ES2375280T3 - Vacuna para prevenir y tratar la rinitis atrófica progresiva porcina. - Google Patents

Abstract

Una vacuna para inmunizar un animal contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas, cada una de ellas comprendiendo solamente un fragmento de una toxina de Pasteurella multocida (rsPMT), en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 y 986-1281 de SEC ID Nº 2, respectivamente.

Description

Vacuna para prevenir y tratar la rinitis atrófica progresiva porcina

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención está, en general, en el campo de las vacunas veterinarias, composiciones de vacuna y procedimientos de producir las mismas. Particularmente, en el presente documento se proporcionan las vacunas para inmunizar animales contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres fragmentos de toxinas de subunidades recombinantes de Pasteurella multocida (rsPMT), cada uno con una secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 o 986-1281 de la toxina de Pasteurella multocida (PMT).

2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

[0002] La riñita atrófica progresiva (RAP) es una importante enfermedad de las vías respiratorias altas en cerdos. Las lesiones características incluyen hipoplasia ósea turbinaza, distorsión facial y hemorragia nasal como consecuencia de los frecuentes estornudos. Además, la RAP produce una significativa pérdida económica global en la producción de cerdos debido al retraso del crecimiento. En varios estudios se ha demostrado que la toxina de Pasteurella multocida (PMT) es el principal factor de virulencia responsable de la atrofia turbinaza que se ve en la RAP (véase, por ejemplo, Ackermann MR y col. 1996; Am J Vet Res 57(6):848-852; y Lax AJ & Chanter N. 1990; J Gen Microbiol 136:81-87). La inoculación de PMT sola podría reproducir todos los síntomas principales de la RAP en cerdos expuestos de forma experimental. La PMT, en aerosol o inyectada en los cerdos, produce una atrofia turbinaza grave y reduce la ganancia de peso (Kamp EM & Kimman TG 1988; Am. J. Vet. Res. 49:1844-1849). Los mecanismos por los cuales la PMT reduce la ganancia de peso y la atrofia ósea conchal se han estudiado extensamente. Los resultados de varios estudios indican que la PMT podría incrementar la resorción ósea y reducir la formación de hueso alterando las funciones de los osteoblastos y los osteoclastos.

[0003] La base molecular de la virulencia de la PMT sigue sin estar clara, pero puede estar asociada con la activación de los osteoclastos o inactivación de los osteoblastos. Se ha demostrado que la PMT es un potente mitógeno para varios tipos de células, como los fibroblastos 3T3 de cerdo. La PMT podía inducir una estimulación semimáxima de la síntesis de ADN y la proliferación celular a dosis tan bajas como 1 pM. El efecto de la PMT sobre los osteoclastos y osteoblastos porciones se ha investigado usando un sistema de cultivo celular in vitro. La exposición de las células de médula ósea a la vitamina F3 y a PMT durante el crecimiento condujo a un incremento del número de células y la aparición temprana de los osteoclastos en comparación con los controles. Las concentraciones bajas de PMT dieron como resultado retraso del crecimiento u disminución de la formación de nódulos en los osteoblastos, mientras que las concentraciones altas de PMT aumentaron la muerte celular e inhibieron la formación de módulos (Gwaltney SM y col. 1997; Vet Pathol 34(5):421-430). PMT también estimula la proliferación celular, pero afecta a la maduración celular y a la función celular en cultivos primarios de osteoblastos de rata. Estos hallazgos sugieren que PMT pueden incrementar la resorción ósea y disminuir la aposición ósea, lo que, en última instancia, conduce a osteólisis progresiva y a atrofia ósea continua.

[0004] Muchos posibles patógenos bacterianos pueden colonizar la cavidad nasal o las amígdalas de cerdos y P. multocida es uno de los principales patógenos oportunistas capaces de producir el complejo de enfermedad respiratoria porcina (CERP). De hecho, la RAP se considera una enfermedad respiratoria contagiosa con una elevada prevalecía en las áreas del mundo en la que se practica la cría moderna de cerdos. Los antibióticos, la vacunación y la buena gestión pueden reducir la gravedad y la frecuencia de la RAP. No obstante, el uso excesivo de antibióticos es una fuente de problemas para la salud pública y la vacunación ha surgido como el abordaje más atractivo en el control de la RAP (Foged NT y col. Vet Rec 1989; 125(1):7-11; Kobisch M, Pennings A, Vet Rec 1989; 124 (3):57-61; y Sakano T y col. J Vet Med Sci 1997; 59(1):55-57).

[0005] La totalidad del gen de PMT (toxA) que codifica una proteína de 1285 aminoácidos se ha clonado y expresado en E. coli (Petersen SK & Foged NT 1989; Infect Immun 57(12):3907-3913). Se ha demostrado que un derivado de PMT recombinante que carece de los residuos de aminoácidos 27-147 en N-terminal induce una respuesta protectora contra la exposición a una dosis letal de PMT en ratones (Petersen SK y col. 1991; Infect Immun 59(4):1387-1393), y que reduce la colonización por P. multocida toxigénica en las narinas y amígdalas de los cerdos (Nielsen JP y col. 1991; Can J Vet Res 55(2):128-138). Por tanto, los derivados de PMT recombinantes pueden servir como inmunógenos ideales para producir una buena respuesta protectora sin causar citotoxicidad en animales.

[0006] La formalina es el reactivo más frecuente usado para inactivar la PMT, pero puede inducir alteraciones químicas que pueden reducir la inmunogenicidad o la eficacia de las vacunas (Nielsen JP y col. 1991; como se ha descrito). Por tanto, un derivado de PMT no tóxico pero inmunogénico podría ser ventajoso para el desarrollo de vacunas eficaces contra la RAP. La mayoría de las vacunas contra la RAP probadas hasta la fecha consisten en cultivos inactivados de P. multocida o de toxoides de PMT. Los toxoides se preparan mediante el tratamiento de PMT con formaldehído, que elimina la toxicidad manteniendo la antigenicidad. Estas vacunas para la RAP son eficaces cuando se prueban en granjas. No obstante, PMT constituye menos del 0,6 % de las proteínas celulares de

P. multocida, lo que hace necesario cultivar una gran cantidad de bacterias con el fin de obtener suficiente antígeno para usar a escala comercial. Las vacunas con toxoide tradicionales requieren el cultivo a gran escala de una cepa toxigénica de P. multocida y un procedimiento tedioso y caro para la preparación del toxoide de PMT. Además de requerir tiempo y ser caro, la necesidad de usar reactivos inactivantes, tales como formaldehído, puede inducir alteraciones químicas incontrolables en la inmunogenicidad de proteínas que pueden reducir o eliminar la eficacia de dichas vacunas.

[0007] La porción en N-terminal de PMT (residuos 1 a 506 a.a.) se ha considerado que contiene el supuesto dominio de unión a la célula y el dominio de translocación. La inmunización de rsPMT Tox1 en N-terminal (Residuos 1 a 487 aa) podría producir anticuerpos neutralizantes que podrían impedir la unión de PMT a las células diana y, posteriormente, su translocación a través de la membrana celular. En consecuencia, se bloqueó la actividad de PMT. Además, se ha sugerido que la porción en C-terminal de PMT era el dominio catalítico y los anticuerpos producidos contra los fragmentos en C-terminal (residuos residuos 681-1285 y 849-1285) eran capaces de inhibir el efecto mitogénico de PMT. Se demostró que los residuos 1165 (cisteína), 1205 (histidina) y 1223 (histidina) eran esenciales para la actividad intracelular de PMT (Baldwin MR y col. 2004; 54(1):239-250; y Pullinger GD y col. 2001; Infect. Immun. 69: 7839-7850). Los derivados de rsPMT son fáciles de producir y no son citotóxicos, de modo que no se requiere una inactivación química adicional antes de usar. La patente de EE.UU. nº 6.110.470 divulgó los derivados polipeptídicos de la toxina de P. multocida, que comprende las secuencias de aminoácidos idénticas a PMT pero carece de los aminoácidos 1043-1130 o carece de los aminoácidos 1130-1285.

[0008] Así, en la presente invención se producen tres derivados de la subunidad recombinante de PMT (rsPMT), que representan las porciones en N-terminal (aa. 2-486), del centro (aa. 486-986) y C-terminal (aa. 986-1281) de PMT, y sus inmunogenicidades se caracterizan evaluando el nivel de células secretoras de anticuerpos específicos de PMT, los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero y el grado de proliferación linfocitaria en ratones y cerdos inmunizados. La eficacia de estas subunidades recombinantes como vacuna se evaluó en cerdas preñadas y su descendencia mediante el análisis de los títulos de anticuerpos neutralizantes en el calostro y el suero, y mediante monitorización de la tasa de supervivencia y la ganancia de peso medio en lechones tras la exposición a PMT.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] Un aspecto de la presente invención es proporcionar una vacunas para inmunizar animales contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas, comprendiendo cada uno de ellas un fragmento de toxinas de subunidades recombinantes de Pasteurella multocida (rsPMT), en el que el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 o 986-1281 en la SEC ID Nº 2, respectivamente.

[0010] En una realización, los fragmentos de PMT se fabrican en la célula huésped que se ha transformado con un plásmido que comprende la secuencia codificadora de un fragmento de la toxina de P. multocida 2-486, 486-986 y/o 986-1281. La célula huésped usada en el presente documento puede ser procariota o eucariota.

[0011] En el segundo aspecto, la presente invención proporciona una vacuna multivalente contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas como se ha descrito anteriormente como primer componente y al menos un antígeno o epítopo asociado con otra patología animal. En una realización, la vacuna multivalente se usa para prevenir y/o tratar la rinitis atrófica progresiva (RAP) y la seudorabia (PR).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS

[0012]

La Figura 1 representa las proteínas celulares totales expresadas por diferentes clones de rsPMT E. coli separadas en 10% de SDS-PAGE (A), seguido de análisis de transferencia Western usando el anticuerpo monoclonal anti-PMT (B) o suero inmunológico de cerdo (C). Calle 1, patrones de proteínas (BIO-RAD); calle 2, Tox1 (86 kDa); calle 3, Tox2 (86 kDa); calle 4, Tox7 (55.4 kDa); calle 5, Tox6 (158 kDa); calle 6, PMT (155 kDa); calle 7, pET 32b(+). La localización de cada proteína rsPMT expresada se indica con una flecha y la PMT nativa sintetizada en P. multocida PMD 48 se indica con la punta de flecha.

La Figura 2 representa la citotoxicidad de rsPMT y PMT nativa sobre las células Vero. Las monocapas de las células Vero se trataron con DMEM (A), 140 ng/ml de PMT nativa (B) y 1,5 mg/ml de Tox1 (C), respectivamente a 37 ºC durante 7 días. La morfología celular se visualiza mediante microscopio de contraste de fases (Olympus IX-70). Aumento 100X.

La Figura 3 representa las ASN específicas de PMT de ratones inmunizados presentes en el bazo 14 días después de la vacunación de refuerzo (barras abiertas) y la dosis letal de PMT nativa a la que ha sido expuestos (barras cerradas). En cada punto de tiempo se estudiaron 3 ratones/grupo. #Significativamente (p<0,05) diferente con ratones inmunizados con toxoide tras la vacunación de refuerzo.*Significativamente (p<0,05) diferente con ratones inmunizados con toxoide tras exposición a PMT nativa.

La Figura 4 representa ASC específicas de PMT detectadas en ganglios linfáticos pulmonares (A) y de bazo (B) de lechones tras inmunización de refuerzo (vacunados) y la posterior exposición a PMT (expuestos) o a un refuerzo con un antígeno homólogo (reforzados). Los resultados de cada experimento se analizaron para determinar el efecto del tratamiento usando una distribución t de Student. Los resultados estadísticos se consideraron significativos cuando los valores de p fueron inferiores o iguales a 0,05 (*).

La Figura 5 representa ASC específicas de PMT detectadas en ganglios linfáticos pulmonares (A) y de bazo (B) de lechones tras inmunización de refuerzo (vacunados) y la posterior exposición a PMT (expuestos) o a un refuerzo con un antígeno homólogo (reforzados). El título de SN se expresó como la dilución de punto final de suero que podía inhibir la citotoxicidad de cuatro veces la DMT de la PMT auténtica en células Vero.

La Figura 6 representa las fotografías representativas de las conchas turbinazas de cerdos experimentales en grupos vacunados con vacuna de rsPMT (B), vacuna del toxoide de la RA convencional (C) y no vacunados (D) a las 2 semanas de la exposición a la auténtica PMT.

Los cerdos no vacunados y no expuestos sirvieron como control negativo (A).

La Figura 7 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero específicos de PMT en cerdas preñadas y tras la inmunización de refuerzo (vacunados) de la vacuna bivalente de RAP-RP.

La Figura 8 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero específicos de RP en cerdas preñadas y tras la inmunización de refuerzo de la vacuna bivalente de RAP-RP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0013] A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica de la invención entiende habitualmente.

[0014] La vacuna de acuerdo con la presente invención comprende una combinación de tres fragmentos de toxinas de subunidades recombinantes de Pasteurella multocida (rsPMT), cada uno con una secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 o 986-1281 en la SEC ID Nº 2. Los fragmentos de rsPMT se puede expresar en células procariotas o eucariotas transformadas con un plásmido que comprende la secuencia de codificación de los fragmentos de la toxina de Pasteurella multocida.

[0015] Como se usa en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más elementos.

[0016] Como se usa en el presente documento, la producción mediante la técnica de ADN recombinante usando procedimientos de ADN recombinante significa el uso de procedimientos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por el ADN clonado.

[0017] Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En general, los vectores de expresión están en forma de “plásmido”, que, en general, son bucles de ADN bicatenario circular que no están unidos al cromosoma.

[0018] Como se usa en el presente documento, "residuo de aminoácido” se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos.

[0019] La secuencia de aminoácidos que “corresponde sustancialmente a” significa con homología de secuencia de aproximadamente más o igual a 80%, 85%, 90%, 95% o 99%; el porcentaje preciso se puede especificar si es necesario.

[0020] Ejemplos de adyuvante convencional usado en las presentes formulaciones de vacunas incluyen compuestos de aluminio, también conocidos como gel de aluminio, tal como hidróxido de aluminio, Al(OH)3 y fosfato de aluminio, AlPO4; sulfato de aluminio potasio, KAl(SO4)2·12H2O (D.E.S. Stewart-Tull (1996), Aluminum adjuvants. en Vaccine protocols, Robinson, A., G. H., y C. N. Wiblin, Farrar Human Press. Totoga, New Jersey, USA. pp. 135-139); adyuvante completo de Freund, FCA; adyuvante incompleto de Freund, FIA; emulsión de agua en aceite, A/A; emulsión de aceite en agua, A/A y similares.

[0021] La concanavalina A, Con A, es un inmunoestimulante eficaz con células T de activación. Las respuestas proliferativas de los linfocitos T secretan IL-2 y otras citoquinas para estimular las respuestas inmunitarias asociadas.

Ejemplos

[0022] Otras características de la invención serán evidentes en el curso de las descripciones siguientes de las realizaciones de ejemplo. Estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración de la invención y no se pretende que la invención se limite a ellos.

Ejemplo 1. Construcción de clones derivados de PMT.

[0023] Pasteurella multocida PMD 48 es un aislamiento toxigénico de tipo D obtenido de un cerdo afectado por un caso típico de RAP en Taiwan (Liao CM y col. 2002; Taiwan Vet J 28(4):281-293.). P. multocida PMD 48 se cultivó en caldo de infusión de cerebro corazón (BHI) (Difco) para la preparación de la toxina de Pasteurella multocida auténtica y la extracción de ADN genómico. La cepa BL21 de E. coli (DE3) (Novagen) se cultivó en medio de Luria-Bertain (LB) para la clonación y expresión de proteínas. Las secuencias de codificación de la proteína PMT se clonaron en los vectores de expresión pET basados en el promotor T7 (Novagen). Las enzimas de restricción y la T4 ADN ligasa se obtuvieron del New England Biolabs.

[0024] Se creó un producto génico de PMT de longitud completa mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos de PMT (directo: 5’AGAGGTTATGGATCCGAAAACAAAACATTTT3’; inverso: 5’CTCTTGTTAAGCTA GCCTTTGTGAAAAGAGGAG3’). El producto génico de PMT de longitud completa se purificó y después se digirió con las combinaciones adecuadas de las enzimas de restricción para producir tres regiones de codificación diferentes del gen de PMT. El fragmento de 1459 pb de BamHI/HindIII que codifica los aminoácidos 1487 en N-terminal de PMT se clonó en pET32b para generar el clon Tox 1.

[0025] El fragmento de 1508 pb de HindIII/HindIII que codifica la región central (aa 485 a 987) de PMT se clonó en pET32b para generar el clon Tox 2. El fragmento de 891 pb de HindIII/NheI que codifica la región en C-terminal (aa 986 a 1282) de PMT se clonó en pET25b y después se subclonó el fragmento BamHI/BlpI en pET32b para generar el clon Tox 7 en C-terminal.

[0026] Los plásmidos de expresión recombinante Tox1, Tox2, y Tox7 se transformaron en BL21 de E. coli (DE3) de acuerdo con el manual del fabricante. La expresión de rsPMT se indujo con

[0027] isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; Protech), y la rsPMT se purificó usando los kit His Bind® (Novagen, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el manual del fabricante. La concentración de proteínas se cuantificó usando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (BIO-RAD, Hercules

[0028] CA). Se preparó PMT auténtica a partir de P. multocida PMD 48 cultivada en medio NHI a 37 ºC durante 26 horas como se ha descrito anteriormente Nakai T y col. 1984; Infect Immun 46(2):429-434). La PMT auténtica se destoxificó con 0,2 % (v/v) de formalina (Fisher) a 37 °C con agitación durante 48 h para generar el toxoide de PMT.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de rsPMT

[0029] Las rsPMT se expresaron como proteínas de fusión que contienen un péptido de fusión en N-terminal. Los plásmidos Tox1, Tox2, Tox6 y Tox7 se transformaron en BL21 de E. coli competente (DE3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una única colona de cada transformante se cultivó a 37 ºC en medio Luria-Bertain (LB) que contiene 100 !g/ml de ampicilina hasta alcanzar una DO600 de 1,0. Después se añadió isopropil-ß-Dtiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de Mm. El cultivo se incubó durante 6 horas adicionales a 37 ºC. Las células se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,1% de Triton X-100. Las células se rompieron mediante sonicación y la suspensión se mezcló con un volumen igual de 2x SDS-PAGE tampón de muestra (Tris-HCl 125 mM [pH6,8], 20% de glicerol, 4% de SDS, 10% de ß-mercaptoetanol, 0,25% de azul bromofenol) y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE. Se preparó PMT nativa a partir de P. multocida PMD 48 cultivada en medio BHI a 37 ºC durante 26 horas como se ha descrito anteriormente (21). Después de romper las células, las fracciones insolubles que contienen rsPMT se recogieron mediante centrifugación. Las fracciones insolubles se disolvieron en tampón de solubilización (CAPS 50 mM, 0,3% de N-lauroilsarcosina, 1 mM DTT; Novagen, Darmstadt, Alemania) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la centrifugación, el sobrenadante que contiene la proteína solubilizada se transfirió a un tubo limpio para una purificación adicional de proteína. La rsPMT se purificó usando el kit His Bind® (Novagen, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el manual del fabricante, seguido por replegamiento en 10 volúmenes de PBS a 4ºC durante la noche. Después de concentrar con Amicon® Ultra 30,000 MWCO (Millipore, Bedford, EE.UU.), La concentración de proteínas se cuantificó usando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (BIO-RAD, Hercules, CA).

[0030] Tres proteínas de subunidades recombinantes de PMT que representan las regiones en N-terminal (Tox1; aa 1 a 487), central (Tox2; aa 485 a 987) y C-terminal (Tox7; aa 986 a 1282) de PMT, respectivamente, se produjeron con éxito en E. coli. El peso molecular de Tox1, Tox2 y Tox7 sobre10% de SDS-PAGE fue 86, 86 y 55,4 kDa, respectivamente (Fig. 2). Las eficiencias de expresión de las proteínas rsPMT variaron de 28-35% de la proteína celular total (datos no mostrados). La expresión de rsPMT aumentó considerablemente hasta 60 veces en las

proteínas celulares totales. Estos resultados sugieren que, en comparación con la producción de PMT nativa, se podían obtener cantidades suficientes de proteínas rsPMT para disminuir suficientemente los costes de la preparación de la vacuna.

Ejemplo 3. Ensayo de citotoxicidad de rsPMT en ratones

[0031] Se obtuvieron células de riñón de mono verde africano (Vero, ATCC CCL-81) en Food Industry Research and Development of Taiwan, R.O.C. y se cultivaron en medio DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM, 1,5 g/l de bicarbonato sódico, piruvato sódico 0,1 mM y 5% de suero bovino fetal (FCS, Gibco/BRL). Las células Vero se sembraron en los pocillos de placas de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 5x104 células por pocillo y las placas se incubaron a 3 ºC durante la noche. A las monocapas de células se añadieron diluciones en serie de las proteínas de rsPMT o de PMT nativa y las células se incubaron en DMEM que contienen 2 % de FCS a 37 ºC durante 5-7 días. Los efectos citopáticos consistentes en formación de nódulos en la monocapa se visualizaron mediante microscopio de contraste de fase (Olympus IX-70) y se calculó la dosis mínima tóxica (DMT) para cada rsPMR y la PMT nativa. Todas las rsPMT eran no citotóxicas (Fig. 3), incluso a dosis tan elevadas como 1,5 mg/ml. En contraste con ello, la dosis mínima tóxica (DMT) de la PMT nativa fue de 140 ng/ml, que será al menos 10.000 más tóxica para las células Vero que cualquiera de las demás proteínas rsPMT.

[0032] DL50 en ratones. Cincuenta ratones SPF BALB/c se repartieron en grupos al azar y se inoculó a cada ratón por vía intraperitoneal (i.p.) 0,5 ml de una suspensión que contenía una concentración seleccionada de rsPMT o de PMT nativa a las seis semanas de edad. Se observó a estos ratones durante 14 días tras la inoculación y se registró la mortalidad. La DL50 se determinó mediante el procedimiento del punto final al 50 % de Behrens-Karber (13). Los ratones a los que se inoculó la PMT nativa mostraron una capa de pelo áspero, anorexia y reticencia a moverse. Estoas animales se acurrucaron en las esquinas de las jaulas y murieron en 2-3 días. En la necropsia, las lesiones incluyeron congestión o hiperemia de los órganos y atrofia del bazo. La DL50 de la PMT nativa en ratones BALB/c fue 1,30 !g. En contraste con ello, no se observaron síntomas clínicos significativos, lesiones macroscópicas u otros hallazgos patológicos en ratones que recibieron dosis tan altas como de 1 mg de proteínas rsPMT (Tabla 1).

Tabla 1. Eficiencia de la expresión de PMT nativa y subunidad recombinante, y su dosis letal del 50 % (DL50) en ratones BALB/c

PMT subunidad recombinante PMT nativa Tox1 Tox2 Tox6 Tox7

Proteína recombinante/prot 28,2 ± 5,07 35,8 ± 6,88 4,1 ± 0,41 32,1 ± 6,92 0,6 ± 0,15

eína celular total (%)a DL50

>1000 >1000 ND >1000 1,30

(!g/0,5 ml) b aLa eficacia de la expresión se analizó con un sistema de imagen AlphaImager™ 2200.bLa DL50 se presentó como la concentración de proteína necesaria para matar el 50% de los ratones.

Ejemplo 4. Propiedades inmunoprotectoras de las proteínas rsPMT en ratones ELISPOT de células secretoras de anticuerpos

[0033] Una suspensión de MNC de bazo de ratón se analizó para determinar ASC específicas de MT mediante el ensayo de inmunomancha unido a enzimas (ELISPOT). Placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (Millititer HA, Millipore Corp) se revistieron con rsPMT (100 ng/ml) y se incubaron a 4 ºC durante la noche. La placa se lavó con PBS que contenía 0,05 % Tween-20 (PBS-T) y se bloqueó con PBS que contenía 0,5 % de seroalbúmina bovina. Tras la incubación a 37 ºC. durante 1 hora, la placa se lavó una vez con PBS-T y se incubó con diluciones en serie de una suspensión de MNC. Las células se incubaron a 37 ºC en una atmósfera que contenía CO2 al 5 % durante otras 6 horas más. La placa se lavó una vez con PBS-T, seguido por la reacción con IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina diluida en PBS a 37 ºC durante 1 hora. Por último, la placa se lavó seis veces con PBS-T y se hico reaccionar con una solución de cromógeno/sustrato NBT/BCIP (Sigma) a temperatura ambiente durante de 15 a 20 minutos. Después de aclarar con agua desionizada, las manchas de color presentes en cada pocillo se visualizaron y cuantificaron con estereomicroscopio.

[0034] Los bazos de ratón aumentaron considerablemente de tamaño tras la segunda inmunización. Dos semanas después de la exposición a PMT nativa, los bazos de los ratones inmunizados con Tox1- y Tox2- comenzaron a atrofiarse, pero todos los ratones sobrevivieron. El mayor número de ASC se detectó en los ratones inmunizados con Tox2 que poseían 2993,33 ± 200,33 ASC específicas de PMR en 106 MNC, La cantidad más baja de ASC (1386,67 ± 477,21 en 106 MNC) se detectó en los ratones inmunizados con el toxoide de PMT. Excepto la Tox2-, no se observaron diferencias significativas entre ratones inmunizados con Tox1-, Tox7- y toxoide (p < 0,05). Las ASC de los ratones inmunizados aumentaron significativamente en cada grupo tras la exposición a PMT nativa ((p �< 0,001)

(Fig. 3). Los ratones inmunizados con Tox1 mostraron el mayor incremento en el número de ASC con 10233,33 ± 850,49 en 106 MNC (Fig. 3).

Respuesta celular de ratones inmunizados

La respuesta inmunitaria celular anti-PMT de los ratones se analizó mediante un ensayo de proliferación de linfocitos. Los índices de estimulación media de ratones vacunados con Tox1-, Tox2-, Tox7- y toxoide fueron 2,11 ± 0,27, 3,31 ± 0,95, 2,31 ± 0,26 y 6,02 ± 0,68, respectivamente. Tras la exposición a PMT nativa, sólo las células aisladas de ratones inmunizados con Tox7- y toxoide pudieron estimularse con la PMT nativa in vitro. Los resultados implicaron que los ratones vacunados con las proteínas rsPMT no podían montar una respuesta celular específica contra PMT (IE>2), pero la respuesta pudo inhibirse mediante la exposición a la PMT nativa (Tabla 2).

Tabla 2. Ensayo de proliferación de linfocitos de ratones inmunizados a losa14 días de la vacunación de refuerzo y dosis letal de la exposición a PMT nativa

Grupos

Vacunación de refuerzo (n= 3) Exposición a PMT (n= 3)

Simulado

0,99 ± 0,26 ,66 ± 0,49

Tox1

2,11 ± 0,27 1,06 ± 0,49

Tox2

3,31 ± 0,95 0,96 ± 0,19

Tox7

2,31 ± 0,26 2,8 ± 0,37

Toxoide

6,02 ± 0,68 8,07 ± 4,13

Los datos se expresaron como el índice de estimulación (IE).

[0036] IE= cpm en cultivos estimulados con antígeno/cpm en cultivos no estimulados con antígeno. Un valor de IE superior a 1 se consideró positivo (van Diemen y col., 1994)

Ejemplo 5. Eficacia de la protección de la vacuna de rsPMT en cerdos Respuestas de anticuerpos en lechones inmunizados

[0037] La antigenicidad de los productos de rsPMT se analizó en lechones de 4 semanas de edad analizando el nivel de células secretoras de anticuerpos específicas de PMT y los títulos de anticuerpos neutralizantes tras la inmunización, exposición a PMT o refuerzo con antígeno homólogo. Las células secretoras de anticuerpos en ganglios linfáticos del bazo y pulmonares se cuantificaron mediante el ensayo ELISPOT. Cada mancha de tinción representó una ASC específica de PMT, se cuantificó el total de manchas de color. Sólo se detectaron unas pocas ASC específicas de PMT a los 14 días de la vacunación de refuerzo en cada grupo vacunado. El mayor número de ASC específicas de PMT en el bazo se detectó en lechones inmunizados con Tox7 que tenían 11,5± 0,7 ASC por 106 MNC (véase la Fig. 4B) y el mayor número de ASC específicas de PMT en los ganglios linfáticos se demostró e el grupo de Tox1 (Fig. 4A). Las cantidades de ASC aumentaron ligeramente a las 4 semanas de la exposición a PMT auténtica, pero aumentaron espectacularmente en el grupo de refuerzo con antígeno homólogo. Los lechones inmunizados con Tox1 mostraron el mayor incremento en las ASC con 493,3 ± 138,7 por 106 MNC en ganglios linfáticos pulmonares y los lechones inmunizados con Tox7 poseían el mayor incremento en las ASC con 440±104,4 por 106 MNC en MNC de bazo tras el refuerzo con el antígeno (mostrado en la Fig. 4).

[0038] Además, el título de anticuerpos neutralizantes específicos de PMT se determinó como su capacidad para inhibir los efectos citopáticos inducidos por PMT en células Vero. Tras la vacunación de refuerzo se detectaron niveles moderados del título de anticuerpos neutralizantes (�1:16) en cerdos inmunizados con Tox1 y Tox7, y se detectaron niveles bajos de del título de anticuerpos neutralizantes (1:4) en el grupo de Tox2. Los títulos de anticuerpos neutralizantes aumentaron significativamente tras la exposición de PMT o el refuerzo con el antígeno de rsPMT homólogo, pero no en el grupo vacunado con el toxoide de PMT. Los cerdos inmunizados con Tox1 pudieron generar los niveles de títulos de anticuerpos neutralizantes más elevados en cada punto de ensayo y los cerdos inmunizados con Tox7 fueron los siguientes. No se detectaron anticuerpos neutralizantes en cerdos no vacunados. En resumen, tras la exposición a PMT o el refuerzo con el antígeno homólogo, los títulos de anticuerpos neutralizantes en cerdos inmunizados con la subunidad recombinante de PMT pudieron alcanzar 1:32 a 1:512, pero sólo 1:8 de cerdos inmunizados con el toxoide de PMT (Fig. 5).

Respuesta inmunitaria celular en ratones inmunizados

[0039] La respuesta inmunitaria celular específica a cada subunidad recombinante de PMT se analizó mediante el ensayo de proliferación de linfocitos. La proliferación de linfocitos se midió y presentó como el índice de estimulación (IE). Tras la vacunación de refuerzo se observó proliferación de linfocitos específicos de PMT en los cerdos vacunados con Tox2 and Tox7, como indica un IE superior a 2, mientras que no se detectó respuesta en los ganglios linfáticos pulmonares. Tras la exposición a PMT o el refuerzo con antígeno homólogo, las MNC de bazo de cada grupo inmunizado con rsPMT o toxoide mostraron una potenciación significativa de la proliferación de linfocitos (Tabla 3). A excepción de los cerdos inmunizados con Tox1, las MNC de ganglios linfáticos pulmonares de cada

grupo también mostraron una respuesta de proliferación específica tras el refuerzo con antígeno homólogo.

Tabla 3 Proliferación de linfocitos específicos de PMT en MNC de ganglios linfáticos pulmonares (PLN) y de bazo aislados de lechones inmunizados tras la vacunación de refuerzo, expuestos a PMT y reforzados antígeno homólogo

Grupo (Anfígeno de vacunación)

Vacunación PLN Bazo Expuestos a PMT PLN Bazo Refuerzo con el antígeno homólogo PLN Bazo

Tox1 Tox2 Tox7 Toxoide

1,1 1,2 1,4 1,5 1,0 4,0 3,4 1,8 1,21,91,41,0 5,6 4,9 3,5 6,9 1,8 3,1 4,2 4,0 4,8 5,1 4,6 5,6

Los datos son la media del índice de estimulación (IE) de la proliferación de linfocitos específicos de PMT de tres cerdos en cada punto de tiempo. El IE se calculó como se ha descrito en Materiales y Procedimientos y un IE> 2 representa la proliferación de linfocitos.

Eficacia de la protección de la vacuna con rsPMT en lechones

[0040] Para evaluar la eficacia de la protección de estos rsPMT en lechones neonatos se aplicó para comparación inmunización de las cerdas preñadas con una mezcla de rsPMT con o sin bacterina de P. multocida de tipo A y una vacuna del toxoide de la RAP convencional. Los títulos de anticuerpos neutralizantes en calostro de cerdas se sometieron a ensayo en el parto y los títulos de anticuerpos neutralizantes maternos en el suero de la descendencia se analizaron al día de edad. Las cerdas preñadas vacunadas con rsPMT a las que se administró (grupo A) o no se administró (grupo B) una inyección de bacterina de P. multocida tipo A pudieron montar una respuesta significativa con títulos de anticuerpos neutralizantes altos en el calostro ((�1:80) que se transfirieron con éxito a lechones neonatos (Tabla 4). Las cerdas inmunizadas en el grupo A demostraron una respuesta de anticuerpos más elevada que las del grupo B. Por el contrario, la vacuna del toxoide para RA convencional (Grupo C) indujo un nivel medio de anticuerpos neutralizantes que conducen a títulos de anticuerpos bajos en su descendencia (1:8). Se detectaron únicamente niveles basales del título de anticuerpos neutralizantes (� 1:4) en los animales control (grupo D). Además, diez descendientes de cada grupo, a los 14 días de edad fueron expuestos mediante inyección intramuscular a 200 !g/kg (5 veces la dosis letal) de PMT auténtica. La muerte de los lechones se observó ya a las 24 horas de la inoculación en los grupos C y D, pero no hasta los 4 días después de la inoculación en los grupos A y

B. Los índices de supervivencia de los descendientes de los grupos C y D fueron 0%, pero alcanzaron el 60 % en los grupos A y B a los 28 días de edad (Tabla 4).

Tabla 4. Títulos de anticuerpos neutralizantes de cerdas inmunizadas y su descendencia y el índice de supervivencia tras la exposición a 5 veces la dosis letal (200 !g/kg) de PMT auténtica a los 14 días de edad

Título medio de anticuerpos neutralizantes

Grupo

Composición de la vacuna Cerdas Neonatos Lechones �?ndice supervivenciaa

Calostros

1 día de edad 28 días de edad

rsPMT + bacterina

A

de P. 1:101 1:102 1:2 60%

multocida

B

rsPMT convencionales 1:80 1:79 1:2 60%

Vacuna con toxoide

C

de la RA 1:39 1:8 NDb 0%

D

Sin vacunar 1 :4 1:2 NDb 0%

aEl índice de supervivencia se calculó a los 28 días de edad. bNo determinado, todos los lechones habían muerto a las 24 horas de la exposición a PMT.

[0041] Además, otros veinte descendientes de cada grupo se analizaron según su ganancia de peso. La mitad de los lechones de cada grupo fueron expuestos a 30 !g/kg (dosis subletal) de PMT auténtica mediante inyección intramuscular a los 14 días de edad y la mitad restante se dejó sin tratar. La ganancia media de peso corporal de los

lechones se registró a los 14 días de la inoculación. No se observaron diferencias significativas entre los lechones de tres grupos de vacunación, expuestos o no expuestos, pero se observó una reducción significativa de la ganancia de peso (p<0,05) entre los lechones del grupo control D expuestos a PMT auténtica en comparación con la cohorte sin tratar (Tabla 5). En la exploración macroscópica conchal nasal se observaron niveles bajos de atrofia de la turbinada con puntuaciones que variaron de 0,1 a 0,3 en los lechones de cerdas vacunadas con rsPMT, incluso después de que estos lechones fueran expuestos a PMT auténtica. En contraste con ello, tras la exposición a PMT auténtica, los lechones de las cerdas vacunadas a toxoide de la RA convencional y de cerdas no vacunadas mostraron atrofia turbinaza de leve a grave con puntuaciones medias de 1,4 y3,4, respectivamente (véase la Tablea 5; y la Fig. 6), que fueron significativamente diferentes de los grupos vacunados con rsPMT (p<0,05).

Tabla 5. Ganancia media de peso y puntuación conchal turbinaza de los lechones descendientes tras 2 semanas de exposición a una dosis subletal (30 !g/kg) de PMT auténtica

Grupo de cerdas Composición de la vacuna

Ganancia media de peso de lechones (media ± SD) (kg) No expuestos Expuestos Puntuación media de la atrofia conchal turbinadaa No expuestos No expuestos

A B

rsPMT + bacterina de P. multocida rsPMT convencionales 3,9 ± 0,8 5,0 ± 0,6 3,5 ± 0,4 4,5 ± 1,3 0,1 0,2 0,2 0,3

C

Vacuna con toxoide de la RA 4,4 ± 1,0 3,5 ± 0,9 0,2 1,4#

D

Sin vacunar 5,2 ± 0,3 3,5 ± 0,8* 0,2 3,4#

a Los grados de atrofia conchal turbinaza variaron de 0 (normal) a 4 (atrofia completa)

*

La ganancia media diaria de peso en el grupo control difiere significativamente (prueba t, p < 0,05)

*

La puntuación media de la atrofia conchal turbinaza en el grupo control difiere significativamente (prueba t, p < 0,05)

[0042] No se observaron diferencias significativas en la ganancia de peso entre los subgrupos expuestos a toxinas y no expuestos, pero los lechones de cerdas no vacunadas mostraron un crecimiento pero tras la exposición a PMT que los no expuestos (p<0,05). Además, los lechones de cerdas vacunadas con una mezcla de rsPMT con o sin bacterina de P. multocida de tipo A exhibieron niveles bajos de atrofia conchal turbinaza tras la exposición a PMT auténtica. En contraste con ello, los lechones de cerdas vacunadas con el toxoide de RAP convencional y no vacunadas mostraron una atrofia significativa de la concha turbinada. Estos resultados indicaron que una vacunación eficaz de cerdas durante el embarazo podía proteger a la descendencia contra la RAP.

[0043] en conclusión, la vacunación con fragmentos cortos de proteínas de PMT subunidades recombinantes tuvo como resultado niveles altos de anticuerpos neutralizantes y una respuesta inmunitaria celular específica contra PMT en cerdos. La inmunización de cerdas con la vacuna de PMT subunidades recombinantes durante el embarazo es segura y puede producir niveles de anticuerpos neutralizantes en calostro que podían proteger a su descendencia contra PMT. Estoas proteínas PMT subunidades recombinantes no tóxicas conservan un gran potencial como antígenos adecuados para desarrollar una vacuna de subunidades eficaz contra la RAP.

Ejemplo 6. Preparación de la prueba de inmunogenicidad de la vacuna bivalente (RAP-PR) contra la rinitis atrófica progresiva y la seudorabia

La vacuna para la RAP (que comprenden 2,1 mg de proteínas de subunidades recombinantes de PMT, cada una 0,7 mg, 1 x 109 UFC de P. multocida inactivada de serotipo D) se mezcló con el virus de la seudorabia sin gE inactivado (108 DICT50), y, después, se añadió adyuvante oleoso estéril (de tipo A/Ac/A) o gel de aluminio se añadió a la mezcla para formar una formulación de vacuna bivalente RAP-PP de una dosis de 2 ml y de 4 ml.

Inmunoprotección de la vacuna bivalente de RAP-PR en cerdas preñadas

[0045] Las cerdas preñadas se inmunizaron mediante inyección intramuscular de la formulación de la vacuna bivalente RAP-PR que comprende gel de aluminio o adyuvante oleoso en dosis de 2 ml o 4 ml, respectivamente, y se extrajeron muestras de sangre para la detección de títulos de anticuerpos neutralizantes en suero específicos de PMT y de PR. Como se muestra en las Fig. 7 y 8, los títulos medios de anticuerpos neutralizantes en suero específicos de PMT y de PR observados en cerdas inmunizadas con la vacuna bivalente que contiene gel de aluminio a dosis de 2 ml fueron 88,4- y 90,4-veces respectivamente y de 75,2 y 99,2-veces los observados en las cerdas tratadas con la dosis de 4 ml. De la observación en los animales tratados con la vacuna bivalente que contiene el adyuvante oleoso, los títulos medios de anticuerpos neutralizantes específicos de PMT y de PR detectados fueron 88,8- y 92,8 veces en los grupos tratados con la dosis de 2 ml, respectivamente. El los grupos tratados con la dosis de 4 ml, el título medio de anticuerpos neutralizantes para PMT detectado fue 101,2 veces y el título de anticuerpos neutralizantes para RP fue 110,5 veces.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0046]

5 <110> National Chung-Hsing University

<120> Vacuna para prevenir y tratar la rinitis atrófica progresiva porcina

<130> CP-19850

<160> 13

<170> PatentIn versión 3.2 10 <210> 1

<211> 4380

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<220> 15 <221> CDS

<222> (219)..(4076)

<400> 1

<210> 2

<211> 1285

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo específico de PMT

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> oligonucleótido

<400> 4

<210> 5 20 <211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 5

<210> 6

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 9

<210> 10

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 11

<210> 12

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador random sintético

<400> 13

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una vacuna para inmunizar un animal contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas, cada una de ellas comprendiendo solamente un fragmento de una toxina de Pasteurella multocida (rsPMT), en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 y 986-1281 de SEC ID Nº 2, respectivamente.

2. 2.

   La vacuna de la reivindicación 1, en la que los fragmentos de PMT derivan de toxinas de Pasteurella multocida de subunidad recombinante (rsPMT) de un aislado con serotipo D.

3. 3.

   La vacuna de la reivindicación 1, en la que cada fragmento de rsPMT se produce mediante tecnología de ADN recombinante.

4. 4.

   La vacuna de la reivindicación 3, en la que cada fragmento de rsPMT se expresa en un transformante de E. coli con un plásmido que comprende la secuencia codificante del fragmento 2-486, 486-986 y/o 986-1281 de la toxina de Pasteurella multocida.

5. 5.

   La vacuna de la reivindicación 1, que además comprende al menos un antígeno derivado del toxoide de PMT, de Pasteurella multocida de serotipo A, de Pasteurella multocida de serotipo D o de Bordetella bronchiseptica.

6. 6.

   La vacuna de la reivindicación 1, que además comprende al menos un adyuvante seleccionado de adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, gel de aluminio, adyuvante oleoso (A/Ac/A), emulsión de agua en aceite, A/Ac; emulsión de aceite en agua, Ac/A, Con A, ß-glucosano y una combinación de los mismos.

7. 7.

   Una vacuna multivalente contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de las tres proteínas de la reivindicación 1 como primer componente; y al menos un antígeno o epítopo asociado con otra patología animal.

8. 8.

   La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que comprende el virus de la seudorabia (PR) inactivado con deleción de gE como segundo componente.

9. 9.

   La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que además comprende al menos un antígeno derivado del toxoide de PMT, de Pasteurella multocida de serotipo A, de Pasteurella multocida de serotipo D o de Bordetella bronchiseptica.

10. 10.

    La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que además comprende al menos un adyuvante seleccionado de adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, gel de aluminio, adyuvante oleoso (A/Ac/A), emulsión de agua en aceite, A/Ac; emulsión de aceite en agua, Ac/A, Con A, ß-glucosano y una combinación de los mismos.

11. 11.

    La vacuna multivalente de la reivindicación 7, en la que los fragmentos de PMT derivan de las toxinas de Pasteurella multocida de subunidad recombinant (rsPMT) de un aislado con serotipo D.

12. 12.

    La vacuna multivalente de la reivindicación 8, en la que los fragmentos de PMT y de PR se producen mediante tecnología de ADN recombinante.

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

    Documentos de patentes citados en la descripción

    Literatura diferente de patentes citada en la descripción