ES2384497T3 - Neutralizing monoclonal antibodies against coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal neutralizante aislado capaz de unión al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), en el que el anticuerpo se produce mediante el hibridoma 30F9 con No. de Acceso de ATCC PTA-6523.An isolated neutralizing monoclonal antibody capable of binding to the binding domain of the coronavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV), in which the antibody is produced by hybridoma 30F9 with ATCC Accession No. PTA-6523.
Description
Anticuerpos monoclonales neutralizantes contra el coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo. Neutralizing monoclonal antibodies against the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.
El síndrome respiratorio agudo severo (SARS) es una enfermedad respiratoria inferior severa febril reconocida recientemente que es el resultado de una infección causada por un nuevo coronavirus (SARS-CoV) (1-5). El brote global del SARS se contuvo, pero se mantienen las preocupaciones sobre la posibilidad de futuras recurrencias, especialmente con recientes informes de infecciones adquiridas en laboratorios (6). Sin embargo, actualmente no existe disponible un tratamiento o profilaxis eficaz para combatir este virus mortal (7,8). Severe acute respiratory syndrome (SARS) is a recently recognized severe febrile lower respiratory disease that is the result of an infection caused by a new coronavirus (SARS-CoV) (1-5). The global SARS outbreak was contained, but concerns remain about the possibility of future recurrences, especially with recent reports of laboratory acquired infections (6). However, there is currently no effective treatment or prophylaxis available to combat this deadly virus (7,8).
Al igual que otros coronavirus, el SARS-CoV, es un virus envuelto que contiene un genoma de ARN de hebra positiva, grande, que codifica proteínas estructurales y proteínas replicasa víricas que incluyen proteínas espicular (S), de membrana (M), de envoltura E), nucleocápsida (N), y diversas proteínas sin caracterizar (4,5,9). Los análisis filogenéticos indican que el SARS-CoV es distinto de los tres grupos antigénicos conocidos de coronavirus. Por ello, la caracterización post-genómica del SARS-CoV es importante para desarrollar productos terapéuticos y vacunas anti-SARS (10,11). Like other coronaviruses, SARS-CoV, is a enveloped virus that contains a large, positive strand RNA genome that encodes structural proteins and viral replicase proteins that include spicular (S), membrane (M) proteins, of envelope E), nucleocapsid (N), and various uncharacterized proteins (4,5,9). Phylogenetic analyzes indicate that SARS-CoV is distinct from the three known antigenic groups of coronavirus. Therefore, the post-genomic characterization of SARS-CoV is important to develop therapeutic products and anti-SARS vaccines (10,11).
La infección por coronavirus se inicia por la unión de la proteína S al receptor huésped específico, lo cual inicia un cambio de conformación en la proteína S. La proteína S del SARS-CoV es una glucoproteína transmembrana de tipo I con una longitud predicha de 1.255 aminoácidos que contienen un líder (restos 1-14), un ectodominio (restos 151190), un dominio transmembrana (restos 1191-1227), y una cola intracelular corta (restos 1227-1255) (5). A diferencia de muchos otros coronavirus, tal como el virus de la hepatitis del ratón (MHV) (12,13), en el cual la proteína S está escindida post-traducción dentro de subunidades S1 y S2, no se ha identificado un motivo de escisión típico en la proteína S del SARS-CoV (5). No obstante, sus dominios S1 y S2 fueron predichos mediante la alineación de secuencias con otras proteínas S de coronavirus (5,14). El domino S2 (restos 681-1255) de la proteína S del SARS-CoV que contiene un péptido de fusión putativo y dos regiones setenas repetidas (HR1 y HR2) es responsable de la fusión entre membranas de célula vírica y diana. Se ha encontrado que las regiones HR1 y HR2 pueden asociarse para formar una estructura en haz de seis hélices (15-18), que se parece al núcleo activo de fusión de la gp41 del VIH (19) y la proteína S del MHV (20,21). El dominio S1 de la proteína S del SARS-CoV media en la unión del virus con la enzima de conversión de la angiotensina 2 (ACE2), el receptor funcional para el SARS-CoV sobre células susceptibles (22-25). Recientemente, se ha identificado un pequeño fragmento de 193 aminoácidos dentro del dominio S1 (restos 318-510) como un dominio de unión del receptor (RBD), el cual es suficiente para asociarse con ACE2 (26-28). Coronavirus infection is initiated by the binding of the S protein to the specific host receptor, which initiates a change of conformation in the S protein. The S protein of the SARS-CoV is a transmembrane type I glycoprotein with a predicted length of 1,255 amino acids containing a leader (residues 1-14), an ectodomain (residues 151190), a transmembrane domain (residues 1191-1227), and a short intracellular tail (residues 1227-1255) (5). Unlike many other coronaviruses, such as the mouse hepatitis virus (MHV) (12,13), in which the S protein is cleaved post-translation within S1 and S2 subunits, a reason for typical cleavage in the S protein of SARS-CoV (5). However, their S1 and S2 domains were predicted by aligning sequences with other coronavirus S proteins (5,14). The S2 domain (residues 681-1255) of the S protein of the SARS-CoV containing a putative fusion peptide and two repeated setenic regions (HR1 and HR2) is responsible for the fusion between viral and target cell membranes. It has been found that regions HR1 and HR2 can be associated to form a six-heliced beam structure (15-18), which resembles the active fusion nucleus of HIV gp41 (19) and MHV S protein (20 ,twenty-one). The S1 domain of the S protein of SARS-CoV mediates the binding of the virus with the angiotensin 2 conversion enzyme (ACE2), the functional receptor for SARS-CoV on susceptible cells (22-25). Recently, a small fragment of 193 amino acids within the S1 domain (residues 318-510) has been identified as a receptor binding domain (RBD), which is sufficient to associate with ACE2 (26-28).
Las proteínas S del coronavirus son determinantes antigénicos principales que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes (29,30). De acuerdo con ello, se deduce lógicamente el uso de la proteína S como un antígeno para el desarrollo de la vacuna (30). Recientemente, se ha mostrado que la proteína S del SARS-CoV es un inductor principal de inmunidad protectora entre proteínas estructurales (31). Yang, y otros (32) han informado que un candidato de vacuna de ADN que codifica la proteína S indujo la neutralización del SARS-CoV (valores de anticuerpo neutralizante dentro del intervalo de desde 1:25 hasta 1:150) e inmunidad protectora en ratones, y se probó que la protección estuvo mediada por anticuerpos neutralizantes pero no por un mecanismo dependiente de la célula T. Bisht, y otros (339 han demostrado que la proteína S del SARS-coV expresada por el vrus vaccinia atenuado (MVA) escindió anticuerpos específicos de S con un valor de anticuerpo neutralizante del SARS-CoV de 1:284, e inmunizó de manera protectora a ratones contra infecciones por SARS-CoV, tal como se muestra mediante los valores reducidos de SARS-CoV en los tractos respiratorios de ratones después de exposición a la infección Bukreyev, y otros (34) han informado que la inmunización de mucosa de monos verdes de Africa con virus para-influenza atenuados (BHPIV3) que expresan la proteína S del SARS-CoV indujo anticuerpos neutralizantes con valores de neutralización que variaron desde 1:8 hasta 1:16 y protegieron los animales contra la exposición a la infección. Estos datos indican que la proteína S del SARS-CoV es un antígeno protector capaz de inducir anticuerpos neutralizantes, aunque sus determinantes antigénicos permanecen sin ser definidos. Coronavirus S proteins are major antigenic determinants that induce the production of neutralizing antibodies (29,30). Accordingly, the use of the S protein as an antigen for the development of the vaccine is logically deduced (30). Recently, it has been shown that SARS-CoV S protein is a major inducer of protective immunity between structural proteins (31). Yang, and others (32) have reported that a DNA vaccine candidate encoding S protein induced neutralization of SARS-CoV (neutralizing antibody values within the range of 1:25 to 1: 150) and protective immunity in mice, and it was proven that the protection was mediated by neutralizing antibodies but not by a T cell-dependent mechanism. Bisht, and others (339 have shown that SARS-coV S protein expressed by attenuated vrus vaccinia (MVA) cleaved S-specific antibodies with a SARS-CoV neutralizing antibody value of 1: 284, and protectively immunized mice against SARS-CoV infections, as shown by reduced SARS-CoV values in the respiratory tracts of Mice after exposure to Bukreyev infection, and others (34) have reported that immunization of mucosa of African green monkeys with attenuated para-influenza viruses (BHPIV3) expressing the S protein of SARS-CoV induced neutralizing antibodies with neutralization values ranging from 1: 8 to 1:16 and protected the animals against exposure to infection. These data indicate that SARS-CoV S protein is a protective antigen capable of inducing neutralizing antibodies, although its antigenic determinants remain undefined.
Los autores de la presente invención han demostrado recientemente que el dominio de unión del receptor (RBD) de la proteína S del SARS-CoV es una diana principal de anticuerpos neutralizantes inducida en pacientes infectados con SARS-CoV y en animales inmunizados con virus inactivados o proteínas S (35,36). Por ello, los autores de la presente invención han usado el RBD recombinante de la proteína S del SARS-CoV como un inmunógeno para inducir anticuerpos monoclonales neutralizantes (mABs). The authors of the present invention have recently demonstrated that the SARS-CoV S protein receptor (RBD) binding domain is a major target of neutralizing antibodies induced in patients infected with SARS-CoV and in animals immunized with inactivated viruses or S proteins (35.36). Therefore, the authors of the present invention have used the recombinant RBD of the SARS-CoV S protein as an immunogen to induce neutralizing monoclonal antibodies (mABs).
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizante aislado capaz de unión al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), en el que el anticuerpo se produce mediante el hibridoma 30F9 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6523. In accordance with the present invention, an isolated neutralizing monoclonal antibody capable of binding to the binding domain of the coronavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) is provided, in which the antibody is produced by the 30F9 hybridoma with ATCC Accession No. PTA-6523.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo de acuerdo con la invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente. In addition, according to the invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the antibody according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona el hibridoma 30F9 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6523. In addition, according to the invention, hybridoma 30F9 is provided with ATCC Accession No. PTA-6523.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de la infección por SARS-CoV. In addition, according to the invention, an antibody according to the invention is provided for use in the treatment of SARS-CoV infection.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección por SARS-CoV. Furthermore, according to the invention, the use of an antibody according to the invention is provided in the preparation of a medicament for the treatment of SARS-CoV infection.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento para la detección del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) o de células infectadas por SARS-CoV in vitro, que comprende poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la invención bajos condiciones que permiten la formación de complejos entre el anticuerpo y el dominio de unión del receptor de la proteína espicular del SARS-CoV, y la detección de los complejos formados. Furthermore, according to the invention, there is provided a method for the detection of the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) or of cells infected with SARS-CoV in vitro, which comprises contacting an antibody according to the invention under conditions that allow the formation of complexes between the antibody and the binding domain of the SARS-CoV spicular protein receptor, and the detection of the complexes formed.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento para el rastreo de compuestos capaces de inhibir la infección por coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), mediante el bloqueo de la unión del virus a los receptores sobre las células huéspedes, que comprende las etapas de: In addition, according to the invention, there is provided a method for the screening of compounds capable of inhibiting coronavirus infection associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV), by blocking the binding of the virus to the receptors on the cells guests, which includes the stages of:
- (a)(to)
- establecer un sistema para un anticuerpo de acuerdo con la invención, para unir al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del SARS-CoV; y establishing a system for an antibody according to the invention, to bind the binding domain of the SARS-CoV spicular protein receptor; Y
- (b)(b)
- poner en contacto un compuesto para ser rastreado con el sistema de (a), indicando una disminución en la unión del anticuerpo al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del SARS-CoV que el compuesto es capaz de interferir con la unión y de inhibir la infección del dominio de unión del receptor de la proteína espicular del SARS-CoV. contacting a compound to be tracked with the system of (a), indicating a decrease in antibody binding to the binding domain of the SARS-CoV spicular protein receptor that the compound is capable of interfering with the binding and of inhibit infection of the SARS-CoV spicular protein receptor binding domain.
Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un kit de diagnóstico o un kit de rastreo que comprende un compartimento que contiene un anticuerpo de acuerdo con la invención. In addition, according to the invention, there is provided a diagnostic kit or a tracking kit comprising a compartment containing an antibody according to the invention.
La presente invención demuestra que el dominio de unión del receptor (RBD) contiene múltiples epítopos de neutralización dependientes de la conformación, que inducen un panel de potentes anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAbs), los cuales pueden usarse para el tratamiento, diagnosis, y prevención del SARS. The present invention demonstrates that the receptor binding domain (RBD) contains multiple conformation-dependent neutralization epitopes that induce a panel of potent neutralizing monoclonal antibodies (mAbs), which can be used for the treatment, diagnosis, and prevention of SARS
Breve descripción de las diferentes vistas de los dibujos Brief description of the different views of the drawings
Figura 1. (no de acuerdo con la invención). Mapaje del epítopo de los mAbs 4D5 y 17H9 mediante péptidos de solapamiento que cubren el RBD de la proteína S. Cada uno de los péptidos se recubrió a una concentración de 5 µg/ml y los mAbs se ensayaron a una concentración de 10 µg/ml. Figure 1. (not according to the invention). Mapping of the epitope of mAbs 4D5 and 17H9 by overlapping peptides covering the RBD of protein S. Each of the peptides was coated at a concentration of 5 µg / ml and the mAbs were tested at a concentration of 10 µg / ml .
Figura 2. Inhibición de la unión de RBD-Fc a la ACE2 mediante mAbs. El panel superior muestra la inhibición de la unión de RBD-Fc a la ACE2 asociada a la célula, expresada sobre células 293T/ACE2 medida mediante citometría de flujo; el panel inferior muestra la inhibición de la unión de RBD-Fc a la ACE2 soluble medida mediante ELISA. El RBD-Fc se usó a una concentración de 1 µg/ml y los mAbs se usaron a una concentración de 50 µg/ml. El % de inhibición se calculó para cada mAb. Figure 2. Inhibition of the binding of RBD-Fc to ACE2 by mAbs. The upper panel shows the inhibition of RBD-Fc binding to the cell-associated ACE2, expressed on 293T / ACE2 cells measured by flow cytometry; the lower panel shows the inhibition of the binding of RBD-Fc to soluble ACE2 measured by ELISA. The RBD-Fc was used at a concentration of 1 µg / ml and the mAbs were used at a concentration of 50 µg / ml. The% inhibition was calculated for each mAb.
Figura 3. Neutralización del pseudovirus SARS mediante mAbs. Se muestra la inhibición de la infección por pseudovirus SARS en células 293T/ACE2 mediante mAbs representativos procedentes de cada grupo. Cada uno de los mAbs se ensayó en unas series de diluciones al doble y se calculó el % de neutralización. Figure 3. Neutralization of the SARS pseudovirus by mAbs. Inhibition of SARS pseudovirus infection in 293T / ACE2 cells is shown by representative mAbs from each group. Each of the mAbs was tested in a series of double dilutions and the% neutralization was calculated.
Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado capaz de unión al dominio de unión del receptor (RBD) de la proteína espicular (S) del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) con el fin de inhibir de manera competitiva la unión del SARS-CoV a las células huéspedes. The present invention provides an isolated monoclonal antibody capable of binding to the receptor binding domain (RBD) of the coronavirus spinal protein (S) associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) in order to competitively inhibit binding. from SARS-CoV to host cells.
La presente invención (no de acuerdo con la invención) proporciona igualmente una substancia que comprende las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal descrito anteriormente, capaz de unión al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal descrito anteriormente. Esta substancia incluye, pero sin limitarse a ellas, un polipéptido, molécula pequeña, anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo. En una realización preferida, el anticuerpo es neutralizante. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla o constructo de fusión de anticuerpo, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico, tal como se ha descrito anteriormente. Es la intención de esta solicitud la de cubrir diferentes constructos quiméricos creados usando los anticuerpos inventados. La presente invención cubre igualmente todos los constructos humanizados de los anticuerpos. La técnica de generación de anticuerpos quiméricos o humanizados es bien conocida. Véase, por ejemplo (37,38) para anticuerpos quiméricos y (39-41) para anticuerpos humanizados. Un técnico experto normal puede modificar la secuencia de la substancia anteriormente descrita a la vista de la presente divulgación. Dicha modificación puede incluir la adición, delección, o mutación de ciertas secuencias de aminoácidos en el fragmento. El procedimiento general para producir un anticuerpo entra dentro del conocimiento de un experto normal en la técnica. Véase, por ejemplo, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No.1, por Ed. Harlow (1998). The present invention (not according to the invention) also provides a substance comprising the complementarity determining regions of the monoclonal antibody described above, capable of binding to the same epitope as the monoclonal antibody described above. This substance includes, but is not limited to, a polypeptide, small molecule, antibody, or an antibody fragment. In a preferred embodiment, the antibody is neutralizing. In another embodiment, the antibody is a single chain antibody or antibody fusion construct, a humanized antibody, or a chimeric antibody, as described above. It is the intention of this application to cover different chimeric constructs created using the invented antibodies. The present invention also covers all humanized antibody constructs. The technique of generating chimeric or humanized antibodies is well known. See, for example (37,38) for chimeric antibodies and (39-41) for humanized antibodies. A normal skilled technician can modify the sequence of the substance described above in view of the present disclosure. Such modification may include the addition, deletion, or mutation of certain amino acid sequences in the fragment. The general procedure for producing an antibody falls within the knowledge of a person skilled in the art. See, for example, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No.1, by Ed. Harlow (1998).
En una realización, el anticuerpo aislado descrito anteriormente se acopla directa o indirectamente a más de un agente citotóxico. Dicho agente citotóxico incluye, pero sin limitarse a ellos, radionucleótidos u otras toxinas. La presente invención (no de acuerdo con la invención) proporciona adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anterior. Una vez aislados los anticuerpos, el gen que codifica dicho anticuerpo puede aislarse y determinarse el secuencia de ácido nucleico. De acuerdo con ello, la presente invención (no de acuerdo con la invención) proporciona además una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente la molécula descrita anteriormente. La molécula de ácido nucleico incluye, pero sin limitarse a ellos, ADN o ARN sintético, ADN genómico, ADNc, y ARN. In one embodiment, the isolated antibody described above is directly or indirectly coupled to more than one cytotoxic agent. Said cytotoxic agent includes, but is not limited to, radionuclides or other toxins. The present invention (not according to the invention) additionally provides a nucleic acid molecule encoding the above antibody. Once the antibodies are isolated, the gene encoding said antibody can be isolated and the nucleic acid sequence determined. Accordingly, the present invention (not according to the invention) further provides a nucleic acid molecule capable of specifically hybridizing the molecule described above. The nucleic acid molecule includes, but is not limited to, synthetic DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, and RNA.
La presente invención (no de acuerdo con la invención) proporciona igualmente un vector que comprende las molécula de ácido nucleico anteriores o una porción de las mismas. Esta porción puede ser una porción funcional que porta una cierta función. Un fragmento o una secuencia parcial puede ser capaz de codificar un dominio funcional de la proteína que es funcional. En una realización, este vector es un vector de expresión, mediante el cual puede expresarse la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico. La presente invención proporciona además una célula que comprende la molécula de ácido nucleico anteriormente descrita. Dichas células pueden usarse para expresión. Los vectores son bien conocidos en este campo. Véase, por ejemplo, Graugner, Patente de EE.UU. No. 6.337.208, “Cloning Vector”, concedida el 8 de Enero de 2002. Véase, igualmente, Schumacher y otros, Patente de EE.UU. No. 6.190.906, “Expression Vector for the Regulatable Expression of foreign Genes in Prokaryotes”, concedida el 20 de Febrero de 2001. En una realización, los vectores son plásmidos. La presente invención proporciona un procedimiento para la producción del anticuerpo capaz de unión al dominio de unión del receptor (RBD) de la proteína espicular (S) del SARS-CoV con el fin de inhibir de manera competitiva la unión del SARS-CoV a las células huéspedes, el cual comprende el ligado de manera operativa de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente al elemento regulador apropiado con el fin de expresar dicho anticuerpo; la disposición de la molécula nucleica ligada en condiciones apropiadas que permitan la expresión de dicho anticuerpo; y la recuperación de dicho anticuerpo expresado, produciendo, de esta forma, dicho anticuerpo. La presente invención proporciona también un anticuerpo producido mediante el procedimiento anterior. The present invention (not according to the invention) also provides a vector comprising the above nucleic acid molecule or a portion thereof. This portion may be a functional portion that carries a certain function. A fragment or partial sequence may be able to encode a functional domain of the protein that is functional. In one embodiment, this vector is an expression vector, by which the protein encoded by the nucleic acid molecule can be expressed. The present invention further provides a cell comprising the nucleic acid molecule described above. Such cells can be used for expression. Vectors are well known in this field. See, for example, Graugner, US Pat. No. 6,337,208, "Cloning Vector", granted on January 8, 2002. See, also, Schumacher et al., US Pat. No. 6,190,906, "Expression Vector for the Regulable Expression of foreign Genes in Prokaryotes", granted on February 20, 2001. In one embodiment, the vectors are plasmids. The present invention provides a method for the production of the antibody capable of binding to the receptor binding domain (RBD) of the spicular protein (S) of SARS-CoV in order to competitively inhibit the binding of SARS-CoV to host cells, which comprises the operationally linked of the nucleic acid molecule described above to the appropriate regulatory element in order to express said antibody; the arrangement of the bound nucleic molecule under appropriate conditions that allow the expression of said antibody; and recovering said expressed antibody, thereby producing said antibody. The present invention also provides an antibody produced by the above procedure.
Las líneas de células de hibridoma 32H5 (Conf I), 31H12 (Conf II), 18D9 (Conf III), 30F9 (Conf IV), 33G4 (Conf V), y 19B2 (Conf VI), se depositaron el 13 de Enero de 2005 en el American Type Culture Collection (ATCC), 1081 University Blvd., Manassas., VA 20110, U.S.A.., bajo las disposiciones del Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure. A las líneas de células 32H5 (Conf I), 31H12 (Conf II), 18D9 (Conf III), 30F9 (Conf IV) (de acuerdo con la invención), 33G4 (Conf V), y 19B2 (Conf VI), se las concedieron los Números de Acceso de ATCC PTA-6525, PTA-6524. PTA-6521, PTA-6523, PTA-6526, y PTA6522, respectivamente. The hybridoma cell lines 32H5 (Conf I), 31H12 (Conf II), 18D9 (Conf III), 30F9 (Conf IV), 33G4 (Conf V), and 19B2 (Conf VI), were deposited on January 13, 2005 in the American Type Culture Collection (ATCC), 1081 University Blvd., Manassas., VA 20110, USA., Under the provisions of the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure. To the cell lines 32H5 (Conf I), 31H12 (Conf II), 18D9 (Conf III), 30F9 (Conf IV) (according to the invention), 33G4 (Conf V), and 19B2 (Conf VI), They were granted by ATCC Access Numbers PTA-6525, PTA-6524. PTA-6521, PTA-6523, PTA-6526, and PTA6522, respectively.
La presente invención (no de acuerdo con la invención) proporciona igualmente epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. Dichos epítopos, secuenciales o de conformación, son importantes para usos de diagnóstico o terapéutico. The present invention (not according to the invention) also provides epitopes recognized by the monoclonal antibodies described above. Such epitopes, sequential or conformation, are important for diagnostic or therapeutic uses.
La presente invención proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal descrito anteriormente de acuerdo con la invención y un vehículo adecuado. La cantidad eficaz puede determinarse mediante experimentación rutinaria. La presente invención proporciona adicionalmente un composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal descrito anteriormente y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal como se usa en la presente invención, un vehículo aceptable farmacéuticamente significa cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales. Los ejemplos de vehículos adecuados son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, solución salina tamponada con fosfato conteniendo Polysorb 80, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir también soluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos, y cápsulas. Típicamente, dichos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato magnésico o cálcico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden incluir igualmente aditivos de aroma y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos. The present invention provides a composition comprising an effective amount of the monoclonal antibody described above according to the invention and a suitable carrier. The effective amount can be determined by routine experimentation. The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the monoclonal antibody described above and a pharmaceutically acceptable carrier. As used in the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier means any of the conventional pharmaceutical carriers. Examples of suitable vehicles are well known in the art and may include, but are not limited to, any of the conventional pharmaceutical vehicles such as phosphate buffered saline solutions, phosphate buffered saline solution containing Polysorb 80, water, emulsions such as emulsion. oil / water, and various types of wetting agents. Other vehicles may also include sterile solutions, tablets, coated tablets, and capsules. Typically, such vehicles contain excipients such as starch, milk, sugar, certain types of clay, gelatin, stearic acid or salts thereof, magnesium or calcium stearate, talc, vegetable fats or oils, gums, glycols, or other known excipients. Such vehicles may also include aroma and color additives or other ingredients. Compositions comprising said vehicles can be formulated by well known conventional procedures.
La presente invención proporciona además un procedimiento para la detección del SARS-CoV (o de células infectadas del SARS-CoV), que comprende poner en contacto el anticuerpo de acuerdo con la invención bajo condiciones que permitan la formación de complejos entre el anticuerpo y el RBD de la proteína S del SARS-CoV; y la detección de los complejos formados. The present invention further provides a method for the detection of SARS-CoV (or infected SARS-CoV cells), which comprises contacting the antibody according to the invention under conditions that allow complex formation between the antibody and the RBD of SARS-CoV protein S; and the detection of the complexes formed.
Finalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para el rastreo de compuestos capaces de inhibir la infección del SARS-CoV mediante el bloqueo de la unión de dicho virus a los receptores sobre las células huéspedes, que comprende las etapas de (a) establecer un sistema para que el anticuerpo de la invención se una al dominio de unión del receptor (RBD) de la proteína espicular (S) del SARS-CoV; y (b) poner en contacto los compuestos con el sistema de (a), con lo cual una disminución en la unión del anticuerpo anterior al RBD de la proteína S del SARS-CoV indica que los compuestos son capaces de interferir con dicha unión, inhibiendo, de esa forma, la infección del RBD de la proteína S del SARS-CoV. Finally, the present invention provides a method for screening compounds capable of inhibiting SARS-CoV infection by blocking the binding of said virus to receptors on host cells, which comprises the steps of (a) establishing a system so that the antibody of the invention binds to the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV spicular protein (S); and (b) contacting the compounds with the system of (a), whereby a decrease in the binding of the prior antibody to the RBD of the SARS-CoV S protein indicates that the compounds are capable of interfering with said binding, thus inhibiting the infection of the RBD of the S protein of the SARS-CoV.
La presente invención proporciona un kit que comprende un compartimento que contiene un anticuerpo de acuerdo con la invención capaz de reconocer el virus del SARS y/o una substancia que puede inhibir de manera competitiva la unión de dicho anticuerpo. The present invention provides a kit comprising a compartment containing an antibody according to the invention capable of recognizing the SARS virus and / or a substance that can competitively inhibit the binding of said antibody.
La presente invención demuestra que el RBD contiene múltiples epítopos de neutralización dependientes de la conformación, los cuales inducen un panel de potentes anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAbs), los cuales pueden usarse para el tratamiento, diagnosis y prevención del SARS. The present invention demonstrates that the RBD contains multiple conformation-dependent neutralization epitopes, which induce a panel of potent neutralizing monoclonal antibodies (mAbs), which can be used for the treatment, diagnosis and prevention of SARS.
La invención se entenderá mejor con referencia a los Detalles Experimentales que siguen a continuación. The invention will be better understood with reference to the Experimental Details that follow.
Detalles Experimentales Experimental Details
Se generaron veintisiete clones de hibridomas mediante la fusión de células de mieloma SP2/0 con los esplenocitos procedentes ratones Balb/c inmunizados con una proteína de fusión que contenía un dominio de unión del receptor (RBD) en la proteína espicular (S) del SARS-CoV ligado al fragmento Fc de IgG1 humano (designado como RBD-Fc). Entre los 27 anticuerpos monoclonales (mABs) producidos a partir de estos clones de hibridoma, excepto 2 mAbs unidos a los epítopos lineales adyacentes, todos los otros mAbs reconocieron epítopos dependientes de la conformación. En base a los resultados obtenidos a partir de los experimentos de competencia de unión, estos 25 mAbs específicos de la conformación pudieron dividirse en seis grupos, designados como Conf I-VI. Los mAbs Conf IV y Conf V bloquearon significativamente la unión de RBD-Fc a ACE2, el receptor para el SARS-CoV, lo que sugiere que sus epítopos se solapan con los sitios de unión del receptor en la proteína S. la mayoría de los mAbs (23/25) que reconocieron los epítopos de conformación poseyeron potentes actividades neutralizantes contra el pseudovirus SARS con una dosis neutralizante al 50% (ND50) comprendida dentro del intervalo de desde 0,005 hasta 6,569 µg/ml. Twenty-seven hybridoma clones were generated by fusing SP2 / 0 myeloma cells with splenocytes from Balb / c mice immunized with a fusion protein containing a receptor binding domain (RBD) in the SARS spinal protein (S) -CoV linked to the Fc fragment of human IgG1 (designated as RBD-Fc). Among the 27 monoclonal antibodies (mABs) produced from these hybridoma clones, except 2 mAbs attached to adjacent linear epitopes, all other mAbs recognized conformation-dependent epitopes. Based on the results obtained from the binding competition experiments, these 25 specific conformation mAbs could be divided into six groups, designated as Conf I-VI. The Conf IV and Conf V mAbs significantly blocked the binding of RBD-Fc to ACE2, the receptor for SARS-CoV, suggesting that their epitopes overlap with the receptor binding sites on the S protein. mAbs (23/25) that recognized conformation epitopes had potent neutralizing activities against SARS pseudovirus with a 50% neutralizing dose (ND50) within the range of 0.005 to 6.569 µg / ml.
Estos mAbs neutralizantes del SARS-CoV pueden usarse: 1) como productos inmunoterapéuticos para el tratamiento temprano de la infección por SARS-CoV; 2) como reactivos biológicos para la diagnosis de la infección por SARS-CoV; 3) como sondas para estudiar la inmunogenicidad, antigenicidad, estructura y función de la proteína S del SARS-CoV. Además, estos mAbs múridos pueden humanizarse para terapia y prevención de infección por SARS-CoV. These SARS-CoV neutralizing mAbs can be used: 1) as immunotherapeutic products for the early treatment of SARS-CoV infection; 2) as biological reagents for the diagnosis of SARS-CoV infection; 3) as probes to study the immunogenicity, antigenicity, structure and function of the S protein of SARS-CoV. In addition, these murine mAbs can be humanized for therapy and prevention of SARS-CoV infection.
Inmunización de ratones y generación de mAbs. Se inmunizaron cinco ratones Balb/c (4 semanas de edad) subcutáneamente con 20 µg de RBD-Fc purificado con Protein A Sepharose preparado tal como se ha descrito previamente (35) en la presencia de MLP+TDM Adjuvant System (Sigma, Saint Louis, MI) y se reforzaron con 10 µg del mismo antígeno más el adyuvante MLP+TDM a intervalos de 3 semanas. Los antisueros de ratón se recolectaron para la detección de anticuerpos anti-RBD y anticuerpos neutralizantes de SARS-CoV. Immunization of mice and generation of mAbs. Five Balb / c mice (4 weeks old) were immunized subcutaneously with 20 µg of RBD-Fc purified with Protein A Sepharose prepared as previously described (35) in the presence of MLP + TDM Adjuvant System (Sigma, Saint Louis , MI) and were reinforced with 10 µg of the same antigen plus adjuvant MLP + TDM at intervals of 3 weeks. Mouse antisera were collected for the detection of anti-RBD antibodies and neutralizing antibodies of SARS-CoV.
Se generaron hibridomas para la producción de mAbs anti-RBD usando el protocolo convencional. En resumen, los esplenocitos procedentes de los ratones inmunizados se recolectaron y fusionaron con células de mieloma SP2/0. Los sobrenadantes del cultivo de células procedentes de los pocillos conteniendo las colonias de hibridomas se rastrearon mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA) usando S1-C9 preparada tal como ha sido ya descrito previamente (35) como un antígeno de recubrimiento. Las células procedentes de los pocillos positivos se expendieron y volvieron a ensayar. Los cultivos que se mantuvieron positivos se subclonaron para generar líneas de células de hibridoma estables. Todos los mAbs se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences). Hybridomas were generated for the production of anti-RBD mAbs using the conventional protocol. In summary, splenocytes from immunized mice were collected and fused with SP2 / 0 myeloma cells. Supernatants from cell culture from wells containing hybridoma colonies were screened by immunoenzymatic assay (ELISA) using prepared S1-C9 as previously described (35) as a coating antigen. Cells from positive wells were expended and retested. Cultures that remained positive were subcloned to generate stable hybridoma cell lines. All mAbs were purified from the culture supernatants by Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences).
ELISA y competencia de unión. La reactividad de los sueros de ratón o de mABs con diversos antígenos se determinó mediante ELISA. En resumen, se usaron 1 µg/ml de proteínas recombinantes (RBD-Fc o S1-C9) o IgG humano purificado (Zymed, South San Francisco, CA), respectivamente, para recubrir placas de microvaloración de 96 pocillos (Coming Costar, Acton, MA) en tampón de carbonato 0,1 M (pH 9,6) a 4ºC durante una noche. Después del bloqueo con leche no grasa al 2%, los sueros de ratón se diluyeron de manera seriada o se agregaron mAbs y se incubaron a 37ºC durante 1 hora, seguido de cuatro lavados con PBS conteniendo Tween 20 al 0,1%. Los anticuerpos unidos se detectaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Zymed) a 37ºC durante 1 hora, seguido de lavados. La reacción se visualizó mediante la adición del substrato 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB) y la absorbancia a 450 nm se midió mediante un lector de placa ELISA (Tecan US, Research Triangle Park, NC). ELISA and union competition. The reactivity of mouse sera or mABs with various antigens was determined by ELISA. In summary, 1 µg / ml of recombinant proteins (RBD-Fc or S1-C9) or purified human IgG (Zymed, South San Francisco, CA), respectively, were used to coat 96-well microtiter plates (Coming Costar, Acton , MA) in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) at 4 ° C overnight. After blocking with 2% non-fat milk, the mouse sera were serially diluted or mAbs were added and incubated at 37 ° C for 1 hour, followed by four washes with PBS containing 0.1% Tween 20. Bound antibodies were detected with goat anti-mouse IgG conjugated to HRP (Zymed) at 37 ° C for 1 hour, followed by washing. The reaction was visualized by the addition of the 3,3 ’, 5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate and the absorbance at 450 nm was measured by an ELISA plate reader (Tecan US, Research Triangle Park, NC).
Para determinar el efecto de reducción del enlace disulfuro sobre la unión de mAbs específicos del RBD, la placa ELISA se recubrió con S1-C9 o RBD-Fc recombinante a una concentración de 1 µg/ml y, a continuación, se trató durante 1 hora a 37ºC con ditiotreitol (DTT) a una concentración de 10 mM, seguido de lavados. A continuación, los pocillos se trataron con yodoacetamida 50 mM durante 1 hora a 37ºC. Después de los lavados, se llevó a cabo un ensayo ELISA convencional tal como se ha descrito anteriormente. To determine the effect of reducing the disulfide bond on the binding of specific mAbs of the RBD, the ELISA plate was coated with recombinant S1-C9 or RBD-Fc at a concentration of 1 µg / ml and then treated for 1 hour at 37 ° C with dithiothreitol (DTT) at a concentration of 10 mM, followed by washing. The wells were then treated with 50 mM iodoacetamide for 1 hour at 37 ° C. After washing, a conventional ELISA test was carried out as described above.
Se llevó a cabo un ensayo ELISA de competencia con el fin de determinar la actividad inhibidora de los mAbs específicos del RBD sobre la unión de los mAbs biotinilados a RBD-Fc. En resumen, los pocillos de las placas ELISA se recubrieron con RBD-Fc a una concentración de 1 µg/ml tal como se ha descrito anteriormente. Se agregó una mezcla conteniendo 50 µg/ml de un mAb no marcado y 1 µg/ml de un mAb biotinilado, seguido de incubación a 37ºC durante 1 hora. La unión de los mAbs biotinilados se detectó después de la adición de estreptavidina conjugada con HRP (Zymed) y TMB, secuencialmente. La biotinilación de los mAbs se llevó a cabo usando el EZ-link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con el protocolo del fabricante. A competitive ELISA assay was carried out in order to determine the inhibitory activity of RBD-specific mAbs on the binding of biotinylated mAbs to RBD-Fc. In summary, the wells of the ELISA plates were coated with RBD-Fc at a concentration of 1 µg / ml as described above. A mixture containing 50 µg / ml of an unlabeled mAb and 1 µg / ml of a biotinylated mAb was added, followed by incubation at 37 ° C for 1 hour. Binding of biotinylated mAbs was detected after the addition of streptavidin conjugated with HRP (Zymed) and TMB, sequentially. The biotinylation of the mAbs was carried out using the EZ-link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit (Pierce, Rockford, IL), according to the manufacturer's protocol.
Neutralización de la infección por pseudovirus SARS. El ensayo de neutralización convencional que usa SARS-CoV vivo es engorroso y ha de llevarse a cabo en instalaciones BSL-3. Por ello, los autores de la presente invención adaptaron un sistema de pesudovirus de SARS-CoV (27,32,42,43) en el laboratorio de los presentes inventores. Este ensayo es sensible y cuantitativo y puede llevarse a cabo en instalaciones BSL-2. El pseudovirus del SARS que porta la proteína S del SARS-CoV y un genoma del VIH-1 defectuoso que expresa luciferasa como una informadora, se preparó tal como ha sido ya descrito (27,42,43). En resumen, se co-transfirieron células 293T con un plásmido que codifica la proteína S del SARS-CoV optimizada con codón y un plásmido que codifica el genoma de VIH-1 que expresa luciferasa, Env-defectuoso (pNL4-3,1uc.RE) usando reactivos Fugene 6 (Boehringer Mannheim). Los sobrenadantes conteniendo el pseudovirus del SARS se cultivaron durante 48 horas post-transfección y se usaron para la infección del ciclo único de células 293T transfectadas con ACE2 (293T/ACE2). En resumen, las células 293T/ACE2 se sembraron en placa a una concentración de 104 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos y se desarrollaron durante una noche. Los sobrenadantes conteniendo el pseudovirus se pre-incubaron con mAbs o sueros de ratón diluidos en serie al doble a 37ºC durante 1 hora antes de la adición a las células. El cultivo se re-alimentó con medio reciente 24 horas después y se incubó durante un tiempo adicional de 48 horas. Las células se lavaron con PBS y se lisaron usando reactivo de lisis incluido en un kit de luciferasa (Promega, Madison, WI). Se transfirieron partes alícuotas de lisados de células a placas de medición de luz de fondo plano Costar de 96 pocillos(Corning Costar, Coming, NY), seguido de la adición del substrato de luciferasa (Promega). Las unidades de luz relativas (RLU) se determinaron inmediatamente en el medidor de luz Ultra 384 (Tecan US). Neutralization of SARS pseudovirus infection. The conventional neutralization test using live SARS-CoV is cumbersome and has to be carried out in BSL-3 facilities. Therefore, the authors of the present invention adapted a SARS-CoV pesudovirus system (27,32,42,43) in the laboratory of the present inventors. This test is sensitive and quantitative and can be carried out in BSL-2 installations. The SARS pseudovirus that carries the S-protein of the SARS-CoV and a defective HIV-1 genome that expresses luciferase as a reporter, was prepared as previously described (27,42,43). In summary, 293T cells were co-transferred with a plasmid encoding codon-optimized SARS-CoV S protein and a plasmid encoding the HIV-1 genome expressing luciferase, Env-defective (pNL4-3,1uc.RE ) using Fugene 6 reagents (Boehringer Mannheim). Supernatants containing the SARS pseudovirus were cultured for 48 hours post-transfection and used for single cycle infection of 293T cells transfected with ACE2 (293T / ACE2). In summary, 293T / ACE2 cells were plated at a concentration of 104 cells / well in 96-well tissue culture plates and grown overnight. Supernatants containing the pseudovirus were pre-incubated with mAbs or mouse sera serially diluted twice at 37 ° C for 1 hour before addition to the cells. The culture was re-fed with fresh medium 24 hours later and incubated for an additional 48 hours. The cells were washed with PBS and lysed using lysis reagent included in a luciferase kit (Promega, Madison, WI). Aliquots of cell lysates were transferred to 96-well Costar flat-bottom light measurement plates (Corning Costar, Coming, NY), followed by the addition of the luciferase substrate (Promega). The relative light units (RLU) were determined immediately on the Ultra 384 (Tecan US) light meter.
Inhibición de la unión de RBD-Fc con receptor mediante mAbs. La inhibición de mAbs sobre la unión de RBD-Fc a células que expresan ACE2, se midió mediante citometría de flujo. En resumen, se separaron, recolectaron y lavaron 106 células 293T/ACE2 con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (Sigma, St Louis, MO). Se agregó RBD-Fc a las células hasta una concentración final de 1 µg/ml en la presencia o ausencia de 50 µg/ml de mAbs, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se lavaron con HBSS y se incubaron con conjugado IgG-FITC anti-humano (Zymed) a una dilución de 1:50 a temperatura ambiente durante un tiempo adicional de 30 minutos. Después del lavado, las células se fijaron con formaldehido al 1% en PBS y se analizaron en un citómetro de flujo Becton FACSCalibur (Mountain View, CA) usando el software CellQuest. Inhibition of RBD-Fc binding with receptor by mAbs. The inhibition of mAbs on the binding of RBD-Fc to cells expressing ACE2, was measured by flow cytometry. In summary, 106 293T / ACE2 cells were separated, collected and washed with Hank's balanced salt solution (HBSS) (Sigma, St Louis, MO). RBD-Fc was added to the cells to a final concentration of 1 µg / ml in the presence or absence of 50 µg / ml of mAbs, followed by incubation at room temperature for 30 minutes. The cells were washed with HBSS and incubated with anti-human IgG-FITC conjugate (Zymed) at a dilution of 1:50 at room temperature for an additional 30 minutes. After washing, the cells were fixed with 1% formaldehyde in PBS and analyzed on a Becton FACSCalibur flow cytometer (Mountain View, CA) using the CellQuest software.
La inhibición de la unión de RBD-Fc a ACE2 soluble mediante mAbs se midió mediante un ensayo ELISA. En resumen, se recubrió ACE2 soluble recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) a una concentración de 2 µg/ml sobre placas ELISA de 96 pocillos (Coming Costar) en tampón de carbonato 0,1 M (pH 9,6) a 4ºC durante una noche. Después de bloqueo con leche no grasa al 2%, se agregó 1 µg/ml de RBD-Fc a los pocillos en la presencia o ausencia de 50 µg/ml de mAbs de ratón y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después del lavado, se agregó IgG anti-humano de cabra conjugado con HRP (Zymed) y se incubaron durante un tiempo adicional de 1 hora. Después del lavado, el substrato TMB se usó para detección. Inhibition of RBD-Fc binding to soluble ACE2 by mAbs was measured by an ELISA. In summary, recombinant soluble ACE2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) was coated at a concentration of 2 µg / ml on 96-well ELISA plates (Coming Costar) in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6 ) at 4 ° C overnight. After blocking with 2% non-fat milk, 1 µg / ml of RBD-Fc was added to the wells in the presence or absence of 50 µg / ml of mouse mAbs and incubated at 37 ° C for 1 hour. After washing, goat anti-human IgG conjugated with HRP (Zymed) was added and incubated for an additional time of 1 hour. After washing, the TMB substrate was used for detection.
Aislamiento y caracterización inicial de mAbs específicos para RBD. La proteína de fusión RBD-Fc se expresó transitoriamente en células 293T y se purificó hasta homogeneidad mediante Proteín A. Se inmunizaron cinco ratones (A a E) cuatro veces con RBD-Fc en la presencia de adyuvante Ribi. Todos los animales desarrollaron respuestas anticuerpos apreciables contra RBD-Fc después del primer refuerzo, y sus valores de anticuerpos se incrementaron en las inmunizaciones posteriores. Los antisueros recolectados 4 días después del tercer refuerzo mostraron actividad neutralizante altamente potente contra el SARS-CoV y el pseudovirus del SARS que porta la proteína S del SARS-CoV. Isolation and initial characterization of mAbs specific for RBD. The RBD-Fc fusion protein was transiently expressed in 293T cells and purified to homogeneity by Protein A. Five mice (A to E) were immunized four times with RBD-Fc in the presence of Ribi adjuvant. All animals developed appreciable antibody responses against RBD-Fc after the first booster, and their antibody values were increased in subsequent immunizations. The antisera collected 4 days after the third booster showed highly potent neutralizing activity against SARS-CoV and the SARS pseudovirus carrying the S protein of SARS-CoV.
Se generó un panel de 27 mAbs específicos del RBD mediante la fusión de esplenocitos procedentes de ratones inmunizados contra RBD-Fc con células de mieloma Sp2/0 y, a continuación, el rastreo de hibridomas con S1-C9 como un antígeno. Las especificidades de los epítopos de estos mAbs se determinaron inicialmente mediante ensayos ELISA usando RBD-Fc, RBD-Fc reducido con DTT, S1-C9, S1-C9 reducido con DTT, y un IgG humano purificado como antígenos de recubrimiento (Tabla I). La mayoría de los mAbs (25/27) fueron reactivos con RBD-Fc y S1-C9 nativos, pero no con RBD-Fc y S1-C9 reducidos con DTT. Esto indica que fueron dirigido contra epitópos de conformación dependientes del enlace disulfuro expresados sobre la proteína S del RBD. Otros dos mAbs (4D5 y 17H9) reconocieron tanto los RBD-Fc y S1-C9 nativos como reducidos, lo que indica que fueron dirigidos contra epítopos lineales presentados sobre el RBD. Ninguno de los mAbs rastreados por S1-C9 reaccionó con IgG humano, en tanto que el antisuero de control procedente de un ratón inmunizado con RBD-Fc fue reactivo con IgG humano (Tabla I). A panel of 27 mAbs specific to the RBD was generated by the fusion of splenocytes from mice immunized against RBD-Fc with Sp2 / 0 myeloma cells and then hybridoma screening with S1-C9 as an antigen. The epitope specificities of these mAbs were initially determined by ELISA assays using RBD-Fc, RBD-Fc reduced with DTT, S1-C9, S1-C9 reduced with DTT, and a purified human IgG as coating antigens (Table I) . Most mAbs (25/27) were reactive with native RBD-Fc and S1-C9, but not with RBD-Fc and S1-C9 reduced with DTT. This indicates that they were directed against disulfide-dependent conformation epitopes expressed on the S protein of the RBD. Two other mAbs (4D5 and 17H9) recognized both native and reduced RBD-Fc and S1-C9, indicating that they were directed against linear epitopes presented on the RBD. None of the mAbs screened by S1-C9 reacted with human IgG, while the control antiserum from a mouse immunized with RBD-Fc was reactive with human IgG (Table I).
Puesto que los mAbs 4D5 y 17H9 pudieron reaccionar con el RBD-Fc y S1-C9 reducidos, sus epítopos podrían maparse con péptidos sintéticos. Se usó un conjunto de 27 péptidos de solapamiento que cubren el RBD de la proteína S para localizar los epítopos 4D5 y 17H9 mediante ELISA. Tal como se muestra en la Fig. 1, el 4D5 reaccionó con el péptido 435-451 (NYNYKYRYLRHGKLRPF), y el 17H9 reaccionó con dos péptidos solapados 442-458 (YLRHGKLRPFERDISNV) y 449-465 (RPFERDISNVPFSPDGK). Aunque el epítopo de 17H9 se mapó claramente a la secuencia solapada (RPFERDISNV) de los péptidos 442-458 y 449-465, el epítopo para 4D5 requiere la mayoría de la secuencia del péptido 435-451 que solapa secuencias parciales de los péptidos 442-458 y 449-465. En consecuencia, estos dos mAbs reconocen los epítopos lineales vecinos que residen dentro del RBD. Ninguno de los mAbs dependientes de la conformación reaccionan con ninguno de los péptidos ensayados (datos no mostrados). Since mAbs 4D5 and 17H9 were able to react with the reduced RBD-Fc and S1-C9, their epitopes could be mapped with synthetic peptides. A set of 27 overlapping peptides covering the RBD of protein S was used to locate epitopes 4D5 and 17H9 by ELISA. As shown in Fig. 1, 4D5 reacted with peptide 435-451 (NYNYKYRYLRHGKLRPF), and 17H9 reacted with two overlapping peptides 442-458 (YLRHGKLRPFERDISNV) and 449-465 (RPFERDISNVPFSP). Although the 17H9 epitope was clearly mapped to the overlapping sequence (RPFERDISNV) of peptides 442-458 and 449-465, the epitope for 4D5 requires the majority of the 435-451 peptide sequence that overlaps partial sequences of peptides 442- 458 and 449-465. Consequently, these two mAbs recognize the neighboring linear epitopes that reside within the RBD. None of the conformation-dependent mAbs react with any of the peptides tested (data not shown).
Especificidad del epítopo de los mAbs específicos del RBD determinada mediante ensayos de competencia de unión. Con el fin de caracterizar los epítopos dependientes de la conformación, los mAbs específicos del RBD se agruparon por ensayos de competencia de unión (Tabla II). Uno de los mAbs (10E7) primeramente se biotiniló y se determinó la actividad inhibidora de los 27 mAbs sobre la unión de 10E7 a RBD-Fc. Los mAbs 4D5 y 17H9 que reconocen epítopos lineales mapados por los péptidos anteriores se incluyeron en los ensayos de competencia como un control. Aproximadamente la mitad de los mAbs dependientes de la conformación (13/25) compitieron con el 10E7 biotinilado, en tanto que otros mAbs no bloquearon la unión de 10E7 al RBD-Fc. Otros cuatro de los mAbs de no competencia (11E12, 33G4, 45B5, y 17H9) se biotinilaron posteriormente y se ensayaron de manera similar con el ensayo de competencia de unión. Cinco de los 13 mAbs que compiten con el 10E7 biotinilado bloquearon también la unión de 45B5 al RBD-Fc y fueron designados como un grupo separado. De esta forma, los 25 mAbs específicos de la conformación se dividieron en seis grupos de competencia distintos (designados como Conf I-VI). Dos mAbs específicos del epítopo lineal (4D5 y 17H9) no compiten con ninguno de los mAbs específicos de la conformación. Estos resultados sugieren que el RBD de la proteína S contiene múltiples estructuras antigénicas que inducen respuestas anticuerpo específicas en los ratones. Sin embargo, los epítopos inmunodominantes en el RBD son dependientes de la conformación. Epitope specificity of the specific RBD mAbs determined by binding competition assays. In order to characterize the conformation-dependent epitopes, the specific mAbs of the RBD were grouped by binding competence assays (Table II). One of the mAbs (10E7) was first biotinylated and the inhibitory activity of the 27 mAbs on the binding of 10E7 to RBD-Fc was determined. The 4D5 and 17H9 mAbs that recognize linear epitopes mapped by the above peptides were included in the competition assays as a control. Approximately half of the conformation-dependent mAbs (13/25) competed with biotinylated 10E7, while other mAbs did not block the binding of 10E7 to the RBD-Fc. Four other non-competition mAbs (11E12, 33G4, 45B5, and 17H9) were subsequently biotinylated and similarly tested with the binding competition test. Five of the 13 mAbs competing with biotinylated 10E7 also blocked the 45B5 binding to the RBD-Fc and were designated as a separate group. In this way, the specific 25 mAbs of the conformation were divided into six distinct competence groups (designated as Conf I-VI). Two specific mAbs of the linear epitope (4D5 and 17H9) do not compete with any of the specific mAbs of the conformation. These results suggest that the RBD of the S protein contains multiple antigenic structures that induce specific antibody responses in mice. However, immunodominant epitopes in the RBD are conformation dependent.
Caracterización de los mAbs que bloquean la unión del receptor. El RBD-Fc pudo unirse de manera eficaz a la ACE2 expresada sobre células 293T/ACE2 y a ACE2 soluble tal como se midió mediante citometría de flujo y ELISA, respectivamente (datos no mostrados). Los autores de la presente invención han ensayado si los mAbs específicos de RBD inhiben la unión de RBD-Fc a ACE2 asociada a células o soluble. Tal como se muestra en la Fig. 2, todos los mAbs procedentes de Conf IV (28D6, 30F9, y 35B5) y de Conf V (24F4, 33G4, y 38D4) bloquearon completamente la unión de RBD-Fc tanto a ACE2 asociado a células como soluble de una manera altamente consistente. La totalidad de los mAbs de Conf III (11E12 y 18D9) y dos de los cuatro mAbs de Conf VI (19B2 y 45F6) inhibieron parcialmente la unión de RBD-Fc a ACE2 expresada sobre células 293T/ACE2 y a ACE2 soluble. Todos los otros mAbs, incluyendo dos mAbs contra secuencias lineales, no tuvieron efecto inhibidor significativo sobre la unión del receptor. Estos resultados indican que los mAbs de Conf IV y Conf V reconocen epítopos que pueden solapar con los sitios de unión del receptor de conformación en la proteína S, aunque estos mAbs no compiten entre sí en los ensayos de competencia de unión. Los mAbs de Conf III y dos mAbs de Conf VI (19B2 y 45F6) pueden unirse igualmente a los epítopos de conformación que están implicaos en la unión del receptor. Todos los mAbs de Conf I y de Conf II no bloquean la unión del receptor, lo cual sugiere que reconocen los epítopos de conformación que no solapan los sitios de unión del receptor en RBD. Estos resultados aclaran la heterogeneicidad epitópica de los mAbs específicos de RBD y además indican que el RBD de la proteína S contiene múltiples conformaciones congénitas. Characterization of mAbs that block receptor binding. The RBD-Fc was able to efficiently bind ACE2 expressed on 293T / ACE2 cells and soluble ACE2 as measured by flow cytometry and ELISA, respectively (data not shown). The authors of the present invention have tested whether RBD-specific mAbs inhibit RBD-Fc binding to cell-associated or soluble ACE2. As shown in Fig. 2, all mAbs from Conf IV (28D6, 30F9, and 35B5) and Conf V (24F4, 33G4, and 38D4) completely blocked the binding of RBD-Fc to both ACE2 associated with cells as soluble in a highly consistent manner. All Conf III mAbs (11E12 and 18D9) and two of the four Conf VI mAbs (19B2 and 45F6) partially inhibited the binding of RBD-Fc to ACE2 expressed on 293T / ACE2 cells and soluble ACE2. All other mAbs, including two mAbs against linear sequences, had no significant inhibitory effect on receptor binding. These results indicate that Conf IV and Conf V mAbs recognize epitopes that can overlap with the conformation receptor binding sites on the S protein, although these mAbs do not compete with each other in binding competition assays. The Conf III mAbs and two Conf VI mAbs (19B2 and 45F6) can also bind to the conformation epitopes that are involved in receptor binding. All Conf I and Conf II mAbs do not block receptor binding, which suggests that they recognize conformation epitopes that do not overlap the receptor binding sites in RBD. These results clarify the epitopic heterogeneicity of RBD-specific mAbs and also indicate that the RBD of protein S contains multiple congenital conformations.
Los mAbs específicos de RBD tienen potente actividad neutralizante. Cada uno de los mAbs específicos de RBD se ensayó para determinar la actividad neutralizante contra el pseudovirus SARS. De manera sorprendente, la mayoría de los mAbs dependiente de la conformación (23/25) tenían potente actividad neutralizante con dosis de neutralización al 50% (ND50) dentro del intervalo de desde 0,005 hasta 6,569 µg/ml (Tabla III), en tanto que dos mAbs que dirigen contra epítopos lineales (4D5 y 17H9) y un mAb procedente de Conf VI (44B5) a una concentración tan alta como de 100 µg/ml no neutralizaron la infección por pseudovirus SARS. Los mAbs 33G4 procedentes de Conf V y 30F9 procedentes de Conf IV, que bloquearon la unión del receptor tenían actividades neutralizantes las más altas contra el pseudovirus. De manera interesante, incluso 45F6 procedente de Conf VI, con su actividad neutralizante del pseudovirus relativamente más baja, bloqueó parcialmente la unión de RBD-Fc con ACE2. En la Fig. 3, se presenta la actividad neutralizante dependiente de la dosis de diversos mAbs representativos procedentes de cada uno de los grupos. Estos resultados sugieren que el RBD de la proteína S induce de manera predominante los anticuerpos neutralizantes que dirigen contra los epítopos de conformación. RBD-specific mAbs have potent neutralizing activity. Each of the specific RBD mAbs was tested for neutralizing activity against the SARS pseudovirus. Surprisingly, most conformation-dependent mAbs (23/25) had potent neutralizing activity with 50% neutralization dose (ND50) within the range of 0.005 to 6.569 µg / ml (Table III), while that two mAbs that directed against linear epitopes (4D5 and 17H9) and one mAb from Conf VI (44B5) at a concentration as high as 100 µg / ml did not neutralize SARS pseudovirus infection. The 33G4 mAbs from Conf V and 30F9 from Conf IV, which blocked receptor binding had the highest neutralizing activities against the pseudovirus. Interestingly, even 45F6 from Conf VI, with its relatively lower pseudovirus neutralizing activity, partially blocked the binding of RBD-Fc with ACE2. In Fig. 3, the dose-dependent neutralizing activity of various representative mAbs from each of the groups is presented. These results suggest that RBD of protein S predominantly induces neutralizing antibodies that direct against conformation epitopes.
Exposición experimental Experimental exposure
Recientes estudios han mostrado que la proteína S del SARS-CoV es uno de los antígenos principales que provocan respuestas inmunes durante la infección (44-46). Esto sugiere que la proteína S puede servir como inmunógeno para la inducción de mAbs neutralizantes. En el presente estudio, los autores de la presente invención han usado una proteína de fusión recombinante RBD-Fc como un inmunógeno para inmunizar ratones y generaron clones de hibridoma para producir 27 mAbs. Una mayoría de estos mAbs (25/27) reconocieron epítopos de conformación yentre ellos, 23 mAbs tenían potente actividad neutralizante. Únicamente dos mAbs se maparon a los epítopos lineales adyacentes mediante péptidos de solapamiento y no pudieron neutralizar la infección por pseuodovirus SARS. De manera interesante, los mAbs dependientes de la conformación pudieron dividirse en seis grupos diferentes (es decir, Conf I-VI) en base a un experimento de competencia de unión, lo que sugiere que existen diversos epítopos de distinta conformación sobre el RBD que pueden provocar anticuerpos neutralizantes. Recent studies have shown that SARS-CoV S protein is one of the main antigens that cause immune responses during infection (44-46). This suggests that the S protein can serve as an immunogen for the induction of neutralizing mAbs. In the present study, the authors of the present invention have used a recombinant RBD-Fc fusion protein as an immunogen to immunize mice and generated hybridoma clones to produce 27 mAbs. A majority of these mAbs (25/27) recognized conformation epitopes and among them, 23 mAbs had potent neutralizing activity. Only two mAbs were mapped to adjacent linear epitopes by overlapping peptides and could not neutralize SARS pseuodovirus infection. Interestingly, conformation-dependent mAbs could be divided into six different groups (i.e., Conf I-VI) based on a binding competition experiment, suggesting that there are several different conformation epitopes on the RBD that may provoke neutralizing antibodies
Sería de esperar que todos los mAbs neutralizantes dirigidos contra el RBD puedieran bloquear la interacción entre RBD y ACE2, el receptor funcional del SARS-CoV. Sin embargo, los autores de la presente invención han encontrado que únicamente los mAbs que reconocen el Conf IV y V pudieron bloquear de manera eficaz la unión de RBD a It would be expected that all neutralizing mAbs directed against the RBD could block the interaction between RBD and ACE2, the functional SARS-CoV receptor. However, the authors of the present invention have found that only mAbs that recognize Conf IV and V could effectively block the binding of RBD to
ACE2. Algunos mAbs que reaccionan con Conf III y VI inhibieron parcialmente la interacción entre el RBD y ACE2. Esto sugiere que sus epítopos pueden solapar los sitios de unión del receptor sobre el RBD o la unión de estos mAbs a RBD puede causar cambios de conformación de los sitios de unión del receptor, dando como resultado la inhibición de la unión de RBD a ACE2. Los mAbs que reconocen los Conf I y II no afectan de manera significativa a la unión de RBD a ACE2, pero igualmente poseen potentes actividades neutralizantes, lo que sugiere que estos mAbs inhiben la infección de SARS-CoV sin interferir la interacción de RBD-ACE2. El mecanismo de acción de estos mAbs necesita investigarse más. Esos datos indican que el RBD induce anticuerpos neutralizantes específicos no solamente para los sitios de unión del receptor, sino además para otras conformaciones estructurales únicas, a la vista de su heterogenicidad antigénica, y sugieren que el RBD de la proteína S de SARS-CoV contiene múltiples epítopos de conformación responsables de la inducción de potentes respuestas de anticuerpos neutralizantes. ACE2. Some mAbs that react with Conf III and VI partially inhibited the interaction between the RBD and ACE2. This suggests that their epitopes may overlap the receptor binding sites on the RBD or the binding of these mAbs to RBD may cause conformation changes of the receptor binding sites, resulting in inhibition of the binding of RBD to ACE2. The mAbs that recognize Conf I and II do not significantly affect the binding of RBD to ACE2, but also have potent neutralizing activities, suggesting that these mAbs inhibit SARS-CoV infection without interfering with the interaction of RBD-ACE2 . The mechanism of action of these mAbs needs further investigation. These data indicate that RBD induces specific neutralizing antibodies not only for receptor binding sites, but also for other unique structural conformations, in view of their antigenic heterogenicity, and suggest that the RBD of SARS-CoV S protein contains multiple conformation epitopes responsible for the induction of potent neutralizing antibody responses.
La sensibilidad de conformación de los mAbs neutralizantes de SARS-CoV descrita en la presente invención está de acuerdo con las propiedades de los mAbs neutralizantes generados contra otros virus envueltos, lo cual generalmente requiere mayor conformación nativa para la unión (47,48). Aunque el RBD de la proteína S de SARS-CoV es un fragmento pequeño de 193 aminoácidos, este contiene siete cisteínas y cinco de las cuales son esenciales para la asociación de ACE2. Los enlaces disulfuro entre estas cisteínas puede formar estructuras terciarias complejas para constituir las múltiples conformaciones antigénicas. Sin embargo, un mAb humano neutralizante seleccionado a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos no inmunes podría reaccionar con la proteína S reducida con DTT y bloquear la asociación del receptor (49). Por ello, es necesaria la caracterización adicional para definir los determinantes de neutralización sobre el RBD de la proteína S de SARS-CoV, y esto puede proporcionar información crítica para el desarrollo de productos farmacéuticos y vacunas anti-SARS. The conformation sensitivity of SARS-CoV neutralizing mAbs described in the present invention is in accordance with the properties of neutralizing mAbs generated against other enveloped viruses, which generally requires greater native conformation for binding (47,48). Although the SARS-CoV S protein RBD is a small fragment of 193 amino acids, it contains seven cysteines and five of which are essential for the association of ACE2. The disulfide bonds between these cysteines can form complex tertiary structures to constitute the multiple antigenic conformations. However, a neutralizing human mAb selected from a library of non-immune human antibodies could react with reduced S protein with DTT and block receptor association (49). Therefore, additional characterization is necessary to define the neutralization determinants on the RBD of the SARS-CoV S protein, and this can provide critical information for the development of pharmaceutical products and anti-SARS vaccines.
Se ha informado que la transferencia pasiva de sueros inmunes de ratón redujeron la replicación vírica pulmonar en los ratones expuestos con SARS-CoV (33,50), y la administración profiláctica de mAbs neutralizantes confirió protección in vivo en los ratones o en los hurones (51,52), lo que sugiere que la inmunización pasiva con anticuerpos anti-SARS es una estrategia viable para el control del SARS. Así, pueden usarse mAbs con altos índices de actividad neutralizante del SARS-CoV para el tratamiento temprano de la infección por SARS-CoV. Sin embargo, la aplicación de mAbs múridos en humanos estará limitada debido a las respuestas anticuerpo anti-ratón-humano (HAMA) (53-55). Si únicamente se usan unas pocas dosis de mAbs múridos en un corto período de tiempo (una o dos semanas) en la fase temprana de la infección por SARS-CoV, puede no causar una seria respuesta HAMA, pero este tratamiento urgente puede salvar vidas de pacientes con SARS. Los autores de la presente invención han usado estrategias similares para el tratamiento temprano de la infección por el virus Hantaan (HTNV), usando mAbs anti-HTNV múridos (56). Además, los mAbs neutralizantes múridos pueden humanizarse como productos terapéuticos o para inmunoprofilaxis para proporcionar protección inmediata contra la infección por SARS-CoV a aquellas poblaciones en riesgo. It has been reported that passive transfer of mouse immune sera reduced pulmonary viral replication in mice exposed with SARS-CoV (33,50), and prophylactic administration of neutralizing mAbs conferred protection in vivo in mice or ferrets ( 51,52), which suggests that passive immunization with anti-SARS antibodies is a viable strategy for SARS control. Thus, mAbs with high rates of SARS-CoV neutralizing activity can be used for the early treatment of SARS-CoV infection. However, the application of murine mAbs in humans will be limited due to the anti-mouse-human antibody (HAMA) responses (53-55). If only a few doses of murine mAbs are used in a short period of time (one or two weeks) in the early phase of SARS-CoV infection, it may not cause a serious HAMA response, but this urgent treatment can save lives of SARS patients. The authors of the present invention have used similar strategies for the early treatment of Hantaan virus (HTNV) infection, using murine anti-HTNV mAbs (56). In addition, murine neutralizing mAbs can be humanized as therapeutic products or for immunoprophylaxis to provide immediate protection against SARS-CoV infection to those populations at risk.
La importancia del presente estudio es triple. En primer lugar, se han generado un cierto número de mAbs neutralizantes específicos del RBD altamente potentes, los cuales pueden desarrollarse como productos inmunoterapéuticos para el tratamiento urgente contra el SARS. En segundo lugar, estos mAbs pueden desarrollarse como agentes de diagnóstico para la detección de la infección por SARS-Co-V. En tercer lugar, estos mAbs pueden usarse como sondas para el estudio de la inmunoespecificidad, antigenicidad, estructura, y función de la proteína S del SARS-CoV. Estos mAbs pueden además humanizarse para el tratamiento y la prevención del SARS. The importance of the present study is threefold. First, a certain number of highly potent neutralizing mAbs of the RBD have been generated, which can be developed as immunotherapeutic products for urgent treatment against SARS. Second, these mAbs can be developed as diagnostic agents for the detection of SARS-Co-V infection. Third, these mAbs can be used as probes for the study of immunospecificity, antigenicity, structure, and function of the S protein of SARS-CoV. These mAbs can also be humanized for the treatment and prevention of SARS.
Tabla I. Reactividades de mAbs específicos del RBD contra diversos antígenosa
Table I. Reactivities of RBD-specific mAbs against various antigens
- mAbs mAbs
- Isotipo Antígeno Isotype Antigen
- RBD-Fc RBD-Fc
- RBD-Fc reducido S1-C9 S1-C9 reducido IgG humano RBD-Fc reduced S1-C9 S1-C9 reduced Human IgG
- 4D5 4D5
- IgG1/к 0,88 1,36 0,65 0,94 0,02 IgG1 / к 0.88 1.36 0.65 0.94 0.02
- 9F7 9F7
- IgG1/к 1,60 0,00 1,45 0,08 0,04 IgG1 / к 1.60 0.00 1.45 0.08 0.04
- 10E7 10E7
- IgG1/к 1,77 0,02 1,72 0,16 0,05 IgG1 / к 1.77 0.02 1.72 0.16 0.05
- 11E12 11E12
- IgG2a/к 1,50 0,01 0,72 0,09 0,02 IgG2a / к 1.50 0.01 0.72 0.09 0.02
- 12B11 12B11
- IgG1/к 1,37 0,04 0,78 0,00 -0,01 IgG1 / к 1.37 0.04 0.78 0.00 -0.01
- 13B6 13B6
- IgG1/к 1,58 -0,01 0,93 0,00 0,02 IgG1 / к 1.58 -0.01 0.93 0.00 0.02
- 17H9 17H9
- IgG1/к 1,72 1,71 1,21 1,15 0,07 IgG1 / к 1.72 1.71 1.21 1.15 0.07
- 18C2 18C2
- IgG1/к 1,28 -0,01 0,80 0,01 -0,20 IgG1 / к 1.28 -0.01 0.80 0.01 -0.20
- 18D9 18D9
- IgG1/к 1,47 -0,01 0,90 0,01 0,03 IgG1 / к 1.47 -0.01 0.90 0.01 0.03
Tabla I. (Cont.)
Table I. (Cont.)
- mAbs mAbs
- Isotipo Antígeno Isotype Antigen
- RBD-Fc RBD-Fc
- RBD-Fc reducido S1-C9 S1-C9 reducido IgG humano RBD-Fc reduced S1-C9 S1-C9 reduced Human IgG
- 19B2 19B2
- IgG1/к 1,63 0,00 1,55 0,12 0,01 IgG1 / к 1.63 0.00 1.55 0.12 0.01
- 20E7 20E7
- IgG2a/к 1,50 0,00 0,98 0,01 0,02 IgG2a / к 1.50 0.00 0.98 0.01 0.02
- 24F4 24F4
- IgG1/к 1,69 -0,01 1,08 0,08 0,04 IgG1 / к 1.69 -0.01 1.08 0.08 0.04
- 24H8 24H8
- IgG1/к 1,54 -0,01 0,94 0,12 0,01 IgG1 / к 1.54 -0.01 0.94 0.12 0.01
- 26A4 26A4
- IgG1/к 1,60 0,00 0,89 0,09 0,01 IgG1 / к 1.60 0.00 0.89 0.09 0.01
- 26E1 26E1
- IgG1/к 1,91 0,07 1,85 0,06 0,01 IgG1 / к 1.91 0.07 1.85 0.06 0.01
- 27C1 27C1
- IgG1/к 1,46 0,00 1,57 0,07 0,01 IgG1 / к 1.46 0.00 1.57 0.07 0.01
- 28D6 28D6
- IgG1/к 2,06 0,01 1,60 0,16 0,00 IgG1 / к 2.06 0.01 1.60 0.16 0.00
- 29G2 29G2
- IgG2a/к 1,69 0,00 0,96 0,17 0,04 IgG2a / к 1.69 0.00 0.96 0.17 0.04
- 30F9 30F9
- IgG1/к 1,66 0,04 1,21 0,12 0,01 IgG1 / к 1.66 0.04 1.21 0.12 0.01
- 31H12 31H12
- IgG1/к 1,72 0,08 1,91 0,22 0,03 IgG1 / к 1.72 0.08 1.91 0.22 0.03
- 32H5 32H5
- IgG1/к 1,54 0,06 1,55 0,51 0,00 IgG1 / к 1.54 0.06 1.55 0.51 0.00
- 33G4 33G4
- IgG2a/к 1,79 0,02 1,76 0,20 -0,01 IgG2a / к 1.79 0.02 1.76 0.20 -0.01
- 34E10 34E10
- IgG1/к 1,62 0,10 1,82 0,18 0,04 IgG1 / к 1.62 0.10 1.82 0.18 0.04
- 35B5 35B5
- IgG1/к 1,74 0,06 1,72 0,25 0,02 IgG1 / к 1.74 0.06 1.72 0.25 0.02
- 38D4 38D4
- IgG1/к 1,63 -0,01 1,20 0,07 0,00 IgG1 / к 1.63 -0.01 1.20 0.07 0.00
- 44B5 44B5
- IgG1/к 1,57 0,09 1,64 0,16 0,00 IgG1 / к 1.57 0.09 1.64 0.16 0.00
- 45F6 45F6
- IgG2a/к 1,61 0,11 1,43 0,15 -0,01 IgG2a / к 1.61 0.11 1.43 0.15 -0.01
- Antisuero Antiserum
- 2,22 1,78 2,32 1,68 2,07 2.22 1.78 2.32 1.68 2.07
- Suero natural Natural serum
- 0,01 0,02 0,02 0,01 0,04 0.01 0.02 0.02 0.01 0.04
- a Se usaron antígenos a una concentración de 1 µg/ml; los mAbs se ensayaron a una concentración de 10 µg/ml y los sueros se ensayaron a una dilución de 1:100. Las reactividades positivas se resaltan en negrilla. a Antigens at a concentration of 1 µg / ml were used; mAbs were tested at a concentration of 10 µg / ml and sera were tested at a dilution of 1: 100. Positive reactivities are highlighted in bold.
Tabla II. % de inhibición de mAbs específicos del RBD sobre la unión de mAbs biotinilados a RBD-Fca Table II % inhibition of specific RBD mAbs on the binding of biotinylated mAbs to RBD-Fca
- Grupo Group
- mAb de competencia mAb biotinilados competition mAb Biotinylated mAbs
- 10E7 10E7
- 11E12 33G4 45B5 17H9 11E12 33G4 45B5 17H9
- Conf I Conf I
- 9F7 84,5 11,7 -13,3 22,3 16,4 9F7 84.5 11.7 -13.3 22.3 16.4
- 10E7 10E7
- 91,0 5,6 -12,9 21,0 9,9 91.0 5.6 -12.9 21.0 9.9
- 12B11 12B11
- 85,8 19,3 -0,2 19,8 21,0 85.8 19.3 -0.2 19.8 21.0
- 18C2 18C2
- 84,9 19,3 4,9 18,1 19,4 84.9 19.3 4.9 18.1 19.4
- 24H8 24H8
- 93,7 24,0 7,0 25,6 22,1 93.7 24.0 7.0 25.6 22.1
- 26E1 26E1
- 95,1 10,5 37,4 30,4 25,0 95.1 10.5 37.4 30.4 25.0
- 29G2 29G2
- 96,6 20,4 1,6 11,4 23,4 96.6 20.4 1.6 11.4 23.4
Tabla II. (Cont.) Table II (Cont.)
- Grupo Group
- mAb de competencia mAb biotinilados competition mAb Biotinylated mAbs
- 10E7 10E7
- 11E12 33G4 45B5 17H9 11E12 33G4 45B5 17H9
- 32H5 32H5
- 98,9 18,5 4,4 9,1 20,3 98.9 18.5 4.4 9.1 20.3
- Conf II Conf II
- 20E7 97,2 38,5 5,9 73,0 24,6 20E7 97.2 38.5 5.9 73.0 24.6
- 26A4 26A4
- 96,3 33,1 -0,5 60,0 19,0 96.3 33.1 -0.5 60.0 19.0
- 27C1 27C1
- 97,2 36,7 14,6 73,7 20,9 97.2 36.7 14.6 73.7 20.9
- 31H12 31H12
- 97,5 18,7 7,1 58,4 19,7 97.5 18.7 7.1 58.4 19.7
- 30E10 30E10
- 98,3 19,3 12,9 68,9 24,6 98.3 19.3 12.9 68.9 24.6
- Conf III Conf III
- 11E12 12,6 92,0 0,3 -3,7 20,2 11E12 12.6 92.0 0.3 -3.7 20.2
- 18D9 18D9
- -16,2 98,3 8,3 23,6 17,1 -16.2 98.3 8.3 23.6 17.1
- Conf IV Conf IV
- 28D6 39,7 99,6 13,8 67,4 26,6 28D6 39.7 99.6 13.8 67.4 26.6
- 30F9 30F9
- 28,7 100,0 8,7 64,0 32,4 28.7 100.0 8.7 64.0 32.4
- 35B5 35B5
- 34,9 99,9 10,0 64,7 33,6 34.9 99.9 10.0 64.7 33.6
- Conf V Conf V
- 24F4 11,5 -1,0 95,5 2,5 24,9 24F4 11.5 -1.0 95.5 2.5 24.9
- 33G4 33G4
- 9,5 -3,7 99,5 26,4 29,1 9.5 -3.7 99.5 26.4 29.1
- 38D4 38D4
- 8,1 -14,4 82,0 -5,1 15,8 8.1 -14.4 82.0 -5.1 15.8
- Conf VI Conf VI
- 13B6 23,3 10,7 -4,9 72,5 12,6 13B6 23.3 10.7 -4.9 72.5 12.6
- 19B2 19B2
- 2,9 -26,4 18,0 50,0 16,1 2.9 -26.4 18.0 50.0 16.1
- 44B5 44B5
- 25,3 -20,6 10,0 95,6 19,4 25.3 -20.6 10.0 95.6 19.4
- 45F6 45F6
- 25,7 -10,4 10,8 94,8 23,5 25.7 -10.4 10.8 94.8 23.5
- Lineal Linear
- 4D5 13,0 10,6 -11,1 1,0 -10,5 4D5 13.0 10.6 -11.1 1.0 -10.5
- 17H9 17H9
- 17,8 33,3 -5,8 25,,0 97,8 17.8 33.3 -5.8 25,, 0 97.8
- Los mAbs de competencia se ensayaron a una concentración de 100 µg/ml para determinar la capacidad para bloquear la unión de los mAbs biotinilados al RBD-Fc en un ensayo ELISA. Una inhibición mayor del 40% se consideró competencia positiva (valores en negrilla). Los números negativos indican el incremento de unión del reactivo biotinilado. Competent mAbs were tested at a concentration of 100 µg / ml to determine the ability to block the binding of biotinylated mAbs to the RBD-Fc in an ELISA assay. An inhibition greater than 40% was considered positive competition (bold values). Negative numbers indicate the increased binding of the biotinylated reagent.
Tabla III. Neutralización de la actividad de mAbs específicos de RDB-Fc contra pesudovirus SARS Table III Neutralization of the activity of RDB-Fc specific mAbs against SARS pesudovirus
- Grupo Group
- mAb Inhibición de la unión a ACE2a ND50 (µg/ml) mAb ACE2a binding inhibition ND50 (µg / ml)
- Conf I Conf I
- 9F7 - 6,569 9F7 - 6,569
- 10E7 10E7
- - 1,673 - 1,673
- 12B11 12B11
- - 4,918 - 4,918
- 18C2 18C2
- - 5,031 - 5,031
- 24H8 24H8
- - 3,955 - 3,955
- 26E1 26E1
- - 0,354 - 0.354
- 29G2 29G2
- - 3,02 - 3.02
- 32H5 32H5
- - 0,275 - 0.275
- Conf II Conf II
- 20E7 - 5,959 20E7 - 5,959
- 26A4 26A4
- - 2,815 - 2,815
- 27C1 27C1
- - 1,607 - 1,607
- 31H12 31H12
- - 0,139 - 0.139
- 30E10 30E10
- - 0,399 - 0,399
- Conf III Conf III
- 11E12 + 1,39 11E12 + 1.39
- 18D9 18D9
- + 0,02 + 0.02
- Conf IV Conf IV
- 28D6 ++ 0,298 28D6 ++ 0.298
- 30F9 30F9
- ++ 0,009 ++ 0.009
- 35B5 35B5
- ++ 0,131 ++ 0.131
- Conf V Conf V
- 24F4 ++ 0,052 24F4 ++ 0.052
- 33G4 33G4
- ++ 0,005 ++ 0.005
- 38D4 38D4
- ++ 0,332 ++ 0,332
- Conf VI Conf VI
- 13B6 - 1,436 13B6 - 1,436
- 19B2 19B2
- + 0,936 + 0.936
- 44B5 44B5
- - >100 - > 100
- 45F6 45F6
- + 43,894 + 43,894
- Lineal Linear
- 4D5 - >100 4D5 - > 100
- 17H9 17H9
- - >100 - > 100
a “-“, “+”, y “++” indican no inhibición, parcial, y completa, respectivamente. to "-", "+", and "++" indicate non-inhibition, partial, and complete, respectively.
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- Xu, Z.K., L.X. Wei, L.Y. Wang, H.T. Wang, y S. Jiang. “The in vitro and in vivo protective activity of monoclonal antibodies directed against Hantaan virus: potential application for immunotherapy and passive immunization”. Bichem. Biophys. Res. Commun., vol. 298, págs. 552-558, ((2002). Xu, Z.K., L.X. Wei, L.Y. Wang, H.T. Wang, and S. Jiang. "The in vitro and in vivo protective activity of monoclonal antibodies directed against Hantaan virus: potential application for immunotherapy and passive immunization." Bichem Biophys Res. Commun., Vol. 298, p. 552-558, ((2002).
La invención (no de acuerdo con la invención) puede definirse de acuerdo con los aspectos 1 a 36 a continuación. The invention (not according to the invention) can be defined in accordance with aspects 1 to 36 below.
- 1.one.
- Un anticuerpo aislado capaz de unión al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) o anticuerpo capaz de inhibir de manera competitiva la unión del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) a un receptor sobre las células huéspedes o a un receptor libre de células. An isolated antibody capable of binding to the coronavirus spinal protein receptor binding domain associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) or antibody capable of competitively inhibiting the coronavirus binding associated with severe acute respiratory syndrome (SARS- CoV) to a receptor on the host cells or a cell-free receptor.
- 2. 2.
- Una substancia que comprende las regiones determinantes complementarias del anticuerpo del aspecto 1, capaces de unión al mismo epítopo o de inhibir de manera competitiva dicho epítopo como el anticuerpo del aspecto 1. A substance comprising the complementary determining regions of the antibody of aspect 1, capable of binding to the same epitope or competitively inhibiting said epitope as the antibody of aspect 1.
- 3.3.
- La substancia del aspecto 2, en el que la substancia es un anticuerpo. The substance of aspect 2, in which the substance is an antibody.
- 4.Four.
- El anticuerpo del aspecto 1, en el que el anticuerpo es neutralizante. The antibody of aspect 1, in which the antibody is neutralizing.
- 5.5.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 18D9 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6521. An antibody produced by hybridoma 18D9 with ATCC Accession No. PTA-6521.
- 6.6.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 5. The epitope recognized by the antibody of aspect 5.
- 7.7.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 19B2 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6522. An antibody produced by hybridoma 19B2 with ATCC Accession No. PTA-6522.
- 8.8.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 7. The epitope recognized by the antibody of aspect 7.
- 9.9.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 30F9 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6523. An antibody produced by hybridoma 30F9 with ATCC Accession No. PTA-6523.
- 10.10.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 9. The epitope recognized by the antibody of aspect 9.
- 11.eleven.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 31H12 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6524. An antibody produced by hybridoma 31H12 with ATCC Accession No. PTA-6524.
- 12.12.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 11. The epitope recognized by the antibody of aspect 11.
- 13.13.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 32H5 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6525. An antibody produced by hybridoma 32H5 with ATCC Accession No. PTA-6525.
- 14.14.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 13. The epitope recognized by the antibody of aspect 13.
- 15.fifteen.
- Un anticuerpo producido por el hibridoma 33G4 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6526. An antibody produced by hybridoma 33G4 with ATCC Accession No. PTA-6526.
- 16.16.
- El epítopo reconocido por el anticuerpo del aspecto 15. The epitope recognized by the 15 aspect antibody.
- 17. 17.
- El anticuerpo del aspecto 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla o un constructo de fusión de anticuerpo. The antibody of aspect 1, wherein the antibody is a single chain antibody or an antibody fusion construct.
- 18.18.
- El epítopo del aspecto 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. The epitope of aspect 1, in which the antibody is a humanized antibody.
- 19. 19.
- El epítopo del aspecto 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. The epitope of aspect 1, wherein the antibody is a chimeric antibody.
- 20.twenty.
- El anticuerpo aislado del aspecto 1, en el que el anticuerpo está acoplado directamente o indirectamente a un agente citotóxico. The isolated antibody of aspect 1, in which the antibody is directly or indirectly coupled to a cytotoxic agent.
- 21.twenty-one.
- Una célula que comprende el anticuerpo del aspecto 1. A cell comprising the antibody of aspect 1.
- 22.22
- Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo del aspecto 1. A nucleic acid molecule that encodes the antibody of aspect 1.
- 23.2. 3.
- Una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente la molécula del aspecto 22. A nucleic acid molecule capable of specifically hybridizing the appearance 22 molecule.
- 24.24.
- La molécula de ácido nucleico del aspecto 22, en la que es ADN sintético, ADN genómico, ADNc, o ARN. The nucleic acid molecule of aspect 22, in which it is synthetic DNA, genomic DNA, cDNA, or RNA.
- 25.25.
- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico del aspecto 24 o una porción de la misma. A vector comprising the nucleic acid molecule of aspect 24 or a portion thereof.
- 26.26.
- Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico del aspecto 24. A cell comprising the nucleic acid molecule of aspect 24.
- 27.27.
- Un procedimiento para la producción de un anticuerpo capaz de unión al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del rotavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) o un anticuerpo capaz de inhibir de manera competitiva la unión del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) a células huéspedes, que comprende el ligado de manera operativa de la molécula de ácido nucleico del aspecto 22 al elemento regulador apropiado con el fin de expresar dicho anticuerpo; la disposición de la molécula nucleica ligada en condiciones apropiadas que permitan la expresión de dicho anticuerpo; y la recuperación de dicho anticuerpo expresado, produciendo, de esta forma, dicho anticuerpo. A method for the production of an antibody capable of binding to the binding domain of the rotavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) or an antibody capable of competitively inhibiting the coronavirus binding associated with the syndrome severe acute respiratory (SARS-CoV) to host cells, comprising operatively linking the nucleic acid molecule of aspect 22 to the appropriate regulatory element in order to express said antibody; the arrangement of the bound nucleic molecule under appropriate conditions that allow the expression of said antibody; and recovering said expressed antibody, thereby producing said antibody.
- 28. 28.
- El anticuerpo producido mediante el procedimiento del aspecto 27. The antibody produced by the procedure of aspect 27.
- 29.29.
- Una composición que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo del aspecto 1 y un vehículo adecuado. A composition comprising an effective amount of the antibody of aspect 1 and a suitable carrier.
- 30.30
- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo del aspecto 1 y un vehículo aceptable farmacéuticamente. A pharmaceutical composition comprising an effective amount of the antibody of aspect 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.
- 31.31.
- Un procedimiento para el tratamiento por infección del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), que comprende el uso de la composición farmacéutica del aspecto 30. A procedure for the treatment for infection of the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV), which comprises the use of the pharmaceutical composition of aspect 30.
- 32.32
- Un procedimiento de prevención de infección del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), que comprende el uso de la composición farmacéutica del aspecto 30. A method of preventing infection of the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV), which comprises the use of the pharmaceutical composition of aspect 30.
- 33.33.
- Un procedimiento para la detección del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) A procedure for the detection of coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV)
o de células infectadas por el SARS-CoV, que comprende la puesta en contacto del anticuerpo o sus derivados capaces de unión al dominio de unión del receptor de la proteína espicular de dicho virus bajo condiciones que permitan la formación de complejos entre el anticuerpo, o su derivado, y el dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV); y la detección del complejo formado. or of cells infected by SARS-CoV, which comprises the contacting of the antibody or its derivatives capable of binding to the binding domain of the spinal protein receptor of said virus under conditions that allow complex formation between the antibody, or its derivative, and the coronavirus spinal protein receptor binding domain associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV); and the detection of the complex formed.
34. Un procedimiento para el rastreo de compuestos capaces de inhibir la infección del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo mediante el bloqueo de la unión de dicho virus a receptores sobre células huéspedes, que comprende las etapas de: 34. A method for the screening of compounds capable of inhibiting coronavirus infection associated with severe acute respiratory syndrome by blocking the binding of said virus to receptors on host cells, which comprises the steps of:
- (a)(to)
- establecer un sistema para el anticuerpo del aspecto 1 para unir al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), y establish a system for aspect 1 antibody to bind to the binding domain of the coronavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV), and
- (b)(b)
- poner en contacto los compuestos con el sistema de (a), indicando una disminución en la unión del anticuerpo del aspecto 1 al dominio de unión del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) que los compuestos son capaces de interferir con dicha unión e inhibir la infección del receptor de la proteína espicular del coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV). contacting the compounds with the system of (a), indicating a decrease in the binding of the aspect 1 antibody to the binding domain of the coronavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV) than the compounds they are capable of interfering with said binding and inhibiting infection of the coronavirus spicular protein receptor associated with severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV).
- 35.35
- El compuesto que resulta del procedimiento del aspecto 34. The compound resulting from the procedure of aspect 34.
- 36. 36.
- Un kit que comprende un compartimento que contiene el anticuerpo del aspecto 1. A kit comprising a compartment containing the antibody of aspect 1.
<110> Jiang, Shibo <110> Jiang, Shibo
He, Yuxian He, Yuxian
<120> Anticuerpos monoclonales neutralizantes contra el coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo <120> Neutralizing monoclonal antibodies against coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome
<130> 1958427-00011 <130> 1958427-00011
<140> 11/351.108 <140> 11 / 351,108
<141> <141>
<150> US 11/141.925 <150> US 11 / 141,925
<151> <151>
5 <150> US 60/651.046 5 <150> US 60 / 651,046
<151> <151>
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<160> 4 <160> 4
<170> Patentin versión 3.3 <170> Patentin version 3.3
<210> 1 15 <211> 17 <210> 1 15 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> Coronavirus humano <213> Human coronavirus
<400> 1 <400> 1
20 <210> 2 20 <210> 2
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<213> Coronavirus humano <213> Human coronavirus
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<212> PRT <212> PRT
<213> Coronavirus humano <213> Human coronavirus
<400> 4 <400> 4
Claims (7)
- 3.3.
- El hibridoma 30F9 con el No. de Acceso de ATCC PTA-6523. Hybridoma 30F9 with ATCC Accession No. PTA-6523.
- 4.Four.
- Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de infección por SARS-CoV. An antibody according to claim 1 for use in the treatment of SARS-CoV infection.
- 5.5.
- Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de infección por SARS-CoV. Use of an antibody according to claim 1 in the preparation of a medicament for the treatment of SARS-CoV infection.
- (a)(to)
- establecer un sistema para el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para unir al dominio de unión de la proteína espicular del receptor del SARS-CoV; y establishing a system for the antibody according to claim 1 to bind the binding domain of the spicular protein of the SARS-CoV receptor; Y
- (b)(b)
- poner en contacto un compuesto a rastrear con el sistema de (a), indicando una disminución en la unión contacting a compound to be traced with the system of (a), indicating a decrease in binding
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