ES2369522T3

ES2369522T3 - USE OF A C1 INHIBITOR FOR THE PREVENTION OF INJURIES BY ISCHEMIA-REPERFUSION.

Info

Publication number: ES2369522T3
Application number: ES06824316T
Authority: ES
Inventors: Maurice Mannesse; Johannes Henricus Nuijens; Frank Pieper; Maria Grazia De Simoni; Gijsbertus Johannes Ziere
Original assignee: Pharming Intellectual Property BV
Current assignee: Pharming Intellectual Property BV
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2011-12-01
Anticipated expiration: 2026-12-19
Also published as: DK1965831T3; SI1965831T1; CN101365478B; PT1965831E; HUE035692T2; CN105641688B; ES2654816T3; CN101365478A; LT2380587T; PT2380587T; CN105641688A

Abstract

Uso de un inhibidor C1 que tiene un nivel reducido de residuos de ácidos siálicos terminales en comparación con el inhibidor C1 humano derivado de plasma, donde el nivel reducido de residuos de ácidos siálicos terminales da como resultado una vida media de plasma inferior a 6 horas, en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, reducción o tratamiento de al menos una lesión de isquemia y reperfusión, donde el inhibidor C1 se administra al menos 10 minutos después del periodo de isquemia y/o el inicio de la reperfusión.Use of a C1 inhibitor that has a reduced level of terminal sialic acid residues compared to the plasma derived human C1 inhibitor, where the reduced level of terminal sialic acid residues results in a plasma half-life of less than 6 hours, in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention, reduction or treatment of at least one ischemia and reperfusion injury, where the C1 inhibitor is administered at least 10 minutes after the ischemia period and / or the onset of reperfusion.

Description

Uso de un inhibidor C1 para la prevención de lesiones por isquemia-reperfusión Use of a C1 inhibitor for the prevention of ischemia-reperfusion injury

Campo de la invención Field of the Invention

[0001] La presente invención se refiere al uso profiláctico y terapéutico del inhibidor C1 para prevenir, reducir y tratar una lesión por isquemia-reperfusión, en particular una lesión de isquemia-reperfusión cerebral que puede suceder como resultado de un accidente cerebrovascular. [0001] The present invention relates to the prophylactic and therapeutic use of the C1 inhibitor to prevent, reduce and treat an ischemia-reperfusion injury, in particular a cerebral ischemia-reperfusion injury that may occur as a result of a stroke.

Antecedentes de la invención Background of the invention

[0002] La lesión por isquemia-reperfusión es una condición patológica bien conocida. Puede representar una condición patológica prevista o una condición patológica imprevista. El accidente cerebrovascular es uno de los tipos más comunes de lesión por isquemia-reperfusión imprevista. El accidente cerebrovascular es la tercera causa de muerte y la causa principal de incapacidad a largo plazo en países industrializados. El accidente cerebrovascular es un tipo de enfermedad cardiovascular que afecta a las arterias que se dirigen al cerebro y a las del mismo. Un accidente cerebrovascular ocurre cuando tales arterias se bloquean por un coágulo o se rompen y dan como resultado una isquemia de los tejidos cerebrales que son atendidos por la arteria bloqueada. Se causa un daño directo al cerebro por la interrupción del flujo sanguíneo, principalmente debido a la pérdida de oxigenación al tejido viable, en última instancia conduciendo al infarto si no se invierte. No obstante si se invierte la lesión (bien fisiológicamente o terapéuticamente), entonces la reperfusión del tejido isquémico puede paradójicamente causar más daños indirectos. Cuando la isquemia es de larga duración, el daño "directo" que resulta de la hipoxia sola es el mecanismo predominante. Para isquemias de menor duración, el daño indirecto o mediado por reperfusión se vuelve cada vez más importante para el resultado final. [0002] Ischemia reperfusion injury is a well known pathological condition. It may represent an expected pathological condition or an unforeseen pathological condition. Stroke is one of the most common types of unforeseen ischemia-reperfusion injury. Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of long-term disability in industrialized countries. Stroke is a type of cardiovascular disease that affects the arteries that go to and from the brain. A stroke occurs when such arteries are blocked by a clot or rupture and result in ischemia of the brain tissues that are treated by the blocked artery. Direct damage to the brain is caused by disruption of blood flow, mainly due to the loss of oxygenation to viable tissue, ultimately leading to heart attack if it is not reversed. However, if the lesion is reversed (either physiologically or therapeutically), then reperfusion of the ischemic tissue can paradoxically cause more indirect damage. When ischemia is long lasting, the damage "direct" resulting from hypoxia alone is the predominant mechanism. For ischemia of shorter duration, indirect or reperfusion-mediated damage becomes increasingly important for the final outcome.

[0003] El inhibidor C1 (INH C1), el inhibidor de complemento C1, ha mostrado acción neuroprotectora al reducir la lesión por isquemia-reperfusión en modelos de roedor con isquemia-reperfusión cerebral (De Simoni et al., 2003, J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9; Akita et al., 2003, Neurosurgery 52: 395-400). La acción neuroprotectora del INH C1 en lesión por isquemia-reperfusión cerebral no requiere C1q (De Simoni et al., 2004, ser J Pathol. 164: 185763). Más recientemente Storini et al. (2005, Neurobiol Dis. 19: 10-7) divulgó que el INH C1 ejercita una acción antiapoptótica y antiinflamatoria en lesión por isquemia-reperfusión a través de la inhibición de la inflamación y el reclutamiento de célula de la vasculatura al sitio isquémico. No obstante, el espacio de tiempo en un accidente cerebrovascular en el que la la administración de INH C1 es terapéuticamente eficaz es más bien limitado. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar al INH C1 una ventana de tiempo mayor en cuanto al tiempo de administración. [0003] The C1 inhibitor (INH C1), the C1 complement inhibitor, has shown neuroprotective action by reducing ischemia-reperfusion injury in rodent models with cerebral ischemia-reperfusion (De Simoni et al., 2003, J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9; Akita et al., 2003, Neurosurgery 52: 395-400). The neuroprotective action of INH C1 in cerebral ischemia reperfusion injury does not require C1q (De Simoni et al., 2004, be J Pathol. 164: 185763). More recently Storini et al. (2005, Neurobiol Dis. 19: 10-7) reported that INH C1 exerts an antiapoptotic and anti-inflammatory action in ischemia-reperfusion injury through the inhibition of inflammation and cell recruitment from the vasculature to the ischemic site. However, the time span in a stroke in which the administration of INH C1 is therapeutically effective is rather limited. Therefore, it is an objective of the present invention to provide the INH C1 with a longer time window in terms of administration time.

Descripción de la invención Description of the invention

[0004] La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que cuando el inhibidor C1(INH C1) derivado de plasma de origen natural, ha perdido la mayor parte de su capacidad para reducir una lesión por isquemiareperfusión en un modelo de ratón con isquemia cerebral focal transitoria cuando se administra después de la isquemia, una preparación recombinante de INH C1 sigue siendo capaz de ejercer sus efectos neuroprotectores también cuando se inyecta al menos 1 hora después de la isquemia y/o reperfusión. Sorprendentemente, un efecto neuroprotector se puede todavía conseguir cuando el INH C1 se inyecta 18 horas después de la isquemia y/o reperfusión. La diferencia entre el INH C1 derivado de plasma de origen natural y la preparación recombinante de INH C1 es que el primero tiene una vida media de plasma de al menos 24 horas y es completamente glicoproteína sialilada, y el último tiene una vida media de plasma reducida y tiene una glicosilación diferente en comparación con el producto derivado de plasma. [0004] The present invention is based on the surprising finding that when the naturally-derived plasma-derived C1 (INH C1) inhibitor has lost most of its ability to reduce ischemiarefusion injury in a mouse model with ischemia Transient focal brain when administered after ischemia, a recombinant preparation of INH C1 remains capable of exerting its neuroprotective effects also when injected at least 1 hour after ischemia and / or reperfusion. Surprisingly, a neuroprotective effect can still be achieved when INH C1 is injected 18 hours after ischemia and / or reperfusion. The difference between the naturally-derived plasma-derived INH C1 and the recombinant INH C1 preparation is that the former has a plasma half-life of at least 24 hours and is completely sialylated glycoprotein, and the latter has a reduced plasma half-life and has a different glycosylation compared to the plasma derived product.

[0005] Una diferencia conocida entre el INH C1 derivado de plasma de origen natural y la preparación recombinante de INH C1 es la extensión y tipo de glicosilación. La glicoproteína recombinante contiene un amplio conjunto de diferentes N-glicanos, comprendiendo estructuras oligomanosas, híbridas y de tipo complejo, mientras que los Nglicanos de INH C1 derivado de plasma están principalmente compuestos por estructuras de tipo complejo completamente sialiladas. Como resultado de las diferencias en la glicosilación, la glicoproteína derivada de plasma tiene una vida media de plasma de al menos 24 horas y el INH C1 recombinante tiene una vida media de plasma reducida. [0005] A known difference between naturally derived plasma-derived INH C1 and the recombinant INH C1 preparation is the extent and type of glycosylation. The recombinant glycoprotein contains a wide array of different N-glycans, comprising oligomanous, hybrid and complex type structures, while plasma derived INH C1 Nglycans are mainly composed of completely sialylated complex type structures. As a result of the differences in glycosylation, plasma-derived glycoprotein has a plasma half-life of at least 24 hours and recombinant INH C1 has a reduced plasma half-life.

[0006] Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a un método para la prevención, reducción o tratamiento de al menos una lesión por isquemia-reperfusión, donde el inhibidor C1 se administra al menos después del periodo de isquemia y/o el inicio de reperfusión y donde el inhibidor C1 tiene un nivel reducido de residuos de ácidos siálicos terminales en comparación con el inhibidor C1 humano derivado de plasma. El método comprende preferiblemente el paso de administrar una cantidad eficaz de un INH C1 con una vida media de plasma menor que la vida media de plasma de un INH C1 derivado de plasma. Alternativamente, el método comprende preferiblemente el paso de administrar una cantidad eficaz de un INH C1 que tenga una glicosilación diferente en comparación con el INH C1 derivado de plasma. Este método se refiere a un uso profiláctico y/o terapéutico de un inhibidor C1 para la prevención, reducción y/o tratamiento de cualquier tipo de lesión por isquemia-reperfusión. [0006] Therefore, in one aspect the present invention relates to a method for the prevention, reduction or treatment of at least one ischemia-reperfusion injury, where the C1 inhibitor is administered at least after the period of ischemia and / or the onset of reperfusion and where the C1 inhibitor has a reduced level of terminal sialic acid residues compared to the human C1 plasma-derived inhibitor. The method preferably comprises the step of administering an effective amount of a C1 INH with a plasma half-life less than the plasma half-life of a plasma-derived INH C1. Alternatively, the method preferably comprises the step of administering an effective amount of a C1 INH having a different glycosylation compared to the plasma derived INH C1. This method refers to a prophylactic and / or therapeutic use of a C1 inhibitor for the prevention, reduction and / or treatment of any type of ischemia-reperfusion injury.

[0007] Un inhibidor C1, también referido como inhibidor de C1 esterasa se define aquí, como un inhibidor de complemento C1. El INH C1 pertenece a la superfamilia de inhibidores de proteinasa de serina y es el único inhibidor de C1r y C1s del sistema de complemento y es el inhibidor mayor de factor XIIa y kalikreína del sistema de contacto. Además el INH C1 también inhibe otras serín proteasas de la coagulación y sistemas fibrinolíticos como el factor XI, activador de plasminógeno de tipo tejido y plasmina (Schapira et al. 1985, Complement 2: 111; Davis, 1988, Ana. Rev. Immunol. 6: 595). El INH C1 humano es una proteína de 500 aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de 22 aminoácidos (Carter et al. 1988, Euro. J. Biochem. 173, 163). El INH C1 de plasma es una glicoproteína de aproximadamente 76 kDa y está fuertemente glicosilada, hasta el 26% de su masa molecular es carbohidrato (Perkins et al., 1990, J. Mol. Biol. 214, 751). Un INH C1 para su uso en los métodos de la presente invención es preferiblemente una proteína con una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 65, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos del INH C1 humano maduro como se representa en la SEC ID NO:1. [0007] A C1 inhibitor, also referred to as C1 esterase inhibitor is defined herein, as a C1 complement inhibitor. The INH C1 belongs to the serine proteinase inhibitor superfamily and is the only C1r and C1s inhibitor of the complement system and is the major inhibitor of factor XIIa and kalikrein of the contact system. In addition, C1 INH also inhibits other coagulation serine proteases and fibrinolytic systems such as factor XI, tissue plasminogen activator and plasmin (Schapira et al. 1985, Complement 2: 111; Davis, 1988, Ana. Rev. Immunol. 6: 595). Human C1 INH is a 500 amino acid protein, including a signal sequence of 22 amino acids (Carter et al. 1988, Euro. J. Biochem. 173, 163). The plasma INH C1 is a glycoprotein of approximately 76 kDa and is strongly glycosylated, up to 26% of its molecular mass is carbohydrate (Perkins et al., 1990, J. Mol. Biol. 214, 751). A C1 INH for use in the methods of the present invention is preferably a protein with an amino acid sequence having at least 65, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 or 99 % identity with the amino acid sequence of mature human INH C1 as depicted in SEQ ID NO: 1.

[0008] Con motivo de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se refiere al porcentaje de aminoácidos que son idénticos en las dos secuencias. Primero, las secuencias polipéptidas homólogas se buscan usando el algoritmo de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que se describe en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los parámetros W, B y E del algoritmo de BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, el matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89: 10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5; N=-4. Después, el grado de identidad (como se ha definido anteriormente) de secuencias homólogas se determina usando el algoritmo de alineación CLUSTALW (Higgins D. Et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) usando los siguientes parámetros; Gap size: 5, Gap open: 11, Gap extension: 1, Mismatch: -15, Word size: 3. [0008] On the occasion of the present invention, the degree of identity between two amino acid sequences refers to the percentage of amino acids that are identical in the two sequences. First, homologous polypeptide sequences are searched using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm, which is described in Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). The software for performing BLAST analyzes is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The parameters W, B and E of the BLAST algorithm determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLAST program uses a word length (W) of 3 as default values, the BLOSUM62 score matrix (see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) alignments (B) of 50, hope (E) of 10, M = 5; N = -4. Then, the degree of identity (as defined above) of homologous sequences is determined using the CLUSTALW alignment algorithm (Higgins D. Et al (1994). Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) using the following parameters; Gap size: 5, Gap open: 11, Gap extension: 1, Mismatch: -15, Word size: 3.

[0009] El INH C1 preferiblemente tiene actividad de INH C1 como se puede, por ej., evaluar tal como es descrito por Drouet et al. (1988, Clin Chim Acta. 174:121-30). Más preferiblemente, el INH C1 es un INH C1 humano (INH C1h) el cual se entiende que significa que un INH C1 tiene una secuencia de aminoácidos que ocurre naturalmente en el hombre (como p. ej. SEC ID NO:1 o CAA30314), pero no significa que el INH C1 se produzca y obtenga de, por ej., plasma humano. [0009] The INH C1 preferably has INH C1 activity as can, for example, be evaluated as described by Drouet et al. (1988, Clin Chim Acta. 174: 121-30). More preferably, the INH C1 is a human INH C1 (INH C1h) which is understood to mean that a INH C1 has an amino acid sequence that occurs naturally in man (eg, SEQ ID NO: 1 or CAA30314) , but it does not mean that the INH C1 is produced and obtained from, for example, human plasma.

[0010] Según un aspecto de la invención, el INH C1 para su uso en los métodos de la invención tiene preferiblemente una vida media de plasma reducida en comparación con la vida media de plasma de INHC1 derivado, más preferiblemente la vida media de plasma de INH C1 de la invención es inferior a la vida media de plasma de INH C1 derivado de plasma humano. Por "vida media de plasma reducida" se entiende el cambio negativo en la vida media circulante de un INH C1 de la invención en relación a la vida media circulante de un INH C1 derivado de plasma. En este contexto, un INH C1 derivado de plasma se refiere a un INH C1 de origen natural que es típicamente derivado de plasma y que se puede purificar de plasma, pero no se modifica químicamente o enzimáticamente. [0010] According to one aspect of the invention, the INH C1 for use in the methods of the invention preferably has a reduced plasma half-life compared to the derived plasma half-life of INHC1, more preferably the plasma half-life of INH C1 of the invention is shorter than the plasma half-life of INH C1 derived from human plasma. For "reduced plasma half-life" the negative change in the circulating half-life of an INH C1 of the invention is understood in relation to the circulating half-life of a plasma-derived INH C1. In this context, a plasma-derived INH C1 refers to a naturally occurring INH C1 that is typically plasma-derived and that can be purified from plasma, but is not chemically or enzymatically modified.

[0011] La vida media de plasma se mide tomando muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de la administración del INH C1 y la determinación de la concentración del INH C1 en cada muestra. La correlación de la concentración de suero con el tiempo permite calcular la vida media de plasma. La reducción de la vida media de plasma de INH C1 de la invención en relación con la vida media de plasma circulante de un INH C1 derivado de plasma preferiblemente es al menos aproximadamente doble, al menos aproximadamente triple, al menos aproximadamente cuádruple, al menos aproximadamente sextuple, más preferiblemente al menos aproximadamente octuple y de la forma más preferible al menos aproximadamente décuple. En otras palabras, la vida media de plasma de un INH C1 de la invención preferiblemente es inferior a 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12,5 o 10% de la vida media de plasma de un INH C1 derivado, es decir, su contraparte natural. [0011] The plasma half-life is measured by taking blood samples at various time points after administration of the INH C1 and determining the concentration of the INH C1 in each sample. The correlation of serum concentration over time allows the plasma half-life to be calculated. The reduction of the plasma half-life of INH C1 of the invention in relation to the circulating plasma half-life of a plasma-derived INH C1 is preferably at least about double, at least about triple, at least about quadruple, at least about sixfold, more preferably at least about octuple and most preferably at least about tenfold. In other words, the plasma half-life of a C1 INH of the invention is preferably less than 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12.5 or 10% of the plasma half-life of a C1 INH derivative, that is, its natural counterpart.

[0012] P. ej. la vida media del plasma del INH C1 de la invención que se usa en los ejemplos aquí, que se obtiene de la leche de conejos transgénicos, muestra una vida media de plasma en seres humanos de aproximadamente 3 horas, que es de cuatro a ocho veces menor que la vida media del plasma de un INH C1 derivado de plasma humano. Se entiende que la determinación de la reducción de la vida media de plasma de un INH C1 de la invención en comparación con el INH C1 derivado de plasma se realiza preferiblemente bajo condiciones similares, si no idénticas, es decir, preferiblemente en dosificaciones correspondientes, regímenes de muestreo, en el mismo organismo, que puede ser un animal de laboratorio tal como un ratón o sujetos humanos, y sobre el mismo número de sujetos de prueba. Además, se entiende que la vida media del plasma de ambas preparaciones de INH C1 se comparan como se puede determinar por método estándar de análisis estadístico. [0012] e.g. The plasma half-life of the INH C1 of the invention used in the examples herein, which is obtained from the milk of transgenic rabbits, shows a plasma half-life in humans of approximately 3 hours, which is four to eight times shorter than the plasma half-life of a C1 INH derived from human plasma. It is understood that the determination of the plasma half-life reduction of an INH C1 of the invention compared to the plasma-derived INH C1 is preferably performed under similar, if not identical conditions, that is, preferably in corresponding dosages, regimens Sampling, in the same organism, which can be a laboratory animal such as a mouse or human subjects, and on the same number of test subjects. In addition, it is understood that the plasma half-life of both INH C1 preparations are compared as can be determined by standard statistical analysis method.

[0013] Un INH C1 con una vida media más corta, puede ser de origen natural o un INH C1 producido de forma recombinante, se puede preparar con cualquier método conveniente. Puede por ejemplo ser preparado in vivo en una célula huésped recombinante u organismo que resulta en un INH C1 con una estructura de carbohidrato modificada (como comparada con el INH C1 derivado de plasma) o la estructura de carbohidrato de un INH C1 de origen natural puede ser químicamente o enzimáticamente modificada in vitro. Preferiblemente, el INH C1 de la invención se modifica en comparación con el INH C1 derivado de plasma de la siguiente forma: eliminación de una fracción de carbohidrato (de una variante de origen natural o variante expresada recombinantemente de la glicoproteína), preferiblemente la eliminación de ácido siálico y/o galactosa de una cadena de carbohidratos unidos por enlace N-glucosídico y/o la eliminación de una cadena de carbohidrato dando como resultado exposición de manosa, galactosa, N-acetilglucosamina y/o residuos de fucosa. [0013] A INH C1 with a shorter half-life, can be of natural origin or a recombinantly produced INH C1, can be prepared by any convenient method. It can for example be prepared in vivo in a recombinant host cell or organism that results in a C1 INH with a modified carbohydrate structure (as compared to the plasma derived INH C1) or the carbohydrate structure of a naturally occurring C1 INH can be chemically or enzymatically modified in vitro. Preferably, the INH C1 of the invention is modified in comparison with the plasma-derived INH C1 as follows: removal of a carbohydrate fraction (from a naturally occurring variant or recombinantly expressed variant of the glycoprotein), preferably the removal of Sialic acid and / or galactose from a carbohydrate chain linked by N-glucosidic bond and / or the elimination of a carbohydrate chain resulting in exposure of mannose, galactose, N-acetylglucosamine and / or fucose residues.

[0014] Según otro aspecto de la invención, el INH C1 para uso en los métodos de la invención tiene preferiblemente una glicosilación diferente en comparación con el INH C1 derivado de plasma. Modificaciones de la estructura de carbohidrato de un INH C1 de la invención incluyen modificaciones que conducen a infraglicosilación. [0014] According to another aspect of the invention, the INH C1 for use in the methods of the invention preferably has a different glycosylation compared to the plasma-derived INH C1. Modifications of the carbohydrate structure of a C1 INH of the invention include modifications that lead to infraglycosylation.

[0015] In vitro, la infraglicosilación puede ser el resultado de una deleción de una fracción de carbohidrato o de una cadena de carbohidrato completa de C1INH. Las modificaciones pueden implicar ambas cadenas de carbohidratos unidos por enlaces N- glucosídicos u O- glucosídicos, o sólo un tipo de cadena. Puede implicar todas las cadenas, o sólo algunas de las cadenas. La sobreglicosilación puede por ejemplo ser el resultado de la adición de una fracción de carbohidrato extra o una cadena de carbohidrato completa a la molécula de INH C1. Una forma asialo de INH C1 [0015] In vitro, infraglycosylation may be the result of a deletion of a carbohydrate fraction or of a complete C1INH carbohydrate chain. Modifications may involve both carbohydrate chains linked by N-glucosidic or O-glucosidic bonds, or only one type of chain. It can involve all the chains, or just some of the chains. Overglycosylation can for example be the result of the addition of an extra carbohydrate fraction or a complete carbohydrate chain to the INH C1 molecule. An Asian form of INH C1

o una forma con un nivel reducido de residuos ácidos siálicos terminales pueden típicamente ser obtenidos por eliminación de un grupo de ácido siálico. Es bien conocido que la vida media de una glicoproteína en la sangre es altamente dependiente en la composición y estructura de sus grupos de carbohidratos unidos por enlaces N-y Oglucosídicos. En general, la vida media máxima de una glicoproteína requiere que sus grupos de carbohidratos unidos por enlaces N- y O- glucosídicos tengan un ácido siálico terminal. Si este ácido siálico terminal no está presente, la glicoproteína es rápidamente esclarecida de la sangre debido a la exposición de residuos de galactosa. Está bien establecido que la presencia de residuos de galactosa terminal en fracciones de carbohidrato de glicoproteínas resulta en espacio de plasma mejorado por el receptor de asialoglicoproteína en el hígado. Así, el INH C1 para uso en los métodos de la presente invención tiene un nivel reducido de residuos ácidos siálicos terminales en comparación con el inhibidor C1 derivado de plasma humano. El ácido siálico se puede quitar de diferentes formas. Por ejemplo, se puede quitar químicamente o enzimáticamente, por ejemplo, por tratamiento con sialidasa. Sialidasas adecuadas para este propósito son descritas por Chou et al. (1996, J Biol Chem. 271 (32):19219-24; y 1994, J Biol Chem. 269(29):18821-6) y pueden p. ej. ser obtenidos de V-labs, Inc. (covingtoNPn, Luisiana, USA). En otra forma de realización preferida, INH C1 para uso en los métodos de la presente invención preferiblemente ha expuesto manosa, N-acetilglucosamina fosfomanosa, galactosa y/o residuos de N-acetilgalactosamina. Un residuo de azúcar expuesto usualmente será un residuo de azúcar terminal en una rama de glicano o al menos un residuo de azúcar que es accesible para interacciones con una fracción con afinidad para el residuo (tal como un dominio de unión de carbohidrato). Un INH C1 con galactosa expuesta, N- acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa, fucosa o residuos de fosfomanosa pueden p. ej. ser obtenidas por tratamiento enzimático con uno o más de 1-D-Nacetilhexosaminidasa, endo-1-d-galactosidasa, y/o a-D-N-acetilgalactosaminidasa (también obtenible de, p. ej., Vlabs, Inc., Covington, Luisiana, EEUU). or a form with a reduced level of terminal sialic acid residues can typically be obtained by removal of a sialic acid group. It is well known that the half-life of a glycoprotein in the blood is highly dependent on the composition and structure of its carbohydrate groups linked by N-and Oglycoside bonds. In general, the maximum half-life of a glycoprotein requires that its carbohydrate groups linked by N- and O-glycosidic bonds have a terminal sialic acid. If this terminal sialic acid is not present, the glycoprotein is rapidly cleared from the blood due to the exposure of galactose residues. It is well established that the presence of terminal galactose residues in glycoprotein carbohydrate fractions results in plasma space enhanced by the asialoglycoprotein receptor in the liver. Thus, the INH C1 for use in the methods of the present invention has a reduced level of terminal sialic acid residues compared to the C1 inhibitor derived from human plasma. Sialic acid can be removed in different ways. For example, it can be removed chemically or enzymatically, for example, by treatment with sialidase. Sialidases suitable for this purpose are described by Chou et al. (1996, J Biol Chem. 271 (32): 19219-24; and 1994, J Biol Chem. 269 (29): 18821-6) and may p. ex. be obtained from V-labs, Inc. (covingtoNPn, Louisiana, USA). In another preferred embodiment, INH C1 for use in the methods of the present invention has preferably exhibited mannose, N-acetylglucosamine phosphamose, galactose and / or N-acetylgalactosamine residues. An exposed sugar residue will usually be a terminal sugar residue in a glycan branch or at least one sugar residue that is accessible for interactions with a fraction with affinity for the residue (such as a carbohydrate binding domain). A C1 INH with exposed galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, mannose, fucose or phosphomanose residues may e.g. ex. be obtained by enzymatic treatment with one or more of 1-D-Nacethylhexosaminidase, endo-1-d-galactosidase, and / or aDN-acetylgalactosaminidase (also obtainable from, e.g., Vlabs, Inc., Covington, Louisiana, USA. ).

[0016] In vivo, modificaciones de cadenas de carbohidratos de INH C1 se pueden introducir usando sistemas de producción recombinantes. Ambos cultivos de células eucariotas y procariotas pueden ser utilizados, tal como células de levadura, células micóticas, células de insecto y células mamíferas. Por ejemplo, células COS y células CHO son sistemas adecuados de producción mamíferos. Aunque los sistemas de cultivo celular mamíferos tienen la capacidad para producir glicoproteínas con grupos sialilados de carbohidratos, glicosilación completa u óptima natural es frequentemente difícil de conseguir y en consecuencia, las glicoproteínas producidas de recombinación en general tienen un modelo de glicosilación diferente a sus duplicados naturales. Normalmente este modelo de glicosilación diferente es incompleto (en comparación con los duplicados naturales) teniendo galactosa expuesta, Nacetilglucosamina y/o residuos de manosa. Asimismo, la producción de INH C1 en microorganismos eucarióticos como levaduras u hongos resultará en INH C1 con residuos de manosa expuestos. [0016] In vivo, carbohydrate chain modifications of INH C1 can be introduced using recombinant production systems. Both cultures of eukaryotic and prokaryotic cells can be used, such as yeast cells, fungal cells, insect cells and mammalian cells. For example, COS cells and CHO cells are suitable mammalian production systems. Although mammalian cell culture systems have the capacity to produce glycoproteins with sialylated carbohydrate groups, complete or optimal natural glycosylation is often difficult to achieve and consequently, glycoproteins produced from recombination in general have a different glycosylation model than their natural duplicates. . Normally this different glycosylation model is incomplete (compared to natural duplicates) having exposed galactose, Nacetylglucosamine and / or mannose residues. Likewise, the production of INH C1 in eukaryotic microorganisms such as yeasts or fungi will result in INH C1 with exposed mannose residues.

[0017] El INH C1 con estructuras de carbohidratos modificadas puede también ser preparado en animales transgénicos, preferiblemente en animales no humanos, tal como en conejos, bovino, ratones, ratas, cabras y ovejas transgénicos. Preferiblemente, tales glicoproteínas se expresan en las glándulas mamarias de estos animales nohumanos transgénicos de manera que las glicoproteínas se pueden obtener de la leche del animal. El experto en la materia entenderá que éste dependerá de la glicoproteína específica a ser producida y en la cantidad que tiene para ser producida, qué animal transgénico es mejor usar para la producción. Un INH C1 particularmente preferido para uso en la presente invención es un INH C1 que se obtiene de la leche de un bovino transgénico o un animal del orden Lagomorfa, preferiblemente de la familia Leporidae, más preferiblemente del género orictolagus y de la forma más preferible un conejo de las especies Orictolagus cuniculus. [0017] INH C1 with modified carbohydrate structures can also be prepared in transgenic animals, preferably non-human animals, such as rabbits, cattle, mice, rats, goats and transgenic sheep. Preferably, such glycoproteins are expressed in the mammary glands of these transgenic nonhuman animals so that glycoproteins can be obtained from the animal's milk. The person skilled in the art will understand that this will depend on the specific glycoprotein to be produced and on the amount it has to be produced, which transgenic animal is better to use for production. A particularly preferred INH C1 for use in the present invention is a C1 INH which is obtained from the milk of a transgenic bovine or an animal of the order Lagomorfa, preferably from the Leporidae family, more preferably from the orictolagus genus and most preferably a Rabbit of the Orictolagus cuniculus species.

[0018] Diferentes tipos de modificaciones a la estructura de la cadena de carbohidrato de la proteína de INH C1 en comparación con su duplicado natural derivado del plasma se pueden obtener de sistemas de producción recombinantes, tal como glicosilación diferente, infraglicosilación se puede introducir separadamente o en combinación, simultáneamente o consecutivamente, algunos tipos se pueden introducir a una parte de la molécula, mientras otros se introducen para otra parte de la molécula. Combinaciones preferidas de modificaciones que contribuyen a la eficacia terapéutica de la proteína incluyen galactosa expuesta, N- acetilgalactosamina, Macetilglucosamina, manosa, fucosa y/o residuos de fosfomanosa en el INH C1 de la invención. El INH C1 de la invención puede p. ej. tener glicanos del tipo oligomanosa o del tipo altamanosa. Preferiblemente al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 40 o 60% de los residuos terminales en los glicanos en el INH C1 se seleccionan de galactosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa, fucosa y residuos de fosfomanosa. P. ej., un INH C1 preferido para su uso en la presente invención contiene aproximadamente hasta 2, 4, 5, 6 veces menos ácido siálico en comparación con su duplicado natural y/o al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 40 o 60% de sus glicanos unidos por enlaces N-glucosídicos son hexosas de terminal de soporte neutral con grupos ecuatoriales de 3 y 4-OH, tal como manosa y N-acetilglucosamina. En cambio, el INH C1 derivado de plasma no tiene oligomanosa de tipo glicosilación. Un INH C1 preferido para su uso en la presente invención, p. ej., es un INH C1 humano recombinante producido en las glándulas mamarias de conejos que tienen 5-6 veces menos ácido siálico en comparación con su duplicado natural y aproximadamente 15% de sus glicanos unidos por enlace N-glucosídico son residuos de manosa de terminal de soporte neutral. [0018] Different types of modifications to the structure of the carbohydrate chain of the INH C1 protein compared to its natural plasma-derived duplicate can be obtained from recombinant production systems, such as different glycosylation, infraglycosylation can be introduced separately or in combination, simultaneously or consecutively, some types can be introduced to one part of the molecule, while others are introduced to another part of the molecule. Preferred combinations of modifications that contribute to the therapeutic efficacy of the protein include exposed galactose, N-acetylgalactosamine, Macethylglucosamine, mannose, fucose and / or phosphomanose residues in the INH C1 of the invention. The INH C1 of the invention may e.g. ex. have oligomanosa glycans or altamanosa type. Preferably at least about 5, 10, 15, 20, 40 or 60% of the terminal residues in the glycans in the INH C1 are selected from galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, mannose, fucose and phosphomanose residues. For example, a preferred INH C1 for use in the present invention contains approximately up to 2, 4, 5, 6 times less sialic acid compared to its natural duplicate and / or at least about 5, 10, 15, 20, 40 or 60% of its glycans linked by N-glycosidic linkages are neutral support terminal hexoses with equatorial groups of 3 and 4-OH, such as mannose and N-acetylglucosamine. In contrast, the plasma-derived INH C1 does not have a glycosylation type oligomanose. A preferred INH C1 for use in the present invention, e.g. For example, it is a recombinant human INH C1 produced in the mammary glands of rabbits that have 5-6 times less sialic acid compared to their natural duplicate and approximately 15% of their glycans linked by N-glycosidic bond are terminal mannose residues neutral support.

[0019] En una forma de realización preferida, la glicosilación diferente del INH C1 para uso en la presente invención resulta en una afinidad más alta para una proteína de enlace de manosa en comparación con su duplicado derivado de plasma. La proteína de enlace de manosa (MBP) es también referida como proteína de unión de manano, lectina de unión de manosa (MBL), lectina de unión de manano, o bactericida Ra-reactivo factor. MBP es una colección que pertenece a un grupo de Ca2+-dependiente (tipo-C) lectinas solubles. MBP es un activador de complemento via la vía de lectina (que difiere de las vías alternativas y tradicionales de activación de complemento). El sistema de complemento es un componente importante de la defensa innata inmunológica y se activa por tres vías: la vía clásica, la vía alternativa, y la vía de lectina recientemente descubierta o lectina de unión de manosa (MBL). [0019] In a preferred embodiment, glycosylation other than INH C1 for use in the present invention results in a higher affinity for a mannose binding protein compared to its plasma-derived duplicate. Mannose binding protein (MBP) is also referred to as mannan binding protein, mannose binding lectin (MBL), mannan binding lectin, or bactericidal Ra-reactive factor. MBP is a collection that belongs to a group of Ca2 + -dependent (type-C) soluble lectins. MBP is a complement activator via the lectin pathway (which differs from the alternative and traditional complement activation pathways). The complement system is an important component of the innate immune defense and is activated by three routes: the classical pathway, the alternative pathway, and the newly discovered lectin pathway or mannose binding lectin (MBL).

[0020] La activación de la vía clásica se inicia cuando los dominios catalíticos C1r y C1s se enlazan con complejos inmunológicos mediante la proteína de reconocimiento C1q (ver Figura 11). [0020] Activation of the classical pathway begins when the catalytic domains C1r and C1s are linked to immunological complexes by the C1q recognition protein (see Figure 11).

[0021] La vía alternativa está continuamente rotando a un índice lento en una manera independiente de anticuerpo y atacará partículas que no están protegidas específicamente contra el complemento. [0021] The alternative pathway is continuously rotating at a slow rate in an independent manner of antibody and will attack particles that are not specifically protected against complement.

[0022] La lectina o vía MBL se activa o inicia tras la unión de MBL a estructuras de carbohidratos presentes en varios patógenos u otras estructuras celulares. Dos serín proteasas: proteasa de serina asociada de lectina de unión de manano (MASP)-1 y -2 (ver Figura 11) se asocian con MBL y muestran similitudes de choque con las serina proteasas C1s y C1r. El complejo tiene capacidades de activación C4- y C3- tras la unión a manano. El complejo contiene dos serina proteasas MASP-1 y MASP-2 unidas por un enlace de disulfuro. En esta forma, MASP es capaz de quebrar C4 y C3 dando como resultado su activación. El INH C1 de la invención tiene preferiblemente una afinidad más alta para un MBP humano en comparación con su duplicado derivado de plasma. [0022] The lectin or MBL pathway is activated or initiated after MBL binding to carbohydrate structures present in various pathogens or other cellular structures. Two serine proteases: Mannan-binding lectin-associated serine protease (MASP) -1 and -2 (see Figure 11) are associated with MBL and show similarities of shock with C1s and C1r serine proteases. The complex has C4- and C3- activation capabilities after binding to mannan. The complex contains two serine proteases MASP-1 and MASP-2 linked by a disulfide bond. In this way, MASP is able to break C4 and C3 resulting in its activation. The INH C1 of the invention preferably has a higher affinity for a human MBP compared to its plasma-derived duplicate.

[0023] MBP reconoce hexosas expuestas con grupos ecuatoriales de 3 y 4-OH, tal como manosa y Nacetilglucosamina y/o N-acetil-hexosaminas. Un INH C1 preferido de la invención por lo tanto lleva tales hexosas terminales. La afinidad más alta para MBP, preferiblemente MBP humano del INH C1 de la invención es preferiblemente de manera que éste permite un objetivo, unión y/o inhibición más eficaz de MBP en comparación con su duplicado derivado de plasma natural al cual le falta manosa expuesta y residuos de N-acetilglucosamina. MBP humano es aquí entendido para referirse a la proteína caracterizada por el hecho de que Kawasaki et al. (1983, [0023] MBP recognizes exposed hexoses with equatorial groups of 3 and 4-OH, such as mannose and Nacethylglucosamine and / or N-acetyl-hexosamines. A preferred INH C1 of the invention therefore carries such terminal hexoses. The highest affinity for MBP, preferably human MBP of the INH C1 of the invention is preferably such that it allows a more efficient objective, binding and / or inhibition of MBP compared to its duplicate derived from natural plasma to which exposed mannose is lacking. and residues of N-acetylglucosamine. Human MBP is here understood to refer to the protein characterized by the fact that Kawasaki et al. (1983,

J. Biochem 94:937-47), con una secuencia de aminoácidos como se describe por Taylor et al. (1989, Biochem. J. 262 (3), 763-771; NCBI adquisición nº CAA34079). La estructura de rata MBP complejo con an.oligosacarido es descrita por Weis et al. (1992, Nature. 360:127-34).Para otra descripción de MBP humano ver p. ej US 6,846,649 y referencias citadas ahí. J. Biochem 94: 937-47), with an amino acid sequence as described by Taylor et al. (1989, Biochem. J. 262 (3), 763-771; NCBI acquisition No. CAA34079). The complex MBP rat structure with an oligosaccharide is described by Weis et al. (1992, Nature. 360: 127-34). For another description of human MBP see p. eg US 6,846,649 and references cited there.

[0024] Todas estas vías (clásica, alternativa y lectina o MBL) generan una actividad enzimática crucial que finalmente conduce al ensamblaje del complejo de incursión de membrana (MAC o C5b-C9) (ver Figura 11). Bajo condiciones fisiológicas, la activación del sistema de complemento es eficazmente controlada por la acción coordinada de proteínas reguladoras asociadas a la membrana y solubles. Una de estas proteínas es el inhibidor C1 (INH C1), un inhibidor de serina proteasa que enlaza a C1s y C1r y habitualmente el único inhibidor fisiológico conocido de la vía clásica. Además, INH C1 es capaz de inactivar el complemento de activación de MBL-mediado por unión e inhibición de MASP-1 y MASP-2. [0024] All of these pathways (classical, alternative and lectin or MBL) generate a crucial enzymatic activity that ultimately leads to the assembly of the membrane incursion complex (MAC or C5b-C9) (see Figure 11). Under physiological conditions, the activation of the complement system is effectively controlled by the coordinated action of membrane-associated and soluble regulatory proteins. One of these proteins is the C1 inhibitor (INH C1), a serine protease inhibitor that binds C1s and C1r and usually the only known physiological inhibitor of the classical pathway. In addition, INH C1 is capable of inactivating the complement of MBL-mediated activation by binding and inhibition of MASP-1 and MASP-2.

[0025] La activación de las diferentes vías de complemento es preferiblemente medida en sueros humanos por el kit Wielisa (producto nºCOMPL 300, Wieslab, Sweeden). Este es un inmuno ensayo de enzima disponible comercialmente, específico para la detección de cada una de las tres vías de complemento con deposición de CSb-C9 como una lectura común. Brevemente, pocillos de las tiras de microtitulación se revisten con activadores específicos de cada una de las tres vías de complemento. Suero humano se diluye en diluyente conteniendo bloqueador específico para asegurar que sólo la vía respectiva se activa. El INH C1 de la invención o su duplicado derivado de plasma se añade posteriormente a una concentración dispuesta entre 0 y 75 μmol, incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadida a los pocillos. Durante una incubación posterior del suero humano diluido en el pocillo durante 60 minutos a 37°C, el complemento se activa por el recubrimiento específico. Los pocillos se lavan luego y C5b-C9 formados se detectan con una fosfatasa alcalina específica marcada anti C5b-C9 anticuerpo. Después de otro paso de lavado, la detección de anticuerpos específicos se obtiene por incubación con solución de sustrato de fosfatasa alcalina. La cantidad de activación de complemento correlaciona con la intensidad de color y se mide en cuanto a absorbencia (densidad óptica DO). Usando este equipo, ambos INH C1 recombinante humano (rhC1-INH) de la invención y INH C1 derivado de plasma (PdC1-INH) demostraron tener capacidades de inhibición similares para la vía clásica. No obstante, el INH C1 de la invención demostró tener approximadamente un 20% más de capacidad de inhibición para la vía MBL que el INH C1 derivado de plasma (véase ejemplo 3). [0025] The activation of the different complement pathways is preferably measured in human sera by the Wielisa kit (product No. COMPL 300, Wieslab, Sweeden). This is a commercially available immune enzyme assay, specific for the detection of each of the three complement pathways with CSb-C9 deposition as a common reading. Briefly, wells of the microtiter strips are coated with specific activators of each of the three complement pathways. Human serum is diluted in diluent containing specific blocker to ensure that only the respective route is activated. The INH C1 of the invention or its plasma-derived duplicate is subsequently added at a concentration between 0 and 75 µmol, incubated for 30 minutes at room temperature and added to the wells. During a subsequent incubation of the diluted human serum in the well for 60 minutes at 37 ° C, the complement is activated by the specific coating. The wells are then washed and C5b-C9 formed are detected with a specific alkaline phosphatase labeled anti C5b-C9 antibody. After another washing step, the detection of specific antibodies is obtained by incubation with alkaline phosphatase substrate solution. The amount of complement activation correlates with color intensity and is measured in terms of absorbency (DO optical density). Using this equipment, both human recombinant INH C1 (rhC1-INH) of the invention and plasma-derived INH C1 (PdC1-INH) were shown to have similar inhibition capabilities for the classical pathway. However, the INH C1 of the invention proved to have approximately 20% more inhibitory capacity for the MBL pathway than the plasma-derived INH C1 (see example 3).

[0026] Por lo tanto, en esta forma de realización preferida, la glicosilación diferente del INH C1 para uso en la presente invención resulta en una afinidad más alta para un MBP en comparación con su duplicado derivado de plasma, que resulta en una inhibición más eficaz de MBP, conduciendo a una inhibición más eficaz de la vía de lectina. La inhibición más eficaz de la vía de lectina preferiblemente incluye al menos 5% más inhibición, incluso más preferiblemente al menos 10% más inhibición, incluso más preferiblemente al menos 15% más inhibición incluso más preferiblemente al menos 20% incluso más preferiblemente al menos 25% incluso más preferiblemente al menos 30% incluso más preferiblemente al menos 35% incluso más preferiblemente al menos 40% incluso más preferiblemente al menos 45% incluso más preferiblemente al menos 50% incluso más preferiblemente al menos 55% incluso más preferiblemente al menos 60% incluso más preferiblemente al menos 65% incluso más preferiblemente al menos 70% incluso más preferiblemente al menos 75% incluso más preferiblemente al menos 80% incluso más preferiblemente al menos 85% incluso más preferiblemente al menos 90% incluso más preferiblemente al menos 95% y de la forma más preferible al menos 98% más de inhibición. La activación de la vía de lectina es preferiblemente medida con el kit Wielisa como se ha descrito anteriormente. [0026] Therefore, in this preferred embodiment, glycosylation other than INH C1 for use in the present invention results in a higher affinity for an MBP compared to its plasma-derived duplicate, which results in further inhibition. effective MBP, leading to a more effective inhibition of the lectin pathway. The most effective inhibition of the lectin pathway preferably includes at least 5% more inhibition, even more preferably at least 10% more inhibition, even more preferably at least 15% more inhibition even more preferably at least 20% even more preferably at least 25 % even more preferably at least 30% even more preferably at least 35% even more preferably at least 40% even more preferably at least 45% even more preferably at least 50% even more preferably at least 55% even more preferably at least 60% even more preferably at least 65% even more preferably at least 70% even more preferably at least 75% even more preferably at least 80% even more preferably at least 85% even more preferably at least 90% even more preferably at least 95% and most preferably at least 98% more inhibition. The activation of the lectin pathway is preferably measured with the Wielisa kit as described above.

[0027] El método de la invención se puede aplicar para prevenir, reducir o tratar cualquier tipo de isquemia y lesión por reperfusión. Preferiblemente, el método de la invención se aplica donde la isquemia y herida por reperfusión se sabe que surge al menos en parte, más preferiblemente principalmente mediante la vía de lectina. Para isquemia de miocardio y lesión por reperfusión (J Immunology 2005, 175: 541-546), lesión por reperfusión de isquemia renal (Sen J Pathol. 2004 165(5):1677-88), lesión por reperfusión de isquemia gastrointestinal (J Inmmnol. 2005 15:174(10):6373-80), y para accidente cerebrovascular (deSimoni et al, 2004 Ser J. Pathol. 164:1857-63) ha demostrado que la lesión por reperfusión surge principalmente mediante la vía de lectina y dificilmente mediante la vía clásica. Por lo tanto, un INH C1 de la invención es preferiblemente un inhibidor más potente de la vía de lectina en comparación con su duplicado derivado de plasma natural. Preferiblemente un INH C1 de la invención es un inhibidor in vivo más potente de la vía de lectina en hombre en comparación con su duplicado derivado de plasma natural. [0027] The method of the invention can be applied to prevent, reduce or treat any type of ischemia and reperfusion injury. Preferably, the method of the invention is applied where ischemia and reperfusion injury is known to arise at least in part, more preferably primarily through the lectin pathway. For myocardial ischemia and reperfusion injury (J Immunology 2005, 175: 541-546), reperfusion injury of renal ischemia (Sen J Pathol. 2004 165 (5): 1677-88), reperfusion injury of gastrointestinal ischemia (J Inmmnol. 2005 15: 174 (10): 6373-80), and for stroke (deSimoni et al, 2004 Ser J. Pathol. 164: 1857-63) has shown that reperfusion injury arises primarily through the lectin pathway and hardly through the classical way. Therefore, an INH C1 of the invention is preferably a more potent inhibitor of the lectin pathway compared to its duplicate derived from natural plasma. Preferably a C1 INH of the invention is a more potent in vivo inhibitor of the lectin pathway in man compared to its duplicate derived from natural plasma.

[0028] A diferencia del modelo experimental usado en los ejemplos aquí, la incidencia de isquemia en la vida real es frecuentemente un evento imprevisto. Por lo tanto la administración de INH C1 antes de la incidencia de isquemia y/o reperfusión posterior no es generalmente una opción realizable e inevitablemente en la práctica INH C1 tendrá que ser administrado algún tiempo sino varias horas después de la isquemia y/o reperfusión posterior. Esto, no obstante, limita seriamente la utilidad terapéutica del INH C1 derivado de plasma convencional porque es principalmente inefectivo cuando se administra depués de la reperfusión isquémica y sólo tiene una franja de tiempo muy pequeña para la eficacia terapéutica (ver Figura 2 y deSimoni et al, 2004 Ser J. Pathol. 164:1857-63). En cambio, un INH C1 para uso en la presente invención tal como se ha definido anteriormente, sigue siendo capaz de ejercer sus efectos neuroprotectores también cuando se inyecta al menos 1 hora después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o 30 minutos después del inicio de la reperfusión. Por lo tanto, el INH C1 de la invención se administra al menos al final o después del periodo isquémico, es decir cuando el tejido isquémico sufre la reperfusión. Más preferiblemente, el INH C1 de la invención se administra al menos 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 o 120 minutos después del periodo isquémico o después del inicio de la reperfusión. Preferiblemente, el INH C1 de la invención se administra no más de 24, 12, 6, 4 o 3 horas después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o reperfusión. En otra forma de realización preferida, el inhibidor C1 se administra al menos 3 horas después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o reperfusión, preferiblemente al menos 6 horas, más preferiblemente al menos 9 horas, incluso más preferiblemente al menos 18 horas. [0028] Unlike the experimental model used in the examples here, the incidence of real-life ischemia is often an unforeseen event. Therefore the administration of INH C1 before the incidence of ischemia and / or subsequent reperfusion is not generally a workable option and inevitably in practice INH C1 will have to be administered some time but several hours after the ischemia and / or subsequent reperfusion . This, however, severely limits the therapeutic utility of conventional plasma-derived INH C1 because it is mainly ineffective when administered after ischemic reperfusion and only has a very small time frame for therapeutic efficacy (see Figure 2 and de Simoni et al. , 2004 Ser J. Pathol. 164: 1857-63). In contrast, an INH C1 for use in the present invention as defined above, remains capable of exerting its neuroprotective effects also when injected at least 1 hour after ischemia or after the onset of ischemia and / or 30 minutes after the start of reperfusion. Therefore, the INH C1 of the invention is administered at least at the end or after the ischemic period, that is when the ischemic tissue undergoes reperfusion. More preferably, the INH C1 of the invention is administered at least 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 or 120 minutes after the ischemic period or after the onset of reperfusion. Preferably, the INH C1 of the invention is administered no more than 24, 12, 6, 4 or 3 hours after ischemia or after the onset of ischemia and / or reperfusion. In another preferred embodiment, the C1 inhibitor is administered at least 3 hours after ischemia or after the onset of ischemia and / or reperfusion, preferably at least 6 hours, more preferably at least 9 hours, even more preferably at minus 18 hours

[0029] En una forma de realización preferida, el método se aplica para prevenir, reducir o tratar una incidencia imprevista, repentina o aguda de reperfusión isquémica. Condiciones y trastornos asociados a una incidencia imprevista, repentina o aguda de reperfusión isquémica incluyen pero de forma no limitativa lesión por reperfusión isquémica tras un infarto de miocardio agudo (IMA), tras un accidente cerebrovascular, incluyendo accidente cerebrovascular perinatal, tras un shock hemorrágico, tras una isquemia intestinal, tras una cirugía coronaria de emergencia por angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP), después de cualquier cirugía vascular con pinzamiento transversal de vaso sanguíneo (p. ej. de aorta, conduciendo a isquemia de músculo esquelético), o después de pancreatitis tras la manipulación del conducto pancreático o bilial (ERCP). En tales ejemplos el INH C1 de la invención se administra preferiblemente al menos 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 o 120 minutos después del infarto de miocardio agudo (IMA), después de un accidente cerebrovascular, incluyendo accidente cerebrovascular perinatal, después de un shock hemorrágico, después de isquemia intestinal, después de cirugía coronaria de emergencia por angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP), después de cualquier cirugía vascular con pinzamiento transversal de vaso sanguíneo (p. ej. de aorta, conduciendo a isquemia de músculo esquelético), o después de pancreatitis tras la manipulación del conducto pancreático o bilial (ERCP). Alternativamente, el tiempo de administrar el INH C1 de la invención se puede definir como preferiblemente al menos 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 o 120 minutos después del inicio de la reperfusión. [0029] In a preferred embodiment, the method is applied to prevent, reduce or treat an unexpected, sudden or acute incidence of ischemic reperfusion. Conditions and disorders associated with an unforeseen, sudden or acute incidence of ischemic reperfusion include but not limited to ischemic reperfusion injury after an acute myocardial infarction (IMA), after a stroke, including perinatal stroke, after hemorrhagic shock, after intestinal ischemia, after emergency coronary surgery for percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA), after any vascular surgery with transverse blood vessel impingement (eg aorta, leading to skeletal muscle ischemia), or after pancreatitis after manipulation of the pancreatic or bile duct (ERCP). In such examples the INH C1 of the invention is preferably administered at least 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 or 120 minutes after acute myocardial infarction (IMA), after a stroke, including perinatal stroke, after hemorrhagic shock, after intestinal ischemia, after emergency coronary surgery for percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA), after any vascular surgery with transverse blood vessel impingement (e.g. aorta, leading to skeletal muscle ischemia), or after pancreatitis after manipulation of the pancreatic or bile duct (ERCP). Alternatively, the time of administering the INH C1 of the invention can be defined as preferably at least 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 or 120 minutes after the start of reperfusion.

[0030] Además, la lesión por reperfusión improvista isquémica es preferiblemente definida como un lesión por reperfusión isquémica donde una terapia o cirugía inducen a una reperfusión pero no a una isquemia. Tal terapia o cirugía incluye pero no se limitan a: [0030] In addition, ischemic reperfusion injury is preferably defined as an ischemic reperfusion injury where therapy or surgery induces reperfusion but not ischemia. Such therapy or surgery includes but is not limited to:

--: trombolisis farmacológica, incluyendo terapias endovasculares e intravenosas por accidente cerebrovascular, síndromes coronarios agudos, oclusión periférica arterial, émbolo pulmonar, oclusión de arteria renal, Pharmacological thrombolysis, including intravascular and intravenous stroke therapies, acute coronary syndromes, peripheral arterial occlusion, pulmonary embolism, renal artery occlusion,

--: trombolisis mecánica, por ejemplo, intervención coronaria percutánea, angioplastia arterial periférica, angioplastia arterial visceral, mechanical thrombolysis, for example, percutaneous coronary intervention, peripheral arterial angioplasty, visceral arterial angioplasty,

--: injerto de bypass aortocoronario, aortocoronary bypass graft,

--: endarterectomía carotídea, carotid endarterectomy,

--: isquemia mesentérica, mesenteric ischemia,

--: shock incluyendo el de tipo hemorrágico, cardiogénico, neurogénico, analfiláctico, shock including hemorrhagic, cardiogenic, neurogenic, analphylactic type,

--: fallo de colgajo, por ejemplo cirugía plástica, flap failure, for example plastic surgery,

--: reimplantación de dedos y brazos, reimplantation of fingers and arms,

--: intestino estrangulado. strangulated intestine

[0031] Alternativamente, en otra forma de realización preferida, el método se aplica para prevenir, reducir o tratar una incidencia prevista de reperfusión isquémica. Una incidencia prevista de lesión por reperfusión de isquemia incluye preferiblemente un ajuste en el que una terapia o cirugía inducen a una isquemia y posteriormente una reperfusión. Una lista no limitativa se da a continuación de terapia o cirugía en donde hay un periodo inducido temporal de flujo sanguíneo bajo o nulo, es decir, isquemia o hipoxia, seguido de reperfusión: [0031] Alternatively, in another preferred embodiment, the method is applied to prevent, reduce or treat an expected incidence of ischemic reperfusion. An expected incidence of ischemia reperfusion injury preferably includes an adjustment in which a therapy or surgery induces ischemia and subsequently reperfusion. A non-limiting list is given following therapy or surgery where there is a temporary induced period of low or no blood flow, that is, ischemia or hypoxia, followed by reperfusion:

--: bypass cardiopulmonar, cardiopulmonary bypass,

--: reparación de aneurisma, incluyendo aórtico o cerebral, aneurysm repair, including aortic or cerebral,

--: endarterectomía carotídea en la que una grapa se usa durante la cirugía, carotid endarterectomy in which a staple is used during surgery,

--: parada circulatoria con hipotermia profunda, circulatory arrest with deep hypothermia,

--: uso de torniquete, es decir, en ajustes de traumatismo, use of tourniquet, that is, in trauma settings,

--: transplante de órgano sólido, solid organ transplant,

--: cualquier otra rotura yatrogénica de flujo sanguíneo. any other yatrogenic blood flow rupture.

[0032] Además, condiciones y trastornos asociados a una incidencia prevista de lesión por reperfusión isquémica incluyen, pero de forma no limitativa, lesión por reperfusión isquémica después de un transplante de órgano (pulmón, hígado, riñón, corazón), después de cualquier cirugía vascular con pinzamiento transversal de vaso sanguíneo (p. ej. de aorta, conduciendo a isquemia de músculo esquelético), o después de pancreatitis después de manipulación de un conducto pancreático o bilial (ERCP), después o durante la circulación extra corporal (ECC). [0032] In addition, conditions and disorders associated with an expected incidence of ischemic reperfusion injury include, but are not limited to, ischemic reperfusion injury after an organ transplant (lung, liver, kidney, heart), after any surgery. vascular with transverse blood vessel impingement (e.g. aorta, leading to skeletal muscle ischemia), or after pancreatitis after manipulation of a pancreatic or bile duct (ERCP), after or during extra-bodily circulation (ECC) .

[0033] En una forma de realización preferida del método para la prevención, reducción o tratamiento de al menos una incidencia prevista de isquemia y lesión por reperfusión, el INH C1 de la invención se administra al menos al final o después del periodo isquémico, es decir cuando el tejido isquémico sufre reperfusión. Más preferiblemente, el INH C1 de la invención se administra al menos 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 o 120 minutos después del periodo isquémico o después del inicio de reperfusión. Preferiblemente, el INH C1 de la invención se administra no más de 24, 12, 6, 4 o 3 horas después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o reperfusión. En otra forma de realización preferida, el inhibidor C1 se administra al menos una hora después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o reperfusión, 3 horas después de la isquemia o después de la aparición de la isquemia y/o reperfusión, preferiblemente al menos 6 horas, más preferiblemente al menos 9 horas, incluso más preferiblemente al menos 18 horas. [0033] In a preferred embodiment of the method for the prevention, reduction or treatment of at least one expected incidence of ischemia and reperfusion injury, the INH C1 of the invention is administered at least at the end or after the ischemic period, it is say when ischemic tissue undergoes reperfusion. More preferably, the INH C1 of the invention is administered at least 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 or 120 minutes after the ischemic period or after the onset of reperfusion. Preferably, the INH C1 of the invention is administered no more than 24, 12, 6, 4 or 3 hours after ischemia or after the onset of ischemia and / or reperfusion. In another preferred embodiment, the C1 inhibitor is administered at least one hour after ischemia or after the onset of ischemia and / or reperfusion, 3 hours after ischemia or after the onset of ischemia and / or reperfusion, preferably at least 6 hours, more preferably at least 9 hours, even more preferably at least 18 hours.

[0034] Según una forma de realización preferida, el INH C1 de la invención se administra continuamente a un sujeto en su necesidad y/o en caso de un transplante de órgano al órgano a ser transplantado. El órgano a ser transplantado es preferiblemente conservado en una composición con un medio adecuado y cantidad adecuada de INH C1. [0034] According to a preferred embodiment, the INH C1 of the invention is continuously administered to a subject in need and / or in case of an organ transplant to the organ to be transplanted. The organ to be transplanted is preferably preserved in a composition with a suitable medium and adequate amount of INH C1.

[0035] En una forma de realización más preferida, el método se aplica en una incidencia imprevista de reperfusión isquémica. Incluso más preferiblemente, una incidencia de lesión por reperfusión isquémica después de un accidente cerebrovascular o un accidente cerebrovascular perinatal. En estos tipos de incidencia imprevista de reperfusión isquémica, demostramos que el inhibidor C1 de la invención ejercita un efecto neuroprotector en la penumbra isquémica. La penumbra isquémica hace referencia preferiblemente al hipocampo y/o córtex. Un efecto neuroprotector preferiblemente significa que la neurodegeneración se contrarresta en el hipocampo y/o córtex después del tratamiento con el inhibidor C1 de la invención hasta 3 horas después de la aparición de isquemia en el hipocampo y hasta 9 horas después de la aparición de isquemia en el córtex. Más preferiblemente, la neurodegeneración se contrarresta hasta 4, 5, 6 horas o más en el hipocampo y hasta 10, 11, 12 horas o más en la isquemia. La neurodegeneración se evalua preferiblemente como en el ejemplo 2: secciones de cerebro se tintan con un marcador específico para degeneración neuronal, preferiblemente Jade (Schmued LC, et al, referencia 4) y se analizan con microscopia fluorescente. Usando este método, el contrarresto de neurodegeneración supone que al menos 2% menos de células coloreadas se visualizan en la muestra tratada en comparación con la muestra no tratada. Preferiblemente, el contrarresto neurodegeneración supone al menos 5% menos de células coloreadas, al menos 7%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40% o más. [0035] In a more preferred embodiment, the method is applied in an unforeseen incidence of ischemic reperfusion. Even more preferably, an incidence of ischemic reperfusion injury after a stroke or perinatal stroke. In these types of unforeseen incidence of ischemic reperfusion, we demonstrate that the C1 inhibitor of the invention exerts a neuroprotective effect in ischemic penumbra. Ischemic penumbra preferably refers to the hippocampus and / or cortex. A neuroprotective effect preferably means that neurodegeneration is counteracted in the hippocampus and / or cortex after treatment with the C1 inhibitor of the invention up to 3 hours after the appearance of ischemia in the hippocampus and up to 9 hours after the appearance of ischemia in The cortex More preferably, neurodegeneration is counteracted up to 4, 5, 6 hours or more in the hippocampus and up to 10, 11, 12 hours or more in ischemia. Neurodegeneration is preferably evaluated as in Example 2: brain sections are stained with a specific marker for neuronal degeneration, preferably Jade (Schmued LC, et al, reference 4) and analyzed with fluorescent microscopy. Using this method, the neurodegeneration counteract assumes that at least 2% less colored cells are visualized in the treated sample compared to the untreated sample. Preferably, the neurodegeneration counteract is at least 5% less colored cells, at least 7%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40% or more.

[0036] Alternativamente o en combinación con la forma de realización anterior mencionada, el uso del inhibidor C1 ejercita una reducción de la lesión inducida por la isquemia y/o reperfusión. Más preferiblemente, cuando la lesión por reperfusión isquémica ocurrida después de un accidente cerebrovascular o un accidente cerebrovascular perinatal, el uso del inhibidor C1 de la invención ejercita una reducción del tamaño del infarto. Incluso más preferiblemente, el tamaño del infarto se cuantifica como se presenta en el ejemplo 2. Incluso más preferiblemente, usando este método de cuantificación, al menos 3 horas después de la aparición de la isquemia, una reducción de al menos 10% del tamaño del infarto se alcanza, incluso más preferiblemente al menos 20%, incluso más preferiblemente al menos 40%, incluso más preferiblemente al menos 60%, incluso más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%,y de la forma más preferible al menos 90%. [0036] Alternatively or in combination with the above-mentioned embodiment, the use of the C1 inhibitor exerts a reduction in the injury induced by ischemia and / or reperfusion. More preferably, when the ischemic reperfusion injury occurred after a stroke or perinatal stroke, the use of the C1 inhibitor of the invention exerts a reduction in the size of the infarction. Even more preferably, the size of the infarction is quantified as presented in Example 2. Even more preferably, using this method of quantification, at least 3 hours after the onset of ischemia, a reduction of at least 10% of the size of the infarction is achieved, even more preferably at least 20%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, and most preferably at least 90%

[0037] Un INH C1 para uso en los métodos de la invención puede ser parte de composiciones farmacéuticas del estado de la técnica. Estas composiciones farmacéuticas típicamente comprenden el INH C1 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar de varias formas dependiendo de si el tratamiento sistémico o local es deseado, el área a ser tratada y la estabilidad del compuesto activo. Formulaciones adecuadas dependerán del método de administración. La composición farmacéutica se administra preferiblemente por administración parenteral, tal como por ejemplo por intravenosa, intra-arterial, inyección intramuscular o subcutánea intraperitoneal o infusión; o por administración intracraneal o intratecal. En una forma de realización preferida se administra por infusión intravenosa. Formulaciones adecuadas para la administración parenteral se conocen en la técnica y son formulaciones típicamente líquidas. Las preparaciones de INH C1 para administración parental deben ser estériles. La esterilización se realiza por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o siguiendo la liofilización y reconstitución. Las preparaciones de INH C1 se pueden administrar continuamente por infusión o por inyección en bolo. Las formulaciones líquidas de INH C1 pueden por ejemplo ser administradas por una bomba de infusión. Una composición típica para infusión intravenosa podría contener de 100 a 500 ml de NaCl 0,9% estéril o 5% de glucosa opcionalmente suplementada con un 20% de solución de albúmina y 100 a 500 mg del INH C1. Una composición típica farmacéutica para la inyección intramuscular contendría, por ejemplo, 1 - 10 ml de agua tamponada estéril y 1 a 250 mg del INH C1 de la presente invención. Métodos para preparar composiciones parenteralmente administrables se conocen bien en la técnica y son descritas en más detalle en varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporada por referencia en su totalidad para todos los objetivos). [0037] An INH C1 for use in the methods of the invention may be part of pharmaceutical compositions of the prior art. These pharmaceutical compositions typically comprise INH C1 and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. These pharmaceutical compositions can be administered in various ways depending on whether systemic or local treatment is desired, the area to be treated and the stability of the active compound. Appropriate formulations will depend on the method of administration. The pharmaceutical composition is preferably administered by parenteral administration, such as for example by intravenous, intra-arterial, intramuscular or subcutaneous intraperitoneal injection or infusion; or by intracranial or intrathecal administration. In a preferred embodiment, it is administered by intravenous infusion. Formulations suitable for parenteral administration are known in the art and are typically liquid formulations. INH C1 preparations for parental administration must be sterile. Sterilization is performed by filtration through sterile filtration membranes, before or following lyophilization and reconstitution. INH C1 preparations can be administered continuously by infusion or by bolus injection. The liquid formulations of INH C1 can for example be administered by an infusion pump. A typical composition for intravenous infusion could contain 100 to 500 ml of 0.9% sterile NaCl or 5% glucose optionally supplemented with 20% albumin solution and 100 to 500 mg of the INH C1. A typical pharmaceutical composition for intramuscular injection would contain, for example, 1-10 ml of sterile buffered water and 1 to 250 mg of the INH C1 of the present invention. Methods for preparing parenterally administrable compositions are well known in the art and are described in more detail in various sources, including, for example, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporated by reference in its totality for all objectives).

[0038] La dosis efectiva, es decir concentración eficaz y frecuencia, del INH C1 cuando se usa en los métodos de la invención dependerá de la composición específica farmacéutica que se usa, la gravedad de la enfermedad y el estado general de la salud del paciente.En general, la dosis efectiva de una composición farmacéutica que se basa en un INH C1 para uso en los métodos de la invención se pueden encontrar por optimización de rutina. Un punto de partida adecuado es la dosis que se usa para la composición equivalente farmacéutica que se basa en el INH C1 derivado de plasma. Una gran ventaja de una composición farmacéutica de la invención es que una alta dosis inicial se puede utilizar en el tratamiento, lo que realza la probabilidad de tratamiento exitoso. Esta alta dosis inicial es posible debido a que el INH C1 en la composición farmacéutica de la invención muestra un espacio más rápido que su duplicado natural. En particular para el tratamiento de casos agudos, puede ser ventajoso una alta dosis inicial del INH C1 de la invención. Esta alta dosis inicial puede ser al menos 1.5, al menos 2, 3 o 4 veces la dosis del duplicado natural que sería administrado. [0038] The effective dose, ie effective concentration and frequency, of the INH C1 when used in the methods of the invention will depend on the specific pharmaceutical composition used, the severity of the disease and the general state of the patient's health. In general, the effective dose of a pharmaceutical composition that is based on a C1 INH for use in the methods of the invention can be found by routine optimization. A suitable starting point is the dose that is used for the pharmaceutical equivalent composition that is based on the plasma-derived INH C1. A great advantage of a pharmaceutical composition of the invention is that a high initial dose can be used in the treatment, which enhances the probability of successful treatment. This high initial dose is possible because the INH C1 in the pharmaceutical composition of the invention shows a space faster than its natural duplicate. In particular for the treatment of acute cases, a high initial dose of the INH C1 of the invention may be advantageous. This high initial dose may be at least 1.5, at least 2, 3 or 4 times the dose of the natural duplicate that would be administered.

[0039] En una forma de realización preferida, el INH C1 de la invención se administra por vía intravenosa a una dosis superior a 50, 100, 200, 400, 600, 800, o 1000 U /kg masa corporal del individuo, preferiblemente en el intervalo de 50 - 2000, 100 - 1000, 200 - 800, 400-700 o 500-700 U/kg masa corporal del individuo. Una unidad (U) de INH C1 es la cantidad de INH C1 presente en 1 mililitro de sangre humana. Una unidad corresponde a aproximadamente 275 microgramos de INH C1 derivado de plasma. Asumiendo un peso molecular de 110,000 dalton, la concentración en plasma humano de INH C1 es de 2,5 micromoles por litro (Nuijens et al. (1989), J. Clin.Invest. 84:443). [0039] In a preferred embodiment, the INH C1 of the invention is administered intravenously at a dose greater than 50, 100, 200, 400, 600, 800, or 1000 U / kg body mass of the individual, preferably in the range of 50-2000, 100-1000, 200-800, 400-700 or 500-700 U / kg body mass of the individual. One unit (U) of INH C1 is the amount of INH C1 present in 1 milliliter of human blood. One unit corresponds to approximately 275 micrograms of plasma-derived INH C1. Assuming a molecular weight of 110,000 dalton, the concentration in human plasma of INH C1 is 2.5 micromoles per liter (Nuijens et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 443).

[0040] En otra forma de realización preferida del método de la invención la composición farmacéutica contiene un agente trombolítico o es para uso en combinación con un agente trombolítico o después del tratamiento posterior con tal agente. Un agente trombolítico se entiende aquí como un agente (fármaco) que es capaz de disolver un coágulo de sangre (trombo) y reabre una arteria o vena. Los agentes trombolíticos son normalmente serina proteasas y convierten plasminógeno en plasmina que rompe el fibrinógeno y fibrina y disuelve el coágulo. Agentes trombolíticos preferidos incluyen reteplasa (r-PA o Retavasa), alteplasa (t-PA o Activasa), uroquinasa (Abboquinasa), prouroquinasa, complejo activador de estreptoquinasa purificada anisoilada (APSAC), y estreptoquinasa. [0040] In another preferred embodiment of the method of the invention the pharmaceutical composition contains a thrombolytic agent or is for use in combination with a thrombolytic agent or after further treatment with such an agent. A thrombolytic agent is understood herein as an agent (drug) that is capable of dissolving a blood clot (thrombus) and reopens an artery or vein. The thrombolytic agents are normally serine proteases and convert plasminogen to plasmin that breaks fibrinogen and fibrin and dissolves the clot. Preferred thrombolytic agents include reteplase (r-PA or Retavase), alteplase (t-PA or Activase), urokinase (Abbokinase), prourokinase, anisolated purified streptokinase activator complex (APSAC), and streptokinase.

[0041] En otro aspecto, la invención pertenece al uso de un INH C1 de la invención tal y como se define anteriormente para la producción de un medicamento para la prevención, reducción o tratamiento de lesión por reperfusión conforme a cualquiera de los métodos definidos anteriormente. [0041] In another aspect, the invention pertains to the use of an INH C1 of the invention as defined above for the production of a medicament for the prevention, reduction or treatment of reperfusion injury according to any of the methods defined above. .

[0042] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que unidades que siguen al verbo se incluyen, pero unidades no específicamente mencionadas no se excluyen. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad que más de un elemento se presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" significa normalmente "al menos uno". [0042] In this document and in its claims, the verb "understand" and their conjugations are used in their non-limiting sense to mean that units that follow the verb are included, but units not specifically mentioned are not excluded. In addition, the reference to an item by the indefinite article " a " or "a" It does not exclude the possibility that more than one element is present, unless the context clearly requires that there be one and only one of the elements. The indefinite article " a " or "a" normally means "at least one".

Descripción de las figuras Description of the figures

[0043] [0043]

Figura 1 Evaluación de tamaño de infarto cuarenta y ocho horas después de la isquemia en ratones tratados con solución salina o con 15U RhC1-INH (INH C1 humano recombinante, véase ejemplo 1.2) por ratón antes y después de una hora de la isquemia. Figure 1 Evaluation of infarct size forty-eight hours after ischemia in mice treated with saline or with 15U RhC1-INH (recombinant human INH C1, see example 1.2) per mouse before and after one hour of ischemia.

Figura 2 Evaluación de tamaño de infarto veinticuatro horas después de isquemia en ratones tratados con solución salina o con 15U de INH C1 derivado de plasma por ratón 1 hora antes y después de la isquemia. Figure 2 Evaluation of infarct size twenty-four hours after ischemia in mice treated with saline solution or with 15U of plasma-derived INH C1 per mouse 1 hour before and after ischemia.

Figura 3 Volumen de infarto evaluado 48h después de isquemia en ratones recibiendo solución salina o 15U/ratón de RhC1-INH de conejo en puntos de tiempo diferentes del principio de isquemia. Los datos se expresan de la siguiente manera ± SEM (n=6 ratones por grupo). *P<0.05; **P<0.01 contra solución salina, ANOVA de sentido único y Dunnett como prueba post-hoc. Figure 3 Infarct volume evaluated 48h after ischemia in mice receiving saline or 15U / mouse of rabbit RhC1-INH at different time points from the beginning of ischemia. Data are expressed as follows ± SEM (n = 6 mice per group). * P <0.05; ** P <0.01 against saline solution, one-way ANOVA and Dunnett as post-hoc test.

Figura 4 Evaluación Semi-cuantitativa de tinción Fluoro-Jade.- = no positividad, + = baja positividad, ++ = positividad intermedia, +++ = alta positividad. Figure 4 Semi-quantitative evaluation of Fluoro-Jade staining.- = no positivity, + = low positivity, ++ = intermediate positivity, +++ = high positivity.

Figura 5 Imágenes representativas de neurodegeneración por tinción Fluoro-Jade en el estriatum de ratones isquémicos recibiendo solución salina o 15U/ratón de RhC1-INH de conejo en puntos de tiempo diferentes de la aparición de isquemia. Barra: 100μm. Figure 5 Representative images of neurodegeneration by Fluoro-Jade staining in the striatum of ischemic mice receiving saline or 15U / mouse of rabbit RhC1-INH at different time points of the appearance of ischemia. Bar: 100μm

Figura 6 Imágenes representativas de neurodegeneración por tinción Fluoro-Jade en el giro dentado de ratones isquémicos recibiendo solución salina o 15U/ratón de INH C1 de conejo en puntos de tiempo diferentes de la aparición de isquemia. Barra: 100μm. Figure 6 Representative images of neurodegeneration by Fluoro-Jade staining in the dentate gyrus of ischemic mice receiving saline or 15U / mouse of rabbit INH C1 at different time points of the appearance of ischemia. Bar: 100μm

Figura 7 Imágenes representativas de neurodegeneración por tinción Fluoro-Jade en el córtex de ratones isquémicos recibiendo solución salina o 15U/ratón de INH C1 de conejo en puntos de tiempo diferentes de la aparición de isquemia. Barra: 100μm. Figure 7 Representative images of neurodegeneration by Fluoro-Jade staining in the cortex of ischemic mice receiving saline or 15U / mouse of rabbit INH C1 at different time points of the appearance of ischemia. Bar: 100μm

Figura 8 Volumen de infarto evaluado 48h después de la isquemia en ratones recibiendo solución salina o 5, 10, 15U/ratón de RhC1-INH de conejo 3 horas después de la aparición de isquemia. Los datos se expresan de la siguiente manera + SEM (n=6 ratones por grupo). **P<0.01 contra solución salina, ANOVA de sentido único y Dunnett como prueba post-hoc. Figure 8 Infarct volume evaluated 48h after ischemia in mice receiving saline or 5, 10, 15U / mouse of rabbit RhC1-INH 3 hours after the onset of ischemia. Data are expressed as follows + SEM (n = 6 mice per group). ** P <0.01 against saline solution, one-way ANOVA and Dunnett as post-hoc test.

Figura 9 Volumen de infarto evaluado 48h después de la isquemia en ratones recibiendo solución salina o 15U/ratón de PdC1-INH o INH C1 de vaca o conejo tres horas después de la aparición de la isquemia. Los datos se expresan de la siguiente forma ± SEM (n=6 ratones por grupo). *P<0.05; **P<0.01 contra solución salina, ANOVA de sentido único y Dunnett como prueba post-hoc. Figure 9 Infarct volume evaluated 48h after ischemia in mice receiving saline or 15U / mouse PdC1-INH or INH C1 from cow or rabbit three hours after the onset of ischemia. Data are expressed as follows ± SEM (n = 6 mice per group). * P <0.05; ** P <0.01 against saline solution, one-way ANOVA and Dunnett as post-hoc test.

Figura 10 Déficits generales (superiores al panel 10a) y focales (inferiores al panel 10b) evaluados 48h después de la isquemia en ratones recibiendo solución salina o 15U/ratón de PdC1-INH o INH C1 de vaca o conejo tres horas después de la aparición de la isquemia. (n=6 ratones por grupo). **P<0.01 contra solución salina, ANOVA de sentido único y Kruskal-Wallis como prueba post-hoc. Figure 10 General (upper panel 10a) and focal (lower panel 10b) deficits evaluated 48h after ischemia in mice receiving saline solution or 15U / mouse of PdC1-INH or INH C1 of cow or rabbit three hours after onset of ischemia. (n = 6 mice per group). ** P <0.01 against saline solution, one-way ANOVA and Kruskal-Wallis as post-hoc test.

Figura 11 Visión general de las diferentes vías de activación de complemento. Figure 11 Overview of the different complement activation pathways.

Figuras 12, 13 Efecto de RhC1-INH y PdC1-INH al activar la vía de complemento tradicional. Dosis en aumento de RhC1-INH o PdC1-INH (eje x) se añadió a dos muestras diferentes de suero normal de humano (muestra 1 panel superior. muestra 2 panel inferior). Como control, el tampón en el que RhC1-INH es disuelto (20 mM citrato, 0.19 M sacarosa pH 6.8, 0.22 μm filtrada) fue tomado a lo largo de las mismas diluciones como INH C1hr. La lectura fue deposición de CSb-9, el control de suero normal en el ensayo definiendo 100% (eje v). Los datos son la media y SD (n = 3). Figures 12, 13 Effect of RhC1-INH and PdC1-INH when activating the traditional complement pathway. Increasing dose of RhC1-INH or PdC1-INH (x axis) was added to two different samples of normal human serum (sample 1 upper panel. Sample 2 lower panel). As a control, the buffer in which RhC1-INH is dissolved (20 mM citrate, 0.19 M sucrose pH 6.8, 0.22 μm filtered) was taken along the same dilutions as INH C1hr. The reading was deposition of CSb-9, the normal serum control in the assay defining 100% (v axis). The data are the mean and SD (n = 3).

Figuras 14, 15 Efecto de RhC1-INH y PdC1-INH al activar la vía de complemento MBL. Dosis en aumento de RhC1-INH o PdC1-INH (eje x) se añadieron a dos muestras diferentes de suero normal de humano (muestra 1 panel superior. muestra 2 panel inferior). Como control, el tampón en el que RhC1-INH es disuelto (20 mM citrato, 0.19 M sacarosa pH 6.8, 0.22 μm filtrada) fue tomado a lo largo de las mismas diluciones como INH C1hr. La lectura fue deposición de C5b-9, el control de suero normal en el ensayo definiendo 100% (eje y). Los datos son la media y SD (n = 3). Figures 14, 15 Effect of RhC1-INH and PdC1-INH when activating the MBL complement pathway. Increasing doses of RhC1-INH or PdC1-INH (x-axis) were added to two different samples of normal human serum (sample 1 upper panel. Sample 2 lower panel). As a control, the buffer in which RhC1-INH is dissolved (20 mM citrate, 0.19 M sucrose pH 6.8, 0.22 μm filtered) was taken along the same dilutions as INH C1hr. The reading was deposition of C5b-9, the normal serum control in the assay defining 100% (y axis). The data are the mean and SD (n = 3).

Figura 16 Efecto de INH rhc y PdC1-INH al activar la vía clásica y MBL de complemento de activación. Dosis en aumento de RhC1-INH o PdC1-INH se añadieron a dos muestras diferentes de suero de humano normal. Como control, el tampón en el que RhC1-INH se disuelve (20 mM citrato, 0.19 M sacarosa pH 6.8, 0.22 μm filtrada) fue tomado a lo largo de las mismas diluciones como INH C1hr. La lectura fue deposición de CSb-9 y la activación de complemento de porcentaje fue calculada por medición con esta fórmula: (Muestra-NC)/(PC-NC')x100. PC se fija en 100%. Los resultados mostrados son la media SD de 3 diluciones independientes en cada concentración evaluada. Figure 16 Effect of INH rhc and PdC1-INH when activating the classical pathway and MBL activation complement. Increasing doses of RhC1-INH or PdC1-INH were added to two different samples of normal human serum. As a control, the buffer in which RhC1-INH dissolves (20 mM citrate, 0.19 M sucrose pH 6.8, 0.22 μm filtered) was taken along the same dilutions as INH C1hr. The reading was deposition of CSb-9 and percentage complement activation was calculated by measurement with this formula: (Sample-NC) / (PC-NC ') x100. PC is set at 100%. The results shown are the mean SD of 3 independent dilutions in each concentration evaluated.

Ejemplos Examples

Ejemplo 1 Example 1

[0044] Experimentos precedentes mostraron que una única dosis de RhC1-INH (15U/ratón) administrada al principio del periodo isquémico, reduce significativamente el volumen isquémico, según la evaluación 48 horas después de la isquemia en nuestro modelo de ratón con isquemia cerebral focal de una manera muy similar al INH C1 derivado de plasma. En este ejemplo hemos explorado la franja de tiempo de eficacia para la actividad neuroprotectora de RhC1-INH en el volumen isquémico y déficits funcionales. También hemos estudiado el efecto de RhC1-INH en resultado de 7 días por evaluación de la respuesta glial y de neurodegeneración. [0044] Previous experiments showed that a single dose of RhC1-INH (15U / mouse) administered at the beginning of the ischemic period significantly reduces ischemic volume, as assessed 48 hours after ischemia in our mouse model with focal cerebral ischemia in a manner very similar to the plasma-derived INH C1. In this example we have explored the time slot of efficacy for the neuroprotective activity of RhC1-INH in ischemic volume and functional deficits. We have also studied the effect of RhC1-INH as a result of 7 days by evaluation of the glial response and neurodegeneration.

1. Métodos 1. Methods

1.1 Isquemia cerebral focal transitoria 1.1 Transient focal cerebral ischemia

[0045] La isquemia ocurrió por oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) tal y como se describe anteriormente (De Simoni et al., 2003 y 2004, supra). La anestesia fue inducida por 5% isoflurano en N2O/O2 (70/30%) mezclada y mantenida por 1.5 2% isoflurano en la misma mezcla. Para confirmar la adecuación de la oclusión vascular en cada animal, el flujo sanguíneo fue medido con láser doppler de flujometría (Transonic BLF-21) usando una sonda de fibra óptica flexible de 0,5 mm (Transonic, tipo M, 0,5 mm diámetro) situada en la superficie de cerebro y fijada con material de impresión en el cráneo en las siguientes coordenadas: AP =.-1mm; L= -3,5mm. Brevemente, la arteria carótida adecuada común fue expuesta y un filamento siliconizado (7-0), fue introducido en la arteria carótida interna a través de una incisión realizada en la arteria carótida común y avanzada a la arteria anterior cerebral para bloquear su bifurcación en la arteria anterior cerebral y el anticuerpo monoclonal. El filamento fue avanzado hasta que una reducción del flujo sanguíneo de >70%, en comparación con la línea base preisquémica, fue observada. Después de 30 min de isquemia, el flujo sanguíneo fue restaurado eliminando cuidadosamente el filamento de nilón. [0045] Ischemia occurred due to occlusion of the middle cerebral artery (MCAO) as described above (De Simoni et al., 2003 and 2004, supra). Anesthesia was induced by 5% isoflurane in N2O / O2 (70/30%) mixed and maintained by 1.5 2% isoflurane in the same mixture. To confirm the adequacy of vascular occlusion in each animal, blood flow was measured with flowmetry Doppler laser (Transonic BLF-21) using a 0.5 mm flexible fiber optic probe (Transonic, type M, 0.5 mm diameter) located on the surface of the brain and fixed with impression material in the skull at the following coordinates: AP = .- 1mm; L = -3.5mm. Briefly, the common adequate carotid artery was exposed and a siliconized filament (7-0) was introduced into the internal carotid artery through an incision made in the common carotid artery and advanced to the cerebral anterior artery to block its bifurcation in the Anterior cerebral artery and monoclonal antibody. The filament was advanced until a blood flow reduction of> 70%, compared to the preischemic baseline, was observed. After 30 min of ischemia, blood flow was restored by carefully removing the nylon filament.

1.2 Tratamiento con medicamentos 1.2 Drug treatment

[0046] Los ratones recibieron una única inyección iv de RhC1-INH a la dosis de 15U/ratón en 150 μl o el mismo volumen de solución salina en tiempos diferentes de la isquemia: [0046] The mice received a single iv injection of RhC1-INH at the dose of 15U / mouse in 150 µl or the same volume of saline at different times of ischemia:

--: al principio del periodo isquémico (pre RhC1-INH). at the beginning of the ischemic period (pre RhC1-INH).

--: al final del periodo isquémico (post RhC1-INH). at the end of the ischemic period (post RhC1-INH).

--: una hora después del principio del periodo isquémico (1h-post RhC1-INH). RhC1-INH usado en este estudio fue producido en conejos transgénicos que expresaron INH C1 humano en sus glándulas mamarias y purificaron la leche obtenida de estos animales como se describe en WO 01/57079. one hour after the beginning of the ischemic period (1h-post RhC1-INH). RhC1-INH used in this study was produced in transgenic rabbits that expressed human INH C1 in their mammary glands and purified the milk obtained from these animals as described in WO 01/57079.

1.3 Evaluación de déficits neurológicos 1.3 Evaluation of neurological deficits

[0047] Cuarenta y ocho horas después de la isquemia, cada ratón fue estimado en dos escalas de función neurológicas únicas al ratón, por un investigador entrenado unido a las condiciones experimentales. Para ratones de déficits generales fueron marcados de 0 a 28 en cada una de las siguientes categorías: pelo, orejas, ojos, actividad espontánea, comportamiento epiléptico. Para ratones de déficits focales fueron marcados de 0 a 28 en cada una de las siguientes categorías: simetría del cuerpo, ascenso, simetría de brazo anterior, giro obligatorio, respuesta sensorial. Los datos se expresan como media y percentiles del 25º al 75º. [0047] Forty-eight hours after ischemia, each mouse was estimated on two neurological function scales unique to the mouse, by a trained researcher attached to the experimental conditions. For mice of general deficits they were marked from 0 to 28 in each of the following categories: hair, ears, eyes, spontaneous activity, epileptic behavior. For mice with focal deficits, they were marked from 0 to 28 in each of the following categories: body symmetry, ascent, anterior arm symmetry, mandatory turn, sensory response. Data are expressed as mean and percentiles from 25th to 75th.

1.4 Cuantificación del tamaño de infarto 1.4 Quantification of infarct size

[0048] Cuarenta y ocho horas después de la isquemia, los ratones fueron profundamente anestesiados con Equitensin (120 μl/ratones, ip) y transcardialmente perfundidos con 30ml de PBS 0.1mol/l, pH 7.4, seguidos de 60ml de paraformaldheide enfriado (4%) en PBS. Después de eliminar cuidadosamente los cerebros del cráneo, fueron transferidos a 30% de sacarosa en PBS a 4°C durante toda la noche para crioprotección. Los cerebros fueron luego rápidamente congelados por inmersión en isopentano a - 45°C durante 3 min siendo sellados antes en viales y almacenados a -70°C hasta su uso. Para determinar el tamaño de lesión, secciones de corona de cerebro de 20 μm fueron cortadas en serie a intervalos de 240 μm y tintados con rojo neutral (Neutral Red Gurr Certistain, BDH, Inglaterra). En cada estrato, las áreas de infarto fueron evaluados ciegamente y delineadas por la palidez relativa de coloración histológica. El área de infarto fue determinada al substraer el área del tejido saludable en el hemisferio ipsilateral del área del hemisferio contralateral en cada sección. Los volúmenes de infarto fueron calculados por la integración de áreas de infarto en cada estrato de cerebro como cuantificado con analizador de imagen asistida de ordenador y calculado por sistema de imagen analítica. [0048] Forty-eight hours after ischemia, the mice were deeply anesthetized with Equitensin (120 µl / mice, ip) and transcardially perfused with 30ml of 0.1mol / l PBS, pH 7.4, followed by 60ml of cooled paraformaldheide (4 %) in PBS. After carefully removing the brains from the skull, they were transferred to 30% sucrose in PBS at 4 ° C overnight for cryoprotection. The brains were then quickly frozen by immersion in isopentane at -45 ° C for 3 min, being sealed in vials before and stored at -70 ° C until use. To determine the size of the lesion, 20 μm brain crown sections were cut in series at 240 μm intervals and stained with neutral red (Neutral Red Gurr Certistain, BDH, England). In each stratum, the infarct areas were blindly evaluated and delineated by the relative paleness of histological coloration. The area of infarction was determined by subtracting the area of healthy tissue in the ipsilateral hemisphere from the area of the contralateral hemisphere in each section. The infarct volumes were calculated by the integration of infarct areas in each brain stratum as quantified with computer-assisted image analyzer and calculated by analytical imaging system.

1.5 Prueba a campo abierto 1.5 Open field test

[0049] Siete días después el comportamiento del ratón con isquemia fue evaluado por la prueba a campo abierto. Esta prueba puede ser útil para detectar la ansiedad y explorar el comportamiento y la actividad locomotora en ratones isquémicos a largo plazo. El campo abierto consistía de una caja de plástico (41 x 41 x 41cm) conteniendo 4 objetos diferentes. El área del campo abierto fue dividida en una zona central de 28 x 28cm y la zona de confin circundante. Los ratones fueron individualmente colocados en el centro del campo abierto y su comportamiento fue observado durante 5 minutos por unos expertos ajenos a las condiciones experimentales. El número de cruces internos (principalmente relacionados con comportamiento de ansiedad), cruces exteriores (principalmente relacionados con actividad de motor), traseros (principalmente relacionados con comportamiento explorador) y contactos con objetos (principalmente relacionados con actividad sensorial/motor) se contó. [0049] Seven days later, the behavior of the mouse with ischemia was evaluated by the open field test. This test can be useful for detecting anxiety and exploring locomotor behavior and activity in long-term ischemic mice. The open field consisted of a plastic box (41 x 41 x 41cm) containing 4 different objects. The open field area was divided into a central area of 28 x 28cm and the surrounding confinement zone. The mice were individually placed in the center of the open field and their behavior was observed for 5 minutes by experts outside the experimental conditions. The number of internal crossings (mainly related to anxiety behavior), external crossings (mainly related to motor activity), rear crossings (mainly related to exploratory behavior) and contacts with objects (mainly related to sensory / motor activity) were counted.

1.6 Cuenta Neuronal 1.6 Neural Account

[0050] Siete días después de la isquemia, los ratones fueron perfundidos transcardialmente tal y como se describe anteriormente. Para determinar la cuenta neuronal, secciones coronarias de cerebro de 20μm fueron cortadas en serie a 640 μm intervalos y tintadas con cresil violeta (Cresyl Violet acetate, Sigma, St. Luis, MO). Tres secciones de ipsi- y hemisferios colaterales de 20 μm fueron seleccionadas para la cuenta neuronal. La primera sección fue en las coordenadas estereotáxicas anteroposterior a +0.86 de bregma. La cantidad de pérdida neuronal fue calculada combinando el número de neuronas viables en tres secciones de ambos hemisferios y expresado como porcentaje de hemisferio controlateral. Un microscopio Olimpus BX61, lindado con cámara de vídeo con Soft Imaging System Colorview y software AnalySIS fue usada. El análisis cuantitativo fue realizado en una ampliación de 40X por unos investigadores ajenos al tratamiento. [0050] Seven days after ischemia, mice were perfused transcardially as described above. To determine the neuronal count, 20μm coronary sections of the brain were cut in series at 640 μm intervals and stained with cresyl violet (Cresyl Violet acetate, Sigma, St. Louis, MO). Three sections of ipsi- and collateral hemispheres of 20 μm were selected for the neuronal count. The first section was in the stereotactic coordinates anteroposterior to +0.86 of bregma. The amount of neuronal loss was calculated by combining the number of viable neurons in three sections of both hemispheres and expressed as a percentage of controlateral hemisphere. An Olimpus BX61 microscope, bounded with a video camera with Soft Imaging System Colorview and AnalySIS software was used. The quantitative analysis was performed in a 40X magnification by researchers outside the treatment.

1.71.7: Inmunohistoquímica para astrocitos y microglia Immunohistochemistry for astrocytes and microglia

[0051] Siete días después de la isquemia secciones cerebrales coronarias de 20μm de grosor de ratones isquémicos fueron preparadas y usadas para evaluar la inmunocoloración de los astrocitos y microglia/macrófagos. Brevemente, las secciones fueron enjuagadas durante 30 minutos en 0.4% Tritón 100 X-100 en 0.1 mol/L PBS seguido de 15 minutos en 0.1% Tritón X-100 y 3% de suero de cabra normal (NGS) en PBS. Las secciones fueron luego incubadas durante toda la noche con anticuerpos para astrocitos y microglia (anti- GFAP 1:1500, Chemicon; anti-CD11b 1:250, gentilmente donado por Dr. A. Doni, Mario Negri institute). El día siguiente, las secciones fueron lavadas en PBS e incubadas con anticuerpos secundarios biotinilados durante 1 hora, lavadas e incubadas con avidin-biotinperoxidasa. Después de reaccionar con 3 -3-diaminobenzidina tetrahidrocloruro las secciones fueron lavadas, secadas, deshidratadas a través de alcoholes clasificados, fijados en xileno y cubiertos usando DPX montante antes del análisis de microscopía óptica. [0051] Seven days after ischemia, 20μm thick coronary brain sections of ischemic mice were prepared and used to evaluate the immunocoloration of astrocytes and microglia / macrophages. Briefly, the sections were rinsed for 30 minutes in 0.4% Triton 100 X-100 in 0.1 mol / L PBS followed by 15 minutes in 0.1% Triton X-100 and 3% normal goat serum (NGS) in PBS. Sections were then incubated overnight with antibodies to astrocytes and microglia (anti-GFAP 1: 1500, Chemicon; anti-CD11b 1: 250, kindly donated by Dr. A. Doni, Mario Negri institute). The next day, the sections were washed in PBS and incubated with biotinylated secondary antibodies for 1 hour, washed and incubated with avidin-biotinperoxidase. After reacting with 3 -3-diaminobenzidine tetrahydrochloride the sections were washed, dried, dehydrated through classified alcohols, fixed in xylene and covered using upright DPX before optical microscopy analysis.

2.2.: Resultados Results

2.1 Ventana de tiempo de eficacia 2.1 Time window of effectiveness

2.1.1 Evaluación de déficits neurológicos 2.1.1 Evaluation of neurological deficits

[0052] Déficits neurológicos fueron evaluados en ratones isquémicos recibiendo RhC1-INH o solución salina 48h después de la isquemia. Una ligera, aunque no significante, reducción en cada grupo de ratones tratados con RhC1-INH fue observada en comparación con los ratones isquémicos tratados en solución salina (pre RhC1-INH: 9 y 12 post RhC1-INH: 7 y 11; post-1h RhC1-INH: 9 y 13, solución salina: 10 y 12.5, media de déficits focales y generales, respectivamente) (datos no mostrados). [0052] Neurological deficits were evaluated in ischemic mice receiving RhC1-INH or saline solution 48h after ischemia. A slight, though not significant, reduction in each group of mice treated with RhC1-INH was observed compared to ischemic mice treated in saline (pre RhC1-INH: 9 and 12 post RhC1-INH: 7 and 11; post- 1h RhC1-INH: 9 and 13, saline: 10 and 12.5, average of focal and general deficits, respectively) (data not shown).

2.1.2 Evaluación del tamaño de infarto 2.1.2 Evaluation of infarct size

[0053] Cuarenta y ocho horas después de la isquemia los ratones tratados con RhC1-INH mostraron una reducción notable del volumen isquémico, a 15U/ratón pre, post y 1 hora post dosis (13.67 ± 2.59mm3, 9.06 ± 0.77mm3 y 8.24 ± 1.00 mm3, respectivamente), en comparación con ratones tratados con solución salina (41.51 ± 7.01mm3) (Figura 1, los datos se expresan como media ± SEM). [0053] Forty-eight hours after ischemia, mice treated with RhC1-INH showed a marked reduction in ischemic volume, at 15U / mouse pre, post and 1 hour post dose (13.67 ± 2.59mm3, 9.06 ± 0.77mm3 and 8.24 ± 1.00 mm3, respectively), compared to mice treated with saline solution (41.51 ± 7.01mm3) (Figure 1, the data are expressed as mean ± SEM).

2.2 Resultados tras siete días 2.2 Results after seven days

2.2.1 Prueba a campo abierto 2.2.1 Open field test

[0054] La isquemia indujo una reducción significante en el número de crías en comparación con animales no tratados mientras en el grupo tratado con RhC1-INH este parámetro no era diferente de los ratones no isquémicos. Los otros parámetros evaluados no mostraron ninguna diferencia entre los tres grupos. [0054] Ischemia induced a significant reduction in the number of offspring compared to untreated animals while in the group treated with RhC1-INH this parameter was not different from non-ischemic mice. The other parameters evaluated showed no difference between the three groups.

2.2.2 Cuenta Neuronal 2.2.2 Neural Account

[0055] Para evaluar si el efecto de protección de RhC1-INH es de larga duración, evaluamos la pérdida de neuronas siete días después de la inducción de isquemia y el tratamiento con el fármaco. Los resultados muestran que el efecto de protección de INH C1 sigue estando presente en ese momento: 14% ± 2.18% contra 4% ± 1.24% media de solución salina y ratones tratados con RhC1-INH, respectivamente (datos no mostrados). [0055] To assess whether the protective effect of RhC1-INH is long-lasting, we evaluate the loss of neurons seven days after the induction of ischemia and drug treatment. The results show that the protection effect of INH C1 is still present at that time: 14% ± 2.18% against 4% ± 1.24% of saline and mice treated with RhC1-INH, respectively (data not shown).

2.2.32.2.3: Inmunohistoquímica para microglía/macrófagos y astrocitos Immunohistochemistry for microglia / macrophages and astrocytes

[0056] Siete días después de la isquemia una gran cantidad de microglía activada y macrófagos infiltrados fueron observados en el hipocampo lesionado y estriado de ratones isquémicos recibiendo solución salina (datos no mostrados). Quince unidades de pre-RhC1-INH fueron capaces de contrarrestar esta activación e infiltración en las áreas consideradas (datos no mostrados). El hipocampo ipsilateral de ratones isquémicos tratados con solución salina mostraron una ligera astrocitosis que no fue diferente de la observada en ratones isquémicos RhC1-INH (datos no mostrados). Otras áreas del cerebro no mostraron ninguna activación de astrocitosis relevante en ningún grupo. [0056] Seven days after ischemia a large amount of activated microglia and infiltrated macrophages were observed in the injured and striated hippocampus of ischemic mice receiving saline (data not shown). Fifteen units of pre-RhC1-INH were able to counteract this activation and infiltration in the areas considered (data not shown). The ipsilateral hippocampus of ischemic mice treated with saline showed a slight astrocytosis that was not different from that observed in RhC1-INH ischemic mice (data not shown). Other areas of the brain showed no relevant astrocytosis activation in any group.

3.3.: Conclusiones Conclusions

[0057] Los presentes datos muestran que RhC1-INH en la dosis de 15U/ratón es de forma similar eficaz al reducir el volumen isquémico cuando se administra al principio (pre) o al final del periodo isquémico (es decir, después de la reperfusión). Más importante, el inhibidor es capaz de ejercer sus efectos neuroprotectores también cuando se inyecta 1 hora después de la aparición de la isquemia (post 1h). Además, la acción de protección de RhC1-INH sigue estando presente 7 días después de la isquemia. Estos resultados están en contraste con INH C1h derivado de plasma que cuando se inyecta 1 horas después de la isquemia ha perdido practicamente la capacidad para ejercer efectos neuroprotectores (ver Figura 2). [0057] The present data show that RhC1-INH at the dose of 15U / mouse is similarly effective in reducing ischemic volume when administered at the beginning (pre) or at the end of the ischemic period (ie, after reperfusion ). More importantly, the inhibitor is able to exert its neuroprotective effects also when it is injected 1 hour after the onset of ischemia (post 1h). In addition, the protective action of RhC1-INH is still present 7 days after ischemia. These results are in contrast to plasma-derived INH C1h that when injected 1 hours after ischemia has practically lost the ability to exert neuroprotective effects (see Figure 2).

[0058] Los resultados principales de este estudio son los siguientes: [0058] The main results of this study are the following:

1.one.: la vida media de RhC1-INH en plasma de ratón es de aproximadamente 3 horas (a una dosis de 15U/ratón). La buena correlación entre antígeno y actividad funcional indica que la proteína recombinante circula en plasma en su forma activa sólo; es posible que la distribución de tejido contribuya a la reducción de niveles de plasma. The half-life of RhC1-INH in mouse plasma is approximately 3 hours (at a dose of 15U / mouse). The good correlation between antigen and functional activity indicates that the recombinant protein circulates in plasma in its active form only; It is possible that tissue distribution contributes to the reduction of plasma levels.

2.2.: RhC1-INH, en la dosis de 15U/ratón -pre es muy eficaz en reducir el volumen isquémico (reducción del 69%). RhC1-INH, at the dose of 15U / mouse -pre is very effective in reducing ischemic volume (69% reduction).

3.3.: RhC1-INH en la dosis de 15U/ratón es capaz de reducir claramente el número de neuronas de degeneración en el hipocampo como se ha evaluado por tinción Fluoro-Jade indicando así que la reducción en volumen isquémico se debe a la preservación de las neuronas. RhC1-INH at the dose of 15U / mouse is able to clearly reduce the number of degeneration neurons in the hippocampus as assessed by Fluoro-Jade staining, thus indicating that the reduction in ischemic volume is due to the preservation of neurons.

4.Four.: RhC1-INH es de forma similar eficaz al reducir el volumen isquémico cuando se administra al principio (pre), al final del periodo isquémico (es decir, post reperfusión) o 1 hora después de la aparición de la isquemia (post 1h, es decir 30 min del principio de reperfusión). Así RhC1-INH tiene una ventana de tiempo más amplia de eficacia que PdC1-INH (que es no más eficaz cuando se administra 1h después de la isquemia). RhC1-INH is similarly effective in reducing ischemic volume when administered at the beginning (pre), at the end of the ischemic period (i.e., post reperfusion) or 1 hour after the onset of ischemia (post 1h, i.e. 30 min from the reperfusion principle). Thus RhC1-INH has a broader time window of efficacy than PdC1-INH (which is no more effective when administered 1h after ischemia).

5. 5.: el efecto neuroprotector de la dosis pre-RhC1-INH es de larga duración, como se mostró en la cuenta neuronal realizada 7 días después del principio de isquemia. The neuroprotective effect of the pre-RhC1-INH dose is long-lasting, as shown in the neuronal count performed 7 days after the onset of ischemia.

6.6.: RhC1-INH, indujo una ligera mejora de déficits focales y generales evaluados 48 horas después de la isquemia. Este hallazgo es similar al observado con PdC1-INH. Para evaluar el efecto de RhC1-INH en resultados de conducta a largo plazo, analizamos el comportamiento de ratón con pruebas a campo abierto. Siete días después de la isquemia el comportamiento de las crías muestra una puntuación significativamente inferior en los isquémicos en comparación con ratones no tratados. Esta reducción no está presente en ratones tratados con RhC1-INH cuya puntuación no es diferente de los ratones de control. RhC1-INH, induced a slight improvement of focal and general deficits evaluated 48 hours after ischemia. This finding is similar to that observed with PdC1-INH. To assess the effect of RhC1-INH on long-term behavioral outcomes, we analyzed mouse behavior with open field tests. Seven days after ischemia, the behavior of the offspring shows a significantly lower score in the ischemic compared to untreated mice. This reduction is not present in mice treated with RhC1-INH whose score is not different from control mice.

7.7.: RhC1-INH es capaz de contrarrestar la activación/reclutamiento de microglía/macrófagos en el cerebro de ratones isquémicos como se ha evaluado a ambos en puntos de tiempo tempranos (48h) y tardíos (7 días). Estas células son un índice de la respuesta inflamatoria del tejido cerebral. RhC1-INH is able to counteract the activation / recruitment of microglia / macrophages in the brain of ischemic mice as both have been evaluated at early (48h) and late (7 days) time points. These cells are an index of the inflammatory response of brain tissue.

8.8.: La fuerte respuesta astrocítica suscitada por la isquemia a las 48h se humedece con RhC1-INH. La activación astrocítica disminuye notablemente a los 7 días en ambos grupos experimentales y ninguna diferencia entre los ratones tratados con solución salina y los tratados con RhC1-INH se puede observar. The strong astrocytic response caused by ischemia at 48h is moistened with RhC1-INH. Astrocytic activation decreases markedly at 7 days in both experimental groups and no difference between mice treated with saline and those treated with RhC1-INH can be observed.

Ejemplo 2: estudio en la acción neuroprotectora de RhC1-INH en modelos de ratón con isquemia cerebral focal Example 2: study on the neuroprotective action of RhC1-INH in mouse models with focal cerebral ischemia

[0059] Hemos demostrado previamente que 15U de RhC1-INH tienen una acción neuroprotectora marcada en un modelo de isquemia/reperfusión cerebral de murina también cuando se administra 1 hora después de la aparición de isquemia/reperfusión, en variación con PdC1-INH que, en ese momento de post-tratamiento, ya no es eficaz. Esta neuroprotección es de larga duración, de hecho siete días después de la isquemia y el tratamiento, cerebros isquémicos de ratones tratados con RhC1-INH todavía muestran un tamaño disminuido de infarto. En los siguientes experimentos hemos determinado la ventana de tiempo de eficacia (más allá de 1 hora después) y la respuesta de dosis de la actividad neuroprotectora de RhC1-INH en el volumen isquémico. Además hemos realizado una comparación directa entre PdC1-INH, y RhC1-INH de conejo y vaca (en la dosis y puntos más efectivos para RhC1-INH de conejo) usando el mismo protocolo. [0059] We have previously shown that 15U of RhC1-INH have a marked neuroprotective action in a murine cerebral ischemia / reperfusion model also when administered 1 hour after the onset of ischemia / reperfusion, in variation with PdC1-INH which, At that time of post-treatment, it is no longer effective. This neuroprotection is long lasting, in fact seven days after ischemia and treatment, ischemic brains of mice treated with RhC1-INH still show a decreased infarct size. In the following experiments we have determined the time window of efficacy (beyond 1 hour later) and the dose response of the neuroprotective activity of RhC1-INH in the ischemic volume. We have also made a direct comparison between PdC1-INH, and RhC1-INH of rabbit and cow (in the most effective dose and points for RhC1-INH of rabbit) using the same protocol.

MÉTODOS METHODS

Animales Animals

[0060] Los procedimientos implicando animales y su cuidado fueron llevados a cabo conforme a las pautas institucionales de acuerdo con las leyes nacionales (D.L. n.116, G.U. suppl. 40, 18 Febrero 1992) y leyes internacionales y pólizas (EEC Consejo Directivo 86/609, OJ L 358,1 Dec.12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council EEUU 1996). Ratones macho C57B1/6 (26-28 g, Charles River, Calco, Italia) fueron alojados en jaulas, 5 en cada una, y mantenidos a temperatura constante (21±1°C) y humedad relativa (60 %) con horario regular ligero/oscuro (7 am-7 μm). Alimentos (gránulos de Altromin para ratones) y agua disponible ad libitum. [0060] The procedures involving animals and their care were carried out in accordance with institutional guidelines in accordance with national laws (DL n.116, GU suppl. 40, 18 February 1992) and international laws and policies (EEC Board of Directors 86 / 609, OJ L 358.1 Dec. 12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US National Research Council USA 1996). C57B1 / 6 male mice (26-28 g, Charles River, Calco, Italy) were housed in cages, 5 in each, and kept at constant temperature (21 ± 1 ° C) and relative humidity (60%) with regular hours light / dark (7 am-7 μm). Food (Altromin granules for mice) and water available ad libitum.

Isquemia cerebral focal transitoria Transient focal cerebral ischemia

[0061] Isquemia fue conseguida por oclusión de la arterial cerebral media (MCAO) como previamente se describió en 1"3. Anestesia fue inducida por 5% isoflurano en NaO/Oa (70/30%) mezcla y mantenida por 1.5-2% isoflurano en la misma mezcla. Para confirmar la adecuación de la oclusión vascular en cada animal, el flujo sanguíneo fue medido por láser doppler flujométrico (Transonic BLF-21) usando una sonda de fibra óptica de 0.5mm, (tipo Transonic M, 0,5 mm diámetro) situado en la superficie del cerebro y fijado con material de impresión en el cráneo en las siguientes coordenadas: AP = -1mm; L= -3,5mm. Brevemente, la arteria carótida adecuada común fue expuesta y un filamento siliconizado (7-0) fue introducido en la arteria carótida interna a través de una incisión realizada en la arteria carótida común y avanzada a la arteria anterior cerebral para bloquear su bifurcación en la arteria anterior cerebral y el MCA. El filamento fue avanzado hasta que una reducción de >70% del flujo sanguíneo, En comparación con línea base preisquémica, fue observada. Después de 30 min de isquemia, el flujo sanguíneo fue restaurado al eliminar cuidadosamente el filamento de nilón. [0061] Ischemia was achieved by middle cerebral arterial occlusion (MCAO) as previously described in 1 "3. Anesthesia was induced by 5% isoflurane in NaO / Oa (70/30%) mixture and maintained by 1.5-2% isoflurane in the same mixture. To confirm the adequacy of vascular occlusion in each animal, blood flow was measured by flowmeter doppler laser (Transonic BLF-21) using a 0.5mm fiber optic probe, (Transonic M type, 0.5mm diameter) located at the surface of the brain and fixed with impression material in the skull at the following coordinates: AP = -1mm; L = -3.5mm. Briefly, the common adequate carotid artery was exposed and a siliconized filament (7-0) was introduced into the internal carotid artery through an incision made in the common carotid artery and advanced to the cerebral anterior artery to block its bifurcation in the artery Anterior cerebral and MCA. The filament was advanced until a> 70% reduction in blood flow, compared to preischemic baseline, was observed. After 30 min of ischemia, blood flow was restored by carefully removing the nylon filament.

Tratamiento con medicamentos Medication treatment

[0062] Ratones recibidos una única inyección iv de INH C1(RhC1-INH de conejo, RhC1-INH de vaca o PdC1-INH) en dosis diferentes en tiempos diferentes de isquemia. Ratones de control recibieron el mismo volumen de solución salina. [0062] Mice received a single iv injection of INH C1 (rabbit RhC1-INH, cow RhC1-INH or PdC1-INH) at different doses at different times of ischemia. Control mice received the same volume of saline.

Evaluación de déficits neurológicos. Evaluation of neurological deficits.

[0063] Cuarenta y ocho horas después de la isquemia, cada ratón fue estimado en dos escalas de función neurológicas únicas al ratón, por unos investigadores expertos ajenos a las condiciones experimentales. Para déficits generales los ratones fueron marcados de 0 a 28 en cada una de las siguientes categorías: pelo, orejas, ojos, actividad espontánea, comportamiento epiléptico. Para déficits focales los ratones fueron marcados de 0 a 28 en cada una de las siguientes categorías: simetría del cuerpo, movimiento, escalada, simetría de brazo anterior, giro obligatorio, respuesta sensorial. Los datos se expresan en media y percentiles. [0063] Forty-eight hours after ischemia, each mouse was estimated on two neurological function scales unique to the mouse, by expert researchers outside the experimental conditions. For general deficits the mice were marked from 0 to 28 in each of the following categories: hair, ears, eyes, spontaneous activity, epileptic behavior. For focal deficits the mice were marked from 0 to 28 in each of the following categories: body symmetry, movement, climbing, anterior arm symmetry, mandatory turning, sensory response. Data are expressed in average and percentiles.

Cuantificación del tamaño de infarto Quantification of infarct size

[0064] Cuarenta y ocho horas después de la isquemia, los ratones fueron profundamente anestesiados con Equitensin (120jil/ratones, ip) y perfundidos transcardialmente con 30ml de PBS O.lmol/1, pH 7.4, seguidos de 60ml de enfriado paraformaldheide (4%) en PBS. Después de quitar cuidadosamente los cerebros del cráneo, fueron transferidos a 30% sacarosa en PBS a 4°C durante toda la noche para crioprotección. Los cerebros fueron luego rápidamente congelados por inmersión en isopentano a -45°C durante 3 min siendo sellado antes en viales y almacenado a -70°C hasta su uso. Para determinación el tamaño de la lesión, 20fjm secciones de cerebro coronarias fueron cortadas en serie a 240(j,m intervalos y tintadas con rojo neutral (Neutral Red Gurr Certistain, BDH, Inglaterra). En cada sección, las áreas afectadas fueron evaluadas ciegamente y delineadas por la palidez relativa de la coloración histológica. El área afectada fue determinada por substraer el área del tejido saludable en el hemisferio ipsilateral del área del hemisferio contralateral en cada sección. Los volúmenes de infarto fueron calculados por la integración de áreas afectadas en cada sección de cerebro como se cuantificó con analizador de imagen asistida de ordenador y se calculó por sistema de imagen analítica. [0064] Forty-eight hours after ischemia, the mice were deeply anesthetized with Equitensin (120 jil / mice, ip) and transcardially perfused with 30ml of PBS O.lmol / 1, pH 7.4, followed by 60ml of paraformaldheide cooling (4 %) in PBS. After carefully removing the brains from the skull, they were transferred to 30% sucrose in PBS at 4 ° C overnight for cryoprotection. The brains were then quickly frozen by immersion in isopentane at -45 ° C for 3 min being sealed in vials before and stored at -70 ° C until use. To determine the size of the lesion, 20fjm coronary brain sections were cut in series at 240 (j, m intervals and stained with neutral red (Neutral Red Gurr Certistain, BDH, England). In each section, the affected areas were blindly evaluated and delineated by the relative paleness of the histological coloration.The affected area was determined by subtracting the area of healthy tissue in the ipsilateral hemisphere from the area of the contralateral hemisphere in each section.The infarction volumes were calculated by the integration of affected areas in each Brain section as quantified with computer-assisted image analyzer and calculated by analytical imaging system.

Evaluación de neurodegeneración Neurodegeneration evaluation

[0065] La presencia de neurodegeneración fue evaluada en 20 secciones gruesas de obstrucción por coloración con Fluoro-Jade4, una etiqueta para la degeneración neuronal. Brevemente, las secciones fueron secadas y rehidratadas en etanol (100% - 75%) y agua destilada. Luego, ellos fueron incubados en 0.06% permanganato de potasio durante 15 minutos, lavadas en agua destilada y transferidas a 0.001% Solución de tinción de Fluro-Jade durante 30 minutos. Después de la coloración, las secciones fueron enjuagadas en agua destilada, secadas, sumergidas en xileno y cubiertas usando DPX mountant (BDH, Poole, UK) antes análisis de microscopía fluorescente. [0065] The presence of neurodegeneration was evaluated in 20 thick sections of obstruction by coloration with Fluoro-Jade4, a label for neuronal degeneration. Briefly, the sections were dried and rehydrated in ethanol (100% - 75%) and distilled water. Then, they were incubated in 0.06% potassium permanganate for 15 minutes, washed in distilled water and transferred to 0.001% Fluro-Jade staining solution for 30 minutes. After coloring, the sections were rinsed in distilled water, dried, dipped in xylene and covered using DPX mountant (BDH, Poole, UK) before fluorescent microscopy analysis.

RESULTADOS RESULTS

VENTANA DE TIEMPO DE EFICACIA EN ISQUEMIA TRANSITORIA EFFECTIVENESS TIME WINDOW IN TRANSITIONAL ISCHEMIA

[0066] Para evaluar la ventana de tiempo de eficacia, 15U de RhC1-INH de conejo o solución salina fueron dadas a 3, 6, 9, 18 y 24 horas del principio de isquemia. Cuarenta y ocho horas más tarde, ratones isquémicos tratados con RhC1-INH de conejo 3 y 6 horas después de la aparición de isquemia mostraron una reducción marcada de volumen isquémico (11,71±0,63mm3 y 20,38±2.37mm3, respectivamente) en comparación con los ratones isquémicos tratados en solución salina (44,43±5,94mm3). También cuando se administra 9 y 18 horas después de la isquemia, el RhC1-INH fue todavía eficaz, aunque a una extensión menor (23,63±4,11mm3 y 27,13±2,58mm3 respectivamente). Veinticuatro horas después de la isquemia el inhibidor perdió su acción beneficiosa (41,92±2,76mm3).(Fig.3). En ratones tratados en solución salina, la tinción Fluoro-Jade mostró que, la neurodegeneración estaba presente en córtex estriado e hipocampo. Cuando administrado en puntos de tiempo tempranos, RhC1-INH fue capaz de contrarrestar la neurodegeneración en hipocampo (hasta 3 horas) y en córtex (hasta a 9 horas). Cuando los ratones fueron tratados con este inhibidor 6 y 9 horas después de la isquemia, algunas neuronas de degeneración fueron observadas en hipocampo. En puntos de tratamiento más tardíos (18 y 24 horas), cuando el volumen isquémico fue más grande, la tinción Fluoro-Jade mostró la presencia de neurodegeneración en el córtex. En todos los puntos de tiempo considerados, el estriatum mostró una neurodegeneración intensiva, tanto en los tratados con solución salina como con los animales tratados con RhC1-INH (Fig.5, 6, 7). Una evaluación semi-cuantitativa de tinción de Fluoro-Jade para cada animal fue realizada por unos investigadores ajenos a las condiciones experimentales (Figura 4). [0066] To evaluate the efficacy time window, 15U of rabbit RhC1-INH or saline solution were given at 3, 6, 9, 18 and 24 hours from the beginning of ischemia. Forty-eight hours later, ischemic mice treated with rabbit RhC1-INH 3 and 6 hours after the onset of ischemia showed a marked reduction in ischemic volume (11.71 ± 0.63mm3 and 20.38 ± 2.37mm3, respectively ) compared to ischemic mice treated in saline solution (44.43 ± 5.94mm3). Also when administered 9 and 18 hours after ischemia, RhC1-INH was still effective, although to a lesser extent (23.63 ± 4.11mm3 and 27.13 ± 2.58mm3 respectively). Twenty-four hours after ischemia the inhibitor lost its beneficial action (41.92 ± 2.76mm3) (Fig. 3). In mice treated in saline solution, Fluoro-Jade staining showed that neurodegeneration was present in striatum cortex and hippocampus. When administered at early time points, RhC1-INH was able to counteract neurodegeneration in the hippocampus (up to 3 hours) and in the cortex (up to 9 hours). When mice were treated with this inhibitor 6 and 9 hours after ischemia, some degeneration neurons were observed in the hippocampus. At later treatment points (18 and 24 hours), when the ischemic volume was larger, Fluoro-Jade staining showed the presence of neurodegeneration in the cortex. At all the time points considered, striatum showed intensive neurodegeneration, both in those treated with saline and with animals treated with RhC1-INH (Fig. 5, 6, 7). A semi-quantitative evaluation of Fluoro-Jade staining for each animal was performed by researchers outside the experimental conditions (Figure 4).

RESPUESTA DE DOSIS EN ISQUEMIA TRANSITORIA DOSE RESPONSE IN TRANSITIONAL ISCHEMIA

[0067] Ya que la dosis de INH C1 usada en seres humanos para angioedema hereditario es inferior a la usada en ratones para el tratamiento de accidente cerebrovascular, dosis inferiores fueron usadas en nuestro modelo isquémico. Basados en los resultados del experimento previo nosotros elegimos tratamiento post 3 horas para experimentar la respuesta a la dosis. Diferentes dosis de RhC1-INH de conejo (5 y 10 unidades) fueron administradas 3 horas después de la aparición de isquemia y reperfusión. La dosis de IOU/ratón fue todavía eficaz al reducir el volumen isquémico (22,10±3,65mm3), mientras que 5U de INH C1 de conejo no modificó la extensión del daño de cerebro (47,39±4,08mm3). Estos datos muestran que INH C1 de conejo es capaz de modificar la lesión isquémica en una manera dependiente de la dosis (Fig.8). [0067] Since the dose of INH C1 used in humans for hereditary angioedema is lower than that used in mice for the treatment of stroke, lower doses were used in our ischemic model. Based on the results of the previous experiment we chose post 3 hour treatment to experience the dose response. Different doses of rabbit RhC1-INH (5 and 10 units) were administered 3 hours after the onset of ischemia and reperfusion. The dose of IOU / mouse was still effective in reducing ischemic volume (22.10 ± 3.65mm3), while 5U of rabbit INH C1 did not change the extent of brain damage (47.39 ± 4.08mm3). These data show that rabbit INH C1 is able to modify the ischemic lesion in a dose-dependent manner (Fig. 8).

[0068] En ratones tratados con 10U de RhC1-INH algunas neuronas neurodegenerativas, como resalta la tinción de Fluoro-Jade, fueron observadas en striatum pero no en hipocampo y córtex, mientras 5U de ratones isquémicos tratados mostraron una neurodegeneración en el striatum córtex (no mostrado). [0068] In mice treated with 10U of RhC1-INH some neurodegenerative neurons, such as Fluoro-Jade staining, were observed in striatum but not in hippocampus and cortex, while 5U of treated ischemic mice showed neurodegeneration in the striatum cortex ( not shown).

[0069] Déficits neurológicos focales y generales no mostraron ninguna variación significativa ni en ventana de tiempo de eficacia ni en experimento de respuesta de dosis (no mostradas). [0069] Focal and general neurological deficits showed no significant variation either in time window of efficacy or in dose response experiment (not shown).

[0070] Comparación entre el efecto de PdC1-INH y RhC1-INH (de conejos y vacas). Nuestros datos precedentes en PdC1-INH fueron obtenidos con un modelo diferente de isquemia cerebral transitoria. Para directamente comparar PdC1-INH, RhC1-INH de vaca y RhC1-INH de conejo, estos compuestos fueron dados a ratones en los que que la isquemia se indujo con el mismo protocolo experimental (filamento revestido de silicona). Los inhibidores fueron administrados a la dosis de 15U/ratón 3 horas después de la aparición de la isquemia. [0070] Comparison between the effect of PdC1-INH and RhC1-INH (of rabbits and cows). Our previous data in PdC1-INH were obtained with a different model of transient cerebral ischemia. To directly compare PdC1-INH, cow RhC1-INH and rabbit RhC1-INH, these compounds were given to mice in which ischemia was induced with the same experimental protocol (silicone coated filament). The inhibitors were administered at the dose of 15U / mouse 3 hours after the onset of ischemia.

[0071] Como estaba previsto, el PdC1-INH no fue capaz de ejercer una acción neuroprotectora en ese punto en el tiempo (47.39±4.08mm3 à). En cambio, los ratones isquémicos tratados con RhC1-INH de vaca mostraron una reducción significativa del volumen isquémico en comparación con los ratones tratados en solución salina, aunque a una extensión inferior de los ratones tratados con RhC1-INH (Fig.9). Sorprendentemente ambos déficits focales y generales fueron significativamente mejorados por RhC1-INH de vaca (Fig. 10). [0071] As planned, the PdC1-INH was not able to exert a neuroprotective action at that point in time (47.39 ± 4.08mm3 à). In contrast, ischemic mice treated with cow RhC1-INH showed a significant reduction in ischemic volume compared to mice treated in saline, although to a lesser extent than mice treated with RhC1-INH (Fig. 9). Surprisingly, both focal and general deficits were significantly improved by cow RhC1-INH (Fig. 10).

[0072] La tinción con Fluoro-Jade mostró una gran neurodegeneración en el cerebro de ratones isquémicos tratados con PdC1-INH en todas las áreas consideradas (córtex, estriatum e hipocampo). La tinción del cerebro de ratones tratados con RhC1-INH de vaca mostró un grado variable de neurodegeneración en córtex e hipocampo ya que en 3 de cada 6 ratones se observó una marcada neurodegeneración en ambas áreas, mientras que en los otros tres ratones la neurodegeneración estaba presente en una pequeña cantidad. El estriatum mostró una coloración de Fluoro-Jade extensiva en 6 de cada 6 ratones. [0072] Staining with Fluoro-Jade showed a great neurodegeneration in the brain of ischemic mice treated with PdC1-INH in all the areas considered (cortex, striatum and hippocampus). The brain staining of mice treated with cow RhC1-INH showed a variable degree of neurodegeneration in the cortex and hippocampus since in 3 out of every 6 mice a marked neurodegeneration was observed in both areas, while in the other three mice the neurodegeneration was Present in a small amount. Striatum showed extensive Fluoro-Jade staining in 6 out of 6 mice.

OBSERVACIONES OBSERVATIONS

[0073] El dato más relevante de este trabajo es la ventana de tiempo de eficacia de RhC1-INH de conejo. La dosis de 15U/ratón de RhC1-INH de conejo fue capaz de reducir significativamente el volumen isquémico hasta 18 horas después de la aparición de la isquemia al contrario que con PdC1-INH que 3 horas después de la isquemia ya ha perdido su efecto neuroprotector. Esta característica sorprendente hace de RhC1-INH un candidato posible como terapia de accidente cerebrovascular en seres humanos. La eficacia diferente de RhC1-INH y PdC1-INH, podría ser debida a la glicosilación diferente de las dos moléculas dando como resultado una afinidad más alta para una proteína de enlace de manosa (MBP) de RhC1-INH en comparación con el derivado de plasma. Uniendo MBP, RhC1-INH causa la inhibición de la vía de lectina de complemento, implicada en la patogénesis del daño por isquemia/reperfusión en corazón, riñón y gastrointestinal 7"9. La función de esta vía mal caracterizada sigue siendo desconocida en la isquemia cerebral y se requieren más experimentos para la claridad del mecanismo de neuroprotección de RhC1-INH. [0073] The most relevant data of this work is the window of efficacy time of rabbit RhC1-INH. The dose of 15U / mouse of rabbit RhC1-INH was able to significantly reduce ischemic volume up to 18 hours after the onset of ischemia, unlike with PdC1-INH that 3 hours after ischemia has already lost its neuroprotective effect . This surprising feature makes RhC1-INH a possible candidate as stroke therapy in humans. The different efficacy of RhC1-INH and PdC1-INH, could be due to the different glycosylation of the two molecules resulting in a higher affinity for a RhC1-INH mannose binding protein (MBP) compared to the derivative of plasma. Joining MBP, RhC1-INH causes inhibition of the complement lectin pathway, implicated in the pathogenesis of ischemia / reperfusion damage in the heart, kidney and gastrointestinal 7 &9; 9. The function of this poorly characterized pathway remains unknown in cerebral ischemia and more experiments are required for the clarity of the RhC1-INH neuroprotection mechanism.

[0074] El efecto superior neuroprotector de RhC1-INH sobre PdC1-INH en la ventana de tiempo después de la aparición de isquemia puede ser además explicada por un objectivo más eficaz de la molécula recombinante al sitio de daño de tejido bien a través de unión a antígenos de superficie de célula y/o una penetración de tejido más eficaz. Es necesario llevar a cabo más investigaciones para dilucidar completamente el mecanismo exacto molecular destacando la observación descrita en esta invención. [0074] The superior neuroprotective effect of RhC1-INH on PdC1-INH in the time window after the onset of ischemia can be further explained by a more effective target of the recombinant molecule to the site of tissue damage well through binding to cell surface antigens and / or more effective tissue penetration. Further research is necessary to fully elucidate the exact molecular mechanism highlighting the observation described in this invention.

[0075] La tinción con Fluoro-Jade da evidencia indirecta de cómo la lesión evoluciona en el tiempo. El tratamiento temprano con RhC1-INH proporciona un rescate completo de la penumbra isquémica (hipocampo y córtex). Cuanto más tarde se administre el tratamiento, más neuronas se degeneran en la penumbra. Estas conclusiones confirman que RhC1-INH ejercita su acción neuroprotectora en la penumbra isquémica. RhC1-INH de conejo es capaz de reducir el volumen isquémico en una dosis de manera dependiente. La dosis más efectiva de RhC1-INH (15U/ratón, correspondiente aproximadamente a 600U/kg), usada para el experimento de ventana de tiempo de eficacia, es muy superior a la usada en seres humanos para angioedema hereditario (aproximadamente 25-100U/kg). Para verificar si una dosis inferior fue todavía eficaz en la reducción de infarto isquémico y neurodegeneración, un experimento de respuesta de dosis se llevó a cabo. Los resultados mostraron que 400U/kg (10 U/ratón) de RhC1-INH fueron todavía capaces de contrarrestar significativamente el ataque isquémico, aunque a una extensión inferior. Una dosis de 8 pliegues superior a la usada para HAE (5U/ratón; 200U/kg) no fue eficaz. Estas conclusiones están en línea con la evidencia que muestra que se requieren grandes dosis de INH C1 para uso terapéutico en varios ajustes de inflamación5. En particular tales dosis son necesarias para alcanzar un efecto inhibidor importante en la adhesión de moléculas endotiales6, un mecanismo implicado en la patogénesis de daño de cerebro de isquemia/reperfusión. Finalmente, el RhC1-INH de vaca proporcionó neuroprotección, cuando se administró 3 horas después de la isquemia a la dosis de 15U/ratón, aunque menos marcadamente que RhC1-INH de conejo. El inhibidor de vaca fue también capaz de mejorar déficits neurológicos en comparación con ratones tratados con solución salina. Estas conclusiones indican que esta molécula es capaz de mejorar las condiciones generales de los ratones isquémicos. [0075] Staining with Fluoro-Jade gives indirect evidence of how the lesion evolves over time. Early treatment with RhC1-INH provides a complete rescue of ischemic penumbra (hippocampus and cortex). The later the treatment is administered, the more neurons degenerate into the penumbra. These conclusions confirm that RhC1-INH exerts its neuroprotective action in ischemic penumbra. Rabbit RhC1-INH is able to reduce ischemic volume in a dose dependently. The most effective dose of RhC1-INH (15U / mouse, corresponding to approximately 600U / kg), used for the efficacy time window experiment, is much higher than that used in humans for hereditary angioedema (approximately 25-100U / kg) To verify if a lower dose was still effective in reducing ischemic infarction and neurodegeneration, a dose response experiment was carried out. The results showed that 400U / kg (10 U / mouse) of RhC1-INH were still able to significantly counteract the ischemic attack, although to a lesser extent. A dose of 8 folds higher than that used for HAE (5U / mouse; 200U / kg) was not effective. These conclusions are in line with the evidence that shows that large doses of INH C1 are required for therapeutic use in various inflammation settings5. In particular, such doses are necessary to achieve an important inhibitory effect on the adhesion of endotial molecules6, a mechanism involved in the pathogenesis of ischemia / reperfusion brain damage. Finally, cow RhC1-INH provided neuroprotection, when administered 3 hours after ischemia at the dose of 15U / mouse, although less markedly than rabbit RhC1-INH. The cow inhibitor was also able to improve neurological deficits compared to mice treated with saline. These conclusions indicate that this molecule is capable of improving the general conditions of ischemic mice.

Ejemplo 3: Comparación de la capacidad de RhC1-INH y INH C1 derivado de plasma para inhibir la activación de las vías clásicas y MBL. Example 3: Comparison of the ability of plasma-derived RhC1-INH and INH C1 to inhibit the activation of classical and MBL pathways.

Materiales y métodos Materials and methods

[0076] El efecto de RhC1-INH y PdC1-INH (Cetor, Sanquin, Amsterdam, Países Bajos) en la función de la vía de lectina y tradicional fue examinada en el Wieslab pantalla de sistema de complemento TM (Euro-Diagnostica, Malmø, Suecia) usando dos fuentes diferentes de suero. Una fuente de suero se incluye en el equipo, donde éste se usa como un control positivo (de aquí en adelante referido como muestra de suero 1). La otra muestra de suero se obtuvo de una agrupación disponible comercialmente de suero humano (agrupación de 25 donantes diferentes; Kordia, Leiden, Países Bajos), de aquí en adelante referido como muestra de suero 2. Ambas muestras de suero fueron incubadas en triples independientes con 0, 15, 30 y 75 μmol de RhC1-INH o PdC1-INH durante 30 min a temperatura ambiente. Por lo tanto, soluciones madre de PdC1-INH y RhC1-INH fueron diluidas en agua a concentraciones apropiadas. Volúmenes correspondientes con 15, 30 y 75 μmol de RhC1-INH o PdC1-INH fueron tomados y ajustados a 15 μl con agua. El tampón en el que RhC1-INH es disuelto (20 mM citrato, 0.19 M sacarosa pH 6.8,0.22 μm filtrada) fue tomado a lo largo de en las mismas diluciones que RhC1-INH para controlar por interferencia con el Wieslab sistema de complemento. Los controles positivos (PC) y negativos (NP) de la vía tradicional y MBL (provista con el equipo), y ambas muestras de suero fueron diluidas 1/101 en diluyente CP para la vía clásica y diluyente MP para la via MBL según instrucciones del fabricante. De estos sueros diluidos, 127.5 μl fue suplementado con 22.5 μl agua, PdC1-INH, RhC1-INH o tampón e incubado durante 30 minutos a RT. Después, 100 μl/pocillo de PC, NC, diluyente CP o MP (formas preliminares) y muestras fueron pipetadas en la placa apropiada e incubadas durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación los pocillos fueron lavados 3 veces con 300 μl/pocillo solución de agua y posteriormente incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 μl/pocillo de conjugado. Después de otro lavado, los pocillos fueron incubados con 100 μl/pocillo de sustrato y nuevamente incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción fue detenida por la adición de 100 μl/pocillo 5 mM EDTA y la absorbencia fue detectada a 405 nm. [0076] The effect of RhC1-INH and PdC1-INH (Cetor, Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) on the function of the lectin and traditional pathway was examined in the Wieslab TM complement system screen (Euro-Diagnostica, Malmø , Sweden) using two different sources of serum. A source of serum is included in the kit, where it is used as a positive control (hereafter referred to as serum sample 1). The other serum sample was obtained from a commercially available cluster of human serum (cluster of 25 different donors; Kordia, Leiden, The Netherlands), hereinafter referred to as serum sample 2. Both serum samples were incubated in independent triples. with 0, 15, 30 and 75 μmol of RhC1-INH or PdC1-INH for 30 min at room temperature. Therefore, stock solutions of PdC1-INH and RhC1-INH were diluted in water at appropriate concentrations. Corresponding volumes with 15, 30 and 75 μmol of RhC1-INH or PdC1-INH were taken and adjusted to 15 μl with water. The buffer in which RhC1-INH is dissolved (20 mM citrate, 0.19 M sucrose pH 6.8.0.22 μm filtered) was taken along at the same dilutions as RhC1-INH to control for interference with the Wieslab complement system. The positive (PC) and negative (NP) controls of the traditional route and MBL (provided with the equipment), and both serum samples were diluted 1/101 in CP diluent for the classical route and MP diluent for the MBL route according to instructions manufacturer. Of these diluted sera, 127.5 μl was supplemented with 22.5 μl water, PdC1-INH, RhC1-INH or buffer and incubated for 30 minutes at RT. Then, 100 μl / well of PC, NC, CP or MP diluent (preliminary forms) and samples were pipetted into the appropriate plate and incubated for 1 hour at 37 ° C. After incubation the wells were washed 3 times with 300 μl / well water solution and subsequently incubated for 30 minutes at room temperature with 100 μl / well of conjugate. After another wash, the wells were incubated with 100 μl / well of substrate and again incubated for 30 minutes at room temperature. The reaction was stopped by the addition of 100 µl / well 5 mM EDTA and the absorbency was detected at 405 nm.

[0077] Para el cálculo de los resultados, la absorbencia de las formas preliminares (diluyente CP o MP) fue sustraída del PC, NC y muestras. La activación de complemento de porcentaje fue calculado por medición con esta fórmula: (Muestra-NC)/(PC-NC)x100. Esto significa que el PC se establece siempre a 100%. Para cada condición la desviación típica, media y CV% fue calculada. [0077] For the calculation of the results, the absorbency of the preliminary forms (diluent CP or MP) was subtracted from the PC, NC and samples. The percentage complement activation was calculated by measurement with this formula: (Sample-NC) / (PC-NC) x100. This means that the PC is always set to 100%. For each condition the standard deviation, mean and CV% was calculated.

Resultados Results

Efecto de RhC1-INH y PdC1-INH en la vía clásica examinado por Wielisa. Effect of RhC1-INH and PdC1-INH on the classical pathway examined by Wielisa.

[0078] Las propiedades inhibidoras de ambos RhC1-INH y PdC1-INH en activación de vía clásica fueron analizadas en dos muestras de suero diferentes. Como se muestra en las Figuras 12, 13 y 16, ambas dosis de RhC1-INH y PdC1-INH dependientemente reducieron la vía clásica deposición mediada C5b-9 en ambas muestras de sueros. Mientras que RhC1-INH - a una concentración de 75 μM - parece inhibir la activación de la vía tradicional en suero 1 ligeramente más fuerte que PdC1-INH, tal efecto no fue visto en muestra de suero 2. En las otras concentraciones evaluadas ninguna diferencia en propiedades inhibitorias fue observada entre RhC1-INH y PdC1-INH. Por lo tanto, fue concluido que ambos RhC1-INH y PdC1-INH son igualmente eficaces en la activación de la vía clásica de inhibición en sueros humanos. [0078] The inhibitory properties of both RhC1-INH and PdC1-INH in classical pathway activation were analyzed in two different serum samples. As shown in Figures 12, 13 and 16, both doses of RhC1-INH and PdC1-INH dependently reduced the classical C5b-9 mediated deposition pathway in both serum samples. While RhC1-INH - at a concentration of 75 μM - appears to inhibit the activation of the traditional route in serum 1 slightly stronger than PdC1-INH, this effect was not seen in serum sample 2. In the other concentrations evaluated no difference In inhibitory properties it was observed between RhC1-INH and PdC1-INH. Therefore, it was concluded that both RhC1-INH and PdC1-INH are equally effective in activating the classical inhibition pathway in human sera.

Efecto de RhC1-INH y PdC1-INH en la vía MBL examinado por Wielisa. Effect of RhC1-INH and PdC1-INH on the MBL pathway examined by Wielisa.

[0079] En el mismo conjunto de experimentos, también las propiedades inhibitorias de ambos RhC1-INH y PdC1-INH en la activación de la vía MBL fueron analizadas.Como se muestra en las Figuras 14, 15 y 16, ambos RhC1-INH y PdC1-INH también en dosis dependientes redujeron la activación de la vía MBL. No obstante, a diferencia de la vía clásica donde ninguna de las diferencias fueron vistas, RhC1-INH resultó ser un inhibidor más potente de la vía MBL cuando se compara con PdC1-INH. En todas las 3 concentraciones evaluadas y en ambas muestras de suero, la inhibición RhC1-INH mediada de la vía MBL es - 20% más alta en comparación con PdC1-INH. Por lo tanto, fue concluido que RhC1-INH es un inhibidor más eficaz de la vía MBL que PdC1-INH. [0079] In the same set of experiments, also the inhibitory properties of both RhC1-INH and PdC1-INH in the activation of the MBL pathway were analyzed. As shown in Figures 14, 15 and 16, both RhC1-INH and PdC1-INH also in dependent doses reduced the activation of the MBL pathway. However, unlike the classic pathway where none of the differences were seen, RhC1-INH proved to be a more potent inhibitor of the MBL pathway when compared to PdC1-INH. In all 3 concentrations evaluated and in both serum samples, the inhibition mediated RhC1-INH of the MBL pathway is - 20% higher compared to PdC1-INH. Therefore, it was concluded that RhC1-INH is a more effective inhibitor of the MBL pathway than PdC1-INH.

Conclusión conclusion

[0080] Los resultados muestran que ambos RhC1-INH y PdC1-INH son igualmente eficaces en la inhibición de la vía clásica, pero RhC1-INH es un inhibidor más potente de la vía MBL. En todas las concentraciones evaluadas, la inhibición de la vía MBL mediante RhC1-INH ~20% más fuerte en comparación con PdC1-INH. [0080] The results show that both RhC1-INH and PdC1-INH are equally effective in inhibiting the classical pathway, but RhC1-INH is a more potent inhibitor of the MBL pathway. At all concentrations evaluated, inhibition of the MBL pathway by RhC1-INH ~ 20% stronger compared to PdC1-INH.

REFERENCIAS REFERENCES

1.one.: De Simoni, M. G. et al. Neuroprotection by complement (C1) inhibitor in mouse transient brain ischemia. J Cereb Blood Flow Met 23, 232-239 (2003 ). From Simoni, M. G. et al. Neuroprotection by complement (C1) inhibitor in mouse transient brain ischemia. J Cereb Blood Flow Met 23, 232-239 (2003).

2.2.: De Simoni, M. G. et al. The powerful neuroprotective action of C1-inhibitor on brain ischemia-reperfusion injury does not require C1q. Am JPathol 164, 1857-63 (2004 ). From Simoni, M. G. et al. The powerful neuroprotective action of C1-inhibitor on brain ischemia-reperfusion injury does not require C1q. Am JPathol 164, 1857-63 (2004).

3.3.: Storini, C. et al. C1 inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion injury via inhibition of cell recruitment and inflammation. Neurobiol Disease 19,10-17 (2005 ). Storini, C. et al. C1 inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion injury via inhibition of cell recruitment and inflammation. Neurobiol Disease 19,10-17 (2005).

4.Four.: Schmued, L. C. & Hopkins, K. J. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration. Brain Res 874, 123-30. (2000 ). Schmued, L. C. & Hopkins, K. J. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration. Brain Res 874, 123-30. (2000).

5.5.: Caliezi, C. et al. C1 esterase inhibitor: an anti-inflammatory agent and its potential use in the treatment of diseases other than hereditary angioedema. Pharmacol Rev 52,91-112 (2000 ). Caliezi, C. et al. C1 esterase inhibitor: an anti-inflammatory agent and its potential use in the treatment of diseases other than hereditary angioedema. Pharmacol Rev 52.91-112 (2000).

6. 6.: Cai, S. et al. A direct role for C1 inhibitor in regulation of leukocyte adhesion. J Immunol 174, 6462-6 (2005 ). Cai, S. et al. A direct role for C1 inhibitor in regulation of leukocyte adhesion. J Immunol 174, 6462-6 (2005).

7.7.: Walsh, M. C. et al. Mannose-binding lectin is a regulator of inflammation that accompanies myocardial ischemia and reperfusion injury. J Immmunol 175, 541-6 (2005 ). Walsh, M. C. et al. Mannose-binding lectin is a regulator of inflammation that accompanies myocardial ischemia and reperfusion injury. J Immmunol 175, 541-6 (2005).

8.8.: Moller-Kristensen, M. et al. Mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury. Scand JImmunol 61,426-34 (2005 ). Moller-Kristensen, M. et al. Mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury. Scand JImmunol 61,426-34 (2005).

9.9.: Hart, M. L. et al. Gastrointestinal ischemia-reperfusion injury is lectin complement pathway dependent without involving C1q. J Immunol 174, 6373-80 (2005 ). Hart, M. L. et al. Gastrointestinal ischemia-reperfusion injury is lectin complement pathway dependent without involving C1q. J Immunol 174, 6373-80 (2005).

LISTA DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

[0082] [0082]

<110> Pharming Intellectual Property B.V. <110> Pharming Intellectual Property B.V.

<120> Uso de inhibidor C1 para la prevención de lesiones por isquemia reperfusión <120> Use of C1 inhibitor for the prevention of reperfusion ischemia lesions

<130> P6005723PCT <130> P6005723PCT

<140> P6005723PCT<141> 2006-12-19 <140> P6005723PCT <141> 2006-12-19

<150> <150>: 05112630.8<151> 2005-12-21 05112630.8 <151> 2005-12-21

<150> <150>: 60/760,944<151> 2006-01-23 60 / 760,944 <151> 2006-01-23

<160> 1 <160> 1

<170> PatenteIn version 3.3 <170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <210> 1

<211> 478 <211> 478

<212> PRT <212> PRT

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<400> <400>

Claims

REIVINDICACIONES

1. one.: Uso de un inhibidor C1 que tiene un nivel reducido de residuos de ácidos siálicos terminales en comparación con el inhibidor C1 humano derivado de plasma, donde el nivel reducido de residuos de ácidos siálicos terminales da como resultado una vida media de plasma inferior a 6 horas, en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, reducción o tratamiento de al menos una lesión de isquemia y reperfusión, donde el inhibidor C1 se administra al menos 10 minutos después del periodo de isquemia y/o el inicio de la reperfusión. Use of a C1 inhibitor that has a reduced level of terminal sialic acid residues compared to the plasma derived human C1 inhibitor, where the reduced level of terminal sialic acid residues results in a plasma half-life of less than 6 hours, in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention, reduction or treatment of at least one ischemia and reperfusion injury, where the C1 inhibitor is administered at least 10 minutes after the ischemia period and / or the onset of reperfusion.

2. 2.: Uso según la reivindicación 1, donde el inhibidor C1 es administrado entre al menos 10 minutos y 24 horas después del periodo de isquemia y/o el inicio de reperfusión. Use according to claim 1, wherein the C1 inhibitor is administered between at least 10 minutes and 24 hours after the ischemia period and / or the onset of reperfusion.

3. 3.: Uso según la reivindicación 1 o 2, donde el inhibidor C1 comprende un glicano que tiene un residuo terminal seleccionado de galactosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa y fucosa. Use according to claim 1 or 2, wherein the C1 inhibitor comprises a glycan having a terminal residue selected from galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, mannose and fucose.

4. Four.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el inhibidor C1 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1. Use according to any of claims 1-3, wherein the C1 inhibitor has an amino acid sequence that has at least 65% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

5. 5.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el inhibidor C1 se obtiene de una célula u organismo genéticamente modificado. Use according to any of claims 1-4, wherein the C1 inhibitor is obtained from a genetically modified cell or organism.

6. 6.: Uso según la reivindicación 5, donde dicho organismo es un animal transgénico no humano. Use according to claim 5, wherein said organism is a non-human transgenic animal.

7. 7.: Uso según la reivindicación 6, donde el inhibidor C1 se obtiene de la leche de dicho animal transgénico no humano. Use according to claim 6, wherein the C1 inhibitor is obtained from the milk of said non-human transgenic animal.

8. 8.: Uso según la reivindicación 6 o 7, donde el animal transgénico no humano es un bovino o un animal del orden Lagomorpha. Use according to claim 6 or 7, wherein the non-human transgenic animal is a bovine or an animal of the order Lagomorpha.

9. 9.: Uso según la reivindicación 8, donde el animal transgénico no humano es un conejo. Use according to claim 8, wherein the non-human transgenic animal is a rabbit.

10. 10.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el inhibidor C1 se usa en una cantidad en el intervalo de 50-2000 unidades por kg de peso corporal. Use according to any of claims 1-9, wherein the C1 inhibitor is used in an amount in the range of 50-2000 units per kg of body weight.

11. eleven.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la composición farmacéutica también contiene un agente trombolítico, o es para su uso en combinación con un agente trombolítico o es para su uso uso después del tratamiento con tal agente. Use according to any of claims 1-10, wherein the pharmaceutical composition also contains a thrombolytic agent, or is for use in combination with a thrombolytic agent or is for use after use with such agent.

12. 12.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la composición farmacéutica es para la prevención, reducción o tratamiento de una aparición imprevista o aguda de lesión por isquemia y reperfusión. Use according to any of claims 1-11, wherein the pharmaceutical composition is for the prevention, reduction or treatment of an unexpected or acute occurrence of ischemia and reperfusion injury.

13. 13.: Uso según la reivindicación 12, donde la aparición imprevista o aguda de lesión por isquemia y reperfusión ocurre después de un accidente cerebrovascular o accidente cerebrovascular perinatal. Use according to claim 12, wherein the unforeseen or acute occurrence of ischemia and reperfusion injury occurs after a stroke or perinatal stroke.

14. 14.: Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la composición farmacéutica es para la prevención, reducción o tratamiento de una aparición prevista de lesión por isquemia y reperfusión. Use according to any of claims 1-11, wherein the pharmaceutical composition is for the prevention, reduction or treatment of an expected occurrence of ischemia and reperfusion injury.

15. fifteen.: Uso según la reivindicación 14, donde la aparición prevista de lesión por isquemia y reperfusión ocurre después de un transplante de órgano. Use according to claim 14, wherein the expected occurrence of ischemia and reperfusion injury occurs after an organ transplant.