ES2370273T3 - Identificación de patógenos. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de identificación de patógenos microbianos, preferiblemente patógenos humanos, en una muestra de fluido corporal, que comprende a) proporcionar una muestra de fluido corporal, b) lisar los patógenos microbianos y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico, preferiblemente la PCR, sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o a partir de la cual los ácidos amplificados se marcan, c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados marcados de la etapa b) con una micromatriz que comprende en zonas definidas en la superficie de la micromatriz sondas multiespecíficas inmovilizadas de ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos, d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados marcados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que se está uniendo específicamente a la micromatriz, y e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos, lo que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas sobre la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos con no correspondencias ponderadas.

Description

Identificación de patógenos
La presente invención se refiere a la identificación de patógenos en infecciones de fluidos corporales
A pesar de los progresos continuados en el diagnóstico y la terapia precoz de las infecciones que se transmiten por la sangre, las tasas de mortalidad siguen siendo elevadas. Los procedimientos tradicionales para la identificación de microorganismos están basados en procedimientos de hemocultivo que requieren el cultivo microbiano con la posterior caracterización morfológica y fisiológica (Peters y col., 2004).
Diferentes científicos y algunos programas de investigación clínica han controlado periódicamente la frecuencia de la incidencia de patógenos humanos. Se ha demostrado que más del 95% de todas las infecciones que se transmiten a través del torrente sanguíneo están producidas únicamente por 15 géneros diferentes. Staphylococcus sp. y Escherichia sp. representan más del 50% de las infecciones. Los estudios de diversidad variaron solo ligeramente entre diferentes países y laboratorios. Aunque las tasas globales de infección por patógenos son estables en el tiempo, especialmente las infecciones por Pseudomonas aeruginosa están claramente en aumento, representando el único patógeno asociado con tasas de mortalidad crecientes (Fluit y col 2001; Kempf y col., 2000; Shigei y col., 1995; Meremikwu y col., 2005; Vincent y col., 2006).
Los primeros procedimientos para la determinación de la cantidad bacteriana en las infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo se basaban en la diseminación de sangre completa en un medio de cultivo sólido, incubación, y posterior evaluación mediante recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC). Los cultivos aislados de pacientes con infecciones estafilocócicas y estreptocócicas contenían hasta 100 UFC por ml de sangre, mientras que se han contado bacterias E. coli en exceso 1000 UFC/ml Se han encontrado cantidades similares de otras bacterias gram negativas (Yagupsky y col., 1990; Henry y col., 1983).
Recientes publicaciones basadas en técnicas moleculares han propuesto que el recuento bacteriano pueda ser mayor que el inicialmente supuesto. Se ha usado la RT-PCR cuantitativa para definir principalmente curvas patrón de cantidades bacterianas en sangre completa para una posterior determinación de cargas bacterianas en muestras clínicas. Se han encontrado densidades en sangre que varían de 104 a 5,4 x 105 bacterias por ml de Streptococcus pneumoniae. Se han detectado otros microorganismos gram positivos o negativos en una extensión de 104 a 107 por ml en pacientes de bacteremia. Hackett incluso ha demostrado una concentración punta en casos graves de septicemia hasta un máximo de 1,8 x 109 bacterias por ml (Hackett y col., 2002; van Haeften y col., 2003; Massi y col., 2005,). Una explicación de la discrepancia entre el cultivo y los procedimientos moleculares es la incapacidad de algunos microorganismos de multiplicarse en condiciones de cultivo normalizadas (Keer y Birch, 2003). Además, los procedimientos basados en la detección del ADN incluyen también el genoma no digerido de bacterias muertas o estáticas (Nogva y col., 2000; Nikkari y col., 2001).
Los sistemas automatizados de hemocultivos tales como BacT/Alert y Bac-TEC9240 son las técnicas de cultivo normalizadas en la práctica clínica moderna. Algunas investigaciones han demostrado que se producen periódicamente resultados falsos negativos debido a condiciones de crecimiento inapropiadas. Se han tratado adicionalmente hemocultivos sin crecimiento microbiano detectable y se han obtenido posteriormente resultados positivos en del 3 al 40% de los casos dependiendo del procedimiento de detección (Shigei y col., 1995; Kocoglu y col., 2005; Karahan y col., 2006). Heininger y col. (1999) han demostrado la ventaja de la detección mediante la PCR del tratamiento con antibióticos anterior en un modelo de rata. La tasa de detección de los hemocultivos clásicos ha caído hasta el 10% en 25 min tras la administración intravenosa de cefotaxima mientras que el índice de detección de la PCR era del 100% en ese momento.
Se llevó a cabo de manera rutinaria el cultivo de levaduras en frascos de cultivo. Los sistemas ofrecidos funcionan a una sensibilidad del 100% cuando se usan para la detección de infecciones de Candida (Horvath y col., 2004).
Los procedimientos diagnósticos convencionales tardan al menos 24 horas debido a su requerimiento de crecimiento microbiano En general la detección e identificación en un proceso muy largo que varía normalmente de 2 a 5 días para la mayor parte de organismos o incluso más para organismos exigentes (Marlowe y col., 2003; Reimer y col., 1997; Henry y col., 1983). En contraste con esto, los procedimientos basados en el ADN cumplen la necesidad de un diagnóstico rápido, fiable y por tanto, protector de la vida (Belgrader y col., 1999; Vincent y Abraham 2006). Sin embargo, estos procedimientos no han sido capaces de adaptarse a las necesidades de la especificidad para el presente campo del hemodiagnóstico.
Rivers y col. (2005) destacaron la importancia del tratamiento temprano en las seis horas desde los primeros síntomas de bacteremia en una unidad de cuidados intensivos (UCI), antes, de esta manera, de la transición desde sepsia a la sepsia grave. Se espera que los ensayos moleculares sustituyan las técnicas microbiológicas convencionales para la
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detección de las enfermedades del torrente sanguíneo. Los procedimientos basados en la amplificación de la PCR y la posterior hibridación de sondas fluorescentes parecen ser los enfoques más prometedores (Peters y col., 2004). Se han adaptado diferentes procedimientos moleculares, que incluyen la utilización de sondas marcadas fluorescentemente, para la detección de patógenos clínicos. La hibridación fluorescente in situ (FISH), la PCR, la PCR en tiempo real el polimorfismo de conformación monocatenaria de la PCR basado en fluorescencia (SSCP), y se han empleado micromatrices de oligonucleótidos para la identificación de microorganismos de pacientes con bacteremia, incluyéndose todavía sin embargo una etapa de enriquecimiento bacteriano basada en cultivo (Kempf V.A.J. y col., (2000); Peters y col., 2006; Mothershed E.A. y Whitney A.M. (2006); Rantakokko-Jalava (2000); Turenne C.Y. y col., (2000); Aoki S. y col., (2003); Martineau F. y col., (2001); Yadaf A.K. y col., (2005); Lehner A. y col., (2005); Shang S., y col., (2005)).
Se ha descrito la tecnología de micromatrices como una poderosa herramienta en diversas aplicaciones clínicas tales como la identificación de patógenos de las infecciones del tracto urinario (ITU), las infecciones agudas del tracto respiratorio superior, los patógenos periodontales y las bacterias intestinales humanas. Las micromatrices se aplican además para el análisis de la expresión génica y la diversidad microbiana (Bryant y col., 2004; Kato-Maeda y col., 2001; Wang y col., 2002; Roth y col., 2004; Yu y col., 2004).
El documento WO2001/07648 A1 describe un procedimiento para la identificación con un procedimiento de amplificación tal como la PCR. Se pueden clasificar los microorganismos por las longitudes del amplificado.
El documento US 2004/0023209 A1 describe una reacción de extensión del cebador para visualizar las secuencias de microorganismos para su identificación. Se puede usar el ARNr de 16S y 18S como sondas.
De acuerdo con el documento DE 197 13 556 A1, se pueden identificar los microorganismos mediante la distribución de oligonucleótidos cortos. Modelos específicos de distribución pueden estar asociados a algunos microorganismos de tipo E. coli, B. subtilis y H. influenzae.
Liu y col. (Experimental Biology and Medicine, 230 (8) (2005): 587-591) describen una micromatriz con sondas específicas de ARNr de 16S para la identificación de microorganismo en el CSF. Las sondas de oligonucleótidos descritas la anterior deben hibridarse solo con una especie bacteriana con la hibridación no específica minimizada.
Keramas y col. (Molecular and cellular Probes, 17 (4) (2003): 187-196) describen una micromatriz de ADN para la identificación de Campylobacter y otras bacterias de referencia tales como Arcobacter, Helicobacter y E. coli. El material de muestra usado en la anterior fue materia fecal de pollo que puede contener sangre en el caso de una infección por Campylobacter.
En resumen, los procedimientos de identificación tradicionales de microorganismos en la vida clínica cotidiana se basan normalmente en el cultivo que necesita tiempo para llevarse a cabo, con la posterior caracterización morfológica y fisiológica. Los procedimientos de hemocultivo son la regla de oro en el diagnóstico de infecciones microbianas transmitidas a través de la sangre. Sin embargo, la identificación precoz de la infección que producen los microbios es el requisito crucial para un rápido y óptimo tratamiento dirigido contra la infección. Sin embargo, desafortunadamente, estos procedimientos diagnósticos duran al menos 24 horas debido a sus requerimientos de enriquecimiento microbiano.
Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un ensayo de patógenos en fluidos corporales rápido, pero sin embargo fiable, especialmente de aquellos patógenos que están relacionados con o conectados (o se propone que están relacionados) con la sepsia humana. Además, se necesita un procedimiento que sea capaz de distinguir – también preferiblemente por un camino rápido – entre especies o tipos de organismos estrechamente relacionados, pero patológica o fisiológicamente diferentes.
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de patógenos microbianos, en particular, patógenos infecciosos, en una muestra de fluido corporal que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una muestra de fluido corporal (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o después de lo cual los ácidos nucleicos amplificados se marcan,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados marcados de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas de la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de patógenos microbianos,
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d) detectar la unión de una o más especies de ácidos nucleicos amplificados marcados a una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que está unido específicamente a la micromatriz, y
e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de patógenos microbianos, que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas sobre la superficie de la micromatriz los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
En las formas de realización particulares, el patógeno microbiano es una infección transmitida a través del torrente sanguíneo, por ejemplo, sepsia, y la muestra de fluido corporal es una muestra de sangre. De esta manera, se proporciona un procedimiento para la identificación de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en una muestra de sangre, que comprende las siguientes etapas.
a) proporcionar una muestra de sangre (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o después de lo cual los ácidos nucleicos amplificados se marcan,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas sobre la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo,
d) detectar la unión de una o más especies de ácidos nucleicos amplificados marcados a una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que está unido específicamente a la micromatriz, y
e) identificar un patógeno microbiano de las infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en la muestra de sangre correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos de las infecciones transmitidas a través de torrente sanguíneo, que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con las sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
En otras formas de realización preferidas, el patógeno es un patógeno de la vaginosis y el fluido vaginal es fluido corporal. De esta manera, se proporciona un patógeno para la identificación de los patógenos microbianos de la vaginosis en una muestra de fluido vaginal que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una muestra de fluido vaginal (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o después de lo cual los ácidos nucleicos amplificados se marcan,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas sobre la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo,
d) detectar la unión de una o más especies de ácidos nucleicos amplificados marcados a una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que está unido específicamente a la micromatriz, y
e) identificar un patógeno microbiano de la vaginosis en la muestra de fluido vaginal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos de la vaginosis, que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con las sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
Con la presente invención, se presenta una solución molecular para la rápida identificación de patógenos infecciosos, en sangre, combinando la amplificación del ácido nucleico con la detección en micromatriz. E chip de ADN de acuerdo con la presente invención comprende sondas de captura de oligonucleótidos para los patógenos relevantes de los
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fluidos corporales humanos, por ejemplo, tal como se proporciona en la sección de ejemplo como microchip industrialmente aplicable completamente desarrollado con 25 patógenos diferentes que incluyen cocos gram positivos, diferentes géneros de la familia de las Enterobacteriaceae, especies de Candida de relevancia clínica y no fermentadoras.
Mediante el uso de la micromatriz de acuerdo con la presente invención, es posible la detección de microorganismos en un plazo corto de tiempo, por ejemplo, en 6 horas lo que permite un rápido diagnóstico de los patógenos de fluidos corporales de pacientes infectados a nivel de género y especie y proporciona importantes conclusiones para los tratamientos de antibióticos. Un diagnóstico rápido de la infección bacteriana acelera el tratamiento y reduce la atención sanitaria. La sensibilidad del procedimiento es elevada y ha demostrado descender hasta 10 bacterias por ml de sangre completa de la especie infecciosa, en el caso de los patógenos infecciosos transmitidos a través del torrente sanguíneo.
Preferiblemente, la reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S se lleva a cabo mediante una reacción de la PCR. Se puede llevar a cabo la reacción de amplificación mediante por ejemplo, PCR Multiplex , sin embargo, de acuerdo con la presente invención la reducción en el número de cebadores para la reacción de amplificación del ácido nucleico ha probado ser ventajosa Por tanto, en el procedimiento de acuerdo con la presente invención la reacción de amplificación de ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S se lleva a cabo preferiblemente con cebadores universales para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S, preferiblemente con no más de ocho (4 directos, 4 inversos) cebadores, de manera más preferida con no más de seis (3 directos, 3 inversos) cebadores, preferiblemente con no más de cuatro (2 directos, 2 inversos) cebadores. Se han identificado los cebadores de acuerdo con las Seq. ID Nos. 1, 2, 4, 5 como siendo específicamente adecuados para el presente procedimiento.
Como muestras de sangre, es de utilidad cualquier muestra de pacientes que sea sospechosa de tener dichos patógenos transmitidos a través del torrente sanguíneo que incluyen las muestras de hemopreparaciones procesadas talas como hemofracciones, hemoderivados o hemoproductos De acuerdo con la presente invención se prefiere específicamente llevar a cabo una etapa de filtración inicial antes de realizar la reacción de amplificación del ácido nucleico, en la que la muestra de fluido corporal, en particular la muestra de sangre, se filtra a través de un filtro que contiene leucocitos presentes en dicha muestra de fluido corporal pero que no contiene patógenos microbianos. Normalmente, los leucocitos tienen un tamaño de exclusión de 11 µm (diámetro) mientras que la mayor parte de los patógenos (bacterianos) que se van a identificar mediante la presente invención tienen un tamaño de 2 µm. De acuerdo con esto, por ejemplo un filtro con un tamaño de exclusión de 5 a 10 µm, preferiblemente de 7 µm, es absolutamente adecuado para esta etapa de filtración.
De lejos, el campo más amplio de aplicación del presente procedimiento es el diagnóstico de una muestra de sangre humana, especialmente en relación con pacientes que tienen sepsia o que están en riesgo de desarrollar sepsia. Sin embargo, el presente procedimiento es adecuado para ensayar una gran serie de muestras, por ejemplo, en el ensayo de personal del hospital o el ensayo veterinario (por ejemplo, de un gran número de animales). Preferiblemente, sin embargo, el ensayo de acuerdo con el presente procedimiento se lleva a cabo en la identificación de patógenos humanos.
Para el marcado de los ácidos nucleicos, especialmente del ADN, durante o después de la amplificación, están disponibles muchos procedimientos para la persona experta en la técnica. Por ejemplo, el marcado de los ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante la extensión del cebador, la transcripción in vitro, el marcado con biotinaestreptavidina, el marcado basado en el fragmento Klenow isotérmico o el marcado directo mediante amplificación del ácido nucleico, preferiblemente por marcado directo mediante la PCR. El procedimiento de marcado más preferido de acuerdo con la presente invención es la extensión del cebador, preferiblemente la extensión del cebador utilizando colorantes fluorescentes, especialmente Cy5, Esta forma de realización preferida mostró la mejor sensibilidad y especificidad.
De acuerdo con una forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos amplificados se aplican directamente a la micromatriz sin una etapa de purificación o lavado tras la reacción de amplificación del ácido nucleico. De manera sorprendente, la no purificación no condujo a efectos adversos durante la unión de los productos a la micromatriz En contraste, debido a la carencia de purificación adicional del ácido nucleico antes de la unión a la micromatriz, se evita la pérdida de productos.
El procedimiento de acuerdo con la presente invención puede comprender en su procedimiento experimental el aislamiento del ADN procedente de la sangre, la PCR multiplex, el marcado mediante fluorescencia (Cy5-dCTP) mediante una etapa de extensión del cebador y una posterior hibridación de la micromatriz.
Preferiblemente, la micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende sondas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifican el ARNr de 16S o 18S, procedente de al menos diez, preferiblemente al menos 15,
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especialmente al menos 20, de los siguientes patógenos microbianos: Escherichia coli (ATCC 35218, EC5, EC17, 81617, 68933, 68307), Enterobacter aerogenes (DSMZ 30053, 12676), Enterobacter cloacae (26385, 79232, 93840, 12720, 74892), Klebsiella pneumoniae (25809, 85813, 26385, 13253), Klebsiella oxytoca (26785, 26384, 73739, 26786, 96633), Citrobacter koseri (DSMZ 4595), Citrobacter freundii (80324, 73489), Staphylococcus aureus (ATCC 6538, ATCC 25923, ATCC 29213, 83799, 82913, 73237, 12998), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990, 73711, 35989, 80320, 13000, 77504, 79510), Enterococcus faecalis (ATCC 29212, EF4, 81239, 83776, 27520), Enterococcus faecium (DSMZ 20477), Streptococcus pneumoniae (DSMZ 25500), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615, 10388), Proteus mirabilis (26786, ATCC 14153, 27761, 97656, 71913), Proteus vulgaris (DSMZ 13387, 80196), Serratia marcescens (DSMZ 30121), Morganella morganii (DSMZ 6675, 12615), Pseudomonas aeruginosa (26178, 12950, 26535, 68961, 74352), Stenotrophomonas maltophilia (DSMZ 50170, 26394, 26396), Acinetobacter baumannii (DSMZ 30007), Acinetobacter lwoffii (DSMZ 2403, 75496), Acinetobacter radioresistens(DSMZ 6976), Acinetobacter johnsonii (DSMZ 6963), Candida albicans (ATCC 10231, 21179, 27184, 96917, 96635), Candida parapsilosis (4344). Estos patógenos son de particular importancia en el caso de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo.
De acuerdo con una forma de realización preferida, la micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende al menos una cepa de al menos 10 especies diferentes, preferiblemente de al menos 15 especies diferentes, especialmente de al menos 20 especies diferentes, de las siguientes especies: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseri, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter johnsonii, Candida albicans, Candida parapsilosis.
Una forma de realización preferida de la micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende sondas inmovilizadas que son multiespecíficas. Por “multiespecífica” de acuerdo con la presente invención se entiende una especificidad en la unión con uno de los patógenos microbianos posiblemente presentes en una muestra de fluido corporal. Esto significa que se puede obtener una unión específica de una única sonda para los ácidos nucleicos amplificados de más de un patógeno. Sin embargo, la identificación de un ácido nucleico que es especifico para más de un tipo de Proteus (por ejemplo, mirabilis o vulgaris) o para más de un tipo de Acinetobacter (por ejemplo, baumannii, lwoffii, radioresistens, o johnsonii) no se contempla como “multiespecífica” de acuerdo con la presente invención, solo, por ejemplo, una sonda que reconoce específicamente Serratia marcescens y Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa y Stenotrophomonas maltophilia, o Escherichia coli, Proteus mirabilis y Serratia marcescens (cada una además posiblemente con diferentes intensidades) se contemplara como “multiespecífica” de acuerdo con la presente invención.
La micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente las sondas en forma de manchas sobre la superficie, preferiblemente en cada una de las manchas solo está presente una especie de sonda. Las sondas de la presente invención son moléculas de ácido nucleico, especialmente moléculas de ADN que se unen a los ácidos nucleicos amplificados de acuerdo con la presente invención, es decir, específicos del ADN microbiano patógeno que codifica el ARNr de 16S o 18S. Preferiblemente la sonda se une a la porción del ácido nucleico amplificado que se localiza entre las secuencias del cebador de la reacción de amplificación, amplificando por tanto solo la porción amplificada del producto de la amplificación y no las secuencias del cebador. Con esta forma de realización, se puede excluir el riesgo de detectar señales falsas positivas debidas a la unión del cebador de la sonda.
Preferiblemente, la micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende al menos 10 preferiblemente al menos 20, de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 40 sondas inmovilizadas multiespecíficas. De acuerdo con una forma de realización específica de la presente invención, la micromatriz comprende preferiblemente una porción de al menos un 20% de sondas multiespecíficas, preferiblemente a menos un 40% de sondas multiespecíficas, especialmente al menos un 50% de sondas multiespecíficas, del número total de sondas inmovilizadas en la micromatriz.
Una micromatriz preferida de acuerdo con la presente invención comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, de manera más preferida al menos 20, incluso de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 50, de las sondas de acuerdo con las Seq. ID Nos 6 a 80. Preferiblemente, las sondas se seleccionan para representar al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, de manera más preferida al menos un 95%, especialmente al menos un 98%, de los patógenos microbianos, especialmente bacterianos, relacionados con o sospechosos de estar relacionados con (por las autoridades médicas reconocidas) sepsia en el microchip.
La correlación de la etapa e) se lleva a cabo usando la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz. Se puede llevar a cabo esta correlación mediante análisis informatizado. Por ejemplo, llevar a cabo la correlación de la etapa e) mediante el uso de modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas ha demostrado dar excelentes resultados para el
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ensayo de acuerdo con la presente invención Se ha desarrollado un prototipo de software que proporciona una evaluación estadística rutinaria, lo que permite corregir la identificación en el 100% de los casos en el género y en el 96% en la especie. Se puede implementar este software de autoaprendizaje (tal como se describe en la sección de ejemplos de la presente solicitud) en una plataforma de análisis completamente automatizada que se puede suministrar con la micromatriz de identificación de patógenos.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende una micromatriz, tal como se ha definido anteriormente y a un producto de programa informático para identificar un patógeno microbiano correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados o marcados con zonas de finidas de sondas multiespecíficas unidas para el ADN que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos en la micromatriz que usa la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados o marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas e la superficie de la micromatriz usando modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas. Una micromatriz (conocida comúnmente como chip de genes, chis de ADN, o biochip) es una colección de manchas de ADN microscópicas unidas a una superficie sólida, tal como un chip de vidrio, plástico
o silicio que forma una matriz para el objetivo del perfil de la expresión, vigilando los niveles de un gran número de ácidos nucleicos amplificados simultáneamente. Se pueden fabricar las micromatrices usando una variedad de tecnologías, que incluyen el grabado con clavijas de punta fina sobre portas de vidrio, fotolitografía usando máscaras prefabricadas, fotolitografía usando dispositivos de microespejos dinámicos, impresión de chorro de tinta, o electroquímica en matrices de microelectrodos. Una micromatriz comprende un gran número de moléculas de oligonucleótidos inmovilizados proporcionadas en elevada densidad sobre el soporte sólido Una micromatriz es una herramienta muy eficaz con el fin de detectar docenas, cientos o incluso miles de diferentes productos de amplificación de acuerdo con la presente invención en una única etapa de detección. Dichas micromatrices se proporcionan a menudo como portas o placas en placas de microvaloración particulares En el estado de la técnica, una micromatriz se define tanto como una disposición miniaturizada de los sitios de unión (es decir, un material, el soporte) o como soporte que comprende sitios de unión miniaturizados (es decir, la matriz). Se pueden aplicar ambas definiciones para la forma de realización de la presente invención. Para la primera de estas definiciones, la forma de realización preferida de la presente invención es una disposición miniaturizada de los oligonucleótidos de la presente invención en una micromatriz. Las moléculas de oligonucleótidos están preferiblemente inmovilizadas sobre la micromatriz con la ayuda de un dispositivo de impresión que asegura la inmovilización en elevada densidad sobre el soporte sólido. Esta micromatriz es particularmente útil cuando se analiza un gran número de muestras. La micromatriz de acuerdo con la presente invención es normalmente una superficie plana con las sondas inmovilizadas en modelos regulares sobre esta superficie en posiciones definidas.
De acuerdo con una forma de realización alternativa, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de patógenos microbianos en una muestra de fluido corporal que comprende las siguientes etapas.
a) proporcionar una muestra de fluido corporal (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas en la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos,
d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado que está unido específicamente a la micromatriz mediante un dispositivo de la micromatriz que detecta el episodio de unión de un ácido nucleico amplificado con una sonda inmovilizada, y
e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos, usando la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas sobre la superficie de la micromatriz mediante el uso de los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
De acuerdo con este procedimiento alternativo específico de acuerdo con la presente invención, no es necesario el marcado de los ácidos nucleicos amplificados, el episodio de unión se detecta mediante una señal de hibridación en la sonda específica de la micromatriz. Esta se puede disponer en la micromatriz de acuerdo con las técnicas convencionales disponibles en el campo de tal manera que se puede analizar cada sonda o mancha de la sonda si ha tenido lugar una señal de unión específica (hibridación) (o no). En esta forma de realización específica la micromatriz de acuerdo con la presente invención comprende medios o dispositivos adicionales para detectar una señal de unión específica con una sonda o una zona dada en la superficie de la micromatriz. Estos dispositivos incluyen interfaces con ordenadores que visualizan los episodios de unión en, por ejemplo, representaciones gráficas, de tal manera que los
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episodios de unión sobre el chip (micromatriz) se pueden correlacionar eficazmente para proporcionar un resultado analítico razonable en la etapa e) de acuerdo con la presente invención. En particular, en el caso de las infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo, se proporciona un procedimiento para la identificación de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en una muestra de sangre que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una muestra de sangre (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas en la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo,
d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado que está unido específicamente a la micromatriz mediante un dispositivo de la micromatriz que detecta el episodio de unión de un ácido nucleico amplificado con una sonda inmovilizada, y
e) identificar un patógeno microbiano de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en la muestra de sangre correlacionando la unión de los ácidos nucleicos amplificados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo, usando la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz mediante el uso de los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de la presente invención para la identificación de patógenos microbianos de la vaginosis (denominada también como vaginitis) en una muestra de fluido vaginal que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una muestra de fluido vaginal (que se sospecha que contiene dichos patógenos microbianos),
b) lisar los patógenos microbianos (si están presentes) y llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico en el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S,
c) poner en contacto los ácidos nucleicos de la etapa b) con una micromatriz que comprende, en zonas definidas en la superficie de la micromatriz, sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de la vaginosis,
d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado que está unido específicamente a la micromatriz mediante un dispositivo de la micromatriz que detecta el episodio de la unión de un ácido nucleico amplificado con una sonda inmovilizada, y
e) identificar un patógeno microbiano de las infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en la muestra de sangre, correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos de la vaginosis, usando la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz mediante el uso de los modelos de hibridación previstos con las no correspondencias ponderadas.
Preferiblemente, el patógeno de la vaginosis que se va a identificar se selecciona entre Gardnerella vaginalis, Atopobium, Mobiluncus y Bacteroides. En particular, las sondas inmovilizadas se seleccionan entre las SEQ ID NO 81 a 138 de la tabla 4 a continuación.
Una vagina normalmente sana contiene muchos microorganismos, algunos de los habituales son Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii. Lactobacillus, particularmente las especies productoras de peróxido de hidrógeno, parecen a ayudar a evitar que otros microorganismos vaginales se multipliquen hasta un nivel en el que puedan producir síntomas. Los microorganismos implicados en la vaginosis bacteriana son muy diversos, pero van siempre acompañados por una especie marcadora, Gardnerella vaginalis, Atopobium, Mobiluncus y Bacteroides. Un cambio en la flora bacteriana normal que incluya la reducción de Lactobacillus, que puede ser debida al uso de antibióticos o a un desequilibrio del pH, permite a las bacterias más resistentes ganar un punto de apoyo y multiplicarse. A la vez, esto produce toxinas, lo que afecta a la defensa natural del cuerpo y vuelve más difícil la recolonización por las bacterias
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sanas.
Se puede detectar la presencia de especies marcadoras de la vaginosis entre otros patógenos humanos usando una micromatriz de ADN que consta de especies específicas así como de sondas multiespecíficas que conducen a un modelo de señal característico posterior a la hibridación. La evaluación del modelo de señal de la hibridación basado en el procedimiento estadístico descrito permite una clara discriminación de las especies infecciosas así como de las especies marcadoras, La creación de una base de datos constituida por intensidades de la señal normalizadas al cuantil y se realizó el análisis estadístico de hibridaciones individuales tal como se ha descrito en el presente documento (Sha y col. (2005) J. Clin. Microbiol., 43, 4607-4612, Donders y col. (1998) N. Engl. J. Med., 338, 1548, Donders (1999) Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 83, 1-4, Donders (1999) Infect. Dis. Obstet. Gynecol., 7, 126127).
De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención se refiere a un kit de ensayo que comprende una muestra que contiene los medios de una muestra de sangre, una micromatriz de acuerdo con la presente invención y opcionalmente, cebadores para llevar a cabo la reacción de amplificación de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el kit de ensayo de acuerdo con la presente invención puede contener cebadores que son específicos para la amplificación del ADN microbiano que codifica el ARN de 16S y 18S de los patógenos que se han definido anteriormente.
De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención se refiere también al uso de una micromatriz de acuerdo con la presente invención o a un kit de ensayo de acuerdo con la presente invención, para la identificación de patógenos microbianos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en una muestra de sangre, especialmente para vigilar la sangre de un paciente con sepsia o de un paciente que está en riesgo de desarrollar sepsia.
En una forma de realización preferida de todos los aspectos de la presente invención, que incluye el uso de la micromatriz del procedimiento inventivo, se lleva a cabo la amplificación, por ejemplo, mediante la PCR, y/o el marcado, por ejemplo, mediante la extensión del cebador, con una polimerasa seleccionada entre polimerasas de especies de Thermus (por ejemplo, Thermus aquaticus, Thermus flavus or Thermus thermophilus), por ejemplo, polimerasa Taq I, en particular, ADN Polimerasa GoTaq® or FirePol®. Se consiguieron resultados excepcionales particulares con las dos polimerasas optimizadas. FirePol es una polimerasa termoestable y es similar a la ADN polimerasa Taq I (con una homología del 98%) con actividad exonucleasa 3’ a 5’. Preferiblemente, la polimerasa tiene una resistencia creciente a la temperatura en comparación con la polimerasa Taq I, preferiblemente de al menos 1˚C, 2˚C, 3˚C, 4˚C, 5˚C o más, y/o tiene actividad exonucleasa 3’ a 5’ y/o carece de actividad exonucleasa 5’ a 3’. Se describen, por ejemplo, polimerasas específicas en el documento EP 0745676 A1 o en el documento US 5079352. La reacción se lleva a cabo preferiblemente de manera adicional a un pH entre 7 y 9, de manera particularmente preferida por encima de 8, lo más preferido a aproximadamente 8,5, por ejemplo 8,2 a 8,7. Puede estar presente Mg, por ejemplo, en forma de MgCl2 para la reacción de polimerización, por ejemplo, en una concentración de entre 0,5 mM a 5 mM, preferiblemente entre 1 mM y 3 mM, lo más preferido aproximadamente 1,5 mM.
Se da a conocer también un procedimiento para la identificación de patógenos que comprende
a) proporcionar una matriz de datos de la señal de episodios de unión detectados del material nucleótido del patógeno con las sondas específicas de un patógeno.
b) normalizar la matriz al cuantil,
c) clasificación de los datos de la señal mediante el procedimiento de los k vecinos más cercanos (KNN).
Usando el algoritmo KNN, los datos de la señal se clasifican por un voto mayoritario de sus vecinos, asignándose la señal al tipo más común entre sus k vecinos más cercanos tal como se describe en Ripley (1996) "Pattern Recognition and Neural Networks", Cambridge and Venables y col. (2002), "Modern Applied Statistic with S.", 4ª Ed., Springer; Se llevó a cabo la Normalización al Cuantil de acuerdo con Bolstad y col., Bioinformatics 19(2) (2003), 185-193. Preferiblemente k es 1, la señal se asigna simplemente al tipo de su vecino más cercano.
En particular, la matriz comprende los datos de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, o 20 patógenos. Preferiblemente, para cada patógeno que se va a detectar se usa al menos 1 sonda para generar una señal. Sin embargo, se pueden usar también más sondas diferentes para cada patógeno, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 o más. En otras palabras, están presentes en la matriz al menos dos episodios de la unión de los datos de la señal En particular, si se usan más sondas, se usa para el procedimiento la mediana de los datos de la señal de las sondas detectadas para cada patógeno, en particular para la etapa de clasificación. Preferiblemente, el clasificador se valida en la etapa d) mediante un procedimiento de validación cruzada, en particular mediante el procedimiento de dejar uno fuera. La validación cruzada es la práctica estadística de repartir la matriz de datos en subconjuntos de tal manera que
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el análisis se lleve a cabo inicialmente en un único subconjunto, mientras que otro(s) subconjunto(s) se retengan para uso posterior en la confirmación y validación del análisis inicial. El subconjunto inicial de la matriz se denomina conjunto de formación y otros subconjuntos se denominan conjuntos de validación o ensayo. El procedimiento de dejar uno fuera implica usar unos únicos datos de la señal procedentes de la matriz como datos de validación, y las señales restantes como datos de formación. Esto se repitió de tal manera que cada dato de la señal en la muestra se usó una vez como los datos de validación.
Preferiblemente, el material nucleótido del patógeno es ADN o ARN, en particular, ARNr de 16S o ARNr de 18S.
Preferiblemente, los episodios de unión incluyen los datos de sondas multiespecíficas que se unen con dos o más patógenos, preferiblemente, patógenos de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo o patógenos del fluido vaginal.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplo sin quedar restringida a los mismos.
La Fig. 1 muestra un árbol filogenético basado en el análisis de la secuencia del ARNr de 16S y 18S de, en la micromatriz desarrollada recientemente representada, microorganismos calculados por el procedimiento de unión de vecinos.
La Fig. 2 muestra el comportamiento de la hibridación de la matriz de predicción de las sondas de la micromatriz diseñadas (representadas gráficamente de manera horizontal. Los intervalos de no correspondencias están codificados por colores. El archivo inicial comprendió aproximadamente 19.000 especies La Fig. 2B muestra la leyenda de la Fig. 2: Clave de color de las no correspondencias ponderadas,
La Fig. 3 muestra intensidades de la señal normalizadas de todos los experimentos de hibridación relacionados por sonda y especies. Los valores brutos de la señal se normalizaron en primer lugar usando la normalización al cuantil, y a continuación se promediaron a través de réplicas de las manchas y de réplicas de la hibridación (valores reales que se dividieron por 1000 para una mejor visualización). Las señales de hibridación de fondo corregidas de 5001 – 10000, 10001 – 20000, y > 20001, se indican en amarillo, naranja y rojo, respectivamente. Los valores normalizado inferiores a 5000 no están coordinados por color. Para los valores absolutos del cálculo se usaron sin definir umbrales que condujeron a la indicación de señales bajas incluso cuando las señales se marcaron de forma negativa mediante el software GenePix. Las especies se relacionaron de acuerdo con la relación filogenética de las secuencias de ARNr de 16S y 18S. Las sondas se clasificaron mediante la especificidad de las especies. En la tabla 3 se relacionan las abreviaturas de los nombres de las sondas,
La Fig. 4, muestra los productos de la PCR de las diluciones en serie de cultivos celulares bacterianos resueltos en gel de agarosa al 1,5%, Se pueden detectar bandas a partir de un recuento inicial de 103 bacterias por ensayo,
La Fig. 5 muestra los gráficos de la etapa de dilución más baja en la que podría detectarse una señal positiva en la micromatriz. Se prepararon las diluciones en serie a partir de cultivos puros de E.coli (Fig. 5A) y Staphylococcus aureus (Fig. 5B). E. coli muestra un límite de detección muy bajo de 10 bacterias por ensayo con respecto a Staphylococcus aureus con 103 bacterias por ensayo, las barras rojas, azules y amarillas representan las señales específicas y no específicas así como los controles positivos (BSrev en el control de la hibridación y pr_FW y pr_FW T7 son los controles de la amplificación mediante la PCR): La diana marcada derivó del producto de la PCR que se muestra en la fig. 4,
La Fig. 6 muestra una comparación de diferentes identificaciones de patógenos en paralelo. Se extrajo el mapa térmico tras la agrupación jerárquica. Se comparó cada combinación diana con los resultados de la hibridación de cultivos individuales en condiciones de experimentación iguales. Las filas corresponden a las sondas y las columnas corresponden a las hibridaciones. Los colores corresponden a los valores de la señal. De esta manera, el azul muestra un elevado valor de la señal y el rojo no tiene valor de la señal,
La Fig. 7 muestra las señales de la hibridación de E. coli aislada de sangre completa. A pesar del gran fondo de ADN en sangre no se observó interferencia (las señales no específicas se mostrarían en azul). Las señales específicas se muestran como rojo y los controles positivos como barras amarillas,
La Fig. 8 muestra el aislamiento del ADN bacteriano procedente de sangre infectada con E. coli y Proteus mirabilis, simulando una infección multimicrobiana. En la tabla 3 se relacionan las abreviaturas de los nombres de las sondas. Las barras rojas, azules y amarillas representan las señales específicas y no específicas así como los controles positivos,
La Fig. 9 muestra los efectos de la normalización al cuantil.
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La Fig. 10 muestra los resultados de todos los experimentos de hibridación como un mapa térmico tras la agrupación jerárquica. Las columnas corresponden a las sondas y las filas corresponden a las hibridaciones. Los colores corresponden a los valores de la señal. Se proporcionó siempre el coeficiente de variación de los diferentes ensayos junto con la tabla de valores de la señal normalizados. Un resultado de la hibridación con las E. coli dianas se agrupó aislado de los otros debido a la señal falsa negativa de la sonda eco2. Sin embargo, durante los procedimientos de identificación se evitó esto mediante la transformación de la jerarquización y el procedimiento de los k vecinos más cercanos que proporcionan adicionalmente el resultado correcto. Las filas muestran las hibridaciones que se pueden asignar a los microorganismos detectados (desde la parte superior a la inferior): Escherichia coli (35 veces), Citrobacter koseri (8 veces), Candida albicans (8 veces), Candida parapsilosis (4 veces), Candida albicans (2 veces), Escherichia coli (1 vez), Stenotrophomona maltophilia (7 veces), Pseudomonas aeruginosa (11 veces), Staphylococcus aureus (20 veces), Staphylococcus epidermis (12 veces), Streptococcus pyogenes (10 veces), Streptococcus pneumoniae (5 veces), Klebsiella oxytoca (10 veces), Enterobacter cloacae (11 veces), Klebsiella pneumoniae (4 veces), Enterobacter aerogenes (11 veces), Klebsiella pneumoniae (8 veces), Morganella morganii (6 veces), Citrobacter freundii (9 veces), Serratia marcescens (5 veces), Klebsiella pneumoniae (2 veces), Proteus mirabilis (9 veces), Proteus vulgaris (4 veces), Proteus mirabilis (4 veces), Proteus vulgaris (1 vez), Proteus mirabilis (2 veces), Proteus vulgaris (1 vez), Proteus mirabilis (1 vez), Enterococcus faecalis (12 veces), Enterococcus faecium (3 veces), Acinetobacter lwoffi (3 veces), Acinetobacter johnsonii (3 veces), Acinetobacter lwoffi (1 vez), Acinetobacter baumannii (3 veces), Acinetobacter radioresistens (4 veces), Acinetobacter baumannii (1 vez).
Ejemplos:
Ejemplo 1: Muestras – Cepas de referencia
Todas las cepas de referencia ensayadas en este estudio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC)
o de la "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur" (DSMZ). Además de la especificidad y de la sensibilidad de las sondas de las cepas de referencia se ensayaron también con aislados clínicos que se habían identificado mediante procedimientos clásicos de microbiología. Para el almacenamiento a largo plazo, todas las cepas bacterianas se mantuvieron como depósitos madre de glicerol al 50% a -80ºC. Para la mayor parte de los experimentos se usaron cultivos puros de los experimentos de un cierto número de bacterias por ml que se obtuvieron cultivando los microbios respectivos en caldo Caso durante la noche a 37ºC y ajustando finalmente la concentración de microbios por ml usando un patrón Mc Farland nº 0,5. Se llevó a cabo el ensayo de la micromatriz en Escherichia coli (ATCC 35218, EC5, EC17, 81617, 68933, 68307), Enterobacter aerogenes (DSMZ 30053, 12676), Enterobacter cloacae (26385, 79232, 93840, 12720, 74892), Klebsiella pneumoniae (25809, 85813, 26385, 13253), Klebsiella oxytoca (26785, 26384, 73739, 26786, 96633), Citrobacter koseri (DSMZ 4595), Citrobacter freundii (80324, 73489), Staphylococcus aureus (ATCC 6538, ATCC 25923, ATCC 29213, 83799, 82913, 73237, 12998), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990, 73711, 35989, 80320, 13000, 77504, 79510), Enterococcus faecalis (ATCC 29212, EF4, 81239, 83776, 27520), Enterococcus faecium (DSMZ 20477), Streptococcus pneumoniae (DSMZ 25500), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615, 10388), Proteus mirabilis (26786, ATCC 14153, 27761, 97656, 71913), Proteus vulgaris (DSMZ 13387, 80196), Serratia marcescens (DSMZ 30121), Morganella morganii (DSMZ 6675, 12615), Pseudomonas aeruginosa (26178, 12950, 26535, 68961, 74352), Stenotrophomonas maltophilia (DSMZ 50170, 26394, 26396), Acinetobacter baumannii (DSMZ 30007), Acinetobacter lwoffii (DSMZ 2403, 75496), Acinetobacter radioresistens (DSMZ 6976), Acinetobacter johnsonii (DSMZ 6963), Candida albicans (ATCC 10231, 21179, 27184, 96917, 96635), Candida parapsilosis (4344).
Ejemplo 2: Diseño de la sonda de oligonucleótidos
Se llevaron a cabo el diseño y el análisis de la sonda con el paquete informático ARB (Ludwig y col., 2004). Secuencias de ADN ribosómico (ADNr) seleccionadas de bacterias y levaduras patógenas se descargaron del GenBank de la página de inicio del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) y se cargó el paquete informático ARB para crear una base de datos que comprende en torno a 27.000 secuencias de ADNr de 16S, pero también en torno a 7.000 secuencias de ADNr de 18S para detectar posibles no correspondencias con secuencias eucariotas.
Después que se han alineado las nuevas secuencias con las bases de datos preexistentes, se calculó un árbol filogenético usando el procedimiento de unión de vecinos (véase la Fig.1).
Se diseñaron las sondas para las especies y los géneros seleccionados basándose en los resultados del software ARB mediante el uso de la función Diseño de la Sonda que incluye configuraciones de parámetros alterables tales como la longitud de la sonda (20 bases), hitos máximos sin grupo, contenido de G+C, temperatura de fusión y horquillas mínimas.
Se ensayaron las secuencias de la sonda para la formación del dúplex y la horquilla y la temperatura de fusión con el software “Oligo”, En sus temperaturas de fusión en un primer momento se variaron las secuencias no correspondientes eliminando o añadiendo bases.
Se comprobaron las secuencias finales de la sonda con la función de Correspondencia de la Sonda en ARB Cada tabla
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de hibridación generada con secuencias de organismos correspondientes a cualquier sonda única sirvieron como entrada para CalcOligo (www.calcoligo.org), un software para ponderar el cálculo de la correspondencia. Se ponderaron las no correspondencias de acuerdo con las fórmulas determinadas experimentalmente (véanse la tabla 1 y la tabla 2).
Tabla 1: Ponderaciones de las no correspondencias relacionadas con su posición en la secuencia. Una única no correspondencia en la primera posición se pondera con 0,3 mientras que no correspondencias en posiciones centrales se ponderan más con 1,2. Posición 5’→3’
1 2 3 4N3 2 1
0,3 0,6 1,0 1,2 1,2 1,1 0,8 0,3
Tabla 2. Ponderaciones de las no correspondencias debidas al tipo de bases no correspondientes. Una no correspondencia de adenina en la sonda con citosina de la secuencia diana es una no correspondencia con 0,4, mientras que una no correspondencia de la misma sonda con una guanina en la secuencia diana se pondera con 1,2.
Sonda
Diana Sonda Diana Sonda Diana Sonda Diana
A
-A 1,0 G -A 1,0 C -A 0,7 T -C 1,0
-C 0,4
-G 1,0 -C 1,0 -G 1,0
-G 1,2
-T 1,0 -T 1,0 -T 1,0
Se añadieron no correspondencias únicas de cada sonda para dar como resultado un valor ponderado total de cada especie. Se dispusieron los valores para generar una matriz de hibridación, tabulada secuencialmente en una hoja de cálculo (véase la Fig. 2 para el resultado final de esta matriz de hibridación).
Debido a la relevancia clínica de Candida sp., también se consideró para la detección, excepcionalmente con su secuencia de ARNr de 18S. El árbol (véase la Fig. 1) muestra además una clara diferenciación de los cocos sp gram positivos y de las bacterias gram negativas. Los miembros de la familia de las Enterobacteriaceae forman un grupo aislado en la parte superior del árbol, indicando poca relación con el resto de especies y fuertes similitudes internas de la secuencia. En este grupo, las especies individuales están estrechamente relacionadas entre sí, haciendo relativamente difícil la identificación adecuada de las bacterias que pertenecen a este grupo.
Secuencias de la sonda
Se diseñaron sondas de las especies seleccionadas basándose en algunas secuencias individuales, seleccionadas en la base de datos ARB. Se diseñaron en conjunto 96 sondas de ADN diferentes usando el paquete informático arb. Se descargaron sondas adicionales del sitio web probeBase (www.microbial-ecology.net/probebase/) (Loy A. y col., 2003). En las tablas 3 y 4 se relacionan las sondas de ADNr usadas en este estudio.
Tabla 3: Lista de sondas usadas en este estudio de los patógenos transmitidos a través del torrente sanguíneo que incluye sus secuencias de nucleótidos y algunas características. Abreviaturas: Ab: Acinetobacter, Cb: Citrobacter, Eb: Enterobacter, Ec: Enterococcus, E: Escherichia, K: Klebsiella, M: Morganella, P: Proteus, Pm: Pseudomonas, Sr: Serratia, Sm: Stenotrophomonas, Str: Streptococcus, Sta: Staphylococcus, C: Candida
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
Ab. baumannii
aba1 64 19 60,3 63 6
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(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
aba2
453 36 59,1 36 7
aba4
1132 29 60,8 41 8
Ab. johnsonii
ajo2 620 28 60,1 39 9
ajo3
979 31 58,8 39 10
ajo4
1114 26 60 42 11
Ab. lwoffii
alw1 133 25 60,4 52 12
alw2
577 23 61 52 13
alw3
637 25 59,9 52 14
Ab. radioresistens
ara1 78 23 59,1 52 15
ara2
450 34 60,3 38 16
ara3
1115 24 59,8 46 17
Cb. freundii
cif1 62 19 58,2 63 18
cif2
442 20 61,1 65 19
cif3
472 23 60,7 52 20
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
Cb. koseri
cik1 469 22 59,9 55 21
cik2
639 22 60 55 22
Eb. cloacae
ecl4 471 21 60,6 57 23
ecl6
643 21 60 57 24
ecl7
652 22 60 55 25
Eb. aerogenes
ena2 444 27 60,2 44 26
ena3
453 28 60,4 43 27
ena4
473 22 60,8 55 28
K. pneumoniae
kpn1 61 20 60,7 65 29
kpn2
203 18 58,9 67 30
K. oxytoca
klol 81 19 60,5 63 31
klo2
633 21 60 57 32
E. coli
eco2 448 40 61,9 40 33
eco3
994 39 65,6 49 34
M. morganii
mom2 121 22 60,9 59 35
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
mom3
440 21 59,7 57 36
mom4
581 23 59,4 52 37
P. mirabilis
pmi3 247 24 59,8 54 38
pmi4
444 27 60 48 39
pmi5
625 25 60,4 48 40
pmi6
820 27 59,3 44 41
P. vulgaris
pvu2 179 22 60,3 55 42
pvu4
1010 26 61,9 50 43
Pm. aerogenes
psa4 585 26 59,9 42 44
psa5
1136 21 61,7 62 45
psa6
1245 20 61 65 46
Sr. marcescens
sem1 62 19 60,4 68 47
sem2
439 20 60,7 65 48
sem3
460 30 59,8 40 49
Sm. maltophilia
sma1 713 23 63,7 57 50
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
sma3
1265 20 61 60 51
Str. pneumoniae
spn1 56 24 60,7 54 52
spn3
201 25 60,9 52 53
spn5
634 30 60,1 37 54
Str. pyogenes
spy1 175 31 60,2 39 55
spy2
471 25 60,8 52 56
spy3
623 26 59,6 42 57
Ec. faecium
efa1 67 23 60,3 52 58
efa2
208 20 60,4 60 59
efa3
1240 24 60,8 50 60
efa4 2
446 39 66,8 46 61
efa4 3
1242 39 69,3 49 62
efa5 1
65 21 59 52 63
efa5 2
82 16 57 52 64
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont. % SEQ ID Nº
Staphylococcus
sta1 995 26 59 46 65
sta2
1137 23 60 52 66
sta3
1237 23 59 44 67
sta4
1264 22 62 55 68
Sta. aureus
sar1 186 24 59 46 69
sar2
230 19 59 58 70
sar3
447 27 57 33 71
Sta. epidermidis
sep1 1005 26 59 46 72
sep2
983 24 59 50 73
sep3
993 24 60 50 74
Ec. faecalis
efc1 84 24 61 50 75
efc2
176 24 61 50 76
efc3
193 22 62 55 77
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GCcont.% SEQ ID Nº
efc4
452 25 59 48 78
C. albicans
call - 22 61,2 59 79
C. parapsilosis
cpa1 - 21 60,6 52 80
Tabla 4: Lista de sondas usadas en este estudio para la vaginosis que incluye sus secuencias de nucleótidos y algunas características:
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GC (%) SEQ ID Nº
Atopobium vaginae
ava1 136 23 61 60,9 81
ava2
434 20 61,2 65 82
ava3
837 24 59,4 50 83
Bacteroides
bac1 145 25 58,7 48 84
bac2
601 25 61,1 48 85
bac3
1155 23 59,6 56,5 86
Gardnerella
gva1 153 25 61,1 52 87
vaginalis
gva2 434 26 59,5 46,2 88
gva3
988 22 61,2 52,2 89
Eb. cloacae
ecl4 471 21 60,6 57 90
ecl6
643 21 60 57 91
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GC (%) SEQ ID Nº
ecl7
652 22 60 55 92
Eb. aerogenes
ena2 444 27 60,2 44 93
ena3
453 28 60,4 43 94
ena4
473 22 60.8 55 95
K. pneumoniae
kpn1 61 20 60,7 65 96
kpn2
203 18 58,9 67 97
K. oxytoca
klo1 81 19 60,5 63 98
klo2
633 21 60 57 99
E. coli
eco2 448 36 60 38,9 100
eco3
994 27 59,2 48,8 101
Mobiluncus
mob1 298 19 62,3 68,4 102
mob2
586 21 61,3 61,9 103
mob3
821 24 59 54,2 104
Pm. aerogenes
psa4 585 26 59,9 42 105
psa5
1136 21 61,7 62 106
psa6
1245 20 61 65 107
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GC (%) SEQ ID Nº
Sr. marcescens
sem1 62 19 60,4 68 108
sem2
439 20 60,7 65 109
sem3
460 30 59,8 40 110
Sm. maltophilia
sma1 713 23 63,7 57 111
sma3
1265 20 61 60 112
S. pneumoniae
spn1 56 24 60,7 54 113
spn3
201 25 60,9 52 114
spn5
634 30 60,1 37 115
Ec. faecium
efa1 67 23 60,3 52 116
efa2
208 20 60,4 60 117
efa3
1240 24 60,8 50 118
efa4 2
446 39 66,8 46 119
efa4 3
1242 39 69,3 49 120
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GC (%) SEQ ID Nº
efa5 1
65 21 59 52 121
efa5 2
82 16 57 52 122
Staphylococcus
sta1 995 26 59 46 123
sta2
1137 23 60 52 124
sta3
1237 23 59 44 125
sta4
1264 22 62 55 126
Sta. aureus
sar1 186 24 59 46 127
sar2
230 19 59 58 128
sar3
447 27 57 33 129
Sta. epidermidis
sep 1 1005 26 59 46 130
sep 2
983 24 59 50 131
sep 3
993 24 60 50 132
Ec. faecalis
efc1 84 24 61 50 133
efc2
176 24 61 50 134
21-10-2011
(continuación)
Especificidad
Nombre E. coli Pos. Secuencia[5’-3’] Longitud (bases) Tm (˚C) GC (%) SEQ ID Nº
efc3
193 22 62 55 135
efc4
452 25 59 48 136
C. albicans
call - 22 61,2 59 137
C. parapsilosis
cpa1 - 21 60,6 52 138
Ejemplo 3: Preparación de la micromatriz
Se obtuvieron sondas de oligonucleótidos de VBC Genomics (Austria).En los extremos 5’ de cada uno se añadieron restos de oligo 5 timina como moléculas separadoras Con el fin de asegurar la unión covalente con el grupo aldehído reactivo en la superficie de la micromatriz (CSS-100 Silylated Slides, Cel Associates, EE.UU.) se modificaron sondas en 5’ amino Las sondas se grabaron a diferentes concentraciones (50 µM, 20 µM y 10 µM en 3 x SSX y betaína monohidrato 1,5 M) sobre los portas de vidrio sililados mediante un equipo de fabricación de matrices de contacto (Omnigrid, GeneMachines) mientras que la humedad ajustada del aire fue entre 55 y 60%.
Se grabaron 6 réplicas de cada sonda por micromatriz. Se llevó a cabo el manchado con clavijas SMP 3 (TeleChem, EE.UU.) que condujeron a un tamaño de mancha de 100 µm de diámetro.
Ejemplo 4 Preparación de la diana
Aislamiento del ADN
Se tomaron muestras de sangre mediante extracción estéril e un tubo K3E de 10 ml (BD Vacutainer Systems, Reino Unido). Se enriquecieron las bacterias en sangre ajustando la densidad apropiada usando McFarlan normalizado nº
0.5 y se transfirieron al volumen o dilución correctos en 10 ml de sangre completa. Para la separación de los leucocitos se llevó a cabo una etapa de filtración. Las bacterias pasaron el filtro. Si no se llevó a cabo la filtración, se aplicó alternativamente el siguiente procedimiento Percoll Para la lisis de las células de la sangre, se añadieron 3 ml de Tris-EDTA, pH 8 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM), se mezclaron y se centrifugaron a 10000 g durante 10 min y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo.
Amplificación del ADN
Se amplificó mediante la PCR el ARNr génico de 16S empleando el cebador directo 27 T7 (5’-TAATACGACTCACTATAGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG; SEQ ID No. 1) y el cebador inverso 1492 (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT; SEQ ID No. 2) (VBC Genomics, Austria) (0,3 nM en una mezcla de la PCR) (Gutenberger y col., 1991). Los cebadores directos contenían el sitio del promotor T7 (5’-TAATACGACTCACTATAG-3’; SEQ ID No. 3) en su extremo 5’, lo que permitió que la ARN polimerasa T7 mediara en la transcripción in vitro usando los productos de la PCR como plantillas para dirigir la comparación de diferentes procedimientos de marcado (Bodrossy y col., 2003). Se identificaron especies de Candida mediante amplificación previa del ARNr génico de 18S con los cebadores CanFW (5’-TCCGCAGGTTCACCTAC; SEQ ID No. 4) y CanRev (5’-CAAGTCTGGTGC CAGCA; SEQ ID No. 5) (White y col., 1990).
Las bacterias en 10 ml de sangre completa sirvieron como escenario para la generación de amplicones de ARNr de 16S de longitud completa. Se optimizó la eficacia de la PCR con ADN bacteriano aislado de 1 ml de sangre variando las concentraciones de diferentes componentes y añadiendo potenciadores de la PCR. Las condiciones óptimas de la mezcla de reacción de 25 µl de la PCR fueron: 3 U de la ADN polimerasa Taq (Invitrogen, California), 2,5 µl de 10 x tampón de la PCR, MgCl2 2 mM; glicerol al 10% y betaína al 0,5%. Se aplicaron alternativa mezclas maestras a la PCR: 1,25 U de ADN Polimerasa GoTaq® (Flexi ADN Polimerasa GoTaq®, Promega Corporation),
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MgCl2 1 mM, 5 µl de 5 x tampón de la PCR-GoTaq, dNTP hasta una concentración final de la PCR de 0,5 mM cada uno (ATP, GTP, CTP y TTP) y cebador directo e inverso a una concentración final de la PCR de 0,3 nM cada uno en la PCR. Una mezcla maestra alternativa fue: 1,25U de ADN Polimerasa I FirePol ® (Solis Biodyne), MgCl2 2 mM, 2,5 µl de 10 x tampón de la PCR GoTaq, dNTP a una concentración final de la PCR de 0,5 mM cada uno (ATP, GTP, CTP y TTP) y cebador directo e inverso a una concentración final de la PCR de 0,15 nM cada uno en la PCR.
La ciclación de la PCR incluyó una etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95ºC durante 30 s, 55ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min. Los ciclos de la temperatura se terminaron a 72ºC durante 10 min hasta completar los amplicones parciales, seguido por almacenamiento a 4ºC hasta utilización adicional.
Se confirmó la amplificación satisfactoria resolviendo los productos de la PCR en un gel de agarosa al 1,5% (SeaKem, Biozym) con bromuro de etidio en tampón TBE (Tris 0,1 M, ácido bórico 90 mM, EDTA 1 mM) (Invitrogen, Reino Unido)
Los productos de la amplificación se marcaron tanto directamente como en una PCR con extensión del cebador.
Para los procedimientos de marcado directo se usaron tanto 6 nmol de Cy5-dCTP (Amersham Biosciences, Reino Unido), como 0,3 nM del cebador Cy3 marcado en el extremo 5’ por mezcla de reacción.
Marcado
Se optimizaron diferentes estrategias de marcado tales como la extensión del cebador, la transcripción in vitro, el marcado con biotina-estreptavidina, el marcado basado en el fragmento Klenow isotérmico, o el marcado directo mediante la PCR usando el cebador marcado en el extremo 5’ Se podrían conseguir buenos resultados sin la purificación de los productos de la PCR. El procedimiento de extensión del cebador mostró una buena sensibilidad y especificidad y se usó por tanto como procedimiento normalizado. Se usaron 6 µl de producto de la PCR para el marcado en la mezcla de reacción de extensión del cebador, que contenía 0,9 mM de cebador inverso 27, 1,5 U Vent de (exo) polimerasa (New England Biolabs, UK), MgSO4 3 mM y 50 mM de dATP, dGTP, dTTP, dCTP y Cy5dCTP 25 mM. La mezcla de reacción se cicló 25 x a 95ºC, 60ºC y 72ºC cada 20 s, seguido por una etapa final de extensión durante 5 min a 72ºC. Los ciclos de temperatura estuvieron precedidos por 3 min de incubación a 95ºC.
Ejemplo 5: Hibridación
Antes de la hibridación, se pretrataron portas de la micromatriz con tampón de bloqueo (tampón de cianoborohidruro: Na2H PO4 20 mM, NaH2PO4 10 mM, NaCl 200 mM, NaBH3CN 50 mM) a temperatura ambiente durante 30 minutos con el fin de inactivar los grupos reactivos de la superficie del porta.
Se ajustó la mezcla de la hibridación a una concentración final de 4 x SSC, SDS al 0,1% en 24 µl de la mezcla de reacción del ADN marcado y amplificado.
Se transfirió un volumen total de 22 µl a un cubreobjetos (22 x 22 mm) y se aplicó a la superficie de la micromatriz. Se realizó la hibridación a 65ºC en una cámara saturada de vapor durante 1 h. Se lavaron los portas en 2 x SSC y SDS al 0,1% durante 5 minutos seguido por 0,2 x SSC durante 2 minutos y 0,1 x SSC durante 1 minuto. Se secaron los portas mediante centrifugación a 900 g durante 2 minutos.
Ejemplo 6: Detección de la señal y análisis de datos
Se escanearon los portas a una resolución de 10 µm con un escáner de micromatrices Axon Genepix 4000A (Axon, EE.UU.) a una potencia de láser equivalente y un nivel de sensibilidad del fotomultiplicador (650 pmt) para cada porta. Por tanto, las intensidades de la señal absoluta y relativa presentadas en experimentos independientes son directamente comparables. Se analizaron las imágenes obtenidas usando el software Genepix y los archivos gpr resultantes se usaron para el análisis adicional.
Evaluación estadística
Se llevó a cabo el análisis de los datos en R (www.r-project.org) usando los paquetes lima, affy, stats y class. Los conjuntos de datos consistieron en 241 hibridaciones llevadas a cabo en 3 diferentes diseños de la micromatriz de identificación del patógeno. Los diferentes diseños conforman 76 sondas; estas se usaron en el análisis. Todas las otras sondas se ignoraron. Se representó cada patógeno por 2-5 diferentes sondas con diferentes secuencias. Para aumentar la robustez, se mancharon 6 veces las sondas en la matriz.
Se representó cada hibridación por un archivo gpr, todos los cuales se almacenaron colectivamente como objetos RGList en R. Se normalizaron las señales usando la normalización al cuantil del paquete affy. Se usaron las medianas de las 6 manchas-réplicas para el procedimiento de clasificación supervisado de los k Vecinos más
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cercanos (k=1). Se validó el clasificador con una solución de validación cruzada de dejar uno fuera (Se llevó a cabo KNN de acuerdo con Ripley (1996) "Pattern Recognition and Neural Networks", Cambridge y Venables y col. (2002), "Modern Applied Statistic with S.", 4ª Ed., Springer; Se llevó a cabo la Normalización al cuantil de acuerdo con Bolstad y col., Bioinformatics 19(2) (2003), 185-193.)
Normalización
La normalización es un importante aspecto de todos los experimentos de micromatriz. Usualmente requiere un conjunto de sondas que se espera que proporcionen una señal constante a lo largo de todas las hibridaciones. En el presente conjunto de experimentos esto no fue factible. Por tanto, se escogió una solución de normalización al cuantil, basándose en la suposición de que cada matriz debería tener un número de sondas que proporcione una señal positiva (que corresponde al patógeno presente en la muestra) y el resto de las sondas tenga una señal baja (o no). Este algoritmo es una solución de normalización entre matrices que sustituye la señal más elevada de cada matriz por el promedio de las señales superiores a través de todas las matrices, y a continuación la segunda más elevada por el promedio de todas las segundas señales más elevadas, y así sucesivamente. En la densidad de las manchas, esto se ilustra por un cambio de cada densidad de mancha para corresponderse a la densidad promedio a lo largo de todas las matrices.
Ejemplo 7: Matriz de hibridación en silicio
Se generó una matriz de hibridación con la función Probe Match del paquete informático ARB y el programa CalcOligo. El comportamiento modelado para hibridación de cada sonda (Fig. 2) estuvo por lo general de acurdo con los datos experimentales reales.
Podía esperarse una hibridación cruzada en la familia Enterobacteriaceae debido a las secuencias fuertemente conservadas del ARNr de 16S de cada miembro que producen fuertes agrupaciones en la matriz de hibridación predicha. Las sondas para otras especies deberían dar como resultado señales específicas. Especialmente, se esperaba que las especies Gram positivas proporcionaran señales específicas de la especie. A diferencia de esto, las bacterias Gram negativas comprendidas en el grupo de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella mostraron hibridaciones menos específicas.
Sin embargo, incluso estas especies individuales pudieron identificarse finalmente con modelos de señal específicos resultado de sondas múltiples-El resto de bacterias gram negativas pudieron diferenciarse sin ambigüedad en el nivel de especie. Las sondas de ARNr de 18S de Candida sp. mostraron una señal no específica con especies bacterianas y proporcionó una buena discriminación entre especies. Los valores predichos de la ARNr se pudieron confirmar con los datos experimentales.
Ejemplo 8: especificidad
Los valores normalizados de la señal procedente de 241 experimentos de hibridación se han resumido en la Fig. 3. Los valores de hibridación observados mostraron un coeficiente de variación (CV) bajo entre las 6 manchas replicadas y entre los diferentes ensayos. El CV de todas las señales específicas varió de 2,4% a 64,1% para el 80% de las sondas. Los resultados experimentales se correlacionan fuertemente con el comportamiento de hibridación predicho a partir de los programas ARB y CalcOligo (la comparación con la Fig. 2 indica intensidades de hibridación similares). Como se esperaba del análisis de CalcOligo, las hibridaciones cruzadas de las sondas individuales se produjeron en la familia Enterobacteriaceae especialmente en el grupo Klebsiella-Enterobacter-Citrobacter. Sin embargo, se pudieron asignar modelos de señal específicos a cada especie permitiendo la identificación de los cultivos en el nivel de especie.
Ejemplo 9: sensibilidad
Se evaluaron los límites de detección bacteriana (LOD) con muestras de sangre repicada y cultivos puros usando dilución en serie desde 108 a 100 bacterias por ml a partir de especies bacterianas gram positivas y gram negativas seleccionadas. El límite de detección en cultivos puros fue inferior al de la sangre repicada debido a la interferencia en la PCR debida a los componentes sanguíneos. Se encontró que las PCR realizadas a partir de cultivos puros amplificaron el ADN hasta 103 células por ensayo dando por resultado una banda claramente visible en el gel de agarosa al 1,5% gel (véase la Fig. 4).
La identificación basada en micromatrices fue 100 veces más sensible de lo que demostraron las evaluaciones en gel de agarosa. Se pudieron obtener señales específicas y reproducibles de hasta 10 bacterias por ensayo para E. coli. El análisis de cultivos estafilocócicos reveló un límite de detección superior en el grupo de bacterias gram positivas siendo necesarias aproximadamente 103 células por ensayo para observar señales en la micromatriz (véase la Fig. 5). Esta diferencia en sensibilidad se puede adscribir a una lisis celular menos eficaz debido a la presencia de una pared celular persistente o a la presencia de DNAsa termostable en el proteoma estafilocócico
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(Heininger y col, 2004). Sin embargo, el uso previsto de la herramienta exige un procedimiento rápido y fiable que represente un compromiso entre tiempo, aplicabilidad y sensibilidad. La adopción del protocolo para diferentes etapas de lisis celular o un tratamiento enzimático adicional puede mejorar adicionalmente el límite de detección.
Ejemplo 10: detección de patógenos en paralelo
Se ajustaron las densidades de las suspensiones bacterianas como se ha descrito en el ejemplo 4 y se añadieron cantidades iguales a los experimentos de especies simples y especies dobles Los resultados de hibridación de las combinaciones de diferentes cepas se compararon con los de las cepas únicas. También se demostró que para la misma carga bacteriana la fuerza de la señal es la misma sin que importe si se trataba de una sola especie o una combinación de especies. Los ensayos con múltiples microbios produjeron un modelo de señal que mostraba las señales compuestas de las hibridaciones de una sola especie (véase la Fig. 6). Debido a estos resultados, es posible establecer una diferenciación clara entre especies en una infección microbiana múltiple. Algunos experimentos se realizaron sobre sangre repicada confirmando los resultados de los cultivos puros (Fig. 8)
Ejemplo 11: hibridación de aislados de sangre completa
Los protocolos PCR y de marcado se optimizaron con ADN bacteriano aislado de muestras de sangre para reducir interferencias de los componentes sanguíneos. La adición de glicerol y betaína redujo la amplificación no específica durante las etapas de PCR y de marcado a pesar de las grandes cantidades de ADN humano residual. De este modo, el rendimiento del producto específico de la PCR aumentó claramente dando como resultado especificidades iguales a las de los microorganismos cultivados. No se observó hibridación cruzada debida al ADN humano (Fig. 7). Se observaron resultados similares mediante la detección de combinaciones de microorganismos únicos simulando infecciones microbianas múltiples como se ha descrito anteriormente, Los modelos de señal obtenidos fueron tan específicos de las cepas añadidas como en las hibridaciones de la micromatriz para una sola especie (Fig. 8).
Se determinó la sensibilidad del procedimiento proporcionando una fila de dilución de diez veces en 10 ml de sangre repicada. Se encontró que el límite de detección era tan bajo como 10 bacterias por de sangre completa. Sin embargo, tal como se observe con cultivos puros, la sensibilidad de las bacterias gram positivas es mucho más elevada, por ejemplo 105 por ml de sangre para Staphylococcus aureus.
Ejemplo 12: Candida
Cuatro sondas específicas de Candida sp dirigidas al ARNr génico de 18S se incluyeron en las sondas microbianas de la micromatriz. La Fig. 3 ya indica pocas hibridaciones cruzadas con secuencias bacterianas diana indicando una especificidad muy elevada de las sondas de Candida. Se obtuvieron respuestas con señal inespecífica para dianas de Candida albicans a partir de sondas de Acinetobacter lwoffi. C. parapsilosis mostró una baja hibridación con la sonda spn3 que es específica de Streptococcus pneumoniae. También se aplicaron protocolos optimizados para bacterias con Candida sp en niveles de sensibilidad similares. Para optimizar la PCR para los dos pares de cebadores, la concentración del cebador de ARNr de 16S tuvo que triplicarse en relación al cebador de ARNr de 18S.
Ejemplo 13: clasificación
La Fig. 9 muestra agrupaciones claras de las hibridaciones también como sondas. Aunque cada sonda fue diseñada para unirse a un patógeno específico, el mapa térmico muestra que algunas sondas son muy específicas de una especie mientras que otras dan señal para un intervalo más amplio de organismos diferentes, y que muy pocas sondas no proporcionan ninguna señal específica. Un enfoque clásico sería evaluar cada conjunto de sondas en todas las hibridaciones y definir un umbral para la señal, por ejemplo mediante análisis ROC (Bilban y col., 2002) para distinguir entre señales positivas y negativas. Sin embargo, puesto que algunas sondas muestran hibridación cruzada entre especies o incluso entre géneros, esto no solo llevaría a problemas de especificidad, sino también significaría una pérdida de información contenida en los modelos de hibridación cruzada. Se utilizó un enfoque de aprendizaje máquina para clasificar un modelo de hibridación por su similitud con hibridaciones de organismos conocidos. Se utilizó el procedimiento del vecino k más cercano (k=1) y se validó con un enfoque de validación cruzada con el procedimiento de dejar uno fuera. En el nivel de género, las 241 hibridaciones se clasificaron correctamente, y el 96,7% en el nivel de especie.
Notas de conclusión
La presente micromatriz para la identificación de patógenos transmitidos por la sangre es la primera herramienta de diagnóstico molecular capaz de identificar una amplia gama de bacterias y levaduras clínicamente relevantes directamente a partir de la sangre en un plazo de tiempo apreciable.
La combinación de la amplificación mediante la PCR con hibridación en micromatriz representa una potente
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herramienta para la identificación de patógenos. Supera las tecnologías habituales en velocidad, a la vez que se comporta con una especificidad extremadamente elevada. El análisis de ARNr génicos de 16S se había notificado con anterioridad para permitir una prueba más robusta, reproducible, y precisa que los procedimientos fenotípicos (Clarridge, 2004).
El paquete informático arb analizó más de 27.000 secuencias para calcular el comportamiento de hibridación de las especies seleccionadas. Los valores predichos y experimentales mostraron una elevada correlación. Los ARNr génicos de 23S se probaron en paralelo a sondas dirigidas al ARNr de 16S. El ARNr génico de 16S se prefirió frente al ARNr de 23S debido a la mayor base de datos de secuencias.
La sensibilidad se aumentó mediante la introducción de una etapa de amplificación del ADN antes del marcado. La selección de las estrategias de amplificación y marcado afectó fuertemente a la sensibilidad, dando lugar al mismo tiempo solo a cambios menores en la especificidad. La hibridación en una micromatriz consigue una sensibilidad aproximadamente 100 veces superior en comparación con la detección directa de la diana amplificada.
Los procedimientos normalizados para la identificación clínica necesitan 2 días y hasta 5 días para microorganismos que son difíciles de cultivar. Los sistemas basados en micromatriz permiten una identificación de microorganismos rápida y precisa. El presente protocolo se llevó a cabo en las 6 horas entre la extracción de sangre y la presentación de resultados mediante el programa de análisis. Tiempos reales de ciclo de PCR de aproximadamente 2,5 horas deberían reducirse significativamente mediante dispositivos de PCR capilar o PCR miniaturizada permitiendo la finalización de la PCR en menos de 20 min.
Los procedimientos basados en ADN permiten la detección de células estáticas o incluso muertas antes de la degradación del genoma, por ejemplo, en el caso de la administración de antibióticos cuando ya no se puede observar crecimiento en cultivo (Heininger y col., 1999).
La aplicación de un procedimiento de clasificación supervisado según el vecino k más cercano (k=1) a todas las bacterias y levaduras ensayadas identificó correctamente en el nivel de género y un 96% en el nivel de especie. Una elevada similitud en la secuencia de ADNr de 16S produjo error de clasificación en el caso de Proteus mirabilis y vulgaris y para Acinetobacter radioresistens y baumanii.
Los mejores procedimientos publicados hasta la fecha solo reconocían la afiliación para la familia de Enterobacteriaceae o para otros géneros gram positivos como Staphylococcus y Streptococcus. Adicionalmente, no se había publicado la identificación simultánea de bacterias y levaduras (Shang y col., 2005; Jordan y col., 2005; Kempf y col., 2000; Jansen y col., 2000; Jordan and Durso, 2005).
El 7% de todas las infecciones de la sangre son polimicrobianas (Henry y col., 1983). Los modelos de señal de microorganismos múltiples se pueden interpretar a partir de señales microbianas únicas. Las intensidades de señal son iguales a las de las infecciones individuales. El panel de sondas fue específico de todas las combinaciones bacterianas dobles seleccionadas al azar. Los controles negativos de sangre no repicada proporcionaron resultados negativos para la amplificación e hibridación mediante PCR. Esto confirma la ausencia de bacterias pleomórficas o de ADN bacteriano en la sangre de seres humanos sanos (McLaughlin y col., 2002; Nikkari y col., 2001).
Los niveles de detección fueron a 101 y 103 bacterias por ensayo para E. coli y Staphylococcus aureus, respectivamente procedentes de cultivos puros. El límite de detección (LOD) del resto de especies bacterianas estuvo entre 102 y 103. Los datos publicados, que sugieren sensibilidades superiores para cultivos puros, a menudo están basados en diluciones de concentrados de ADN y se amplificó una secuencia diana mucho más pequeña lo que permitió solamente la determinación de presencia bacteriana (Wilson y col., 2002).
Con la sangre repicada, se encontró que el LOD del protocolo y la micromatriz de acuerdo con la presente invención eran de 10 a 105 bacterias por ml de sangre. Sin embargo, el LOD superior de las muestras de sangre repicada en comparación con los cultivos puros debería ser el resultado de componentes inhibitorios de la PCR en la sangre (Al-Soud y col., 2000, 2001). Una purificación adicional del AND puede reducir la cantidad de estos inhibidores, pero los niveles elevados de ADN humano residual sighen dificultando la obtención de una LOD baja.
La mayor parte de procedimientos de identificación basados en tecnología de micromatrices fueron publicados sin una estimación del LOD. Las declaraciones de sensibilidad en muestras de sangre estaban basadas habitualmente en experimentos en PCR y RT-PCR. El LOD variaba de 40 a 2000 UFC por ml de sangre repicada, aunque si se tienen en cuenta las bacterias estáticas se deben aumentar estas cifras. Para una PCR normalizada con ARNr de 16S, el LOD fue 104 para E. coli y 105 para Staphylococcus aureus por ml de sangre. Sin embargo, estos ensayos solo estaban dirigidos a confirmar la presencia bacteriana en la sangre sin su identificación (Jordan y Durso, 2005; Heininger y col., 2004).
Se pueden aplicar a esta prueba otros enfoques prometedores diferentes para aumentar la fuerza de la señal y
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reducir adicionalmente el LOD del análisis con micromatriz. Por ejemplo, ya se ha propuesto utilizar microcámaras en rotación continua y discontinua (Vanderhoeven y col., 2005; Peplies y col., 2003; Liu y col., 2001; Francois y col., 2003).
Se preparó una base de datos que actuaba como clasificador para el procedimiento estadístico aplicado. La evaluación implementa reconocimiento de modelos y algoritmos de aprendizaje máquina. El procedimiento del vecino k más cercano consigue una identificación precisa en una plataforma completamente automatizada. Adicionalmente, está en desarrollo un paquete informático que incluye la flexibilidad de la adición posterior de sondas únicas, especies individuales, grupos de especies o incluso un cambio completo de todo el clasificador. Una ampliación del clasificador por adición de otros resultados de hibridación aumentaría la especificidad de la identificación debido a la reducción en la posibilidad de errores de interpretación debido a señales falsas negativas
o hibridaciones cruzadas (especialmente para las especies Proteus y Acinetobacter). El programa permitirá el procesado automático de archivos gpr procedentes del programa genepix y encontrará los nombres del género y la especie.
Adicionalmente, se proporcionarán recomendaciones de tratamientos antibióticos adecuados a partir de las evaluaciones estadísticas de la información actualizada sobre resistencias a antibióticos.
En los presentes ejemplos se muestra un procedimiento rápido y sensible para la identificación basada en el ADN de patógenos clínicamente relevantes que producen infecciones en la sangre. Debido a los presentes resultados, esta micromatriz tiene sensibilidad suficiente para identificar patógenos a una concentración baja inferior a 10 bacterias por ml. Basándose en el análisis de los modelos de señal, se determine que la especificidad era del 100% en el nivel de género y más del 96% en el nivel de especie. Esto muestra que una herramienta de identificación basada en el marcador génico ARNr de 16S representa un enfoque potente para análisis clínico rutinario. En comparación con los procedimientos normalizados, que usan hemocultivos, una identificación mediante micromatriz se puede realizar en 6 horas y también tiene en cuenta infecciones multimicrobianas. Adicionalmente, el número de organismos identificables se puede ampliar con facilidad a nuevos patógenos.
Una realización preferida de la presente invención es proporcionar sondas multiespecíficas que identifican específicamente más de 1 especie en la familia de Enteroceae, especialmente sondas que identifican específicamente Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Austrian Research Centers GmbH -ARC
<120> Identificación de patógenos
<130> R 50322
<150> AT A 1148/2006
<151> 05-07-2006
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<223> Sonda
<400> 39
gggtattaac cttatcacct tcctccc
27
20
<210> 40
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
25
<223> Sonda
<400> 40
ccaaccagtt tcagatgcaa ttccc
25
<210> 41
<211> 27
30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 41
35
gttcaagacc acaacctcta aatcgac 27
<210> 42
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
40
<220>
<223> Sonda
<400> 42
ctgctttggt ccgtagacgt ca
22
<210> 43
45
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
50
<400> 43
ttcccgaagg cactcctcta tctcta
26
<210> 44
<211> 26
<212> ADN
55
<213> Artificial
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<220>
<223> Sonda
<400> 44
gatttcacat ccaacttgct gaacca
26
5
<210> 45
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
10
<223> Sonda
<400> 45
tctccttaga gtgcccaccc g
21
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<211> 20
15
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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20
cgtggtaacc gtcccccttg
20
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<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
25
<220>
<223> Sonda
<400> 47
ctcccctgtg ctaccgctc
19
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30
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
35
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caccaccttc ctcctcgctg
20
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<211> 30
<212> ADN
40
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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gagtaacgtc aattgatgag cgtattaagc
30
45
<210> 50
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
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50
<223> Sonda
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agctgccttc gccatggatg ttc
23
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Sonda
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5
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<212> ADN
<213> Artificial
10
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<223> Sonda
<400> 52
ctcctccttc agcgttctac ttgc
24
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
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ggtccatctg gtagtgatgc aagtg
25
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<212> ADN
25
<213> Artificial
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<223> Sonda
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tcttgcactc aagttaaaca gtttccaaag
30
30
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<213> Artificial
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35
<223> Sonda
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attactaaca tgcgttagtc tctcttatgc g
31
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40
<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
<400> 56
45
ctggttagtt accgtcactt ggtgg 25
<210> 57
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
50
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<223> Sonda
<400> 57
ttctccagtt tccaaagcgt acattg
26
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55
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
5
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caagctccgg tggaaaaaga agc
23
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<211> 20
<212> ADN
10
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 59
catccatcag cgacacccga
20
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<212> ADN
<213> Artificial
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20
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<400> 60
acttcgcaac tcgttgtact tccc
24
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
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ccgtcaaggg atgaacagtt actctcatcc ttgttcttc 39
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<212> ADN
<213> Artificial
35
<220>
<223> Sonda
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attagcttag cctcgcgact tcgcaactcg ttgtacttc
39
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40
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
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<400> 63
ctccggtgga aaaagaagcg t
21
<210> 64
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Sonda
<400> 64
ctcccggtgg agcaag
16
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<210> 65
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<213> Artificial
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26
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Sonda
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cagtcaacct agagtgccca act
23
15
<210> 67
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<212> ADN
<213> Artificial
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20
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agctgccctt tgtattgtcc att
23
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
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atgggatttg catgacctcg cg 22
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<212> ADN
<213> Artificial
35
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<223> Sonda
<400> 69
ccgtctttca cttttgaacc atgc
24
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<213> Artificial
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agctaatgca gcgcggatc
19
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<212> ADN
50
<213> Artificial
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<223> sonda
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tgcacagtta cttacacata tgttctt
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<213> Artificial
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aaggggaaaa ctctatctct agaggg
26
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Sonda
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gggtcagagg atgtcaagat ttgg 24
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<212> ADN
<213> Artificial
20
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<223> Sonda
<400> 74
atctctagag gggtcagagg atgt
24
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25
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
30
<400> 75
ccactcctct ttccaattga gtgca
25
<210> 76
<211> 24
<212> ADN
35
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 76
gccatgcggc ataaactgtt atgc
24
40
<210> 77
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
45
<223> Sonda
<400> 77
cccgaaagcg cctttcactc tt
22
<210> 78
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> sonda
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ggacgttcag ttactaacgt ccttg 25
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<212> ADN
<213> Artificial
5
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<223> sonda
<400> 79
ccagcgagta taagccttgg cc
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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tagccttttt ggcgaaccag g
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Procedimiento de identificación de patógenos microbianos, preferiblemente patógenos humanos, en una muestra de fluido corporal, que comprende
    a) proporcionar una muestra de fluido corporal,
    b) lisar los patógenos microbianos y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico, preferiblemente la PCR, sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o a partir de la cual los ácidos amplificados se marcan,
    c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados marcados de la etapa b) con una micromatriz que comprende en zonas definidas en la superficie de la micromatriz sondas multiespecíficas inmovilizadas de ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos,
    d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados marcados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que se está uniendo específicamente a la micromatriz, y
    e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos, lo que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas sobre la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos con no correspondencias ponderadas.
  2. 2.-Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de amplificación del ácido nucleico sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S se lleva a cabo con cebadores universales para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S, preferiblemente con no más de ocho cebadores, de manera más preferida con no más de seis cebadores, preferiblemente con no más de cuatro cebadores, de manera particularmente preferida con los cebadores de acuerdo con las Seq. ID Nos. 1, 2, 4 y 5, preferiblemente con la ADN polimerasa GoTaq® o FirePol®.
  3. 3.-Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque entre la etapa a) y la etapa b) se lleva a cabo una etapa de filtración, en la que la muestra se filtra a través de un filtro que contiene leucocitos presentes en dicha muestra de fluido corporal, preferiblemente una muestra de sangre, pero que no contiene los patógenos microbianos.
  4. 4.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el marcado de los ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante la extensión del cebador, transcripción in vitro, marcado con biotinaestreptavidina, marcado basado en el fragmento Klenow isotérmico, o marcado directo mediante amplificación del ácido nucleico, preferiblemente mediante marcado directo mediante la PCR.
  5. 5.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los ácidos nucleicos amplificados marcados se aplican directamente a la micromatriz sin una purificación o etapa de lavado tras la reacción de amplificación del ácido nucleico.
  6. 6.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la micromatriz comprende sondas inmovilizadas de ADN microbiano que codifican el ARNr de 16S o 18S, de al menos diez, preferiblemente al menos 15, especialmente al menos 20, de los siguientes patógenos microbianos: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca , Citrobacter koseri, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter johnsonii, Candida albicans, Candida parapsilosis, que comprende preferiblemente sondas para al menos una cepa de al menos 10 especies diferentes, preferiblemente de al menos 15 especies diferentes, especialmente de al menos 20 especies diferentes, de las siguientes especies: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseri, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter johnsonii, Candida albicans, Candida parapsilosis.
  7. 7.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la micromatriz comprende al menos 10, preferiblemente 20, de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 40,
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    sondas inmovilizadas multiespecíficas, y/o al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, especialmente al menos un 50%, de las sondas inmovilizadas en la micromatriz son sondas multiespecíficas.
  8. 8.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la micromatriz comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, de manera más preferida al menos 20, de manera incluso más preferida al menos 30, especialmente al menos 50, de las sondas de acuerdo con las Seq. ID Nos 6 a 80.
  9. 9.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las sondas en la micromatriz se seleccionan para representar al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, de manera más preferida al menos el 95%, especialmente al menos el 98%, de los patógenos microbianos, especialmente bacterianos, conectados con o sospechosos de estar relacionados con sepsia.
  10. 10.-Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el patógeno microbiano es de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo y la muestra de fluido corporal es una muestra de fluido vaginal, preferiblemente, en el que la matriz comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, de manera más preferida al menos 20, incluso de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 50, de las sondas de acuerdo con las Seq. ID Nos 81 a 138.
  11. 11.-Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la micromatriz comprende sondas inmovilizadas de ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de al menos una, preferiblemente al menos 2, especialmente al menos 3, de los siguientes patógenos microbianos: Gardnerella vaginalis, Atopobium, Mobiluncus y Bacteroides.
  12. 12.-Procedimiento para la identificación de patógenos microbianos en una muestra de fluido corporal que comprende las siguientes etapas:
    a) proporcionar una muestra de fluido corporal sospechosa de contener dichos patógenos microbianos,
    b) lisar los patógenos microbianos y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN que codifica el ARNr de 16S o 18S,
    c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende en zonas definidas en la superficie de la micromatriz sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos,
    d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado que se está uniendo específicamente a la micromatriz mediante un dispositivo de la micromatriz que detecta el episodio de unión de un ácido nucleico amplificado con una sonda inmovilizada, y
    e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados con zonas definidas de las sondas inmovilizadas multiespecíficas del ADM microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos, usando la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos cono no correspondencias ponderadas.
    en el que se aplican preferiblemente las formas de realización específicas que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, excepto que en vez de los ácidos nucleicos amplificados marcados se aplican ácidos nucleicos no marcados.
  13. 13.-Kit que comprende una micromatriz tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 12 y un producto de programa informático para identificar un patógeno microbiano correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos marcados o amplificados con zonas definidas de sondas multiespecíficas unidas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos en la micromatriz que usa la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados o amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando modelos de hibridación previstos con no correspondencias ponderadas.
  14. 14.-Kit de ensayo que comprende un elemento que retiene una muestra para una muestra de sangre, un kit de acuerdo con la reivindicación 13 y opcionalmente los cebadores que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo los cebadores preferiblemente específicos para la amplificación del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 10 u 11, y opcionalmente un filtro adecuado que contiene leucocitos pero que no contiene patógenos microbianos.
  15. 15.-Uso de una micromatriz, tal como se define en la reivindicación 13 o un kit de ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, cuando depende de la reivindicación 10, para la identificación de patógenos microbianos de
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    infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en una muestra de sangre, especialmente para vigilar la sangre de un paciente con sepsia, o de un paciente que tiene riesgo de desarrollar sepsia, o para la identificación de patógenos microbianos de la vaginosis en una muestra de fluido vaginal.
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