continua durante 1 hora) . Los pacientes con una enfermedad clínicamente conocida inflamatoria o maligna fueron excluidos del análisis. Para identificar el mecanismo potencial de infarto cerebral, un conjunto de pruebas de diagnóstico se realizó que incluyeron electrocardiograma

(ECG) , radiografía de tórax, hemograma completo y diferencial de leucocitos, bioquímica de sangre, ecografía carotídea, contraste y tomografía craneal (TC) en todos los pacientes. Cuando esté indicado, algunos pacientes también se sometieron a pruebas especiales de coagulación,

imágenes de resonancia magnética (MRI), ecocardiografía transtorácica y monitorización por Holter ECG. Teniendo en cuenta esta información, subgrupos etiológicos previamente definidos se determinaron según los criterios TOAST [1] y también por criterios de la Comunidad Oxfordshire (OCSP), basados en los síntomas clínicos, localización y extensión del infarto cerebral [ 2] . El examen clínico se realizó al ingreso y a las 12, 2 4 y 4 8 horas después del inicio de los síntomas y todos los días hasta el alta. Se evaluó la gravedad del accidente neurovascular mediante el uso de la escala de NIHSS [3]. De definieron la mejoría neurológica como una disminución en la puntuación ~ 4 puntos y el deterioro neurológico como la muerte o un aumento en la puntuación de > 4 puntos a las 48 horas [4]. El resultado funcional fue definido por la escala de Rankin modificada (mRS) >2, 3 meses después del ictus. Los exámenes TCD se realizaron en el servicio de urgencias antes de la administración de t-PA (<3 horas). La presión arterial sistólica, diastólica y la frecuencia cardíaca se midieron en el momento de cada examinación de TCD. El examen TCD se realizó con el dispositivo Multi-Dop X4 TCD (DWL Elektronische Systeme GmbH), por un transductor de mano y un modo de onda pulsada con una frecuencia de 2 MHz. La oclusión proximal de ACM fue definida como la ausencia de flujo o la presencia de una señal de flujo mínimo en todo la ACM a una profundidad de insonación entre 45 y 65 mm [5]. La oclusión distal ACM se definió como una velocidad media en la zona afectada ACM > 21% en comparación con la ACM no afectada [ 6] . A sus ingresos, todos los pacientes se sometieron a una tomografía computarizada en las primeras 3 horas después del inicio del ictus. Ningún paciente con una hipodensidad > 33% en el territorio de la ACM recibió t-PA en este estudio. El TC se repitió posteriormente, de 24 a 48 horas más tarde (o antes, cuando se produjo un deterioro neurológico rápido) para

evaluar la presencia de transformación hemorrágica

(TH). Las TC fueron revisadas por un neurorradiólogo con amplia experiencia en el ictus agudo. Presencia y tipo de HT se definieron de acuerdo a criterios previamente publicados [7-8] . El infarto hemorrágico (HI) se definió como infartos petequiales sin efecto masa y hematoma parenquimatoso (PH) se definió como hemorragias con efecto masa.

54 7 controles fueron reclutados en la unidad de ictus y en el laboratorio del hospital Vall d' Hebron de Barcelona entre 2 O O 7 y 2 O O 8. Todos los controles fueron mayores de 65 años de edad y se declararon sanos de demencia, enfermedad neurovascular y/o cardiovascular, evaluados mediante por entrevista antes de la extracción de sangre. Los pacientes con historia familiar de primer o segundo grado de enfermedad neurovascular fueron excluidos del estudio.

Una historia detallada de los factores de riesgo vascular se ha obtenido de cada participante. El tabaquismo se definió como fumar o haber fumado en alguna ocasión. La hipertensión se definió como una presión arterial sistólica ~ 140 mmHg y presión arterial diastólica ~ 85 mmHg, historia de hipertensión auto-reportada y/o tratamiento para la hipertensión. La diabetes mellitus se definió por historia de diabetes auto-reportada y/o tratamiento de diabetes tipo 2. La dislipidemia fue definida por niveles lipídicos elevados

(colesterol> 200 mg/dL o triglicemia> 200 mg/dL), historia reportada y/o cualquier tratamiento. El consentimiento informado se obtuvo de cada participante del estudio y todos los sujetos presentaban ascendencia europea. El comité ético del hospital aprobó el estudio.

2.1.2.-Genotipado y asociaciones de SNPs 221 SNPs en 135 genes candidatos elegidos en la

literatura por sus funciones putativas en enfermedades

neurovasculares y en procesos relacionados funcionalmente

con estas enfermedades, como inflamación, fibrinólisis,

coagulación, hipertensión, enfermedad coronaria,

5

angiogénesis, metabolismo lipídico o diabetes fueron

analizados de la siguiente manera. El ADN genómico se

extrajo de cada muestra de 1 mL de sangre periférica

anticoagulada con EDTA mediante métodos estándar. Los SNPs

se genotiparon por SNPlexrn (Applied Biosystems, Inc.,

1 O

Foster City, EE.UU.) en el centro de genotipado nacional

español (CeGen) , con tasa de éxito de más de 9O%. Cinco

genes fueron analizados en su totalidad por Tag-SNPs,

definidos por los datos del HapMap utilizando pairwise

tagger r2 ~ O, 8 y una frecuencia del alelo menor >0, 1:

15

MMP9, NOS3, VEGF, LRP y IL6. Desviación del equilibrio de

Hardy-Weinberg (HWE) se evaluó mediante una prueba X2 con

1 grado de libertad. Una prueba X2 o de Fisher, en su

caso, se utilizó para comparar variables categóricas entre

grupos. La corrección de Bonferroni se utilizó para dar

20

cuenta de las pruebas múltiples. Los tests de Student o

Krustal-Wallis se usaron para comparar variables

continuas, según correspondiera. Las odds ratio ( ORs) con

intervalos de confianza (IC) de 95% para el efecto sobre

el riesgo de ictus isquémico fueron estimadas por

25

regresión logística. Todos los análisis estadísticos se

realizaron con el programa SPSS 15.0 ©.

La asociación cumulada de los SNP individuales

asociados positivamente se calculó en función del número

de alelos de riesgo llevados (de O a 6) y de la

30

combinación de alelos de los 6 SNPs llevada (de los 26 =

64 combinaciones posibles). El análisis se realizó bajo

un modelo aditivo, teniendo en cuenta la etapa 1, etapa 2

y la base de datos global. A continuación se realizó una

regresión logística, incluyendo cada variable y las

35

probabilidades predictivas fueron registradas. Se

realizaron 2 curvas ROC, una con los factores de riesgo y

otra con los factores de riesgo y variantes genéticas,

para explorar la relación entre la sensibilidad y

especificidad de una prueba clínica para el riesgo de

5

accidente cerebrovascular. También se calculó la

diferencia entre las áreas bajo las curvas con el

programa MedCalc. Por último, la combinación de variantes

genéticas y clínicas realizadas por cada individuo se

utilizó para desarrollar un modelo predictivo de riesgo

1 O

de accidente cerebrovascular y para determinar las

categorías de riesgo para ictus.

2.1.3.-Análisis funcional

Se extrajo ARN de controles sanos y se midió la

15

expresión mediante PCR cuantitativa en tiempo real de los

genes KCNK17, LRP, SCNN1A y MMP12. La fracción de glóbulos

blancos se obtuvo tras la centrifugación de sangre total

conservada en EDTA durante 15 minutos a 35O O rpm, y se

conservó en RNAlater ® a -80 °C. El ARN total fue aislado

2 O

por RiboPure-Blood™ Kit (Ambion ®, Foster City,

EE.UU.). La síntesis del cDNA se realizó utilizando el kit

High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems Inc.,

Foster City, EE.UU.). Los niveles de ARNm se determinaron

mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un

25

protocolo estándar de kit TaqMan® PCR y sondas TaqMan

fluorogénicas (LRP: Hs00233856_m1, SCNN1A: Hs00168906_m1,

MMP12: Hs001591 78_m1) mediante tecnología 7500 Real Time

PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City ,

EE.UU.) . El gen Cyclophilin A (PPIA) se usó para

30

normalizar los resultados (Hs99999904_m1). Todas las

reacciones se realizaron por triplicado en placas de 96

pocillos y se analizaron con el Applied Biosystems SDS

7500 system software (Applied Biosystems Inc., Foster

City, EE.UU.) Los resultados se expresan en porcentaje en

35

comparación a una muestra calibrador que se utiliza en

todos los experimentos.

Los niveles de proteína MMP12 se midieron a partir de

suero de controles mediante Fuorokine® MMP12 Analyte

Profiling en placas de 96 pocillos. Cada muestra se

5

concentró de 500pL a 100uL con Microcon® (MilliporeTM,

Billerica, EE.UU.) y se analizaron dos veces según las

instrucciones del fabricante, las muestras se midieron en

un analizador Luminex (Human MMP Base Kit, Fluorokine®

MAP, R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.). La actividad de

10

la proteína NOS3 fue analizada a partir de plasma de

controles por Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit en

placas de 96 pocillos. Cada muestra se concentró desde

5O OpL hasta 1 O OuL con Microcon® (MilliporeTM, Billerica,

EE.UU.) y se analizo dos veces según las instrucciones del

15

fabricante (Catalog n°780001, Cayman™, Ann Arbor, USA).

2.1.4.-Microarrays y análisis por Ingenuity Pathways

Se extrajo ARN de 12 sujetos. Tubos con EDTA se

centrifugaron a 3500RPM durante 15 minutos para obtener la

2 O

fracción de glóbulos blancos. El kit RiboPure™ -Blood de

Ambion (Ambion, Woodward st. Austin, EE.UU.) fue el

empleado para extraer el ARN total siguiendo las

instrucciones del fabricante. El ARN de la globina de los

eritrocitos de muestras de sangre que provoca

25

interferencias en los estudios con microarrays fue

eliminado utilizando el kit de Globin-Clear (Ambion,

Woodward st. Austin, EE.UU.). Las imágenes fueron

procesadas con el Microarray Analysis Suite 5.0

(Affymetrix) Todas las muestras mostraron

30

características de alta calidad y se sometieron a análisis

posteriores. Los valores de expresión crudos obtenidos

directamente de archivos CEL fueron pre-procesados por el

método de RMA, un proceso de tres pasos que integra

corrección de valores de fondo, normalización y resumen de

35

valores de las sondas. Estos valores normalizados fueron

la base para todos los siguiente análisis. La selección de genes expresados diferencialmente se basó en un análisis con el modelo de Bayes. Los valores de p se usaron para

clasificar

los genes con mayor o menor cambios de

expresión.

Los valores de p se ajustaron utilizando la

corrección

por falso positivo (FDR) y el método de

Benjamini

Hochberg. Los genes asociados de forma más

significativa se destacaron gráficamente utilizando gráficas de tipo volcanes con, en horizontal, la amplitud del cambio de expresión y, en vertical, los valores de p

obtenidos. La importancia biológica de los cambios observados se estimó comprobando si los genes que

resultaron ser expresados diferencialmente parecían estar concentrados o particularmente ausentes de algunas categorías del Ontology. Finalmente, con el software Ingenuity Pathways (IPA) se evaluaron las relaciones entre los genes asociados significativamente con los genotipos del LRP. Los resultactos se registraron en el IPA, y las asociaciones entre las moléculas significativas con otras moléculas, sus funciones y su participación en redes moleculares y en enfermedades se registro. El protocolo usado para el estudio fue el siguiente:

Esquema 1

Recogida de datos (cuestionarios) y muestras (ADN, ARN, suero, plasma, etc)

+

Extraccion de ADN o ARN

+

Genotipado (PCR y secuenciación, PCR en tiempo real, etc)

+

Analisis estadi~ de los datos

~ ~ Estudios funcionales:

Replicacion de los . ,

resultados en una n1veles de protema por ELISA nueva populacion actividad de proteína por ensayo calorimétrico niveles de mARN por PCR en tiempo real Microarrays

2.2.-Resultados

2.2.1.-Análisis genético El análisis estadístico y el genotipado de las

5 muestras se realizaron en dos etapas distintas. En total, los casos de ictus isquémico se dividieron dependiendo de la etiologías en cardioembolicos (50%), aterotromboticos ( 23%) e indeterminados ( 2 7%) . No había diferencias significativas entre los casos y controles de la etapa 1

10 contra los casos y controles del etapa 2. Los factores de riesgo establecidos como por ejemplo el género masculino, la edad, diabetes, hipertensión y el tabaquismo se observaron con una frecuencia mas elevada en el grupo de ictus (Tabla 1)

15 22 SNPs se excluyeron del análisis debido a la frecuencia del alelo menor (MAF) inferior a 1% y 33 SNPs se excluyeron por fallo de genotipado en cualquier fase del análisis, por lo que el análisis estadístico final incluyó 166 SNPs. Teniendo en cuenta un modelo aditivo, un

20 total de 25 SNPs se asociaron a ictus en al menos una etapa del análisis. Seis SNPs situados cerca o dentro de los genes KCNK17 (rs10947803), LRPl (rs7956957), MMP12

(rs2276109), NOS3 (rs10275136 y rs310585) y SCNNlA (rsS 7 42 912) se asociaron con ictus isquémico, en las dos 25 etapas del análisis (Tabla 2). Tabla l. Características de la población de estudio

Total (n=l062) Controles Cases (n=535) (n=527) valor de p

Edad, años ± DE 71.6 ± 7.1 70.7 ± 12.0 <0.05 Hombres, n (%) 230 (42.5) 287 (54. 5) <0.001 Fumadores, n (%) 68 (12.6) 130 (25.9) <0.001

Hipertensión, n (%) 239 (44.2) 308 (59. 2) <0.001 Diabetes mellitus, n (%) 44 (8. 2) 120 (22.9) <0.001

Dislipidemia, n (%) 155 (28. 7) 173 (33 .1) <0.05

Tabla 2. SNPs asociados significativamente a ictus en las

2

etapas del análisis

Etapa

1

Valor de

SNP

Riesgo Controles Casos p OR (95% IC)

rsl0947803

A 17.8 25.3 0.003 1.57 (1.16-2.11)

rs7956957

G 63.0 70.0 0.0261 1.37 (1.04-1.80)

rs2276109

G 9.7 17.7 0.0003 2.00 (1.37-2.91)

rsl0275136

e 93.5 9 7. 2 0.0137 2.35 (1.17-4. 73)

rs310585

A 46.4 58.1 0.0005 1.60 (1.23-2.09)

rs5742912

T 86.8 96.5 3.1E-07 4.19 (2.33-7.54)

Etapa 2

Valor de

SNP

Riesgo Controles Casos p OR (95% IC)

rsl0947803

A 17.8 23.5 0.012 1.42 (1.08-2.12)

rs7956957

G 64.4 70.7 0.0415 1.33 (1.01-1. 76)

rs2276109

G 9.7 14.0 0.0405 1.51 (1.02-2.25)

rsl0275136

e 93.5 9 7. 6 0.0046 2.89 (1.34-6.20)

rs310585

A 44.9 55.4 0.0038 1.52 (1.14-2.03)

rs5742912

T 93.8 9 7. 2 0.0127 2.31 (1.18-4.55)

Total

Valor de

SNP

Riesgo Controles Casos p OR (95% IC)

rsl0947803

A 17.8 24.2 0.003 1.48 (1.14-1.91)

rs7956957

G 63.7 70.3 0.0027 1.35 (1.11-1.64)

rs2276109

G 9.7 15.9 4.3E-05 1.76 (1.34-2.31)

rsl0275136

e 93.5 97.4 0.0002 2.59 (1.55-4.34)

rs310585

A 45.7 56.7 7.9E-06 1.56 (1.28-1.89)

rs5742912

T 91.0 96.8 2.5E-07 3.05 (1.96-4.75)

Curiosamente, la combinación de seis SNPs mostró una 5 clara contribución al riesgo de ictus en comparación con el riesgo acumulado obtenido por los factores de riesgo

clínicos convencionales, incluyendo edad, sexo, tabaquismo, hipertensión y diabetes, con áreas bajo la curva ROC de 0,687 (95% IC: 0,589-0,669) contra 0,629 (IC 95%: O, 649 a O. 725) (Figura 1). Además, el riesgo aumenta con el número de variantes genéticas que presenta el paciente (Figura 2), y el riesgo aumenta con la cantidad de marcadores genéticos y/o variable de riesgo clínicos presentes, aunque nadie en nuestra población presentaba más de 9 factores de riesgo (Figura 3) . Por último, se diseñó un modelo predictivo de riesgo para crear categorías de bajo a alto riesgo de ictus. Las seis variables clínicas y seis variantes genéticas replicadas se introdujeron en el modelo. Todas las variables son independientes unas de la otras. El test de Hosmer y Lemeshow mostró que nuestro modelo se adapta muy bien a los datos. Una puntuación de riesgo se asignó a cada variable y una escala de riesgo de 1 a 45 (Figura 4) se utilizó para clasificar a los sujetos en tres categorías. El riesgo de ictus fue definido como bajo (puntuación :<::; 18), moderado (19 <puntuación :<::; 26) o alto (26 <puntuación) (Figura 5). 2.2.2.-Análisis funcionales

La expresión génica de SCNN1A, medida en 26 controles sanos, reveló que los portadores de TT tenían niveles de ARNm significativamente superiores a los TC y ce (TT: 109 ± 40%, CT: 60 ± 28%, ce: 58 ± 25%, p o, 005) Sin embargo, la expresión génica de LRP1 se determinó en 18 controles sanos, pero ninguna asociación se observó entre el SNP rs7956957 y los niveles de ARNm (GG: 114 ± 73%, CG: 105 ± 60%, CC: 96 ± 47%, p = 0.578). Además, los niveles de ARNm del gen KCNK1 7 dependían de los alelos del SNP rs10947803 (p 0,021). Los portadores del alelo A presentan niveles más altos que los C (114 ± 35%, n = 5 vs 77 ± 38%, n 8). Por otra parte, la actividad de la proteína NOS3 determinada en 80 controles sanos reveló que los dos alelos de riesgo para ictus, los SNPs rs310585 y rs10275136, se asociaban a niveles menores de actividad de la proteína (A: 6,8 ± 2,0 mM, G: 8,0 ± 3,4 mM, p = 0,005 y

C: 7,2 ± 2,7 mM, T: 8,8 ± 3,6 mM, p = 0,027). Por otro lado, la expresión génica del MMP12 no se pudo detectar en 12 controles sanos. Sin embargo, los niveles de proteína MMP12 se determinaron en 14 controles sanos por Luminex y solo pudimos detectar unos niveles muy bajos de MMP12 en 6 muestras, pero ninguna asociación con los genotipos del SNP rs2276109 (AA: 22,4 ± 13,3 años, AG: 18,1 ± 12, 8, AP: 11,6 pg 1 mg de proteína total, p = 0,704). Por último, el análisis por microarrays en 12 sujetos revelaron que los genotipos del SNP rs7956957 del gen LRP se asocian con la expresión de varios genes después de corrección por la tasa de descubrimiento falso (FDR) y el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) identificó varias redes asociadas a los genotipos del LRP. Notablemente, el alelo de riesgo del SNP rs7956957 (alelo G) se asoció con una menor expresión de genes implicados en procesos inflamatorios,

tales

como CLEC4C o los complementos 4A y 4B (C4A y C4B),

mientras

que se asoció con un incremento de la expresión

de

genes implicados en apoptosis como ITGB3, ALOX12, NEK1

o GOS2.

2.3.-Discusión

En este estudio caso-control, los inventores analizaron la asociación de 221 SNPs funcionalmente relacionados con las enfermedades neurovasculares en una población mediterránea. Tras el análisis multivariante, ajustado por factores de riesgo convencionales, los inventores podrían replicar una asociación estadísticamente significativa entre seis SNPs

(rs10947803, rs7956957, rs2276109, rs10275136, rs310585 y rs5 7 42 912) y el riesgo de accidentes neurovasculares, o ictus.

El SNP rs5742912 del gen SCNNlA es un cambio de aminoácido importante al nivel estructural de la proteína se trata de un cambio triptófano por arginina

(Trp493~Arg), cambiando un aminoácido cíclico no polar por un aminoácido de carga positiva. El gen codifica una subunidad de la proteína ENaC, un canal de sodio que está

presente

en las células epiteliales, junto con otras dos

subunidades,

SCNN1B y SCNN1G [15] El papel de esta

proteína

en la homeostasis del sodio, osmolaridad

plasmática y la regulación de la presión arterial lo ha convertido en un candidato ideal para estudiar el desarrollo de enfermedades complejas como el ictus, el infarto de miocardio o la insuficiencia renal [16] . De hecho, el eNaC es importante por el paso limitante en la velocidad de reabsorción de sodio y es sensible al amiloride, un diurético que puede bloquear el canal de sodio e inhibe su asimilación, utilizado en el tratamiento de la hipertensión e insuficiencia cardíaca congestiva [17]. A nivel genético, el SNP rs5742912 de SCNN1A se ha asociado con el ictus isquémico [11]. En nuestro estudio, la asociación resistió corrección de Bonferroni y alcanzó un valor de p de 2. SE-O 7 y un OR de 3, 59, valores muy bajos para un estudio de genes candidatos. Los inventores también demuestran aquí por primera vez que este SNP está asociado a niveles de ARNm del gen SCNN1A, y los portadores del alelo de riesgo T mostraron niveles significativamente más elevados que los portadores del alelo C. Al ser un SNP no sinónimo, esperamos que pudiera afectar a la actividad de la proteína además del ARNm, sobre todo porque el SNP se encuentra en el dominio extracelular, donde se unen diferentes ligandos y el amiloride. Estos resultados son consistentes con otros estudios que muestran que otras variantes de la subunidad a se asocian con aumentos de actividad de esta proteína en células epiteliales humanas [18]. Los inventores

observaron niveles mayores de ARNm asociados con el alelo de riesgo T, que es también el alelo más común. El gen SCNN1A se encuentra en el cromosoma 12p13, donde un GWAS mostró recientemente una asociación robusta con el locus genético del gen NINJ2 y el ictus, lo que indica que esta región podría ser de hecho una región importante de susceptibilidad para sufrir un accidente cerebrovascular

[5].

Otro SNP localizado en el cromosoma 12 se asoció con ictus isquémico en nuestro estudio. De hecho, el alelo G del rs7956957 del gen LRP1 en el locus 12q13 fue identificado como factor de riesgo en todas las etapas de nuestro estudio y en todas las etiologías de ictus, aunque no se asoció a los niveles de ARNm. El SNP está en ligamiento con muchos otros SNPs del gen, aunque el único SNP funcional descrito (C766T o rs1799986) se encuentra en otra región diferente del gen, compuesto de 8 9 exones, y no está en desequilibrio de ligamiento con el SNP rs7956957. Nada se sabe sobre este SNP (rs7956957), se trata de un SNP intrónico que se seleccionó en este estudio como un Taq-SNP para LRP1. El efecto del rs7956957 en ictus se examinó también mediante microarrays e

identificamos

varios genes interesantes asociados a los

genotipos

del rs7956957 como ALOX12, ITGB3, MPL, C4a y

C4b.

Una representación combinada de las dos redes

principales identificadas por el software IPA reveló que los genes implicados podrían tener un papel importante en los procesos biológicos de apoptosis, señalización celular, muerte celular e inflamación. La fusión de estas redes indica también que algunos genes como el LDL, NFKB, CDKN1A, y p38-MAPK podrían ser reguladores importantes de estas redes. El mecanismo del efecto del rs7956957 en el ictus isquémico todavía no está claro pero podría ser debido a una modulación de la actividad de la proteína ya que no afecta a la expresión de ARNm del LRP1, aunque los

resultactos indicaron que los casos de ictus presentaban niveles significativamente más bajos de ARNm que los controles sanos.

Otros dos genes que han sido identificados en nuestro estudio, MMP12 y NOS3, están involucrados en procesos de inflamación. La proteína MMP12 se ha relacionado con accidente cerebrovascular isquémico, gracias a su papel en la estabilidad de la placa aterosclerótica, mientras que el gen MMP12, localizado en el cromosoma 11q22 se ha relacionado con la enfermedad coronaria y el ictus hemorrágico [21-22]. El SNP rs2276109 se asoció con accidente cerebrovascular isquémico en nuestra cohorte. Es una sustitución de A por G en la región promotora del gen, y se ha demostrado ser funcional, al influir en la capacidad de unión del factor de transcripción AP -1 en ensayos de electromobilidad [23]. El alelo A se asocia con una mayor actividad del promotor de MMP12 in vitro en los estudios de transfección transitoria, y se asocia con un menor riesgo de ictus isquémico en nuestro estudio. Por tanto, parece que una disminución de actividad del promotor de MMP12, a través del alelo G del SNP rs2276109, podría estar asociada con un mayor riesgo de ictus. La expresión génica y los niveles de proteína de MMP12 se midieron en controles sanos, con el fin de entender mejor la contribución de la variante rs2276109, pero los niveles de ARNm y proteínas eran apenas perceptibles e insuficientes para sacar conclusiones. Se utilizaron muestras de sangre, mientras que la MMP12 se manifiesta, principalmente, en macrófagos activados y células del estroma, lo que podría explicar por qué no se detectó.

El NOS3, en el cromosoma 7q36, también se asoció con ictus en este estudio. De hecho, se observó una asociación de dos SNPs en este gen, rs10275136 y rs310585, este último llegando a valores de p de 7. 9E-06. Ambas asociaciones resistieron la corrección de Bonferroni.

Estos 2 SNPs no están en desequilibrio de ligamiento y,

por tanto son independientes entre ellos y se ubican en la

región 5 'del NOS3. Se seleccionaron para este estudio

como Tag SNPs y su función es desconocida. La proteína

5

NOS3, también conocida como eNOS o cNOS participa en

muchos procesos biológicos, incluyendo la hipertensión y

los espasmos coronarios [ 2 4 J . Cataliza la generación de

óxido nítrico en los vasos sanguíneos a partir de L-

arginina, y es particularmente importante en la

10

señalización celular y la regulación de la función

vascular [25]. A nivel genético, algunos polimorfismos en

este gen se han asociado con ictus, infarto de miocardio,

hipertensión y cardiopatía coronaria [26] . Curiosamente,

mientras que los 3 otros SNP se asociaron con todos los

15

subtipos de ictus isquémico, estas dos variantes son

específicas de la etiología cardioembólica, lo que indica

que podrían estar asociados con otros trastornos

cardiovasculares. Por otra parte, los dos alelos de riesgo

se asociaron con una menor actividad de la proteína NOS3 y

2O

los casos de ictus presentaron niveles más bajos que los

controles sanos, lo que indica que niveles bajos de NOS3

podrían ser factores de riesgo para ictus. De hecho, esta

hipótesis esta en concordancia con estudios anteriores que

muestran que NOS3 es un regulador importante del f 1 uj o

25

sanguíneo cerebral, especialmente durante la isquemia

cerebral, donde se ha demostrado que presenta efectos

neuroprotectores a través de una perfusión mejor y un

tamaño de ictus menor [27-28].

El alelo A del SNP rs10947803 del gen KCNK17 se

30

asoció independientemente con ictus isquémico en este

estudio con una OR de 1,47 (p = 0,010) Poco se sabe sobre

el gen KCNK17, pero se expresa ampliamente, sobre todo en

hígado, pulmón, placenta, páncreas, intestino y aorta

[ 2 9] . Niveles altos de mRNA del gen KCNK1 7 se asociaron

35

con un mayor riesgo de ictus isquémico. El mecanismo de

esta asociación se desconoce y el SNP es intrónico y por lo tanto no pertenece a la región promotora del gen. La proteína codificada por el gen KCNK17 es un miembro de la superfamilia de canales de K+ [29-30]. Estos canales 5 regulan los flujos celulares de iones y en consecuencia el volumen celular, así como la acidosis metabólica y la hipotensión provocada por la secreción de HC0-3 [31-34] y teniendo en cuenta su función y su localización en muchos tejidos, podría desempeñar un papel importante en el

10 ictus, siendo un disparador principal común a todos los subtipos de ictus. En resumen, se observó que seis SNPs fueron factores de riesgo independientes de ictus en la población española. Cuatro de estos SNPs, en los genes KCNK17,

15 SCNN1A y NOS3, mostraron una clara influencia sobre la función del gen o la proteína correspondiente, y un SNP en el gen MMP12 tenía también un efecto claro como se describe en otro estudio [23]. A continuación se evaluó la asociación acumulada de

20

estas variantes. El principal objetivo era establecer si

la

combinación de al menos dos de estos SNP,

preferiblemente

tres SNP, mejor cuatro SNPs, todavía mejor

cinco

SNP, y el óptimo seis SNPs, podría predecir el

riesgo

de accidente cerebrovascular mejor que cada SNP de

25

forma individual, y si los inventores podrían mejorar la

discriminación

entre los sujetos de riesgo, en combinación

con

factores de riesgo clásicos, en contraste con los

factores

de riesgo clásicos solos. Los resultados de este

análisis

mostraron que el riesgo aumentó gradualmente con

3O

el número de alelos del riesgo portados. De hecho, la

asociación

acumulada de los seis SNPs tenía un valor de

predicción positiva

superior a la adición del OR de cada

SNP

de forma individual. Los portadores de todos los

alelos

de susceptibilidad presentaban un riesgo de ictus

35

de casi el 100% comparándolo con controles sanos. Por otra

parte, la contribución de la información genética con factores de riesgo clásicos era significante, como se indica en la gráfica de las curvas ROC con los factores clínicos o clínicos y genéticos, así que los inventores asignaron una puntuación a cada SNP y cada factor de riesgo convencional, en función de su efecto sobre el ictus. El modelo predictivo obtenido finalmente permito la

distinción

de varias categorías de riesgo ictus, para

clasificar

a los sujetos en categorías de riesgo bajo,

moderado

o alto. Los inventores creen que este modelo

podría

ser un instrumento importante en medicina

preventiva, ya que el ictus supone una carga enorme para el sistema de salud y sobre todo para los pacientes. Ellos podrían beneficiarse de una prevención primaria individualizada y específica. De hecho, la combinación de SNPs presentada aquí podría aportar información clínica nueva e importante por lo menos al mismo nivel que factores de riesgo clásicos como la hipertensión, el tabaquismo o la diabetes. Los resultados obtenidos en este estudio permitirán clasificar mejor los individuos que presentan un riesgo moderado basado en factores clínicos, y que podrían realmente pertenecer al grupo de alto riesgo según este modelo de combinación genética y clínica.

En este estudio, los inventores encontraron sorprendentemente que a partir de una combinación de al menos dos de los SNPs descritos anteriormente, la predicción del riesgo medido era mejor que cualquier herramienta de predicción descrita en la literatura, y los inventores fueron capaces de prever que el riesgo de sufrir un ictus aumentaba con el número de SNPs portados, como se muestra en la tabla adyacente. En otras palabras, la combinación de dos de los SNPs mencionados indicaba un riesgo individual de accidente cerebrovascular de al menos 3,417 veces más alto que una persona que, en las mismas condiciones ambientales, no presenta ninguno de

estos SNPs. Como se muestra en la tabla, esta relación aumenta de manera dramática a medida que aumenta el número de SNPs, no sólo a través de un efecto sumatorio, sino a través de un efecto multiplicador, el modelo es óptimo 5 cuando el número de SNPs es de seis. La combinación de al menos dos SNPs es entonces un buen modelo para predecir el riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular, pero la combinaciones de tres, cuatro o cinco SNPs es cada vez mejor hasta seis SNPs que es la combinación óptima

10 de predecir el riesgo de accidente cerebrovascular.

Tabla 3. Combinaciones de SNPs significativamente asociados a ictus

Numero de SNPs

OR 95% IC

1

1

-

2

3.417 0.670-17.426

3

6.159 1.261-30.089

4

10.26 2.095-50.326

5+

26.056 4.672-145.308

15

Métodos

y kits para su aplicación

La

presente invención se refiere también a un método

para

la determinación de la predisposición genética a

2 O

enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un

individuo,

que comprende la detección de los alelos de al

menos

dos SNPs seleccionados del grupo que consiste en

rs2276109,

rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y

rs10947803

en un una muestra de ácido nucleico aislado de

25

un individuo.

En

una realización preferida, dicho método se utiliza

para

determinar la predisposición genética a enfermedades

neurovasculares,

en particular ictus, en un individuo y

comprende la detección de los alelos de tres SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2 2761 O9, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo.

En una realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo y comprende la detección de los alelos de cuatro SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo.

En una realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo y comprende la detección de los alelos de cinco SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs10947803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo.

En la realización más preferida, dicho método se utiliza para determinar la predisposición genética a enfermedades neurovasculares, en particular ictus, en un individuo que comprende la detección de los alelos de los seis SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957, rs5742912 y rs1094 7803 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo.

En una realización particular, los alelos detectados

de

acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores

serían

un alelo G de rs7956957, A de rs310585, G de

r s 2 2 7 61 O 9,

e de r s 1 O 2 7 513 6, T de r s 57 4 2 912 y A de

rs1094 7803.

La muestra de ácido nucleico aislado del individuo utilizada en cualquiuera de las realizaciones del método de la presente invención puede comprender ADN o ARN. Por otra parte, dicha muestra de ácido nucleico puede ser amplificada, generalmente por una reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), de la forma establecida en la técnica.

La detección de los SNP puede realizarse mediante

cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por

ejemplo sin limitarse a éstos, mediante hibridación de una

5

sonda de ácido nucleico o de oligonucleótidos, o mediante

marcadores radiactivos, enzimáticos, luminosos o

fluorescentes [35: pagina 4183 y 36: páginas 246-247].

Dicha sonda o secuencia de oligonucleótido comprende

una secuencia que es totalmente complementaria a una

1O

secuencia de ácido nucleico que comprende los SNPs

divulgada en la presente invención (SEC ID N o 1 a SEC ID

N ° 6).

En una realización preferida, la presente invención

se refiere al método según cualquiera de las

15

realizaciones descritas anteriormente en el que por lo

menos dos, tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con

una o más variables clínicas asociadas con una enfermedad

neurovascular, en particular ictus.

Preferentemente, dichas variables clínicas se

20

seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión,

diabetes y dislipidemia.

En una realización particular, la presente invención

se refiere al método según cualquiera de las realizaciones

descritas anteriormente en el que los alelos de dichos

25

SNPs se deducen mediante pruebas genéticas.

En otra realización, la presente invención se refiere

al método según cualquiera de las realizaciones descritas

anteriormente en el que los alelos de dichos SNPs se

deducen de los niveles de actividad o concentración de las

30

proteínas, o de los correspondientes niveles de expresión

de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK1 7, MMP12 y/o LRP, que son

modulados por la presencia de los marcadores genéticos,

tal como se muestra en la sección de resultados.

En una realización particular, la presente invención

35

se refiere al método según cualquiera de las realizaciones

descritas anteriormente en el que dichos al menos dos,

tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con los SNPs

rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343,

rs6007897, rs4044210 y rs2200733.

5

En una realización particular, la presente invención

se refiere al método según cualquiera de las realizaciones

descritas anteriormente, que comprende además la

comparación de la combinación de alelos obtenida para un

individuo con la combinación de alelos obtenida para otro

1 O

individuo afectado por una enfermedad neurovascular, en

particular ictus, y la detección de la predisposición

genética a una enfermedad neurovascular, en particular

ictus, si el individuo a ser analizado presenta la misma

carga genética que el individuo afectado. En una

15

realización más preferida, dicho otro individuo tiene una

relación familiar con el individuo a analizar.

Preferentemente, en todas las realizaciones del

método anteriores dicha enfermedad neurovascular es el

ictus.

20

En una realización particular, el método según

cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente

para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una

enfermedad neurovascular, preferentemente ictus, se aplica

a un individuo perteneciente a la población mediterránea.

25

En una realización más particular, dicho individuo

pertenece a la población española.

La presente invención se refiere además un kit para

determinar el riesgo de un individuo de sufrir una

30

enfermedad neurovascular, en particular ictus, que

comprende:

(A) Dos o más sondas que permiten detectar los alelos de

los SNPs rs2276109, rs10275136, rs310585, rs7956957,

rs10947803 y rs5742912.

35

(B) Instrucciones para usar el kit y determinar el riesgo

de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, en

particular ictus, teniendo en cuenta la combinación de

SNPs presentada.

En una realización preferida, se detectan dos SNPs

5

asociados a una enfermedad neurovascular, en particular

ictus.

En una realización preferida, se detectan tres SNPs

asociados a una enfermedad neurovascular, en particular

ictus.

10

En una realización más preferida, se detectan cuatro

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en

particular ictus.

En una realización más preferida, se detectan cinco

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en

15

particular ictus.

En la realización más preferidq se detectan los seis

SNPs asociados a una enfermedad neurovascular, en

particular ictus.

Dichas dos o más sondas del kit pueden marcarse. De

2 O

manera opcional, el kit puede comprender reactivos tales

como soluciones de dilución, tampones de reacción, enzimas

de polimerización y/o oligonucleótidos (cebadores). Al

utilizar sondas marcadas radioactivamente, la hibridación

puede ser detectada por autorradiografía, centelleo,

25

contador o contador gamma.

En ciertas realizaciones del kit, éste puede

comprender además oligonucleótidos (cebadores) para la

amplificación o secuenciación y estos pueden ser

específicos de las secuencias SEC ID N o 1 a 6.

30

El kit también puede comprender también reactivos

para el marcaje de uno o más de los oligonucleótidos

específicos de secuencia, o puede comprender

oligonucleótidos marcados específicos de secuencia. Los

marcadores útiles incluyen radioisótopos, así como grupos

35

no radioactivos. Los marcadores isotópicos incluyen 3 H,

35 s, 32p, 125 I, 57Co y 14C. Los marcadores isotópicos pueden

ser introducidos en el oligonucleótido mediante técnicas

descritas en la literatura. Los marcadores no isotópicos

pueden ser fluorescentes, de quimioluminiscencia, enzimas,

5

cofactores, sustratos de la enzima, haptenos u otros

ligandos.

En una realización preferida, la presente invención

se refiere al kit según cualquiera de las realizaciones

descritas anteriormente en el que dichos por lo menos dos,

10

tres, cuatro, cinco o seis SNPs se combinan con una o más

variables clínicas asociadas con una enfermedad

neurovascular, en particular ictus. Preferentemente,

dichas variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo,

tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia.

15

En una realización particular, en el kit de acuerdo

con las realizaciones anteriores, los alelos de dichos

SNPs se deducen mediante pruebas genéticas de otros

marcadores o midiendo los niveles de actividad o

concentración de las proteínas, o los correspondientes

20

niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNNlA, KCNK17, MMP12

y/o LRP.

Preferentemente, en todas las realizaciones

anteriores del kit, la enfermedad neurovascular es el

ictus.

25

En una realización particular, dicho kit para

determinar el riesgo individual de un individuo de sufrir

una enfermedad neurovascular, preferiblemente ictus, se

aplica a un individuo perteneciente a la población

mediterránea.

3O

En una realización más particular, dicho individuo

pertenece a la población española.

La presente invención se refiere además a la

utilización de la combinación de al menos dos SNPs

seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136,

35

rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912 y todas las

realizaciones de la combinación descritas en la presente

invención en un kit para determinar el riesgo de un

individuo de sufrir una enfermedad neurovascular,

preferiblemente el ictus.

5

En una realización particular, dicho uso se aplica a

un individuo perteneciente a la población mediterránea.

En una realización más particular, dicho individuo

pertenece a la población española.

La presente invención se refiere además a la

10

utilización de la combinación de al menos dos SNPs

seleccionados entre los SNPs rs2276109, rs10275136,

rs310585, rs7956957, rs10947803 y rs5742912, indicativos

del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad

neurovascular, preferiblemente el ictus, y todas las

15

realizaciones de la combinación descritas en la presente

invención como una herramienta de prueba genética para una

enfermedad neurovascular, preferiblemente el ictus.

En una realización particular, dicho uso se aplica a

un individuo perteneciente a la población mediterránea.

2 O

En una realización más particular, dicho individuo

pertenece a la población española.

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Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Combinación de polimorfismos de nucleótido único

   (SNPs) que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912, indicativa del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular.
2. 2.-La combinación según la reivindicación 1, donde dicha combinación de SNPs se combina con uno o más de los SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733.
3. 3.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha combinación de polimorfismos de nucleótido único se combina con una o más variables clínicas asociadas con una enfermedad neurovascular.
4. 4.-La combinación según la reivindicación 3, donde dicha variable clínica se selecciona entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia.
5. 5.-Combinación de polinucleótidos aislados incluidos en genes asociados a enfermedades neurovasculares que comprenden cada uno de dichos polinucleótidos un SNP de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912, indicativa del riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular, correspondiendo dichos polinucleótidos aislados a las SEC ID N 1, 2, 3 y 6, respectivamente.

   o
6. 6.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 o LRP.
7. 7.-La combinación según la reivindicación S en la que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12

   o LRP.
8. 8.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6, donde la enfermedad neurovascular es el ictus.
9. 9.-La combinación según la reivindicación 5 ó 7, donde la enfermedad neurovascular es el ictus.
10. 10.-Un método para la determinación de una predisposición genética a las enfermedades neurovasculares de un individuo, que comprende la detección de los alelos de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912 en una muestra de ácido nucleico aislado de un individuo.
11. 11.-El método según la reivindicación 10, donde se detectan un alelo A para rs310585, un alelo G para rs2276109, un alelo C para rs10275136, o un alelo T para

    rs5742912.

12. 12.-

    El método según cualquiera de las

    reivindicaciones

    10 u 11, donde la muestra de ácido

    nucleico comprende ADN.

13. 13.-

    El método según cualquiera de las

    reivindicaciones 10-12, donde la muestra de ácido nucleico comprende ARN.
14. 14.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dichos SNPs se detectan por hibridación de una sonda de ácido nucleico o secuencia de oligonucleótido, o mediante marcadores radiactivos, enzimáticos, luminosos o fluorescentes.
15. 15.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, donde dicha combinación de SNPs se combina con una o más variables clínicas asociadas con enfermedades neurovasculares.
16. 16.-El método según la reivindicación 15, donde dichas variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia.
17. 17. -El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, donde dicha combinación de SNPs

    se

    combina con uno o más de los SNPs rs7956957,

    rs10947803,

    rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778,

    rs7193343,

    rs6007897, rs4044210 y rs2200733.

18. 18.-

    El método según cualquiera de las

    reivindicaciones 10 a 17, en el que los alelos de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y/o LRP.
19. 19.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, que comprende además la

    comparación de la combinación de alelos obtenida para un individuo con la combinación de alelos obtenida para otro individuo afectado por una enfermedad neurovascular y la detección de la predisposición genética a una enfermedad neurovascular si el individuo a ser analizado presenta la misma carga genética que el individuo afectado
20. 20.-El método según la reivindicación 19, donde el otro individuo tiene una relación familiar con el

    individuo

    a analizar.

21. 21.-

    El método según cualquiera de las

    reivindicaciones

    10 a 20, donde dicha enfermedad

    neurovascular

    es el ictus.

22. 22.-Un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir dicha enfermedad neurovascular que comprende,

    (a)

    Sondas que permiten detectar los alelos de la combinación de SNPs que comprende rs2276109, rs10275136, rs310585, y rs5742912.

    (b)

    Instrucciones para usar el kit y determinar el riesgo del individuo de sufrir una enfermedad neurovascular teniendo en cuenta la combinación de SNPs presentada.

23. 23.-El kit según la reivindicación 22, donde una o más sondas están marcadas.
24. 24.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, que incluye un reactivo para detectar el marcador.
25. 25.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde dicha combinación de SNPs se combina con variables clínicas asociadas con una enfermedad neurovascular.
26. 26.-El kit según la reivindicación 25, donde las variables clínicas se seleccionan entre edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, diabetes y dislipidemia.
27. 27.-El kit según las reivindicaciones 22 a 26, donde dicha combinación de SNPs se combina con uno o más de los SNPs rs7956957, rs10947803, rs405509, rs4934, rs2720723, rs2295778, rs7193343, rs6007897, rs4044210 y rs2200733.
28. 28.-El kit según las reivindicaciones 22 a 27, donde los alelas de dichos SNPs se deducen mediante pruebas genéticas o midiendo los niveles de actividad o concentración de las proteínas, o los correspondientes niveles de expresión de ARN de NOS3, SCNN1A, KCNK17, MMP12 y/o LRP.
29. 29.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, donde dicha enfermedad neurovascular es el ictus.
30. 30.-El uso de la combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un kit para determinar el riesgo de un individuo de sufrir una enfermedad neurovascular.
31. 31.-El uso de la combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como herramienta de prueba genética para enfermedades neurovasculares.
32. 32.-El uso según las reivindicaciones 30 ó 31, donde dicha enfermedad neurovascular es el ictus.
33. 33.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea.
34. 34.-La combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho individuo pertenece a

    la población española.
35. 35.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea.

    5 36.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, donde dicho individuo pertenece a la población española.
36. 37.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, donde dicho individuo pertenece a la población 10 mediterránea.

    38-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, donde dicho individuo pertenece a la población española.
37. 39.-El uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 30 a 32, donde dicho individuo pertenece a la población mediterránea.
38. 40.-El uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, donde dicho individuo pertenece a la población española.