ES2365602T3 - Proteínas oligoméricas tipo chaperona, estables a desnaturalizantes y/o resistentes a proteasa, polinucleótidos que codifican las mismas y sus usos. - Google Patents

Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica una proteína estable a ebullición, estable a detergentes, o resistente a proteasa, teniendo dicha proteína una actividad tipo chaperona y en el que dicha proteína estable tiene una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2; y (b) un segundo polinucleótido que incluye una secuencia promotora que está unida de forma funcional a dicho primer polinucleótido para dirigir la expresión de dicha proteína.

Description

La presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, una célula transformada con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, un organismo no humano transformado con la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido aislado estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 12, un procedimiento para estabilizar a una proteína frente a condiciones desnaturalizantes de acuerdo con la reivindicación 13, una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 14, una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 y reivindicación 25, un procedimiento para proteger a una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática de acuerdo con la reivindicación 21, una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 22, un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico de acuerdo con la reivindicación 23, uso de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 24, un procedimiento para aumentar la avidez de unión de una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 28, un heterocomplejo de acuerdo con la reivindicación 32.

La presente invención se refiere a proteínas oligoméricas tipo chaperona, estables a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición, detergentes, otros desnaturalizantes) y/o resistentes a proteasa, polinucleótidos que codifican las mismas y usos de las mismas. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevas proteínas homo-oligoméricas estables a desnaturalizantes, resistentes a proteasas compuestas por homo-monómeros, mencionándose dichas proteínas a partir de ahora en este documento como proteínas estables (PE), procedimientos de producción y purificación de PE, construcciones de ácido nucleico que codifican PE, anticuerpos que reconocen PE, el uso de PE para estabilizar, replegar y desagregar, en otras palabras, realizar la función chaperona sobre, macromoléculas tales como proteínas, proteínas de fusión que incluyen PE, construcciones de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión, su uso en inmunización y/o formación de estructuras complejas homogéneas o heterogéneas y otras aplicaciones.

Chaperonas moleculares:

Las chaperonas moleculares se caracterizan por su remarcable capacidad de reconocer selectivamente y unirse a proteínas inestables, organizadas de forma no nativa (a partir de ahora no nativas). Las interacciones de las chaperonas con dichas proteínas dirigen múltiples (diversas) funciones que son específicas para diferentes chaperonas, incluyendo: facilitar y promover el plegamiento de proteínas nacientes en su conformación final, albergar sustratos en una forma no estructurada que es competente para el transporte a través de la membrana, mantener las proteínas en conformaciones específicas, evitar la agregación de proteínas no plegadas, y promover la renaturalización de proteínas agregadas. Las últimas dos funciones son particularmente importantes para células que experimentan altas temperaturas y otros estreses. Por lo tanto, no es sorprendente que muchas chaperonas moleculares se identificaran por primera vez como proteínas de choque térmico (Hsp).

Proteínas de choque térmico (Hsp):

Las Hsp son un grupo de proteínas encontradas en todos los organismos expuestos a temperaturas de estrés. Se ha demostrado claramente que muchas Hsp tienen las actividades de chaperonas moleculares que están implicadas en el plegamiento apropiado de polipéptidos nacientes y ayudan a las proteínas dañadas a volver a conseguir su conformación biológicamente activa (Hartl, 1996). Las Hsp pequeñas (sHsp) son Hsp que tienen un tamaño molecular que varía de 12-40 kDa en diferentes organismos, y que se encuentran abundantemente en plantas. La sHsp vegetal como otras sHsp y las alfa cristalinas tienden a formar grandes complejos oligoméricos que se creen que es su forma funcional (Chen y col., 1994; Lee y col., 1995; Collada y col., 1997). Suzuki y col. (1998) proporcionaron evidencias de que la Hsp21 localizada en cloroplasto del guisante existe como un complejo y no se disocia durante el estrés térmico y la recuperación. En contraste con las Hsp vegetales, las sHsp citosólicas de mamífero experimentan disociación de los complejos en monómeros por fosforilación durante el estrés térmico (Rogalla y col., 1999). Un artículo reciente de Haslbeck y col., (1999) demostró que la disociación del complejo Hsp26 de la levadura está regulado por la temperatura y es un prerrequisito para la actividad eficaz de la chaperona. Se ha demostrado que in vitro, las sHsp se unen a proteínas no nativas (Lee y col., 1995, Ehrnsperger y col., 1997, Veinger y col., 1998), por lo tanto, evitan la agregación de proteínas no nativas, permitiendo el posterior replegamiento por la red de chaperonas (Ehrnsperger y col., 1997, Veinger y col., 1998; Haslbeck y col., 1999).

En general, las Hsp son estables a temperaturas moderadas pero no a temperaturas que exceden de 80ºC. La acumulación de Hsp18.1 del guisante sigue siendo estable con una vida media de 38 horas a 38ºC. A 55ºC, el efecto de la Hsp18.1 para evitar la agregación de LDH desnaturalizado por calor era menor que a 45ºC (Lee y col., 1995). El oligómero Hsp25 era estable a 43ºC hasta 60 minutos (Ehrnsperger y col., 1997). La exposición de Hsp21 a temperaturas por encima de 70ºC condujo a una agregación irreversible (Hrndahl y col., 1999). El único informe de una Hsp altamente estable al calor es Hsp12 de levaduras (Praekelt y Meacock, 1990). En base a sus propiedades físico-químicas y la similitud de la composición de aminoácidos, Mtwisha y col., (1998) sugirieron que Hsp12 es una proteína tipo LEA. No se ha informado de que ningún complejo oligomérico de sHsp sea estable en desnaturalización con SDS. Todas las sHsp presentadas se verificaron como monómeros en SDS-PAGE, salvo que la proteína estuviera reticulada.

Usos de Hsp y moléculas tipo chaperona:

La capacidad única de las proteínas de estrés para estabilizar estructuras proteicas y peptídicas se ha empleado para modificar la antigenicidad de péptidos, para proteger a células del estrés oxidativo y térmico, para alterar la agregación de las proteínas y para promover el plegamiento proteico in vitro.

La capacidad de las Hsp de ejecutar la conformación de antígenos ha conducido a varias aplicaciones propuestas, incluyendo la incorporación de Hsp70, Hsp90 y gp 76 en vacunaciones usando antígenos tumorales no antigénicos (Patente de Estados Unidos Nº 6.162.436 de Srivastava), para provocar la inmunidad contra agentes de enfermedad infecciosa (Patente de Estados Unidos Nº 6.139.841 de Srivastava) y la supresión del rechazo de aloinjertos y xenoinjertos a través de la modulación de la respuesta inmune del injerto tisular (Patente de Estados Unidos Nº

5.891.653 de Attfield).

La expresión de elevado nivel de secuencias de ADN clonadas que codifican Hsp se ha empleado para conferir una nueva resistencia a estrés en las células transformadas. Hsp27 humana sobreexpresada protegía a células 1929 y

13.S. 1.24 transformadas del estrés oxidativo (Rogalla, T., y col., JBC (1999) 274, 18947-56). La sHsp Cs Hsp 17.5 derivada de plantas (de cotiledones de castaño), cuando se expresaba en E. coli transformada, protegía a las bacterias contra extremos de frío (4ºC) y calor (50ºC) (Soto-A, y col., Plant Physiology (1999) 120, 521-528).

La alfa-beta cristalina del cristalino también se considera una proteína sHsp. Cuando se expresaba una secuencia de ADN que codifica la proteína cristalina en células propensas a la formación de agregados amiloides, la sHsp evitaba la formación de fibrillas in vitro. Sin embargo, esta desagregación aumentaba en lugar de disminuir la toxicidad de la proteína beta amiloide. (Stege, G. J. y col., Biochem. y Biophys. Res. Comm. (1999) 262 (1): 152- 6).

Las proteínas estructurales se han empleado exitosamente en el ensamblaje in vitro de proteínas de la cápsida viral (Newcomb, WW. y col., Journal of Virology (1999) 73, 4231-50); para promover el plegamiento preciso de las proteínas in vitro y en sistemas de expresión heterólogos (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 5.561.221 de Yoshida y col.) y para promover la respuesta inmunológica presentando una pluralidad de antígenos en la misma partícula (Gonzalo y col., J. Mol. Biol (2001) 305, 259-267).

Ninguna de las Hsp o sHsp conocidas, sin embargo, son estables en duras condiciones desnaturalizantes tales como ebullición o exposición a elevada concentración de SDS o son resistentes a la escisión proteolítica.

Proteínas estables a ebullición de plantas:

Pelah y col., (1995) muestra un intento de purificar una proteína estable a ebullición a partir de brotes de álamo estresados con agua. Se separó un extracto proteico estable a ebullición en un SDS-PAGE al 10%, produciendo una banda dominante que tenía una masa molecular de 66 kDa. Cuando se microsecuenció, la secuencia N-terminal de la proteína de 66 kDa mostraba una elevada homología con los gérmenes de trigo GF-2.8 y GF-3.8. Los gérmenes y las proteínas tipo germen son glicoproteínas homo-oligoméricas extracelulares, ubicuas, solubles en agua, que muestran estabilidad extrema térmica, a pH y detergentes y resistencia a proteasa, y que tienen actividad oxalato oxidasa, sin embargo carecen de cualquier actividad tipo chaperona.

El documento EP774512 se refiere a un casete de expresión que puede expresar una forma soluble de una proteína deseada en una célula bacteriana, donde el casete comprende una secuencia en la que un gen que codifica una chaperona molecular está unido de forma funcional a un primer promotor y en un sitio en el que puede insertarse un gen que codifique la proteína deseada. Además, se proporciona un procedimiento para expresar una proteína deseada en una forma soluble por el uso del casete de expresión o por co-transformación con un plásmido que puede expresar una chaperona molecular y un plásmido que puede expresar la proteína deseada.

Dendrome, Arie Altman, Diciembre de 1996, volumen 3, número 2 se refiere a la biología molecular de la tolerancia a la sequía y la transformación de álamo y pino.

La construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la presente invención se define en la reivindicación 1, la célula transformada con una construcción de ácido nucleico de la presente invención se define en la reivindicación 9, el organismo no humano transformado con la construcción de ácido nucleico de la presente invención se define en la reivindicación 10, el anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de la presente invención se define en la reivindicación 12, el procedimiento para estabilizar una proteína contra las condiciones desnaturalizantes de la presente invención se definen en la reivindicación 13, la proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de la presente invención se define en la reivindicación 14, la composición farmacéutica de la presente invención se define en la reivindicación 20 y reivindicación 25, el procedimiento para proteger una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática de la presente invención se define en la reivindicación 21, la planta transgénica de la presente invención se define en la reivindicación 22, el procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico de la presente invención se define en la reivindicación 23, el uso de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de la presente invención se define en la reivindicación 24, el procedimiento para aumentar una avidez de unión de una molécula de unión de la presente invención se define en la reivindicación 28, el heterocomplejo de la presente invención se define en la reivindicación 32.

De acuerdo con un aspecto de la invención, proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un primer polinucleótido que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa (en este documento, proteína estable, PE), teniendo la proteína estable una actividad tipo chaperona; y un segundo polinucleótido que incluye una secuencia promotora que está unida de forma funcional al primer polinucleótido para dirigir la expresión de la proteína estable.

De acuerdo con una característica adicional en realizaciones preferidas descritas a continuación, la secuencia promotora es un promotor eucariota.

De acuerdo con una característica adicional más en las reivindicaciones preferidas descritas, el promotor eucariota es un promotor constitutivo.

De acuerdo con una característica adicional más en las realizaciones preferidas descritas, el promotor es un promotor vegetal, tal como un promotor vegetal constitutivo, un promotor vegetal específico de tejido y un promotor vegetal inducible.

De acuerdo con otra característica adicional en las reivindicaciones preferidas descritas (i) el promotor vegetal constitutivo se selecciona entre el grupo constituido por el promotor vegetal CaMV35S, el promotor vegetal CaMV19S, el promotor vegetal FMV34S, el promotor vegetal del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor vegetal CsVMV, el promotor vegetal de la actina ACT2/ACT8 de Arabidopsis, el promotor vegetal UBQ1 de la ubiquitina Arabidopsis, el promotor vegetal BTH6 de la tionina de las hojas de la cebada, y el promotor vegetal de la actina del arroz; (ii) el promotor vegetal específico de tejido se selecciona entre el grupo constituido por el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de faseolina de la alubia, el promotor vegetal DLEC, el promotor vegetal PHS, el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de zeína, el promotor vegetal de la conglutina gamma de la soja, el promotor vegetal del gen AT2S1, el promotor vegetal de actina ACT11 de Arabidopsis, el promotor vegetal napA de Brassica napus y el promotor vegetal del gen de la patatina de la patata; y (iii) el promotor vegetal inducible se selecciona entre el grupo constituido por un promotor vegetal inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante, un promotor vegetal del gen rbcS de la alfalfa, promotores vegetales DRE, MYC y MYB que son activos en sequía; los promotores vegetales INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 activos en elevada salinidad y estrés osmótico, y los promotores vegetales hsr203J y str246C activos en estrés patogénico.

De acuerdo con una característica adicional más en realizaciones preferidas, la secuencia promotora es un promotor procariota.

De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas descritas a continuación, el primer polinucleótido tiene una secuencia al menos un 60% idéntica a las SEC ID Nº 1, 5 ,6, 34, 39 ó 40, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la carga por hueco es igual a 50, la carga por longitud es igual a 3, el apareamiento promedio es igual a 10 y el desapareamiento promedio es igual a -9.

De acuerdo con más características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la proteína estable tiene una secuencia al menos un 60% homóloga a las SEC ID Nº 2 ó 35, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.

De acuerdo con más características adicionales en las reivindicaciones preferidas descritas, la proteína estable de nativa es un oligómero.

De acuerdo con más características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la actividad tipo chaperona incluye la estabilización por calor de las proteínas.

De acuerdo con más características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el ácido nucleico aislado que comprende adicionalmente un tercer polinucleótido que codifica una proteína adicional, estando adyacente el tercer polinucleótido y en fase, en el extremo 5' o el extremo 3', al primer polinucleótido, codificando el primer y tercer polinucleótidos, en combinación, una proteína de fusión de la proteína estable y la proteína adicional, donde la proteína adicional puede estar situada de forma C o N terminal a la proteína estable y la proteína de fusión también puede incluir un péptido espaciador de, 1-100 aminoácidos entre la proteína estable y la proteína adicional.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico descrito en este documento.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona una célula u organismo transformado con el ácido nucleico descrito en este documento.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento explorar una biblioteca de expresión con el polinucleótido descrito en este documento o una parte del mismo de al menos 20, preferiblemente al menos 30, más preferiblemente al menos 50, aún más preferiblemente al menos 100 bases contiguas.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasas que tienen una actividad tipo chaperona eficaz, por ejemplo, en la estabilización de proteínas.

De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas descritas a continuación, el polipéptido está codificado por un polinucleótido como se describe en este documento.

De acuerdo con más características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el polipéptido tiene una secuencia al menos un 60% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.

De acuerdo con más características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el polipéptido de forma nativa es un oligómero, preferiblemente un homo-oligómero de al menos 10 subunidades.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo, ya sea un anticuerpo policlonal o monoclonal, que reconoce al menos un epítope del polipéptido descrito en este documento.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para evitar que una proteína agregante se agregue en un agregado que comprende causar que una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento llegue a estar en contacto con la proteína agregante.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para desagregar agregados de una proteína agregante que comprende causar que una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento llegue a estar en contacto con el agregado.

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con la agregación de proteínas de una proteína agregante, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que lo necesite una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para desagregar y/o evitar la agregación de la proteína agregante, la proteína agregante es, por ejemplo, beta-amiloide o prión.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para estabilizar una proteína frente a condiciones desnaturalizantes que comprende causar que una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento llegue a estar en contacto con la proteína.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para enriquecer o aislar una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; (c) recoger las proteínas solubles; y opcionalmente (d) ensayar la actividad tipo chaperona de las proteínas solubles y enriquecer o aislar la proteína estable que tiene la actividad tipo chaperona. Preferiblemente, el procedimiento comprende adicionalmente el fraccionamiento por tamaño de las proteínas solubles.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes), y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento explorar una biblioteca de expresión con un polinucluétido que codifica un polipéptido descrito en este documento.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes), y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; (c) recoger las proteínas solubles; (d) ensayar la actividad tipo chaperona de las proteínas solubles y aislar una proteína estable que tenga actividad tipo chaperona; (e) crear anticuerpos que reconozcan la proteína estable que tiene la actividad tipo chaperona; y (f) explorar una biblioteca de expresión con los anticuerpos.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes), y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; (c) recoger las proteínas solubles; (d) ensayar la actividad tipo chaperona de las proteínas solubles y enriquecer o aislar una proteína estable que tenga la actividad tipo chaperona; (e) microsecuenciar la proteína estable para obtener al menos una secuencia de aminoácidos parcial de la misma; (f) diseñar un oligonucleótido correspondiente a la secuencia de aminoácidos; y

(g) explorar una biblioteca con el oligonucleótido.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona, comprendiendo el procedimiento explorar una biblioteca de ADNc o genómica con un polinucleótido de al menos 17 bases al menos un 60% idénticas a una parte contigua de las SEC ID Nº 1, 5, 6, 34, 39 ó 40.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para identificar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona, comprendiendo el procedimiento hacer una búsqueda en una biblioteca electrónica que contenga una pluralidad de secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos para secuencias que tiene un grado predeterminado de identidad u homología con cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40 o partes de las mismas de, o correspondientes a, al menos 15 bases.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona, comprendiendo el procedimiento (a) proporcionar al menos un par de oligonucleótidos que tienen cada uno al menos 15 bases de longitud, incluyendo el al menos un par de oligonucleótidos al menos un ologonucleótido correspondiente a la SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40, seleccionándose el al menos un par de oligonucleótidos para amplificar un ácido nucleico que tiene un grado de identidad con, o que codifica proteína homólogas a, la SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40; (b) poner en contacto el al menos un par de oligonucleótidos con una muestra de ácido nucleico y amplificar el ácido nucleico que tiene el grado de identidad con, o que codifica las proteínas homólogas a, la SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40; y (c) usar el ácido nucleico que tiene el grado de identidad con o que codifica las proteína homólogas a la SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40 para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para el aislamiento sin detergentes de una proteína resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de una fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) poner en contacto el extracto proteico con una proteasa; (c) aislar una proteína resistente a proteasa; y opcionalmente (d) ensayar la proteína resistente a proteasa para la actividad tipo chaperona.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene una actividad tipo chaperona fusionado con un polipéptido adicional, preferiblemente la proteína de fusión adquiere una forma oligomérica.

En una realización, el polipéptido estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona está fusionado al polipéptido adicional mediante un enlace peptídico. En otra realización, el polipéptido estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona está fusionado al polipéptido adicional mediante un enlazador.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de inmunización que comprende someter el sistema inmune de un mamífero a la proteína de fusión descrita en este documento.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para proteger a una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática, comprendiendo el procedimiento añadir a la preparación enzimática una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para proteger a la preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para reparar al menos una parte de la actividad enzimática perdida de una preparación enzimática, comprendiendo el procedimiento añadir a la preparación enzimática una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para reparar al menos la parte de la actividad enzimática perdida de la preparación enzimática.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para administrar a un animal que tiene un sistema inmune un polipéptido, reduciendo al mismo tiempo la respuesta inmune contra el polipéptido, comprendiendo el procedimiento administrar el polipéptido al animal, estando fusionado el polipéptido a una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, reduciendo de este modo la respuesta inmune contra el polipéptido, en comparación con una respuesta inmune que se desarrolla por la administración al animal del polipéptido sólo.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona una planta transgénica que expresa una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico, comprendiendo el procedimiento modificar la planta para que exprese una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para volver a una planta más recuperable a partir de un estrés biótico o abiótico, comprendiendo el procedimiento modificar la planta para que exprese una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para aumentar la migración celular, comprendiendo el procedimiento exponer las células a una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para aumentar la migración celular.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para acelerar la curación de heridas, comprendiendo el procedimiento administrar sobre una herida una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para acelerar la cicatrización de heridas.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para inducir la curación de heridas, comprendiendo el procedimiento administrar sobre una herida una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para inducir la cicatrización de heridas.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para fortalecer y/o lavar el cabello, las uñas o la piel, comprendiendo el procedimiento administrar sobre el cabello, las uñas o la piel una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para fortalecer y/o lavar el cabello, las uñas o la piel.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas descritas a continuación, la composición farmacéutica está envasada en un envase e identificada en letra de imprenta para su uso en una aplicación de cicatrización de heridas.

De acuerdo con más características adicionales en realizaciones preferidas descritas, la composición farmacéutica está envasada en un envase e identificada en letras de imprenta para su uso en una aplicación para fortalecer y/o lavar el cabello, las uñas o la piel.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar una proteína estable a ebullición que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento: (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; (c) recuperar la fracción de proteínas solubles; y opcionalmente (d) ensayar la proteína resistente a proteasa para la actividad tipo chaperona.

De acuerdo con características adicionales en las realizaciones preferidas descritas a continuación, el procedimiento comprende adicionalmente digerir el extracto proteico como una proteasa.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aumentar la avidez de unión de una molécula de unión, comprendiendo el procedimiento presentar múltiples copias de la molécula de unión sobre una superficie de un oligómero de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona. La molécula de unión puede ser, por ejemplo, un receptor, un ligando, una enzima, un sustrato, un inhibidor, un anticuerpo y un antígeno. En casos en los que la molécula de unión es una proteína de unión, la proteína de unión puede fusionarse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de ingeniería genética o reticulación química. En casos en los que la molécula de unión no es una proteína, la molécula de unión puede fusionarse o unirse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de reticulación química.

La presente invención también proporciona un heterocomplejo que comprende un oligómero que incluye una pluralidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, y al menos dos moléculas diferentes que están fusionadas al oligómero. Las al menos dos moléculas diferentes pueden comprender al menos una primera enzima y una segunda enzima. La primera enzima y la segunda enzima pueden catalizar fracciones secuenciales en una vía de síntesis o degradación. La primera enzima y la segunda enzima pueden catalizar diferentes reacciones en una vía de síntesis o degradación. En otra realización, las al menos dos moléculas diferentes comprenden al menos una molécula de unión y una molécula informadora.

La presente invención aborda de forma exitosa los inconvenientes de las configuraciones actualmente conocidas para proporcionar una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa y describe sus usos.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe en este documento, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los particulares mostrados son a modo de ejemplo y para propósitos de análisis ilustrativo de las realizaciones preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con motivo de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente comprendida de los principio y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se hacen intentos de mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que lo necesario para una comprensión fundamental de la invención, haciendo evidente, para los especialistas en la técnica, la descripción tomada con los dibujos cómo pueden llevarse a la práctica varias formas de la invención.

En los dibujos:

La FIG. 1 demuestra la separación en SDS-tricina PAGE de las fracciones purificadas de monómero de 12,4 kDa y oligómero de 116 kDa de SP1. Las fracciones de 12,4 y 116 kDa de las proteínas SP1 se escindieron de las bandas correspondientes en SDS-tricina al 17%-PAGE de extractos de álamo estables a ebullición. Las proteínas después se electro-eluyeron. Las muestras de las proteínas electro-eluidas se prepararon en tampón de muestra 2 X SDS, se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS-tricina al 17%. Carril 1: fracción de SP1 de 12,4 kDa. Carril 2: fracción de SP1 de 116 kDa.

Las FIG. 2a-c demuestran la estabilidad del oligómero SP1 a tratamiento con SDS y calor. La Figura 2a muestra la estabilidad a SDS del oligómero SP1. La SP1 electro-eluida (116 kDa) se preparó en tampón de muestra SDS a un intervalo de proporciones molares, y se hirvió (+) o no ser hirvió (-) antes de la separación en geles de poliacrilamida SDS-tricina al 17%. Las Figuras 2b-c muestran la estabilidad al calor del oligómero SP1: el oligómero SP1 electroeluido (116 kDa) se preparó en tampón de muestra SDS a una proporción molar final de SDS:monómero SP1 de

1:900 y se calentó durante 5, 10 ó 20 minutos a las temperaturas indicadas antes de la separación en geles de poliacrilamida SDS-tricina al 17%. TA: temperatura ambiente. M: marcadores de tamaño molecular.

Las FIG. 3a-c demuestran la protección de la citrato sintasa (CS) de la inactivación por calor mediante la adición de SP1 nativa o recombinante. La actividad enzimática de CS a 43ºC se ensayó a intervalos sucesivos (como se describe en la siguiente sección de Ejemplos). Figura 3a: la CS se ensayó en ausencia (0) o presencia de SP1, en las siguientes proporciones molares monoméricas (CS:SP1): 1:5, 1:12,5, :25, 1:50, o en presencia de BSA y lisozima (proporción molar de monómero CS:BSA o lisozima de 1:25). Figura 3b: la CS se ensayó en ausencia (0) o presencia de CBD-SP1 recombinante en las siguientes proporciones molares monoméricas (monómero CS:monómero CBD-SP1): 1:5, 1:10 y 1:20, o en presencia de proteína CBD a una proporción molar (monómero CS:CBD) de 1:10 ó 1:20. Figura 3c: la CS se ensayó en ausencia (0) o presencia de alfa cristalina a una proporción molar monomérica (CS:cristalina) de 1:12,5, o en presencia de glicerol a concentraciones finales del 10% o el 20%.

La FIG. 4 demuestra la protección de la peroxidasa de rábano rusticano (HRP) de la inactivación por calor mediante la adición de SP1. La actividad de HARP a 55ºC se ensayó (como se describe en la siguiente sección de ejemplos) a intervalos sucesivos en ausencia (0) o presencia de SP1 nativa a proporciones molares monoméricas (HRP:SP1) de 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 ó 1: 300; o en presencia de BSA a una proporción final (HRP:BSA) de 1:300.

La FIG. 5 representa la secuencia nucleotídica del ADNc de SP1 (SEC ID Nº 1) y la secuencia proteica deducida (SEC ID Nº 2) de SP1. El ADNc de SP1 se remitió al EMBL con el número de acceso AJ276517.

Las FIG. 6a-b demuestran el análisis PAGE y la inmunodetección de la proteína de fusión recombinante CBD-SP1 (32,4 kDa) a partir de células E. coli. Las proteínas se separaron en mini-geles de tricina-SDS-poliacrilamida al 15%. Carril 1: proteínas bacterianas totales (E. coli que no contiene inserto de ADNc). Carril 2: proteínas bacterianas transformadas totales (E. coli que contiene el inserto cbd-SP1). Carril 3: proteína de fusión CBD-SP1 purificada en celulosa.

La FIG. 6a presenta un gel teñido con azul de Coomassie de las proteínas bacterianas.

La FIG. 6b demuestra la inmunodetección de proteínas SP1 por transferencia de Western de las proteínas bacterianas en nitrocelulosa y reacción con anticuerpos policlonales anti-SP1 (1:2.500).

La FIG. 7 demuestra el análisis de peso molecular por HPLC de filtración en gel de SP1 nativa y CBD-SP1 recombinante. SP1 y CBD-SP1 purificadas eluían de la columna TSK-3000 como un único pico con tiempos de retención de 9,8 (Kav = 0,36025) y 9,2 (Kav = 0,2775) minutos respectivamente. La curva de calibrado se obtuvo representando los logaritmos de los pesos moleculares de proteínas patrón (véase Materiales y Procedimientos) frente a sus parámetros de elución respectivos (Kav). El volumen R2 se calculó por el procedimiento de mínimos cuadrados y se muestra en la figura.

Inserción: cromatograma de los picos eluidos de SP1 y CBD-SP1.

La FIG. 8 demuestra las propiedades estables a ebullición de SP1 recombinante expresada en Pichia pastoris. El medio de cultivo de células de Pichia pastoris de control y transformadas con SP1 se hirvió (B) o no ser hirvió (NB) durante 10 minutos y después se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 g. Las muestras de sobrenadante se prepararon en tampón de muestra SDS de potencia total (2%) (carril 2) o tampón de muestra nativo (SDS al 0%) (carril 0), se hirvieron durante 5 minutos, y se separaron en gel de poliacrilamida SDS-tricina al 17%. Sin SP1: medio de cultivo de Pichia pastoris sin secuencias de SP1. Conteniendo SP1: medio de cultivo de Pichia pastoris que secreta SP1 recombinante.

La FIG. 9 demuestra la prevención de la inactivación por calor de CS por las fracciones de proteína estable a ebullición de plantas. La actividad CS a 43ºC se ensayó (como se describe en la siguiente sección de Ejemplos) a intervalos sucesivos en presencia de extractos de proteína estable a ebullición de tomate M82, tomate VF36 o álamo (CS:proteína igual a 1:2,5 gramos por mililitro) o BSA (proporción molar de HRP:BSA de 1:300).

La FIG. 10 representa una imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) de la estructura molecular de SP1. La imagen representa el promedio de 51 partículas hecha por alineación rotacional y traslacional.

La FIG. 11 representa la construcción del plásmido pET-CBD180-SP1, que contiene la secuencia de ADNc de SP1 (SEC ID Nº 1) insertada cadena abajo del elemento CBD-180, entre los sitios de restricción NcoI y BamHI.

La FIG. 12 representa la comparación de homología de secuencia entre el polipéptido SP1 putativos (SEC ID Nº 2) y las secuencias peptídicas putativas de EST homólogos de diversas especies relacionadas y no relacionadas (SEC ID Nº 7-32; Pluralidad = 10,00; umbral = 4,00; carga promedio = 1,00; apareamiento promedio = 2,91; desapareamiento promedio = menos 2,00). Las secuencias consenso (SEC ID Nº 33) se indican para cada agrupamiento de 50 restos.

La FIG. 13 representa la comparación de homología de secuencia entre el polipéptido SP1 putativo (SEC ID Nº 2) y el péptido putativo codificado por un cierto ARNm pop3 (SEC ID Nº 34).

Las FIG. 14a-d representan la inmunodetección de PE de pino y tomate que tienen reactividad cruzada antigénica con SP1. Las proteínas totales estables a ebullición de pino (Figuras 14a y 14b) y tomate (Figuras 14c y 14d) se prepararon (como se describe en la siguiente sección de Ejemplos), se separaron en PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se inmunodetectaron las proteínas con reactividad cruzada con anticuerpos anti-SP1 o anti-SP1 recombinante. La Figura 14a representa la reactividad cruzada inmune de proteínas estables a ebullición de agujas de pino (Pinus halepensis) en la estación lluviosa (carriles W1 y W2) o seca (carriles S1 y S2) después de la separación en SDS-glicina al 12,5% PAGE, la transferencia a nitrocelulosa y la reacción con anticuerpos anti-SP1 recombinante (anti-CBD-SP1). La Figura 14b representa la reactividad cruzada inmune de proteínas estables a ebullición de plántulas de punto tratadas con frío durante 36 horas (frío), tratadas con sal 3 días (sal) o no tratadas

(C) con SP1 de álamo purificada (SP1) después de la separación en SDS-tricina al 17% PAGE, transferencia a nitrocelulosa y reacción con anticuerpos anti-SP1 nativa (oligomérica). Las Figuras 14c y 14d representan la reactividad cruzada inmune de proteínas estables a ebullición de hojas de tomate (Lycopersicum esculentum). Los extractos de hojas sometidas a desprendimiento con estrés por sequedad (Figura 14c) (carril D), sin estrés por sequedad (C) o desprendimiento solo (0); o desprendimiento con (carrilles 0, 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 M de NaCl) o sin (H2O) estrés salino (Figura 14d) se separaron en SDS-tricina al 17% PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-recombinantes (anti-CBD-SP1).

La FIG. 15 es un gráfico de barras que demuestra que SP1 protege a la -amilasa de la inactivación inducida por CaCl2. La -amilasa (Sigma, A 6380, disuelta en tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,0, que contenía NaCl 6 mM, 0,2 mg/ml) se incubó en presencia de una concentración creciente de CaCl2 a temperatura ambiente (25ºC) durante 2 horas en ausencia o presencia de SP1 (0,7 M, del complejo de 12 unidades) [proporción de -amilasa:SP1 de 6:1). La actividad -amilasa se midió usando 'SIGMA DIAGNOSTICS AMYLASE' (Sigma, Nº Cat. 577-3) y se expresó como el porcentaje de la enzima no tratada (0-hielo).

La FIG. 16 es un gráfico de barras que demuestra que SP1 protege la actividad -amilasa durante la incubación a temperatura ambiente. La -amilasa (Sigma, A 6380, disuelta en tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,0, que contenía NaCl 6 mM, 0,2 mg/ml) se incubó a temperatura ambiente (25ºC) durante una semana en ausencia (0) o presencia de SP1 a diversas concentraciones. La actividad -amilasa se ensayó midiendo la cantidad de almidón que quedaba después de hidrolizarse por la -amilasa. La actividad se define como los miligramos de almidón que se hidrolizaron por un miligramo de -amilasa por minuto a 37ºC. La actividad relativa en esta Figura se expresa como el porcentaje de enzima no tratada (0-frío).

La FIG. 17 es un gráfico de barras que demuestra que SP1 repara la actividad -amilasa. La -amilasa (Sigma, A 6380, disuelta en tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,0, que contenía NaCl 6 mM, 0,2 mg/ml) se incubó con 0,1 mg/ml (0,7 M) de SP1 a temperatura ambiente (25ºC). La actividad -amilasa se ensayó 2 horas después, usando 'SIGMA DIAGNOSTICS AMYLASE' (Sigma, Nº Cat. 577-3). La proporción molar monomérica de amilasa:SP1 fue de 6:1.

La FIG. 18 es un gráfico de barras que demuestra que SP1 repara la HRP dañada. La solución de HRP diluida (5 nM en tampón HEPES 40 mM, pH 7,5) se incubó a temperatura ambiente (25ºC) durante 30 minutos, seguido de adición de SP1 o tampón (170 nM, correspondiente a una proporción molar del complejo de 12 unidades de HRP:SP1 de 1:17). La actividad HRP se midió en diferentes momentos puntuales indicados. La actividad relativa se calculó como el porcentaje de la enzima no tratada (tiempo 0).

La FIG. 19 es un diagrama que demuestra que SP1 repara la actividad SOD. Se diluyó SOD de calidad cosmética ("dismutin", Pentapharm Ltd.) a factor 1000 veces en tampón acetato/Tris 50 mM, pH 5,5, EDTA 1,0 mM (concentración final de SOD 10 unidades/ml, donde una unidad SOD se define como la cantidad de enzima que, en condiciones específicas del ensayo, causa la inhibición del 50% en la velocidad de reducción de pirogalol) y se incubó a 37ºC en ausencia o presencia de SP1 en las concentraciones indicadas. Las condiciones de reacción de SOD se determinaron en una cubeta de plástico desechable de 1 ml a 25 ºC, del siguiente modo: se mezclaron 100 l de solución SOD (10 U/ml) con 800 ml de tampón Tris/acetato, pH 8,3, EDTA 1,0 mM y 100 l de solución recién preparada de pirogalol 2 mM que se disolvió en el mismo tampón (concentración final de 0,2 mM). El pH final en el tampón de reacción era 8,0. Se registró la densidad óptica después de 60 minutos a 420 nm a temperatura ambiente.

Las FIG. 20a y 20b(i)-(iv) son gráficos que demuestran que la respuesta inmune contra CBD de ratones inyectados con CBD es mucho mayor que en ratones inyectados con la fusión CBD-SP1. A 16 ratones (C57BL/6) se les inyectó (100 l) CBD {5 M (ratones 1-4), 0,05 M (ratones 9-12)} o proteína de fusión CBD-SP1 {5 M (ratones 5-8), 0,05 M (ratones 12-16)}. Se dio dos inyecciones a cada ratón en el día 0 y el día 21. Se exanguinó a los ratones justo antes de la primera inmunización (NIS) 14, 21 y 35 días después de la primera inmunización. La actividad de los anticuerpos en el suero se ensayó usando ELISA con CBD como antígeno y anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP para detectar la cantidad de anticuerpo unido. Para este fin, las placas se revistieron con CBD (1,0 g/ml de PBS, 120 g/pocillo durante 2 horas, a 37ºC). El bloqueo se realizó usando BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. La primera reacción con anticuerpo se realizó diluyendo los sueros en BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Todas las etapas de lavado se realizaron cinco veces con PBS suplementado con TWEEN-20 al 0,1%. La segunda reacción con anticuerpo se realizó con IgG anti-ratón conjugado con HRP (Sigma, diluido 1/10000, v/v). El desarrollo de color se detuvo por ácido sulfúrico 1 M después de 5 minutos de incubación con sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, PIERCE).

Las FIG. 21a-c son gráficos de barras que demuestran la elongación del tallo, la retención de hojas y el peso seco de plantas de álamo después de estrés salino y la recuperación a partir del estrés salino. Se transformaron plantas de álamo con un vector que albergaba el gen sp1 bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S. Se ensayaron dos líneas de álamo spI-transgénicas seleccionadas, que mostraban diferente nivel de expresión de SP1, así como la planta no transformada (NT), para la tolerancia a sales. Las plantas de álamo clonadas in vitro se aclimataron en un invernadero y se curtieron en macetas de medio litro que contenían vermiculita:medio de jardín 1:1. Se diseñó un experimento de bloque, con grupos de seis plantas cada línea y cada tratamiento se diseñó en un invernadero controlado (26ºC durante el día y 20ºC durante la noche). Las plantas de control se regaron diariamente con agua corriente (250 ml por maceta) que contenía 200 ppm de fertilizante (7/3/7, NPK). Las plantas sometidas a estrés salino se regaron como el control, pero se suplementaron con NaCl y CaCl2 150 mM (en una proporción molar de 6:1), durante 3 semanas, es decir, el "periodo de estrés". Al final del tratamiento con sales, todas las plantas se regaron durante 3 semanas adicionales sin sal, es decir, el "periodo de recuperación". Se tomó la longitud del tallo y la cantidad de hojas, así como muestras de hoja para medir el potencial osmótico, cada semana durante los periodos de estrés y recuperación. Se tomaron los pesos fresco y seco al final del experimento.

La FIG. 22 es un gráfico de barras que demuestra el efecto de SP1 sobre la curación de heridas. Se sembraron células fibroblásticas humanas a una densidad de 200.000/placa petri (4 cm de diámetro) en un medio de crecimiento (2 ml de medio DEME que contenía FCS al 10%, glutamina al 2% y antibióticos). El medio se cambió cada dos días hasta que las células alcanzaron la confluencia. Se hizo un rasguño con una punta de micropipeta (punta de 1 ml) y la placa se lavó dos veces en PBS, para retirar los desechos desprendidos. Se marcaron cuatro puntos seleccionados aleatoriamente a los largo del rasguño usando un bolígrafo marcador sobre la parte inferior de la placa. Se añadió medio fresco sin o con 5 g/ml de proteína SP1 obtenida de la planta al medio. Las células se incubaron a 37ºC durante 28 horas. El rasguño en cada placa se registró a tiempo 0 y 28 horas tomando las imágenes de los cuatro puntos marcados a lo largo del rasguño, usando una videocámara conectada a un microscopio invertido. Todas las imágenes se tomaron al mismo aumento. La distancia del rasguño se midió en estas imágenes. Los datos se promediaron para 12 imágenes de 3 placas petri replicadas. En la Figura, la confluencia se calculó como el porcentaje del rasguño inicial.

Las FIG. 23a-b son una fotografía de un gel y una tabla que demuestran que CBD-SP1 se une a la celulosa como la proteína CBD y protege a HRP como SP1. Se aplicó una cantidad igual de proteínas CBD y CBD-SP1 (15 pmol, calculada sobre el peso molecular de CBD) a 30 mg de celulosa (Sigmacell tipo 20). Las muestras proteicas se recogieron antes de aplicarse a la celulosa (antes de la unión), antes de la elución de la celulosa (unión) y después de la elución de la celulosa (elución). Las muestras proteicas de cada fase se mezclaron con tampón de muestra SDS, se hirvieron durante 5 min., y se separaron en tricina-SDS al 15%-PAGE. Para el ensayo de protección de HRP, se incubó una alícuota de 100 l de HRP (Sigma, 5 nM en tampón HEPES 40 mM pH 7,5) a 25ºC en presencia de SP1 o proteína de fusión SP1-CBD a diferentes concentraciones. Las alícuotas se retiraron después de 16 horas para determinar la actividad enzimática restante. Las condiciones de reacción de HRP se determinaron del siguiente modo: se incubaron 5 l de HRP 5 nM y 100 l de sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; PIERCE) a 25ºC. La reacción se detuvo después de 10 min. mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M y se registró mediante un lector de microplaca a 435 nm. Se determinó que la reacción colorimétrica de HRP así como la concentración de sustrato de HRP estaban en el intervalo lineal. Las unidades de protección son el factor de dilución de una solución de SP1 a una concentración de 1 mg/ml que confiere una protección del 50% de la actividad HRP en las condiciones anteriores.

Las FIG. 24a(i)-(ii) y 24b son fotografías que demuestran la producción de proteína SP1 a partir de plantas y bacterias recombinantes. Se transformó la cepa de E. coli BL21(DE3) con un plásmido que portaba el gen de SP1 (pET29a, que confiere resistencia a kanamicina) y se cultivó en medio mínimo M9 (Sambrook y col., 1989) que contenía kanamicina A (Sigma K4000; 50 g/ml) a (D.O.(600nm)) = 0,05. Este procedimiento se repitió para un total de cinco diluciones rebrotes sucesivos. Se añadió glicerol estéril a una concentración final del 15% (v/v). Se distribuyeron alícuotas de 40 l de forma aséptica en tubos estériles y se almacenaron a -80ºC. Cultivo de bacterias que portan el gen de SP1 recombinante: Se diluyó asépticamente una alícuota de solución madre de glicerol bacteriana (40 l) 250 veces en 12 ml de medio mínimo M9 (Sambrook y col., 1989) que contenía kanamicina A y se cultivó a D.O.(600nm) de 1-3. Este cultivo se diluyó 120 veces en medio complejo y se cultivó a D.O.(600nm) de 0,8. En este punto, el cultivo se indujo mediante la adición de isopropil--D-tiogalactopiranósido (IPTG, 0,5 mM), y se dejó que el cultivo creciera durante otras cuatro horas. Las células se recogieron por centrifugación (10000 g, 15 minutos, 4ºC), y el sedimento celular se almacenó congelado a -80ºC. Extracción y purificación de SP1 recombinante de la preparación bacteriana de cultivos de almacenamiento bacterianos: El sedimento celular bacteriano se suspendió en tampón Tris-HCl (30 mM; pH = 10,5; 180 g/litro; DO(600nm) =100-120), se sonicó en hielo (1 hora, pulsos del 40% de la capacidad completa) hasta que la turbidez descendió cuatro veces. Se añadieron Triton-X-100 y lisozima (0,1% y 10 g/ml, respectivamente), se incubaron con agitación suave (1 hora a 37ºC), seguido de centrifugación (15000 g, 15 minutos, 4ºC). El sedimento se desechó, se añadieron NaCl y MgCl2 al sobrenadante (150 mM y 2,5 mM, respectivamente) y el pH se ajustó a 8,3 con HCl. Para diferir los ácidos nucleicos, la solución se incubó con Benzonasa (Sigma, Nº Cat. E1014; 0,3 unidades/ml) con agitación suave (12 horas a 37ºC). Para digerir la proteína, se añadieron NH4HCO3 y Subtilisina (Sigma, Nº Cat. P5380) al extracto (0,1 M y 1 g/ml, respectivamente) y la solución se incubó con agitación suave (12 horas a 37ºC). Para retirar las proteínas sensibles a ebullición se hirvió el extracto (10 minutos), se enfrió en hielo y se centrifugó (10000 g, 15 minutos, 4ºC). El sobrenadante se filtró a través de papel de filtro (Whatman número 42) y filtros de membrana (Schleicher & Schull ME-28, tamaño de poro de 1,2 m y ME-25, tamaño de poro de 0,45 m). El filtrado se concentró y se lavó con solución salina tamponada con Tris

o con solución salina tamponada con fosfato hasta que el filtrado se hizo incoloro. La concentración de proteína se midió usando el procedimiento de Bradford y SP1 como patrón, y se ajustó a 10 mg/ml. Se añadió Timerosal (Sigma, Nº Cat. T8784) (50 ppm). La solución se distribuyó en viales color ámbar con tapón a rosca en forma de alícuotas de 1 ml y se almacenaron en oscuridad a 4 ºC. Figura 24a(i) (de izquierda a derecha) Carril 1 - Extracto en bruto de hojas de chopo. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 min. antes de la aplicación sobre el gel; Carril 2 - Extracto en bruto de hojas de chopo después de ebullición durante 10 minutos y centrifugación. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 minutos antes de la aplicación sobre el gel. Figura 24a(ii) (de izquierda de derecha) Carril 1 - Extracto en bruto de proteína recombinante expresada en E. coli. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 minutos antes de la aplicación sobre el; Carril 2 - Extracto en bruto de proteína recombinante expresada en E. coli después de ebullición durante 10 minutos y centrifugación. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 min. antes de la aplicación sobre el gel. Figura 24b - La SP1 recombinante es resistente a ebullición y proteolisis (de izquierda de derecha): Carril 1, Extracto en bruto: bacterias solubilizadas (véase el texto anterior); Carril 2 - Sobrenadante del extracto en bruto después de ebullición durante 10 minutos y centrifugación. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 min. antes de la aplicación sobre el gel. Carril 3 - Sobrenadante del extracto en bruto después de ebullición durante 10 minutos y centrifugación. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina pero no se hirvió antes de la aplicación sobre el gel. Carril 4 - Extracto en bruto después de tratamiento con Proteinasa K. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina y se hirvió durante 10 minutos antes de la aplicación sobre el gel. Carril 5 - Extracto en bruto después de tratamiento con Proteinasa K. La muestra se mezcló con tampón de aplicación Tricina pero no se hirvió antes de la aplicación sobre el gel.

La FIG. 25 es un gráfico de barras que demuestra el efecto de SP1 sobre el cabello humano. Se tomó cabello humano, de aproximadamente 20 cm de longitud, de un individuo. Cada cabello se cortó en dos fragmentos, cada uno de aproximadamente 10 cm de longitud. Un fragmento se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en solución de tampón Tris {(100 mM; pH 8,0), control} y el otro se incubó en el mismo tampón que contenía SP1 (50 g/ml; cabello tratado con SP1). El cabello se secó al aire durante 10 minutos, y se comparó la fuerza de cada fragmento individual con la fuerza del otro. Cada fragmento de cabello se pegó usando cinta adhesiva a un vara de metal y en el otro extremo al asa de una cubeta de plástico. La cubeta se dejó colgando de la vara de metal a través del cabello. El peso se aumentó gradualmente añadiendo agua a la cubeta hasta que el cabello se rompió. La fuerza se define como el peso sobre el cual se rompió el cabello. La probabilidad de que la fuerza del cabello tratado con SP1 sea mayor a la del cabello de control es del 97%, que se determina por en ensayo de t de Student para muestras dependientes.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención es de (i) nuevas proteínas homo-oligoméricas estables a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistentes a proteasa, también mencionadas como proteínas estables (PE), que tienen actividad tipo chaperona; (ii) procedimientos de producción y purificación de PE; (iii) ácidos nucleicos que codifican PE; (iv) procedimientos para aislar ácidos nucleicos que codifican PE; (v) anticuerpos que reconocen PE;

(vi) el uso de PE para estabilizar, replegar, activar, evitar la agregación y/o desagregar macromoléculas, proteínas en particular; (vii) proteínas de fusión que incluyen PE; (viii) construcciones de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión; y (ix) su uso para inmunización. A continuación se analizan adicionalmente aspectos y aplicaciones adicionales.

Los principios y funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los gráficos y las descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención tiene capacidad para otras realizaciones o para ponerse en práctica o realizarse de diversos modos. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología empleadas en este documento es para el propósito de descripción y no deben considerarse como limitantes.

Restringiendo la presente invención a la práctica, se purificó una nueva proteína estable a ebullición importante a partir de plantas de álamo sometidas a escasez de agua (mencionada en este documento como SP1). En estado nativo, como se demuestra por SDS-PAGE, SP1 existe en forma de un complejo oligomérico de alto peso molecular de 116 kDa, que es estable a temperaturas en exceso de 80ºC, y en presencia de altas concentraciones (proporción molar de SDS:monómero SP1 de hasta 600:1) de SDS. El complejo SP1 oligomérico es puede convertir en su forma monomérica (12,4 kDa) solamente cuando se somete a una combinación de temperatura extrema (100ºC) y elevadas concentraciones de SDS (proporción molar de SDS:monómero SP1 mayor de, o igual a 600:1).

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, se demostró que la SP1 nativa de extracto proteico en bruto de álamo sometido a escasez de agua mostraba resistencia a digestión proteolítica con proteinasa K. Cuando se extraía de material vegetal de álamo homogeneizado en nitrógeno líquido, la proteína soluble predominante que quedaba después de 60 minutos de digestión con proteinasa K se identificó como SP1. Además, la proteína SP1 purificada con proteasa mantiene su naturaleza oligomérica. Por tanto, SP1 muestra resistencia a digestión proteolítica y puede aislarse y purificarse sin detergente a partir de material vegetal.

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, la SP1 nativa purificada en gel se ensayó para su capacidad de estabilizar y reparar proteínas inestables al calor frente a la inactivación/agregación térmica. La actividad citrato sintasa desciende cuando se incuba a 43ºC durante 15 minutos, debido a la agregación de la proteína enzimática. Algunas sHsp (tales como la alfa-cristalina) son capaces de evitar la agregación de la proteína CS dimérica, pero no de revertir la inactivación de la actividad catalítica CS. La adición de la proteína SP1 (CS a monómero SP1 1:50) confería una protección térmica casi completa (93%) de la actividad enzimática CS durante 40 minutos a 43ºC. Concentraciones inferiores de SP1 conferían estabilidad térmica significativa, pero proporcionalmente menor. La BSA, la alfa-cristalina y el glicerol fueron ineficaces para proteger la CS de la inactivación térmica. Concentraciones similares de SP1 oligomérica purificada, nativa también fueron eficaces para proteger la enzima monomérica, la peroxidasa de rábano rusticano (proporción molar de SP1 a HRP de 300:1) de la inactivación térmica de la actividad catalítica por una exposición prolongada a 55ºC (actividad restante de 53% después de 2 horas). Además, la SP1 oligomérica purificada, nativa fue eficaz para reparar la actividad de la peroxidasa de rábano rusticano después de la inactivación térmica. Por tanto, la SP1 muestra capacidad tipo chaperona para estabilizar y reparar proteínas monoméricas y poliméricas durante la exposición a condiciones desnaturalizantes, sin inhibición de la actividad biológica en condiciones no desnaturalizantes.

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, se usó el ARN poli-adenilado de brotes de álamo sometidos a escasez de agua para preparar ADNc para una biblioteca de expresión lambda en E. coli. Se identificó un clon que expresaba una secuencia polipeptídica de SP1 por reactividad con anticuerpos policlonales anti-SP1 creados contra la SP1 nativa purificada en gel. Cuando se amplificó y secuenció, se descubrió que el inserto de ADN de SP1 de 567 nucleótidos (SEC ID Nº 1) contenía una fase de lectura abierta que representa la secuencia codificante de longitud completa del monómero polipeptídico de SP1 (SEC ID Nº 2). El análisis de la secuencia codificante indicó una proteína altamente hidrófoba, rica en restos de treonina, alanina, leucina, ácido glutámico y serina, con bajo contenido en triptófano, y que carece de cisteínas. No se detectó homología con otras secuencias proteicas presentadas, pero se identificaron proteínas que mostraban homología de secuencia con SP1 a partir de diversas especies de plantas evolutivamente distantes (filogenéticamente remotas) usando las bases de datos EST. Se identificaron veinticinco secuencias con homología significativa (3 en Arabidopsis, 2 en maíz, 1 en patata, 2 en arroz, 1 en sorgo, 7 en soja, 2 en tomate y 7 en trigo, SEC ID Nº 7-32). Se encuentra una homología del 96,6% entre la SP1 y una secuencia de ARNm de pop3 de Populus trichocarpa x Populus deltoides (SEC ID Nº 34 y 35 para las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos, respectivamente). Se alinearon las secuencias peptídicas putativas y se compararon con la secuencia peptídico de SP1 (SEC ID Nº 2), revelando unas pocas secuencias consenso conservadas: "HAF-ESTFES" (61-75, SEC ID Nº 36), "VKH" (9-11, SEC ID Nº 37) y "KSF" (47-49, SEC ID Nº 38), por ejemplo, que indican que SP1 es un miembro de una familia de genes proteicos con amplia representación en genomas de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Sin embargo, excepto para SP1, no se ha descubierto o atribuido ninguna función para ninguna de las proteínas de esta familia.

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, cuando se insertó la fase de lectura abierta del ADNc de SP1 en la orientación apropiada cadena abajo del elemento CBD del vector de expresión de CBD pET-CBD-180, se obtuvo una secuencia de nucleótidos que codificaba una proteína de fusión CBD-SP1. La proteína de fusión recombinante CBD-SP1 se detectó en cuerpos de inclusión de bacterias transformadas. En SDS-PAGE, la proteína de fusión migraba a 32:4 kDa, y era muy inmunorreactiva según se determinó por análisis de transferencia de Western con anticuerpos policlonales anti-SP1. Por tanto, la proteína de fusión y la SP1 nativa tienen epítopes comunes. Esta identidad antigénica se demostró adicionalmente después de la generación de anticuerpos policlonales anti-CBD-SP1. Aprovechando la afinidad del elemento CBD por la celulosa, se purificó la proteína recombinante CBD-SP1 en perlas de celulosa. Se creó un anticuerpo policlonal frente a la proteína de fusión altamente purificada. El anticuerpo anti-CBD-SP1 y los anticuerpos anti-SP1 nativa reconocieron ambos tanto SP1 como la proteína de fusión CBD-SP1 en SDS-PAGE de proteínas nativas (172,5% 1,25 kDa) y recombinantes (267,5% 2,5 kDa) purificadas por HPLC por filtración en gel. Por tanto, las secuencias de SP1 recombinantes retienen las propiedades antigénicas y formadoras de oligómeros de la proteína nativa.

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, se consiguió la secreción de una SP1 recombinante no fusionada clonando una parte de la secuencia codificante de SP1 en fase en un vector de expresión secretor de P. pastoris pPIC9K y transformado células vegetales huésped con construcciones en fase verificadas. La exploración e inducción de un elevado nivel de expresión reveló que la SP1 recombinante se secreta en el medio de cultivo. Se descubrió que la SP1 recombinante no fusionada secretada por P. pastoris tenía reactividad cruzada antigénica con anticuerpos policlonales anti-SP1 nativa y anti-CBD-SP1 recombinante.

Además, restringiendo la presente invención a la práctica, la SP1 recombinante recuperada del medio de cultivo de

P. pastoris se sometió a condiciones desnaturalizantes extremas, y se visualizó en SDS-PAGE. Como la proteína nativa, la SP1 recombinante permanecía en forma de un complejo oligomérico después de la exposición a altas concentraciones de detergente (por ejemplo, SDS al 2%) o altas temperaturas (por ejemplo, ebullición). Solamente la combinación de las dos condiciones extremas, alta concentración de SDS y ebullición, causaba que la proteína migrara como la forma monomérica en SDS-PAGE. Por tanto, la SP1 recombinante también retiene el carácter oligomérico antigénico y estable en ebullición y detergentes de la proteína SP1 nativa.

Los polipéptidos SP1 recombinantes tienen actividad tipo chaperona similar a la SP1 nativa. A una proporción molar monomérica relativamente baja (proporción CBD-SP1:CS de 20:1), la proteína de fusión CBD-SP1 purificada confería protección significativa (73%) contra la inactivación térmica de la actividad citrato sintasa (CS). Una proporción inferior de CBD-SP1 a CS (5:1) conducía a una protección proporcionalmente menor (33%), mientras que la incubación de la CS con concentraciones mayores de lisozima o alfa-cristalina no tubo efecto estabilizador sobre la actividad enzimática CS. Por tanto, la parte de la proteína SP1 codificada por la secuencia de SP1 clonada retenía las propiedades tanto antigénica como de estabilización térmica de la proteína nativa.

Se examinó la naturaleza oligomérica de SP1 mediante formación de imágenes en microscopía electrónica de transmisión (MET). Las imágenes revelaron un oligómero de 12 subunidades, dispuestas en una disposición tipo anillo que tiene un diámetro externo de aproximadamente 11 nm.

Se detectó una proteína estable a ebullición importante que se descubrió que protegía la actividad catalítica de CS en otras plantas filogenéticamente remotas - tomate y pino. Cuando se separaban en SDS PAGE, se transferían a nitrocelulosa y se inmuno-detectaban con anticuerpos anti-SP1, se descubrió que los extractos proteicos estables a ebullición de estas especies remotas contenían proteínas con reactividad cruzada que se correlacionan con la estructura tanto monomérica como oligomérica de SP1. Además, estas proteínas con reactividad cruzada del tomate y el pino parecían ser sensibles a la sequía, el frío y el estrés salino. Por tanto, las PE de especies filogenéticamente remotas y que muestras reactividad inmune cruzada con SP1 también tienen actividad tipo chaperona.

Restringiendo adicionalmente la presente invención a la práctica, se descubrió que las PE pueden usarse para proteger a una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática, para reparar al menos una parte de la actividad enzimática perdida de una preparación enzimática. Se descubrió adicionalmente que las PE puede usarse para administrar un polipéptido a un animal con sistema inmune, reduciendo al mismo tiempo una respuesta inmune contra el polipéptido. También se descubrió adicionalmente que una planta transgénica que expresaba PE por encima de una cantidad normal de PE es más tolerante a y más recuperable de estrés abiótico. Se prevé un comportamiento similar con respecto al estrés biótico, tal como infección por parásitos. También se descubrió adicionalmente que pueden usarse PE para aumentar la migración celular y por tanto pueden usarse para la aceleración y/o inducción de la curación de heridas. También se descubrió que pueden usarse PE para aumentar la fuerza del cabello. Se prevé que podrían usarse PE para aumentar la fuerza de las uñas y de la piel también.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un primer polinucleótido que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa. La proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa codificada por el polinucleótido de este aspecto de la presente invención tiene una actividad tipo chaperona, que se puede ensayar como se describe adicionalmente en este documento.

Como se usa en este documento la expresión "estable a desnaturalizantes" se refiere una estabilidad oligomérica estructural importante (por encima del 50%) después de un tratamiento de desnaturalización en solución acuosa. Un tratamiento de desnaturalización puede incluir ebullición y exposición a un desnaturalizante químico, tal como un detergente (por ejemplo, SDS), urea, o guanidin-HCl.

Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la siguiente sección de reivindicaciones, la expresión "estable a ebullición" se refiere a estabilidad oligomérica estructural importante (por encima del 50%) después de tratamiento a sustancialmente 100ºC en solución acuosa durante al menos 10 minutos, que se determina por ensayo de fraccionamiento por tamaño.

Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la siguiente sección de reivindicaciones, la expresión "estable a detergentes" se refiere a estabilidad oligomérica importante (por encima del 50%) de una proteína oligomérica después de tratamiento en solución acuosa que contiene una proporción molar 1/2.000 (monómero:SDS), que se determina por un ensayo de fraccionamiento por tamaño.

Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la siguiente sección de reivindicaciones, la expresión "resistente a proteasa" se refiere una estabilidad importante (por encima del 50%) después de tratamiento en solución acuosa que contiene 50 g por ml de proteinasa K durante al menos 60 minutos a 37ºC.

Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la siguiente sección de reivindicaciones, la expresión "actividad tipo chaperona" se refiere a la capacidad de mediar el plegamiento nativo y la oligomerización nativa de las proteínas, de evitar la formación de estructuras proteicas incorrectas, de desenredar estructuras proteicas incorrectas existentes y de limitar el daño relacionado con el estrés inhibiendo las interacciones incorrectas que podrían existir entre proteínas parcialmente desnaturalizadas o sus dominios. Una de dichas interacciones incorrectas podría, por ejemplo, conducir a la desnaturalización irreversible de las proteínas enzimáticas, como en la citrato sintasa, y a una pérdida significativa de la actividad catalítica resultante de condiciones térmicas extremas. Otra interacción incorrecta podría causar la agregación de proteínas plegadas de forma no nativa, como resultado del estrés o la expresión de genes heterólogos en células transformadas. Evitando dichas interacciones incorrectas, las moléculas que tienen "actividad tipo chaperona" podrían conferir resistencia a estrés térmico u otro tipo de estrés a moléculas biológicamente activas, y evitar o incluso revertir la agregación de las proteínas.

El polinucleótido de la invención tiene una secuencia que es al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, aún preferiblemente al menos un 65%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80%, todavía preferiblemente al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, mucho más preferiblemente al menos un 95%, idéntica a la SEC ID Nº 1, 5, 6, 34, 39 ó 40 o una parte de la misma de al menos 100, al menos 150, al menos 200 o al menos 250 bases contiguas, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la carga por hueco es igual a 50, la carga por longitud es igual a 3, el apareamiento promedio es igual a 10 y el desapareamiento promedio es igual a -9.

La SEC ID Nº 1 es un ADNc que codifica una proteína estable (PE) de álamo (SP1) que se clonó usando una biblioteca de expresión y un anticuerpo anti-SP1 creado contra una banda principal de una fracción proteica estable al calor. La SEC ID Nº 34 es una secuencia homóloga. Usando éstas u otras secuencias homólogas, y la hibridación convencional de ácidos nucleicos, la PCR de transcripción inversa u otras técnicas, o como alternativa, usando los anticuerpos anti-SP1, un especialista en la técnica puede aislar (i) el clon genómico que codifica SP1; y (ii) clones de ADNc y genómicos de proteínas estables de otras especies. Debe enfatizarse adicionalmente en este contexto que SP1 es la proteína principal en una fracción proteica estable a ebullición de álamo sometido a escasez de agua, está presente en otras especies de plantas y por lo tanto se espera que sea la proteína más abundante en una fracción proteica estable a ebullición de cualquier planta, especialmente en condiciones de escasez de agua, que convierte el aislamiento de la misma y los polinucleótidos que codifican la misma en bastante simple por, por ejemplo, electroforesis preparativa en gel, aislamiento de péptidos y microsecuenciación, seguido de exploración de las bibliotecas apropiadas o genómicas usando oligonucleótidos sintéticos o por RT-PCR.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento explorar una biblioteca de expresión con el polinucleótido descrito en este documento o una parte del mismo. A continuación en este documento se analizan procedimientos adicionales de aislamiento de genes.

Como se usa en este documento la expresión "polinucleótido complementario" o "ADNc" incluye secuencias que originalmente son el resultado de la transcripción inversa del ADN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Dichas secuencias pueden amplificarse posteriormente in vivo

o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.

Como se usa en este documento, la expresión "polinucleótido genómico" incluye secuencias que derivan originalmente de un cromosoma y reflejan una parte contigua de un cromosoma.

Preferiblemente, la proteína estable codificada por el polinucleótido de este aspecto de la invención tiene una secuencia al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 65%, aún más preferiblemente al menos un 70%, aún preferiblemente al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80%, todavía preferiblemente al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, mucho más preferiblemente al menos un 95%, homóloga (idéntica + aminoácidos similares) a la SEC ID Nº 2 ó 35, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.

Como alternativa o adicionalmente, el polinucleótido de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede hibridar preferiblemente con la SEC ID Nº 1, 5, 6, 34, 39 ó 40, o con los ácidos nucleicos que codifican las SEC ID Nº 7-33, o partes de los mismos de al menos 100, al menos 150, al menos 200 o al menos 250 bases consecutivas.

La hibridación para ácidos nucleicos largos (por ejemplo, por encima de 100 pb de longitud) se realiza de acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención por hibridación rigurosa o moderada, donde la hibridación rigurosa se realiza por una solución de hibridación que contiene sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1 M, SDS al 1% y 5 x 106 cpm de sonda marcada con 32p, a 65ºC, con una solución de lavado final de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% y un lavado final a 65ºC; mientras que la hibridación moderada se realiza por una solución de hibridación que contiene sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1 M, SDS al 1% y 5 x 106 cpm de sonda marcada con 32p, a 65ºC, con una solución de lavado final de 1 x SSC y SDS al 0,1% y un lavado final a 50ºC.

Por tanto, este aspecto de la presente invención abarca (i) polinucleótidos expuestos en las SEC ID Nº 1 y 34; (ii) fragmentos de los mismos; (iii) secuencias que pueden hibridar con los mismos; (iv) secuencias homólogas a los mismos; (v) secuencias que codifican polipéptidos similares con diferente uso de codones; (vi) secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, de forma natural o inducidas por el hombre, de modo aleatorio o dirigido. Cada una de dichas secuencias puede expresarse usando un sistema de expresión y la proteína codificada por las mismas puede ensayarse para la estabilidad y la actividad tipo chaperona como se describe y ejemplifica adicionalmente en este documento en la siguiente sección de Ejemplos.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencias con diferente uso de codones" se refiere a secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de idéntica secuencia y número de restos aminoacídicos, que difieren en la composición de bases de uno o más de los codones en triplete que especifican los aminoácidos. Dicho diferente uso de codones es una función de la pluralidad de tripletes que codifican restos aminoacídicos individuales, y se ha demostrado para genes de proteínas homólogas en especies remotas tales como mamíferos y protozoos, y para proteínas específicas de tejido de familias de genes de múltiples copias.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ácido nucleico aislado de acuerdo con este aspecto de la presente invención comprende adicionalmente un segundo polinucleótido que alberga una secuencia promotora para regular la expresión del primer polinucleótido en una orientación con sentido. Se sabe que dichos promotores son elementos de secuencia de acción en cis necesarios para la transcripción ya que sirven para unirse a la ARN polimerasa dependiente de ADN que transcribe secuencias presentes cadena abajo de los mismos.

Aunque el primer polinucleótido descrito en este documento es un elemento esencial de la invención, es modular y puede usarse en diferentes contextos. El promotor de elección que se usa junto con el polinucleótido de la invención es de importancia secundaria per se, y comprenderá cualquier promotor adecuado. Un especialista en la técnica apreciará, sin embargo, que es necesario asegurarse de que el sitio o sitios de inicio de la transcripción estarán localizados cadena arriba de una fase de lectura abierta. En una realización preferida de la presente invención, el promotor que se selecciona comprende un elemento que es activo en las células huésped particulares de interés, sean bacterias, levaduras o una célula superior de una planta o animal, incluyendo células de insecto y derivadas de mamífero.

Como se usa en este documento un "promotor eucariota" se refiere a un promotor que puede dirigir la expresión génica en células eucariotas. Puede obtenerse de un genoma eucariota o de un genoma viral capaz de infectar una célula eucariota.

Como se usa en este documento un "promotor procariota" se refiere a un promotor que puede dirigir la expresión génica en un procariota. Puede obtenerse de un genoma procariota o plásmido o de un genoma viral capaz de infectar una célula procariota.

Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la siguiente sección de reivindicaciones, la expresión "promotor vegetal" incluye un promotor que puede dirigir la expresión génica en células vegetales. Dicho promotor puede obtenerse de una planta, virus, hongo o animal. Dicho promotor puede ser constitutivo, es decir, capaz de dirigir un elevado nivel de expresión génica en una pluralidad de tejidos vegetales, específico de tejido, es decir, capaz de dirigir la expresión génica en un tejido o tejidos vegetales particulares, inducible, es decir, capaz de dirigir la expresión génica bajo un estímulo, o quimérico.

Los promotores que pueden dirigir la expresión génica en orgánulos subcelular tales como cloroplastos, cloroplástides o mitocondrias, también están dentro del alcance de la presente invención. Dichos promotores puede ser funcionales también en procariotas.

El promotor vegetal empleado puede ser un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor quimérico.

Los ejemplos de promotores vegetales constitutivos incluyen, sin limitación, los promotores CaMV35S y CaMV19S, el promotor FMV34S, el promotor del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor CsVMV, el promotor de la actina ACT2/ACT8 de Arabidopsis, el promotor UBQ de la ubiquitina de Arabidopsis, el promotor BTH6 de la tionina de la hoja de la cebada, y el promotor de la actina del arroz.

Los ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen, sin limitación, el promotor de la proteína de almacenamiento de la faseolina de la alubia, el promotor DLEC, el promotor PHS, el promotor de la proteína de almacenamiento de zeína, el promotor de la conglutina gamma de la soja, el promotor del gen AT2S1, el promotor de la actina ACT11 de Arabidopsis, el promotor napA de Brassica napus y el promotor del gen de la patatina de la patata.

El promotor inducible es un promotor inducido por un estímulo específico tal como condiciones de estrés que comprenden, por ejemplo, luz, temperatura, agentes químicos, sequía, alta salinidad, choque osmótico, condiciones oxidantes o en caso de patogenicidad e incluyen, son limitación, el promotor inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante, el promotor del gen rbcS de la alfalfa, los promotores DRE, MYC y MYB activos en sequía; los promotores INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 activos en elevada salinidad y estrés osmótico, y los promotores hsr203J y str246C activos en estrés patogénico.

El primer (región codificante) y segundo (secuencia promotora) polinucleótidos descritos en este documento preferiblemente forman una parte de una construcción de ácido nucleico que preferiblemente tiene elementos genéticos adicionales como se describe adicionalmente a continuación.

Por tanto, una construcción de acuerdo con la presente invención preferiblemente incluye adicionalmente un marcador de selección apropiado. En una realización más preferida de acuerdo con la presente invención, la construcción incluye adicionalmente un origen de replicación. En otra realización más preferida de acuerdo con la presente invención, la construcción es un vector lanzadera, que puede tanto propagarse en E. coli (donde la construcción comprende un marcador de selección y un origen de replicación apropiados) como ser compatible para la propagación en células, o la integración en el genoma, de un organismo de elección. La construcción de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagómido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.

La construcción de la presente invención puede usarse para expresar el polipéptido codificado por la misma en una diversidad de especies que varían desde bacterias tales como E. coli, células de levadura o células superiores tales como las células de una planta. La expresión puede seleccionarse estable o transitoria, como se detalla adicionalmente a continuación en este documento. Se espera que plantas que sobre-expresan una proteína estable que tiene actividad tipo chaperona de la invención lleguen a adaptarse o ser tolerantes al estrés, ya que la expresión endógena de SP1 y proteínas tipo SP1 en plantas se correlaciona con la inducción de estrés (véase la Figura 14 y la sección de ejemplos).

Pueden usarse varios procedimientos de transformación con ácido nucleico para poner en práctica un procedimiento para generar plantas tolerantes al estrés de acuerdo con la presente invención.

Por tanto, existen diversos procedimientos para introducir construcciones de ácido nucleico en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto y col., Nature (1989) 338:274-276). Dichos procedimientos dependen de la integración estable de la construcción de ácido nucleico o una parte de la misma en el genoma de la planta, o de la expresión transitoria de la construcción de ácido nucleico en cuyo caso estas secuencias no se heredan por la descendencia de la planta.

Existes dos procedimientos principales para realizar la integración genómica estable de secuencias exógenas tales como las incluidas dentro de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en genomas de plantas:

(i)

Transferencia génica mediada por Agrobacterium: Klee y col. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) pág. 93-112.

(ii)

Captación directa de ADN: Paszkowski y col., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) pág. 52-68; incluyendo procedimientos para la captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. y col. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. Captación de ADN inducida por un breve choque eléctrico de las células vegetales: Zhang y col. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm y col. Nature (1986) 319:791-793. Inyección de ADN en células o tejidos vegetales por bombardeo de partículas, Klein y col. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe y col. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; por el uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus y col., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; o por la incubación directa de ADN con polen en germinación, DeWet y col. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, Londres, (1985) pág. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los procedimientos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de la especie de planta y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un procedimiento ampliamente usado es el procedimiento de disco foliar que puede realizarse con cualquier explante tisular que proporcione una fuente para el inicio de la diferenciación de la planta completa. Horsch y col. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) pág. 1-9. Un enfoque suplementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

Existen diversos procedimientos de transferencia directa de ADN en células vegetales. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo eléctrico. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio, partículas de tungsteno o partículas de oro, y los microproyectiles se aceleran físicamente al interior de las células o tejidos vegetales.

Después de la transformación, se ejerce la propagación de la planta. El procedimiento más común de propagación de plantas es por siembra. La regeneración por propagación de semillas, sin embargo, tiene la deficiencia de que debido a la heterogenicidad exista una ausencia de uniformidad en el cultivo, ya que las semillas se producen por las plantas de acuerdo con las variaciones genéticas gobernadas por las normas mendelianas. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca de modo que la planta regenerada tenga los rasgos y características idénticos de la planta transgénica parental. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere por micropropagación, lo que proporciona una reproducción rápida, constante de las plantas transformadas.

Los procedimientos de expresión transitoria que pueden utilizarse para expresar de forma transitoria el ácido nucleico aislado incluido dentro de la construcción de ácido nucleico de la presente invención incluyen, aunque no tienen que serlo, microinyección y bombardeo, como se ha descrito anteriormente, pero en condiciones que favorezcan la expresión transitoria, y la expresión mediada por virus donde se utiliza un vector viral recombinante empaquetado o no empaquetado que incluyen la construcción de ácido nucleico para infectar tejidos o células vegetales de modo que un virus recombinante de propagación establecido en los mismos exprese la secuencia de ácido nucleico no viral.

Los virus que han demostrado ser útiles para la transformación de huéspedes vegetales incluyen CaMV, TMV y BV. La transformación de plantas usando virus de plantas usando se describe en la patente de Estados Unidos Nº

4.855.237 (BGV), el documento EP-A 67.553 (TMV), la solicitud publicada japonesa Nº 63-14693 (TMV), el documento EPA 194,809 (BV), el documento EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. y col., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, pág. 172-189 (1988). Las partículas pseudovirales para su uso en la expresión de ADN foráneo en muchos huéspedes, incluyendo plantas, se describen en el documento WO 87/06261.

La construcción de virus ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de ácido nucleico exógeno no viral en plantas está demostrada por las referencias anteriores así como por Dawson, W. O. y col., Virology (1989) 172: 285-292; Takamatsu y col. EMBO J. (1987) 6:307-311; French y col. Science (1986) 231:1294-1297; y Takamatsu y col. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Cuando el virus es un virus ADN, las construcciones pueden prepararse como el propio virus. Como alternativa, el virus puede clonarse primero en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN foráneo. El virus después puede escindirse del plásmido. Si el virus es un virus ADN, puede unirse un origen de replicación bacteriano al ADN viral, que después se replica por las bacterias. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de envuelta que formará la cápsida del ADN viral. Si el virus es un virus ARN, el virus generalmente se clona en forma de ADNc y se inserta en un plásmido. El plásmido después se usa para preparar todas las construcciones. Después se produce el virus ARN transcribiendo la secuencia viral del plásmido y traduciendo los genes virales para producir la proteína o proteínas de envuelta que formarán la cápsida del ARN viral.

La construcción de virus ARN de plantas para la introducción y expresión en plantas de secuencias de ácido nucleico exógenas no virales tales como las incluidas en la construcción de la presente invención está demostrada por las anteriores referencias así como en la Patente de Estados Unidos Nº 5.316.931.

En una realización, se proporcionó un ácido nucleico viral vegetal en el que la secuencia codificante de la proteína de envuelta nativa se ha delecionado de un ácido nucleico viral, se ha insertado una secuencia codificante de la proteína de envuelta viral vegetal no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia codificante de la proteína de envuelta no nativa, capaz de expresarse en el huésped vegetal, que empaqueta el ácido nucleico viral vegetal recombinante, y asegura una infección sistémica del huésped por el ácido nucleico viral vegetal recombinante. Como alternativa, el gen de la proteína de envuelta puede inactivarse por inserción de la secuencia de ácido nucleico no nativa en el mismo, de modo que se produzca una proteína. El ácido nucleico viral vegetal recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de ácido nucleico en el huésped vegetal y tiene incapacidad de recombinación con otros y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativas (foráneas) adyacentes al promotor subgenómico viral vegetal nativo o los promotores subgenómicos virales vegetales nativos y no nativos si se incluye más de una secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico no nativas se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.

En una segunda realización, se proporciona un ácido nucleico viral vegetal recombinante como en la primera realización excepto en que la secuencia codificante de la proteína de envuelta nativa se coloca adyacente a uno de los promotores subgenómicos de la proteína de envuelta no nativa en lugar de una secuencia codificante de la proteína de envuelta no nativa.

En una tercera realización, se proporciona un ácido nucleico viral vegetal recombinante en el que el gen de la proteína de envuelta nativa está adyacente a su promotor subgenómico y se ha insertado uno o más promotores subgenómicos no nativos en el ácido nucleico viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en un huésped vegetal y no tiene capacidad de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativo adyacentes a los promotores virales vegetales subgenómicos no nativos de modo que las secuencias se transcriban

o expresen en la planta huésped bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.

En una cuarta realización, se proporciona un ácido nucleico viral vegetal recombinante como en la tercera realización excepto en que la secuencia codificante de la proteína de envuelta nativa está reemplazada por una secuencia codificante de proteína de envuelta no nativa.

Los vectores virales se encapsidan por las proteínas de envuelta codificadas por el ácido nucleico viral vegetal recombinante para producir un virus vegetal recombinante. El ácido nucleico viral vegetal recombinante o el virus vegetal recombinante se usa para infectar plantas huésped apropiadas. El ácido nucleico viral vegetal recombinante tiene capacidad de replicación en el huésped, propagación sistémica en el huésped, y trascripción o expresión del gen o genes foráneos (ácido nucleico aislado) en el huésped para producir la proteína deseada.

Como alternativa, la construcción de ácido nucleico de acuerdo con este aspecto, incluye adicionalmente marcadores de selección positivos y negativos y por lo tanto pueden emplearse para seleccionar acontecimientos de recombinación homóloga, incluyendo, aunque sin limitación, recombinación homóloga empleada en procedimientos de knock-in o knock-out. Un especialista en la técnica puede diseñar fácilmente una construcción knock-out o knock-in incluyendo genes de selección positiva y negativa para seleccionar de forma eficaz células madre embrionarias transfectadas que experimenten un acontecimiento de recombinación homóloga con la construcción. Se proporcionan detalles adicionales con relación a la construcción y uso de construcciones knock-out y knock-in en, por ejemplo, Fukushige, S. y Ikeda, J.E.: Trapping of mammalian promoters by Cre-lox site-specific recombination. DNA Res 3 (1996) 73-80; Bedell, M.A., Jenkins, N.A. y Copeland, N.G.: Mouse models of human disease. Parte I: Techniques and resources for genetic analysis in mice. Genes y Development 11 (1997) 1-11; Bermingham, J.J., Scherer, S.S., O'Connell, S., Arroyo, E:, Kalla, K.A., Powell, F.L. y Rosenfeld, M.G.: Tst-1/Oct-6/SCIP regulates a unique step in peripheral mye-lination and is required for normal respiration. Genes Dev 10 (1996) 1751-62.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una planta transgénica que expresa una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

La elevada expresión de PE nativa en plantas está positivamente correlacionada con las condiciones de estrés. La sobre expresión de PE1 en plantas provocaba que (i) la planta se volviera más tolerante a, y más recuperable después de, un estrés biótico.

Por tanto, se proporciona un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico. El procedimiento de acuerdo con este aspecto, se realiza modificando la planta para que exprese una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para volver a una planta más recuperable de un estrés biótico o abiótico. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención, se realiza modificando la planta para que exprese una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, por encima de una cantidad natural de la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa que tiene la actividad tipo chaperona en la planta.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un oligonucleótido de al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 22, al menos 25, al menos 30 o al menos 40, bases que pueden hibridar específicamente con cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento que codifican una proteína estable.

La hibridación de ácidos nucleicos más cortos (por debajo de 100 bases de longitud, por ejemplo, 17-40 bases de longitud) se realiza por hibridación rigurosa, moderada o leve, donde la hibridación rigurosa se realiza por una solución de hibridación de 6 x SSC y SDS al 1% o TMACl 3 M, fosfato sódico 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1mM (pH 7,6), SDS al 0,5%, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y leche en polvo desnatada al 0,1%, temperatura de hibridación de 1 - 1,5ºC por debajo de la Tm, solución de lavado final de TMACl 3 M, fosfato sódico 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1 nM (pH 7,6), SDS al 0,5% a 1 - 1,5ºC por debajo de la Tm; la hibridación moderada se realiza por una solución de hibridación de 6 x SSC y SDS al 0,1% o TMACl 3 M, fosfato sódico 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1 mM (pH 7,6), SDS al 0,5%, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y leche en polvo desnatada al 0,1%, temperatura de hibridación de 2 - 2,5ºC por debajo de la Tm, solución de lavado final de TMACl 3 M, fosfato sódico 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1 mM (pH 7,6), 0,5% a 1 - 1,5ºC por debajo de la Tm, solución de lavado final de 6 x SSC, y lavado final a 22ºC; mientras que la hibridación leve se realiza por una solución de hibridación de 6 x SSC y SDS al 1% o TMACl 3 M, fosfato sódico 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1 mM (pH 7,6), SDS al 0,5%, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y leche en polvo desnatada al 0,1%, temperatura de hibridación de 37ºC, solución de lavado final de 6 x SSC y lavado final a 22ºC.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un par de oligonucleótidos cada uno independientemente de la menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 22, al menos 25, al menos 30 o al menos 40 bases que pueden hibridar específicamente con el ácido nucleico aislado descrito en este documento en una orientación opuesta para dirigir la amplificación exponencial de una parte de el mismo en una reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa y otras reacciones de amplificación de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica y no requieren descripción adicional en este documento. El par de oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se seleccionan preferiblemente para que tengan temperaturas de fusión compatibles (Tm), por ejemplo, temperaturas de fusión que difieren en menos de 7ºC, preferiblemente menos de 5ºC, más preferiblemente menos de 4ºC, mucho más preferiblemente menos de 3ºC, idealmente entre 3ºC y 0ºC. Los pares de oligonucleótidos adecuados pueden seleccionarse usando el software OLIGO.

Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un producto de amplificación de ácido nucleico obtenido usando el par de cebadores descritos en este documento. Dicho producto de amplificación de ácido nucleico puede aislarse por electroforesis en gel o cualquier otra técnica de separación basada en tamaño. Como alternativa, dicho producto de amplificación de ácido nucleico puede aislarse por separación de afinidad, ya sea afinidad de cadena o afinidad de secuencia. Además, una vez aislado dicho producto puede manipularse genéticamente de forma adicional por restricción, ligamiento y similares, o puede marcarse, según sea necesario para su uso adicional.

De acuerdo con una realización actualmente preferida, la proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa codificada por el polinucleótido de la invención es de forma nativa un homo-oligómero de, por ejemplo, al menos 10 subunidades, opcionalmente 12 ó 14 subunidades, dispuestas, por ejemplo, en una disposición concéntrica, cuyo homo-oligómero es estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa según se han definido estos términos en este documento. Se apreciará, sin embargo, que el proceso de formación del homo-oligómero de proteínas estables puede producir homo-oligómeros de menos subunidades, ya que se espera, al menos durante periodos de tiempo cortos, homo-oligómeros parcialmente ensamblados de dos o más subunidades .

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; (c) recoger las proteínas solubles;

(d) obtener una proteína estable a ebullición purificada que tiene actividad tipo chaperona; (e) producir anticuerpos que reconozcan la proteína estable a ebullición que tiene la actividad tipo chaperona; y (f) explorar una biblioteca de expresión con los anticuerpos.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para aislar un gen que codifica una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona partir de una fuente biológica, comprendiendo el procedimiento (a) extraer las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) hervir el extracto proteico; y (c) recoger las proteínas solubles; (d) obtener una proteína estable a ebullición purificada que tiene la actividad tipo chaperona por, por ejemplo, ensayo de las proteínas solubles con actividad tipo chaperona y enriquecimiento o aislamiento de una proteína estable que tiene actividad tipo chaperona; (e) microsecuenciar la proteína estable que tiene la actividad tipo chaperona, para obtener al menos una secuencia de aminoácidos parcial de la misma; (f) diseñar un oligonucleótido correspondiente a la secuencia de aminoácidos; y (g) explorar una biblioteca con el oligonucleótido.

El diseño y síntesis de oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de aminoácidos dada y el uso de los mismos para explorar bibliotecas son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, las referencias generales enumeradas a continuación en la sección de ejemplos. Dichos oligonucleótidos pueden usarse como alternativa en una PCR, RT-PCR, RACE y procedimientos similares para aislar el gen por amplificación de ADNc.

También se proporciona un procedimiento para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención se realiza explorando una biblioteca de ADNc o genómica con un polinucleótido de al menos 17 bases, al menos un 60% idéntico a una parte contigua de las SEC ID Nº 1, 5, 6, 34, 39 ó 40. Dicho polinucleótido puede ser un oligonucleótido sintético como se describe adicionalmente más adelante en este documento y está preferiblemente marcado con un marcador adecuado.

También se describe un procedimiento para identificar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona. Este procedimiento se realiza haciendo una búsqueda de una biblioteca electrónica que contiene una pluralidad de secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos para secuencias que tengan un grado predeterminado de identidad u homología con cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 o 39-40 o partes de las mismas de, o correspondientes a, al menos 15, al menos 17, al menos 20, al menos 25, al menos 30 bases o más bases.

Otro aspecto proporciona un procedimiento para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona. El procedimiento comprende (a) proporcionar al menos un par de oligonucleótidos que son cada uno independientemente de al menos 15, al menos 17, al menos 20, al menos 25, al menos 30 bases o más bases de longitud, incluyendo el al menos un par de oligonucleótidos al menos un oligonucleótido correspondiente a las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40, seleccionándose el al menos un par de oligonucleótidos para amplificar un ácido nucleico que tiene un grado de identidad con, o que codifican proteínas homólogas a, las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40; (b) poner en contacto el al menos un par de oligonucleótidos con una muestra de ácido nucleico y amplificar el ácido nucleico que tiene el grado de identidad con, o que codifica proteínas homólogas a, las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 3940; y (c) usar el ácido nucleico que tiene el grado de identidad con, o que codifica proteínas homólogas a, las SEC ID Nº 1, 2, 5-35 ó 39-40 para aislar un ácido nucleico que codifica potencialmente una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un polipéptido estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene una actividad tipo chaperona, eficaz, por ejemplo, para estabilizar proteínas. Preferiblemente, el polipéptido está codificado por polinucleótido descrito en este documento. Más preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 65%, aún más preferiblemente al menos un 70%, aún preferiblemente al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80%, todavía preferiblemente al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, mucho más preferiblemente al menos un 95%, homóloga (idéntica + aminoácidos similares) a las SEC ID Nº 2 ó 35, que se determina usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2. El polipéptido de este aspecto de la invención de forma nativa es preferiblemente un homo-oligómero, preferiblemente un homo-oligómero de 14 subunidades como se detalla adicionalmente a continuación en este documento. Como se detalla adicionalmente a continuación, el polipéptido de la invención puede purificarse a partir de una fracción estable a ebullición/resistente a proteasa de plantas. Como alternativa, puede fabricarse usando la tecnología de ADN recombinante como se describe adicionalmente y se ejemplifica en este documento. A continuación en este documento en la siguiente sección de Ejemplos se muestra y se analiza adicionalmente que un polipéptido recombinante de la invención y su proteína nativa correspondiente comparten oligomerización similar, propiedades de epítopes y actividad tipo chaperona.

Los polipéptidos pueden purificarse por cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Se describen diversos procedimientos de purificación de proteínas, por ejemplo, en Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Meth.

Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; y Scopes, Protein Purification: Principles y Practice, Springer Verlag, Nueva York, 1982.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para enriquecer o aislar una proteína estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes) y/o resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica. El procedimiento de acuerdo con este aspecto, se realiza por (a) extracción de las proteínas totales a partir de una fuente biológica, para obtener un extracto proteico; (b) ebullición del extracto proteico; (c) recogida de las proteínas solubles; y opcionalmente (d) ensayo de la actividad tipo chaperona de las proteínas solubles. Preferiblemente, el procedimiento comprende adicionalmente el fraccionamiento por tamaño de las proteínas soluble y el ensayo de una proteína fraccionada para la actividad tipo chaperona, como se describe adicionalmente en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión "aislar una proteína", significa identificar y separar y/o recuperar una proteína de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que impedirían los usos de diagnóstico, terapéuticos o comerciales de la proteína, y pueden incluir enzimas y otros solutos proteicos o no proteicos. Como se usa en este documento, la expresión "enriquecer una proteína" significa separar una proteína de al menos el 10%, y preferiblemente el 50% de los componentes contaminantes de su entorno natural, como se ha mencionado anteriormente.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para aislar sin detergentes una proteína resistente a proteasa que tiene actividad tipo chaperona a partir de una fuente biológica. El procedimiento se realiza

(a)

extrayendo las proteínas solubles preferiblemente usando un procedimiento de extracción en frío (por ejemplo, al menos -50ºC, preferiblemente -80ºC), para obtener un extracto proteico; (b) poniendo en contacto el extracto proteico con una proteasa; (c) aislando una proteína resistente a proteasa; y opcionalmente (d) ensayando la proteína resistente a proteasa para la actividad tipo chaperona.

De acuerdo a otro aspecto, se proporciona otro procedimiento más para aislar una proteína estable a ebullición que tiene actividad tipo chaperona a partir de de una fuente biológica. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención se realiza (a) extrayendo las proteínas totales de la fuente biológica, para obtener un extracto proteico;

(b)

hirviendo el extracto proteico; (c) recuperando la fracción de proteínas soluble; y opcionalmente (d) ensayando la proteína resistente a proteasa para la actividad tipo chaperona. También puede usarse una proteasa en este procedimiento.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para evitar que una proteína agregante se agregue en un agregado. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención, se realiza poniendo en contacto una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento con la proteína agregante.

La "cantidad eficaz" para los propósitos de este documento se determina por consideraciones que son conocidas para los especialistas en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para inducir en la proteína que está en contacto un aumento significativo en la solubilidad en condiciones que de otro modo producen agregación, que se evalúa por mediciones físico químicas o funcionales, tales como resistencia a la precipitación después de centrifugación, una disminución en las propiedades refractantes, disminución en la masa molecular después de el fraccionamiento por tamaño en SDS-PAGE, HPLC, filtración, diálisis o cualquier otra metodología de fraccionamiento por tamaño; y/o retención de las propiedades biológicas tales como actividad catalítica, actividad de unión molecular y propiedades antigénicas.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para desagregar agregados de una proteína agregante. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención se realiza poniendo en contacto una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento con el agregado.

Por tanto, se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con la agregación de proteínas de una proteína agregante, comprendiendo el procedimiento a administrar a un sujeto que lo necesite una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable desnaturalizante y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para desagregar y/o evitar la agregación de la proteína agregante, la proteína agregante es, por ejemplo, beta-amilóide o prión, como es el caso en la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades asociadas con priones, por ejemplo, encéfalo espongiforme.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para estabilizar una proteína frente a condiciones desnaturalizantes. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención se realiza poniendo en contacto una cantidad eficaz del polipéptido descrito en este documento para que llegue a estar en contacto con la proteína.

En este contexto, la presente invención se restringió a la práctica con respecto a la citrato sintasa y la peroxidasa de rábano rusticano, que son sistemas modelo aceptados para evaluar la anti agregación de proteínas, la estabilización y la actividad chaperona, como se describe adicionalmente y se ejemplifica en la siguiente sección de Ejemplos.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento para proteger a una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención, se realiza añadiendo a la preparación enzimática una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable desnaturalizante y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para proteger a la preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para reparar al menos una parte de la actividad enzimática perdida de una preparación enzimática. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención, se realiza añadiendo a la preparación enzimática una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable desnaturalizante y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, en una cantidad suficiente para reparar al menos la parte de la actividad enzimática perdida de la preparación enzimática.

De acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un anticuerpo, ya sea un anticuerpo policlonal o monoclonal, que reconoce al menos un epítope del polipéptido descrito en este documento. La presente invención puede utilizar inmunoglobulinas séricas, anticuerpos policlonales o fragmentos de los mismos (es decir, derivado inmunorreactivo de un anticuerpo), o anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismo. Los anticuerpos monoclonales o fragmentos purificados de los anticuerpos monoclonales que tiene al menos una parte de una región de unión a antígeno, incluyendo, tal como, fragmentos Fv, F(abl)2, Fab (harlow and Lane, 1988 Antibody, Cold Spring Harbor), anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos 4.946.778), anticuerpos quiméricos o humanizados y regiones determinantes de complementariedad (CDR) pueden prepararse por procedimientos convencionales. La purificación de estas inmunoglobulinas séricas, anticuerpos o fragmentos puede conseguirse por una diversidad de procedimientos conocidos para los especialistas en la técnica, precipitación por sulfato amónico o sulfato sódico seguido de diálisis frente a solución salina, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o inmunoafinidad así como filtración en gel, electroféresis zonal, etc. (véase, Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles y Practice, 2nd ed., pág. 104-126, 1986, Orlando, Fla., Academic Press). En condiciones fisiológicas normales, se encuentran anticuerpos en el plasma y otros fluidos corporales y en la membrana de ciertas células y se producen por los linfocitos del tipo llamado células B o su equivalente funcional. Los anticuerpos de la clase IgG está compuestos por cuatro cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro. Las cuatro cadena de moléculas IgG intactas son cadenas pesadas idénticas conocidas como cadenas H y dos cadenas ligeras idénticas mencionadas como cadenas L. Clases adicionales incluyen IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas relacionadas.

Los procedimientos para la generación y selección de anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, son bien conocidos en la técnica, como se resume por ejemplo en revisiones tales como Tramontano and Schloeder, Methods in Enzymology 178, 551-568, 1989. Las PE nativas purificadas, las PE recombinantes o las proteína de fusión de PE recombinante (véase a continuación) de la presente invención o partes inmunogénicas de las mismas incluyendo al menos un epítope inmunogénico pueden usarse para generar los anticuerpos de la invención.

Preferiblemente, la producción del anticuerpo es a través de técnicas in vivo o in vitro, preparándose el anticuerpo por un procedimiento que comprende las etapas de, primero, exponer las células (in vivo o in vitro) capaces de producir anticuerpos a una proteína PE de la invención o a una parte inmunogénica de la misma, generando de este modo células que producen anticuerpos. Segundo, inmortalizando las células productoras de anticuerpos por, por ejemplo, fusión de las mismas con células de mieloma o infección de las mismas con un virus transformante, generando de este modo una pluralidad de células inmortalizadas, que producen cada una anticuerpos monoclonales, y tercero, explorando la pluralidad de anticuerpos monoclonales para identificar un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a la PE. Estos procedimientos son conocidos en la técnica y por lo tanto no se elaboran adicionalmente en este documento.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición y/o detergentes), resistente a proteasa que tiene una activad tipo chaperona fusionado a un polipéptido adicional. Preferiblemente, la proteína de fusión adquiere una forma oligomérica, con el añadido de que pueden ensamblarse formas homo o hetero oligoméricas. La presentación simultánea de una diversidad de proteínas sobre el mismo oligómero PE puede conseguirse por desnaturalización reversible y reensamblaje de mezclas de diferentes proteínas de fusión como se describe en este documento o, como alternativa, por coexpresión de varias proteína de fusión en las mismas células/organismo (ensamblaje in vivo). Dichas proteínas de fusión pueden mostrar propiedades biológicas (tales como unión a sustrato o ligando, actividad enzimática, actividad antigénica, etc.) derivadas de cada unas de las secuencias fusionadas. Puede usarse cualquier compañero de fusión convencional incluyendo, por ejemplo, beta-glucuronidasa, beta-galactosidasa, etc. Los polipéptidos de fusión se preparan preferiblemente por la expresión de ácidos nucleicos recombinantes producidos por técnicas convencionales.

A continuación se proporciona una lista no exhaustiva de proteínas que tienen genes conocidos que pueden fusionarse a una proteína estable de la invención: proteínas que tienen propiedades medicinales: proteínas agregantes tales como beta amilóide, proteínas mensajeras tales como las citoquinas IL-1 e IL-7, y sus proteínas receptoras, proteínas de agentes de enfermedades infecciosas, tales como proteínas exportadas por bacterias de neumococos, estreptococos y otras cepas patogénicas, proteínas de virus patogénicos tales como la hepatitis B y la gastroenteritis transmisible, y de protozoos y helmintos en infecciones parasitarias; enfermedades no infecciosas, tales como proteínas de células tumorales autólogas poco antigénicas y cualquiera de sus epítopes, interferones y sus proteínas receptoras en el caso de enfermedades autoinmunes, proteínas útiles en investigación, incluyendo reactivos proteicos o polipeptídicos para inmuno ensayos tales como insulina, gastrina, opióides, factores de crecimiento, calcitonina, antígenos malariales y otros antígenos protozoarios en fase sanguínea, enzimas tales como la peroxidasa y proteínas biológicamente activas inestables al calor o a detergentes, incluyendo enzimas y proteínas útiles en aplicaciones comerciales, por ejemplo, proteasas, glicosil-hidrolasas y lipasas, proteínas heterólogas que se agregan en células transformadas o sus medios de cultivo tales como factores de crecimiento, glicosil-hidrolasas, peroxidasas, transferasas, quinasas, fosfatasas, sulfatasas, enzimas modificadoras de ácidos nucleicos (ligasas, enzimas de restricción, trasncriptasa inversa, polimeraras de ácido nucleico).

Una proteína de fusión se puede obtener por técnicas de ingeniería genética mediante las cuales se fusionan dos fases de lectura abierta en un único ácido nucleico que crea una fase de lectura continua, cuya traducción en un sistema de expresión produce la proteína de fusión, o mediante fusión química o unión de proteínas preexistentes, usando uno cualquiera de una pluralidad de reactivos de unión conocidos en la técnica para ligar o unir proteínas.

Por tanto, se conocen muchos procedimientos en la técnica para conjugar o fusionar (acoplar) moléculas de diferentes tipos, incluyendo proteínas o polipéptidos. Estos procedimientos pueden usarse de acuerdo con la presente invención para acoplar una proteína estable con cualquier otra proteína. Los dos péptidos aislados pueden conjugarse o fusionarse usando cualquier procedimiento de conjugación conocido para los especialistas en la técnica. Un péptido puede conjugarse con otro usando un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio) propiónico (también llamado N-succinimidil 3-(2piridilditio) propionato) ("SDPD") (Sigma, Nº Cat. P-3415), un procedimiento de conjugación con glutaraldehído o un procedimiento de conjugación con carbodiimida.

Conjugación con SPDP - Puede usarse cualquier procedimiento de conjugación con SPDP conocido para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, se usa una modificación del procedimiento de Cumber y col., (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224) como se describe a continuación. Se mezcla un primer péptido (1,7 mg/ml) con un exceso de factor 10 veces de SPDP (50 mM en etanol) y el segundo péptido se mezcla con un exceso de factor 25 de SPDP en fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,10 M pH 7,2 y cada una de las reacciones se incuba, por ejemplo, durante 3 horas a temperatura ambiente. Las reacciones después se dializan frente a PBS. El primer péptido se reduce, por ejemplo, con DTT 50 mM durante 1 hora a temperatura ambiente. El péptido reducido se desala por equilibrado en columna G-25 (hasta un volumen de muestra/columna del 5%) con KH2PO4 50 mM pH 6,5. el péptido reducido se combina con el SPDP-segundo péptido en una proporción molar de segundo péptido:primer péptido de 1:10 y se incuba a 4ºC durante una noche para formar un conjugado péptido-péptido.

Conjugación con glutaraldehído - La conjugación de un péptido con otro péptido puede realizarse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica usando glutaraldehído. Por ejemplo, en realización ilustrativa, se usa el procedimiento de conjugación de G.T. Hermanson (1996, "Antibody Modification and Conjugation, in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego) descrito a continuación. Los péptidos (1,1 mg/ ml) se mezclan a un exceso de factor 10 con glutaraldehído al 0,05% en fosfato 0,1 M, NaCl 0,15 M pH 6,8, y se deja reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Puede añadirse lisina 0,01 M para bloquear el exceso de sitios. Después de la reacción, se elimina el exceso de glutaraldehído usando una columna G-25 equilibrada con PBS (volúmenes de muestra/columna del 10% v/v).

Conjugación con carbodiimida - La conjugación de un péptido con otro péptido puede conseguirse por procedimientos conocidos para los especialistas en la técnica usando un agente de deshidratación tal como carbodiimida. Más preferiblemente, la carbodiimida se usa en presencia de 4-dimetil aminopiridina. Como saben bien los especialistas en la técnica, la conjugación con carbodiimida puede usarse para formar un enlace covalente entre un grupo carboxilo del péptido y un grupo hidroxilo de un péptido (provocando la formación de un enlace éster), o un grupo amino de un péptido (provocando la formación de un enlace amida) o un grupo sulfidrilo de un péptido (provocando la formación de un enlace tioéste). Así mismo, el acoplamiento con carbodiimida puede usarse para formar enlaces covalente análogos entre un grupo carbono de un péptido y un grupo hidroxilo, amino o sulfidrilo del otro péptido. Véase, en líneas generales, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, pág. 349-50 & 372-74 (3ª ed.), 1985. A modo de ilustración, y no de limitación, el péptido se conjuga con otro mediante un enlace covalente usando una carbodiimida, tal como diciclohexilcarbodiimida. Véase, en líneas generales, los procedimientos de conjugación de B. Neises y col., (1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522; A. Hassner y col., (1978, Tetrahedron Lett. 4475); E.P. Boden y col., (1986, J. Org. Chem. 50:2394) y L.J. Matias (1979, Synthesis 561).

Se demuestra en este documento que la proteína estable de la invención oligomeriza. En este documento se muestra adicionalmente que una proteína de fusión que comprende una proteína estable de la invención y una proteína adicional oligomerizan de forma similar. Esta característica puede servir para varios propósitos incluyendo el aumento de la avidez de unión de una molécula de unión, y general heterocomplejos que pueden servir para diferentes funciones.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para aumentas la avidez de unión de una molécula de unión. El procedimiento de acuerdo con este aspecto comprende presentar múltiples copias de la molécula de unión sobre la superficie de un oligómero de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona. La molécula de unión puede ser, por ejemplo, un receptor, un ligando, una enzima, un sustrato, un inhibidor, un anticuerpo y un antígeno. En casos en los que la molécula de unión es una proteína de unión, la proteína de unión puede fusionarse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de ingeniería genética o reticulación química. En casos en los que la molécula de unión no es una proteína, la molécula de unión puede fusionarse o unirse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de reticulación química.

También se proporciona un heterocomplejo que comprende un oligómero que incluye una pluralidad de proteínas estables a desnaturalizantes y/o resistentes a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, y al menos dos moléculas diferentes que se fusionan al oligómero. Las al menos dos moléculas diferentes pueden comprender al menos una primera enzima y una segunda enzima. La primera enzima y la segunda enzima pueden catalizar reacciones secuenciales en una vía de síntesis o degradación. La primera enzima y la segunda enzima pueden catalizar diferentes reacciones en una vía de síntesis

o degradación. En otra realización, las al menos dos moléculas diferentes comprenden al menos una molécula de unión y una molécula informadora, tal como GFP o HRP.

En casos en los que las moléculas son proteínas, las proteínas pueden fusionarse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de ingeniería genética o reticulación química. En casos en los que las moléculas no son proteínas, las moléculas pueden fusionarse o unirse a las unidades oligoméricas mediante técnicas de reticulación química.

Uno de los usos de dichas proteínas de fusión surge del hecho de que las proteínas estables retienen su actividad y capacidad de oligomerización también cuando están en el contexto de una proteína de fusión. De forma interesante, en dichas condiciones, el par fusionado a la proteína estable también retiene su actividad, como se demuestra en la siguiente sección de Ejemplos por la fusión CBD-SP1. Por tanto, una proteína de fusión oligomerizada de la invención puede servir para presentar mejor el par fusionado a la proteína estable para reacciones de inmunización

o de superficie.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional más, se proporciona un procedimiento de inmunización que comprende someter al sistema inmune de un mamífero a la proteína de fusión descrita en este documento.

Se ha descubierto que la inmunización con una proteína de fusión SP1-polipéptido reduce la respuesta inmune contra el polipéptido. Por tanto, de acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un procedimiento para administrar a un animal, que tiene sistema inmune, un polipéptido, reduciendo al mismo tiempo la respuesta inmune contra el polipéptido. El procedimiento de acuerdo con este aspecto se realiza administrando el polipéptido al animal, estando fusionado el polipéptido a una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, reduciendo de este moda la respuesta inmune contra dicho polipéptido, en comparación con una respuesta inmune que se desarrolla administrando al animal el polipéptido sólo.

En un ensayo in vitro se demostró que SP1 induce un cubrimiento más rápido de regiones raspadas de células fibroblásticas en una placa petri.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para aumentar la migración celular. El procedimiento de acuerdo con este aspecto se realiza exponiendo las células a una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para aumentar la migración celular.

Como la migración celular es esencial para la curación de heridas, también se proporciona un procedimiento para acelerar la curación de heridas realizado por la administración sobre una herida de una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para acelerar la curación de heridas. También se proporciona adicionalmente un procedimiento para inducir la curación de heridas realizado por la administración sobre una herida de una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para inducir la curación de heridas.

En la siguiente sección de Ejemplos se muestra que el cabello es más fuerte mediante la administración de SP1.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para fortalecer y/o lavar el cabello, las uñas o la piel. El procedimiento se realiza administrando sobre el cabello, las uñas o la piel una cantidad de una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, suficiente para fortalecer y/o lavar el cabello, las uñas o la piel.

Los polipéptidos pueden formularse en composiciones farmacéuticas (incluyendo cosméticos y cosmocéuticos) que comprenden, como ingrediente activo, una proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa, teniendo la proteína estable a desnaturalizantes y/o resistente a proteasa una actividad tipo chaperona, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, aprobado para su uso en seres humanos y para uso veterinario por una agencia reguladora apropiada tal como la Food and Drug Administration en los Estados Unidos de América. Para su uso en la curación de heridas, la composición farmacéutica se embasa en un embase y se identifica en letras de imprenta para su uso en una aplicación de curación de heridas. Para su uso en el fortalecimiento/lavado del cabello, las uñas

o la piel, la composición farmacéutica se envasa en un envase y se identifica en letras de imprenta para su uso en una aplicación de fortalecimiento y/o lavado del cabello, las uñas o la piel. Pueden usarse ingredientes adicionales en dichas composiciones. Por ejemplo, la proteína estable de la invención puede añadirse a composiciones para lavar el cabello, las uñas o la piel tales como jabones, champús, acondicionadores, cremas, geles, pulverizadores, lacas, etc., siendo conocidos en la técnica los otros ingredientes de las mismas y se enumeran típicamente en los recipientes de dichos productos.

Serán evidentes para los especialistas en la técnica objetos adicionales, ventajas, y nuevas características tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos indicadas anteriormente en este documento y reivindicadas en la siguiente sección de reivindicaciones encuentra su porqué experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de un modo no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican minuciosamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y col., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y col. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías expuestas en las patentes de Estados Unidos Nº 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes IIII Coligan J. E., ed. (1994); Stites y col. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins

S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales en todo este documento. Los procedimientos de este documento se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan por conveniencia del lector.

Materiales y procedimientos experimentales

Purificación de proteínas estables a ebullición derivadas de plantas: Se prepararon fracciones proteicas estables a ebullición de álamo, tomate M82, VF36 y pino del siguiente modo: Se centrifugaron los extractos vegetales en bruto a 10.000 g durante 10 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Los sobrenadantes se sometieron a una sesión e ebullición de 10 minutos, después se mantuvieron en hielo durante 5 minutos y se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 g. Los sobrenadantes resultantes se precipitaron añadiendo 4 volúmenes de acetona fría, y se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 g. Las proteínas estables a ebullición se recuperaron después disolviendo los sedimentos en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). La concentración de proteína total se determinó como para las preparaciones de SP1 (véase a continuación).

Solamente cuando se separaron las proteínas totales estables a ebullición en un SDS-tricina al 17% PAGE, se separó una banda de 66 kDa que aparece usando las condiciones de electroforesis descritas por Pelah (1995) como dos bandas de 66 y 116 kDa. Se descubrió que la banda de 66 kDa representa una proteína germen.

Purificación de la proteína SP1 vegetal: Se disolvieron las proteínas estables a ebullición precipitadas en acetona de la planta de álamo preparadas como se ha descrito anteriormente en tampón de muestra 1X tricina-SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, glicerol al 20%, SDS al 1%, azul de Coomassie G-250 al 0,025%), después se separaron en un gel preparativo de poliacrilamida tricina-SDS al 17%. Las bandas principales correspondientes a la proteína SP1 (oligómero de 116 kDa y monómero de 12,4 kDa) se escindieron del gel. El oligómero y monómero SP1 se electroeluyeron por separado, en una bolsa de diálisis. El eluyente se dializó adicionalmente frente a 500 volúmenes de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) durante una noche a 4ºC, seguido de precipitación con acetona y centrifugación. La SP1 purificada se obtuvo disolviendo el sedimento en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). La concentración de proteína se determinando usando el kit de ensayo de proteínas BIO-RAD (Hercules, CA, EEUU) empleando albúmina sérica bovina como patrón.

Resistencia proteolítica y purificación sin detergente de SP1: Se homogeneizaron brotes u hojas de la planta de álamo en nitrógeno líquido en Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) y PVPP al 2%. El extracto se centrifugó a 10.000 g durante 15 minutos a 4ºC, y la fracción de proteína soluble total se recuperó de la fracción sobrenadante. Las proteínas solubles se concentraron adicionalmente con 4 volúmenes de acetona fría, y después se volvieron a disolver en tampón de digestión con proteasa 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM). La proteolisis se inició por la adición de Proteinasa K a una concentración final de 50 g por mililitro, y se continuó durante 60 minutos a 37ºC. La proteolisis se terminó por la adición de PMSF 1 mM a la mezcla, incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, y 10 minutos de ebullición. Los agregados se retiraron por centrifugación a alta velocidad durante 10 minutos, y el sobrenadante, que estaba altamente enriquecido en SP1, se concentró a presión usando un concentrador de 50-kDa de punto de corte.

Generación de anticuerpos policlonales: Se inyectaron SP1 nativa purificada en gel o CBD-SP1 recombinante (50 g por inyección) a conejos con adyuvante complejo de Freund. Se inyectaron dos refuerzos adicionales (a intervalos de 14 días) y 14 días después se recogió el anti-suero.

Clonación de ADNc: La extracción del ARN poliadenilado (poli A+) se realizó de acuerdo con Bartels y Thompson (1983) a partir de brotes de álamo sometidos a escasez de agua, y el ARNm se usó como molde para la síntesis de ADNc. Se construyó una biblioteca de ADNc lambda ZAPII (Stratagene La Jolla, CA, EEUU) de acuerdo con las instrucciones del proveedor, y se inmuno-exploró con anticuerpo policlonal contra SP1 creados contra la proteína natural como se ha descrito anteriormente (diluidos 1:500, v/v). La escisión in vivo se realizó de acuerdo con las instrucciones del proveedor y se determinó la secuencia (Sequencing Lab, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

Generación de una proteína de fusión CBD-SP1 en E. coli: Se clonó el ADNc de SP1 en el vector de expresión pET-CBD-180 (Shpigel y col., 1999) subclonando en el mismo un producto de PCR generado usando dos cebadores de amplificación que portan un sitio NcoI (cebador directo) 5'-AAAACCATGGCAACCAGAACTCCAAAGC-3' (SEC ID Nº 3) y un sitio BamHI (cebador inverso) 5'-AAAAGGATCCTTACTTTATTACCATGAAATAGCC-3' (SEC ID Nº 4) para la amplificación del ORF correspondiente del ADNc de SP1. El plásmido resultante (pET-CBD-180-SP1) se usó para transformar la cepa de E. coli BL21 (DE3). La síntesis de la proteína de fusión recombinante CBD-SP1 se indujo en BL21 (DE3) por la adición de IPTG (isopropil-D-tiogalactósido) a una concentración final de 1 mM para la fase semi-log del cultivo bacteriano, seguido de cinco horas adicionales de inducción a 37ºC. La proteína recombinante CBD-SP1 se purificó sobre celulosa de acuerdo con Shpigel y col. (1999). La proteína de fusión recombinante CBD-SP1 se detectó usando SDS-PAGE.

Generación y secreción de SP1 recombinante por Pichia pastoris:

Se clonó un fragmento de ADN de la región codificante de la proteína SP1 en fase en los sitios de restricción EcoRI y NotI del vector de expresión de Pichia pastoris de secreción pPIC9K (Invitrogen®, Groningen, Países Bajos) para generar pPIC9K-SP1. La secuencia de la construcción se confirmó por secuenciación (Sequence lab, Weizmann Institute, Rehovot, Israel). Para transformar células de Pichia pastoris, se linealizó pPIC9K-SP1 por las enzimas de restricción SalI o BglII. Las construcciones linealizadas se usaron cada una independientemente para transformar células competentes de Pichia por electroporación, de acuerdo con las instrucciones de proveedor (Invitrogen®, Groningen, Países Bajos). Para este fin, se usaron 5-10 g de ADN de pPIC9K-SP1 lineal SalI o BglII para transformar Pichia SMD1168, una cepa con fenotipo mutante deficiente en proteasa, His+, Mut+ (utilización de metanol positiva). Las células competentes transformadas se sembraron en placas RDB y se incubaron a 30ºC. Cinco días después, se transfirieron primero 240 colonias de transformantes SalI (Mut+) y 180 colonias de transformantes BglI (Muts: utilización de metanol lenta) a placas YPD que contenían 0,25 mg/ml de antibióticos G418; el 73% y el 16% de los transformantes Mut+ y Muts sobrevivieron. Para los transformantes Mut+, las colonias supervivientes se transfirieron adicionalmente a placas YPD que contenían una concentración mayor de G418. Los transformantes Muts se transfirieron a placas MM. Para seleccionar los transformantes de elevado nivel de expresión, se usaron 2 transformantes Mut+ de 4 mg por ml y 2 de 1 mg por ml de G418, respectivamente y 4 colonias Muts en un sistema de expresión de volumen pequeño de acuerdo con el manual para la expresión de proteínas recombinantes en Pichia pastoris (Invitrogen®). La exploración de transformantes de elevado número de copias y la expresión de SP1 recombinante se realizaron de acuerdo con las instrucciones en el manual de Pichia Pastoris (Invitrogen®). La SP1 recombinante secretada se detectó a partir del medio de cultivo por SDS-PAGE. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie para la visualización de proteína total, o se transfirieron a nitrocelulosa (transferencias de Western) para la inmunodetección de SP1 con anticuerpo policlonal anti-SP1.

Filtración en gel, HPLC y detección de SP1 nativa: Se empeló un sistema de HPLC (Merck, Hitachi) equipado con una columna TSKSWX3000 (30 cm x 7,8 mm) (SUPELCO, Sigma, Israel) para estudiar el tamaño de SP1 en su estado nativo. Se separó una alícuota de 100 l del extracto de proteína total soluble de plantas de álamo sometidas a escasez de agua, o la fracción estable a ebullición total del mismo extracto usando tampón PBS a pH 6,6. El caudal se ajustó a 0,8 ml por minuto y se usó un monitor de UV a 280 nm para detectar la elución de las proteínas de la columna. Las fracciones se recogieron cada minuto. Cada fracción se concentró adicionalmente añadiendo cuatro volúmenes de acetona fría, seguido de 10 minutos de centrifugación a 10.000 g. Los sedimentos resultantes se disolvieron en tampón de muestra 1 X SDS. Se separó una alícuota en tricina-SDS al 17%-PAGE, y los perfiles resultantes de proteínas se visualizaron por tinción con Coomassie o análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-SP1 recombinante (véase anteriormente). También se analizaron la SP1 nativa purificada y CBDSP1 recombinante (alícuotas de 50 l) a una concentración de 1 miligramo por mililitro y 0,5 miligramos por mililitro. Para determinar el tamaño de la proteína, se usaron citocromo C (12,4 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa), albúmina sérica bovina (66 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), beta-amilosa (200 kDa) y apoferritina (443 kDa) (Sigma-Aldrich Israel Ltd.) como patrones moleculares. Se usó azul de dextrano (2000 kDa) para evaluar el volumen vacío de la columna. Se obtuvo una relación lineal representando los logaritmos de los pesos moleculares de proteínas patrón frente a sus parámetros de elución respectivos (Kav). El valor de Kav se calculó usando la ecuación: Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo), donde Ve = volumen de elución de la proteína, Vo = volumen vacío de la columna, Vt = volumen de lecho compactado total.

Estabilidad de SP1 después de exposición a SDS y calentamiento: Para evaluar la estabilidad de complejos SP1 a detergentes, se prepararon cantidades iguales de proteína SP1 purificada en un tampón de muestra que contenía SDS a una concentración final que variaba del 0% (tampón de muestra nativo) al 2% (tampón de muestra de Laemmli convencional), y que corresponden a una proporción molar final de 1:0, 1:200, 1:400, 1:500, 1:600 ó 1:4334 (monómero SP1:SDS). Las muestras se hirvieron (o no se hirvieron) durante 5 minutos antes de la separación en un gel de tricina-SDS al 17%. Para examinar la estabilidad del oligómero SP1 al calentamiento, la SP1 se preparó en tampón de muestra SDS a una proporción molar final de 1:900 (monómero SP1:SDS) y se calentó durante 5, 10 ó 20 minutos a un intervalo de temperaturas de temperatura ambiente a 100ºC antes de la separación en SDS-tricina PAGE.

Ensayo in vitro de estabilización térmica por SP1: La actividad protectora contra el calor de SP1 se examinó in vitro midiendo el efecto de SP1 sobre la estabilidad térmica de la actividad enzimática de la citrato sintasa (CS) y la peroxidasa de rábano rusticano (HRP).

Preparación de proteínas: La CS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) se preparó de acuerdo con el procedimiento de Buchner y col. (1998). La HRP, BSA, lisozima (SIGMA, Israel) y CBD (CBD-Technologies Ltd. Rehovot, Israel) se disolvieron en agua a aproximadamente 10 mg/ml, después se dializaron durante una noche frente a 200 volúmenes de tampón HEPES-KOH 40 mM (pH 7,5) a 4ºC. Después de la diálisis, las proteínas se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 minutos a 2ºC para retirar cualquier partícula insoluble. Se preparó una solución madre de HRP 20 M, BSA 60 M y lisozima en tampón HEPES filtrado y se hizo en alícuotas. Las alícuotas se almacenaron a -20ºC. Las alícuotas descongeladas de las proteínas se desecharon después de su uso. La concentración de proteína se determinó como para SP1. La alfa-cristalina liofilizada (Stressgen Inc., Canadá) se resuspendió en agua de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Ensayo de actividad CS y HRP: Los ensayos de actividad enzimática se realizaron a 25ºC, en una placa ELISA. La reacción colorimétrica se registró por un lector de microplaca (BIO-RAD,) a 412 nm para CS, y 650 nm para HRP.

El ensayo de actividad CS fue de acuerdo con el procedimiento de Buchner y col. (1998) con una ligera modificación: el volumen de los componentes de reacción se redujo proporcionalmente para el volumen de la placa ELISA. En resumen, se mezclaron 4 l de CS 0,15 M con 200 l de mezcla de reacción compuesta por tampón TE buffer (Tris 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0), ácido oxaloacético 100 M (en Tris 50 mM, pH no ajustado), DTNB 100 M (en tampón TE), y acetil-CoA 150 M (en tampón TE). El cambio en la absorbancia se registró a intervalos de 20 segundos durante 1 minuto. La parte lineal del diagrama se usó para calcular la actividad específica de la CS. La actividad CS se expresó como mol por minuto por mg (definida en este documento como unidad de actividad) usando un coeficiente de extinción molar de DTNB de 1,36 x 10-4 M por cm.

TMB-ELISA lento TM de una etapa sensible: Se usó TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; PIERCE, Rockford, EEUU) como sustrato para el ensayo de actividad HRP en los experimentos. Se determinó una reacción colorimétrica óptima de HRP experimentalmente. La parte lineal del gráfico que representa la absorbancia frente al tiempo se usó para calcular la velocidad de cambio en la absorbancia a 650 nm. Se determinó que las condiciones óptimas de reacción era 4 l de HRP 2,5 nM en 100 l de sustrato TMB a 25ºC. La reacción se registró a intervalos de 30 segundos durante 5 minutos. La actividad HRP se expresó como mol por minuto por mg (definida en este documento como unidad de actividad enzimática) usando un coeficiente de absorción molar para complejo con carga de azul de 3,9 x 10-4 M por cm (Josephy y col., 1982).

Inactivación por calor de CS y HRP: Se calentó una alícuota de 100 l de CS 0,15 M o HRP 2,5 nM preparada en tampón HEPES 40 mM pre-refrigerado, pH 7,5, en ausencia o presencia de proteínas (SP1, CBD-SP1, BSA, lisozima, y otras proteínas vegetales estables a ebullición (véase anteriormente)) usando un termociclador de gradiente T programado (Biometra, Gottingen, Alemania) para la temperatura y longitud de tiempo deseadas. Las alícuotas se retiraron para el ensayo de actividad enzimática durante el transcurso de la estimulación con calor.

El grado de protección conferido por la proteína específica en cada momento puntual se expresó como el % de actividad restante de la actividad enzimática completa. Cada punto representa al menos 4 réplicas. Los datos se analizaron por el programa JMP (versión 3.11).

Estabilidad de SP1 recombinante de Pichia pastoris: El medio de cultivo que contenía la SP1 recombinante secretada se hirvió durante 10 minutos, seguido de 10 minutos de centrifugación a 10.000 g. Las muestras de sobrenadante se prepararon en tampón de muestra SDS de potencia total (2%) o tampón de muestra nativo (SDS al 0%). Las muestras se hirvieron en tampones de muestra durante 5 minutos antes de la separación en tricina-SDS al 17%-PAGE.

Estudio de microscopía electrónica de transmisión (MET): Se aplicó la SP1 nativa purificada a una concentración de 0,45 mg por ml a rejillas de carbono y se tiñeron con acetato de uranilo. Las imágenes se visualizaron en un ME Philips CM12 y se registraron en una cámara Tietz CCD (Dr. Sharon Wolf, Electron Microscope Center, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

Procedimientos experimentales adicionales: Los métodos y procedimientos adicionales se describen en detalle en la breve descripción de los gráficos en el contexto de las Figuras específicas.

Resultados experimentales

Estabilidad del oligómero SP1 nativo al calor y la desnaturalización con detergentes: La SP1 de plantas de álamo se identificó primero como una proteína de gran tamaño en SDS-PAGE, apareciendo como un complejo en el extracto de proteína total soluble. Cuando se desnaturaliza parcialmente, se detectan una forma de tamaño molecular grande (116 kDa) y pequeño (12,4 kDa) de la proteína (Figura 1). Estas dos formas representan los estados monomérico (12,4 kDa) y homo-oligomérico nativo (116 kDa) de la proteína SP1, como se demuestra por la interconversión de las muestras purificadas en gel de las dos formas en condiciones desnaturalizantes extremas (Figura 1).

La resistencia remarcable del oligómero SP1 nativo a la desnaturalización por detergentes se examinó en todo un intervalo de concentraciones de SDS. A pesar de la presencia de SDS en el gel y el tampón de procesamiento (0,1%), se descubrió que solamente podía observarse una pequeña cantidad de monómero cuando SP1 se preparaba en tampón de muestra nativo (0%) (Figura 2a). El complejo SP1 permanecía estable cuando se hervía en concentraciones de SDS de una proporción molar de hasta 600:1 (SDS:monómero SP1), y en concentraciones de SDS incluso mucho mayores sin ebullición (Figura 2a).

Por tanto, el oligómero SP1 también muestra estabilidad térmica inusual. Esto se demostró adicionalmente por la estabilidad constante de la forma oligomérica de SP1 a temperaturas de hasta 80ºC y una concentración de SDS:monómero SP1 de 900:1 (Figuras 2b), independientemente del tiempo de incubación (Figura 2c).

Resistencia a proteasa y purificación sin detergente de SP1: La purificación sin detergente y la resistencia a proteasa de SP1 de plantas de álamo se demostró por extracción criogénica (a -50ºC) seguida de 60 minutos de tratamiento con proteasa K de la fracción de proteína soluble a partir de brotes u hojas de álamo a 37ºC. Después de terminarse la digestión proteolítica, la proteína predominante en la fracción soluble restante era SP1. El fraccionamiento por tamaño por filtración molecular demostró que la SP1 resistente a proteasa era mayor de 50 kDa de masa molecular, lo que indica que la proteína resistente mantenía la estructura oligomérica.

La SP1 aumenta la estabilidad térmica de la actividad enzimática de la citrato sintasa (CS) y la peroxidasa de rábano rusticano (HRP): La actividad tipo chaperona de SP1 se ensayó in vitro midiendo la resistencia de la actividad enzimática CS y HRP a la desnaturalización por calor en presencia de SP1. La CS es una enzima dimérica inestable al calor, disponible en el mercado, que experimenta inactivación después de 15 minutos a 43ºC en ausencia de algún protector (Figura 3a). En presencia de altas concentraciones de SP1 (proporción CS:SP1 de 1:50), la actividad CS permanecía casi al 100% durante 15 minutos y retenía al menos el 93% de su actividad mientras duró el ensayo (40 minutos). Concentraciones inferiores de SP1 conferían proporcionalmente menos protección contra la inactivación por calor (a una proporción CS:SP1 de 1:5, se conseguía una protección del 22% a los 40 minutos). En contraste con la protección drástica producida por SP1, ni BSA ni la lisozima afectaban a la inactivación por calor de la actividad CS (Figura 3a). En un ensayo diferente, los estabilizadores de proteínas glicerol (10 y 20%) y la Hsp alfa-cristalina eran igualmente ineficaces para proteger la actividad enzimática CS de la inactivación térmica (Figura 3c).

La HRP es una proteína monomérica disponible en el mercado con una masa molecular de 44 kDa. Cuando se incubaba a 55ºC en condiciones de ensayo convencionales (véase Materiales y Procedimientos), se perdía el 60% de la actividad enzimática después de 10 minutos y se perdía más del 90% después de 60 minutos. Solamente pudo medirse el 3% de la actividad HRP original después de 2 horas a 55ºC (Figura 4). No se observó recuperación de la actividad después de una incubación exhaustiva (16 horas) de la enzima inactivada por calor a 25ºC. Por tanto, la actividad HRP es inestable al calor a 55ºC. Cuando se añadía SP1 purificada, la protección de la actividad HRP de la inactivación por calor era significativa a proporciones molares de HRP:SP1 de 1:50 y superiores. A una proporción molar de HRP:SP1 de 1:300, se conseguía una protección mayor del a los 60 minutos, con una actividad restante del 53% después de 2 horas de incubación a 55ºC. La protección mediada por SP1 de la inactivación por calor de HRP fue significativa, pero proporcionalmente más débil a proporciones de 200:1, 100:1 y 50:1 (Figura 4). A una proporción molar de HRP a SP1 de 1:25, se observó poca protección. La adición de BSA (proporción de HRP:SP1 de 1:300) también produjo un grado de protección, pero SP1 era aproximadamente 3 veces más eficaz (Figura 4).

Clonación y análisis de secuencia del ADNc de SP1: Se preparó una biblioteca de expresión lambda a partir del ARN poliadenilado de brotes de álamo sometidos a escasez de agua, como se ha descrito en Materiales y Procedimientos Experimentales anteriormente. Después de explorar 7 x 105 placas mágicas recombinantes con anticuerpos policlonales anti-SP1, se aisló una secuencia de ADNc de 567 nucleótidos que codificaba un polipéptido SP1 (ADNc de SP1) (Figura 5 y SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SP1, respectivamente). El análisis de secuencia de nucleótidos del ADNc (Paquete Wisconsin Versión 9.1, Genetics Computer Group-GCG, Madison WI.) indicó que el ADNc de SP1 codifica un polipéptido de 12.368 kDa con un pI calculado de 4,87. El análisis de la fase de lectura abierta reveló que este polipéptido carece de restos de cisteína, es de bajo contenido en restos de triptófano (0,9%), y es rico en restos de leucina (13,8%), treonina (9,2%), alanita (8,3%), ácido glutámico (7,4%) y serina (7,4%). No se detectó homología con ninguna secuencia proteica conocida en el banco de proteínas SWISS-PROT. Se identificaron secuencias codificantes que muestran homología de secuencia con SP1 de diversas especies de plantas evolutivamente distantes usando la base de datos EST (Pluralidad = 10,0; Umbral = 4; Carga promedio = 1,00; Apareamiento promedio = 2,91; Desapareamiento promedio = -2,00). Se identificaron 25 secuencias con homología significativa (valor E por debajo de 0,5) (3 en Arabidopsis, 2 en maíz, 1 en patata, 2 en arroz, 1 en sorgo, 7 en soja, 2 en tomate y 7 en trigo, véase la Figura 12 y las SEC ID Nº 7-32, Secuencia consenso - SEC ID Nº 33). Las secuencias peptídicas putativas se alinearon y compararon con la secuencia peptídico de SP1 (SEC ID Nº 2), revelando unas pocas secuencias consenso conservadas: "HAFESTFES" (61-75, SEC ID Nº 36), "VKH" (9-11, SEC ID Nº 37) y "KSF" (47-49, SEC ID Nº 38) por ejemplo, lo que indica que SP1 es un miembro de la familia de genes proteicos con amplia representación en genomas de plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas. Sin embargo, hasta ahora, no se ha descubierto o asignado ninguna función para ninguna de las proteínas de esta familia, excepto lo presentado en este documento.

Además de las secuencias anteriores, se observó una elevada homología de ADN con el ADNc de SP1 (SEC ID Nº 1) para varias EST de Populus: homología del 97% con EST AI161912 (SEC ID Nº 5) y AI163063 (SEC ID Nº 6), homología del 90% con AI161643 (SEC ID Nº 39) y homología del 92% con AI163329 (SEC ID Nº 40) de un álamo híbrido (Populus tremula x Populus tremuloides); homología del 96,6% con la secuencia de ARNm de pop3 de Populus trichocarpa x Populus deltoides (SEC ID Nº 34 y 35 para las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos, respectivamente, véase también la Figura 13, para la alineación de homología de la proteína codificada por el ARNm de pop3 - SEC ID Nº 35, y la proteína SP1 - SEC ID Nº 2), homología del 61,6% con el ARNm sensible a heridas de Populus trichocarpa x Populus deltoides (números de acceso a EMBL M18538 y X55440, respectivamente). La proteína SP1 se identificó en todas las especies de Populus estudiadas. La secuencia de nucleótidos de ADN de SP1 se remitió a EMBL (con el número de acceso AJ276517). El análisis del polipéptido codificado por SP1 usando los diagramas de hidropatía de Kyte y Doolittle (1984) y Goldman y col. (1986) indicó que SP1 es una proteína altamente hidrófila, excepto para su extremo C-terminal hidrófobo.

Expresión de SP1 en E. coli, purificación de la proteína de fusión recombinante CBD-SP1, y carácter antigénico de la proteína recombinante CBD-SP1: La introducción de la secuencia de ADNc de SP1 clonada en el vector de expresión de CBD pET-CBD-180 (Figura 11, descrito en Materiales y Procedimientos Experimentales) produjo una secuencia de nucleótidos que codificaba una proteína de fusión CBD-SP1. La CBD-SP1 recombinante se expresó a elevados niveles por las bacterias (aproximadamente 300 miligramos por litro de medio de cultivo) y se acumuló en forma de cuerpos de inclusión. Cuando se separó el extracto total de E. coli en SDS-PAGE, se detectó una banda de 32,4 kDa por tinción con azul de Coomassie, aparentemente ausente de la fracción proteica bacteriana no transformada (Figura 6a). La identidad antigénica de la proteína fusionada con SP1 se demostró por una fuerte reacción después de la inmunodetección de la banda de proteína monomérica fusionada de 32,4 kDa en transferencias de Western de los mismos geles, usando los anticuerpos policlonales anti-SP1 (Figura 6b). También se detectó una banda inmunorreactiva de 65 kDa en el SDS-PAGE de las proteínas bacterianas totales transformadas, que representa posiblemente un dímero de la proteína de fusión de 32,4 kDa (Figura 6b). La proteína de fusión recombinante CBD-SP1 se purificó en perlas de celulosa a partir de los cuerpos de inclusión solubilizados con urea 4,5 M, aprovechando la afinidad de CBD por las perlas de celulosa. La proteína de fusión CBD-SP1 altamente purificada obtenida se usó para preparar anticuerpos policlonales anti-CBD-SP1 en conejos. Estos anticuerpos policlonales anti-CBD-SP1 también reconocían bandas de proteínas CBD-SP1 de 32,4 kDa y 65 kDa en transferencias de Western de extractos celulares transformados, confirmando adicionalmente la identidad antigénica de los polipéptidos CBD-SP1 recombinante y SP1 nativo. Los pesos moleculares de la proteína SP1 nativa y la proteína CBD-SP1 recombinante en condiciones no desnaturalizantes (tampón PBS) se estimaron por HPLC de filtración en gel e inmunodetección de las fracciones proteicas eluidas en transferencias de Western con anticuerpos anti-SP1 y anti-CBD-SP1. Tanto la proteína SP1 nativa y como la proteína CBD-SP1 recombinante eluían como un único pico, a aproximadamente 9,8 y 9,2 minutos, respectivamente (Figura 7). Estos picos correspondían a pesos moleculares de 172,5 + 1,25 kDa y 267,5 ± 2,5 kDa, que representan un complejo de 14 unidades (13,9) de monómero SP1 (12.369 kDa) y 8,4 unidades de monómero CBD-SP1 (32,4 kDa), respectivamente. Naturalmente, la cantidad de subunidades solamente puede estimarse ya que los resultados están influenciados por la forma del complejo.

Clonación del ADN de SP1 en Pichia pastoris y secreción de la proteína SP1 recombinante: La proteína de secreción SP1 no fusionada recombinante se generó transformando células de Pichia SMD1168 (un mutante deficiente en proteasa, His+, Mut+) con el ADN de SP1 de plásmidos pPIC9K linealizados con SalIo BglII como se ha descrito en Materiales y Procedimientos. Se indujeron elevados niveles de expresión de SP1 y se mantuvieron en las células transformadas por la adición de metanol al cultivo durante 96 horas. Se descubrió que un transformante Mut+ y uno Muts expresaban y secretaban niveles relativamente elevados de SP1 recombinante, ausente del medio de cultivo celular de control, que se verifica por SDS-PAGE (Figura 8) e inmunodetección en transferencia de Western con anticuerpo anti-SP1.

5 Propiedades estables a SDS y al calor de la proteína SP1 recombinante: La proteína SP1 recombinante del medio de cultivo de células transformadas se expuso a condiciones extremas de calor y concentraciones de SDS para determinar la similitud funcional del polipéptido recombinante y nativo (Figura 8). La separación del medio de cultivo tratado con calor y SDS en SDS-PAGE demuestra que, como con SP1 nativa, el oligómero SP1 recombinante es resistente a ebullición, disociándose en la forma monomérica solamente en presencia de altas

10 concentraciones (2%) de SDS (Figura 8).

La proteína de fusión recombinante CBD-SP1 aumenta la estabilidad térmica de CS: La capacidad de la proteína de fusión recombinante CBD-SP1 de proteger contra la inactivación térmica a la actividad enzimática de la citrato sintasa se demostró empleando el ensayo colorimétrico de CS (como se describe en Materiales y Procedimientos). Como la proteína SP1 nativa, la CBD-SP1 recombinante purificada confería protección significativa 15 dependiente de la concentración contra la inactivación térmica de la actividad enzimática CS a 43ºC (Figura 3b). Después de 40 minutos, el 73% de la actividad permanecía a una proporción molar monomérica de CS:CBD-SP1 de

1:20. A una proporción de 1:5, se retenía el 33% de la actividad enzimática, en comparación con los controles. En contraste con esto, la incubación con elevadas concentraciones de proteína CBD no fusionada (Figura 3b), BSA o proteína lisozima (Figura 3a) no tenía efecto protector sobre la inactivación de CS. La incubación con otros

20 estabilizadores de proteínas, tales como glicerol (10 o 20%) o la Hsp alfa-cristalina (proporción de CS:alfa-cristalina de 1:12,5) tampoco tuvo efecto sobre la inactivación de la CS (Figura 3c). Por tanto, la parte de la proteína SP1 codificada por la secuencia clonada retiene las propiedades de protección térmica de la proteína nativa.

Las proteínas estables a ebullición de plantas protegen contra la inactivación térmica a la actividad enzimática CS: Se investigó la existencia de proteínas tipo SP1 en otras especies de plantas ensayando el efecto 25 de fracciones de proteínas estables a ebullición de tomate y pino (que son plantas evolutivamente distantes) sobre la inactivación por calor de la actividad enzimática CS. Se prepararon las proteínas totales estables a ebullición de plantas de tomate M82, tomate VF36 y pino (como se describe en Materiales y Procedimientos), y se compararon con las fracciones en bruto de proteína estable a ebullición de álamo para su efecto de estabilización térmica sobre la actividad enzimática CS a 43ºC. Se demostró una protección significativa contra la inactivación térmica (más del

30 60% de actividad restante después de 40 minutos) para las fracciones estables a ebullición de tomate y pino (Figura 9).

Inmunorreactividad cruzada, sensibilidad al estrés y estructura oligomérica de PE de Pino y Tomate: Se investigó la reactividad cruzada antigénica de proteínas estables de especies filogenéticamente remotas por transferencia de Western e inmunodetección con anticuerpos anti-SP1. Se prepararon las proteínas totales estables 35 a ebullición a partir de hojas de tomate sometidas a estrés salino y sequía, y de material de pino sometido a estrés térmico y sequía (como se ha descrito en Materiales y Procedimientos Experimentales anteriormente), se separaron en SDS PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se inmunorreaccionaron con anticuerpos anti-SP1 oligomérica nativa o anticuerpos anti-SP1 recombinante (anti-CBD-SP1). Se detectaron proteínas con reactividad cruzada en las transferencias de los extractos tanto de tomate (Figuras 14c y 14d) como de pino (Figuras 14a y 14b), con una

40 banda predominante sensible al estrés a 45-50 kDa.

Caracterización de la estructura molecular de SP1 nativa por microscopía electrónica: La estructura molecular de SP1 nativa se examinó usando microscopía electrónica de transmisión (Materiales y Procedimientos). Estos estudios de MET de proteína SP1 purificada indicaron una proteína tipo anillo con una cavidad central. El diámetro de la estructura completa es de aproximadamente 11 nanómetros (Figura 10).

45 Protección de -amilasa por SP1: Además de la protección de HRP y CS por SP1, en este documento se muestra que SP1 puede usarse para proteger a la -amilasa de la inactivación inducida por elevadas concentraciones de CaCl2 (conocido como desnaturalización salina) y después de incubación durante periodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente. Como se muestra en la Figura 15, el CaCl2 a elevada concentración inactiva la -amilasa; después de 2 horas de incubación en CaCl2 1 M y 2 M la actividad -amilasa descendió hasta menos del 60% y

50 hasta menos del 10%, respectivamente. La enzima tratada con SP1 estaba completamente protegida en presencia de CaCl2 1 M y protegida al 50% en presencia de CaCl2 2 M. Una larga incubación de solución de -amilasa diluida a temperatura ambiente también causaba una pérdida drástica de la actividad enzimática. Como se muestra en la Figura 16, solamente permanecía una actividad de aproximadamente el 25% después de una semana de incubación a temperatura ambiente. Sin embargo, en presencia de SP1, permanecía más del 40% de la actividad después de

55 una semana de incubación a temperatura ambiente. Por tanto, SP1 protege a la -amilasa de la inactivación inducida tanto por elevada concentración de CaCl2 como por una larga incubación de solución enzimática diluida a temperatura ambiente.

Reparación de la actividad enzimática por SP1: Se evaluó la capacidad de SP1 de reparar la actividad enzimática con respecto a las enzimas -amilasa, SOD y HRP.

Reparación de la actividad -amilasa por SP1: Como se muestra en la Figura 17, la adición de SP1 a la -amilasa provocaba un aumento del 60% en la actividad -amilasa en comparación con la enzima sin SP1. Este resultado indica claramente que SP1 repara la -amilasa que perdió actividad parcial durante el almacenamiento o el ensayo de actividad.

Reparación de la actividad peroxidasa de rábano rusticano (HRP) por SP1: La HRP diluida se inactiva fácilmente después de exposición a temperatura ambiente. Como se muestra en la Figura 18, se perdió más del 35% de la actividad HRP después de 30 minutos de exposición a temperatura ambiente. Como se muestra adicionalmente en la Figura 18, la SP1 no solamente protege la HRP de la inactivación inducida por la temperatura ambiente, también repara la HRP dañada, ya que se rescató aproximadamente el 10% de la actividad HRP después de la adición de SP1, y se mantuvo durante al menos 6 horas después de ello. Esto resalta notablemente de la HRP no tratada con SP1 que continuó perdiendo actividad durante todo el experimento.

Reparación de la actividad superóxido dismutasa (SOD) por SP1: También se evaluó la actividad de reparación de SP1 con respecto a SOD. Como se muestra en la Figura 19, la adición de SP1 a SOD de calidad cosmética (Pentapharm), provocó una actividad mayor del 60% en comparación con la SOD no tratada con SP1. La actividad de reparación es dependiente de la concentración y demuestra que SP1 puede reparar la SOD que perdió actividad parcial durante el almacenamiento o el ensayo.

Respuesta inmune reducida como resultado de la fusión de un polipéptido con SP1: A 16 ratones (C57BL/6) se les inyectó por vía intraperitoneal (100 l) CBD {5 M (ratones 1-4), 0,05 M (ratones 9-12)} o proteína de fusión CBD-SP1 {5 M (ratones 5-8), 0,05 M (ratones 12-16)}. Como se muestra en la Figura 20a, 35 días después de la inmunización, el título sanguíneo de anticuerpo anti-CBD en ratones inyectados con la fusión CBD-SP1 era muy inferior al título sanguíneo de anticuerpo anti-CBD en ratones inyectados con CBD solo. La diferencia entre el título de anticuerpos de ratones inyectados con CBD y ratones inyectados con la fusión CBD-SP1 es incluso mayor cuando los ratones se inmunizaron con cantidades inferiores de antígeno y después de un tiempo más corto desde la inyección (Figura 20b(i)-(iv)).

La SP1 confiere tolerancia salina en plantas: La inserción de genes de tolerancia a estrés abiótico en plantas se usa para desarrollar cultivos tolerantes al estrés. Se ensayó el efecto de los niveles de expresión de la proteína SP1 sobre la tolerancia salina en líneas de álamo (P. tremula) SP1-transgénico. Plantas NT (no transformadas) así como plantas transgénicas M4 y L3 expresan un nivel normal de proteína SP1, mientras que plantas transgénicas H3 expresan un nivel mayor considerable de proteína SP1. Se midió la longitud del tallo, la retención de hojas y el peso seco final de los órganos de la planta en plantas de P. tremula (NT) y en las tres líneas de P. tremula transformadas con SP1, después del estrés salino y la recuperación del estrés salino, en un experimento de maceta, con relación a un régimen de riego normal (Figuras 21a-c). Se observó una severa supresión del crecimiento como resultado del estrés salino. Sin embargo, las plantas H3, que expresan un nivel considerablemente mayor de proteína SP1, muestran una tolerancia mucho mejor al estrés salino que las plantas que expresan niveles normales o bajos de SP1. El efecto beneficioso de los elevados niveles de SP1 durante el periodo de recuperación fue incluso más claro: las plantas H3 se recuperaban del estrés salino mucho mejor que las otras líneas. Es importante observar que no se observó diferencia significativa entre las diferentes líneas en regímenes de riego normal.

La SP1 induce la curación de heridas: Como se muestra en la Figura 22, la SP1 estimulaba la migración de un área descubierta arañada en una monocapa confluyente, lo que indica un efecto positivo de SP1 en los procesos de curación de heridas.

Efecto de SP1 sobre la fuerza del cabello: El cabello está compuesto por proteínas tales como la queratina principalmente y por tanto la SP1 puede estabilizar y fortalecer el cabello. La fuerza del cabello se ensayó por medición de su capacidad de portar peso, y se definió como el peso por encima del cual se rompía. Como la fuerza del cabello varía, incluso entre el mismo donante, cada cabello se cortó en dos fragmentos, un fragmento se trató con tampón Tris y el otro con el mismo tampón que contenía SP1. La fuerza de cada fragmento individual se comparó con la fuerza del otro. Como se muestra en la Figura 25, la fuerza promedio del cabello tratado con SP1 fue del 16%, de forma significativa, mayor que la del cabello no tratado de control. Por tanto, el tratamiento con SP1 fortalece el cabello humano.

La SP1 sirve como estructura molecular: La fusión entre la SP1 y el dominio de unión a celulosa (CBD) se usó para demostrar que la fusión de SP1 con un polipéptido mantiene las características de ambos componentes. Se demostró que la fusión recombinante CBD-SP1 mantiene la capacidad de ensamblarse espontáneamente en un oligómero de 12 unidades como lo hace SP1, mantiene la capacidad de unión a celulosa como lo hace CBD, y puede estabilizar HRP como lo hace SP1. La Figura 7 muestra un perfil de HPLC por exclusión de tamaño tanto de SP1 como de CBD-SP1. Ambas se ensamblan espontáneamente en un oligómero de 12 unidades (Figura 10). La Figura 23a compara la capacidad de unión de CBD-SP1 a celulosa con la de CBD. Se aplicó una cantidad equimolar de las proteínas CBD y CBD-SP1 (primeros dos carriles desde la izquierda; 15 pmol, calculada en base al peso molecular de CBD) a 30 mg de celulosa (Sigmacell tipo 20). Se realizaron los mismos procedimientos de unión y elución para estas dos proteínas. De forma similar a CBD, CBD-SP1 se unió a la celulosa, y se eluyó en las mismas condiciones. La actividad de protección de HRP tanto de CBD-SP1 como de SP1 se muestra en la Figura 23b. Es evidente que CBD-SP1 estabiliza HRP como lo hace SP1 (obsérvese que el peso molecular de CBD-SP1 es aproximadamente dos veces mayor que el de SP1). Por tanto, estos resultados demuestran que la fusión de SP1 con CBD mantiene las características tanto de SP1 como de CBD.

Producción de SP1: La extracción y purificación de SP1 a partir de hojas frescas de álamo y bacterias transformadas con sp1 aprovechan la resistencia de la proteína a la ebullición y las proteasas. Como se muestra en las Figuras 24a(i)-(ii) y 24b, la mayoría de las proteínas presentes en el extracto en bruto de hojas frescas de álamo y bacterias transformadas con sp1 se elimina por la ebullición o la proteolisis por Subtilisina, salvo SP1. La proteína predominante encontrada después de dicho tratamiento es SP1.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones diferentes, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.

Referencias citadas

(Las referencias adicionales se citan en el texto)

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Wang, Wangxia Pelah, Dan Alegrand, Tal Shoseyov, Oded Altman, Arie

<120> PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS TIPO CHAPERONA, ESTABLES A EBULLICIÓN Y/O DETERGENTES Y/O RESISTENTES A PROTEASA, POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LAS MISMAS Y SUS USOS

<130> 01/22939

<160> 40

<170> Patent In versión 3.0

<210> 1

<211> 567

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<900> 1

imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

imagen2

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 3

aaaaccatgg caaccagaac tccaaagc 28

<210> 4

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 4

aaaaggatcc ttactttatt accatgaaat agcc 34

<210> 5

<211> 593

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<220>

<221> misc_feature

<222> (224)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (451)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (566)..()

<223> cualquier nucleótido

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 357

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<220>

<221> misc_feature

<222> (201).. ()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (302)..()

<223> cualquier nucleótido

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 98

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 98

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 98

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 9 <210> 10

imagen1

<211> 84

<212> PRT

<213> Zea mays

<220>

<221> misc_feature

<222> (50).. (51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 98

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 11 <210> 12

imagen1

imagen1

<211> 98

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(49)

<223> cualquier aminoácido

<400> 12

imagen1

<210> 13

<211> 109

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 13 <210> 14

imagen1

imagen1

<211> 47

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<900> 14

imagen1

<210> 15

<211> 98

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 15 <210> 16

imagen1

imagen1

<211> 98

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> cualquier aminoácido

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 93

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(50)

<223> cualquier aminoácido

<400> 17 <210> 18

imagen1

imagen1

<211> 108

<212> PRT

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 96

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (49) .. ()

<223> cualquier aminoácido

<400> 19

<211> 96

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (18) .. (20)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (49) .. ()

<223> cualquier aminoácido

<400> 20 <210> 21

imagen3

imagen1

<211> 96

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (49) .. ()

<223> cualquier aminoácido

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 97

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(17)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..()

<223> cualquier aminoácido

<400> 22 <210> 23

imagen1

imagen1

<211> 104

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..()

<223> cualquier aminoácido

<400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 77

<212> PRT

<213> Zea mays

<220> <221> misc_feature

<222> (25)..()

<223> cualquier aminoácido

<400> 24

imagen1

<210> 25

<211> 97

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(34)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(45)

<223> cualquier aminoácido

<400> 25 <210> 26

imagen1

imagen1

<211> 94

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(31)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(42)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (75)..(76)

<223> cualquier aminoácido

<400> 26

imagen1

<210> 27

<211> 96

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(15)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature <222> (43)..(44)

<223> cualquier aminoácido

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 96

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(15)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(44)

<223> cualquier aminoácido

<400> 28 <210> 29

imagen1

<211> 97

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(45)

<223> cualquier aminoácido

<400> 29

imagen1

<210> 30

<211> 43

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> cualquier aminoácido

<400> 30

imagen1

<210> 31

<211> 111

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

imagen1

<210> 32

<211> 100

<212> PRT

<213> Glycine max

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(56)

<223> cualquier aminoácido

<400> 32 <210> 33

imagen1

imagen1

<211> 102

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia consenso

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (17).. (18)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(32)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(37)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(49)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(54)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(78)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(88)

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (90)..()

<223> cualquier aminoácido

<220>

<221> misc_feature

<222> (92)..(93)

<223> cualquier aminoácido

<400> 33

imagen1

<210> 34

<211> 428

<212> ADN

<213> Populus deltoides

<400> 34

imagen1

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> Populus deltoides

<400> 35

imagen1

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias consenso conservadas

<400> 36

imagen1

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias consenso conservadas

<400> 37

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias consenso conservadas

<400> 38

imagen1

imagen1

<210> 39

<211> 497

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc-feature

<222> (75)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (108)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..()

<223> cualquier nucleótido <220>

<221> misc_feature

<222> (182)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (270).. ()

<223> cualquier nucleótido

<400> 39

imagen1

<210> 40

<211> 366

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (121)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (141)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (144)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (153)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (178)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (200)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (212)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (221)..()

<223> cualquier nucleótido

<220> <221> misc_feature

<222> (231)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (245)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (266)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (274)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (281)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (306)..()

<223> cualquier nucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (323)..()

<223> cualquier nucleótido

<400> 40

imagen1

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende:

   (a)

   un primer polinucleótido que codifica una proteína estable a ebullición, estable a detergentes, o resistente a proteasa, teniendo dicha proteína una actividad tipo chaperona y en el que dicha proteína estable tiene una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2; y

   (b)

   un segundo polinucleótido que incluye una secuencia promotora que está unida de forma funcional a dicho primer polinucleótido para dirigir la expresión de dicha proteína.

2. 2.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que:

   (i)

   dicho promotor vegetal constitutivo se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor vegetal CaMV35S, el promotor vegetal CaMV19S, el promotor vegetal FMV34S, el promotor vegetal del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor vegetal CsVMV, el promotor vegetal de la actina ACT2/ACT8 de Arabidopsis, el promotor vegetal UBQ1 de la ubiquitina de Arabidopsis, el promotor vegetal BTH6 de la tionina de la hoja de la cebada, y el promotor vegetal de la actina del arroz;

   (ii)

   dicho promotor vegetal específico de tejido se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de la faseolina de la alubia, el promotor vegetal DLEC, el promotor vegetal PHS, el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de zeína, el promotor vegetal de la conglutina gamma de la soja, el promotor vegetal del gen AT2S1, el promotor vegetal de la actina ACT11 de Arabidopsis, el promotor vegetal napA de Brassica napus y el promotor vegetal del gen de la patatina de la patata; y

   (iii) dicho promotor vegetal inducible se selecciona entre el grupo que consiste en un promotor vegetal inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante, un promotor vegetal del gen rbcS de la alfalfa, los promotores vegetal DRE, MYC y MYB que son activos en sequía; los promotores vegetal INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 activos en elevada salinidad y estrés osmótico, y los promotores vegetal hsr203J y str246C activos en estrés patogénico.
3. 3.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia promotora es un promotor procariota.
4. 4.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha proteína estable de forma nativa es un oligómero.
5. 5.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha proteína estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.
6. 6.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha proteína estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35.
7. 7.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho primer polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1.
8. 8.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho primer polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 34.
9. 9.- Una célula transformada con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. 10.- Un organismo no humano transformado con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. 11.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende adicionalmente (c) un tercer polinucleótido que codifica una proteína adicional, estando adyacente dicho tercer polinucleótido y en fase con dicho primer polinucleótido, codificando dicho primer y tercer polinucleótidos, en combinación, una proteína de fusión de dicha proteína estable y dicha proteína adicional.
12. 12.- Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes aislado, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.
13. 13.- Un procedimiento para estabilizar una proteína contra condiciones desnaturalizantes que comprende causar que una cantidad eficaz de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa llegue ha estar en contacto con dicha proteína, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.
14. 14.- Una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, fusionado a un polipéptido adicional.
15. 15.- La proteína de fusión de la reivindicación 14, en la que dicho polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes y/o resistente a proteasa que tiene dicha actividad tipo chaperona está fusionado a dicho polipéptido adicional mediante un enlace peptídico.
16. 16.- La proteína de fusión de la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes y/o resistente a proteasa que tiene dicha actividad tipo chaperona está fusionado a dicho polipéptido adicionalmente mediante un enlazador.
17. 17.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, que tiene una forma oligomérica.
18. 18.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.
19. 19.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35.
20. 20.- Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21. 21.- Un procedimiento para proteger una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática, comprendiendo el procedimiento añadir a la preparación enzimática un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa que tiene una actividad tipo chaperona y que tiene una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, en una cantidad suficiente para proteger la preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática.
22. 22.- Una planta transgénica transformada con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
23. 23.- Un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico, comprendiendo el procedimiento modificar la planta para que exprese la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
24. 24.- Uso de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa para la preparación de un medicamento para acelerar la cicatrización de heridas, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.
25. 25.- Una composición farmacéutica, que comprende, como ingrediente activo, un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
26. 26.- La composición de la reivindicación 25, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.
27. 27.- La composición de la reivindicación 25, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35.
28. 28.- Un procedimiento para aumentar la avidez de unión de una molécula de unión, comprendiendo el procedimiento presentar múltiples copias de la molécula de unión sobre la superficie de un oligómero de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.
29. 29.- El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicha molécula de unión se selecciona entre el grupo que consiste en un receptor, un ligando, una enzima, un sustrato, un inhibidor, un anticuerpo y un antígeno.
30. 30.- El procedimiento de la reivindicación 28 ó 29, en el que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.
31. 31.- El procedimiento de las reivindicaciones 28-29, en el que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35.
32. 32.- Un heterocomplejo que comprende un oligómero que incluye una pluralidad de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, y al menos dos moléculas diferentes que están fusionadas a dicho oligómero.
33. 33.- La composición de la reivindicación 32, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.
34. 34.- La composición de la reivindicación 32, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35.