ES2385904B1

ES2385904B1 - PROCEDURE FOR MONITORING THE EVAPORATION OF A CELL CULTURE.

Info

Publication number: ES2385904B1
Application number: ES201000818A
Authority: ES
Inventors: Enric Claverol Tinture; Lin Wang
Original assignee: Universitat Politecnica de Catalunya UPC
Current assignee: Universitat Politecnica de Catalunya UPC
Priority date: 2010-06-16
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2014-02-04
Anticipated expiration: 2030-06-16
Also published as: ES2385904A1

Abstract

Procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular en un dispositivo de tecnología microfluídica provisto de al menos un microcanal, que comprende la etapa de registrar la impedancia entre los dos extremos del microcanal durante un período de tiempo. Dicho procedimiento se basa en la observación de que hay una relación entre la evaporación y la variación temporal de la resistividad eléctrica en un medio de cultivo. Preferiblemente se aplica una corriente alterna y se mide la impedancia a través de dos electrodos dispuestos en contacto con el cultivo celular.Method for monitoring the evaporation of a cell culture in a microfluidic technology device provided with at least one microchannel, which comprises the step of recording the impedance between the two ends of the microchannel for a period of time. This procedure is based on the observation that there is a relationship between evaporation and the temporary variation of the electrical resistivity in a culture medium. Preferably an alternating current is applied and the impedance is measured through two electrodes arranged in contact with the cell culture.

Description

Procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular Procedure to monitor the evaporation of a cell culture

SECTOR DE LA TÉCNICA SECTOR OF THE TECHNIQUE

5 La presente invención se refiere a un procedimiento para monitorizar la The present invention relates to a method for monitoring the

evaporación de un cultivo celular en un dispositivo de tecnologia microfluidica provisto de al menos un microcanal. Se entiende por micro canal un conducto cuyas dimensiones transversales van desde 0,1 micras hasta 500 micras. evaporation of a cell culture in a microfluidic technology device provided with at least one microchannel. A micro channel is understood as a conduit whose transverse dimensions range from 0.1 microns to 500 microns.

10 los microcanales forman parte a menudo de dispositivos "Iab-on-a chip" 10 microchannels are often part of "Iab-on-a chip" devices

(laboratorio en un chip) y, cuando se integran en una cámara que contiene un (lab on a chip) and, when integrated into a camera that contains a

cultivo celular, pueden muestrear continuamente el medio del cultivo celular. cell culture, can continuously sample the cell culture medium.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE

15 Las incubadoras diseñadas para qultivos celulares se suelen humidificar para alcanzar una humedad relativa del 100% Y minimizar la evaporación , pero normalmente persiste una evaporación residual. Por ejemplo se ha medido una velocidad de evaporación de 4,6 micro1itros/día en un solo pozo de una 15 Incubators designed for cell cultures are usually humidified to achieve a relative humidity of 100% and minimize evaporation, but residual evaporation usually persists. For example, an evaporation rate of 4.6 micro1iters / day has been measured in a single well of one

2 O placa con 96 pozos. los pozos descubiertos que hay fuera de la incubadora 2 O plate with 96 wells. the wells discovered outside the incubator

presentan una evaporación mucho mayor, de hasta decenas de they have a much greater evaporation, of up to tens of

microlitros/hora, por ejemplo 30 microlitros/hora a 25°C y un 65% de humedad atmosférica _ microliters / hour, for example 30 microliters / hour at 25 ° C and 65% atmospheric humidity _

25 Un cultivo celular es una solución acuosa y la evaporación del agua da lugar a una variación en la osmolaridad de la solución, que es una medida de la concentración de soluto. En el contexto de la" presente invención dichos cultivos se emplean en ensayos de electrofisiologia, que es el estudio de las propiedades eléctricas de las células e incluye medidas del potencial de 30 membrana de la célula. 25 A cell culture is an aqueous solution and the evaporation of water results in a variation in the osmolarity of the solution, which is a measure of the solute concentration. In the context of the "present invention, said cultures are used in electrophysiology tests, which is the study of the electrical properties of cells and includes measurements of the cell membrane potential.

la evaporación del cultivo celular en las cámaras de dispositivos "Iab-on-aevaporation of cell culture in the cameras of devices "Iab-on-a

chip" puede controlarse a base de cerrar herméticamente dichas cámaras, pero entonces las falta de acceso de CO, a las cámaras impide el uso de 35 buffers de bicarbonato para controlar el pH. Se puede mejorar la situación chip "can be controlled by tightly closing said chambers, but then the lack of CO access to the chambers prevents the use of 35 bicarbonate buffers to control the pH. The situation can be improved

utilizando membranas semipermeables a gases, como por ejemplo una using semipermeable gas membranes, such as a

película de etileno-propileno fluorado, para cerrar la cámara, ya que dejan fluorinated ethylene-propylene film, to close the chamber, since they leave

, ,

pasar el CO, pero retienen el vapor de agua en la cámara. pass the CO, but retain the water vapor in the chamber.

5 5: Otra estrategia para frenar la evaporación hace uso de capas de aceite flotante en pequeños viales. Se trata de una técnica utilizada habitualmente durante la amplificación PCR (Polymerase Chain Reaction), por ejemplo. Another strategy to stop evaporation makes use of layers of floating oil in small vials. This is a technique commonly used during PCR amplification (Polymerase Chain Reaction), for example.

1 0 1 0: También es posible compensar los cambios en la osmolaridad del medio acuoso mediante el uso de bombas de perfusión. Sin embargo, en ausencia de datos frecuentes de retroalimentación, todas estas medidas están sujetas a desviaciones en la osmolaridad . It is also possible to compensate for changes in the osmolarity of the aqueous medium through the use of perfusion pumps. However, in the absence of frequent feedback data, all these measures are subject to deviations in osmolarity.

1 5 fifteen: La lectura continua de la osmolaridad es crucial para realizar experimentos a largo plazo con células en dispositivos microfluidicos o de tecnologia microfluídi~a, es decir, que utilizan microfluidos, que son fluidos en conductos o canal.es (microcanales) cuyas dimensiones transversales van desde 0,1 micras hasta 500 micras, en los cuales el volumen del medio de cultivo es de nanolitros o microlitros. The continuous reading of osmolarity is crucial for long-term experiments with cells in microfluidic or microfluidic technology devices, that is, they use microfluids, which are fluids in ducts or canal.es (microchannels) whose transverse dimensions range from 0.1 microns to 500 microns, in which the volume of the culture medium is nanoliters or microliters.

2O 2O: Se desprende que monitorizar la evaporación en un dispositivo microfluidico es critico para conocer el estado del cultivo celular, ya que la evaporación residual puede afectar apreciablemente la precisión de los ensayos y la viabilidad de los cultivos. It follows that monitoring evaporation in a microfluidic device is critical for knowing the state of cell culture, since residual evaporation can significantly affect the accuracy of the assays and the viability of the cultures.

25 30 35 25 30 35: La solicitud de patente PCT/EP2008/061584 (Enrie Claverol), presenta un aparato para registrar la actividad eléctrica producida por células in-vitro que comprende un dispositivo provisto de una estructura polimérica, la cual comprende un par de pozos o cámaras para el cultivo celular unidos por un microcanal y un par electrodos que se sumergen en dichos pozos y permiten medir la diferencia de potencial entre ellos, es decir, entre los dos extremos del microcanal. Un dispositivo de este tipo es particularmente adecuado para monitorizar la evaporación mediante un procedimiento de acuerdo con la presente invención , aunque la técnica propugnada es aplicable a una amplia variedad de dispositivos microfluidicos provistos de una estructura de microcanales. Patent application PCT / EP2008 / 061584 (Enrie Claverol), presents an apparatus for recording the electrical activity produced by in-vitro cells comprising a device provided with a polymeric structure, which comprises a pair of wells or chambers for cultivation cell joined by a microchannel and a pair of electrodes that are submerged in said wells and allow to measure the potential difference between them, that is, between the two ends of the microchannel. Such a device is particularly suitable for monitoring evaporation by a method according to the present invention, although the proposed technique is applicable to a wide variety of microfluidic devices provided with a microchannel structure.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION

Un objetivo de la presente invención es el de proporcionar una manera An objective of the present invention is to provide a way

sencilla de utilizar una estructura de microcanales prevista para experimentos simple to use a microchannel structure intended for experiments

5 5: de electrofisiologia como sensor de evaporación. of electrophysiology as evaporation sensor.

El procedimiento desarrollado se basa en la observación de que hay una The procedure developed is based on the observation that there is a

relación entre la evaporación y la variación temporal de la resistividad relationship between evaporation and temporal variation of resistivity

eléctrica en un medio de cultivo. electric in a culture medium.

10 10

De acuerdo con un aspecto de la invención, el procedimiento para monitorizar According to one aspect of the invention, the procedure for monitoring

la evaporación comprende la etapa de registrar la impedancia entre los dos evaporation comprises the stage of recording the impedance between the two

extremos del microcanal durante un periodo de tiempo. De este modo tan microchannel ends for a period of time. In this way so

sencillo se puede aprovechar la estructura de microcanales existente en simple you can take advantage of the existing microchannel structure in

15 fifteen: numerosos dispositivos "Iab-on-a-chip" sin necesidad de introducir en ellos numerous "Iab-on-a-chip" devices without having to enter them

modificaciones destacables. Así, la medida de la evaporación resulta barata Notable modifications Thus, evaporation measurement is cheap

utilizando este procedimiento, ya que tampoco hay que utilizar un osmómetro using this procedure, since you don't have to use an osmometer either

separado. separated.

2 O 2 o: Además, con el procedimiento de la invención no hay que consumir la In addition, with the process of the invention it is not necessary to consume the

muestra (el medio de cUltivo), como sucede con los osmómetros sample (the medium of cUltivo), as it happens with the osmometers

convencionales, Y, una vez calibrado el sistema, los resultados de las conventional, and, once the system is calibrated, the results of the

medidas se pueden leer en pocos segundos, mientras que con los measurements can be read in a few seconds, while with the

osmómetros convencionales hay que esperar de 60 a 90 segundos. Conventional osmometers must wait 60 to 90 seconds.

25 25

Para medir la impedancia se aplica preferiblemente una corriente alterna a To measure the impedance, an alternating current is preferably applied to

través de dos electrodos dispuestos en contacto con el cultivo celular. Por through two electrodes arranged in contact with the cell culture. By

diversos motivos es preferible la corriente alterna a la continua: la corriente various reasons are preferred alternating current to continuous: current

continua polarizaría los electrodos; muchos electrodos (de, por ejemplo, Pt, continuous would polarize the electrodes; many electrodes (of, for example, Pt,

30 30: Au , ITO, etc) son capacitivos y presentan una impedancia muy alta en Au, ITO, etc.) are capacitive and have a very high impedance in

corriente continua; con corriente continua es necesario calibrar DC; with direct current it is necessary to calibrate

cuidadosamente el potencial de los electrodos; es mucho más fácil reducir el carefully the potential of the electrodes; it is much easier to reduce the

ruido con corriente alterna que con corriente continua. noise with alternating current than with direct current.

35 35: En una realización el microcanal está abierto en al menos uno de sus In one embodiment the microchannel is open in at least one of its

extremos a una cámara que contiene el cultivo celular y uno de los electrodos ends to a chamber that contains the cell culture and one of the electrodes

se sitúa en dicha cámara, aunque es preferible que ambos extremos del it is located in said chamber, although it is preferable that both ends of the

5 5: microcanal estén abiertos a sendas cámaras que contienen el cultivo ce1ular y que cada electrodo se coloque en una cámara distinta, ya que entonces los dos electrodos se pueden simplemente sumergir en el cultivo celular y pueden reutilizarse. En una realización, al menos un electrodo está formado por un núcleo de plata con un recubrimiento de AgCI. Microchannels are open to two chambers that contain the cell culture and that each electrode is placed in a different chamber, since then the two electrodes can simply be submerged in the cell culture and can be reused. In one embodiment, at least one electrode is formed by a silver core with an AgCI coating.

10 10: En una realización , los electrodos se seleccionan para que la capacitancia entre cada electrodo y el medio de cultivo sea al menos el triple de la capacitancia lineal entre los electrodos, ya que el hecho de que aquélla sea mucho mayor que ésta favorece la precisión de la medida de la resistencia eléctrica del microcanal. In one embodiment, the electrodes are selected so that the capacitance between each electrode and the culture medium is at least three times the linear capacitance between the electrodes, since the fact that it is much greater than this favors the accuracy of the measurement of the electrical resistance of the microchannel.

15 2 O 15 2 O: En una realización la frecuencia de la corriente alterna es de entre 10Hz y 1000 Hz, preferiblemente de entre 400 Hz y 600 Hz, y más preferiblemente de entre 480 Hz y 520 Hz. En este último caso la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por un factor de 2,5. En general, la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por un factor constante. In one embodiment the frequency of the alternating current is between 10 Hz and 1000 Hz, preferably between 400 Hz and 600 Hz, and more preferably between 480 Hz and 520 Hz. In the latter case the evaporation rate is estimated by multiplying the speed of variation of the impedance by a factor of 2.5. In general, the evaporation rate is estimated by multiplying the impedance variation rate by a constant factor.

25 25: En una realización, la altura del microcanal es de entre 2 y 100 micras, en otra realización (o en la misma) la anchura del microcanal es de entre 5 y 200 micras, y en otra (o coincidiendo con alguna de las anteriores) la longitud del microcanal es de entre 0,1 y 5 mm. In one embodiment, the height of the microchannel is between 2 and 100 microns, in another embodiment (or in the same) the width of the microchannel is between 5 and 200 microns, and in another (or coinciding with any of the above) the Microchannel length is between 0.1 and 5 mm.

30 30: En una realización , la cámara es circular y tiene un diámetro de entre 1 y 10 milímetros, es decir, no es microfluídica. De todos modos, la medida o la forma de estas cámaras es poco relevante. En una realización , el microcanal forma parte de una estructura microfluídica de un material polimérico, preferiblemente PDMS. Esta estructura polimérica está preferiblemente dispuesta sobre un substrato de poliestireno. In one embodiment, the chamber is circular and has a diameter of between 1 and 10 millimeters, that is, it is not microfluidic. In any case, the size or shape of these cameras is of little relevance. In one embodiment, the microchannel is part of a microfluidic structure of a polymeric material, preferably PDMS. This polymeric structure is preferably arranged on a polystyrene substrate.

35 35: En un procedimiento, para registrar la impedancia se utiliza un ampl~i cador electrofisiológico en modo de fijación de voltaje (voltage clamp mode). En el modo de fijación de voltaje se varia la corriente inyectada para mantener In one procedure, an electrophysiological amplifier is used to record the impedance in voltage clamp mode. In the voltage setting mode the injected current is varied to maintain

constante el potencial de membrana. constant membrane potential.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

5 A continuación se describirá, a título de ejemplo no limitativo, una realización 5 Next, a non-limiting example will be described as an embodiment

de la invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales: of the invention, referring to the accompanying drawings, in which:

la figura 1 es una representación esquemática de un dispositivo microfluídico .en el que puede aplicarse el procedimiento de la invención; 10 la figura 2 es una gráfica cuya abcisa es el tiempo y cuya ordenada Figure 1 is a schematic representation of a microfluidic device in which the method of the invention can be applied; 10 Figure 2 is a graph whose time is abcissa and whose ordinate

representa dos funciones temporales: la variación porcentual de la It represents two temporary functions: the percentage variation of the

impedancia y la variación porcentual del peso del líquido; y figura 3 es una gráfica cuya abcisa es el tiempo y cuya ordenada representa las mismas funciones temporales que en la figura 2 pero a lo largo de un impedance and percentage variation of liquid weight; and figure 3 is a graph whose abcision is time and whose ordinate represents the same temporal functions as in figure 2 but along a

15 período mayor y con aportaciones puntuales de agua desionizada. 15 major period and with specific contributions of deionized water.

DESCRIPCiÓN DE REALIZACIONES PREFERIDAS DESCRIPTION OF PREFERRED EMBODIMENTS

La evaporación de un medio de cultivo en una cámara conduce a un aumento Evaporation of a culture medium in a chamber leads to an increase

2O de la concentración de electrolito y, en consecuencia, a una disminución de la resistividad eléctrica (p) a lo largo del tiempo. En efecto, p depende de la 2O of the electrolyte concentration and, consequently, a decrease in electrical resistivity (p) over time. Indeed, p depends on the

concentración iónica según la siguiente fórmula: ionic concentration according to the following formula:

P == 1/ IN z¡ x F x ¡.ti x c¡ P == 1 / IN z¡ x F x ¡.ti x c¡

i=l i = l

donde Z ¡ es la valencia del ión i, Ili su movilidad eléctrica en soluciones 25 acuosas, G¡SU concentración y F la constante de Faraday. where Z ¡is the valence of the ion i, Ili its electric mobility in aqueous solutions, G¡SU concentration and F the Faraday constant.

La resistencia entre los dos extremos de un microcanal depende de su The resistance between the two ends of a microchannel depends on its

geometría y de p según la siguiente fórmula: geometry and of p according to the following formula:

L L

R =pxs R = pxs

30 donde L y S son la longitud y la sección, respectivamente. 30 where L and S are the length and section, respectively.

A medida que la concentración de electrolito (principalmente NaCI pero también KCI, CaCl, y MgCI,) en el medio de cultivo aumenta, p disminuye y también lo hace R. As the electrolyte concentration (mainly NaCI but also KCI, CaCl, and MgCI,) in the culture medium increases, p decreases and so does R.

De las fórmulas anteriores se deduce la siguiente: From the above formulas the following is deduced:

L Vol L L Vol L

R=p x-=( N ) XR = p x - = (N) X

S :El = l Zi X F X Ili x m¡ S donde mi es el contenido molar total del electrolito i. S: El = l Zi X F X Ili x m¡ S where mi is the total molar content of the electrolyte i.

Por consiguiente cabe esperar que la variación relativa de R en función del Therefore, the relative variation of R as a function of

tiempo tenga una relación lineal con la variación relativa del volumen de líquido debida a la evaporación, lo cual sugiere que la resistencia entre extremos del microcanal puede ser una medida fiable de la evaporación. time has a linear relationship with the relative variation of the volume of liquid due to evaporation, which suggests that the resistance between the ends of the microchannel can be a reliable measure of evaporation.

A continuación se describirá los ensayos efectuados y los resultados experimentales. Next, the tests carried out and the experimental results will be described.

Se preparó un bloque de PDMS de 6 mm de grosor en el que se fabricó por litografia blanda un microcanal a partir de un master SU-8 y por medio de unos punzones para biopsias dos orificios pasantes de 6 mm de diámetro. Dicho bloque se superpuso a un sustrato de poliestreno de manera que los A 6 mm thick PDMS block was prepared in which a microchannel was manufactured by soft lithography from an SU-8 master and by means of biopsy punches two through holes 6 mm in diameter. Said block was superimposed on a polystyrene substrate so that the

dos orificios se convirtieron en sendos pozos o cámaras unidos en su parte inferior por el microcanal. two holes became two wells or chambers joined at the bottom by the microchannel.

La estructura resultante es la representada en la figura 1, en la que se aprecia el bloque de PDMS 1, el sustrato de poliestireno 2, las dos cámaras 7 y el microcanal 8. En la citada solicitud de patente de Claverol se mostró que un dispositivo de este tipo es adecuado para el cultivo neuronal y para el registro electrofisiológico de neuronas primarias. The resulting structure is that shown in Figure 1, which shows the PDMS block 1, the polystyrene substrate 2, the two chambers 7 and the microchannel 8. In the aforementioned Claverol patent application it was shown that a device This type is suitable for neuronal culture and for electrophysiological registration of primary neurons.

Otros elementos del dispositivo de la figura 1 son: dos electrodos 4 y 5, un generador de corriente alterna 3 y un amplificador de electrofisiologia 6. También se aprecia que las cámaras 7 y 8 se han rellenado con el medio de Other elements of the device of Figure 1 are: two electrodes 4 and 5, an alternating current generator 3 and an electrophysiology amplifier 6. It is also appreciated that chambers 7 and 8 have been filled with the means of

cultivo 10, y las flechas quebradas en la superficie del líquido indican su evaporación. culture 10, and the broken arrows on the surface of the liquid indicate its evaporation.

El microcanal 8 fue pre-rellenado con ca, para facilitar la eliminación posterior de burbujas en el medio de cultivo, ya que la elevada solubilidad del ca, en soluciones acuosas impide que el microcanal esté bloqueado mucho tiempo por burbujas de ca,. Microchannel 8 was pre-filled with ca, to facilitate the subsequent removal of bubbles in the culture medium, since the high solubility of the ca, in aqueous solutions prevents the microchannel from being blocked for a long time by bubbles of ca.

El amplificador 6 se aplicó en modo de fijación de voltaje y los electrodos 4 y Amplifier 6 was applied in voltage setting mode and electrodes 4 and

5 eran de plata recubierta de AgCL Las cámaras 7 se dejaron descubiertas y 5 were silver coated with AgCL Cameras 7 were left uncovered and

se llenaron con 100 microlitros de solución acuosa. They were filled with 100 microliters of aqueous solution.

5 5

El peso total de líquido se monitorizó con una resolución de 1 miligramo The total liquid weight was monitored with a resolution of 1 milligram

(aproximadamente un microlitro) mediante una balanza Sartorius CP153 de (approximately one microliter) using a Sartorius CP153 balance of

carga superior Se empleó un calentador a 37°C para aumentar la velocidad top load A heater at 37 ° C was used to increase the speed

de evaporación. evaporation

10 10

Se registró continuamente la impedancia entre los extremos del micro canal The impedance between the ends of the micro channel was continuously recorded

durante un período de tiempo. Dicha impedancia se midió a una frecuencia de over a period of time. Said impedance was measured at a frequency of

500 Hz. 500 Hz

15 fifteen: En la figura 2 se representa la regresión lineal de la impedancia medida The linear regression of the measured impedance is shown in Figure 2

(cruces 21) Y la regresión lineal de la evaporación medida (círculos 22). Se ha (crosses 21) And the linear regression of the measured evaporation (circles 22). It has been

corregido la impedancia multiplicándola por un factor de 2,5, resultando en los the impedance corrected by multiplying it by a factor of 2.5, resulting in the

triángulos 23, que se ajustan a la regresión de la evaporación. En este triangles 23, which fit the regression of the evaporation. In this

ensayo las dimensiones del microcanal eran de 200 micras x 100 micras x 3 test the dimensions of the microchannel were 200 microns x 100 microns x 3

20 twenty: mm (anchura por altura por longitud). Las líneas punteadas que acompañan a mm (width by height by length). The dotted lines that accompany

las regresiones representan unos intervalos de confianza del 95%. Regressions represent 95% confidence intervals.

La diferencia de pendiente entre las rectas de la impedancia medida y la The difference in slope between the lines of the measured impedance and the

evaporación medida pueden deberse, al menos en parte, a que la measured evaporation may be due, at least in part, to the fact that the

25 25: evaporación produce el secado y la cristalización del electrolito sobre las evaporation produces the drying and crystallization of the electrolyte on the

paredes de las cámaras; dichos depósitos de electrolito están representados chamber walls; said electrolyte deposits are represented

por la referencia 11 en la figura 1. El electrolito así cristalizado ya no está by reference 11 in figure 1. The electrolyte thus crystallized is no longer

disponible para la conducción eléctrica , lo cual resulta en una resistencia available for electric conduction, which results in a resistance

mayor de la esperada a partir del volumen evaporado. También .podría influir higher than expected from evaporated volume. It could also influence

3 O 3 o: la falta de homogeneidad de la concentración de electrolito en la solución the lack of homogeneity of the electrolyte concentration in the solution

(hay una diferencia por ejemplo entre ·el fondo de la cámara y la interfaz (There is a difference, for example, between the background of the camera and the interface

líquido-aire). liquid-air).

En cualquier caso esta diferencia de pendiente se corrige mediante el In any case this slope difference is corrected by

35 35: mencionado factor multiplicativo de 2,5. mentioned multiplicative factor of 2.5.

En general, la selección de la frecuencia de la corriente depende de la In general, the selection of the frequency of the current depends on the

capacitancia lineal entre los electrodos (debida al condensador que forman los electrodos fuera del medio de cultivo) y de la resistencia eléctrica del linear capacitance between the electrodes (due to the capacitor formed by the electrodes outside the culture medium) and the electrical resistance of the

microcanal. La reactancia capacitiva (impedancia) es inversamente proporcional al producto de la frecuencia y la capacitancia. Como la resistencia eléctrica del microcanal y la impedancia debida a la capacitancia lineal están en paralelo, esta impedancia afecta más negativamente a la medida de la resistencia cuanto mayor es la frecuencia, ~unque una microchannel Capacitive reactance (impedance) is inversely proportional to the product of frequency and capacitance. Since the electrical resistance of the microchannel and the impedance due to linear capacitance are in parallel, this impedance affects the resistance measurement more negatively the higher the frequency, ~ a

frecuencia más alta tiene el efecto positivo de reducir más el ruido. Así, si la Higher frequency has the positive effect of further reducing the noise. So, if the

capacitancia lineal es relativamente pequeña comparada con la resistencia del microcanal, entonces se puede usar una frecuencia más alta, por ejemplo Linear capacitance is relatively small compared to the resistance of the microchannel, so a higher frequency can be used, for example

de 500 Hz a 1000 Hz. Pero si la capacitancia lineal es mayor o la resistencia 500 Hz to 1000 Hz. But if the linear capacitance is greater or the resistance

del microcanal es menor, entonces conviene usar una frecuencia inferior a of the microchannel is lower, then it is convenient to use a frequency lower than

500 Hz. 500 Hz

A veces es necesario utilizar electrodos capacitivos (en cultivos celulares a Sometimes it is necessary to use capacitive electrodes (in cell cultures to

largo plazo, por ejemplo, hay que utilizar electrodos de Pt o Au porque son poco citotóxicos). En este caso interviene, además de la resistencia del microcanal y la impedancia debida a la capacitancia lineal entre los electrodos, la impedancia debida a la capacitancia entre cada electrodo y el medio de cultivo (denominada impedancia de los electrodos capacitivos); esta long term, for example, you have to use Pt or Au electrodes because they are not very cytotoxic). In this case, in addition to the resistance of the microchannel and the impedance due to the linear capacitance between the electrodes, the impedance due to the capacitance between each electrode and the culture medium (called capacitive electrode impedance) is involved; is

impedancia está en serie con aquéllas. Entonces conviene usar una impedance is in series with those. Then you should use a

frecuencia más bien alta porque una frecuencia baja (inferior a 500 Hz) haria aumentar la impedancia de los electrodos capacitivos, lo cual perjudicaria la rather high frequency because a low frequency (less than 500 Hz) would increase the impedance of the capacitive electrodes, which would damage the

precisión de la medida. measurement accuracy.

En resumen: a mayor frecuencia menor impedancia debida a la capacitancia In summary: the higher the frequency, the lower the impedance due to capacitance

lineal (mal resultado), y a menor frecuencia mayor impedancia de 1m electrodos capacitivos (mal resultado) . De modo que, cuanto menor es 1" linear (bad result), and at a lower frequency greater impedance of 1m capacitive electrodes (bad result). So, the smaller is 1 "

impedancia de los electrodos capacitivos, lo cual es positivo, menor es capacitive electrode impedance, which is positive, lower is

también la impedancia debida a la capacitancia lineal, lo cual es negativo, y also the impedance due to linear capacitance, which is negative, and

viceversa; por tanto no hay una frecuencia perfecta. Para obtener un buen resultado es necesario que la capacitancia entre cada electrodo y el medio vice versa; therefore there is no perfect frequency. To obtain a good result it is necessary that the capacitance between each electrode and the medium

sea mucho mayor que la capacitancia lineal entre electrodos. Si la capacitancia lineal es comparable a la capacitancia entre electrodo y medio, is much greater than the linear capacitance between electrodes. If the linear capacitance is comparable to the capacitance between electrode and medium,

entonces es muy difícil medir con precisión la resistencia del microcanal. then it is very difficult to measure the resistance of the microchannel accurately.

En otro ensayo se exploró la compensación de la evaporación mediante la In another test, evaporation compensation was explored by

5 5: adición de agua desionizada. En la figura 3 se representan las mismas funciones de la figura 2 pero en una escala temporal diferente, y además con la aportación puntual de agua desionizada . La línea más emborronada representa la variación porcentual de la impedancia y la línea más limpia representa la variación porcentual del peso de líquido. Las flechas indican la adición de diversas cantidades de agua desionizada. En este ensayo las dimensiones del microcanal eran de 20 micras x 4 micras x 1 mm (anchura por altura por longitud). addition of deionized water. Figure 3 shows the same functions of Figure 2 but on a different time scale, and also with the timely input of deionized water. The more blurred line represents the percentage variation of the impedance and the cleaner line represents the percentage variation of the liquid weight. The arrows indicate the addition of various amounts of deionized water. In this test the dimensions of the microchannel were 20 microns x 4 microns x 1 mm (width by height by length).

1 0 1 0: Como se aprecia en la figura 3, la impedancia siguió a la evaporación pero con un pequeño desplazamiento, aunque la diferencia entre la pérdida de agua estimada y la realmente medida fue menor del 10%. As can be seen in Figure 3, the impedance followed evaporation but with a small displacement, although the difference between the estimated water loss and the actual measured was less than 10%.

15 fifteen: En los dispositivos microfluídicos que se puedan diseñar para optimizar este procedimiento habrá que tener en cuenta algunos fenómenos, como la homogeneización iónica, la pérdida de iones solubilizados por cristalización sobre las paredes de la cámara, o las desviaciones debidas a la temperatura. In microfluidic devices that can be designed to optimize this procedure, some phenomena must be taken into account, such as ionic homogenization, loss of ions solubilized by crystallization on the walls of the chamber, or temperature deviations.

2 O 2 o: Aunque en la presente memoria sólo se han representado y descrito realizaciones particulares de la invención, el experto en la materia sabrá introducir modificaciones y sustituir unas características técnicas por otras equivalentes, dependiendo de los requisitos de cada caso, sin separarse del ámbito de protección definido por las reivindicaciones adjuntas. Although only particular embodiments of the invention have been represented and described herein, the person skilled in the art will know how to introduce modifications and replace some technical characteristics with equivalent ones, depending on the requirements of each case, without separating from the scope of protection defined by the attached claims.

25 25

.. _.. _

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular en un dispositivo de tecnología microfluídica provisto de al menos un microcanal, 1. Procedure for monitoring the evaporation of a cell culture in a microfluidic technology device provided with at least one microchannel,

5 caracterizado por el hecho de que comprende la etapa de registrar la impedancia entre los dos extremos del microcanal durante un período de tiempo. 5 characterized by the fact that it comprises the step of recording the impedance between the two ends of the microchannel for a period of time.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que 2. Method according to claim 1, characterized in that

10 para medir la impedancia se aplica una corriente alterna a través de dos electrodos dispuestos en contacto con el cultivo celular. 10 to measure impedance an alternating current is applied through two electrodes arranged in contact with the cell culture.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el microcanal está abierto en al menos uno de sus extremos a una cámara 3. Method according to claim 2, characterized in that the microchannel is open at least one of its ends to a chamber

15 que contiene el cultivo celular, y de que uno de los electrodos se sitúa en dicha cámara. 15 which contains the cell culture, and that one of the electrodes is located in said chamber.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que ambos extremos del microcanal están abiertos a sendas cámaras que 4. Method according to claim 2, characterized in that both ends of the microchannel are open to two chambers which

2O contienen el cultivo celular, y de que cada electrodo se coloca en una cámara distinta. 2O contain the cell culture, and that each electrode is placed in a different chamber.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que 5. Method according to claim 4, characterized in that

los dos electrodos se sumergen en el cultivo celular y son reutilizables. 25 The two electrodes are immersed in the cell culture and are reusable. 25

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que al menos un electrodo está formado por un núcleo de plata con un recubrimiento de AgCI. Method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that at least one electrode is formed by a silver core with an AgCI coating.

: 30 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que los electrodos se seleccionan para que la capacitancia entre cada electrodo y el medio de cultivo sea al menos el triple de la capacitancia lineal entre los electrodos. Method according to any of claims 2 to 5, characterized in that the electrodes are selected so that the capacitance between each electrode and the culture medium is at least three times the linear capacitance between the electrodes.

: 35 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por el hecho de que la frecuencia de la corriente alterna es de entre 10Hz y 1000 Hz. Method according to any one of claims 2 to 7, characterized in that the frequency of the alternating current is between 10 Hz and 1000 Hz.

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9. 9.: Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que la frecuencia de la corriente alterna es de entre 480 Hz y 520 Hz. Method according to claim 8, characterized in that the frequency of the alternating current is between 480 Hz and 520 Hz.

10. 10.: Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por 2,5. Method according to claim 9, characterized in that the evaporation rate is estimated by multiplying the impedance variation rate by 2.5.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 caracterizado por el hecho de que la velocidad de evaporación se estima 11. Method according to any of claims 1 to 8, 10 characterized in that the evaporation rate is estimated

multiplicando· la velocidad de variación de la impedancia por un factor multiplying the speed of impedance variation by a factor

constante. constant.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 12. Method according to any of the preceding claims,

15 caracterizado por el hecho de que la altura del microcanal es de entre 2 y 100 micras. 15 characterized by the fact that the height of the microchannel is between 2 and 100 microns.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 13. Method according to any of the preceding claims,

caracterizado por el hecho de que la anchura del microcanal es de entre 5 y 2 O 200 micras. characterized by the fact that the width of the microchannel is between 5 and 2 or 200 microns.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 14. Method according to any of the preceding claims,

caracterizado por el hecho de que la longitud del microcanal es de entre 0,1 Y 5mm. characterized by the fact that the length of the microchannel is between 0.1 and 5mm.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por el hecho de que el microcanal forma parte de unE estructura microfluídica de un material polimérico. 15. Method according to any of the preceding claims characterized in that the microchannel is part of a microfluidic structure of a polymeric material.

30 16. Procedimiento según cualquiera la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que dicho material polimérico es PDMS. A method according to any one of claim 15, characterized in that said polymeric material is PDMS.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 6 16, 17. Method according to any of claims 15 6 16,

caracterizado por el hecho de que la estructura polimérica está dispuesta 35 sobre un substrato de poliestireno. characterized in that the polymer structure is disposed on a polystyrene substrate.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 18. Method according to any of the preceding claims,

caracterizado por el hecho de para registrar la impedancia se utiliza un characterized by the fact that to record the impedance a

amplificador electrofisiológico en modo de fijación de voltaje. electrophysiological amplifier in voltage setting mode.