ES2370225T3 - Anticuerpos superhumanizados. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para fabricar una molécula de anticuerpo quimérico, que comprende: determinar un tipo canónico de estructura de CDR para al menos dos CDR en una región variable sujeto de un anticuerpo sujeto; seleccionar una región variable objeto de un anticuerpo objeto sobre la base de si la región variable objeto tiene los mismos tipos canónicos de estructura CDR en ubicaciones correspondientes en la región variable objeto; y construir una molécula de anticuerpo quimérico que comprende una región variable quimérica que tiene las al menos dos CDR de una región variable sujeto injertadas en la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en las ubicaciones correspondientes, en la que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en no más de 10 restos de aminoácidos.

Description

Anticuerpos superhumanizados

5 Campo técnico

La invención se refiere a procedimientos para humanizar anticuerpos, en particular para humanizar anticuerpos fabricando anticuerpos quiméricos que contienen secuencias de CDR a partir de un anticuerpo no humano y secuencias estructurales de anticuerpos humanos, más particularmente a procedimientos de selección de secuencias estructurales apropiadas de anticuerpos humanos para realizar la humanización y, aún más particularmente, al uso de tipos de estructura canónica de CDR del anticuerpo no humano en comparación con tipos de estructura canónica de CDR de línea germinal de anticuerpos humanos como base para seleccionar las secuencias estructurales humanas apropiadas para un anticuerpo humanizado.

15 Antecedentes de la invención

Los anticuerpos son proteínas naturales que forman el sistema inmunitario de los vertebrados como respuesta a sustancias extrañas (antígenos), principalmente para la defensa contra infecciones. Durante un siglo, los anticuerpos se han inducido en animales en condiciones artificiales y se han recogido para su uso en la terapia o el diagnóstico de afecciones patológicas o para investigación biológica. Cada célula individual productora de anticuerpos produce un único tipo de anticuerpos con una composición químicamente definida, no obstante, los anticuerpos obtenidos directamente a partir de suero animal como respuesta a la inoculación de antígenos comprenden realmente un conjunto de moléculas no idénticas (es decir, anticuerpos policlonales) producido a partir de un conjunto de células individuales productoras de anticuerpos.

25 La tecnología de hibridoma proporcionó un procedimiento para propagar una célula productora de anticuerpos durante un número indefinido de generaciones con un procedimiento de cribado para identificar clones de células que producen un anticuerpo que reaccionaría con un antígeno particular. El desarrollo de esta tecnología permitió la producción de cantidades ilimitadas de anticuerpos estructuralmente idénticos con, esencialmente, cualquier especificidad antigénica deseada. Dichos anticuerpos se denominan comúnmente anticuerpos monoclonales y se originan en su mayor parte en roedores. La secuenciación de genes de anticuerpos monoclonales permitió que se definiera la estructura primaria de aminoácidos de los anticuerpos.

El advenimiento de la metodología de ADN recombinante permitió el diseño estructural de genes de anticuerpos y la

35 producción de moléculas de anticuerpos modificadas con propiedades que no pueden obtenerse mediante la tecnología de hibridoma. En la escena terapéutica, un objetivo de esta metodología ha sido reducir la inmunogenicidad en seres humanos de anticuerpos monoclonales de roedor modificando su estructura primaria de aminoácidos. La reducción de la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es deseable debido a que la inducción de una respuesta inmunitaria puede causar una serie de efectos secundarios en el paciente, variando desde la eliminación acelerada del anticuerpo terapéutico, con la consecuencia de la pérdida de eficacia, hasta la anafilaxia fatal en el caso más extremo.

Un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales extraños ha consistido en reemplazar los dominios constantes de las cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal por dominios análogos 45 de origen humano manteniendo intactos los dominios de las regiones variables del anticuerpo extraño. Los dominios de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Los dominios de unión que conectan los dominios variables a los dominios constantes están ubicados en una región alejada del sitio de unión al antígeno y, por lo tanto, los dominios de unión entre los dominios variables y los constantes no interfieren, generalmente, en la unión al antígeno. Las moléculas de anticuerpos quiméricos que tienen dominios variables de ratón unidos a dominios constantes humanos se unen al antígeno, generalmente, con la misma constante de afinidad que el anticuerpo de ratón a partir del que se deriva el anticuerpo quimérico. Dichos anticuerpos quiméricos son menos inmunogénicos en humanos que sus equivalentes totalmente murinos. No obstante, los anticuerpos que conservan dominios variables murinos enteros tienden a provocar respuestas inmunitarias en una fracción sustancial de pacientes. Por ejemplo, INFLIXIMAB®, un anticuerpo recetado

55 ampliamente que se considera seguro, induce una respuesta de anticuerpos antiquiméricos humanos en 7 de cada 47 pacientes con enfermedad de Crohn. (Rutgeerts, P. y col (1999) Efficacy and safety of retreatment with anti-tumor necrosis factor antibody (INFLIXIMAB) to maintain remission in Crohn's disease. Gastroenterology 117, 761-769).

El que los seres humanos producirían una respuesta inmunitaria a la totalidad de los dominios variables murinos era predecible; de este modo, los intentos de obtener dominios variables con un carácter más humano habían comenzado incluso antes de que se hubiera informado sobre los ensayos clínicos de dichos anticuerpos quiméricos estándar. Una categoría de procedimientos denominados frecuentemente “humanización” tienen el objetivo de convertir los dominios variables de anticuerpos monoclonales murinos en una forma más humana construyendo recombinantemente un dominio variable de anticuerpo que tenga un carácter tanto murino como humano. Los 65 procedimientos de humanización se basan en distintas interpretaciones consensuadas de datos de estructuras de anticuerpos. Primeramente, los dominios variables contienen tramos contiguos de secuencias de péptidos que se

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conservan dentro de una especie, pero que difieren entre especies evolucionariamente alejadas, tales como ratones y seres humanos. En segundo lugar, otros tramos contiguos no se conservan dentro de una especie, sino que también difieren incluso entre células productoras de anticuerpos dentro del mismo individuo. En tercer lugar, los contactos entre anticuerpo y antígeno tienen lugar principalmente a través de regiones no conservadas del dominio

5 variable. En cuarto lugar, la arquitectura molecular de dominios variables de anticuerpos es lo suficientemente similar entre especies que las posiciones de los restos de aminoácidos correspondientes entre especies pueden identificarse solamente sobre la base de su posición, sin datos experimentales.

Los procedimientos de humanización comparten la premisa de que el reemplazo de restos de aminoácidos que son característicos de secuencias murinas por restos encontrados en las posiciones correspondientes de anticuerpos humanos reducirá la inmunogenicidad en seres humanos del anticuerpo resultante. No obstante, el reemplazo de secuencias entre especies da como resultado, generalmente, la reducción de la unión del anticuerpo a su antígeno. La técnica de la humanización se basa, por lo tanto, en equilibrar el reemplazo de la secuencia murina original para reducir la inmunogenicidad con la necesidad de que la molécula humanizada conserve una unión al antígeno

15 suficiente como para ser terapéuticamente útil. Este equilibrio se ha conseguido usando dos enfoques.

En un enfoque, ejemplificado por medio del documento de patente de Estados Unidos Nº 5.869.619 de Studnicka y por Padlan (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties, Molecular Immunology 28:489-498, los restos humanos se sustituyen de forma característica por restos del dominio variable murino que se han determinado o predicho (i) para cumplir un papel químico poco importante en la interacción con el antígeno y (ii) para ubicarse con cadenas laterales que se proyectan en el disolvente. De este modo, los restos exteriores alejados del sitio de unión al antígeno están humanizados, mientras que los restos interiores, los restos de unión al antígeno y los restos que forman la interconexión entre dominios variables permanecen murinos. Una desventaja de este enfoque es que se requieren

25 unos datos experimentales bastante amplios para determinar si un resto tiene un papel químico poco importante en la unión al antígeno o será ubicado en el disolvente en una estructura de anticuerpo particular de tres dimensiones.

En otro enfoque más general, ejemplificado por el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.225.539 de Winter y por Jones y col. (1986) Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321:522-525, tramos contiguos de la secuencia de péptidos del dominio variable murino que se consideran conservados se reemplazan por los tramos correspondientes de un anticuerpo humano. En este enfoque más general, todos los restos de los dominios variables están humanizados excepto en las regiones no conservadas implicadas en la unión al antígeno. Para determinar los tramos contiguos apropiados para el reemplazo, Winter y Jonesy col. (1986) usaron una clasificación de secuencias de dominios variables de anticuerpos que habían sido

35 desarrolladas previamente por Wu y Kabat (1970).

Wu y Kabat fueron pioneros en el alineamiento de secuencias de péptidos de anticuerpos y sus contribuciones al respecto fueron múltiples: En primer lugar, mediante el estudio de similitudes secuenciales entre dominios variables, identificaron los restos correspondientes que en mayor o menor medida eran homólogos en todos los anticuerpos de todas las especies de vertebrados, en cuanto a que adoptaban estructuras tridimensionales similares, tenían papeles funcionales similares, interactuaban de forma similar con restos adyacentes y existían en ambientes químicos similares. En segundo lugar, diseñaron un sistema de numeración de secuencias de péptidos en el que se asignó a los restos de inmunoglobulina homólogos el mismo número de posición. Un experto en la técnica puede asignar de forma no ambigua lo que actualmente se denomina numeración de Kabat a cualquier secuencia de un 45 dominio variable sin depender de datos experimentales más allá de la secuencia en sí. En tercer lugar, para cada posición de la secuencia numerada según Kabat, Kabat y Wu calcularon la variabilidad, por medio de la cual se denota el hallazgo de pocos o muchos aminoácidos posibles cuando se alinean las secuencias de dominios variables. Identificaron tres regiones contiguas de alta variabilidad embebidas en cuatro regiones contiguas menos variables. Otros investigadores habían observado previamente variabilidad aproximadamente en estas regiones (regiones hipervariables) y habían postulado que las regiones de variabilidad alta representaban restos de aminoácidos que se usaban para la unión al antígeno. Kabat y Wu determinaron formalmente restos que constituían estos tramos variables y los denominaron "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), con referencia a la complementariedad química entre anticuerpo y antígeno. A las regiones menos variables restantes, que actualmente se denominan “regiones estructurales”, se les atribuyó un papel en el plegamiento tridimensional del

55 dominio variable, pero no en el reconocimiento del antígeno. En cuarto lugar, Kabat y Wu establecieron una base de datos pública de secuencias de ácidos nucleicos y péptidos de anticuerpos que continúa manteniéndose y es bien conocida por los expertos en la técnica.

El procedimiento de humanización dado a conocer por Winter y Jones usando la clasificación de Kabat da como resultado un anticuerpo quimérico que comprende CDR de un anticuerpo y regiones estructurales de otro anticuerpo que difiere del primero en la especie de origen, especificidad, subclase u otras características. No obstante, no se atribuyeron secuencias o propiedades particulares a las regiones estructurales, es más, Winter enseñó que cualquier conjunto de estructuras podía combinarse con cualquier conjunto de CDR. Desde entonces se ha reconocido que las secuencias estructurales son importantes para conferir la estructura tridimensional de una región variable de un 65 anticuerpo necesaria para mantener una buena unión al antígeno. De este modo, los procedimientos de humanización generales descritos por Winter y Jones tienen la desventaja de que producen frecuentemente

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anticuerpos inactivos debido a que estas referencias no proporcionan la información necesaria para seleccionar racionalmente entre las muchas secuencias estructurales humanas posibles las que proporcionan con mayor probabilidad el sitio de unión requerido por una región CDR particular de un anticuerpo no humano. Los desarrollos subsiguientes en el sector han sido mejoras dentro del ámbito de Winter para tratar la pérdida de avidez para

5 antígenos observada en algunos anticuerpos humanizados con relación a la avidez de los anticuerpos de ratón correspondientes. (La avidez es la medida cuantitativa de la distribución de un anticuerpo en presencia de un antígeno, en condiciones aproximadas al equilibrio químico, entre formas libres y unidas al antígeno. Para reacciones en solución no sometidas a efectos de unión multivalentes, la avidez es lo mismo que la afinidad, la constante de equilibrio bioquímica).

El documento de patente de Estados Unidos Nº 5.693.761 de Queen y col., da a conocer una mejora sobre Winter para la humanización de anticuerpos que se basa en la premisa de que atribuye la pérdida de avidez a problemas en motivos estructurales en la estructura humanizada, debido a una incompatibilidad estérica o de otro tipo químico, que interfiere en el plegamiento de las CDR en la conformación capacitada para la unión encontrada en el 15 anticuerpo de ratón. Para solucionar este problema, Queen instruye sobre el uso de secuencias estructurales humanas estrechamente homólogas en la secuencia de péptidos lineal a las secuencias estructurales del anticuerpo de ratón que se va a humanizar. En consecuencia, los procedimientos de Queen se enfocan en comparar las secuencias estructurales entre especies. Típicamente, todas las secuencias disponibles de dominios variables humanos se comparan a una secuencia de ratón particular y se calcula el porcentaje de identidad entre los restos estructurales correspondientes. El dominio variable humano con el porcentaje más alto se selecciona para proporcionar las secuencias estructurales para el proyecto de humanización. Queen también enseña que es importante retener en la estructura humanizada determinados restos de aminoácidos de la estructura murina críticos para mantener las CDR en una conformación capacitada para la unión. La criticalidad potencial se evalúa a partir de modelos moleculares. Los restos candidatos para la retención son típicamente los adyacentes en secuencia linear a

25 una CDR o físicamente dentro de 6 Å de cualquier resto de CDR.

En otros enfoques, la criticalidad de restos de aminoácidos estructurales particulares se determina experimentalmente una vez se ha obtenido un constructo humanizado de baja avidez, mediante reversión de restos individuales a la secuencia murina y analizando la unión al antígeno tal como describen Riechmann y col., (1988). Otro ejemplo de enfoque para identificar la criticalidad de aminoácidos en secuencias estructurales se da a conocer en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.821.337 de Carter y col y en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.859.205 de Adair y col. Estas referencias dan a conocer posiciones de restos de Kabat específicas en la estructura, lo que, en un anticuerpo humanizado puede requerir la sustitución por el aminoácido murino correspondiente para conservar la avidez. Una de las desventajas de las mejoras de Queen, y de los

35 enfoques de Ricechmann, Carter y Adair, es que se requiere un número muy elevado de secuencias estructurales humanas para la comparación, y/o las instrucciones para conservar los restos de aminoácidos críticos no son totalmente suficientes para predecir la funcionalidad. En consecuencia, las estructuras resultantes construidas, que son en parte humanas y en parte murinas, muestran frecuentemente, todavía, inmunogenicidad humana o una unión al antígeno más reducida, por lo que se requieren numerosas iteraciones en construcción de estructuras para obtener una estructura adecuada para usos terapéuticos.

Un segundo tipo de mejora a Winter se ejemplifica por Padlan y col. (1995) Identification of specificity-determining residues in antibodies, FASEB J. 9:133-139; y Tamura y col. (2000) Structural correlates of an anti-carcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and Development of a minimally immunogenic

45 antibody variant by retention of SDRs only. J. Immunol. 164:1432-1441. Estas referencias comparten la premisa de que aumentando la proporción de la secuencia característicamente humana en un anticuerpo humanizado se reducirá la inmunogenicidad de dicho anticuepo y, en consecuencia, da a conocer procedimientos para injertar parcialmente secuencias de CDR. La determinación de la estructura de tres dimensiones de complejos anticuerpoantígeno mostró que muchas posiciones de restos asignadas a las CDR definidas por Kabat y Wu raramente estaban implicados directamente en la unión al antígeno. Estas referencias mostraron que el injerto de un subconjunto de restos de CDR se transferiría adecuadamente a la unión al antígeno en un anticuerpo humanizado. No obstante, las secuencias estructurales humanizadas todavía se necesitan, y estas referencias no dan a conocer procedimientos para seleccionar secuencias estructurales humanas adecuadas para su uso con un conjunto dado de CDR de ratón.

55 WU H. Y COL.: 'Humanization of a murine monoclonal antibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues' JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY vol. 294, 1999, páginas 151-162, da a conocer la humanización de un anticuerpo monoclonal murino mediante la optimización simultánea de restos estructurales y de CDR. Los autores generaron fragmentos Fab de anticuerpo que contenían sólo un resto estructural murino. Usando datos estructurales, los autores determinaron qué restos estructurales eran importantes para el mantenimiento de la afinidad de unión del anticuerpo murino y generando una colección combinatoria de variantes fueron capaces, a continuación, de seleccionar anticuerpos muy humanizados y con gran afinidad.

MHASHILKAR A.M. Y COL.: 'Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in vitro in acutely and

65 persistently infected human CD4+ mononuclear cells expressing murine and humanized anti-human immunodeficiency virus type 1 Tat single-chain variable fragment intrabodies 'HUMAN GENE THERAPY vol. 10, 10

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de junio de 1999, páginas 1453-1467, da a conocer intracuerpos ScFv humanizados para tat de VIH. Los fragmentos de anticuerpos se obtuvieron comparando el anticuerpo donante murino con las moléculas aceptoras humanas potenciales y seleccionando el anticuerpo humano de una base de datos de secuencias de VH y VL humanas sobre la base de una alta coincidencia estructural general, longitud de CDR similar y la no coincidencia mínima de restos

5 de contacto de VH/VL canónicas. Por lo tanto, todos los procedimientos de la técnica anterior requieren una comparación de secuencias estructurales.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de procedimientos para humanizar anticuerpos que identifiquen de forma fidedigna las secuencias estructurales humanas adecuadas para dar soporte a las regiones CDR no humanas y proporcionar anticuerpo humanizados que conserven una unión al antígeno alta con poca inmunogenicidad en humanos, sin la necesidad de una comparación directa de secuencias estructurales, sin necesidad de determinar restos de aminoácidos críticamente importantes en la estructura y sin la necesidad de una iteración múltiple en la construcción para obtener anticuerpos humanizados con propiedades terapéuticas adecuadas.

15 Sumario de la invención

La presente invención satisface esta necesidad proporcionando el procedimiento reivindicado en la reivindicación 1. Las realizaciones de la presente invención se reivindican en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona procedimientos para fabricar anticuerpos humanizados de alta afinidad y baja inmunogenicidad sin necesidad de comparar secuencias estructurales entre anticuerpos no humanos y humanos y también describe los anticuerpos humanizados fabricados mediante los mismos. En vez de basarse en secuencias estructurales humanas como punto de análisis, los procedimientos proporcionados en el presente documento se basan en la comparación de tipos de estructura canónica de CDR del anticuerpo no humano con tipos de estructura de CDR de anticuerpos humanos, en particular codificadas por secuencias de línea germinal humana, para identificar secuencias del

25 anticuerpo humano candidato de las que se obtengan estructuras humanas apropiadas.

Más particularmente, se proporciona un procedimiento para fabricar anticuerpos humanizados que incluye las acciones de obtener una secuencia de péptidos para una región variable sujeto codificada por un gen de anticuerpo maduro no humano y de identificar un primer conjunto de tipos de estructuras canónicas de CDR para al menos dos CDR de la región variable del anticuerpo no humano. A continuación, se obtiene también una colección de secuencias de péptidos para regiones variables de anticuerpo humano para anticuerpos humanos. En una realización preferente, la colección contiene secuencias para regiones variables de línea germinal humana codificadas por segmentos de ácidos nucleicos de línea germinal. En otras realizaciones, no obstante, la colección puede incluir secuencias maduras de anticuerpo humano. En cualquier caso, el procedimiento incluye identificar 35 tipos canónicos de estructuras de CDR (es decir, un segundo conjunto de tipos canónicos de estructuras de CDR) para al menos dos CDR para cada secuencia de la colección de secuencias de regiones variables humanas. A partir de esta colección se selecciona un subconjunto de secuencias candidatas comparando el primer conjunto de tipos canónicos de estructuras de CDR con un segundo conjunto de tipos canónicos de estructuras de CDR (es decir, comparando los tipos canónicos de estructuras de CDR con los tipos canónicos de estructuras de CDR en ubicaciones correspondientes dentro de la región variable) y seleccionando aquellas secuencias humanas en las que el segundo conjunto de estructuras canónicas de CDR es el mismo que el primer conjunto de tipos canónicos de estructuras de CDR en las ubicaciones correspondientes dentro de las regiones variables no humanas y humanas, respectivamente. El procedimiento usa estas secuencias de regiones variables humanas candidatas como base para construir una molécula quimérica que incluya al menos dos de las secuencias de CDR de la región variable no

45 humana (por ejemplo, de las CDR de ratón) combinadas con las regiones estructurales de las secuencias de las región variables humanas candidatas. El resultado de la construcción es que el anticuerpo quimérico contiene cada una de las secuencias de las CDR no humanas sustituidas por cada una de las secuencias de las CDR humanas en las ubicaciones correspondientes en las regiones variables de tal modo que las secuencias estructurales del anticuerpo quimérico difieren de las secuencias estructurales humanas candidatas en no más de 10 restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, las secuencias estructurales del anticuerpo quimérico difieren de las secuencias estructurales humanas en no más de 5 restos de aminoácidos. En otras realizaciones, las secuencias estructurales del anticuerpo quimérico difieren de las secuencias estructurales humanas en no más de 2 restos de aminoácidos. En la mayor parte de las realizaciones, el acto de construir la molécula de anticuerpo quimérico incluye construir una secuencia de ácido nucleico que codifique las secuencias del anticuerpo quimérico.

En realizaciones típicas, el procedimiento incluye también ordenar los miembros del subconjunto de secuencias humanas candidatas comparando posición por posición la similitud de los restos de aminoácidos de las secuencias de CDR no humanas con las secuencias de CDR humanas correspondientes de acuerdo con un criterio de clasificación. En determinadas prácticas, el candidato de secuencias humanas incluye sólo el 25 % superior de la clasificación de los miembros. En algunas realizaciones, el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR no humanas y humanas en las posiciones de restos correspondientes de al menos una CDR, o al menos dos CDR, o, del modo más típico, de cada CDR correspondiente. En otras realizaciones, el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR no humanas y humanas en las posiciones de restos correspondientes de al menos una, al menos dos, o de 65 cada CDR correspondiente. En aún otra realización más, el criterio de clasificación incluye un registro de la identidad de aminoácidos y también un registro de la homología de aminoácidos para al menos una, al menos dos o cada una

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de las correspondientes CDR. El procedimiento puede ponerse en práctica usando CDR tal como se definen mediante sistemas diferentes. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las CDR son CDR definidas según Kabat; en otras realizaciones, las CDR son bucles de CDR definidos según Chothia.

5 El procedimiento no está limitado a usar estrictamente las secuencias de CDR exactas de la fuente no humano o las exactas de las estructuras humanas de los conjuntos de miembros. En determinadas realizaciones, el procedimiento puede incluir también la sustitución de al menos un resto de aminoácido de las secuencias de CDR no humanas por un aminoácido diferente, siempre que, no obstante, no se sustituyen más de 4 restos en cualquiera de entre la CDR1 de cadena ligera humana, CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena ligera, CDR1 de cadena pesada o CDR3 de cadena pesada y no se sustituyan más de 10 aminoácidos en la CDR2 de cadena pesada no humana. En otras realizaciones, el procedimiento también puede incluir la sustitución de al menos un resto de aminoácido, pero no más de 10, de la secuencia estructural humana por un resto de aminoácido diferente.

El procedimiento también reconoce que en determinadas ocasiones la región variable no humana puede incluir una

15 secuencia de CDR que tenga un tipo canónico ausente de las regiones variables humanas. En casos en los que cada una de las tres CDR no humanas es una CDR de cadena ligera, si una de las tres secuencias de CDR no humanas es de un tipo canónico de estructura ausente de la colección de secuencias de regiones variables humanas, la actuación de seleccionar las secuencias humanas incluye seleccionar una secuencia de región variable humana con una CDR de un tipo canónico diferente al tipo de CDR no humana ausente en la ubicación correspondiente, con la única condición de que el tipo canónico de CDR humana diferente tenga una longitud de no más de dos restos de aminoácidos mayor o menor que la longitud del tipo canónico de estructura CDR ausente de la CDR no humana. Típicamente, si las secuencias de la CDR ausente no son del tipo 1, la actuación incluye entonces seleccionar una secuencia humana con una CDR del tipo canónico 2 en la ubicación correspondiente, o si la secuencia de CDR no humana es del tipo canónico 5 entonces el acto incluye seleccionar una secuencia humana

25 con una CDR del tipo canónico 4 ó 3 en la ubicación correspondiente.

En la mayor parte de las reivindicaciones, la región variable no humana es una región variable de ratón. De modo similar, en la mayor parte de las reivindicaciones, la colección de secuencias de regiones variables humanas incluye una secuencia Vk Vλ, VH, JH, Jk o Jλ humana como fuente de las estructuras humanas. En la mayor parte de las reivindicaciones, el procedimiento incluye ensamblar un anticuerpo quimérico que tenga tanto una cadena ligera variable quimérica como una cadena pesada variable quimérica, típicamente con estructuras humanas de secuencias Vk y VH. En realizaciones típicas, las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas variables quiméricas están formadas por un fragmento Fab, o una molécula (Fab)'2, o una molécula Fv de cadena simple, o las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas quiméricas están ensambladas con una

35 región constante de anticuerpo humano formando un anticuerpo completo.

Los procedimientos son aplicables a convertir una secuencia de anticuerpo sujeto de cualquier especie sujeto en una forma menos inmunogénica adecuada para su uso en una especie objeto fabricando anticuerpos quiméricos que contienen secuencias estructurales de la especie objeto en combinación con CDR de la especie sujeto. En tales casos, los procedimientos precedentes son los mismos en cuanto a las acciones realizadas, en los que la región variable puede ser de cualquier especie sujeto y la región variable objeto puede ser de cualquier especie objeto para la que se use el anticuerpo. De este modo, por ejemplo, en varias realizaciones, un anticuerpo sujeto puede quimerizarse con secuencias estructurales de fuentes bovinas, porcinas, murinas o equinas para formar un anticuerpo bovinizado, porcinizado, murinizado o equinizado, respectivamente.

45 Las composiciones pueden fabricarse de modo que incluyan las moléculas de anticuerpo quimérico fabricadas de acuerdo con los procedimientos desvelados. Los procedimientos de la presente invención proporcionan un anticuerpo humanizado que incluye una región variable de anticuerpo quimérica que contiene al menos dos secuencias de CDR no humanas condensadas adyacentes a la secuencia estructural de la región variable humana. Las secuencias estructurales humanas se seleccionan a partir de un subconjunto de secuencias estructurales caracterizadas por tener no más de 10 restos de aminoácidos que difieren de una secuencia estructural en una región variable de anticuerpo humano que tiene al menos dos secuencias de CDR humana con el mismo tipo canónico de estructura que las secuencias de CDR no humanas para al menos dos posiciones de CDR correspondientes entre la región variable del anticuerpo quimérico y del anticuerpo humano.

55 Las CDR de regiones variables no humanas son típicamente de ratón. La secuencia de región variable humana es típicamente una secuencia Vk, Vλ, VH, JH, Jko Jλ. Del modo más típico, el anticuerpo quimérico incluye secuencias de anticuerpo quimérico para una cadena ligera variable y una cadena pesada variable. Más típicamente, las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas variables quiméricas están formadas por un fragmento Fab, o una molécular (Fab)'2, o una molécula Fv de cadena simple, o las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas quiméricas están ensambladas con una región constante de anticuerpo humano formando un anticuerpo completo. Del modo más típico, la secuencia de la región variable humana es una secuencia de un fragmento de región variable de línea germinal humana. Además, la secuencia de regiones variables humanas puede ser una secuencia de un anticuerpo maduro humano.

65 Preferentemente, el anticuerpo humanizado tiene una constante de disociación para su antígeno de al menos106 M

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M-1 M-1

1, más preferentemente de al menos 107 y aún más preferentemente de al menos 108 . Típicamente, el anticuerpo humanizado no provoca una respuesta inmunitaria cuando se administra a un ser humano. Realizaciones particulares incluyen anticuerpos humanizados que se unen a antígeno de veneno de escorpión, que se unen al receptor CD28 humano, que se unen a lisozimas humanos o que se unen a ácido glutámico-descarboxilasa

5 (GAD65) humana.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa una colección de segmentos génicos de VH de línea germinal humana.

La figura 2 representa una colección de segmentos génicos de Vk de línea germinal humana.

La figura 3 representa una porción de secuencia de cadena ligera variable de anticuerpo de D1.3 (lisozoma antipollo) murino y un subconjunto seleccionado de las secuencias de región variable de Vk de línea germinal

15 humana que tienen CDR canónicas del mismo tipo que la secuencia de cadena ligera de DL.3 de ratón en las ubicaciones correspondientes. El subconjunto está clasificado por similitud de secuencias de aminoácidos entre las CDR de DL.3 y las CDR humanas, con la secuencia clasificada como superior representada en primer lugar.

La figura 4 representa una porción de secuencia de cadena pesada variable de anticuerpo D1.3 de ratón y un subconjunto seleccionado de secuencias de regiones variables de VH de línea germinal humana que tiene CDR canónicas del mismo tipo que el DL.3. El subconjunto está clasificado por similitud de secuencias de aminoácido de las CDR correspondientes de forma análoga a la figura 3.

25 La figura 5 representa secuencias de aminoácidos para una región variable de Vk quimérica y una región variable de VH para un anticuerpo D1.3 humanizado, que ilustra un aspecto de la invención.

La figura 6 representa una secuencia de ácido nucleico para un constructo de ADN que codifica (y expresa) el anticuerpo D1.3 quimérico humanizado de la figura 5, que ilustra otro aspecto de la invención.

La figura 7 es un gráfico que ilustra la unión de antígeno al anticuerpo D1.3 humanizado, que tiene una constante de afinidad superior a 108 M-1, que ilustra una realización de la invención.

La figura 8 representa una porción de una secuencia de cadena ligera variable de ratón de un anticuerpo CD28

35 antihumano denominado 9.3 y un subconjunto seleccionado de secuencias de regiones variables de Vk de línea germinal humana que tiene CDR canónicas del mismo tipo que la secuencia de cadena ligera variable 9.3 de ratón en las ubicaciones correspondientes, que están clasificadas por similitud de secuencias de aminoácidos de forma análoga a la figura 3.

La figura 9 representa una porción de la secuencia de cadena pesada variable de ratón para el anticuerpo 9.3 y un subconjunto seleccionado de secuencias de región variable de línea germinal VH humana que tiene CDR canónicas del mismo tipo que la secuencia de cadena pesada variable de ratón en ubicaciones correspondientes ordenadas también por similitud de secuencias de aminoácidos.

45 La figura 10 representa un fragmento FAb de CD28 (Hu.9.3) antihumano con cadenas ligeras variables y pesadas variables quiméricas que ilustra otra realización de la invención.

La figura 11 es un gráfico que ilustra la unión de antígeno al fragmento Fab de Hu9.3, que tiene una constante de afinidad superior a 106 M-1, que ilustra una realización de la invención.

La figura 12 representa un fragmento Fab de toxina antiescorpión humanizado con cadenas ligeras variables y pesadas variables quiméricas que ilustra otra realización de la invención.

La figura 13 representa un fragmento FAb de ácido glutámico-descarboxilasa (GAD65) antihumano con 55 cadenas ligeras variables y pesadas variables quiméricas que ilustra otra realización de la invención.

La figura 14 es un gráfico que ilustra la unión de antígeno al fragmento Fab antiGAD65 humanizado, que tiene una constante de afinidad superior a 1011 M-1, que ilustra una realización de la invención.

Descripción detallada de la invención

En la descripción siguiente, se realiza una mención a varias referencias que pueden ayudar a un experto en la técnica a comprender y a poner en práctica la invención en su extensión más completa. Por lo tanto, cada referencia que se cita en la descripción en adelante se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Para

65 ayudar a entender mejor varias realizaciones de la invención puede ser útil explicar el significado de determinados términos que se usan en el presente documento.

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Un "gen de anticuerpo maduro" es una secuencia genética que codifica una inmunoglobulina que se expresa, por ejemplo, en un linfocito tal como un linfocito B, en un hibridoma o en cualquier célula productora de anticuerpos que ha experimentado un proceso de maduración de tal modo que se expresa la inmunoglobulina particular. El término 5 incluye la secuencia genómica madura, de ADNc o de otro ácido nucleico que codifique dichos genes maduros que haya sido aislada y/o diseñada recombinantemente para la expresión en otros tipos de células. Los genes de anticuerpo maduro han experimentado varias mutaciones y reordenamientos que los distinguen estructuralmente de genes de anticuerpo codificados en todas las células distintas a los linfocitos. Los genes de anticuerpo maduro en seres humanos, roedores y muchos otros mamíferos se forman mediante fusión de segmentos génicos V y J en el

10 caso de cadenas ligeras de anticuerpos de genes V, D y J en el caso de cadenas pesadas de anticuerpos. Muchos genes de anticuerpo maduro adquieren mutaciones puntuales después de la fusión, algunos de los cuales aumentan la afinidad de la proteína del anticuerpo por un antígeno específico.

"Genes de anticuerpo de línea germinal" o fragmentos génicos son secuencias de inmunoglobulina codificadas por

15 células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce a reordenamiento genético y mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular. Una de las ventajas proporcionadas por varias realizaciones de la presente invención se deriva del reconocimiento de que los genes de anticuerpo de línea germinal es más probable que conserven estructuras de secuencias de aminoácidos esenciales características de individuos de la especie animal que los genes de anticuerpos maduros, por lo que es menos probable que se

20 reconozcan como de una fuente extraña cuando se usan terapéuticamente en esas especies. La figura 1 y la figura 2 muestran secuencias de péptidos para genes de anticuerpos de líneas germinales humanas que codifican anticuerpos de región pesada variable (VH) y de región ligera variable (Vk) humana (por ejemplo, inmunoglobulinas). Cada una de estas listas de secuencias ejemplifica una colección de genes de anticuerpos humanos, en particular una colección de genes de anticuerpos de línea germinal humana.

25 "Una CDR" es la región determinante de la complementariedad dentro de secuencias variables de un anticuerpo. Existen tres CDR en cada una de las secuencias pesadas variables y ligeras denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Los límites exactos de estas CDR se han definido de forma diferente según sistemas diferentes, no obstante, todos tienen restos superpuestos en los que se constituyen las denominadas

30 “regiones hipervariables” dentro de secuencias variables. El sistema descrito por Kabat (CITE) no sólo proporciona un sistema de numeración de restos no ambiguo que puede aplicarse a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de restos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y sus colaboradores (CITE) descubrieron que determinadas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de esqueleto de péptidos casi idénticas, a pesar de tener una gran

35 diversidad en los niveles de la secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se denominaron L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3, denominando "L" y "H" las regiones de cadena ligera y de cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR de Chothia, que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. La tabla I ilustra el solapamiento de CDR de Chotia y de Kabat de acuerdo con el sistema de numeración de restos de Kabat.

40 TABLA I

Cadena

CDR Kabat Chotia

Ligera

CDR1 24 -34 26 -32

"

CDR2 50 -56 50 -52

"

CDR3 89 -96 91 -96

Pesada

CDR1 31 -35 26 -32

"

CDR2 50 -65 52 -56

"

CDR3 95 -102 no definida de forma única

Otros límites que definen CDR que se solapan con CDR de Kabat se han descrito por Padlan (1995) o MacCallum (1996). Otras definiciones más de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas anteriores, 45 pero, sin embargo, se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse mediante la predicción o los hallazgos experimentales de que restos particulares o grupos de restos o incluso CDR enteras no influyen significativamente en la unión al antígeno. Los procedimientos que se usan en el presente documento usan CDR definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque realizaciones preferentes usan CDR definidas por Kabat

o Clothia.

50 "Estructura" o "secuencia estructural" son las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse por medio de sistemas diferentes, el significado de un secuencia estructural es sujeto de interpretaciones correspondientemente diferentes. Para aclarar el significado que se usa en el presente documento, una secuencia estructural significa las secuencias de una región

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variable de un anticuerpo diferentes de las definidas como secuencias CDR, de tal modo que la secuencia exacta de una estructura depende sólo de como se define la CDR. Por ejemplo, las CDR que se usan en los procedimientos que se proporcionan en el presente documento son generalmente un subconjunto de lo que se considera una CDR de Kabat, pero en el caso de la CDR1 de cadenas pesadas, por ejemplo, también incluye restos que están

5 clasificados como restos estructurales en el sistema de Kabat.

"Tipos canónicos de estructura de CDR" son los tipos estructurales designados por Chothia (CITE). Chothia y sus colaboradores descubrieron que porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos adoptan conformaciones de esqueleto de péptidos casi idénticas, a pesar de tener una gran diversidad en los niveles de la secuencia de

10 aminoácidos. En consecuencia, Chothia definió para cada CDR en cada cadena una o unas pocas “estructuras canónicas". Cada estructura canonica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión de esqueleto peptídico para un segmento contiguo de restos de aminoácidos formando un bucle. Los tipos canónicos de estructura de CDR definidos por Chothia se enumeran en la tabla II.

15 TABLA II:

Cadena

CDR Tipos canónicos de estructura

Kappa

CDR1 1 -6

"

CDR2 1

"

CDR3 1 -6

Pesada

CDR1 1 -3

"

CDR2 1 -4

Lambda

CDR1 1 -4

Lambda

CDR2 1

"

CDR3 1 -2

"CDR de correspondencia" se refiere relativamente a las CDR entre dos secuencias variables diferentes que se corresponden en posición dentro de dos secuencias variables diferentes. De este modo, por ejemplo, una CDR1 de

20 cadena ligera de ratón se corresponde con una CDR1 de cadena ligera humana y viceversa, debido a que cada una cartografía una posición definida en el sistema de numeración de Kabat, estando el límite real de la CDR definido o no por Kabat, Chothia o algún otro sistema. De modo similar, restos, secuencias o aminoácidos “de correspondencia” se refiere relativamente a las posiciones de los restos entre dos secuencias de péptidos diferentes cartografiadas por el sistema de numeración de Kabat.

25 El objetivo de los procedimientos que se proporcionan en el presente documento, que pueden denominarse procedimiento de injerto de CDR, es proporcionar una indicación para lograr una secuencia estructural humana apropiada para la humanización de un anticuerpo no humano sujeto. En todos los procedimiento de injerto de CDR previos, la elección de la secuencia estructural humanizada se basa en la comparación de la estructura humana con

30 las estructuras sujeto (murinas). Por el contrario, la base de los procedimientos que se describen en el presente documento son para seleccionar el anticuerpo humano para proporcionar la estructura humanizada basada en la similitud de sus CDR con las del anticuerpo sujeto, sin tener en cuenta la comparación de las secuencias estructurales entre los dos anticuerpos.

35 La similitud de las CDR sujeto de secuencias de anticuerpo humano candidato se evalúa para cada dominio en dos niveles. En primer lugar, se buscan conformaciones tridimensionales idénticas de esqueletos peptídicos. Los coordinados atómicos determinados experimentalmente de las CDR sujeto están disponibles raramente, por lo que la similitud tridimensional se aproxima determinando tipos canónicos de estructura de Chothia de las CDR sujeto y excluyendo de posteriores consideraciones candidatos que poseen estructuras canónicas diferentes. En segundo

40 lugar se considera la homología resto a resto entre las CDR sujeto y las CDR candidatas humanas restantes, y se elige el candidato con la homología más alta.

La elección de homología más alta se basa en diversos criterios que se usan para clasificar las regiones variables humanas candidatas que tienen la misma estructura canónica como las regiones variables humanas sujeto. Los 45 criterios de clasificación de los miembros del conjunto seleccionado pueden ser por identidad de secuencia de aminoácidos u homología de aminoácidos o ambas. La identidad de aminoácidos es simplemente un registro de la posición mediante similitudes de posición de restos de aminoácidos. La similitud por homología de aminoácidos es la similitud posición a posición en estructura de carácter de restos. La homología puede registrarse, por ejemplo, de acuerdo con las tablas y procedimientos descritos por Henikoff y Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices

50 from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci 89: 10915-10919, o por la serie BLOSUM descrita por Henikoff y Henikoff, (1996).

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Las etapas de los procedimientos son las siguientes:

Determinar las secuencias de péptidos de los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo

5 sujeto. Éstas pueden determinarse mediante cualquiera de entre varios procedimientos, tales como la secuenciación de los genes respectivos después de una clonación de ADNc convencional, secuenciación de ADN de productos de clonación que se han amplificado por medio de la reacción en cadena de la polimerasa a partir de transcriptos inversos o ADN de la línea de hibridoma sujeto, o secuenciación de péptidos de una proteína de anticuerpo purificada.

10 Aplicar el sistema de numeración de Kabat (Kabat y col., 1991) a las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo no humano sujeto.

Determinar los tipos canónicos de estructura para cada una de las CDR del anticuerpo no humano sujeto. Esta

15 determinación se realiza a partir del examen de la secuencia de péptidos siguiendo las directrices expuestas por Chothia y Lesk (1987), Chothia y col. (1992), Tomlinson y col. (1995), Martin y Thornton (1996) y Al-Lazikani y col. (1997). Los aspectos notables de la determinación de estructuras canónicas para cada una de las CDR son los siguientes.

20 Para la CDR1 de cadena pesada, se conocen actualmente tres tipos canónicos de estructura. La asignación de una secuencia nueva es sencilla debido a que cada tipo canónico de estructura tiene un número diferente de restos. Tal como se describe en Al-Lazikani y col. (1997), cuando se asigna la numeración de Kabat a la secuencia, la numeración para los restos 31 -35 será como sigue para las estructuras canónicas respectivas.

25 Estructura canónica de tipo 1: 31, 32, 33, 34, 35. Estructura canónica de tipo 2: 31, 32, 33, 34, 35, 35a. Estructura canónica de tipo 3: 31, 32, 33, 34, 35, 35a, 35b.

Para la CDR2 de cadena pesada, se conocen actualmente cuatro tipos canónicos de estructura. Muchas tienen

30 números únicos de restos, y se distinguen fácilmente por su numeración de Kabat única de posiciones 52 -56, es decir:

Estructura canónica de tipo 1: 52, 53, 54, 55, 56. Estructura canónica de tipo 4: 52, 52a, 52b, 52c, 53, 54, 55, 56.

35 Los tipos 2 y 3 de estructuras canónicas para la CDR2 de cadena pesada tienen el mismo número de restos, por lo que deben distinguirse por indicios dentro de sus secuencias, tal como se expone por Chothia y col. (1992). La numeración de Kabat del segmento que contiene estos indicios es: 52, 52a, 53, 54, 55. La estructura canonical de tipo 2 tiene Pro o Ser en posición 52a y Gly o Ser en posición 55, con ninguna restricción en las otras posiciones. El

40 tipo 3 de estructura canonical tiene Gly, Ser, Asn, o Asp en la posición 54, con ninguna restricción en las otras posiciones. Estos criterios son suficientes para resolver la asignación correcta en la mayor parte de los casos. Adicionalmente, el resto estructural 71 es comúnmente Ala, Val, Leu, Ile o Thr para el tipo 2 de estructura canónica y comúnmente Arg para el tipo 3 de estructura canónica.

45 La CDR3 de cadena pesada es la mas diversa de todas las CDR. Se genera mediante procesos genéticos, algunas de naturaleza aleatoria, únicas para linfocitos. En consecuencia, las estructuras canónicas para la CDR3 han sido difíciles de predecir. En algunos casos, los segmentos génicos V de línea germinal humana no codifican ninguna parte de la CDR3, debido a que los segmentos finalizan en la posición de Kabat 94, mientras que las posiciones 95 a 102 codifican la CDR3. Por estas razones, las estructuras canónicas de CDR3 no se consideran para elegir

50 secuencias humanas candidatas.

Para CDR1 de cadena ligera, se conocen actualmente seis tipos de estructura canónica para CDR1 en cadenas kappa. Cada tipo de estructura canonical tiene un número diferente de restos, por lo que las asignaciones de una tipo de estructura canónica a una secuencia nueva es aparente a partir de la numeración de Kabat de las posiciones

55 de restos 27 -31.

Estructura canónica de tipo 1: 27, 29, 30, 31. Estructura canónica de tipo 2: 27,28,29,30, 31. Estructura canónica de tipo 3: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 27f, 28, 29, 30, 31.

60 Estructura canónica de tipo 4: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 28, 29, 30, 31. Estructura canónica de tipo 5: 27, 27a, 27b, 27c, 27d, 28, 29, 30, 31. Estructura canónica de tipo 6: 27, 27a, 28, 29, 30, 31.

Para la CDR2 de cadena ligera, sólo se conoce un único tipo de estructura canónica para CDR2 en cadenas capa, 65 por lo que, con la excepción de secuencias de anticuerpo sujeto excepcionales, la asignación es automática

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Para la CDR3 de cadena ligera, se han descrito hasta seis tipos de estructura canónica para CDR3 en cadenas kappa, pero tres de ellas son raras. Las tres comunes pueden distinguirse por su longitud, reflejada en la numeración de Kabat de las posiciones de restos 91 -97:

5 Estructura canónica de tipo 1: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 (también con una Pro obligatoria en la posición 95 y Gln, Asn o His en la posición 90). Estructura canónica de tipo 3: 91, 92, 93, 94, 95, 97. Estructura canónica de tipo 5: 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96a, 97.

10 Después de identificar los tipos canónicos de estructura de CDR del anticuerpo no humano sujeto, los genes humanos del mismo tipo de cadena (pesada o ligera) que tienen la misma combinación de tipos de estructura canónica que el anticuerpo sujeto se identifican para formar un conjunto candidato de secuencias humanas. En realizaciones preferentes sólo se consideran para la comparación las secuencias de péptidos de fragmentos génicos VH y Vk de inmunoglobulina de línea germinal humana. La mayor parte de estos fragmentos génicos han sido

15 descubiertos y han sido asignados a un tipo de estructura canónica (Chothia y col., 1992, Tomlinson y col., 1995). Entre las secuencias enumeradas en la figura 1 y en la figura 2 aparecen fragmentos génicos V adicionales no dados a conocer por estas referencias y que se proporcionan en el presente documento. Para la cadena pesada, se evalúa la conformidad de la CDR1 y la CDR2 con los tipos de estructura canónica de ratón, y se excluyen los genes que no conforman. Para la cadena ligera, se evalúa primeramente la conformidad de la CDR1 y la CDR2 de cada

20 secuencia humana con los tipos de estructura canónica del anticuerpo sujeto. El potencial de restos 89-95 de un gen Vk candidato para formar una CDR3 del mismo tipo de estructura canónica que el anticuerpo sujeto se evalúa situando una fusión del gen con una región J y aplicando criterios para la determinación del tipo de estructura de CDR canónica para la CDR3 con la secuencia fusionada y se excluyen las secuencias de no conformidad.

25 En otra realización, apropiada cuando un dominio variable de un anticuerpo sujeto es de un tipo de estructura canónica no disponible en el genoma humano, se consideran para la comparación genes V de línea germinal humana que tienen similar tridimensionalidad, pero no idéntica, los tipos de estructura de estructura canónica. Dicha circunstancia ocurre a menudo con la CDR1 de cadena kappa en anticuerpo murinos, incluidos dos de los ejemplos descritos más adelante. Todos los 6 tipos de estructura canónica posibles se han observado en esta CDR en

30 anticuerpos murinos, mientras que el genoma humano codifica sólo los tipos canónicos 2, 3, 4 y 6. En estas circunstancias, un tipo de estructura de CDR canónico que tiene una longitud de restos de aminoácidos puede seleccionarse para la comparación de entre dos de la longitud de los restos de aminoácidos de la secuencia no humana sujeto. Por ejemplo, cuando un tipo 1 de estructura canónica se encuentra en el anticuerpo sujeto, deberían usarse para la comparación las secuencias Vk humanas con el tipo 2 de estructura canónica. Por ejemplo, cuando

35 un tipo 5 de estructura canonical se encuentra en el anticuerpo murino, deberían usarse para la comparación las secuencias Vk humanas con el tipo 3 ó 4 de estructura canónica.

En otra realización, pueden considerarse para la comparación de secuencias secuencias de anticuerpo humano reordenado maduro. Dicha consideración puede garantizarse en una variedad de circunstancias, incluidas pero no

40 limitadas a instancias en las que la secuencia humana madura (1) es muy cercana a la línea germinal, (2) se sabe que no es inmunogénica en humanos; o (3) contiene un tipo de estructura canónica idéntico al del anticuerpo sujeto, pero no se encuentra en la línea germinal humana.

En realizaciones preferentes, para cada uno de los genes V candidatos con tipos de estructura canónica similares, la

45 identidad de secuencias resto y/o la homología con la secuencia sujeto se evalúan también para clasificar las secuencias humanas candidatas. En una realización específica, los restos evaluados son tal como sigue:

Cadena

CDR Posiciones de restos

Kappa

1 26 -32

"

2 50 -52

"

3 91 -96

Pesada 1

1 31 -35

"

2 50 -60

50 En realizaciones preferentes, la homología resto a resto se registra primeramente por el número de restos de aminoácidos idénticos entre el sujeto y las secuencias humanas candidatas. La secuencia humana que se usa para la construcción subsiguiente de un anticuerpo convertido se elige de entre el 25 por ciento de los candidatos con los mayores registros. En otras realizaciones, apropiadas cuando las secuencias candidatas tienen registros similares de identidad, puede considerarse adicionalmente la similitud entre restos de aminoácidos no idénticos. Las

55 coincidencias alifático con alifático, aromático con aromático, o polar con polar entre restos sujeto y objeto se añaden a los registros. En otra realización, la evaluación cuantitativa de homología de secuencia puede realizarse

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usando matrices de sustitución de aminoácidos tales como la matriz BLOSUM62 de Henikoff y Henikoff (1992).

Una secuencia objeto para el extremo C terminal de la región estructural para la secuencia de la CDR3 se selecciona a partir del conjunto de segmentos J de línea germinal humana conocidos. Una secuencia de péptidos J

5 preferente se selecciona evaluando la homología resto a resto para cada segmento J para posiciones de secuencia para las que se solapan CDR3 y J, usando los criterios de registro especificados para la evaluación de genes candidatos V tal como se ha mencionado anteriormente. La secuencia de péptidos de segmento génico J que se usa para la construcción subsiguiente de un anticuerpo convertido se elige de entre el 25 por ciento de los candidatos con los registros superiores.

10 En una realización, la cadena variable quimérica contiene al menos dos CDR de la secuencia no humana sujeto, y secuencias estructurales de la secuencia humana candidata. En otras realizaciones, la cadena ligera quimérica contiene al menos tres CDR de la secuencia no humana sujeto, y secuencias estructurales de la secuencia humana candidata. En otras realizaciones, una cadena pesada quimérica contiene al menos dos CDR de la cadena pesada

15 sujeto y secuencias estructurales de la cadena pesada humana candidata. En otra realización, una cadena pesada quimérica contiene al menos dos CDR de la cadena pesada sujeto y las secuencias estructurales de la cadena pesada humana candidata. En otra realización, una cadena pesada de anticuerpo quimérico contiene las CDR 1 y 2 de la secuencia humana no sujeto y los restos 50-60 para CDR3 y los restos 61-65 de una CDR de la cadena pesada human, además de las secuencias estructurales de la secuencia humana candidata. En otra realización, una

20 secuencia de cadena pesada quimérica contiene cada una de las CDR de la secuencia no humana sujeto, secuencias estructurales 27-30 de la secuencia sujeto y las secuencias estructurales de las secuencias candidatas. En todos los casos, no obstante, la molécula de anticuerpo quimérico contiene no más de 10 restos de aminoácidos en la secuencia estructural que difieren de los de la secuencia estructural de la región variable humana candidata.

25 En otra realización, apropiada cuando se desea un aumento de la afinidad de un anticuerpo humanizado, pueden sustituirse adicionalmente restos de de la CDR de un anticuerpo convertido por otros aminoácidos. Típicamente, no se cambian más de cuatro restos de aminoácidos de una CDR y, del modo más típico, no se cambiarán más de dos restos de la CDR, excepto para la CDR2 de cadena pesada, en la que pueden cambiarse hasta 10 restos. De modo similar, en determinadas realizaciones, pueden cambiarse algunos de los aminoácidos de las secuencias

30 estructurales. En todas las realizaciones, no se cambian más de 10 restos de aminoácidos.

La secuencia de anticuerpo humanizada se ensambla a continuación físicamente mediante procedimientos de síntesis génica y de expresión de proteínas recombinantes conocidos por los expertos en la técnica. La forma final de las secuencias humanizadas que tienen las cadenas variables quiméricas fabricadas mediante los 35 procedimientos divulgados en el presente documento puede tomar varias formas. Del modo más típico, los anticuerpos quiméricos se fabricarán mediante la construcción de una secuencia de ácido nucleico que codifique las cadenas variables quiméricas, que se expresan recombinantemente en un tipo de célula adecuado. Una de las formas más típicas de los anticuerpo quiméricos será un fragmento de anticuerpo Fab. Otras formas adecuadas del anticuerpo quimérico incluyen la molécula (Fab)'2 o una molécula Fv de cadena sencilla. Otras formas más pueden

40 incluir además la fusión dando dominios constantes de un anticuerpo humanoo para formar un anticuerpo completo. En realizaciones preferentes, las cadenas variables ligera y pesada se humanizan. No obstante, en otra realización, las cadenas ligera y pesada variables pueden ser mixtas, es decir, con una cadena variable de ratón completa (o la pesada o la ligera), siendo la otra una cadena variable humanizada.

45 En la mayor parte de las reivindicaciones, el procedimiento incluirá el cribado de anticuerpo quiméricos candidatos para seleccionar los que tengan una constante de disociación por el antígeno adecuada para el uso pretendido. En la mayor parte de las realizaciones, el anticuerpo humanizado fabricado de acuerdo con estos procedimientos tendrá una constante de disociación de al menos aproximadamente 106 M-1, al menos aproximadamente 107 M-1 o al menos aproximadamente 108 M-1. Una Kd de al menos aproximadamente 108 M-1 es preferente para la mayor parte de los

50 usos terapéuticos.

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención mostrando realizaciones específicas para anticuerpo humanizados que se unen a tipos diferentes de antígenos con fines de ilustración. Un experto en la técnica entenderá que pueden crearse muchas otras realizaciones específicas usando los procedimientos dados a conocer

55 en el presente documento y que la presente invención no está limitada por los ejemplos específicos.

Ejemplo 1

Lisozima antipollo humanizada

60 El anticuerpo D1.3 de ratón se une a un antígeno lisozima de pollo. La secuencia de péptidos de los dominios variables de D1.3 se obtuvo del Banco de datos de proteínas, número de acceso 1VFA. La cadena ligera se numeró de acuerdo con Kabat y a las CDR de ratón se les asignaron tipos de estructura canónica tal como sigue:

65 La CDR1 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia:

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Debido a que no hay inserciones ni deleciones entre los restos 27 y 31, la CDR1 tiene una estructura canónica de tipo 2.

La CDR2 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia:

Ésta no es una secuencia excepcional, su tipo de estructura canónica es el tipo 1. La CDR3 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia:

15 Debido a la longitud y a la Pro en la posición 95, está secuencia es consecuente con la estructura canónica de tipo 1.

En la compilación de la figura 2 y en Tomlinson y col. (1995), 21 genes Vk de línea germinal humana no redundante

20 codifican (1) la CDR1 con el tipo 2 de estructura canónica, (2) la CDR2 con el tipo 1 de estructura canónica y (3) una secuencia con el potencial para formar el tipo 1 de estructura canónica en la CDR3. Están enumeradas en la figura 3 en la secuencia Vk de D1.3. Sus secuencias en ls posiciones de los restos que comprenden los tipos de estructura canonical de Chothia también se proporcionan, y los genes Vk humanos en la figura 3 se estratifican según el número de identidades resto a resto en estas secuencias. La L23 tiene 7 identidades, mientras que las tres entradas

25 siguientes de la lista tienen 6. Además, la L23 ha conservado las posiciones de restos 91 y 92, dentro de la CDR3, de nuevo superiores a las siguientes tres candidatas. La L23, por lo tanto, se elige para la construcción de humanización.

Entre los segmentos Jk humanos de la figura 3, ninguno coincide con la Arg en D1.3 en la posición 96, y todos son

30 idénticos en las tres posiciones siguientes. El Jk4, que replica el motivo GGG en D1.3 en las posiciones 99-101, es el que mejor coincide para el segmento J y se usa para la construcción de humanización.

El dominio variable de cadena pesada de D1.3 se numeró según Kabat, tal como muestra la figura 4. A las CDR se les asignaron tipos de estructura canónica tal como sigue.

35 La secuencia en la región de cadena pesada CDR1 es

40 Esta secuencia carece de residuos insertados, por lo que se le asigna una estructura canónica de tipo 1. La CDR2 de Kabat de D1.3 tiene la secuencia

45 Debido a que no hay inserciones entre los restos 52 y 56, a la CDR2 se le asigna una estructura canónica de tipo 1. Los genes VH de línea germinal humana que se ha predicho que tienen una estructura canónica de tipo 1 en la CDR1 y una estructura canónica de tipo 1 en la CDR2 están tomadas de Chothia y col. (1992) y la figura 1, y se enumeran en la figura 4.

50 Los segmentos elegidos para la evaluación de homología fueron 27 -35, correspondientes a la CDR1 de Kabat más los restos adicionales que forman la estructura canónica de Chothia, y 50 -60, correspondientes a la CDR2 de Kabat

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menos los restos 61 -65, que raramente participan directamente en la unión al antígeno. Las dos primeras entradas tienen 8 identidades en estos segmentos cuando se comparan con la secuencia de ratón, y las cinco siguientes tienen 7 identidades. El 25 % principal de entradas en la clasificación de similitud son, de este modo, los dos genes con 8 identidades y cualquiera de éstas con siete. Aunque cualquiera de estos siete genes serían candidatos

5 adecuados para una construcción de humanización, muchos son preferentes debido a la conservación en restos no idénticos. Tres que tienen Glu o Arg reemplazando a Met en el resto 50 están excluidas debido a que el soterramiento de una cadena lateral cargada en el medio de un segmento hidrófobo es probable que proporcione una estructura tridimensional alterada. De este modo, el V71-4 se eligió a partir de las cuatro restantes.

El JH4 es claramente el que mejor coincide con el extremo C terminal de CDR3.

Se diseñó el anticuerpo humanizado quimérico combinando las CDR de Kabat de D1.3 con las estructuras de Kabat codificadas por V71-4, JH4, L23 y Jk4. Las secuencias de los dominios variables de cadena pesada y ligera de este anticuerpo se muestran en la figura 5.

15 Los genes de dominio variable sintético que codifican los Vk y VH se prepararon a partir de oligonucleótidos oligoméricos mediante el procedimiento de Ye y col. (1992), incorporado al presente documento como referencia. Estos genes se tranfirieron a continuación al vector de expresión pAK19 de Fab, descrito por Carter y col. (1992), incorporado al presente documento como referencia. Las secuencias de ADN de los genes sintéticos y del casete de expresión de pAK19 de Fab se muestran en la figura 6. el Fab recombinante se expresó en E. coli, se liberó desde el periplasma por choque osmótico y se purifican mediante cromatografía en lisozima sefarosa.

La afinidad de SHuD1.3 por el lisozima se determinó mediante el procedimiento de inactivación por fluorescencia descrito por Foote y Winter (1992). El procedimiento se basa en cambios en la fluorescencia de triptofano intrínseca

25 del anticuerpo y antígeno después de la formación de complejo. En el experimento de la figura 7, se valoró Fab de D1.3 humanizado 200 nM con pequeñas partes alícuotas de una solución de lisozima concentrada. Los datos de fluorescencia se ajustaron en al menos los cuadrados con la ecuación de valoración para obtener un valor y el error típico para la constante de disociación, 23 ± 5 nM. Por comparación, el Kd de D1.3 IgG se sabe que tiene una Kd de 4 nM (Foote y Winter, 1992). De este modo, el anticuerpo humanizado del Ejemplo 1 tiene una especificidad antigénica idéntica al anticuerpo de ratón sujeto y se une al antígeno con una afinidad disminuida en menos que un factor de 6 con relación al anticuerpo sujeto.

Ejemplo 2

35 CD28 Antihumano humanizado

El anticuerpo CD28 antihumano de ratón designado 9.3 se usó como anticuerpo sujeto no humano. La línea de hibridoma de 9.3 de ratón se aisló y se describe por Hansen y col. (1980).

Los genes de las regiones de cadena pesada y ligera de 9.3 se clonaron mediante transcripción inversa y la reacción en cadena de la polimerasa, comenzando con el ARN mensajero que ha sido aislado por un procedimiento de isotiocianato de guanidinio (Chomczynski y Sacchi, 1987) seguido de cromatografía en columnas oligo dT. La amplificación se realizó usando oligonucleótidos complementarios con la región constante y los oligonucleótidos correspondientes a las regiones del péptido señal o secuencia estructural N-terminal.

45 La cadena ligera se enumeró según Kabat, y a las CDR se les asignaron tipos de estructura canónica tal como sigue, con referencia a la figura 8.

La CDR1 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia

Debido a los restos insertados entre 27 y 31, la CDR1 tiene una estructura canónica de tipo S. 55 La CDR2 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia

Ésta no es una secuencia excepcional, su estructura canónica es de tipo 1. La CDR3 de cadena ligera, numerada según Kabat, consiste en la secuencia

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Debido a la longitud y a la Pro en la posición 95, está secuencia es consecuente con la estructura canónica de tipo

5 1.

Las secuencias Vk con estructura canónica de tipo 5 en la CDR1 no están representadas en la línea germinal humana, pero las estructuras 3 y 4 semejan estructuras canónicas de tipo 5, y se consideran posteriormente.

10 En la compilación de la figura 2 ocho genes Vk de línea germinal humana no redundante codifican (1) la CDR1 con el tipo 3 ó 4 de estructura canónica, (3) la CDR2 con el tipo 1 de estructura canónica y (3) una secuencia con el potencial para formar el tipo 1 de estructura canónica en la CDR3. Están enumeradas en la figura 8 en la secuencia Vk de 9.3. También se proporciona su secuencia en la CDR de Kabat. Los genes Vk humanos en la figura 3 están clasificados según el número de identidades resto a resto en las posiciones de restos que forman la estructura

15 canónica de Chothia. El gen B3 tiene 7 identidades en esta posición, mientras que los tres siguientes en la lista tienen 5, por lo que se eligió B3 para la construcción de humanización. Habiendo basado el registro en las posiciones de CDR de Kabat más que en las de Chothia, el B3 sería todavía un candidato principal. El resto de Tyr que codifica en 5' del Jk2 humano coincide con la posición correspondiente de 9.3 exactamente, por lo que se usó este fragmento de línea germinal.

20 El dominio variable de cadena pesada de 9.3 se numeró según Kabat, tal como muestra la figura 9. A las CDR se les asignaron tipos de estructura canónica tal como sigue.

La secuencia en la región de cadena pesada CDR1 es 25

Esta secuencia carece de residuos insertados, por lo que se le asigna una estructura canónica de tipo 1. 30 La CDR2 de Kabat de 9.3 tiene la secuencia

Debido a que no hay inserciones entre los restos 52 y 56, a la CDR2 se le asigna una estructura canónica de tipo 1.

35 Los genes VH de línea germinal humana que se ha predicho que tienen una estructura canónica de tipo 1 en la CDR1 y una estructura canónica de tipo 1 en la CDR2 están tomadas de Chothia y col. (1992) y la figura 1, y se enumeran en la figura 9.

Los segmentos elegidos para la evaluación de homología fueron 27 -35, correspondientes a la CDR1 de Kabat más

40 los restos adicionales que forman la estructura canónica de Chothia, y 50 -60, correspondientes a la CDR2 de Kabat menos los restos 61 -65, que raramente participan directamente en la unión al antígeno. Las secuencias se registraron por números de restos idénticos cuando se compararon con 9.3, y se ordenaron por registro en la figura

9. El gen DP-45 tiene el número más alto de identidades, 10, en una comparación resto a resto con 9.3; las siguientes 6 entradas tienen todas 9. El DP-45 se eligió para la construcción de humanización.

45 De los segmentos JH humanos, el JH4 tiene la homología más cercana al extremo C terminal de CDR3 en 9.3, por lo que se usó en la construcción.

Los dominios variables del anticuerpo humanizado quimérico se diseñaron combinando secuencias tal como sigue.

50 El dominio variable de cadena ligera está constituido por secuencias de CDR de Kabat de la cadena ligera de 9.3, con la excepción del resto 34,, que se pensó que no era crítico con el reconocimiento del antígeno, por lo que se fabricó Ala, idéntico al resto en B3 esa posición; y las secuencias estructurales idénticas a B3 hasta el resto 88 e idénticas a Jk2 de la posición 98 a la 108, con la excepción de los restos 70 y 72, que se mantuvieron idénticos a 9.3 para conservar el motivo de glucosilación de estas formas de restos en combinación con el resto 71. El dominio

55 variable de cadena pesada está constituido por secuencias de CDR de Kabat CDR de la cadena pesada de 9.3, con la excepción de los restos 60 -65, que se pensó que eran críticos con el reconocimiento del antígeno y, por ello, se hicieron idénticos a la secuencia de DP-45 en esas posiciones; y las secuencias estructurales de Kabat idénticas a DP-45 en el resto 94 e idénticas a JH4 del resto 103 al 113.

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Las secuencias de los dominios variables de cadena pesada y ligera de este anticuerpo se muestran en la figura 10. Una recombinación del fragmento Fab con dominios variables de estas secuencias se preparó tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de usar cromatografía de afinidad sobre la proteína G sefarosa para la

5 purificación. Como control se preparó un fragmento Fab que estaba comprendido por dominios variables de 9.3 de ratón y dominios constantes humanos mediante procedimientos similares, tal como un fragmento Fab híbrido estaba comprendido por dominios constantes humanos, dominio variable de cadena pesada de 9.3 de ratón y dominio variable de cadena ligera humanizada.

La capacidad de los tres Fab para unirse a CD28 se examinó mediante ELISA. Las placas recubiertas con CD28Ig se incubaron con soluciones de Fab a concentraciones que variaban de 1 pM a 10 mM. La unión se analizó a continuación con un inmunoconjugado k antihumano. Las isotermas de unión generadas se procesaron para determinar la concentración equivalente par la unión semimáxima de los anticuerpos a CD28Ig (CE50) tal como se describe en Jin y col. (1992), incorporada al presente documento como referencia. Este análisis, que se muestra en 15 la figura 11, indica que el Fab de ratón tenía una CE50 de 20 nM, la CE50 de Hu9.3 fue 630 nM y la CE50 del Fab híbrido fue 30 nM. La similitud de las avideces de los Fab híbrido y de ratón mostró que la reducción en la unión por

9.3 humanizado podía atribuirse a las interacciones débiles que implican a la cadena ligera, causando de este modo la humanización de la cadena ligera sola una perdida de avidez mínima.

Ejemplo 3

Toxina antiescorpión humanizada

El anticuerpo de toxina antiescorpión de ratón denominado BCF2 se usó como secuencia no humana sujeto para

25 una toxina antiescorpión humanizada. Se describió la línea de hibridoma BCF2 de ratón, y la eficacia del anticuerpo de BCF2 en un modelo de ratón demostrado por Licea y col. (1996). La secuencia de los dominios variables de BCF2 se dio a conocer por Selisko y col. (1999), y se presenta en la figura 12.

Los tipos de estructura canonical de la cadena ligera se determinaron tal como se ha descrito anteriormente y fueron el tipo 5 para CDR1, el tipo 1 para la CDR2 y el tipo 1 para la CDR3. Los tipos de estructura canonical de las CDR de cadena pesada son tipo 1 para la CDR1 y tipo 2 para la CDR2. Se diseñó una versión humanizada de BCF2 usando las consideraciones abordadas anteriormente para la selección de secuencias génicas V y J de línea germinal humana.

35 El dominio variable de cadena ligera estaba constituido por secuencias de CDR de Kabat de la cadena ligera de BCF2; y las secuencias estructurales eran idénticas al gen humano A2/DPK12 hasta el resto 88 e idénticas a Jk4 de la posición 98 a la 108. El dominio de cadena pesada estaba constituido por secuencias de CDR de Kabat de la cadena pesada de BCF2, con la excepción de los restos 62 -65, que se pensó que no eran críticos con el reconocimiento de la secuencia de 1-f/DP3 en esas posiciones; y las secuencias estructurales de Kabat eran idénticas a 1-f/DP3 hasta el resto 94 e idénticas a JH6 del resto 103 al 113.

Las secuencias de los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo BCF2 humanizado se muestran en la figura 12. Un fragmento Fab recombinante con dominios variables que tenían estas secuencias se preparó tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Como control se preparó un fragmento de (Fab)'2 de digestión de pepsina de

45 IgG de BCF2 de ratón obtenido a partir de células de hibridoma.

La capacidad de los dos Fabs para unirse a CD28 se examinó usando un instrumento biosensor BIAcore, con toxina inmovilizada sobre la superficie del chip sensor y anticuerpo en el sobrenadante. Este procedimiento se ha descrito por Jönsson y col. (1991), y se ha incorporado al presente documento como referencia. Las soluciones de Fab a concentraciones que variaban en al menos un intervalo de 10 veces se pasaron sobre el chip para observar la fase de asociación. El sensograma se continuó con tampón solo en la fase fluida para observar la disociación. La afinidad, como constante de equilibrio de disociación Kd se determinó a partir de la relación de las constantes de velocidad cinética kon/koff. Las afinidades respectivas fueron 10 nM para el (Fab)'2 de ratón y +140 nM para la versión humanizada.

Ejemplo 4

GAD65 Antihumano humanizado

El anticuerpo de ratón para la isoforma de ácido glutámico descarboxilasa humana de 65 kilodalton, NGAD65.

La línea de hibridoma de NGAD65 de ratón y las secuencias de sus dominios variables de anticuerpo se describieron por Hampe y col. (2001) y las secuencias se presentan en la figura 13. Los dos primeros restos de la cadena ligera se omiten debido a que se derivaron del oligonucleótido usado para la clonación.

65 Se determinó que los tipos de estructura canónica de las CDR de cadena ligera eran el tipo 4 para la CDR1, el tipo 1

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para la CDR2 y el tipo 1 para la CDR3. Se determinó que los tipos de estructura canonical de las CDR de cadena pesada eran el tipo 1 para la CDR1 y el tipo 2 para la CDR2.

Se diseñó una versión humanizada de NGAD65 usando las consideraciones abordadas anteriormente para la

5 selección de secuencias génicas V y J de línea germinal humana. El dominio variable de cadena ligera estaba constituido por secuencias de CDR de Kabat de la cadena ligera de NGAD65; y las secuencias estructurales eran idénticas al gen Vk humano de A17/DPK18 hasta el resto 88 e idénticas a Jk3 de la posición 98 a la 108. El dominio de cadena pesada estaba constituido por secuencias de CDR de Kabat de la cadena pesada de BCF2, con la excepción de los restos 61 -65, que se pensó que no eran críticos con el reconocimiento de la secuencia de 1-v en esas posiciones; y las secuencias estructurales de Kabat eran idénticas a 1-f/DP3 hasta el resto 94 e idénticas a JH4 del resto 103 al 113.

Las secuencias de los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo NGAD65 humanizado se muestran en la figura 13. Un fragmento Fab recombinante con dominios variables que tenían estas secuencias se

15 preparó tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Como control se preparó un fragmento Fab que comprendía dominios variables y constantes de NGAD65 mediante procedimientos similares.

La capacidad de los tres Fab para unirse al antígeno se examinó mediante un ensayo de inmunoprecipitación. La ácido glutámico descarboxilasa humana radioactiva se preparó mediante translación in vitro con metionina 35S. El antígeno etiquetado se incubo durante la noche con diversas concentraciones de cada uno de los dos fragmentos Fab. Se añadieron a continuación perlas de proteína G sefarosa al Fab secuestrado y cualquier antígeno asociado. La radioactividad se determinó por recuento de escintilación y se determinó la CE50 visualmente a partir del punto medio de gráficos de radioactividad unida frente a concentración del fragmente de Fab. Se obtuvieron valores de CE50 de 0,36 pM para el Fab de ratón y de 9 pM para el Fab humanizado. Incluso dada una pérdida de afinidad de

25 25 veces del anticuerpo humanizado con relación al anticuerpo de ratón, el humanizado todavía se unirá al antígeno de modo suficiente para usarse en seres humanos en terapia sin necesidad de mutagénesis posterior de la secuencia para maquillar la pérdida de afinidad de 25 veces.

Los procedimientos que se proporcionan en el presente documento se han ejemplificado para el uso de genes de anticuerpo maduros de ratón como fuente de la primera CDR canónica de Chothia y genes de anticuerpo humano como fuente para la segunda CDR canónica de Chothia. Estos ejemplos son particularmente adecuados para la construcción de anticuerpos humanizados para su uso en aplicaciones terapéuticas en seres humanos. Dichos anticuerpos humanizados contiene suficientes secuencias amino de ratón para retener una estructura de tres dimensiones necesaria para la unión al antígeno ávida pero también contienen suficientes secuencias de anticuerpo

35 humano para evitar una inmunogenicidad no deseada en seres humanos. Un experto en la técnica apreciará, no obstante, que los procedimientos dados a conocer en el presente documento son aplicables igualmente a la preparación de anticuerpos convertidos que incluyen regiones hipervariables quiméricas derivadas de cualquiera de las dos especies diferentes de vertebrados.

En un sentido más general, la primera secuencia de anticuerpo, que se selecciona originalmente en virtud de su unión a un antígeno, puede referirse a una secuencia de anticuerpo "sujeto". Típicamente, la secuencia de anticuerpo sujeto es originaria de ratón o de rata. La segunda secuencia de anticuerpo, que se selecciona a partir de secuencias de anticuerpo del animal diana, puede denominarse secuencia de anticuerpo “objeto”. La secuencia de anticuerpo objeto es, típicamente, de un ser humano o de un animal de granja que sea el objeto del tratamiento

45 terapéutico. Las composiciones de anticuerpos que contienen las regiones hipervariables quiméricas según los procedimientos de la presente invención dan como resultado una tercera secuencia de anticuerpo que pude denominarse generalmente una secuencia de anticuerpo “convertida”. La secuencia de anticuerpo convertida difiere en determinadas característica estructurales definidas de cada una de las secuencias de los anticuerpos sujeto y objeto y es idéntica en otras determinadas características estructurales definidas para cada uno de las secuencias sujeto u objeto.

Referencias

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Foote, Jefferson

<120> Anticuerpos superhumanizados

<130> 501231.02 5 <140> PCT/US02/22011

<141> 2002-07-12

<150> US 60/305,111

<151> 2001-07-12

<160> 122 10 <170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 1

<210> 2

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

26-07-2011

<210> 51

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

10 <210> 52

26-07-2011

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

26-07-2011

<210> 54

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

10 <210> 55

<211> 95

<212> PRT

26-07-2011

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

10 <210> 57

<211> 95

<212> PRT

26-07-2011

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

10 <210> 59

<211> 95

<212> PRT

26-07-2011

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

10 <210> 61

<211> 95

<212> PRT

26-07-2011

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <400> 62

<210> 63

<211> 95

26-07-2011

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

26-07-2011

<210> 65

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

26-07-2011

<210> 67

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

26-07-2011

<210> 69

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

26-07-2011

<210> 71

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

10 <210> 74

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <400> 75

<210> 76

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

10 <210> 77 <211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <400> 78

<210> 79

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

10 <210> 82 <211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85

<210> 86

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

<210> 87

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

<210> 88

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

<210> 89

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

10 <210> 91 <211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 94

<210> 95

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

<210>

97 15 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

<210>

99 10 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

<210> 100

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 100

<210> 101

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

<210> 102

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

<210> 104

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104

<210> 105

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

<210> 106

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

<210> 107

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

<210>

108 15 <211> 1730

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223>

humanized chimeric D1.3 antibody 20 <220>

<221> CDS

<222> (119)..(832)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (914)..(1666)

<223>

<400> 108

<210> 109

<211> 237

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo D1.3 quimérico humanizado

<400> 109

<210> 110

<211> 250

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo D1.3 quimérico humanizado

<400> 110

<210> 112

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 112

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223>

fragmento Fab de C28 antihumano humanizado 10 <400> 113

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento Fab de CD28 (Hu.9.9)) antihumano humanizado

<400> 114

<210> 115

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 115

<210> 116

<211> 112

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento Fab de toxina antiescorpión humanizada

<400> 116

<210> 117

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 117

<210> 118

<211> 117

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento Fab de toxina antiescorpión humanizada

<400> 118

<210> 119

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 119

<210> 120

<211> 122

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento Fab de ácido glutámico descarboxilasaAD65) antihumana huminizada

<400> 120

<210> 121

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 121

<211> 119

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 10 <223> fragmento Fab de ácido glutámico descarboxilasaAD65) antihumana huminizada

<400> 122

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para fabricar una molécula de anticuerpo quimérico, que comprende:

   determinar un tipo canónico de estructura de CDR para al menos dos CDR en una región variable sujeto de un anticuerpo sujeto; seleccionar una región variable objeto de un anticuerpo objeto sobre la base de si la región variable objeto tiene los mismos tipos canónicos de estructura CDR en ubicaciones correspondientes en la región variable objeto; y construir una molécula de anticuerpo quimérico que comprende una región variable quimérica que tiene las al menos dos CDR de una región variable sujeto injertadas en la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en las ubicaciones correspondientes, en la que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en no más de 10 restos de aminoácidos.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende injertar cada una de las tres CDR de una región variable sujeto en las ubicaciones correspondientes en la secuencia estructural objeto.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto en no más de 5 restos de aminoácidos.

4. 4.

   El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto en no más de 2 restos de aminoácidos.

5. 5.

   El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que se selecciona la región variable objeto que incluye un conjunto de regiones variables objeto candidatas que tienen los mismos tipos de estructura de CDR canónicos que las CDR sujeto y clasificar el conjunto de regiones variables objeto comparando la similitud posición a posición de restos de aminoácidos de las CDR sujeto con las CDR objeto correspondientes de acuerdo con un criterio de ordenación.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la región variable objeto se selecciona de entre el 25 % superior de las regiones variables candidatas clasificadas.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos una CDR.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos dos CDR.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos tres CDR.

10. 10.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos una CDR.

11. 11.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos dos CDR.

12. 12.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos tres CDR.

13. 13.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que las CDR son CDR definidas por Kabat.

14. 14.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que las CDR son bucles de CDR definidas por Chothia.

15. 15.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que cada una de las tres CDR sujeto

    es una CDR de cadena ligera, y si una de las tres secuencias de CDR sujeto es de un tipo de estructura canónico ausente de la región variable de cadena ligera objeto, entonces la actuación de seleccionar incluye también seleccionar una región variable objeto con una CDR de un tipo de estructura canónico diferente que el tipo de CDR sujeto que está ausente, con la condición de que el tipo de estructura canónico objeto diferente tenga una longitud de no más de 2 restos de aminoácidos menor o mayor que el tipo de estructura canónica sujeto que está ausente.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que si el tipo de estructura canónico de CDR ausente es del tipo canónico 1, entonces la actuación incluye seleccionar una región variable objeto con una CDR de tipo canónico 2 en la ubicación correspondiente, o si las secuencias de CDR sujeto son del tipo canónico 5 entonces la actuación incluye seleccionar una región variable objeto con un tipo canónico 4 ó 3 en la ubicación correspondiente.

17. 17.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende la sustitución de al menos un resto de aminoácido de una secuencia de CDR sujeto por un aminoácido diferente, con la condición de que no se sustituyen más de 4 restos en cualquiera de la CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena ligera, CDR1 de cadena pesada o CDR3 de cadena pesada sujeto y no se sustituyan más de 10 aminoácidos en la CDR2 de cadena pesada sujeto.

18. 18.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende la sustitución de al menos un resto de aminoácido, pero no más de 10, de la secuencia estructural seleccionada por un resto de aminoácido diferente.

19. 19.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende fabricar regiones variables quiméricas para cada una de la cadena ligera y la cadena pesada.

20. 20.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas quiméricas se diseñan para formar una molécula seleccionada del grupo constituido por un fragmento Fab, una molécula (Fab)'2 y una molécula Fv de cadena única.

21. 21.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas variables quiméricas se diseñan además para que incluyan un dominio de región constante de anticuerpo para el anticuerpo objeto forme un anticuerpo completo.

22. 22.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la región variable sujeto es una región variable de ratón.

23. 23.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la región variable objeto es una región variable humana.

24. 24.

    El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la secuencia de región variable objeto se selecciona del grupo constituido por secuencias de Vk, Vλ, VH,JH,Jk y Jλ humanos.

25. 25.

    El procedimiento de la reivindicación 24, que comprende fabricar regiones variables quiméricas para cada una de la cadena ligera y la cadena pesada, en el que las regiones variables quiméricas incluyen las estructuras de secuencias de Vk y VH humanos.

26. 26.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que la región variable objeto seleccionada se codifica por un gen de región variable de línea germinal humana.

27. 27.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que la región variable objeto seleccionada es de un anticuerpo humano maduro.

28. 28.

    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende preparar un ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo quimérica.

29. 29.

    El procedimiento de la reivindicación 28, que además comprende expresar recombinantemente el ácido nucleico en un tipo de célula adecuado.

30. 30.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que además incluye la actuación de construir un conjunto de moléculas con regiones variables objeto diferentes, determinar una constante de disociación entre el antígeno y diferentes miembros del conjunto de moléculas y seleccionar una molécula que tenga una constante de disociación de al menos 106M-1, al menos 107M-1 o al menos 108M-1 .

    9,3

    9,3

    9,3

    9,3 9,3 9,3

    9,3 9,3

    9,3 9,3

    9,3 9,3

    9,3 9,3 9,3