ES2364452T3

ES2364452T3 - METHOD FOR DESIGNING PROFESSIONAL COMPOUNDS ACTIVATED BY CD10.

Info

Publication number: ES2364452T3
Application number: ES02746852T
Authority: ES
Inventors: Christopher R. Bebbington; Matthew H. Nieder; Pina M. Cardarelli; Sanjeev Gangwar; Lesley B. Pickford; Chin Pan
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2011-09-02
Anticipated expiration: 2022-06-11
Also published as: WO2002100353A3; EP1404356B1; US6897034B2; JP4541693B2; AU2002316539B2; US20090136980A1; WO2002100353A2; CA2450316A1; US7304032B2; AU2002316539C1; US20040087497A1; EP1404356A4; ATE504315T1; US20050267016A1; JP2004537527A; EP1404356A2; DE60239679D1; US7771962B2

Abstract

The compounds of the invention are modified forms of therapeutic agents. A typical prodrug compound of the invention comprises a therapeutic agent, an oligopeptide, a stabilizing group and, optionally, a linker group. The prodrug is cleavable by the CD10 enzyme. Methods of treatment using the prodrug and methods of designing the prodrug are also disclosed.

Description

Introducción Introduction

Campo Técnico Technical Field

[0001] La presente invención se refiere a un método como se define en la reivindicación 1. Los profármacos identificados por el método de la reivindicación 1 pueden usarse para tratar una enfermedad, especialmente tumores, en pacientes. [0001] The present invention relates to a method as defined in claim 1. The prodrugs identified by the method of claim 1 can be used to treat a disease, especially tumors, in patients.

Antecedentes Background

[0002] Muchos agentes terapéuticos, tales como antraciclinas y alcaloides de la vinca, son especialmente eficaces para el tratamiento de cánceres. Sin embargo, estas moléculas se caracterizan con frecuencia in vivo por una toxicidad aguda, especialmente una toxicidad de la médula ósea y de las mucosas, así como una toxicidad cardiaca crónica en el caso de las antraciclinas y una toxicidad neurológica crónica en el caso de los alcaloides de la vinca. De forma similar, puede usarse metotrexato para el tratamiento de reacciones inflamatorias, tales como enfermedades reumáticas, pero su alta toxicidad limita sus aplicaciones. Es deseable el desarrollo de agentes antitumorales más seguros y específicos para una mayor eficacia contra células tumorales y una disminución en el número y la gravedad de los efectos secundarios de estos productos (toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc.). También es deseable el desarrollo de agentes antiinflamatorios más específicos. [0002] Many therapeutic agents, such as anthracyclines and vinca alkaloids, are especially effective for the treatment of cancers. However, these molecules are often characterized in vivo by an acute toxicity, especially a toxicity of the bone marrow and mucous membranes, as well as a chronic cardiac toxicity in the case of anthracyclines and a chronic neurological toxicity in the case of vinca alkaloids. Similarly, methotrexate can be used for the treatment of inflammatory reactions, such as rheumatic diseases, but its high toxicity limits its applications. The development of safer and more specific antitumor agents is desirable for greater efficacy against tumor cells and a decrease in the number and severity of side effects of these products (toxicity, destruction of non-tumor cells, etc.). The development of more specific anti-inflammatory agents is also desirable.

[0003] Para minimizar los problemas de toxicidad, los agentes terapéuticos se presentan ventajosamente a los pacientes en forma de profármacos. Los profármacos son moléculas capaces de convertirse en fármacos (compuestos terapéuticos activos) in vivo mediante ciertas modificaciones químicas o enzimáticas de su estructura. Con el fin de reducir la toxicidad, esta conversión debería estar confinada al sitio de acción o tejido diana más que al sistema circulatorio o tejido no diana. Sin embargo, los profármacos se caracterizan con frecuencia por una baja estabilidad en sangre y suero. Esto se debe a la presencia de enzimas en sangre y suero que degradan y, por consiguiente, pueden activar los profármacos antes de que los profármacos alcancen los sitios deseados dentro del cuerpo del paciente. [0003] To minimize toxicity problems, therapeutic agents are advantageously presented to patients in the form of prodrugs. Prodrugs are molecules capable of becoming drugs (active therapeutic compounds) in vivo by certain chemical or enzymatic modifications of their structure. In order to reduce toxicity, this conversion should be confined to the site of action or target tissue rather than the circulatory system or non-target tissue. However, prodrugs are often characterized by low blood and serum stability. This is due to the presence of enzymes in blood and serum that degrade and, therefore, can activate the prodrugs before the prodrugs reach the desired sites within the patient's body.

[0004] Una clase deseable de profármacos que superan dichos problemas se ha descrito en la Publicación Internacional del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes Nº WO 96/05863 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.962.216. Compuestos de profármacos útiles adicionales y métodos de preparación de dichos profármacos son deseables, sin embargo, como lo son métodos de preparación de los profármacos. Pan Chin et al. “CPI-0004, a doxorubicin prodrug that is inactive in vitro, prolongs survival of both doxorubicin-resistant and -sensitive human tumor bearing-mice” en Proceeding of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, vol. 42, marzo 2001, página 324, describe el profármaco CPI-0004. [0004] A desirable class of prodrugs that overcome such problems has been described in the International Patent Cooperation Treaty Publication No. WO 96/05863 and in US Patent No. 5,962,216. Additional useful prodrug compounds and methods of preparing said prodrugs are desirable, however, as are prodrug preparation methods. Pan Chin et al. "CPI-0004, a doxorubicin prodrug that is inactive in vitro, prolongs survival of both doxorubicin-resistant and -sensitive human tumor bearing-mice" in Proceeding of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, vol. 42, March 2001, page 324, describes the prodrug CPI-0004.

[0005] Son particularmente deseables profármacos que presenten una alta especificidad de acción, una toxicidad reducida y una estabilidad mejorada en sangre, especialmente respecto a profármacos de estructura similar que han existido en el dominio público. [0005] Prodrugs that have a high specificity of action, reduced toxicity and improved blood stability, especially with regard to prodrugs of similar structure that have existed in the public domain, are particularly desirable.

Descripción resumida de la invención Summary Description of the Invention

[0006] La presente invención se refiere a un método de diseño de un profármaco in vitro, comprendiendo el método: [0006] The present invention relates to a method of designing an in vitro prodrug, the method comprising:

(1) proporcionar un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m, en la que: (1) provide an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ’- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

AAP1’ representa cualquier aminoácido, y AAP1 ’represents any amino acid, and

cada AA representa independientemente un aminoácido, each AA independently represents an amino acid,

(2) unir el oligopéptido en un primer sitio de unión del oligopéptido a un grupo estabilizante que obstaculice la escisión del oligopéptido por enzimas presentes en sangre completa; en el que el grupo estabilizante se selecciona entre: ácido succínico, ácido adípico, ácido glutárico, ácido ftálico, ácido diglicólico, ácido fumárico, ácido naftaleno dicarboxílico, ácido piroglutámico, ácido acético, ácido 1- o 2naftilcarboxílico, ácido 1,8-naftildicarboxílico, ácido aconítico, ácido carboxicinámico, ácido triazol dicarboxílico, ácido glucónico, ácido 4-carboxi-fenil borónico, ácido polietilen glicólico, ácido butano disulfónico, ácido maleico, (2) bind the oligopeptide at a first site of binding of the oligopeptide to a stabilizing group that hinders the cleavage of the oligopeptide by enzymes present in whole blood; wherein the stabilizing group is selected from: succinic acid, adipic acid, glutaric acid, phthalic acid, diglycolic acid, fumaric acid, naphthalene dicarboxylic acid, pyroglutamic acid, acetic acid, 1- or 2-naphthylcarboxylic acid, 1,8-naphthyldicarboxylic acid, aconitic acid, carboxycinnamic acid, tricarzole dicarboxylic acid, gluconic acid, 4-carboxyphenyl boronic acid, polyethylene glycolic acid, butane disulfonic acid, maleic acid,

ácido nipecótico, ácido isonipecótico, y está unido al extremo N-terminal, nipecotic acid, isonipecotic acid, and is attached to the N-terminal end,

o de: or of:

beta-alanina, ácido tiazolidin-4-carboxílico, 2-tienilalanina, 2-naftilalanina, D-alanina, D-leucina, D-metionina, D-fenilalanina, ácido 3-amino-3-fenilpropiónico, ácido gamma-aminobutírico, ácido 3-amino-4,4-difenilbutírico, ácido tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, 4-aminometilbenzoico y ácido aminoisobutírico; y beta-alanine, thiazolidin-4-carboxylic acid, 2-thienylalanine, 2-naphthylalanine, D-alanine, D-leucine, D-methionine, D-phenylalanine, 3-amino-3-phenylpropionic acid, gamma-aminobutyric acid, acid 3-amino-4,4-diphenylbutyric acid, tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid, 4-aminomethylbenzoic acid and aminoisobutyric acid; Y

(3)(3): unir directa o indirectamente el oligopéptido a un agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, en el que las etapas (2) y (3) pueden realizarse en cualquier orden o al mismo tiempo, y en el que además se forma un conjugado por realización de las etapas (1) a (3), directly or indirectly binding the oligopeptide to a therapeutic agent at a second oligopeptide binding site, in which steps (2) and (3) can be performed in any order or at the same time, and in which a conjugate is also formed by performing steps (1) to (3),

(4)(4): ensayar si el conjugado puede escindirse por CD10 y PSA; y test whether the conjugate can be cleaved by CD10 and PSA; Y

(5)(5): seleccionar el conjugado como un profármaco si: (i) la escisión del conjugado es superior al 10% por hora tras la incubación del conjugado y la enzima CD10 en condiciones experimentales que sirvan de modelo de las condiciones fisiológicas; y (ii) la velocidad de escisión por PSA no es superior al 15% de la velocidad de escisión de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu conjugado por el extremo carboxilo terminal al mismo agente terapéutico que el conjugado. select the conjugate as a prodrug if: (i) the conjugate cleavage is greater than 10% per hour after incubation of the conjugate and the CD10 enzyme under experimental conditions that serve as a model of physiological conditions; and (ii) the cleavage rate by PSA is not greater than 15% of the cleavage rate of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu conjugated by the carboxyl terminal end to the same therapeutic agent as the conjugate.

Los compuestos no forman parte de las reivindicaciones. The compounds do not form part of the claims.

[0007] También se describe un compuesto que es una forma profármaco de un agente terapéutico, en el que el agente terapéutico se une directa o indirectamente a un oligopéptido, que a su vez se une a un grupo estabilizante. El compuesto es escindible por CD10. Los profármacos descritos presentan una alta especificidad de acción, una toxicidad reducida, una estabilidad mejorada en el suero y la sangre y no se mueven hacia células diana o lo hacen sólo mínimamente hasta que se activan por CD10. También se describen conjugados escindibles por CD10 u otra enzima de tipo termolisina. No obstante, los compuestos y conjugados no forman parte de las reivindicaciones. [0007] A compound is also described which is a prodrug form of a therapeutic agent, in which the therapeutic agent binds directly or indirectly to an oligopeptide, which in turn binds to a stabilizing group. The compound is cleavable by CD10. The prodrugs described have a high specificity of action, a reduced toxicity, an improved stability in the serum and blood and do not move towards target cells or do so only minimally until they are activated by CD10. Also described are conjugates cleavable by CD10 or other thermolysin-like enzyme. However, the compounds and conjugates do not form part of the claims.

[0008] También se describe una composición farmacéutica que comprende el compuesto descrito y, opcionalmente, un vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable. También se describen artículos de fabricación, tales como kits para diagnóstico o ensayo. [0008] A pharmaceutical composition comprising the described compound and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or excipient is also described. Manufacturing articles, such as kits for diagnosis or testing, are also described.

[0009] Además, se describen métodos de diseño de profármacos y de disminución de la toxicidad modificando un agente terapéutico para crear un profármaco. Dicha modificación proporciona un índice terapéutico mejorado en comparación con el agente terapéutico libre. Puede utilizarse un método de exploración para un oligopéptido de secuencia apropiada que pueda escindirse por CD10 en el diseño de un profármaco. [0009] In addition, prodrug design and toxicity reduction methods are described by modifying a therapeutic agent to create a prodrug. Such modification provides an improved therapeutic index compared to the free therapeutic agent. A scanning method for an appropriate sequence oligopeptide that can be cleaved by CD10 can be used in the design of a prodrug.

[0010] También se describe el tratamiento de una afección médica o trastorno, tal como un tumor, por administración del profármaco de la invención. La afección implica células diana asociadas a CD10. [0010] The treatment of a medical condition or disorder, such as a tumor, by administration of the prodrug of the invention is also described. The condition involves target cells associated with CD10.

[0011] Se describen también varios procedimientos para preparar los profármacos. [0011] Several methods for preparing prodrugs are also described.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

[0012] Las Figuras 1A-1D son una tabla de abreviaturas, nombres y estructuras. [0012] Figures 1A-1D are a table of abbreviations, names and structures.

[0013] La Figura 2 es un esquema ejemplar de la escisión de un profármaco de la invención en las proximidades extracelulares de la célula diana y en el interior de la célula diana. [0013] Figure 2 is an exemplary scheme of excision of a prodrug of the invention in the extracellular proximities of the target cell and inside the target cell.

[0014] La Figura 3 ilustra una síntesis de Fmoc-Ala-IIe-Ala-Leu, un intermediario típico de la invención. [0014] Figure 3 illustrates a synthesis of Fmoc-Ala-IIe-Ala-Leu, a typical intermediate of the invention.

[0015] La Figura 4 ilustra una síntesis por la “ruta de Fmoc” de Metil-succinil-Ala-lIe-Ala-Leu, un intermediario típico de la invención. [0015] Figure 4 illustrates a synthesis by the "Fmoc path" of Methyl-succinyl-Ala-lIe-Ala-Leu, a typical intermediate of the invention.

[0016] La Figura 5 ilustra una síntesis por la “ruta de Fmoc” de una forma de sal de Suc-Ala-lIe-Ala-Leu-DOX, un compuesto típico de la invención. [0016] Figure 5 illustrates a synthesis by the "Fmoc path" of a salt form of Suc-laAla-lIe-Ala-Leu-DOX, a typical compound of the invention.

[0017] La Figura 6 ilustra una síntesis por la “ruta de éster” de una forma de sal de Suc-Ala-lIe-Ala-Leu-DOX, un compuesto típico de la invención. [0017] Figure 6 illustrates a synthesis by the "ester route" of a salt form of Suc-Ala-lIe-Ala-Leu-DOX, a typical compound of the invention.

[0018] La Figura 7 ilustra una síntesis de un Ala-lIe-Ala-Leu-DOX amino-protegido, un intermediario típico de la invención. [0019] La Figura 8 ilustra una síntesis por la “ruta de éster alílico” de una forma de sal de Suc-Ala-lIe-Ala-LeuDOX, un compuesto típico de la invención. [0018] Figure 7 illustrates a synthesis of an amino-protected laAla-lIe-Ala-Leu-DOX, a typical intermediate of the invention. [0019] Figure 8 illustrates a synthesis by the "allyl ester route" of a salt form of Suc-laAla-lIe-Ala-LeuDOX, a typical compound of the invention.

[0020] La Figura 9 ilustra una síntesis por la “ruta de resina” de Suc-Ala-lIe-Ala-Leu-DOX, un compuesto típico de la invención. [0020] Figure 9 illustrates a synthesis by the "resin route" of Suc-Ala-lIe-Ala-Leu-DOX, a typical compound of the invention.

[0021] La Figura 10 es una tabla de oligopéptidos útiles en el profármaco de la invención. [0021] Figure 10 is a table of oligopeptides useful in the prodrug of the invention.

[0022] La Figura 11 ilustra la eliminación de agente terapéutico libre mediante el uso de resina o perlas de atrapamiento. [0022] Figure 11 illustrates the removal of free therapeutic agent by the use of resin or entrapment beads.

[0023] La Figura 12 es una tabla de velocidades de hidrólisis específicas de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox y Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox por homogeneizados de diversas líneas celulares humanas cultivadas. [0023] Figure 12 is a table of specific hydrolysis rates of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox and Suc- Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox by homogenates of various cultured human cell lines.

[0024] La Figura 13 es una tabla de velocidades de hidrólisis específicas de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox y Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox por homogeneizados de diversos tejidos de xenoinjerto. [0024] Figure 13 is a table of specific hydrolysis rates of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox and Suc- Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox by homogenates of various xenograft tissues.

[0025] La Figura 14 muestra la expresión de CD10 según se determinó por análisis citométrico de flujo para un panel de líneas celulares. [0025] Figure 14 shows the expression of CD10 as determined by flow cytometric analysis for a panel of cell lines.

[0026] La Figura 15 es una gráfica de algunas curvas de valoración de la escisión de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox por CD10 en ausencia o presencia de fosforamidón 300 nM. [0026] Figure 15 is a graph of some titration curves of the cleavage of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox by CD10 in the absence or presence of 300 nM phosphoramidon.

[0027] La Figura 16 es una gráfica de los niveles plasmáticos de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox y sus metabolitos a 1 y 4 horas después de la administración de una sola dosis en embolada intravenosa del profármaco. [0027] Figure 16 is a graph of the plasma levels of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox and its metabolites at 1 and 4 hours after the administration of a single intravenous bolus dose of the prodrug.

[0028] La Figura 17 es una gráfica de la cantidad de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox y sus metabolitos presentes en la orina recogida 0-2 y 2-24 horas después de la administración de un solo bolo intravenoso del profármaco. [0028] Figure 17 is a graph of the amount of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox and its metabolites present in the urine collected 0-2 and 2-24 hours after the administration of a single intravenous bolus of the prodrug.

[0029] La Figura 18 es una gráfica de los niveles plasmáticos de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y sus metabolitos 1 y 4 horas después de la administración de una sola dosis en embolada intravenosa del profármaco. [0029] Figure 18 is a graph of the plasma levels of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox and its metabolites 1 and 4 hours after the administration of a single dose in intravenous embolate of the prodrug.

[0030] La Figura 19 es una gráfica de la cantidad de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y sus metabolitos presentes en la orina recogida 0-2 y 2-24 horas después de la administración de un solo bolo intravenoso del profármaco. [0030] Figure 19 is a graph of the amount of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox and its metabolites present in the urine collected 0-2 and 2-24 hours after the administration of a single intravenous bolus of the prodrug.

[0031] La Figura 20 es una gráfica del cambio de peso corporal en porcentaje de ratones tratados con Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox o que reciben el control de vehículo. [0031] Figure 20 is a graph of the change in body weight in percent of mice treated with Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox or receiving vehicle control.

[0032] La Figura 21 es una gráfica de la velocidad de crecimiento de tumores en ratones con xenoinjertos de LS174T tratados con Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox o a los que se administró el control de vehículo. [0032] Figure 21 is a graph of the growth rate of tumors in mice with LS174T xenografts treated with Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox or to which the vehicle control was administered.

[0033] La Figura 22 es una gráfica de crecimiento de LNCaP en ratones atímicos tratados con vehículo, doxorrubicina o Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. [0033] Figure 22 is a graph of LNCaP growth in vehicle-treated, doxorubicin or Suc-leAla-Ile-Ala-Leu-Dox treated mice.

[0034] La Figura 23 es una gráfica del peso corporal de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados. [0034] Figure 23 is a graph of body weight of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors.

[0035] La Figura 24 es una gráfica del peso corporal de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados. [0035] Figure 24 is a graph of body weight of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors.

[0036] La Figura 25 es una gráfica de crecimiento de tumores LNCaP en ratones atímicos tratados con vehículo, doxorrubicina o Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. [0036] Figure 25 is a graph of growth of LNCaP tumors in vehicle-treated, doxorubicin or Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox treated mice.

[0037] La Figura 26 es una gráfica de la concentración de metabolitos de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox y doxorrubicina en plasma con el tiempo. [0037] Figure 26 is a graph of the metabolite concentration of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox , Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox and plasma doxorubicin over time.

[0038] La Figura 27 ilustra una síntesis a gran escala de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, un intermediario típico de la invención. [0038] Figure 27 illustrates a large-scale synthesis of MeOSuc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox, a typical intermediary of the invention.

[0039] La Figura 28 ilustra la asignación de NMR para MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, un compuesto típico de la invención. [0039] Figure 28 illustrates the allocation of NMR for MeOSuc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox, a typical compound of the invention.

[0040] La Figura 29 ilustra la expresión de CD10 en células CHO transfectadas. [0040] Figure 29 illustrates the expression of CD10 in transfected CHO cells.

[0041] La Figura 30 es una gráfica de crecimiento de tumores LNCaP en ratones atímicos tratados con Suc-Ala5 Leu-Ala-Leu-Dox, doxorrubicina o vehículo. [0041] Figure 30 is a graph of growth of LNCaP tumors in nude mice treated with Suc-laAla5 Leu-Ala-Leu-Dox, doxorubicin or vehicle.

[0042] La Figura 31 es una gráfica del índice de supervivencia de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados tratados con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, doxorrubicina o vehículo. [0042] Figure 31 is a graph of the survival index of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors treated with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, doxorubicin or vehicle.

[0043] La Figura 32 es una gráfica del peso corporal ajustado por la media de grupo de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados tratados con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, doxorrubicina o vehículo. [0043] Figure 32 is a graph of the body weight adjusted by the mean group of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors treated with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, doxorubicin or vehicle.

[0044] La Figura 33 es una gráfica de crecimiento de tumores LNCaP en ratones atímicos tratados con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox o vehículo. [0044] Figure 33 is a graph of growth of LNCaP tumors in nude mice treated with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly -Dox or vehicle.

15 [0045] La Figura 34 es una gráfica del índice de supervivencia de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados tratados con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox o vehículo. [0045] Figure 34 is a graph of the survival index of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors treated with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc- Leu-Ala-Gly-Dox or vehicle.

[0046] La Figura 35 es una gráfica del peso corporal ajustado por la media de grupo de ratones atímicos que contienen tumores LNCaP xenoinjertados tratados con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox o vehículo. [0046] Figure 35 is a graph of body weight adjusted by the mean group of athymic mice containing xenografted LNCaP tumors treated with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu- Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox or vehicle.

Descripción detallada Detailed description

25 Abreviaturas 25 Abbreviations

[0047] ACN = Acetonitrilo [0048] Aib = Ácido aminoisobutírico [0049] All = Alilo [0050] Aloc = Aliloxicarbonilo [0051] Amb = Ácido 4-(aminometil)benzoico [0052] APP = Ácido 3-amino-3-fenilpropiónico [0053] DCC = N,N’-diciclohexilcarbodiimida [0054] Boc = t-butiloxicarbonilo [0047] ACN = Acetonitrile [0048] Aib = aminoisobutyric acid [0049] All = Alilo [0050] Aloc = Allyloxycarbonyl [0051] Amb = 4- (aminomethyl) benzoic acid [0052] APP = 3-amino-3-phenylpropionic acid [0053] DCC = N, N’-dicyclohexylcarbodiimide [0054] Boc = t-butyloxycarbonyl

35 [0055] Cap = ácido aminocaproico [0056] DBN = 1,5 Diazabiciclo [4.3.0] non-5-eno [0057] DBO = 1,4 Diazabiciclo [2.2.2] octano [0058] DBU = 1,8-Diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno [0059] Dox-HCl= Sal clorohidrato de doxorrubicina [0060] DCM = Diclorometano [0061] DIC = N,N’-Diisopropilcarbodiimida [0062] DIEA = Diisopropiletilamina [0063] Dg = Ácido diglicólico [0064] DMF = Dimetilformamida 35 [0055] Cap = aminocaproic acid [0056] DBN = 1.5 Diazabicyclo [4.3.0] non-5-eno [0057] BOD = 1.4 Diazabicyclo [2.2.2] octane [0058] BOD = 1.8 -Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-eno [0059] Dox-HCl = Doxorubicin hydrochloride salt [0060] DCM = Dichloromethane [0061] DIC = N, N'-Diisopropylcarbodiimide [0062] DIEA = Diisopropylethylamine [0063] Dg = Diglycolic acid [0064] DMF = Dimethylformamide

45 [0065] Dnr = Daunorrubicina [0066] Dox = Doxorrubicina [0067] Et2O = Éter dietílico [0068] Fmoc = 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo [0069] GI = Ácido glutárico [0070] HATU = Hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotrazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio [0071] HBTU = Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)1,1,3,3-tetrametiluronio [0072] HEPES = Hidroxetilpiperidina [0073] HOBt = N-hidroxibenzotriazol [0074] HPLC = Cromatografía líquida a alta presión [0065] Dnr = Daunorubicin [0066] Dox = Doxorubicin [0067] Et2O = Diethyl ether [0068] Fmoc = 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl [0069] GI = Glutaric acid [0070] HATU = Hexafluorophosphate-1-Oz (7-) -il) -1,1,3,3-tetramethyluronium [0071] HBTU = 2- (1 H -benzotriazol-1-yl) 1,1,3,3-tetramethyluronium [0072] HEPES = Hydroxyethylpiperidine [0073] HOBt = N-hydroxybenzotriazole [0074] HPLC = High pressure liquid chromatography

55 [0075] MeOH = Metanol [0076] MeOSuc = Metil hemisuccinilo/Metil hemisuccinato [0077] MTD = Dosis máxima tolerada [0078] NAA = Ácido 3-amino-4,4-difenilbutírico [0079] Nal = 2-Naftilalanina [0080] Naph = Ácido 1,8-naftaleno dicarboxílico [0081] Nle = Norleucina [0082] NMP = N-metilpirrolidina [0083] Nva = Norvalina [0084] Resina de PAM = 4-hidroximetilfenilacetamidometilo [0085] Pyg = Ácido piroglutámico [0086] Pyr = 3-Piridilalanina [0087] rRTOP = TOP de rata recombinante [0088] RT, rt = Temperatura ambiente [0089] Suc = Ácido succínico/Succinilo [0090] TCE = tricloroetilo [0091] TFA = Ácido trifluoroacético [0092] THF = Tetrahidrofurano [0093] Thi = 2-Tienilalanina [0094] Thz = Ácido tiazolidin-4-carboxílico [0095] Tic = Ácido tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico [0096] TOP = Oligopeptidasa Thimet [0075] MeOH = Methanol [0076] MeOSuc = Methyl hemisuccinyl / Methyl hemisuccinate [0077] BAT = Maximum tolerated dose [0078] NAA = 3-amino-4,4-diphenylbutyric acid [0079] Nal = 2-Naphthylalanine [0080] ] Naph = 1,8-Naphthalene dicarboxylic acid [0081] Nle = Norleucine [0082] NMP = N-methylpyrrolidine [0083] Nva = Norvaline [0084] PAM resin = 4-hydroxymethylphenylacetamidomethyl [0085] Pyg = Pyroglutamic acid [0086] Pyr = 3-Pyridylalanine [0087] rRTOP = TOP of recombinant rat [0088] RT, rt = Ambient temperature [0089] Suc = Succinic acid / Succinyl [0090] TCE = trichlorethyl [0091] TFA = Trifluoroacetic acid [0092] THF = Tetrahydrofuran [0093] Thi = 2-Thienylalanine [0094] Thz = Thiazolidin-4-carboxylic acid [0095] Tic = Tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid [0096] TOP = Thimet oligopeptidase

[0097] Se describen en la presente memoria compuestos que pueden describirse como formas profarmacológicas de agentes terapéuticos. El agente terapéutico se une directa o indirectamente a un oligopéptido, que a su vez se une a un grupo estabilizante. Opcionalmente puede estar presente un grupo enlazador entre el agente terapéutico y el oligopéptido. El oligopéptido tiene una longitud de al menos tres aminoácidos y, preferentemente, una longitud de tres a seis aminoácidos. El compuesto se caracteriza por su susceptibilidad a la escisión por la enzima CD10. [0097] Compounds that can be described as pro -macological forms of therapeutic agents are described herein. The therapeutic agent binds directly or indirectly to an oligopeptide, which in turn binds to a stabilizing group. Optionally a linker group may be present between the therapeutic agent and the oligopeptide. The oligopeptide has a length of at least three amino acids and, preferably, a length of three to six amino acids. The compound is characterized by its susceptibility to cleavage by the enzyme CD10.

Profármaco Prodrug

[0098] Más particularmente, el profármaco es una forma modificada de un agente terapéutico y comprende varias porciones, incluyendo: [0098] More particularly, the prodrug is a modified form of a therapeutic agent and comprises several portions, including:

(1)(one): un agente terapéutico, a therapeutic agent,

(2)(2): un oligopéptido, an oligopeptide,

(3)(3): un grupo estabilizante, y a stabilizing group, and

(4)(4): opcionalmente, un grupo enlazador. optionally, a linker group.

Dicho profármaco no forma parte de las reivindicaciones. Said prodrug is not part of the claims.

[0099] Cada una de las porciones del profármaco se analizan en más detalle a continuación. La orientación típica de estas porciones del profármaco es la siguiente: [0099] Each portion of the prodrug is discussed in more detail below. The typical orientation of these portions of the prodrug is as follows:

(grupo estabilizante)-(oligopéptido)-(grupo enlazador opcional)-(agente terapéutico) (stabilizing group) - (oligopeptide) - (optional linker group) - (therapeutic agent)

[0100] El grupo estabilizante se une directamente al oligopéptido en un primer sitio de unión del oligopéptido. El oligopéptido se une directa o indirectamente al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido. Si el oligopéptido y el agente terapéutico se unen indirectamente, entonces está presente un grupo enlazador. [0100] The stabilizing group binds directly to the oligopeptide at a first oligopeptide binding site. The oligopeptide binds directly or indirectly to the therapeutic agent at a second binding site of the oligopeptide. If the oligopeptide and the therapeutic agent bind indirectly, then a linker group is present.

[0101] El enlace directo de dos porciones del profármaco significa que existe un enlace covalente entre las dos porciones. El grupo estabilizante y el oligopéptido se unen por lo tanto directamente mediante un enlace químico covalente en el primer sitio de unión del oligopéptido, típicamente el extremo N-terminal del oligopéptido. Cuando el oligopéptido y el agente terapéutico se unen directamente, entonces se unen covalentemente entre sí en el segundo sitio de unión del oligopéptido. El segundo sitio de unión del oligopéptido es típicamente el extremo C-terminal del oligopéptido, pero puede ser otra parte del oligopéptido. [0101] The direct bond of two portions of the prodrug means that there is a covalent bond between the two portions. The stabilizing group and the oligopeptide are therefore directly linked by a covalent chemical bond at the first binding site of the oligopeptide, typically the N-terminal end of the oligopeptide. When the oligopeptide and the therapeutic agent bind directly, then they covalently bind each other at the second binding site of the oligopeptide. The second binding site of the oligopeptide is typically the C-terminal end of the oligopeptide, but may be another part of the oligopeptide.

[0102] El enlace indirecto de dos porciones del profármaco significa que cada una de las dos porciones se une covalente a un grupo enlazador. El profármaco puede tener un enlace indirecto del oligopéptido con el agente terapéutico. Por lo tanto, el oligopéptido se une covalentemente al grupo enlazador, que a su vez se une covalentemente al agente terapéutico. [0102] The indirect binding of two portions of the prodrug means that each of the two portions covalently binds to a linker group. The prodrug may have an indirect linkage of the oligopeptide with the therapeutic agent. Therefore, the oligopeptide covalently binds to the linker group, which in turn covalently binds to the therapeutic agent.

[0103] La orientación del profármaco puede invertirse, de modo que un grupo estabilizante se une al oligopéptido en el extremo C-terminal de estos oligopéptidos y el agente terapéutico se une directa o indirectamente al extremo N-terminal del oligopéptido. Por lo tanto, en una forma alternativa, el primer sitio de unión del oligopéptido puede ser el extremo C-terminal del oligopéptido y el segundo sitio de unión del oligopéptido puede ser el extremo N-terminal del oligopéptido. El grupo enlazador puede estar opcionalmente presente entre el agente terapéutico y el oligopéptido. Este profármaco alternativo funciona de la misma forma en que lo hace el primario. [0103] The orientation of the prodrug can be reversed, so that a stabilizing group binds to the oligopeptide at the C-terminal end of these oligopeptides and the therapeutic agent binds directly or indirectly to the N-terminal end of the oligopeptide. Therefore, in an alternative form, the first binding site of the oligopeptide can be the C-terminal end of the oligopeptide and the second binding site of the oligopeptide can be the N-terminal end of the oligopeptide. The linker group may optionally be present between the therapeutic agent and the oligopeptide. This alternative prodrug works the same way the primary does.

[0104] El profármaco descrito es típicamente escindible dentro de su porción oligopeptídica. Para que el profármaco sea eficaz, el profármaco típicamente experimenta una modificación in vivo que produce una porción del profármaco que es capaz de entrar en la célula diana. Una primera escisión dentro de la porción oligopeptídica del profármaco puede dejar una porción activa del profármaco, es decir, una porción del profármaco que sea competente para transportarse a la célula diana, como uno de los productos de escisión. Como alternativa, puede ser necesaria una escisión adicional por una o más peptidasas para dar como resultado una porción de transporte competente del profármaco. La porción activa o de transporte competente del profármaco tiene al menos el agente terapéutico y es esa parte del profármaco que puede entrar en la célula diana para ejercer un efecto terapéutico directamente o tras una conversión adicional dentro de la célula diana. [0104] The described prodrug is typically cleavable within its oligopeptide portion. For the prodrug to be effective, the prodrug typically undergoes an in vivo modification that produces a portion of the prodrug that is capable of entering the target cell. A first cleavage within the oligopeptide portion of the prodrug may leave an active portion of the prodrug, that is, a portion of the prodrug that is competent to be transported to the target cell, as one of the cleavage products. Alternatively, additional cleavage by one or more peptidases may be necessary to result in a competent transport portion of the prodrug. The competent active or transport portion of the prodrug has at least the therapeutic agent and is that part of the prodrug that can enter the target cell to exert a therapeutic effect directly or after additional conversion within the target cell.

[0105] Por lo tanto, el compuesto tiene una porción activa, y la porción activa es más capaz de entrar en la célula diana después de la escisión por una enzima asociada con una célula diana que antes de dicha escisión. Las estructuras del grupo estabilizante y del oligopéptido se seleccionan para limitar el aclaramiento y el metabolismo del profármaco por enzimas que pueden estar presentes en la sangre o en tejidos no diana, y se seleccionan adicionalmente para limitar el transporte del profármaco al interior de las células. El grupo estabilizante bloquea la escisión del profármaco por exopeptidasa in vivo y, además, puede actuar proporcionando una carga preferible u otras características físicas del profármaco. La secuencia de aminoácidos del oligopéptido se selecciona por su susceptibilidad a la escisión por CD10, una enzima asociada con células diana y descrita en más detalle a continuación. Se describen profármacos que tienen oligopéptidos de longitud variable, pero se describen preferentemente oligopéptidos de al menos tres aminoácidos y se describen especialmente preferentemente oligopéptidos de tres a seis aminoácidos. [0105] Therefore, the compound has an active portion, and the active portion is more capable of entering the target cell after cleavage by an enzyme associated with a target cell than before said cleavage. The structures of the stabilizing group and the oligopeptide are selected to limit clearance and metabolism of the prodrug by enzymes that may be present in the blood or in non-target tissues, and are additionally selected to limit the transport of the prodrug into the cells. The stabilizing group blocks excision of the prodrug by exopeptidase in vivo and, in addition, can act by providing a preferable load or other physical characteristics of the prodrug. The amino acid sequence of the oligopeptide is selected for its susceptibility to cleavage by CD10, an enzyme associated with target cells and described in more detail below. Prodrugs having oligopeptides of variable length are described, but oligopeptides of at least three amino acids are preferably described and oligopeptides of three to six amino acids are especially described.

[0106] Es deseable preparar un agente terapéutico, especialmente un agente terapéutico antitumoral y/o antiinflamatorio, inactivo por modificación del agente terapéutico a una forma profármaco. Las células diana descritas en la presente memoria son habitualmente células tumorales o células tales como macrófagos, neutrófilos y monocitos, que participan en reacciones inflamatorias, especialmente las asociadas con enfermedades reumáticas. La modificación del agente terapéutico a una forma profármaco también reduce algunos de los efectos secundarios de los agentes terapéuticos. [0106] It is desirable to prepare a therapeutic agent, especially an anti-tumor and / or anti-inflammatory therapeutic agent, inactive by modification of the therapeutic agent to a prodrug form. The target cells described herein are usually tumor cells or cells such as macrophages, neutrophils and monocytes, which participate in inflammatory reactions, especially those associated with rheumatic diseases. Modification of the therapeutic agent to a prodrug form also reduces some of the side effects of the therapeutic agents.

[0107] El profármaco se administra al paciente, se transporta a través del torrente sanguíneo en una forma estable y, cuando está en las proximidades de una célula diana, es reconocido y modificado por una enzima asociada a la célula diana. Puesto que la actividad enzimática está sólo mínimamente presente dentro de las proximidades extracelulares de las células normales, el profármaco no se activa y su porción de transporte competente (incluyendo el agente terapéutico) consigue la entrada en las células normales sólo mínimamente como mucho. En las proximidades de células tumorales u otras células diana, sin embargo, la presencia aumentada de la enzima pertinente en el entorno local causa la escisión del profármaco. Después de la modificación de la forma profármaco y de su entrada en la célula diana, el agente terapéutico (opcionalmente unido a uno o más aminoácidos y posiblemente también a un grupo enlazador) actúa destruyendo o bloqueando la proliferación de la célula diana. El ejemplo mostrado en la FIG. 2 representa un profármaco típico que se escinde extracelularmente y consigue la entrada en la célula diana. Una vez dentro de la célula diana, puede modificarse adicionalmente para proporcionar un efecto terapéutico. Aunque una porción del profármaco puede ocasionalmente conseguir acceso a y, posiblemente, dañar a células normales, la porción de transporte competente del profármaco se libera principalmente en las proximidades de células diana. Por lo tanto, se minimiza la toxicidad en células normales. [0107] The prodrug is administered to the patient, is transported through the bloodstream in a stable manner and, when in the vicinity of a target cell, is recognized and modified by an enzyme associated with the target cell. Since enzymatic activity is only minimally present within the extracellular proximities of normal cells, the prodrug is not activated and its competent transport portion (including the therapeutic agent) achieves entry into normal cells only minimally as much. In the vicinity of tumor cells or other target cells, however, the increased presence of the relevant enzyme in the local environment causes excision of the prodrug. After modification of the prodrug form and its entry into the target cell, the therapeutic agent (optionally bound to one or more amino acids and possibly also to a linker group) acts by destroying or blocking the proliferation of the target cell. The example shown in FIG. 2 represents a typical prodrug that is cleaved extracellularly and achieves entry into the target cell. Once inside the target cell, it can be further modified to provide a therapeutic effect. Although a portion of the prodrug may occasionally gain access to and possibly damage normal cells, the competent transport portion of the prodrug is released primarily in the vicinity of target cells. Therefore, toxicity in normal cells is minimized.

[0108] Los compuestos descritos en la presente memoria son buenos profármacos porque muestran una alta estabilidad, es decir, un bajo nivel de liberación del agente terapéutico activo en la circulación sistémica y en tejidos normales. Los profármacos descritos en la presente memoria no se activan en la sangre o tejidos normales en gran medida, pero se activan en sitios tumorales u otros sitios diana. Por consiguiente, tienen un índice terapéutico mejorado, un perfil toxicológico mejorado y una farmacocinética favorable en comparación con compuestos conocidos. [0108] The compounds described herein are good prodrugs because they show high stability, that is, a low level of active therapeutic agent release in systemic circulation and in normal tissues. The prodrugs described herein are not activated in the blood or normal tissues to a large extent, but they are activated in tumor sites or other target sites. Consequently, they have an improved therapeutic index, an improved toxicological profile and a favorable pharmacokinetics compared to known compounds.

[0109] Sin limitación a teoría particular alguna, se cree que los compuestos que tienen secuencias particulares reconocibles por CD10 se activan en las proximidades de las células diana por la enzima CD10 o una enzima de tipo termolisina similar. La CD10 está presente al menos durante cierta parte del ciclo vital de la célula diana. [0109] Without limitation to any particular theory, it is believed that compounds having particular sequences recognizable by CD10 are activated in the vicinity of the target cells by the CD10 enzyme or a similar thermolysin-like enzyme. CD10 is present at least during a certain part of the life cycle of the target cell.

[0110] Se describen en la presente memoria compuestos que pueden escindirse en la porción oligopeptídica por CD10 pero que son resientes a la escisión por la oligopeptidasa Thimet (“TOP”). Se cree que TOP es un miembro de una clase de enzimas descrita en más detalle en el documento WO 00/33888. El compuesto incluye preferentemente un oligopéptido que se caracteriza adicionalmente por su resistencia a la escisión por antígeno prostático específico (PSA). Dicha resistencia se mide en condiciones fisiológicas. [0110] Compounds that can be cleaved into the oligopeptide portion by CD10 but which are resistant to cleavage by Thimet oligopeptidase ("TOP") are described herein. TOP is believed to be a member of a class of enzymes described in more detail in WO 00/33888. The compound preferably includes an oligopeptide that is further characterized by its resistance to cleavage by prostate specific antigen (PSA). This resistance is measured in physiological conditions.

[0111] En la presente invención, un compuesto es resistente a la escisión por una enzima dada si la velocidad de escisión por una preparación purificada de la enzima dada no es superior al 15%, preferentemente no es superior al 5% e, idealmente, no es superior al 1% de la velocidad de escisión de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu conjugado a través del extremo carboxilo terminal al mismo agente terapéutico que el compuesto de interés. Los índices deberían compararse en las mismas condiciones de ensayo. [0111] In the present invention, a compound is resistant to cleavage by a given enzyme if the cleavage rate by a purified preparation of the given enzyme is not greater than 15%, preferably it is not greater than 5% and, ideally, is not greater than 1% of the cleavage rate of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu conjugated through the carboxyl terminal end to the same therapeutic agent as the compound of interest. The indices should be compared under the same test conditions.

[0112] En la presente invención, un compuesto puede escindirse por una enzima dada si más del 10% por hora, preferentemente más del 50% por hora del compuesto se escinde tras la incubación del compuesto y la enzima en condiciones experimentales que sirvan de modelo de las condiciones fisiológicas, particularmente las de fuera de la célula diana. La concentración de la enzima dada en condiciones experimentales debería ser representativa de la concentración de la enzima dada en el medio extracelular del tejido diana. [0112] In the present invention, a compound can be cleaved by a given enzyme if more than 10% per hour, preferably more than 50% per hour of the compound is cleaved after incubation of the compound and the enzyme under experimental conditions that serve as a model of physiological conditions, particularly those outside the target cell. The concentration of the enzyme given under experimental conditions should be representative of the concentration of the enzyme given in the extracellular medium of the target tissue.

[0113] Como se describe en la presente memoria, un compuesto comprende: [0113] As described herein, a compound comprises:

(1)(one): un agente terapéutico capaz de entrar en una célula diana, a therapeutic agent capable of entering a target cell,

(2)(2): un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m, en la que: an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ’- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

(3)(3): un grupo estabilizante, y a stabilizing group, and

(4)(4): opcionalmente, un grupo enlazador, optionally, a linker group,

en el que el oligopéptido se une directamente al grupo estabilizante en un primer sitio de unión del oligopéptido y el oligopéptido se une directamente al agente terapéutico o se une indirectamente a través del grupo enlazador al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, en el que el grupo estabilizante obstaculiza la escisión del compuesto por enzimas presentes en sangre completa, y en el que el compuesto puede escindirse por CD10. Preferentemente, n es 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3. El compuesto puede escindirse por CD10 en condiciones fisiológicas. wherein the oligopeptide binds directly to the stabilizing group at a first binding site of the oligopeptide and the oligopeptide binds directly to the therapeutic agent or binds indirectly through the linker group to the therapeutic agent at a second oligopeptide binding site, in which the stabilizing group hinders the cleavage of the compound by enzymes present in whole blood, and wherein the compound can be cleaved by CD10. Preferably, n is 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3. The compound can be cleaved by CD10 under physiological conditions.

[0114] Los compuestos descritos en la presente memoria no incluyen los descritos específicamente en la técnica. Por ejemplo, el documento WO 00/33888, la Patente de Estados Unidos Nº 5.962.216, los documentos WO 00/69472, WO 98/52966, la Patente de Estados Unidos Nº 5.599.686 y otras publicaciones pueden ser relevantes. Por lo tanto, si el oligopéptido del compuesto es Leu-Ala-Leu, entonces el grupo estabilizante no es succinilo o Ala [0114] The compounds described herein do not include those specifically described in the art. For example, WO 00/33888, U.S. Patent No. 5,962,216, WO 00/69472, WO 98/52966, U.S. Patent No. 5,599,686 and other publications may be relevant. Therefore, if the compound oligopeptide is Leu-Ala-Leu, then the stabilizing group is not succinyl or Ala

o el agente terapéutico no es uno de doxorrubicina y daunorrubicina. De forma similar, si el oligopéptido es Ala-Leu-Ala-Leu, entonces el grupo estabilizante no es succinilo o el agente terapéutico no es uno de doxorrubicina y daunorrubicina. Si el oligopéptido es Ala-Leu-Ala-Leu, entonces el grupo estabilizante no es glutarilo o el agente terapéutico no es doxorrubicina. Además, el compuesto no se selecciona entre el grupo que consiste en Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, pGlu-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, D-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, D-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, D-Leu-D-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, Acetil-His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln-Dox, Morfolinocarbonil-His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln-Leu-Dox, N-(2hidroxipropil)metacrilamida-Gly-Phe-Leu-Gly-Dox, N-glutaril-(4-hidroxiprolil)-Ala-Ser-ciclohexilglicina-Gln-Ser-Leu-Dox, N-Cbz-Gly-Phe-Ala-Leu-Dox y N-Cbz-Gly-Phe-Ala-Leu-PABC-Dox. or the therapeutic agent is not one of doxorubicin and daunorubicin. Similarly, if the oligopeptide is laAla-Leu-Ala-Leu, then the stabilizing group is not succinyl or the therapeutic agent is not one of doxorubicin and daunorubicin. If the oligopeptide is Ala-Leu-Ala-Leu, then the stabilizing group is not glutaryl or the therapeutic agent is not doxorubicin. In addition, the compound is not selected from the group consisting of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, pGlu-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, D-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, D -Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, D-Leu-D-Ala-Leu-Ala-Leu-Dnr, Acetyl-His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln-Dox, Morfolinocarbonil-His-Ser -Ser-Lys-Leu-Gln-Leu-Dox, N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide-Gly-Phe-Leu-Gly-Dox, N-glutaryl- (4-hydroxypropyl) -Ala-Ser-cyclohexylglycine-Gln-Ser- Leu-Dox, N-Cbz-Gly-Phe-Ala-Leu-Dox and N-Cbz-Gly-Phe-Ala-Leu-PABC-Dox.

Enzimas asociadas a células diana Enzymes associated with target cells

[0115] Los profármacos descritos en la presente memoria están diseñados para aprovechar la activación preferente, a través de la interacción con una enzima asociada con la célula diana, en o próxima al sitio diana dentro del cuerpo del paciente. La totalidad de la enzima asociada a célula diana, o al menos el sitio activo de la enzima asociada a célula diana, puede asociarse con o unirse en la superficie externa de la célula. Como alternativa, la enzima asociada a célula diana puede secretarse, liberarse o estar presente de alguna otra forma en las proximidades extracelulares de la célula diana. [0115] The prodrugs described herein are designed to take advantage of preferential activation, through interaction with an enzyme associated with the target cell, at or near the target site within the patient's body. The entire enzyme associated with the target cell, or at least the active site of the enzyme associated with the target cell, can be associated with or attached to the outer surface of the cell. Alternatively, the enzyme associated with the target cell can be secreted, released or otherwise present in the extracellular vicinity of the target cell.

[0116] A modo de antecedentes, un tipo de enzima asociada a célula diana es la trouasa, descrita en más detalle en el documento WO 00/33888. Se cree que la trouasa es una clase de enzimas de la que la oligopeptidasa Thimet (“TOP”) es un miembro. Las trouasas son altamente discriminantes en su selectividad y escisión. La trouasa es una endopeptidasa que muestra un grado notable de discriminación entre leucina e isoleucina en el lado carboxilo del sitio de escisión del oligopéptido. Una característica destacada es que, en condiciones de ensayo apropiadas, la trouasa escinde fácilmente la succinil-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorrubicina, mientras que es al menos veinte veces menos activa con la succinil-Ala-Ile-Ala-Leu-Daunorrubicina. [0116] By way of background, a type of enzyme associated with a target cell is trouasa, described in more detail in WO 00/33888. It is believed that trouasa is a class of enzymes of which Thimet oligopeptidase ("TOP") is a member. The trouasas are highly discriminating in their selectivity and excision. The trouasa is an endopeptidase that shows a remarkable degree of discrimination between leucine and isoleucine on the carboxyl side of the oligopeptide cleavage site. A prominent feature is that, under appropriate test conditions, trouasa readily cleaves succinyl-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin, while it is at least twenty times less active with succinyl-Ala-Ile-Ala- Leu-Daunorubicin.

[0117] Otra enzima asociada a célula diana y de una importancia particular pero distinta de las enzimas trouasas es CD10. [0117] Another enzyme associated with a target cell and of a particular importance but distinct from trouasas enzymes is CD10.

Historia de CD10 CD10 history

[0118] La primera información de CD10 era una actividad en las membranas de borde en cepillo de riñón de rata capaz de hidrolizar la cadena B de 125 yodoinsulina a pH neutro (Wong-Leung et al., “Some properties of a microsomal peptidase in rat kidney”, Biochem. J. 110: 5P (1968)). La enzima se denomina por lo tanto proteinasa neutral del borde en cepillo renal. Se demostró que la enzima era una metalopeptidasa (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). CD10 se redescubrió independientemente como una enzima de membrana cerebral responsable de la inactivación de las encefalinas (Malfroy et al., “High-affinity enkephalindegrading peptidase is increased after morphine”, Nature, 276: 523-526 (1978)), que condujo al uso del nombre trivial encefalinasa. CD10 también se denomina comúnmente neprilisina o endopeptidasa neutra 24.11 o EC [0118] The first information of CD10 was an activity in the rat kidney brush border membranes capable of hydrolyzing the 125 iodoinsulin B chain at neutral pH (Wong-Leung et al., “Some properties of a microsomal peptidase in rat kidney ”, Biochem. J. 110: 5P (1968)). The enzyme is therefore called neutral border proteinase in the renal brush. The enzyme was shown to be a metallopeptidase (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). CD10 was rediscovered independently as a brain membrane enzyme responsible for the inactivation of encephalin (Malfroy et al., "High-affinity enkephalindegrading peptidase is increased after morphine", Nature, 276: 523-526 (1978)), which led to use of the trivial name enkephalinase. CD10 is also commonly called neprilysin or neutral endopeptidase 24.11 or EC

3.4.24.11 o NEP en la bibliografía. La clonación y secuenciación de la enzima (Devault et al., “Amino acid sequence of rabbit kidney neutral endopeptidase-24.11 (enkephalinase) deduced from a complementary DNA”, EMBO J, 6: 1317-1322 (1987)) condujo al reconocimiento de que era idéntica a un antígeno de superficie celular de leucocitos, el antígeno de leucemia linfoblástica aguda común (CALLA o CD10) que está presente en un grupo de leucemias de células pre-B (LeTarte et al., “Common acute lymphocytic leukemia antigen is identical to neutral endopeptidase”, J. Exp. Med, 168: 1247-1253 (1988)). 3.4.24.11 or NEP in the bibliography. Enzyme cloning and sequencing (Devault et al., "Amino acid sequence of rabbit kidney neutral endopeptidase-24.11 (enkephalinase) deduced from a complementary DNA", EMBO J, 6: 1317-1322 (1987)) led to the recognition of which was identical to a leukocyte cell surface antigen, the common acute lymphoblastic leukemia antigen (CALLA or CD10) that is present in a group of pre-B cell leukemia (LeTarte et al., “Common acute lymphocytic leukemia antigen is identical to neutral endopeptidase ”, J. Exp. Med, 168: 1247-1253 (1988)).

Actividad Biológica de CD10 Biological Activity of CD10

[0119] CD10 es esencialmente una oligopeptidasa que hidroliza péptidos de hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, aunque generalmente la eficacia de la hidrólisis disminuye a medida que aumenta la longitud del péptido. Uno de los sustratos hidrolizados más eficazmente es el undecapéptido sustancia P (Matsas et al., “The metabolism of neuropeptides: the hydrolysis of peptides, including enkephalins, tachykinins and their analogues by endopeptidase-24.11”, Biochem J, 223: 433-440 (1984)). Los sustratos principales in vivo parecen ser las encefalinas, taquicininas tales como sustancia P y la familia del péptido natriurético atrial. [0119] CD10 is essentially an oligopeptidase that hydrolyzes peptides up to about 40 amino acids in length, although generally the efficiency of hydrolysis decreases as the length of the peptide increases. One of the most effectively hydrolyzed substrates is the undecapeptide substance P (Matsas et al., "The metabolism of neuropeptides: the hydrolysis of peptides, including enkephalins, tachykinins and their analogues by endopeptidase-24.11", Biochem J, 223: 433-440 (1984)). The main substrates in vivo appear to be enkephalin, tachykinins such as substance P and the atrial natriuretic peptide family.

[0120] El requisito de especificidad principal de acuerdo con la bibliografía es un resto hidrófobo voluminoso en la posición P1’, funcionando la enzima normalmente como una endopeptidasa. La Leu en la posición P1’ proporciona las mayores velocidades de hidrólisis mientras que la Phe muestra los menores valores de Km. El sustrato de menor tamaño identificado en la bibliografía es el péptido quimiotáctico formil-Met-Leu-Phe, produciéndose la escisión en el enlace Met+Leu (Connelly et al., “Neutral endopeptidase 24.11 in human neutrophils: cleavage of chemotactic peptide”, Proc. Natl Acad. Sci., USA, 86: 7103-7107 (1985)). [0120] The main specificity requirement according to the literature is a bulky hydrophobic moiety in the P1 ’position, the enzyme functioning normally as an endopeptidase. The Leu in the P1 'position provides the highest hydrolysis rates while the Phe shows the lowest Km values. The smallest substrate identified in the literature is the formyl-Met-Leu-Phe chemotactic peptide, with cleavage occurring in the Met + Leu link (Connelly et al., "Neutral endopeptidase 24.11 in human neutrophils: cleavage of chemotactic peptide", Proc. Natl Acad. Sci., USA, 86: 7103-7107 (1985)).

[0121] La enzima tiene un sitio activo prolongado que aloja al menos cuatro cadenas laterales de aminoácidos. Una secuencia de consenso para una hidrólisis eficaz por CD10 se sugiere como: -Phe-Phe-Gly+Phe-Leu-(Ala)(Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). Con algunos sustratos, CD10 presenta carácter de peptidil-dipeptidasa, por ejemplo en la hidrólisis de [Leu]-encefalina: Tyr-Gly-Gly+Phe-Leu (kcat/Km 43,9 min-1 mM-1). El derivado C-terminalmente amidado de [Leu]-encefalina se hidroliza mucho menos eficazmente (kcavKm 1,7 min-1 mm-1), reflejando la interacción del grupo carboxilato C-terminal libre en la [Leu]-encefalina con un resto arginilo (Arg102) en el sitio activo de la enzima (Bateman et al., “Identification of the active site arginine in rate neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) as Arg 102 and analysis of a glutamine 102 mutant”, J. Biol. Chem, 264: 6151-6157 (1989)). Los ejemplos de posiciones de escisión en otros sustratos biológicamente activos son para la sustancia P, Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln+Phe+-Phe-Gly+Leu-Met-NH2, produciéndose la hidrólisis más rápida en el enlace Gly+Leu, lo que concuerda con la secuencia de consenso para la hidrólisis. En la neurotensina se observan los siguientes sitios de hidrólisis: Pyg-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro+Tyr+Ile-Leu, y en la colecistocinina-8, Asp-Tyr-Met-Gly+Trp-Met-Asp+Phe-NH2. Los valores de Km para sustratos sintéticos y péptidos naturales están habitualmente en el intervalo de 10 M-1 mM. [0121] The enzyme has a prolonged active site that hosts at least four amino acid side chains. A consensus sequence for effective hydrolysis by CD10 is suggested as: -Phe-Phe-Gly + Phe-Leu- (Ala) (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). With some substrates, CD10 has a peptidyl dipeptidase character, for example in the hydrolysis of [Leu] -encephalin: Tyr-Gly-Gly + Phe-Leu (kcat / Km 43.9 min-1 mM-1). The C-terminal amidated derivative of [Leu] -encephalin is hydrolyzed much less efficiently (kcavKm 1.7 min-1 mm-1), reflecting the interaction of the free C-terminal carboxylate group in the [Leu] -encephalin with a residue arginyl (Arg102) at the active site of the enzyme (Bateman et al., "Identification of the active site arginine in rate neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) as Arg 102 and analysis of a glutamine 102 mutant", J. Biol. Chem, 264: 6151-6157 (1989)). Examples of cleavage positions in other biologically active substrates are for substance P, Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln + Phe + -Phe-Gly + Leu-Met-NH2, with faster hydrolysis occurring in the Gly bond + Leu, which is consistent with the consensus sequence for hydrolysis. The following hydrolysis sites are observed in neurotensin: Pyg-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro + Tyr + Ile-Leu, and in cholecystokinin-8, Asp-Tyr-Met- Gly + Trp-Met-Asp + Phe-NH2. Km values for synthetic substrates and natural peptides are usually in the range of 10 M-1 mM.

[0122] De acuerdo con la bibliografía, CD10 presenta un pH óptimo de 6,0 (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). Se inhibe por reactivos quelantes de cinc y se han diseñado una diversidad de inhibidores sintéticos de la enzima, de los cuales el primero fue tiorfano ([DL-3-mercapto-2bencilpropanoil]glicina). [0122] According to the literature, CD10 has an optimum pH of 6.0 (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). It is inhibited by zinc chelating reagents and a variety of synthetic enzyme inhibitors have been designed, of which the first was thiorphane ([DL-3-mercapto-2-benzylpropanoyl] glycine).

Química estructural de CD10 Structural chemistry of CD10

[0123] CD10 es una proteína integral de membrana de tipo II de la membrana plasmática; existe como una ectoenzima, mirando la parte voluminosa de la proteína, incluyendo el sitio activo, hacia el espacio extracelular. Está compuesta por un dominio citoplasmático N-terminal de 23 aminoácidos, un dominio transmembrana de 28 aminoácidos y un dominio extracelular de aproximadamente 700 aminoácidos que contiene el sitio activo (Li et al., “Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization”, Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995)). Contiene 1 mol de cinc por subunidad. Los enlaces disulfuro intracatenarios son importantes para el mantenimiento de la estructura y la actividad. El Mr de CD10 varía de aproximadamente 85000 a 100000 dependiendo de la fuente de tejido, pudiendo la variación atribuirse a diferencias en la glicosilación. La clonación de ADNc puso de manifiesto [0123] CD10 is a plasma membrane type II integral protein; It exists as an ectoenzyme, looking at the bulky part of the protein, including the active site, towards the extracellular space. It is composed of an N-terminal cytoplasmic domain of 23 amino acids, a transmembrane domain of 28 amino acids and an extracellular domain of approximately 700 amino acids that contains the active site (Li et al., “Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization”, Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995)). It contains 1 mole of zinc per subunit. Intracatenary disulfide bonds are important for the maintenance of structure and activity. The Mr of CD10 varies from approximately 85,000 to 100,000 depending on the tissue source, the variation being able to be attributed to differences in glycosylation. The cDNA cloning revealed

que las enzimas de conejo, rata y ser humano consisten en polipéptidos de 750, 742 y 742 aminoácidos, respectivamente (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). [0124] CD10 está fuertemente glicosilada con cinco o seis sitios de glicosilación ligada a N, dependiendo de la especie. Parece no haber otras modificaciones postraduccionales de la enzima ni se ha identificado ningún inhibidor natural circulante. El gen de CD10, localizado en la región cromosómica 3q21-q27, existe en una sola copia, abarca más de 80 kb, está compuesto por 24 exones y está altamente conservado entre especies de mamífero (Barker et al., “The common acute lymphoblastic leukemia antigen maps to chromosomal region 3(q21-q27)”, J. Immunol, 142: 283-287 (1989)). that rabbit, rat and human enzymes consist of 750, 742 and 742 amino acid polypeptides, respectively (Neprilysin, Turner, Handbook of Proteolytic Enzymes 1080-1085 (1998)). [0124] CD10 is strongly glycosylated with five or six N-linked glycosylation sites, depending on the species. There appear to be no other post-translational modifications of the enzyme nor have any inhibitors been identified. natural circulating The CD10 gene, located in chromosomal region 3q21-q27, exists in a single copy, encompasses more than 80 kb, it is composed of 24 exons and is highly conserved among mammalian species (Barker et al., "The common acute lymphoblastic leukemia antigen maps to chromosomal region 3 (q21-q27)", J. Immunol, 142: 283-287 (1989)).

[0125] El dominio C-terminal de CD10 contiene el motivo de unión a cinc HEXXH típico de muchas peptidasas de cinc. Las histidinas en este motivo (His583 y 587 en la secuencia de conejo) constituyen dos de los ligandos de cinc, actuando un glutamato en la posición 646 como el tercer ligando de cinc. La Glu584 es esencial para la catálisis. [0125] The C-terminal domain of CD10 contains the HEXXH zinc binding motif typical of many zinc peptidases. Histidines in this motif (His583 and 587 in the rabbit sequence) constitute two of the zinc ligands, glutamate acting at position 646 as the third zinc ligand. Glu584 is essential for catalysis.

Biología de CD10 CD10 Biology

[0126] CD10 muestra una amplia distribución tisular, pero la actividad de la enzima es bastante variable entre diferentes tejidos. Se ha descubierto que el riñón tiene la mayor concentración de CD10, y que la enzima se localiza principalmente en las membranas de borde en cepillo de los túbulos proximales renales (A. J. Kenny, Trends Biochem. Sci. 11, 40 (1986)). [0126] CD10 shows a wide tissue distribution, but the activity of the enzyme is quite variable between different tissues. It has been found that the kidney has the highest concentration of CD10, and that the enzyme is primarily located in the brush-edge membranes of the renal proximal tubules (A. J. Kenny, Trends Biochem. Sci. 11, 40 (1986)).

[0127] Se encuentra una concentración relativamente alta de CD10 en membranas de las células epiteliales de borde en cepillo del intestino, ganglios linfáticos y placenta, mientras que se localizan niveles significativos de la enzima en células musculares en el estómago, intestino delgado y colon (A. J. Kenny, S. L. Stephenson y A. J. Turner, en “Mammalian Ectoenzymes” (A. J. Kenny and A. J. Turner, eds.), pág. 169. Elsevier, Amsterdam, (1987)). Se encuentra CD10 en menores concentraciones en glándulas suprarrenales, testículos, próstata, fibroblastos, neutrófilos y pulmón (A. J. Kenny, S. L. Stephenson y A. J. Turner, en “Mammalian Ectoenzymes” (A. J. Kenny and [0127] A relatively high concentration of CD10 is found in brush border epithelial cell membranes of the intestine, lymph nodes and placenta, while significant levels of the enzyme are located in muscle cells in the stomach, small intestine and colon ( AJ Kenny, SL Stephenson and AJ Turner, in “Mammalian Ectoenzymes” (AJ Kenny and AJ Turner, eds.), Page 169. Elsevier, Amsterdam, (1987)). CD10 is found in lower concentrations in the adrenal glands, testicles, prostate, fibroblasts, neutrophils and lungs (A. J. Kenny, S. L. Stephenson and A. J. Turner, in “Mammalian Ectoenzymes” (A. J. Kenny and

A. J. Turner, eds.), pág. 169. Elsevier, Amsterdam, (1987); N. Sales, I. Dutriez, B. Maziere, M. Ottaviani y B. P. Roques, Regul. Pept. 33, 209 (1991)). En el tracto respiratorio superior, se cree que la enzima aparece en células epiteliales, células serosas de las glándulas submucosas y paredes de los vasos (J. N. Baraniuk, K. Ohkubo, O. J. Kwon, J. Mak, J. Rohde, M. A. Kaliner, S. R. Durham y P. J. Barnes, J. Appl. Physiol. 74, 272 (1993)). El descubrimiento de CD10 en endometrio humano, donde está confinado a las células estromales, sugiere un posible papel en la regulación del ciclo ovulatorio (M. L. Casey, J. W. Smith, K. Nagai, L. B. Hersh y P. C. MacDonald, J. Biol. Chem. 266, 23041 (1991); J. R. Head, P. C. MacDonald y M. L. Casey, J. Clin. Endocrinol. Metab. 76, 769 (1993)). A. J. Turner, eds.), P. 169. Elsevier, Amsterdam, (1987); N. Sales, I. Dutriez, B. Maziere, M. Ottaviani and B. P. Roques, Regul. Pept 33, 209 (1991)). In the upper respiratory tract, the enzyme is believed to appear in epithelial cells, serous cells of the submucosal glands and vessel walls (JN Baraniuk, K. Ohkubo, OJ Kwon, J. Mak, J. Rohde, MA Kaliner, SR Durham and PJ Barnes, J. Appl. Physiol. 74, 272 (1993)). The discovery of CD10 in human endometrium, where it is confined to stromal cells, suggests a possible role in the regulation of the ovulatory cycle (ML Casey, JW Smith, K. Nagai, LB Hersh and PC MacDonald, J. Biol. Chem. 266 , 23041 (1991); JR Head, PC MacDonald and ML Casey, J. Clin. Endocrinol. Metab. 76, 769 (1993)).

[0128] En el cerebro de mamífero, se ha descubierto CD10 en concentraciones relativamente elevadas en el plexo coroideo, la sustancia negra, caudado, putamen, globo pálido, tubérculo olfatorio, núcleo acuminado y la sustancia gelatinosa de la médula espinal. La enzima también se detectó en las meninges de la médula espinal de rata y ser humano (G. Waksman, R. Bouboutou, J. Devin, R. Besselievre, M. C. Foumie-Zaluski y B. P. Roques, Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 262 (1985); J. M. Zajac, Y. Charnay, J. M. Soleilhac, N. Sales y B. P. Roques, FEBS Lett. 216, 118 (1987)). [0128] In the mammalian brain, CD10 has been discovered in relatively high concentrations in the choroid plexus, the black substance, caudate, putamen, pale globe, olfactory tubercle, accumulated nucleus and the spinal cord gelatinous substance. The enzyme was also detected in the meninges of the rat and human spinal cord (G. Waksman, R. Bouboutou, J. Devin, R. Besselievre, MC Foumie-Zaluski and BP Roques, Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 262 (1985); JM Zajac, Y. Charnay, JM Soleilhac, N. Sales and BP Roques, FEBS Lett. 216, 118 (1987)).

Purificación de CD10 CD10 purification

[0129] CD10 puede purificarse por aplicación de cromatografía de inmunoafinidad empleando un anticuerpo monoclonal después de la solubilización de la enzima a partir de la membrana por tratamiento con detergente. También se han aplicado procedimientos cromatográficos convencionales en la purificación de CD10. Se ha conseguido la expresión y purificación a gran escala de neprilisina o CD10 recombinante a partir de una línea celular de insecto infectada con baculovirus. Se describen adicionalmente métodos de purificación en Li et al., “Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization”, Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995). [0129] CD10 can be purified by application of immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody after solubilization of the enzyme from the membrane by treatment with detergent. Conventional chromatographic procedures have also been applied in the purification of CD10. Large-scale expression and purification of recombinant neprilysin or CD10 has been achieved from an insect cell line infected with baculovirus. Purification methods are further described in Li et al., "Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization", Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995).

Ensayos para CD10 Tests for CD10

[0130] Un ensayo de dos fases particularmente conveniente y sensible para CD10, que puede adaptarse a un ensayo en placa de microtitulación, implica el sustrato Suc-Ala-Ala+Leu-NHPhNO2 en presencia de aminopeptidasa de S. griseus como enzima de acoplamiento (Indig et al., “Investigation of neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) and of neutral proteinases (EC 3.4.24.4) using a new two-stage enzymatic reaction”, FEBS, 255: 237-240 (1989)). La liberación de Leu-NHPhNO2 por CD10 viene seguida de la liberación por aminopeptidasa del grupo saliente 4nitroanilina que puede controlarse a 405 nm. [0130] A particularly convenient and sensitive two-phase test for CD10, which can be adapted to a microtiter plate assay, involves the substrate Suc-Ala-Ala + Leu-NHPhNO2 in the presence of S. griseus aminopeptidase as coupling enzyme (Indig et al., "Investigation of neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) and of neutral proteinases (EC 3.4.24.4) using a new two-stage enzymatic reaction", FEBS, 255: 237-240 (1989)). The release of Leu-NHPhNO2 by CD10 is followed by the release by aminopeptidase of the leaving group 4nitroaniline which can be controlled at 405 nm.

[0131] Se usan varios otros métodos de ensayo para seguir la actividad de CD10. Estos incluyen un ensayo radiométrico que mide la hidrólisis de derivados de encefalina tritiada, ensayos fluorométricos que siguen la hidrólisis de péptidos sintéticos que contienen un fluoróforo y ensayos que siguen la escisión de sustratos inactivados internamente (Li et al., “Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization”, Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995)). [0131] Several other test methods are used to track the activity of CD10. These include a radiometric assay that measures the hydrolysis of tritiated enkephalin derivatives, fluorometric assays that follow the hydrolysis of synthetic peptides containing a fluorophore and assays that follow the cleavage of internally inactivated substrates (Li et al., "Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization ”, Methods in Enzymology, 248: 253-263 (1995)).

CD10 en células diana CD10 in target cells

[0132] La CD10 se expresa por células precursoras linfoides, linfocitos B de centros germinales y algunos mielocitos y, por lo tanto, se usa ampliamente como marcador de superficie celular para la categorización de leucemias agudas y la subclasificación de linfomas malignos. CD10 se expresa ampliamente en carcinomas de los tractos gastrointestinal y genitourinario y en algunos sarcomas, y puede ser un marcador útil para el diagnóstico diferencial de estos tumores (Chu et al., “Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frecuent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma”, Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)). [0132] CD10 is expressed by lymphoid precursor cells, B germ cell lymphocytes and some myelocytes and, therefore, is widely used as a cell surface marker for categorizing acute leukemia and subclassifying malignant lymphomas. CD10 is widely expressed in carcinomas of the gastrointestinal and genitourinary tracts and in some sarcomas, and may be a useful marker for the differential diagnosis of these tumors (Chu et al., “Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frecuent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma ”, Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)).

[0133] Se ha descubierto que el antígeno CD10 está ampliamente asociado con leucemias linfoblásticas agudas de células B precursoras (Greaves et al., “Selective expression of the common acute lymphoblastic leukemia (gp100) antigen on immature lymphoid cells and their malignant counterparts”, Blood, 61: 628-639 (1983)). CD10 también está asociada con leucemias linfoblásticas agudas de células T (Weiss et al., “Lymphoblastic lymphoma: an immunophenotype study of 26 cases with comparison to T cell acute lymphoblastic leukemia,” Blood, 67: 474-478 (1986)). [0133] It has been found that the CD10 antigen is widely associated with acute lymphoblastic precursor B cell leukemia (Greaves et al., "Selective expression of the common acute lymphoblastic leukemia (gp100) antigen on immature lymphoid cells and their malignant counterparts", Blood, 61: 628-639 (1983)). CD10 is also associated with acute lymphoblastic T-cell leukemia (Weiss et al., "Lymphoblastic lymphoma: an immunophenotype study of 26 cases with comparison to T cell acute lymphoblastic leukemia," Blood, 67: 474-478 (1986)).

[0134] CD10 se expresa ampliamente en neoplasias del tracto genitourinario, incluyendo carcinoma de células renales, carcinoma de células de transición y adenocarcinoma prostático (Chu et al., “Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma", Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)). Además, los sarcomas estromales endometriales, rabdomiosarcomas, adenocarcinomas pancreáticos, el schwannoma y el melanoma maligno son positivos para CD10 (Chu et al., “Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma", Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)). La positividad a CD10 estaba limitada a la superficie apical de las células glandulares malignas de adenocarcinoma de colon, páncreas y próstata bien diferenciado, mientras que en el adenocarcinoma escasamente diferenciado y otros tumores, tales como melanoma, carcinoma de células de transición, carcinoma de células renales y sarcoma estromal endometrial, la positividad a CD10 mostraba patrones citoplasmáticos o membranosos/Golgi difusos (Chu et al., “Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma," Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)). [0134] CD10 is widely expressed in genitourinary tract neoplasms, including renal cell carcinoma, transitional cell carcinoma and prostate adenocarcinoma (Chu et al., "Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma ", Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000). In addition, endometrial stromal sarcomas, rhabdomyosarcomas, pancreatic adenocarcinomas, schwannoma and malignant melanoma are positive for CD10 (Chu et al., "Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma", Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)). CD10 positivity was limited to the apical surface of the malignant glandular cells of colon adenocarcinoma, pancreas and prostate well differentiated, while in poorly differentiated adenocarcinoma and other tumors, such as melanoma, transitional cell carcinoma, cell carcinoma Renal and endometrial stromal sarcoma, CD10 positivity showed diffuse cytoplasmic or Golgi / Golgi patterns (Chu et al., "Paraffin-Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma," Am J Clin Pathol, 113: 374-382 (2000)).

Especificidad de sustrato Substrate specificity

[0135] La bibliografía contiene varias pistas en relación con los sustratos preferidos para CD10. Dos estudios, Pozsgay et al., “Substrate and Inhibitor Studies of Thermolysin-like Neutral Metalloendopeptidase From Kidney Membrane Fractions. Comparison with Bacterial Thermolysin”, Biochemistry. 25: 1292-1299 (1986), y Hersh et al., “Comparison of the Subsite Specificity of the Mammalian Neutral Endopeptidase 24.11 (Enkephalinase) to the Bacterial Neutral Endopeptidase Thermolysin”, The Journal of Biological Chemistry, 261: 6433-6437 (1986) han descrito en detalle la especificidad de sustrato de CD10. Ambas publicaciones se incorporan en la presente memoria como referencia. A continuación se proporciona un breve resumen de los resultados de especificidad de sustrato obtenidos en estas dos publicaciones. [0135] The literature contains several clues in relation to the preferred substrates for CD10. Two studies, Pozsgay et al., “Substrate and Inhibitor Studies of Thermolysin-like Neutral Metalloendopeptidase From Kidney Membrane Fractions. Comparison with Bacterial Thermolysin ”, Biochemistry. 25: 1292-1299 (1986), and Hersh et al., "Comparison of the Subsite Specificity of the Mammalian Neutral Endopeptidase 24.11 (Enkephalinase) to the Bacterial Neutral Endopeptidase Thermolysin", The Journal of Biological Chemistry, 261: 6433-6437 ( 1986) have described in detail the substrate specificity of CD10. Both publications are incorporated herein by reference. A brief summary of the substrate specificity results obtained in these two publications is provided below.

[0136] El sustrato óptimo para CD10 sería un oligopéptido de fórmula AAP3-AAP2 -AAP1-AAP1'-AAP2'-AAP3', en la que: [0136] The optimal substrate for CD10 would be an oligopeptide of formula AAP3-AAP2 -AAP1-AAP1'-AAP2'-AAP3 ', in which:

AAP3 es Phe o Ala AAP3 is Phe or Ala

AAP2 es Phe, AAP2 is Phe,

AAP1 es Gly o Ala AAP1 is Gly or Ala

AAP1' es Phe o Leu AAP1 'is Phe or Leu

AAP2' es Leu AAP2 'is Leu

AAP3' es Ala AAP3 'is Ala

De estos restos, la posición P3' parece ser la menos importante de acuerdo con la bibliografía. Of these remains, position P3 'seems to be the least important according to the literature.

[0137] La especificidad primaria de esta metaloendopeptidasa unida a membrana está dirigida hacia enlaces peptídicos en el lado amino de restos de aminoácidos hidrófobos. Como otras proteasas, esta enzima tiene un sitio de unión a sustrato prolongado que aloja al menos cuatro restos de aminoácidos. El sitio activo de la enzima contiene aparentemente un bolsillo hidrófobo en el subsitio S1' que interacciona con las cadenas laterales de restos de aminoácidos hidrófobos. [0137] The primary specificity of this membrane-bound metalloendopeptidase is directed towards peptide bonds on the amino side of hydrophobic amino acid residues. Like other proteases, this enzyme has a prolonged substrate binding site that hosts at least four amino acid residues. The active site of the enzyme apparently contains a hydrophobic pocket in subsite S1 'that interacts with the side chains of hydrophobic amino acid residues.

[0138] Las constantes de velocidad de renovación (kcat) y la constante de especificidad (kcat/km) aumentan enormemente cuando un resto Gly en el P1' se sustituye por restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas. Por lo tanto, la sustitución del resto Gly por una Leu causa un aumento de 140 veces en la constante de velocidad de renovación y un aumento de 370 veces en la constante de especificidad. Sin embargo, se observa una disminución en estos parámetros cuando un resto Leu se sustituye por un resto Phe, y aún más por un resto Tyr, por experimentos descritos en la bibliografía. [0138] The renewal rate constants (kcat) and the specificity constant (kcat / km) increase greatly when a Gly residue in P1 'is replaced by amino acid residues that have hydrophobic side chains. Therefore, replacing the Gly remainder with a Leu causes a 140-fold increase in the renewal rate constant and a 370-fold increase in the specificity constant. However, a decrease in these parameters is observed when a Leu residue is replaced by a Phe residue, and even more so by a Tyr residue, by experiments described in the literature.

[0139] Los parámetros cinéticos obtenidos con sustratos en los que los restos que se unen al bolsillo hidrófobo en el subsitio S1' de la enzima eran variados mostraban que un resto Leu en P1' proporcionaba la mayor kcat, mientras que restos Phe mostraban la menor Km. La sustitución del resto Phe por una Tyr condujo a un aumento marcado en la Km y a una disminución en la constante de velocidad de renovación. [0139] The kinetic parameters obtained with substrates in which the residues that bind to the hydrophobic pocket in the S1 'subsite of the enzyme were varied showed that a Leu residue in P1' provided the greatest kcat, while Phe residues showed the lowest Km. The substitution of the rest Phe by a Tyr led to a marked increase in Km and a decrease in the rate of renewal speed.

[0140] La presencia de un resto Phe en la posición P1' causaba una disminución pronunciada en la constante de velocidad de renovación que era independiente de la clase de resto presente en la posición P2', sugiriendo la presencia de restricciones de tamaño definitivas en los restos que se unen en el subsitio S1''. De hecho, las mayores velocidades de reacción se obtuvieron con sustratos que tenían un resto Ala en esta posición. Los menores valores de Km se obtuvieron con un resto Phe en la posición P1', sugiriendo que este resto proporciona la mayor afinidad de unión. [0140] The presence of a Phe residue in position P1 'caused a pronounced decrease in the rate of renewal constant that was independent of the class of remainder present in position P2', suggesting the presence of definitive size restrictions in the remains that join in subsite S1 ''. In fact, the highest reaction rates were obtained with substrates that had an Ala residue in this position. The lowest Km values were obtained with a Phe residue at position P1 ', suggesting that this residue provides the highest binding affinity.

[0141] En el subsitio P1', el efecto de la sustitución de aminoácidos se reflejada principalmente en la kcat y, por consiguiente, en la kcat/Km. Un resto Ala en esta posición da como resultado valores de kcat 8 y 3,5 veces mayores respecto a Gly o Phe. La sustitución de un D-aminoácido en esta posición conduce a un sustrato no reactivo. Las interacciones de P1' con la enzima no implican fuertes interacciones hidrófobas. [0141] In subsite P1 ', the effect of amino acid substitution is mainly reflected in the kcat and, consequently, in the kcat / Km. An Ala residue in this position results in values of kcat 8 and 3.5 times higher than Gly or Phe. The substitution of a D-amino acid in this position leads to a non-reactive substrate. The interactions of P1 'with the enzyme do not imply strong hydrophobic interactions.

[0142] Se obtuvieron bajos valores de Km para la enzima cuando la posición P2' estaba representada por un resto Phe. Además, los sustratos con este resto proporcionaron tanto velocidades de reacción elevadas como valores de Km reducidos cuando la posición P1' se sustituía por un resto Ala o Gly. [0142] Low Km values were obtained for the enzyme when the P2 'position was represented by a Phe moiety. In addition, substrates with this moiety provided both high reaction rates and reduced Km values when the P1 'position was replaced by an Ala or Gly moiety.

[0143] Los efectos principales de la sustitución de aminoácidos en el subsitio P2' de la enzima se reflejan en la Km, uniéndose la Leu 3 veces más fuerte y la Gly 3 veces más débil que la Ala. Las interacciones hidrófobas de la enzima en P2' no afectan a las interacciones de P1' y, por lo tanto, se reflejan directamente en la Km. Las interacciones de unión en la posición P2’ parecen implicar interacciones hidrófobas, como se observa a partir de los valores de Km 4 veces menores de la Phe y Ala respecto a la Gly. Un resto D-Ala en la posición P2' de la enzima no afecta mucho a la catálisis. Puede aceptarse un resto D-Ala en esta posición, dando como resultado los mayores valores de kcat. [0143] The main effects of amino acid substitution in the P2 'subsite of the enzyme are reflected in Km, joining Leu 3 times stronger and Gly 3 times weaker than Ala. The hydrophobic interactions of the enzyme in P2 'do not affect the interactions of P1' and, therefore, are directly reflected in the Km. The binding interactions in the P2 'position appear to involve hydrophobic interactions, as observed from the values of Km 4 times lower of the Phe and Ala with respect to the Gly. A D-Ala residue at the P2 'position of the enzyme does not affect catalysis much. A D-Ala residue can be accepted in this position, resulting in higher kcat values.

[0144] El sustrato fluorogénico dansilo-D-Ala-Gly (pNO2)Phe-Gly se hidroliza a una velocidad apreciable por la enzima. La enzima muestra un aumento de 8-9 veces en la unión de un ácido libre respecto a su amida. Este descubrimiento sugiere que la unión de sustrato a la enzima depende en parte de interacciones de subsitio hidrófobas, así como de una interacción electrostática relativamente fuerte con un grupo carboxilo COOH-terminal libre. La consecuencia de esta interacción iónica debería ser una preferencia por la escisión de sustratos hacia su extremo COOH-terminal. [0144] The dansyl-D-Ala-Gly fluorogenic substrate (pNO2) Phe-Gly is hydrolyzed at a rate appreciable by the enzyme. The enzyme shows an 8-9 fold increase in the binding of a free acid with respect to its amide. This discovery suggests that substrate binding to the enzyme depends in part on hydrophobic subsite interactions, as well as a relatively strong electrostatic interaction with a free COOH-terminal carboxyl group. The consequence of this ionic interaction should be a preference for the cleavage of substrates towards their COOH-terminal end.

[0145] Se cree que la enzima implicada en la activación de los profármacos descritos está asociada con la membrana externa de células diana pero se encuentra en la circulación sólo a niveles muy reducidos. Más probablemente, se genera por las propias células diana o por células normales que se asocian con las células diana, tales como leucocitos, células estromales, células B, neutrófilos o macrófagos. El término leucocitos, como se usa en la presente memoria, incluye linfocitos, monocitos, macrófagos, granulocitos, leucocitos polimorfonucleares, células asesinas naturales y células dendríticas. Así, por ejemplo, la enzima asociada a célula diana puede estar presente de alguna otra forma en las proximidades extracelulares de la célula diana. En muchos casos, el profármaco incluye un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer y la célula diana es una célula tumoral. Por lo tanto, la enzima puede estar unida a la membrana extracelular de la célula tumoral, o puede estar presente extracelularmente debido a células asociadas a tumores que expresan las enzimas. [0145] It is believed that the enzyme involved in the activation of the described prodrugs is associated with the outer membrane of target cells but is in the circulation only at very reduced levels. More likely, it is generated by the target cells themselves or by normal cells that are associated with the target cells, such as leukocytes, stromal cells, B cells, neutrophils or macrophages. The term leukocytes, as used herein, includes lymphocytes, monocytes, macrophages, granulocytes, polymorphonuclear leukocytes, natural killer cells and dendritic cells. Thus, for example, the enzyme associated with the target cell may be present in some other way in the extracellular vicinity of the target cell. In many cases, the prodrug includes a therapeutic agent for the treatment of cancer and the target cell is a tumor cell. Therefore, the enzyme may be attached to the extracellular membrane of the tumor cell, or it may be present extracellularly due to cells associated with tumors expressing the enzymes.

[0146] Son especialmente útiles compuestos que se escinden preferentemente por la enzima descrita en la presente memoria y que son resistentes a la escisión en otra parte del cuerpo por otras endopeptidasas. Otras enzimas que se sabe que escinden pequeños péptidos a cierta velocidad detectable y que podrían conducir a una activación excesiva o inapropiada de los profármacos incluyen TOP, PSA y metaloproteinasas de la matriz. Los compuestos que pueden escindirse por CD10 pero que son resistentes a la escisión por la enzima TOP son especialmente útiles. Son ejemplos de compuestos escindibles por CD10 pero resistentes a la escisión por TOP Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. [0146] Compounds that are preferentially cleaved by the enzyme described herein and that are resistant to cleavage elsewhere in the body by other endopeptidases are especially useful. Other enzymes that are known to cleave small peptides at a certain detectable rate and that could lead to excessive or inappropriate activation of prodrugs include TOP, PSA and matrix metalloproteinases. Compounds that can be cleaved by CD10 but which are resistant to cleavage by the enzyme TOP are especially useful. Examples of compounds cleavable by CD10 but resistant to cleavage by TOP Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox.

[0147] También son útiles compuestos que pueden escindirse por CD10 pero que son resistentes a la escisión por antígeno prostático específico (PSA). Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox también son ejemplos de estos tipos de compuestos. [0147] Compounds that can be cleaved by CD10 but which are resistant to cleavage by prostate specific antigen (PSA) are also useful. Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox are also examples of these types of compounds.

Grupo estabilizante Stabilizing group

5 [0148] Una porción importante del profármaco es el grupo estabilizante, que sirve para proteger el compuesto de profármaco de la escisión en sangre circulante cuando se administra al paciente y, por lo tanto, permite que el profármaco alcance las proximidades de la célula diana relativamente intacto. El grupo estabilizante protege al profármaco de la escisión por proteinasas y peptidasas presentes en la sangre, suero sanguíneo y tejido normal. Puesto que el grupo estabilizante típicamente protege el extremo N-terminal del oligopéptido, y se le denomina por lo tanto a veces protección N-terminal o bloqueo N-terminal, sirve para guardar contra peptidasas a las que de otro modo el profármaco podría ser susceptible. [0148] An important portion of the prodrug is the stabilizing group, which serves to protect the prodrug compound from circulating blood cleavage when administered to the patient and, therefore, allows the prodrug to reach the vicinity of the target cell. relatively intact The stabilizing group protects the prodrug from cleavage by proteinases and peptidases present in the blood, blood serum and normal tissue. Since the stabilizing group typically protects the N-terminal end of the oligopeptide, and is therefore sometimes referred to as N-terminal protection or N-terminal blocking, it serves to guard against peptidases to which the prodrug might otherwise be susceptible. .

[0149] Idealmente, el grupo estabilizante es útil en el profármaco de la invención si sirve para proteger al profármaco de la degradación, es decir, de la escisión, cuando se ensaya por almacenamiento del compuesto de [0149] Ideally, the stabilizing group is useful in the prodrug of the invention if it serves to protect the prodrug from degradation, that is, from cleavage, when tested for storage of the compound of

15 profármaco en sangre humana a 37 ºC durante 2 horas y da como resultado una escisión inferior al 20%, preferentemente inferior al 2%, del profármaco por las enzimas presentes en la sangre humana en las condiciones de ensayo dadas. 15 prodrug in human blood at 37 ° C for 2 hours and results in a cleavage of less than 20%, preferably less than 2%, of the prodrug by enzymes present in human blood under the given test conditions.

[0150] En el método de la reivindicación 1, el grupo estabilizante es ácido succínico, ácido adípico, ácido glutárico [0150] In the method of claim 1, the stabilizing group is succinic acid, adipic acid, glutaric acid

o ácido ftálico, siendo más preferido ácido succínico y ácido adípico. Otros ejemplos incluyen ácido diglicólico, ácido fumárico, ácido naftaleno dicarboxílico, ácido piroglutámico, ácido acético, ácido 1- o 2-naftilcarboxílico, ácido 1,8naftil dicarboxílico, ácido aconítico, ácido carboxicinámico, ácido triazol dicarboxílico, ácido glucónico, ácido 4carboxifenil borónico, un análogo de (PEG)n tal como ácido polietilenglicólico, ácido butano disulfónico, ácido maleico, ácido nipecótico y ácido isonipecótico. Los grupos estabilizantes mencionados anteriormente son or phthalic acid, with succinic acid and adipic acid being more preferred. Other examples include diglycolic acid, fumaric acid, naphthalene dicarboxylic acid, pyroglutamic acid, acetic acid, 1- or 2-naphthylcarboxylic acid, 1,8-naphthyl dicarboxylic acid, aconitic acid, carboxycinnamic acid, dicarboxylic triazole acid, gluconic acid, 4-carboxyphenyl boronic acid, an analogue of (PEG) n such as polyethylene glycolic acid, butane disulfonic acid, maleic acid, nipecotic acid and isonipecotic acid. The stabilizing groups mentioned above are

25 protecciones N-terminales. 25 N-terminal protections.

[0151] Además, un aminoácido no codificado genéticamente seleccionado de uno de los siguientes también puede usarse como grupo estabilizante usado en el método de la reivindicación 1: -alanina, ácido tiazolidin-4-carboxílico, 2-tienilalanina, 2-naftilalanina, D-alanina, D-leucina, D-metionina, D-fenilalanina, ácido 3-amino-3-fenilpropiónico, ácido -aminobutírico, ácido 3-amino-4,4-difenilbutírico, ácido tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido 4aminometilbenzoico y ácido aminoisobutírico. [0151] In addition, a genetically uncoded amino acid selected from one of the following may also be used as a stabilizing group used in the method of claim 1: -alanine, thiazolidin-4-carboxylic acid, 2-thienylalanine, 2-naphthylalanine, D-alanine, D-leucine, D-methionine, D-phenylalanine, 3-amino-3-phenylpropionic acid, -aminobutyric acid, 3-amino-4,4-diphenylbutyric acid, tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid, 4aminomethylbenzoic acid and aminoisobutyric acid.

[0152] Además, en algunos experimentos la administración intravascular de un profármaco agregante cargado positivamente en ratones daba como resultado una toxicidad aguda. Sin embargo, no se observó dicha toxicidad [0152] In addition, in some experiments the intravascular administration of a positively charged aggregating prodrug in mice resulted in acute toxicity. However, this toxicity was not observed

35 cuando la carga en este profármaco se invertía por derivatización con un grupo estabilizante cargado negativamente. 35 when the charge in this prodrug was reversed by derivatization with a negatively charged stabilizer group.

[0153] Muchos compuestos citotóxicos tienen intrínsecamente una escasa solubilidad. Las antraciclinas cargadas positivamente, por ejemplo, pueden formar agregados a alta concentración y estos agregados pueden inducir una coagulación intravenosa cuando los agregados se administran por vía intravenosa. Puesto que muchos oligopéptidos tienen extremos amino-terminales cargados positivamente expuestos a pH fisiológico, estos agregados pueden formar una superficie policargada positivamente in vivo e inducir una cascada de coagulación a los pocos minutos desde su administración. Esto tiene el potencial de volver cualquier profármaco cargado positivamente que forma agregados inadecuado para uso terapéutico. [0153] Many cytotoxic compounds intrinsically have poor solubility. Positively charged anthracyclines, for example, can form aggregates at high concentration and these aggregates can induce intravenous coagulation when the aggregates are administered intravenously. Since many oligopeptides have positively charged amino-terminal ends exposed to physiological pH, these aggregates can form a positively polycarbonated surface in vivo and induce a coagulation cascade within a few minutes of administration. This has the potential to return any positively charged prodrug that forms aggregates unsuitable for therapeutic use.

45 [0154] Como se describe en mayor detalle en el documento WO 00/33888, una forma de abordar dicho obstáculo potencialmente peligroso es utilizar el grupo estabilizante en el extremo N-terminal de la cadena peptídica de una funcionalidad cargada negativamente o neutra. Por ejemplo, el uso de succinilo como grupo estabilizante en el profármaco puede aliviar la toxicidad aguda del profármaco. Esto resuelve un problema importante en el uso de profármacos peptídicos como terapias prácticas para uso intravenoso en seres humanos. [0154] As described in greater detail in WO 00/33888, one way of addressing said potentially dangerous obstacle is to use the stabilizing group at the N-terminal end of the peptide chain of a negatively charged or neutral functionality. For example, the use of succinyl as a stabilizing group in the prodrug can alleviate the acute toxicity of the prodrug. This solves an important problem in the use of peptide prodrugs as practical therapies for intravenous use in humans.

Oligopéptido Oligopeptide

[0155] Los oligopéptidos se definen en general como polipéptidos de longitud corta, típicamente de veinte [0155] Oligopeptides are generally defined as short-length polypeptides, typically twenty

55 aminoácidos o menos. Un oligopéptido útil en el profármaco descrito en la presente memoria tiene una longitud de al menos tres aminoácidos y, preferentemente, una longitud de tres a seis aminoácidos. Sin embargo, también son útiles oligopéptidos de una longitud más allá del intervalo. 55 amino acids or less. An oligopeptide useful in the prodrug described herein has a length of at least three amino acids and, preferably, a length of three to six amino acids. However, oligopeptides of a length beyond the range are also useful.

Esquema de numeración Numbering Scheme

[0156] La porción oligopeptídica del profármaco descrito en la presente memoria y reivindicado en el método de la reivindicación 1 tiene una fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1'-(AA)m. En esta fórmula, n y m son números enteros. Como se usa en la presente memoria, un número entero es cualquier número natural positivo o cero. El oligopéptido tiene una longitud de tres o más aminoácidos. En la realización preferida, n es un número entero de 0 a 3, y en conjunto, 0 a 3 m + n no es más de 3. Por lo tanto, el oligopéptido preferido tiene una longitud de 3-6 aminoácidos. Cada AA en la fórmula representa independiente un aminoácido. Ciertos aminoácidos se presentan con un superíndice que indica su posición respecto al sitio de escisión por CD10. Particularmente, CD10 escinde entre el aminoácido en la posición P1, es decir, AAP1, y el aminoácido en la posición P1’, es decir, AAP1'. [0156] The oligopeptide portion of the prodrug described herein and claimed in the method of claim 1 has a formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA) m. In this formula, n and m are whole numbers. As used herein, an integer is any positive or zero natural number. The oligopeptide has a length of three or more amino acids. In the preferred embodiment, n is an integer from 0 to 3, and altogether, 0 to 3 m + n is not more than 3. Therefore, the preferred oligopeptide is 3-6 amino acids in length. Each AA in the formula independently represents an amino acid. Certain amino acids are presented with a superscript that indicates their position with respect to the cleavage site by CD10. Particularly, CD10 cleaves between the amino acid at position P1, that is, AAP1, and the amino acid at position P1 ’, that is, AAP1 '.

[0157] El oligopéptido se escribe de la forma convencional con el extremo carboxilo-terminal (o extremo C-terminal) a la derecha y el extremo amino-terminal (o extremo N-terminal) a la izquierda. [0157] The oligopeptide is written in the conventional manner with the carboxyl-terminal (or C-terminal) on the right and the amino-terminal (or N-terminal) on the left.

[0158] En el oligopéptido de la invención, AAP2 representa cualquier aminoácido. AAP1 también representa cualquier aminoácido, como lo hace AAP1'. Los aminoácidos adicionales pueden estar presentes unidos a la sección de núcleo AAP2-AAP1 -AAP1' del oligopéptido. En general, se unen de 0 a 3 aminoácidos adicionales a AAP2 o AAP1' , pero son posibles más de tres. Estos aminoácidos adicionales se presentan en la fórmula como (AA)n o (AA)m. Cada AA en la serie representado por (AA)n o (AA)m también representa independientemente un aminoácido. Por lo tanto, cuando m = 1, entonces (AA)m representa AAm=1 y AAm=1 se une a AAP1. AAm=1 está entonces en la posición P2' y puede representarse mediante AAP2'. Cuando m = 2, entonces (AA)m representa AA m=1-AAm=2, con AAm=1 en la posición P2' y AAm=2 en la posición P3', y AAm=1 se une a AAP1'. Cuando m = 3, entonces (AA)m representa AAm=1AAm=2-AAm=3, (es decir, AAP2' AAP3' AAP4' ) y AAm=1 se une a AAP1'. De forma similar, puede estar presente AAn,=1 o AAn=2-AAn=1 o AAn=3-AAn=2-AAn=1, con el AAn=1 unido a AAP2 y representando AAP3, AAn=2 está por lo tanto en la posición P4, AAn=3 está en la posición P5. [0158] In the oligopeptide of the invention, AAP2 represents any amino acid. AAP1 also represents any amino acid, as does AAP1 '. Additional amino acids may be present attached to the core section AAP2-AAP1 -AAP1 'of the oligopeptide. In general, 0 to 3 additional amino acids bind to AAP2 or AAP1 ', but more than three are possible. These additional amino acids are presented in the formula as (AA) n or (AA) m. Each AA in the series represented by (AA) n or (AA) m also independently represents an amino acid. Therefore, when m = 1, then (AA) m represents AAm = 1 and AAm = 1 joins AAP1. AAm = 1 is then in position P2 'and can be represented by AAP2'. When m = 2, then (AA) m represents AA m = 1-AAm = 2, with AAm = 1 at position P2 'and AAm = 2 at position P3', and AAm = 1 joins AAP1 '. When m = 3, then (AA) m represents AAm = 1AAm = 2-AAm = 3, (that is, AAP2 'AAP3' AAP4 ') and AAm = 1 joins AAP1'. Similarly, AAn, = 1 or AAn = 2-AAn = 1 or AAn = 3-AAn = 2-AAn = 1 may be present, with AAn = 1 attached to AAP2 and representing AAP3, AAn = 2 is therefore In both position P4, AAn = 3 is in position P5.

Aminoácidos preferidos Preferred Amino Acids

[0159] A menos que se indique otra cosa, todos los aminoácidos están en la configuración L. Aunque puede estar presente cualquier aminoácido en la porción oligopeptídica del profármaco, se prefieren ciertos aminoácidos. [0159] Unless otherwise indicated, all amino acids are in the L configuration. Although any amino acid may be present in the oligopeptide portion of the prodrug, certain amino acids are preferred.

[0160] Particularmente, AAP1 se selecciona preferentemente del grupo que consiste en arginina, alanina, glicina, leucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, glutamina, valina y serina. [0160] Particularly, AAP1 is preferably selected from the group consisting of arginine, alanine, glycine, leucine, methionine, proline, phenylalanine, tyrosine, glutamine, valine and serine.

[0161] De forma similar, AAP1' se selecciona preferentemente del grupo que consiste en leucina, isoleucina, fenilalanina, valina, tirosina y prolina. AAP1' es preferentemente un aminoácido hidrófobo. [0161] Similarly, AAP1 'is preferably selected from the group consisting of leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tyrosine and proline. AAP1 'is preferably a hydrophobic amino acid.

[0162] En algunas realizaciones de la invención, se prefieren emparejamientos de AAP1-AAP1' particulares. En concreto, la combinación de AAP1-AAP1' se selecciona preferentemente del grupo que consiste en Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Phe, Arg-Val, Ala-Phe, Ala-Leu, Gly-Phe, Gly-Leu, Leu-Phe, Leu-Tyr, Met-Leu, Pro-Phe, Pro-Tyr, Pro-Leu, Phe-Leu, Phe-Phe, Tyr-Ile, Tyr-Pro, Tyr-Leu, Gln-Phe, Val-Tyr, Val-Phe, Ser-Leu, Gly-Trp y Asp-Phe. [0162] In some embodiments of the invention, particular AAP1-AAP1 'pairings are preferred. Specifically, the combination of AAP1-AAP1 'is preferably selected from the group consisting of Arg-Leu, Arg-Ile, Arg-Phe, Arg-Val, Ala-Phe, Ala-Leu, Gly-Phe, Gly-Leu, Leu-Phe, Leu-Tyr, Met-Leu, Pro-Phe, Pro-Tyr, Pro-Leu, Phe-Leu, Phe-Phe, Tyr-Ile, Tyr-Pro, Tyr-Leu, Gln-Phe, Val- Tyr, Val-Phe, Ser-Leu, Gly-Trp and Asp-Phe.

[0163] Preferentemente está presente un aminoácido hidrófobo como AAP2. Por lo tanto, la isoleucina es un aminoácido particularmente útil en la posición P2. Si m es 1 a 3, entonces AAn=1 es preferentemente un aminoácido hidrófobo también. [0163] Preferably a hydrophobic amino acid is present as AAP2. Therefore, isoleucine is a particularly useful amino acid in the P2 position. If m is 1 to 3, then AAn = 1 is preferably a hydrophobic amino acid as well.

[0164] Como ejemplos, pueden estar presentes las secuencias de aminoácidos siguientes en el oligopéptido como al menos una porción de la secuencia escindible por CD10: Ala-Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Ala-Ile-Ala-Leu, Leu-Ala-Leu, Met-Ala-Leu y Phe-Ala-Leu. [0164] As examples, the following amino acid sequences may be present in the oligopeptide as at least a portion of the sequence cleavable by CD10: la Ala-Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Ala-Ile-Ala -Leu, Leu-Ala-Leu, Met-Ala-Leu and Phe-Ala-Leu.

Agentes terapéuticos Therapeutic agents

[0165] Los agentes terapéuticos que son particularmente ventajosos para modificar una forma profármaco son aquellos con una estrecha ventana terapéutica. Un fármaco o agente terapéutico con una estrecha ventana terapéutica es uno en el que la dosis a la que se manifiesta la toxicidad, por patrones médicos generales, está muy próxima a la dosis a la que se manifiesta la eficacia. [0165] The therapeutic agents that are particularly advantageous for modifying a prodrug form are those with a narrow therapeutic window. A drug or therapeutic agent with a narrow therapeutic window is one in which the dose at which toxicity is manifested, by general medical standards, is very close to the dose at which efficacy is manifested.

[0166] El agente terapéutico conjugado con el grupo estabilizante y el oligopéptido y, opcionalmente, el grupo enlazador para formar el profármaco descrito en la presente memoria y que se usará en la reivindicación 1 puede ser útil para el tratamiento del cáncer, una enfermedad inflamatoria o alguna otra afección médica. Preferentemente, el agente terapéutico se selecciona entre las siguientes clases de compuestos: agentes alquilantes, agentes antiproliferativos, agentes de unión a tubulina, alcaloides de la vinca, enediinas, podofilotoxinas o derivados de podofilotoxina, la familia de fármacos de la pteridina, taxanos, antraciclinas, dolastatinas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes quimioterápicos de complejos de coordinación de platino y maitansinoides. [0166] The therapeutic agent conjugated to the stabilizer group and the oligopeptide and, optionally, the linker group to form the prodrug described herein and to be used in claim 1 may be useful for the treatment of cancer, an inflammatory disease. or some other medical condition. Preferably, the therapeutic agent is selected from the following classes of compounds: alkylating agents, antiproliferative agents, tubulin binding agents, vinca alkaloids, enediines, podophyllotoxins or podophyllotoxin derivatives, the pteridine drug family, taxanes, anthracyclines , dolastatins, topoisomerase inhibitors, chemotherapeutic agents of platinum and maitansinoid coordination complexes.

[0167] Particularmente, el agente terapéutico se selecciona ventajosamente de los compuestos siguientes, o un derivado o análogo de los mismos: doxorrubicina, daunorrubicina, vinblastina, vincristina, caliqueamicina, etopósido, fosfato de etopósido, CC-1065, duocarmicina, KW-2189, metotrexato, metopterina, aminopterina, diclorometotrexato, docetaxel, paclitaxel, epitiolona, combretastatina, fosfato de combretastatina A4, dolastatina 10, dolastatina 11, dolastatina 15, topotecán, camptotecina, mitomicina C, porfiromicina, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, fludarabina, tamoxifeno, arabinósido de citosina, arabinósido de adenosina, colchicina, halicondrina B, cisplatino, carboplatino, mitomicina C, bleomicina, melfalán, cloroquina, ciclosporina A y maitansina. Por derivado se entiende un compuesto que se obtiene como resultado de la reacción del compuesto nombrado con otro resto químico, e incluye una sal, ácido, base o éster farmacéuticamente aceptable del compuesto nombrado. Por análogo se entiende un compuesto que tiene propiedades estructurales y funcionales similares, tales como actividades biológicas, a las del compuesto nombrado. [0167] Particularly, the therapeutic agent is advantageously selected from the following compounds, or a derivative or analog thereof: doxorubicin, daunorubicin, vinblastine, vincristine, calicheamycin, etoposide, etoposide phosphate, CC-1065, duocarmycin, KW-2189 , methotrexate, metopterin, aminopterin, dichloromethotrexate, docetaxel, paclitaxel, epitiolone, combretastatin, combretastatin phosphate A4, dolastatin 10, dolastatin 11, dolastatin 15, topotecan, camptothecin, mitomycin C, porphyromycin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrin, 5-fluoropyrine Tamoxifen, cytosine arabinoside, adenosine arabinoside, colchicine, halicondrine B, cisplatin, carboplatin, mitomycin C, bleomycin, melphalan, chloroquine, cyclosporine A and maitansin. By derivative is meant a compound that is obtained as a result of the reaction of the named compound with another chemical moiety, and includes a pharmaceutically acceptable salt, acid, base or ester of the named compound. By analogue is meant a compound that has similar structural and functional properties, such as biological activities, to those of the named compound.

Grupos enlazadores Linker Groups

[0168] Un grupo enlazador entre el oligopéptido y el agente terapéutico puede ser ventajoso por razones tales como las siguientes: [0168] A linker group between the oligopeptide and the therapeutic agent may be advantageous for reasons such as the following:

1.one.: Como espaciador para consideraciones estéricas para facilitar la liberación enzimática del aminoácido unido al agente terapéutico u otras etapas de activación enzimática. As a spacer for steric considerations to facilitate the enzymatic release of the amino acid bound to the therapeutic agent or other stages of enzymatic activation.

2.2.: Para proporcionar una química de unión apropiada entre el agente terapéutico y el oligopéptido. To provide an appropriate binding chemistry between the therapeutic agent and the oligopeptide.

3.3.: Para mejorar el procedimiento sintético de generar el conjugado de profármaco (por ejemplo, prederivatizando el agente terapéutico u oligopéptido con el grupo enlazador antes de la conjugación para aumentar el rendimiento o la especificidad). To improve the synthetic procedure of generating the prodrug conjugate (for example, by prederivatizing the therapeutic agent or oligopeptide with the linker group before conjugation to increase yield or specificity).

4.Four.: Para mejorar las propiedades físicas del profármaco. To improve the physical properties of the prodrug.

5.5.: Para proporcionar un mecanismo adicional para la liberación intracelular del fármaco. To provide an additional mechanism for intracellular drug release.

[0169] Las estructuras de enlazador vienen impuestas por la funcionalidad necesaria. Son ejemplos de químicas enlazadoras potenciales hidrazida, éster, éter y sulfhidrilo. El ácido aminocaproico es un ejemplo de un grupo enlazador bifuncional. Cuando se usa el ácido aminocaproico como parte del grupo enlazador, no se cuenta como un aminoácido en el esquema de numeración del oligopéptido. [0169] Linker structures are imposed by the necessary functionality. Examples of potential chemical linkers are hydrazide, ester, ether and sulfhydryl. Aminocaproic acid is an example of a bifunctional linker group. When aminocaproic acid is used as part of the linker group, it is not counted as an amino acid in the oligopeptide numbering scheme.

Diseño de profármaco Prodrug Design

[0170] Un método de diseño de un profármaco como se describe en la reivindicación 1 de la invención implica inicialmente identificar un oligopéptido como se ha descrito anteriormente. Después, el oligopéptido se une en un primer sitio de unión del oligopéptido a un grupo estabilizante de la reivindicación 1, que obstaculiza la escisión del oligopéptido por enzimas presentes en sangre completa, y se une directa o indirectamente a un agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido. El primer sitio de unión es habitualmente el extremo N-terminal del oligopéptido, pero puede ser el extremo C-terminal del oligopéptido u otra parte del oligopéptido. El segundo sitio de unión es habitualmente el extremo C-terminal del oligopéptido, pero puede ser el extremo N-terminal del oligopéptido u otra parte del oligopéptido. El enlace del oligopéptido con el agente terapéutico y el grupo estabilizante puede realizarse en cualquier orden o al mismo tiempo. [0170] A method of designing a prodrug as described in claim 1 of the invention initially involves identifying an oligopeptide as described above. Then, the oligopeptide binds at a first binding site of the oligopeptide to a stabilizing group of claim 1, which hinders cleavage of the oligopeptide by enzymes present in whole blood, and binds directly or indirectly to a therapeutic agent at a second site. of binding of the oligopeptide. The first binding site is usually the N-terminal end of the oligopeptide, but it may be the C-terminal end of the oligopeptide or another part of the oligopeptide. The second binding site is usually the C-terminal end of the oligopeptide, but it can be the N-terminal end of the oligopeptide or another part of the oligopeptide. The linkage of the oligopeptide with the therapeutic agent and the stabilizing group can be carried out in any order or at the same time.

[0171] El conjugado resultante se ensaya para determinar su capacidad de escisión por CD10 como se menciona en la reivindicación 1, utilizando métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, el conjugado puede ensayarse para determinar su capacidad de escisión por CD10 por incubación del conjugado con CD10 purificada a partir de una fuente celular y análisis de los productos resultantes por HPLC usando detección de fluorescencia como se describe en el Ejemplo 2. El conjugado puede seleccionarse como un profármaco si es escindible por CD10. [0171] The resulting conjugate is tested for its cleavage capacity by CD10 as mentioned in claim 1, using methods known to the person skilled in the art. For example, the conjugate can be tested for its ability to excision by CD10 by incubation of the conjugate with purified CD10 from a cellular source and analysis of the resulting products by HPLC using fluorescence detection as described in Example 2. The conjugate It can be selected as a prodrug if it is cleavable by CD10.

[0172] Un oligopéptido que todavía no está conjugado con el grupo estabilizante o con el grupo terapéutico también puede ensayarse para determinar su capacidad de escisión por CD10 mediante los métodos usados para ensayar la capacidad de escisión del conjugado. La capacidad de escisión por CD10 es indicativa del oligopéptido como candidato para el diseño de un profármaco. [0172] An oligopeptide that is not yet conjugated with the stabilizing group or with the therapeutic group can also be tested to determine its ability to excision by CD10 by the methods used to test the ability of cleavage of the conjugate. The cleavage capacity by CD10 is indicative of the oligopeptide as a candidate for the design of a prodrug.

[0173] En la presente memoria también se describe un método de exploración para identificar un oligopéptido útil para diseñar un profármaco. Se proporcionan oligopéptidos de tres o más aminoácidos y se ensayan para determinar su escisión por CD10. Como se ha analizado anteriormente, la capacidad de escisión por CD10 es indicativa del oligopéptido como candidato para el diseño de un profármaco. [0173] A screening method to identify an oligopeptide useful for designing a prodrug is also described herein. Oligopeptides of three or more amino acids are provided and tested for CD10 cleavage. As discussed above, the cleavage capacity by CD10 is indicative of the oligopeptide as a candidate for the design of a prodrug.

[0174] Se describe en la presente memoria un ensayo adicional para determinar la capacidad de escisión por CD10 pero la resistencia a la escisión por TOP. El ensayo para determinar la capacidad de escisión por CD10 pero la resistencia a la escisión por antígeno prostático específico (PSA) es parte de la invención. El conjugado resultante también puede ensayarse para determinar su estabilidad en sangre completa. Pueden seleccionarse compuestos de ensayo estables en sangre completa. Se realiza una selección de compuestos que pueden escindirse por CD10 y resistentes a la escisión por PSA como se menciona en la reivindicación 1. También se describe un profármaco diseñado por un método de este tipo. [0175] Además, en la presente memoria se describe un método para disminuir la toxicidad de un agente terapéutico que está destinado a su administración a un paciente. En concreto, una forma profármaco modificada del agente terapéutico se forma uniendo directa o indirectamente el agente terapéutico a un oligopéptido escindible por CD10 y, preferentemente, también resistente a la escisión por TOP y PSA. El oligopéptido también se une a un grupo estabilizante. Preferentemente, el oligopéptido tiene la fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m, en la que: [0174] An additional assay to determine the cleavage capacity by CD10 but the resistance to cleavage by TOP is described herein. The assay to determine the ability to excision by CD10 but resistance to cleavage by prostate specific antigen (PSA) is part of the invention. The resulting conjugate can also be tested for stability in whole blood. Stable test compounds can be selected in whole blood. A selection of compounds that can be cleaved by CD10 and resistant to cleavage by PSA is made as mentioned in claim 1. A prodrug designed by such a method is also described. [0175] In addition, a method of decreasing the toxicity of a therapeutic agent that is intended for administration to a patient is described herein. In particular, a modified prodrug form of the therapeutic agent is formed by directly or indirectly binding the therapeutic agent to an oligopeptide cleavable by CD10 and, preferably, also resistant to cleavage by TOP and PSA. The oligopeptide also binds to a stabilizing group. Preferably, the oligopeptide has the formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ’- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

AAP1’ representa cualquier aminoácido, AAP1 ’represents any amino acid,

cada AA representa independientemente un aminoácido. each AA independently represents an amino acid.

Más preferentemente, n es 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3. More preferably, n is 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3.

[0176] El profármaco así formado proporciona una toxicidad disminuida del agente terapéutico cuando se administra al paciente. La modificación del agente terapéutico de esta forma también permite la administración de una dosificación aumentada del agente terapéutico al paciente respecto a la dosificación del agente terapéutico en forma no conjugada. [0176] The prodrug thus formed provides a decreased toxicity of the therapeutic agent when administered to the patient. The modification of the therapeutic agent in this way also allows the administration of an increased dosage of the therapeutic agent to the patient with respect to the dosage of the therapeutic agent in unconjugated form.

Composiciones farmacéuticas Pharmaceutical compositions

[0177] En la presente memoria también se describe una composición farmacéutica que comprende un compuesto, particularmente un compuesto de profármaco, y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un adyuvante o excipiente. [0177] A pharmaceutical composition comprising a compound, particularly a prodrug compound, and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier, for example an adjuvant or excipient, is also described herein.

[0178] Más específicamente, una composición farmacéutica descrita comprende: [0178] More specifically, a pharmaceutical composition described comprises:

(1)(one): un compuesto que comprende: a compound comprising:

(a)(to): un agente terapéutico capaz de entrar en una célula diana, a therapeutic agent capable of entering a target cell,

(b)(b): un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m, en la que: an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ’- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1’ representa cualquier aminoácido, y cada AA representa independientemente un aminoácido. n and m are whole numbers, AAP2 represents any amino acid, AAP1 represents any amino acid, AAP1 ’represents any amino acid, and each AA independently represents an amino acid.

(c)(C): un grupo estabilizante, y a stabilizing group, and

(d)(d): opcionalmente, un grupo enlazador no escindible por CD10, en el que el oligopéptido se une directamente al grupo estabilizante en un primer sitio de unión del oligopéptido y el oligopéptido se une directamente al agente terapéutico o se une indirectamente a través del grupo enlazador al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, en el que el grupo estabilizante obstaculiza la escisión del compuesto por enzimas presentes en sangre completa, y en el que el compuesto es escindible por CD10, y optionally, a linker group not cleavable by CD10, wherein the oligopeptide binds directly to the stabilizing group at a first binding site of the oligopeptide and the oligopeptide binds directly to the therapeutic agent or indirectly binds through the linker group to the therapeutic agent at a second oligopeptide binding site, in which the stabilizing group hinders the cleavage of the compound by enzymes present in whole blood, and in which the compound is cleavable by CD10, and

(2)(2): un vehículo farmacéuticamente aceptable a pharmaceutically acceptable vehicle

Preferentemente, n es 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3 en el oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1AAP1’-(AA)m del compuesto. Preferably, n is 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3 in the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1AAP1 ′ - (AA) m of the compound.

[0179] En la presente memoria también se describe el uso de la composición farmacéutica para la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de una afección médica. [0179] The use of the pharmaceutical composition for the preparation of a medicinal product intended for the treatment of a medical condition is also described herein.

[0180] Por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse al paciente por vía parenteral, especialmente por vía intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. Las composiciones farmacéuticas de la invención para administración parenteral comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Como vehículo o disolvente o excipiente farmacéuticamente aceptable puede emplearse propilenglicol, polietilenglicol, ésteres orgánicos inyectables, por ejemplo, oleato de etilo o ciclodextrinas. La solución salina isotónica puede ser parte de la composición farmacéutica. Estas composiciones también pueden comprender agentes humectantes, emulsionantes y/o dispersantes. [0180] For example, the pharmaceutical composition can be administered to the patient parenterally, especially intravenously, intramuscularly or intraperitoneally. The pharmaceutical compositions of the invention for parenteral administration comprise sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. As a pharmaceutically acceptable carrier or solvent or excipient, propylene glycol, polyethylene glycol, injectable organic esters, for example, ethyl oleate or cyclodextrins can be used. The isotonic saline solution may be part of the pharmaceutical composition. These compositions may also comprise wetting, emulsifying and / or dispersing agents.

[0181] La esterilización puede llevarse a cabo de varias formas, por ejemplo usando un filtro bacteriológico, incorporando agentes esterilizantes en la composición o por irradiación. También pueden prepararse en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento del uso en agua estéril o cualquier otro medio [0181] Sterilization can be carried out in several ways, for example using a bacteriological filter, incorporating sterilizing agents in the composition or by irradiation. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions that can be dissolved at the time of use in sterile water or any other medium

inyectable estéril. [0182] La composición farmacéutica también puede comprender adyuvantes que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, vitamina C, ácido málico, agentes antioxidantes, etc.) y capaces de usarse en combinación con el compuesto de la invención para mejorar y prolongar el tratamiento de la afección médica para la que se administran. sterile injectable. [0182] The pharmaceutical composition may also comprise adjuvants that are well known in the art. (for example, vitamin C, malic acid, antioxidant agents, etc.) and capable of being used in combination with the compound of the invention to improve and prolong the treatment of the medical condition for which they are administered.

[0183] Las dosis para la administración a un paciente de los compuestos de acuerdo con la invención son generalmente al menos las dosis habituales de los agentes terapéuticos conocidos en el campo, descritas en Bruce [0183] The doses for administration to a patient of the compounds according to the invention are generally at least the usual doses of the therapeutic agents known in the field, described in Bruce

A. Chabner y Jerry M. Collins, Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN 0-397-50900-6 (1990) o pueden ajustarse a juicio del médico adjunto, para adaptarse a la eficacia superior de las formulaciones profarmacológicas o a las circunstancias particulares del paciente que se esté tratando. Por lo tanto, las dosis administradas varían de acuerdo con el agente terapéutico usado para la preparación del compuesto descrito en la presente memoria. A. Chabner and Jerry M. Collins, Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN 0-397-50900-6 (1990) or may be adjusted according to the judgment of the attending physician, to adapt to the superior efficacy of prodrug formulations or particular circumstances of the patient being treated. Therefore, the doses administered vary according to the therapeutic agent used for the preparation of the compound described herein.

Tratamiento con compuesto de profármaco Prodrug Compound Treatment

[0184] También se describe un medicamento para el tratamiento terapéutico de una afección médica que implica administrar, preferentemente por vía parenteral y, más preferentemente, por vía intravenosa, al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica. [0184] A medicament for the therapeutic treatment of a medical condition is also described which involves administering, preferably parenterally and, more preferably, intravenously, to the patient a therapeutically effective dose of the pharmaceutical composition.

[0185] Por lo tanto, un método para tratar a un paciente incluye administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en la presente memoria. [0185] Therefore, a method of treating a patient includes administering to the patient a therapeutically effective amount of a compound described herein.

[0186] El compuesto de profármaco es generalmente útil para el tratamiento de muchas afecciones médicas incluyendo cáncer, enfermedades neoplásicas, tumores, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas. Son ejemplos de enfermedades preferidas para tratamiento el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cerebral y cáncer pancreático. Más específicamente, puesto que se han identificado varios tipos tumorales específicos como positivos para CD10, el tratamiento de estos tipos de tumores es especialmente ventajoso con los compuestos mostrados en la presente memoria. En concreto, puede efectuarse el tratamiento de uno de los tipos tumorales siguientes: leucemia linfoblástica de células B, leucemia linfoblástica de células T, linfoma, incluyendo linfoma de Hodgkin y linfoma no-Hodgkin, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, melanoma, melanoma ocular, melanoma cutáneo, adenocarcinomas de colon, carcinomas hepatocelulares, carcinoma de células renales, carcinoma ovárico, adenocarcinoma prostático, carcinoma hepático, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma pancreático, carcinoma pulmonar, carcinoma de mama y carcinoma de colon. [0186] The prodrug compound is generally useful for the treatment of many medical conditions including cancer, neoplastic diseases, tumors, inflammatory diseases and infectious diseases. Examples of preferred diseases for treatment are breast cancer, colorectal cancer, liver cancer, lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, brain cancer and pancreatic cancer. More specifically, since several specific tumor types have been identified as positive for CD10, the treatment of these types of tumors is especially advantageous with the compounds shown herein. Specifically, treatment of one of the following tumor types may be performed: B-cell lymphoblastic leukemia, T-cell lymphoblastic leukemia, lymphoma, including Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, Burkitt lymphoma, melanoma, ocular melanoma , cutaneous melanoma, colon adenocarcinomas, hepatocellular carcinomas, renal cell carcinoma, ovarian carcinoma, prostate adenocarcinoma, liver carcinoma, transition cell carcinoma, pancreatic adenocarcinoma, lung carcinoma, breast carcinoma and colon carcinoma.

[0187] Formulado en vehículos farmacéuticamente aceptables (tales como solución salina isotónica), el compuesto de profármaco puede administrarse a animales o seres humanos en dosis intravenosas que varían de 0,05 mg/kg/dosis/día a 300 mg/kg/dosis/día. También puede administrarse por goteo intravenoso u otro método de infusión lenta. [0187] Formulated in pharmaceutically acceptable carriers (such as isotonic saline solution), the prodrug compound can be administered to animals or humans in intravenous doses ranging from 0.05 mg / kg / dose / day to 300 mg / kg / dose /day. It can also be given by intravenous drip or other slow infusion method.

[0188] Los pacientes humanos son los destinatarios habituales del profármaco descrito en la presente memoria, aunque también se contempla el uso veterinario. [0188] Human patients are the usual recipients of the prodrug described herein, although veterinary use is also contemplated.

[0189] En la presente memoria se describe un medicamento para su uso en un método para tratar un trastorno que tiene células diana asociadas a CD10, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende: [0189] A medicament for use in a method for treating a disorder having CD10-associated target cells is described herein, the method comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a compound comprising:

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

(3)(3): un grupo estabilizante, y a stabilizing group, and

(4)(4): opcionalmente, un grupo enlazador no escindible por CD10, en el que el oligopéptido se une directamente al grupo estabilizante en un primer sitio de unión del oligopéptido y el oligopéptido se une directamente al agente terapéutico o se une indirectamente a través del grupo enlazador al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, en el que el grupo estabilizante obstaculiza la escisión del compuesto por enzimas presentes en sangre completa, y en el que el compuesto es escindible por CD10. optionally, a linker group not cleavable by CD10, wherein the oligopeptide binds directly to the stabilizing group at a first binding site of the oligopeptide and the oligopeptide binds directly to the therapeutic agent or indirectly binds through the linker group to the therapeutic agent at a second oligopeptide binding site, in which the stabilizing group hinders the cleavage of the compound by enzymes present in whole blood, and in which the compound is cleavable by CD10.

Preferentemente, n es 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3. El compuesto es escindible por CD10 en condiciones fisiológicas. Preferably, n is 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3. The compound is cleavable by CD10 under physiological conditions.

[0190] A continuación se describe en más detalle un medicamento para su uso en un método para tratar un trastorno tal como un tumor en un paciente. El método incluye las etapas de detectar CD10 en una célula diana y administrar un profármaco escindible por CD10 al paciente si CD10 está asociada con la célula diana. La etapa de detección incluye además las etapas de obtener una muestra de tejido del paciente, combinar la muestra con un anticuerpo contra CD10 y determinar si se ha producido la unión del anticuerpo contra CD10 a la muestra. [0190] A drug for use in a method of treating a disorder such as a tumor in a patient is described in more detail below. The method includes the steps of detecting CD10 in a target cell and administering a prodrug cleavable by CD10 to the patient if CD10 is associated with the target cell. The detection step further includes the steps of obtaining a sample of tissue from the patient, combining the sample with an antibody against CD10 and determining whether binding of the antibody against CD10 has occurred to the sample.

[0191] Se describe en la presente memoria un medicamento para su uso en un método para tratar un tumor positivo para CD10 u otra célula diana positiva para CD10, que comprende administrar un profármaco escindible por CD10 al tumor u otra célula diana. El profármaco escindible por CD10 está caracterizado como se ha descrito anteriormente. También se describe particularmente un medicamento para su uso en un método de tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, que comprende administrar un profármaco escindible por CD10 al paciente. El profármaco tiene un agente terapéutico generalmente útil para el tratamiento del cáncer de próstata. Otro aspecto descrito en la presente memoria es el uso de un compuesto como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con un trastorno que tiene células diana asociadas a CD10. [0191] A medicament for use in a method of treating a tumor positive for CD10 or another target cell positive for CD10 is described herein, comprising administering a prodrug cleavable by CD10 to the tumor or other target cell. The prodrug cleavable by CD10 is characterized as described above. A medicament is also particularly described for use in a method of treating prostate cancer in a patient, which comprises administering a prodrug cleavable by CD10 to the patient. The prodrug has a therapeutic agent generally useful for the treatment of prostate cancer. Another aspect described herein is the use of a compound as described for the manufacture of a medicament for the treatment of a patient with a disorder that has target cells associated with CD10.

[0192] Como se ha descrito anteriormente, una célula diana puede estar asociada a CD10 si se genera CD10 por la célula diana o por células normales que están asociadas con las células diana, tales como leucocitos, células estromales, células B, neutrófilos o macrófagos. Por lo tanto, la CD10 puede estar unida a la membrana extracelular de la célula diana o puede estar presente extracelularmente porque las células asociadas a la célula diana expresen la enzima. [0192] As described above, a target cell may be associated with CD10 if CD10 is generated by the target cell or by normal cells that are associated with the target cells, such as leukocytes, stromal cells, B cells, neutrophils or macrophages. . Therefore, CD10 may be attached to the extracellular membrane of the target cell or may be present extracellularly because the cells associated with the target cell express the enzyme.

Uso de la inmunorreactividad de CD10 en tejido tumoral humano para diagnosticar y tratar tumores positivos para CD10 Use of CD10 immunoreactivity in human tumor tissue to diagnose and treat CD10 positive tumors

[0193] Los profármacos descritos en la presente memoria tienen usos particularmente novedosos en el caso de tumores que expresan CD10 como marcador de superficie en algunas o todas las células del tumor. Pueden usarse reactivos de tinción inmunohistoquímica para CD10 como marcadores de diagnóstico para tumores con una susceptibilidad particular a profármacos escindibles por CD10, de modo que puedan preseleccionarse pacientes para el tratamiento. Por ejemplo, se esperaría que la producción localizada de doxorrubicina que se libera a partir de profármacos escindibles por CD10 mediante CD10 en células tumorales aumentase la seguridad relativa del profármaco en comparación con el tratamiento con doxorrubicina libre que, por el contrario, se esperaría que actuase sobre todas las células indiscriminadamente. [0193] The prodrugs described herein have particularly novel uses in the case of tumors expressing CD10 as a surface marker in some or all of the tumor cells. Immunohistochemical staining reagents for CD10 can be used as diagnostic markers for tumors with a particular susceptibility to prodrugs cleavable by CD10, so that patients can be pre-selected for treatment. For example, localized production of doxorubicin that is released from CD10 cleavable prodrugs by CD10 in tumor cells would be expected to increase the relative safety of the prodrug compared to treatment with free doxorubicin which, on the contrary, would be expected to act. over all cells indiscriminately.

[0194] Los pacientes con tumores sólidos, o sospechosos de presencia de células tumorales en un tejido, podrían explorarse por biopsia de tejido tumoral, después de la identificación de la presencia de un tumor por procedimientos médicos convencionales. Los histopatólogos usan rutinariamente anticuerpos monoclonales de diagnóstico convencionales para identificar y clasificar los tumores basándose en la inmunorreactividad de CD10. En particular, el anticuerpo monoclonal de ratón contra CD10 humana, clon 56C6, Novocastra Laboratories, Newcastle, Reino Unido, se usa ampliamente con este fin (Suzuki, et al., “Imbalance between neutral endopeptidase 24.11 and endothelin-1 expression in human endometrial carcinoma” Oncology 60: 258-267 (2001); y Chu y Arber, “Paraffinsection detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma”, Am. J. Pathol. 113: 374-382 (2000)). [0194] Patients with solid tumors, or suspected of the presence of tumor cells in a tissue, could be screened by tumor tissue biopsy, after identification of the presence of a tumor by conventional medical procedures. Histopathologists routinely use conventional diagnostic monoclonal antibodies to identify and classify tumors based on CD10 immunoreactivity. In particular, the mouse monoclonal antibody against human CD10, clone 56C6, Novocastra Laboratories, Newcastle, United Kingdom, is widely used for this purpose (Suzuki, et al., "Imbalance between neutral endopeptidase 24.11 and endothelin-1 expression in human endometrial carcinoma ”Oncology 60: 258-267 (2001); and Chu and Arber,“ Paraffinsection detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma ”, Am. J. Pathol. 113: 374-382 (2000)).

[0195] Pequeñas biopsias de tumor pueden tratarse para inmunohistoquímica de la forma siguiente. Las biopsias pueden fijarse en formalina tamponada neutra, después embeberse en parafina y seccionarse (6-10 micrómetros). Las secciones pueden desparafinarse y rehidratarse. Para la recuperación de epítopos inducida por calor, las secciones desparafinadas en tampón citrato 0,01 M pueden tratarse en un horno microondas. Puede realizarse una tinción inmunohistoquímica usando la técnica de inmunoperoxidasa con avidina-biotina. El anticuerpo monoclonal de ratón contra CD10 humana, clon 56C6, puede usarse como una dilución 1:20. El anticuerpo de IgG1 de ratón MOPC-31C puede usarse como control negativo del mismo isotipo. Después, se realiza la contratinción de las secciones con hematoxilina de Mayer. La inmunorreactividad de CD10 está indicada por una tinción marrón específicamente alrededor de la periferia de células positivas en tejido tratado con anti-CD10 humana, pero no el control de isotipo. Estos tumores son dianas para el tratamiento con un profármaco que sea susceptible a la escisión por CD10. [0195] Small tumor biopsies can be treated for immunohistochemistry as follows. Biopsies can be fixed in neutral buffered formalin, then embedded in paraffin and sectioned (6-10 micrometers). Sections can be dewaxed and rehydrated. For heat-induced epitope recovery, the dewaxed sections in 0.01M citrate buffer can be treated in a microwave oven. Immunohistochemical staining can be performed using the avidin-biotin immunoperoxidase technique. The mouse monoclonal antibody against human CD10, clone 56C6, can be used as a 1:20 dilution. The mouse IgG1 antibody MOPC-31C can be used as a negative control of the same isotype. Then, the contraction of the sections with Mayer's hematoxylin is performed. CD10 immunoreactivity is indicated by a brown stain specifically around the periphery of positive cells in tissue treated with human anti-CD10, but not isotype control. These tumors are targets for treatment with a prodrug that is susceptible to excision by CD10.

[0196] De forma similar, otros tumores humanos no sólidos que pueden ser positivos para CD10, tales como tumores hematológicos que pueden no ser accesibles por biopsia, pueden explorarse para determinar la presencia de CD10 por inmunoquímica y analizarse mediante métodos con citómetro de flujo clínico convencional (por ejemplo, FACS). Dichos tumores que se exploran como positivos también serían dianas para un profármaco escindible por CD10. Los ensayos in vitro con la línea celular Ramos (linfoma de células B humano) indican que CD10 puede detectarse fácilmente en células mediante este método. [0196] Similarly, other non-solid human tumors that may be positive for CD10, such as hematologic tumors that may not be accessible by biopsy, can be screened for the presence of CD10 by immunochemistry and analyzed by clinical flow cytometer methods conventional (for example, FACS). Such tumors that are screened as positive would also be targets for a prodrug cleavable by CD10. In vitro assays with the Ramos cell line (human B cell lymphoma) indicate that CD10 can be easily detected in cells by this method.

Diagnóstico o ensayo Diagnosis or trial

[0197] También se describe un artículo de fabricación, tal como un kit, para el diagnóstico o ensayo. Dicho artículo de fabricación utilizaría preferentemente un compuesto como se ha descrito anteriormente, excepto por el hecho de que un marcador, tal como cumarina, se conjuga con el oligopéptido y el grupo estabilizante en lugar de un agente terapéutico. Un marcador como se usa se define como cualquier resto que puede conjugarse con el oligopéptido y que es fácilmente detectable por cualquier método conocido en la técnica. Típicamente se incluye como parte del kit al menos un reactivo útil en la detección del marcador. Por lo tanto, el artículo de fabricación incluiría lo siguiente: [0197] An article of manufacture, such as a kit, is also described for diagnosis or testing. Said article of manufacture would preferably use a compound as described above, except for the fact that a label, such as coumarin, is conjugated with the oligopeptide and the stabilizing group instead of a therapeutic agent. A marker as used is defined as any moiety that can be conjugated to the oligopeptide and that is easily detectable by any method known in the art. Typically, at least one reagent useful in the detection of the label is included as part of the kit. Therefore, the article of manufacture would include the following:

(1) un compuesto que comprende: (1) a compound comprising:

(a)(to): un marcador, a marker,

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

(c)(C): un grupo estabilizante, y a stabilizing group, and

(d)(d): opcionalmente, un grupo enlazador, en el que el oligopéptido se une directamente al grupo estabilizante en un primer sitio de unión del oligopéptido y el oligopéptido se une directamente al marcador o se une indirectamente a través del grupo enlazador al marcador en un segundo sitio de unión del oligopéptido, optionally, a linker group, wherein the oligopeptide binds directly to the stabilizing group at a first binding site of the oligopeptide and oligopeptide binds directly to the label or binds indirectly through the group linker to the marker at a second oligopeptide binding site,

en el que el grupo estabilizante obstaculiza la escisión del compuesto por enzimas presentes en sangre completa, y en el que el compuesto es escindible por CD10, y in which the stabilizing group hinders the cleavage of the compound by enzymes present in whole blood, and in which the compound is cleavable by CD10, and

(2) al menos un reactivo útil en la detección de dicho marcador. (2) at least one reagent useful in detecting said marker.

Preferentemente, n es 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3. Preferably, n is 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3.

[0198] El artículo de fabricación puede usarse, por ejemplo, con muestras de pacientes para diagnosticar tumores [0198] The article of manufacture can be used, for example, with patient samples to diagnose tumors

o para identificar pacientes susceptibles a tratamiento por terapia con profármaco. or to identify patients susceptible to treatment by prodrug therapy.

Procedimientos generales de química de proceso General process chemistry procedures

Oligopéptido: Método general para la síntesis de péptidos Oligopeptide: General method for peptide synthesis

[0199] Las secuencias peptídicas, u oligopeptídicas, en los conjugados de profármaco de esta invención pueden sintetizarse mediante la síntesis de péptidos en fase sólida (usando química de Boc o Fmoc) o por síntesis en fase de solución. Los métodos de Boc y Fmoc generales se usan ampliamente y se describen en las referencias siguientes: Merrifield, J. A. Chem. Soc., 88: 2149 (1963); Bodanszky y Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín, 7-161 (1994); Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical, Rockford, (1984). [0199] The peptide, or oligopeptide, sequences in the prodrug conjugates of this invention can be synthesized by solid phase peptide synthesis (using Boc or Fmoc chemistry) or by solution phase synthesis. The general Boc and Fmoc methods are widely used and are described in the following references: Merrifield, J. A. Chem. Soc., 88: 2149 (1963); Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 7-161 (1994); Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical, Rockford, (1984).

Método general en fase sólida de Fmoc Fmoc solid phase general method

[0200] Usando el método de síntesis en fase sólida preferido, automático o manual, se sintetiza un péptido de secuencia y longitud deseada mediante la adición por etapas de aminoácidos a una cadena en crecimiento que está unida a una resina sólida. Los ejemplos de resinas compatibles con Fmoc útiles incluyen resina de Wang, resina HMPA-PEGA, resina ácida de Rink o una resina de hidroxietil-fotoenlazador. El extremo C-terminal de la cadena peptídica se une covalentemente a una resina polimérica y se añaden -aminoácidos protegidos de una forma por etapas con un reactivo de acoplamiento. Un grupo protector -amino preferido es el grupo Fmoc, que es estable en las condiciones de acoplamiento y puede eliminarse fácilmente en condiciones alcalinas suaves. Los disolventes de reacción son preferentemente DMF, NMP, DCM, MeOH y EtOH. Son ejemplos de agentes de acoplamiento: DCC, DIC, HATU, HBTU. La escisión del grupo protector N-terminal se efectúa en piperidina al 10-100% en DMF a 0-40 ºC, prefiriéndose la temperatura ambiente. Al final de la síntesis, el grupo protector Fmoc final se elimina usando el procedimiento de escisión N-terminal anterior. El péptido restante en la resina se escinde de la resina junto con cualquier grupo protector de cadena lateral sensible a ácido por tratamiento de la resina en condiciones ácidas. Por ejemplo, una condición de escisión ácida es una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano. Si se usa la resina de hidroxietil-fotoenlazador, la longitud de onda apropiada para inducir la escisión es luz ultravioleta de  365 nm. Se proporciona una representación esquemática de este procedimiento en la FIG. 3. [0200] Using the preferred solid phase synthesis method, automatic or manual, a desired sequence and length peptide is synthesized by stepwise addition of amino acids to a growing chain that is attached to a solid resin. Examples of useful Fmoc-compatible resins include Wang resin, HMPA-PEGA resin, Rink acid resin or a hydroxyethyl photo linker resin. The C-terminal end of the peptide chain is covalently linked to a polymeric resin and protegidos-protected amino acids are added in a stepwise manner with a coupling reagent. A preferred -amino protecting group is the Fmoc group, which is stable under the coupling conditions and can be easily removed under mild alkaline conditions. The reaction solvents are preferably DMF, NMP, DCM, MeOH and EtOH. Examples of coupling agents are: DCC, DIC, HATU, HBTU. The cleavage of the N-terminal protecting group is performed in 10-100% piperidine in DMF at 0-40 ° C, with room temperature being preferred. At the end of the synthesis, the final Fmoc protecting group is removed using the above N-terminal cleavage procedure. The remaining peptide in the resin is cleaved from the resin together with any acid-sensitive side chain protecting group by treatment of the resin under acidic conditions. For example, an acid cleavage condition is a mixture of trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane. If the hydroxyethyl photo linker resin is used, the appropriate wavelength to induce excision is ultra 365 nm ultraviolet light. A schematic representation of this procedure is provided in FIG. 3.

Método general de protección N-terminal mediante síntesis en fase sólida General method of N-terminal protection by solid phase synthesis

[0201] La preparación de péptidos derivatizados en su extremo N-terminal se logra convenientemente en fase sólida. Cuando se completa la síntesis del péptido, el Fmoc terminal se elimina mientras que el péptido está todavía en el soporte sólido. La protección N-terminal de elección se acopla a continuación usando condiciones de acoplamiento de péptidos convencionales sobre el extremo N-terminal del péptido. A la finalización del acoplamiento de la protección N-terminal, el péptido se escinde de la resina usando el procedimiento descrito anteriormente si se usa el procedimiento de síntesis de Fmoc. [0201] The preparation of derivatized peptides at their N-terminal end is conveniently achieved in solid phase. When the peptide synthesis is complete, the terminal Fmoc is removed while the peptide is still in the solid support. The N-terminal protection of choice is then coupled using conventional peptide coupling conditions on the N-terminal end of the peptide. Upon completion of the N-terminal protection coupling, the peptide is cleaved from the resin using the procedure described above if the Fmoc synthesis procedure is used.

Método general en fase sólida de Boc General solid phase method of Boc

[0202] Para el método en fase sólida usando química de Boc, es útil la resina de Merrifield o resina de PAM. Los aminoácidos se acoplan a la cadena en crecimiento en fase sólida por adiciones sucesivas de aminoácidos protegidos con Boc activados por agente de acoplamiento. Son ejemplos de agentes de acoplamiento: DCC, DIC, HATU y HBTU. Los disolventes de reacción pueden ser DMF, DCM, MeOH o NMP. La escisión del grupo protector Boc se efectúa en TFA al 10-100% en DCM a 0-40 ºC, prefiriéndose la temperatura ambiente. A la finalización del ensamblaje de la cadena peptídica, el grupo protector N-terminal (habitualmente Boc) se elimina como se ha descrito anteriormente. El péptido se elimina de la resina usando HF líquido o ácido trifluorometano sulfónico en diclorometano. [0202] For the solid phase method using Boc chemistry, Merrifield resin or PAM resin is useful. The amino acids are coupled to the solid phase growing chain by successive additions of Boc protected amino acids activated by coupling agent. Examples of coupling agents are: DCC, DIC, HATU and HBTU. The reaction solvents can be DMF, DCM, MeOH or NMP. The cleavage of the Boc protecting group is performed in 10-100% TFA in DCM at 0-40 ° C, with room temperature being preferred. Upon completion of the peptide chain assembly, the N-terminal protecting group (usually Boc) is removed as described above. The peptide is removed from the resin using liquid HF or trifluoromethane sulfonic acid in dichloromethane.

Procedimiento general para la preparación de oligopéptido con Fmoc por síntesis en fase de solución General procedure for the preparation of oligopeptide with Fmoc by solution phase synthesis

[0203] Como alternativa, el intermediario peptídico de profármaco puede generarse mediante una síntesis en fase sólida, utilizando química de Boc o Fmoc. En la presentación esquemática de los métodos (FIG. 4), el tetrapéptido Leu C-terminal se usa generalmente como ejemplo, pero se entenderá que también pueden realizarse reacciones similares con otros péptidos C-terminales de cualquier longitud. El péptido puede construirse mediante el ensamblaje por etapas análogo al método en fase sólida (en la dirección N-terminal o en la dirección C-terminal) o mediante el acoplamiento de, por ejemplo, dos dipéptidos convenientemente protegidos o un tripéptido con un solo aminoácido. [0203] Alternatively, the prodrug peptide intermediate can be generated by solid phase synthesis, using Boc or Fmoc chemistry. In the schematic presentation of the methods (FIG. 4), the C-terminal Leu tetrapeptide is generally used as an example, but it will be understood that similar reactions can also be performed with other C-terminal peptides of any length. The peptide can be constructed by stepwise assembly analogous to the solid phase method (in the N-terminal direction or in the C-terminal direction) or by coupling, for example, two conveniently protected dipeptides or a tripeptide with a single amino acid .

[0204] Un método de síntesis en fase de solución es una construcción por etapas del intermediario peptídico de profármaco usando química de Fmoc, mostrado en la FIG. 4. El extremo C-terminal debe protegerse para reducir la formación de productos secundarios. El grupo R C-terminal en la FIG. 4 es Me, tBu, bencilo o TCE. (Obsérvese que cuando la protección N-terminal es metil succinilo, el grupo R C-terminal no puede ser metilo). Aunque se proporciona DMF como disolvente, otros disolventes tales como DMSO, CH3CN o NMP (o mezclas de los mismos) pueden sustituirlo. La piridina, Et3N u otras bases pueden sustituir a la piperidina en la desprotección del extremo amino-terminal protegido de la cadena peptídica en crecimiento. De forma similar, aunque HBTU se proporciona en el diagrama anterior como el agente activante, pueden usarse otros agentes activantes tales como DCC, DIC, DCC [0204] A solution phase synthesis method is a stepwise construction of the prodrug peptide intermediate using Fmoc chemistry, shown in FIG. 4. The C-terminal end must be protected to reduce the formation of secondary products. The C-terminal R group in FIG. 4 is Me, tBu, benzyl or TCE. (Note that when the N-terminal protection is methyl succinyl, the C-terminal R group cannot be methyl). Although DMF is provided as a solvent, other solvents such as DMSO, CH3CN or NMP (or mixtures thereof) can replace it. Pyridine, Et3N or other bases can replace piperidine in the deprotection of the protected amino-terminal end of the growing peptide chain. Similarly, although HBTU is provided in the above diagram as the activating agent, other activating agents such as DCC, DIC, DCC can be used.

+ HOBt, OSu, ésteres activados, azida o trifenil fosforil azida. Además, el cloruro de ácido o bromuro de ácido del péptido protegido puede usarse para acoplarse directamente con el aminoácido o fragmento peptídico. A la finalización del ensamblaje del oligopéptido, el extremo N-terminal se desprotege y el péptido protegido en su extremo C-terminal está listo para aceptar la protección N-terminal deseada. + HOBt, OSu, activated esters, azide or triphenyl phosphoryl azide. In addition, the acid chloride or acid bromide of the protected peptide can be used to directly couple with the amino acid or peptide fragment. Upon completion of the oligopeptide assembly, the N-terminal end is unprotected and the protected peptide at its C-terminal end is ready to accept the desired N-terminal protection.

Procedimiento general para la preparación de oligopéptido con protección N-terminal mediante síntesis en fase de solución General procedure for the preparation of oligopeptide with N-terminal protection by solution phase synthesis

[0205] Cuando se construye el oligopéptido con protección N-terminal mediante síntesis en fase de solución, la protección N-terminal tiene que sintetizarse mediante un procedimiento ligeramente modificado (FIG. 4). En primer lugar, el extremo C-terminal del oligopéptido Fmoc tiene que protegerse con un grupo protector inestable a ácido o sensible a la hidrogenación compatible con la desprotección selectiva del extremo C-terminal sobre la protección N-terminal. Después, el grupo protector Fmoc tiene que eliminarse del oligopéptido para dejar al descubierto el extremo N-terminal. Con el extremo N-terminal desprotegido y el extremo C-terminal protegido, el oligopéptido se hace reaccionar con el hemiéster activado de la protección N-terminal deseada. La protección N-terminal puede activarse usando métodos para activar aminoácidos tales como DCC o HATU en una base y un disolvente apropiado. Como alternativa, cuando se usa el metil-hemisuccinato, el acoplamiento también puede realizarse mediante cloruro de metil hemisuccinilo (u otro haluro de ácido) (FIG. 4) usando un disolvente inerte en presencia de una base orgánica o inorgánica, tal como DIEA, trietilamina o Cs2CO3. Un ejemplo de dicha síntesis incluye hacer reaccionar metil-hemisuccinato y éster Ala-Ile-Ala-Leu bencílico. El método de acoplamiento puede ser cualquiera de los métodos usados generalmente en la técnica (véase, por ejemplo: Bodanszky, M., The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 185 (1984); Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 159 (1984). El grupo bencílico puede eliminarse después por hidrogenación catalítica, proporcionando la forma con protección N-terminal metil-succinilo deseada de un oligopéptido. Otros ejemplos de grupos protectores C-terminales adecuados que pueden eliminarse selectivamente pueden ser, pero sin limitación, tBu, alcoxi-metilo y TCE. Se describen en la bibliografía otros métodos de realización de esta etapa. [0205] When the oligopeptide with N-terminal protection is constructed by solution phase synthesis, the N-terminal protection has to be synthesized by a slightly modified procedure (FIG. 4). First, the C-terminal end of the Fmoc oligopeptide has to be protected with an acid-unstable or hydrogenation sensitive protecting group compatible with the selective deprotection of the C-terminal end over the N-terminal protection. Next, the Fmoc protecting group has to be removed from the oligopeptide to expose the N-terminal end. With the N-terminal end unprotected and the C-terminal end protected, the oligopeptide is reacted with the activated hemiester of the desired N-terminal protection. N-terminal protection can be activated using methods to activate amino acids such as DCC or HATU in a base and an appropriate solvent. Alternatively, when methyl hemisuccinate is used, the coupling can also be performed by methyl hemisuccinyl chloride (or other acid halide) (FIG. 4) using an inert solvent in the presence of an organic or inorganic base, such as DIEA, triethylamine or Cs2CO3. An example of such synthesis includes reacting methyl-hemisuccinate and Ala-Ile-Ala-Leu benzyl ester. The coupling method can be any of the methods generally used in the art (see, for example: Bodanszky, M., The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 185 (1984); Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 159 (1984) The benzyl group can then be removed by catalytic hydrogenation, providing the desired N-terminal methyl succinyl protected form of an oligopeptide Other examples of suitable C-terminal protecting groups that can be selectively removed may be, but without limitation, tBu, alkoxy-methyl and TCE Other methods of carrying out this step are described in the literature.

[0206] Puede considerarse cualquier combinación del método anterior, tal como la “condensación de fragmento” de di- o tripéptidos. Las condiciones de reacción son bien conocidas en la técnica y se detallan en las citas proporcionadas. La ventaja de los métodos descritos anteriormente es la fácil purificación del producto producido por síntesis en fase de solución. [0206] Any combination of the above method, such as "fragment condensation" of di- or tripeptides can be considered. The reaction conditions are well known in the art and are detailed in the citations provided. The advantage of the methods described above is the easy purification of the product produced by solution phase synthesis.

Conjugado de profármaco Prodrug Conjugate

Métodos generales para las etapas de conjugación y desprotección General methods for conjugation and deprotection stages

[0207] La forma con protección N-terminal del oligopéptido-agente terapéutico descrito en esta invención puede sintetizarse por acoplamiento de una forma con Fmoc (que significa que está unido Fmoc al extremo N-terminal del oligopéptido) del oligopéptido con daunorrubicina, doxorrubicina o cualquier agente terapéutico apropiado usando cualquiera de los reactivos activantes convencionales usados en la síntesis de péptidos (FIG. 5). El disolvente puede ser tolueno, acetato de etilo, DMF, DMSO, CH3 CN, NMP, THF, DCM o cualquier otro disolvente inerte adecuado como se conoce en la técnica, y los reactivos son solubles en el mismo. Los disolventes preferidos son DMF y NMP. El intervalo de temperatura apropiado es de -25 a +25 ºC, prefiriéndose la temperatura ambiente. El agente activante puede seleccionarse de uno de los siguientes: PyBOP, HBTU, HATU, EDC, DIC, DCC, DCC + HOBT, ésteres activados con OSu, azida o trifenilfosforilazida. HBTU o HATU es el agente activante preferido. Como alternativa, el cloruro de ácido o el bromuro de ácido del péptido protegido también puede usarse para esta reacción de acoplamiento. Son necesarios 2-4 equivalentes, ventajosamente 2-2,5 equivalentes de una base para la reacción de acoplamiento. La base puede seleccionarse de bases inorgánicas tales como CsCO3, Na2CO3 o K2CO3, o bases orgánicas, tales como TEA, DIEA, DBU, DBN, DBO, piridina, piridinas sustituidas, N-metil-morfolina, etc., preferentemente TEA o DIEA. La reacción puede llevarse a cabo a temperaturas de entre -15 ºC y 50 ºC, ventajosamente entre -10 ºC y 10 ºC. El tiempo de reacción es de entre 5-90 minutos y es ventajosamente de 20-40 minutos. El producto se aísla vertiendo la mezcla de reacción en agua y filtrando el precipitado formado. El producto bruto puede purificarse adicionalmente por recristalización a partir de DCM, THF, acetato de etilo o acetonitrilo, preferentemente a partir de diclorometano o acetonitrilo. La forma con Fmoc aislada del conjugado de oligopéptidoagente terapéutico se desprotege después durante 2-90 minutos, preferentemente 3-8 minutos, usando un exceso de diez a cien veces de base a una temperatura de entre -10 ºC y 50 ºC. Idealmente, se prefieren 5-60 equivalentes de la base. La piperidina es la base preferida para desproteger grupos Fmoc. El extremo amino-terminal desprotegido del conjugado de oligopéptido-agente terapéutico se acila mediante un anhídrido de diácido o un diácido activado hemi protegido (es decir, un monoéster que posteriormente se desprotege) para dar la forma con protección N-terminal final del oligopéptido-agente terapéutico. [0207] The N-terminal protected form of the oligopeptide-therapeutic agent described in this invention can be synthesized by coupling in a way with Fmoc (meaning that Fmoc is attached to the N-terminal end of the oligopeptide) of the oligopeptide with daunorubicin, doxorubicin or any appropriate therapeutic agent using any of the conventional activating reagents used in peptide synthesis (FIG. 5). The solvent may be toluene, ethyl acetate, DMF, DMSO, CH3 CN, NMP, THF, DCM or any other suitable inert solvent as is known in the art, and the reagents are soluble therein. Preferred solvents are DMF and NMP. The appropriate temperature range is from -25 to +25 ° C, with room temperature being preferred. The activating agent may be selected from one of the following: PyBOP, HBTU, HATU, EDC, DIC, DCC, DCC + HOBT, esters activated with OSu, azide or triphenylphosphorylazide. HBTU or HATU is the preferred activating agent. Alternatively, the acid chloride or acid bromide of the protected peptide can also be used for this coupling reaction. 2-4 equivalents are needed, advantageously 2-2.5 equivalents of a base for the coupling reaction. The base may be selected from inorganic bases such as CsCO3, Na2CO3 or K2CO3, or organic bases, such as TEA, DIEA, DBU, DBN, BOD, pyridine, substituted pyridines, N-methyl morpholine, etc., preferably TEA or DIEA. The reaction can be carried out at temperatures between -15 ° C and 50 ° C, advantageously between -10 ° C and 10 ° C. The reaction time is between 5-90 minutes and is advantageously 20-40 minutes. The product is isolated by pouring the reaction mixture into water and filtering the precipitate formed. The crude product can be further purified by recrystallization from DCM, THF, ethyl acetate or acetonitrile, preferably from dichloromethane or acetonitrile. The Fmoc form isolated from the therapeutic oligopeptide conjugate conjugate is then deprotected for 2-90 minutes, preferably 3-8 minutes, using an excess of ten to one hundred times of base at a temperature between -10 ° C and 50 ° C. Ideally, 5-60 equivalents of the base are preferred. Piperidine is the preferred base for deprotecting Fmoc groups. The unprotected amino-terminal end of the oligopeptide-therapeutic agent conjugate is acylated by a diacid anhydride or a protected hemi activated diacid (i.e., a monoester that is subsequently deprotected) to form the final N-terminal protection of the oligopeptide. therapeutic agent

[0208] Como alternativa, el profármaco final puede prepararse de forma similar a partir de la forma con protección N-terminal protegida del oligopéptido, tal como una forma de metil hemiéster de oligopéptido con protección N-terminal succinilo, y conjugarse con un agente terapéutico. Este método se ilustra en la FIG. 6. [0208] Alternatively, the final prodrug may similarly be prepared from the N-terminal protected form of the oligopeptide, such as a methyl hemiester form of oligopeptide with N-terminal succinyl protection, and conjugated to a therapeutic agent. . This method is illustrated in FIG. 6.

[0209] La protección N-terminal-oligopéptido-agente terapéutico protegida se desprotege ahora por métodos compatibles con la estabilidad del agente terapéutico. Por ejemplo, las dicarboxil-peptidil-antraciclinas pueden protegerse con un grupo metilo y desprotegerse con una esterasa. Para otros agentes terapéuticos, pueden seleccionarse grupos protectores bencilo e hidrogenación catalítica para desprotegerlos. [0209] The N-terminal-oligopeptide-protected therapeutic agent protection is now deprotected by methods compatible with the stability of the therapeutic agent. For example, dicarboxy-peptidyl anthracyclines can be protected with a methyl group and deprotected with an esterase. For other therapeutic agents, benzyl and catalytic hydrogenation protecting groups can be selected to protect them.

[0210] La forma de sal de protección N-terminal-oligopéptido-agente terapéutico cargado negativamente se lleva a cabo con un disolvente seleccionado del grupo siguiente: alcohol (incluyendo metanol, etanol o isopropanol), agua, acetonitrilo, tetrahidrofurano, diglime u otros disolventes polares. La fuente de sodio es un equivalente molar de NaHCO3 , NaOH, Na2CO3 , NaOAc, NaOCH3 (en general alcóxido de sodio) o NaH. También es útil una columna de intercambio iónico cargada con Na+ (tal como intercambiadores iónicos fuertes o débiles) para esta última etapa de preparación de la forma de sal de protección N-terminal-oligopéptido-agente terapéutico cuando sea apropiado. Se describe sodio como ejemplo solamente. [0210] The N-terminal-oligopeptide-negatively charged therapeutic agent salt form is carried out with a solvent selected from the following group: alcohol (including methanol, ethanol or isopropanol), water, acetonitrile, tetrahydrofuran, diglyme or others polar solvents The source of sodium is a molar equivalent of NaHCO3, NaOH, Na2CO3, NaOAc, NaOCH3 (in general sodium alkoxide) or NaH. Also useful is an ion exchange column loaded with Na + (such as strong or weak ion exchangers) for this last stage of preparation of the N-terminal-oligopeptide-therapeutic agent protective salt form when appropriate. Sodium is described as an example only.

[0211] Generalmente, el profármaco puede convertirse en una forma de sal farmacéuticamente aceptable para mejorar la solubilidad del profármaco. La protección N-terminal-oligopéptido-agente terapéutico se neutraliza con una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, NaHCO3, Na2CO3, NaOH tris(hidroximetil)aminometano, KHCO3 , K2CO3 , CaCO3, NH4OH, CH3NH2, (CH3)2NH, (CH3)3N, acetiltrietilamonio. La forma de sal preferida de profármaco es sodio y la sal neutralizante preferida es NaHCO3. [0211] Generally, the prodrug can be converted into a pharmaceutically acceptable salt form to improve the solubility of the prodrug. The N-terminal-oligopeptide-therapeutic agent protection is neutralized with a pharmaceutically acceptable salt, for example, NaHCO3, Na2CO3, NaOH tris (hydroxymethyl) aminomethane, KHCO3, K2CO3, CaCO3, NH4OH, CH3NH2, (CH3) 2NH, (CH3) 3N, acetyltriethylammonium. The preferred form of prodrug salt is sodium and the preferred neutralizing salt is NaHCO3.

[0212] Está bien documentado que las moléculas de tipo antraciclina, incluyendo doxorrubicina y daunorrubicina, forman geles en disolventes orgánicos a concentraciones muy reducidas (Matzanke, B. F., et al., Eur. J. Biochem., [0212] It is well documented that anthracycline-like molecules, including doxorubicin and daunorubicin, form gels in organic solvents at very low concentrations (Matzanke, B. F., et al., Eur. J. Biochem.,

207: 747-55 (1992); Chaires, J. B., et al., Biochemistry, 21: 3927-32 (1982); Hayakawa, E., et al., Chem. Pharm. Bull, 207: 747-55 (1992); Chaires, J. B., et al., Biochemistry, 21: 3927-32 (1982); Hayakawa, E., et al., Chem. Pharm. Bull,

39: 1282-6 (1991). Esto puede ser un obstáculo considerable para obtener altos rendimientos de producto limpio cuando se preparan conjugados de péptido-antraciclina. La formación de gel contribuye a la formación de reacciones secundarias indeseables. Una forma de minimizar este problema es usar soluciones muy diluidas (1-2%) para la reacción de acoplamiento, sin embargo, esto no es práctico en el entorno de un procedimiento (grandes cantidades de desechos, aislamiento complicado). Para superar este problema puede usarse urea u otros agentes caotrópicos para romper las fuerzas de formación de enlaces de hidrógeno e hidrófobas fuertes que forman el gel. Por lo tanto, si la reacción de acoplamiento se lleva a cabo en un disolvente que contiene urea, ventajosamente de un 20% a una solución saturada de urea en DMF o NMP, las reacciones secundarias pueden mantenerse por debajo del 2% incluso si la concentración de reactivos supera el 10%. Esto hace que la etapa de conjugación sea práctica a altas concentraciones y produzca buenos rendimientos. 39: 1282-6 (1991). This can be a considerable obstacle to obtaining high yields of clean product when preparing peptide-anthracycline conjugates. Gel formation contributes to the formation of undesirable side reactions. One way to minimize this problem is to use very dilute solutions (1-2%) for the coupling reaction, however, this is not practical in the environment of a procedure (large amounts of waste, complicated insulation). To overcome this problem, urea or other chaotropic agents can be used to break the forces of hydrogen bonding and strong hydrophobes that form the gel. Therefore, if the coupling reaction is carried out in a urea-containing solvent, advantageously from 20% to a saturated urea solution in DMF or NMP, the secondary reactions can be maintained below 2% even if the concentration of reagents exceeds 10%. This makes the conjugation stage practical at high concentrations and produces good yields.

Método enzimático general General Enzymatic Method

[0213] La hidrólisis de protección N-terminal-oligopéptido-agentes terapéuticos protegidos en el compuesto con protección N-terminal completo catalizada por ácidos o bases conduce a mezclas de reacción complejas debido a la inestabilidad de muchos agentes terapéuticos incluso en condiciones moderadamente ácidas o básicas. Las enzimas pueden promover la hidrólisis sin destruir el sustrato o el producto. Las enzimas adecuadas para esta reacción pueden ser esterasas o lipasas y pueden estar en su forma natural, hidrosoluble o inmovilizadas por acoplamiento cruzado o unión a materiales de soporte sólido disponibles en el mercado. De las enzimas solubles evaluadas, es especialmente útil la lipasa de Candida antarctica “B” (Altus Biologics). Un ejemplo de una enzima inmovilizada por acoplamiento cruzado es ChiroCLEC-PC (Altus Biologics). La lipasa de Candida antarctica “B” (Altus Biologics) puede inmovilizarse por reacción con Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS (American Pharmacia Biotech). El pH de la mezcla de reacción durante la hidrólisis se controla cuidadosamente y se mantiene mediante un pH-stato entre 5,5 y 7,5, ventajosamente entre 5,7 y 6,5, mediante la adición controlada de solución de NaHCO3. Cuando la reacción se completa el producto se aísla por liofilización de la mezcla de reacción filtrada. Las enzimas inmovilizadas permanecen en la torta de filtro y pueden reutilizarse si se desea. [0213] The hydrolysis of N-terminal-oligopeptide-protected therapeutic agents protected in the compound with complete N-terminal protection catalyzed by acids or bases leads to complex reaction mixtures due to the instability of many therapeutic agents even under moderately acidic conditions or basic. Enzymes can promote hydrolysis without destroying the substrate or product. The enzymes suitable for this reaction may be esterases or lipases and may be in their natural form, water soluble or immobilized by cross coupling or binding to commercially available solid support materials. Of the soluble enzymes evaluated, Candida antarctica lipase "B" (Altus Biologics) is especially useful. An example of a cross-linked immobilized enzyme is ChiroCLEC-PC (Altus Biologics). Candida antarctica lipase "B" (Altus Biologics) can be immobilized by reaction with NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (American Pharmacia Biotech). The pH of the reaction mixture during hydrolysis is carefully controlled and maintained by a pH-stato between 5.5 and 7.5, advantageously between 5.7 and 6.5, by the controlled addition of NaHCO3 solution. When the reaction is complete the product is isolated by lyophilization of the filtered reaction mixture. The immobilized enzymes remain in the filter cake and can be reused if desired.

Método general de éster alílico o alquílico General method of allyl or alkyl ester

[0214] El profármaco también puede prepararse por acoplamiento de una forma alil-hemiéster o alquil-hemiéster del oligopéptido con protección N-terminal con un agente terapéutico, y liberación después del ácido libre del conjugado. La FIG. 8 ilustra este procedimiento con succinil-Ala-Ile-Ala-Leu y doxorrubicina. [0214] The prodrug can also be prepared by coupling in an allyl hemiester or alkyl hemiester form of the oligopeptide with N-terminal protection with a therapeutic agent, and release after free conjugate acid. FIG. 8 illustrates this procedure with succinyl-laAla-Ile-Ala-Leu and doxorubicin.

[0215] El acoplamiento de alil-succinil-Ala-Ile-Ala-Leu con doxorrubicina puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos de conjugación con oligopéptidos. [0215] The coupling of allyl-succinyl-laAla-Ile-Ala-Leu with doxorubicin can be carried out by any of the oligopeptide conjugation methods.

[0216] El alil-succinil-Ala-Ile-Ala-Leu-doxorrubicina también puede sintetizarse por reacción de alil hemisuccinato, que se preparó mediante métodos conocidos (Casimir, J. R., et al., Tet. Lett. 36/19 3409 (1995)), con Ala-Ile-AlaLeu-doxorrubicina de forma similar al acoplamiento de los precursores tetrapeptídicos protegidos con doxorrubicina que se describió en los métodos anteriores, mostrado en la FIG. 5. Son disolventes inertes adecuados THF, diclorometano, acetato de etilo, tolueno, preferentemente THF, a partir del cual precipita la forma de ácido del producto a medida que se desarrolla la reacción. El ácido aislado se convierte en su sal de sodio como se ha descrito anteriormente. Los tiempos de reacción varían entre 10-180 minutos, ventajosamente 10-60 minutos, a temperaturas entre 0-60 ºC, preferentemente 15-30 ºC. [0216] Allyl-succinyl-laAla-Ile-Ala-Leu-doxorubicin can also be synthesized by reaction of allyl hemisuccinate, which was prepared by known methods (Casimir, JR, et al., Tet. Lett. 36/19 3409 (1995)), with Ala-Ile-AlaLeu-doxorubicin in a manner similar to the coupling of tetrapeptide precursors protected with doxorubicin described in the above methods, shown in FIG. 5. Suitable inert solvents are THF, dichloromethane, ethyl acetate, toluene, preferably THF, from which the acid form of the product precipitates as the reaction proceeds. The isolated acid is converted into its sodium salt as described above. Reaction times vary between 10-180 minutes, advantageously 10-60 minutes, at temperatures between 0-60 ° C, preferably 15-30 ° C.

[0217] La eliminación del grupo alilo o alquilo puede realizarse con Pd(0) o Ni(0), ventajosamente transferencia promovida por Pd(0) del grupo alilo o alquilo a moléculas aceptoras, como se conoce bien en la técnica y está documentado en la bibliografía científica (Genet, J-P, et al., Tet. Lett., 50, 497, 1994; Bricout, H., et al. Tet. Lett., 54: 1073 (1998), Genet, J-P. et al. Synlett, 680 (1993); Waldmann, H., et al., Bioorg. Med. Chem., 7: 749 (1998); Shaphiro, G., Buechler, D., Tet. Lett., 35: 5421 (1994)). La cantidad de catalizador puede ser del 0,5-25% mol respecto al sustrato. [0217] The removal of the allyl or alkyl group can be carried out with Pd (0) or Ni (0), advantageously transfer promoted by Pd (0) from the allyl or alkyl group to acceptor molecules, as is well known in the art and is documented. in the scientific literature (Genet, JP, et al., Tet. Lett., 50, 497, 1994; Bricout, H., et al. Tet. Lett., 54: 1073 (1998), Genet, JP. et al. Synlett, 680 (1993); Waldmann, H., et al., Bioorg. Med. Chem., 7: 749 (1998); Shaphiro, G., Buechler, D., Tet. Lett., 35: 5421 ( 1994)). The amount of catalyst can be 0.5-25% mol with respect to the substrate.

Método general de tritilo o tritilo sustituido General method of trityl or substituted trityl

[0218] El profármaco también puede sintetizarse mediante el método mostrado en la FIG. 7. Esta estrategia utiliza un R’-oligopéptido en el que R’ es tritilo o tritilo sustituido. El acoplamiento de R’-oligopéptido con un agente terapéutico puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente para la conjugación de un oligopéptido protegido con un agente terapéutico en 30-120 minutos a 0-20 ºC. [0218] The prodrug can also be synthesized by the method shown in FIG. 7. This strategy uses an R’-oligopeptide in which R ’is trityl or substituted trityl. The coupling of R’-oligopeptide with a therapeutic agent can be carried out by any of the methods described above for the conjugation of a protected oligopeptide with a therapeutic agent in 30-120 minutes at 0-20 ° C.

[0219] La eliminación del grupo tritilo o tritilo sustituido puede conseguirse en condiciones ácidas para dar el profármaco cargado positivamente. Este profármaco cargado positivamente está protegido N-terminalmente como se ilustra en la FIG. 4 y se ha descrito anteriormente. La desprotección de tritilo puede efectuarse con ácido acético, ácido fórmico y ácido clorhídrico diluido. [0219] Removal of the substituted trityl or trityl group can be achieved under acidic conditions to give the positively charged prodrug. This positively charged prodrug is N-terminally protected as illustrated in FIG. 4 and described above. Deprotection of trityl can be carried out with acetic acid, formic acid and dilute hydrochloric acid.

[0220] El profármaco puede convertirse en (succinil o glutaril)-oligopéptido-agente terapéutico por reacción con anhídrido succínico o anhídrido glutárico, después convertirse adicionalmente en cualquier sal farmacéuticamente aceptable. El disolvente para la etapa de acoplamiento puede ser DMF, DMSO, CH3CN, NMP o cualquier otro disolvente adecuado conocido en la técnica. [0220] The prodrug can be converted into (succinyl or glutaryl) -olipopeptide-therapeutic agent by reaction with succinic anhydride or glutaric anhydride, then further converted into any pharmaceutically acceptable salt. The solvent for the coupling step may be DMF, DMSO, CH3CN, NMP or any other suitable solvent known in the art.

Método general de conjugación en fase sólida de dirección inversa General method of reverse phase solid phase conjugation

[0221] El compuesto de profármaco de la presente invención puede sintetizarse usando química en fase sólida mediante métodos de dirección inversa (del extremo N-terminal al extremo C-terminal) “por etapas”. [0221] The prodrug compound of the present invention can be synthesized using solid phase chemistry by reverse direction methods (from the N-terminus to the C-terminus) "stepwise."

[0222] Una forma es usar resinas para inmovilizar un succinil hemiéster, por ejemplo, éster succinil-mono-bencílico [0222] One way is to use resins to immobilize a succinyl hemiester, for example, succinyl mono-benzyl ester

: o éster succinil-mono-alílico. Son ejemplos de resinas que podrían seleccionarse las “resinas de Wang” (Wang, S. S., J. Am. Chem. Soc., 95: 1328 (1973); Zhang, C., Mjaili, A. M. M., Tet. Lett., 37: 5457(1996)), “resinas de Rink” (Rink., H., Tet. Lett., 28: 3787 (1987)), “resinas de tritilo o tritilo sustituido” (Chen, C., et al., J. Am. Chem. Soc, 116: 2661 (1994); Bartos, K. et al., Peptides, Proc. 22nd European Peptide Symposium (1992); Schneider, C. H.; Eberle, or succinyl mono-allyl ester. Examples of resins that "Wang resins" could be selected (Wang, SS, J. Am. Chem. Soc., 95: 1328 (1973); Zhang, C., Mjaili, AMM, Tet. Lett., 37: 5457 (1996)), "Rink resins" (Rink., H., Tet. Lett., 28: 3787 (1987)), "trityl or substituted trityl resins" (Chen, C., et al., J Am. Chem. Soc, 116: 2661 (1994); Bartos, K. et al., Peptides, Proc. 22nd European Peptide Symposium (1992); Schneider, CH; Eberle,

A.TO.: N. (Eds.), ESCOM, Leiden, pág. 281 (1993). El éster inmovilizado se desprotege después y se hace reaccionar con, por ejemplo, una alanina protegida C-terminalmente de forma similar. Estas etapas se repiten después con isoleucina, alanina y, finalmente, ésteres de leucina, seguidas del acoplamiento de doxorrubicina al succiniltetrapéptido inmovilizado. Después, la molécula se libera de la resina usando condiciones ligeramente ácidas para formar un profármaco libre, tal como Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Esta metodología está representada por el esquema de la FIG. 9. Otra versión de la síntesis de fase utiliza éster de succinil oligopéptido inmovilizado. Después, éste se desprotege C-terminalmente, seguido de la etapa de acoplamiento con doxorrubicina u otro agente terapéutico, y finalmente se libera de la resina como se representa mediante el esquema de la FIG. 9. La forma de ácido de las moléculas de profármaco puede convertirse después finalmente en su sal de sodio como se ha descrito anteriormente. N. (Eds.), ESCOM, Leiden, p. 281 (1993). The immobilized ester is then deprotected and reacted with, for example, a similarly protected C-terminal alanine. These steps are then repeated with isoleucine, alanine and, finally, leucine esters, followed by coupling doxorubicin to the immobilized succinyltetrapeptide. Then, the molecule is released from the resin using slightly acidic conditions to form a free prodrug, such as Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. This methodology is represented by the scheme of FIG. 9. Another version of the phase synthesis uses immobilized succinyl oligopeptide ester. This is then deprotected C-terminally, followed by the docking stage with doxorubicin or other therapeutic agent, and finally released from the resin as represented by the scheme of FIG. 9. The acid form of the prodrug molecules can then finally be converted into their sodium salt as described above.

Síntesis general de compuesto a gran escala General synthesis of large-scale compound

[0223] El compuesto de profármaco puede sintetizarse usando un procedimiento de tres etapas simple y eficaz de la invención: (1) acoplamiento de un grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido y un agente terapéutico en presencia de un agente activante para generar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido-agente terapéutico, (2) eliminación del agente terapéutico no acoplado que queda después de la etapa de acoplamiento y (3) desprotección del conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido-agente terapéutico para generar el compuesto de profármaco de grupo estabilizante-oligopéptido-agente terapéutico. [0223] The prodrug compound can be synthesized using a simple and effective three-step process of the invention: (1) coupling of a stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester and a therapeutic agent in the presence of an activating agent to generate a stabilizing group conjugate protected with alkyl or allyl ester-oligopeptide-therapeutic agent, (2) removal of the uncoupled therapeutic agent remaining after the coupling step and (3) deprotection of the stabilizing group conjugate protected with alkyl or allyl ester -oligopeptide-therapeutic agent to generate the prodrug compound of stabilizing group-oligopeptide-therapeutic agent.

[0224] La primera etapa implica el acoplamiento de un fragmento oligopeptídico protegido con éster alquílico con un agente terapéutico. Una realización preferida de la primera etapa implica el acoplamiento de un grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido, tal como MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-OH, con un agente terapéutico, tal como doxorrubicina (FIG. 27) usando un agente activante, tal como HATU, para dar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido-agente terapéutico, por ejemplo, MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. El centro de esta etapa está en la pureza y el rendimiento del éster metílico, ya que se descubrió que la etapa de hidrólisis no afectaba a la pureza. Preferentemente, la proporción molar del grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido respecto al agente terapéutico será de entre 2:1 y [0224] The first stage involves coupling an oligopeptide fragment protected with alkyl ester with a therapeutic agent. A preferred embodiment of the first stage involves coupling a stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester, such as MeOSuc-laAla-Leu-Ala-Leu-OH, with a therapeutic agent, such as doxorubicin (FIG. 27 ) using an activating agent, such as HATU, to give a stabilizing group conjugate protected with alkyl or allyl ester-oligopeptide-therapeutic agent, for example, MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. The center of this stage is in the purity and performance of the methyl ester, since it was discovered that the hydrolysis stage did not affect the purity. Preferably, the molar ratio of the stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester with respect to the therapeutic agent will be between 2: 1 and

1:1. Más preferentemente, la proporción molar está entre 1,75:1 y 1,5:1. Más preferentemente, la proporción molar es de 1,66:1. 1: 1. More preferably, the molar ratio is between 1.75: 1 and 1.5: 1. More preferably, the molar ratio is 1.66: 1.

[0225] El acoplamiento del grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido y un agente terapéutico se realiza preferentemente por: (a) combinación del grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido y el agente terapéutico en DMF, (b) adición de DIEA, (c) reacción del grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido y el agente terapéutico en presencia del agente activante para formar el conjugado y (d), precipitación del conjugado por adición de una solución de salmuera para formar un precipitado. Preferentemente, la proporción molar del DIEA y el grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido está entre 3:1 y 1,5:1. Más preferentemente, la proporción molar está entre 2,5:1 y 2:1. Más preferentemente, la proporción molar es de 2,18:1. La etapa de reacción se realiza preferentemente a 0 ºC, durante 30 minutos. Preferentemente, la proporción molar del agente activante y el grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido está entre 1,5:1 y 1:1. Más preferentemente, la proporción molar es de 1,1:1. La solución de salmuera está preferentemente entre el 20% (p/v) y el 40% (p/v) de NaCl en agua. Más preferentemente, la solución de salmuera está entre el 25% (p/v) y el 35% (p/v) de NaCl en agua. Más preferentemente, la solución de salmuera es del 30% (p/v) de NaCl en agua. El conjugado se precipita preferentemente en una solución de salmuera, en la que el pH está entre 5,0 y 7,0, ambos inclusive. Más preferentemente, el conjugado se precipita a un pH de entre 5,8 y 6,0. [0225] The coupling of the stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester and a therapeutic agent is preferably performed by: (a) combination of the stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester and the DMF therapeutic agent, (b) addition of DIEA, (c) reaction of the stabilized group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester and the therapeutic agent in the presence of the activating agent to form the conjugate and (d), precipitation of the conjugate by adding a brine solution to form a precipitate. Preferably, the molar ratio of DIEA and the stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester is between 3: 1 and 1.5: 1. More preferably, the molar ratio is between 2.5: 1 and 2: 1. More preferably, the molar ratio is 2.18: 1. The reaction step is preferably performed at 0 ° C, for 30 minutes. Preferably, the molar ratio of the activating agent and the stabilizing group protected with alkyl or allyl-oligopeptide ester is between 1.5: 1 and 1: 1. More preferably, the molar ratio is 1.1: 1. The brine solution is preferably between 20% (w / v) and 40% (w / v) NaCl in water. More preferably, the brine solution is between 25% (w / v) and 35% (w / v) NaCl in water. More preferably, the brine solution is 30% (w / v) NaCl in water. The conjugate is preferably precipitated in a brine solution, in which the pH is between 5.0 and 7.0, inclusive. More preferably, the conjugate is precipitated at a pH between 5.8 and 6.0.

[0226] Puesto que muchos agentes terapéuticos son sustancias tóxicas, es preferible eliminar cualquier agente terapéutico libre del producto acoplado. La etapa de eliminación se realiza preferentemente por: (a) disolución del conjugado en DMF, (b) disolución de una resina de atrapamiento en DMF anhidro, (c) adición del conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido-agente terapéutico formado en la etapa de acoplamiento a la resina de atrapamiento para formar una mezcla de conjugado-resina, (d) mantenimiento de la mezcla a entre 0 ºC y 30 ºC durante 2 a 24 horas, en las que el agente terapéutico no acoplado reacciona con la resina, (e) eliminación de la resina de la mezcla, y (f) precipitación del resto por adición de una solución de salmuera para formar un precipitado del conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptidoagente terapéutico. Preferentemente, la resina de atrapamiento es poliestireno-isocianato (PS-isocianato), PSmetilisocianato, PS-tioisocianato, PS-metil-tioisocianato, PS-cloruro de sulfonilo, PS-cloruro de metilsulfonilo o PSbenzaldehído. Más preferentemente, la resina de atrapamiento es PS-isocianato. La etapa de eliminación se realiza preferentemente para eliminar el agente terapéutico libre, que es una antraciclina. [0226] Since many therapeutic agents are toxic substances, it is preferable to remove any free therapeutic agent from the coupled product. The elimination step is preferably carried out by: (a) dissolution of the conjugate in DMF, (b) dissolution of a trapping resin in anhydrous DMF, (c) addition of the stabilizing group conjugate protected with alkyl or allyl-oligo-oligopeptide-agent Therapeutic formed in the coupling stage to the entrapment resin to form a conjugate-resin mixture, (d) maintaining the mixture at between 0 ° C and 30 ° C for 2 to 24 hours, in which the uncoupled therapeutic agent reacts with the resin, (e) removal of the resin from the mixture, and (f) precipitation of the remainder by the addition of a brine solution to form a precipitate of the stabilizing group conjugate protected with therapeutic alkyl or allyl-oligopeptide-therapeutic agent. Preferably, the trapping resin is polystyrene-isocyanate (PS-isocyanate), PSmethylisocyanate, PS-thioisocyanate, PS-methyl-thioisocyanate, PS-sulfonyl chloride, PS-methylsulfonyl chloride or PSbenzaldehyde. More preferably, the entrapment resin is PS-isocyanate. The elimination step is preferably performed to remove the free therapeutic agent, which is an anthracycline.

[0227] La tercera etapa es desproteger el conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílicooligopéptido-agente terapéutico, preferentemente por hidrólisis mediante una enzima, más preferentemente mediante hidrólisis por una esterasa, que directamente proporciona el compuesto de profármaco a un buen rendimiento con una pureza final de al menos el 90%. Por ejemplo, la tercera etapa puede ser la hidrólisis del grupo éster metílico en MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox mediante una enzima, tal como CLEC CAB (lipasa de Candida antartica B entrecruzada), que proporciona directamente la sal de sodio de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox en rendimientos cuantitativos con alta pureza. [0227] The third step is to deprotect the stabilized group conjugate protected with alkyl ester or allyl oligopeptide-therapeutic agent, preferably by hydrolysis by an enzyme, more preferably by hydrolysis by an esterase, which directly provides the prodrug compound at good performance with a final purity of at least 90%. For example, the third stage may be the hydrolysis of the methyl ester group in MeOSuc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox by an enzyme, such as CLEC CAB (cross-linked Candida Antarctic lipase), which directly provides the salt of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox sodium in quantitative yields with high purity.

[0228] La enzima está preferentemente entrecruzada o inmovilizada sobre un soporte sólido. La esterasa puede ser la esterasa de hígado de cerdo, lipasa de Candida antartica B, lipasa de Candida rugosa, lipasa de Pseudomonas cepacia, esterasa de hígado de cerdo inmovilizada en sepharose, lipasa de Candida antartica B inmovilizada en sepharose, CLEC-PC (lipasa de Pseudomonas cepacia), CLEC-CAB (lipasa de Candida antartica B) o CLEC-CR (lipasa de Candida rugosa). La desprotección mediante hidrólisis por una enzima se realiza preferentemente por: (a) lavado de la enzima para eliminar la enzima libre, (b) adición de la enzima lavada al conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico o alílico-oligopéptido-agente terapéutico, (c) reacción de la enzima con el conjugado a entre 15 ºC y 40 ºC, ambos inclusive, a un pH de entre 5,0 y 8,0, ambos inclusive, durante al menos 18 horas, para crear el compuesto de profármaco de grupo estabilizante-oligopéptido-agente terapéutico, y (d) separación de la enzima del compuesto de profármaco. Más preferentemente se añade enzima entrecruzada o inmovilizada lavada adicional después de la etapa de reacción de la enzima con el conjugado, antes de separar la enzima del compuesto de profármaco. [0228] The enzyme is preferably crosslinked or immobilized on a solid support. The esterase may be the liver liver esterase, Candida antartica B lipase, Candida rugosa lipase, Pseudomonas cepacia lipase, pig liver esterase immobilized in sepharose, Candida antartica B lipase immobilized in sepharose, CLEC-PC ( Pseudomonas cepacia lipase), CLEC-CAB (Candida antartica B lipase) or CLEC-CR (Candida rugosa lipase). Deprotection by hydrolysis by an enzyme is preferably carried out by: (a) washing the enzyme to remove the free enzyme, (b) adding the washed enzyme to the stabilizing group conjugate protected with alkyl or allyl ester-oligopeptide-therapeutic agent, (c) reaction of the enzyme with the conjugate at between 15 ° C and 40 ° C, inclusive, at a pH between 5.0 and 8.0, both inclusive, for at least 18 hours, to create the prodrug compound of stabilizing group-oligopeptide-therapeutic agent, and (d) separation of the enzyme from the prodrug compound. More preferably, additional washed crosslinked or immobilized enzyme is added after the reaction step of the enzyme with the conjugate, before separating the enzyme from the prodrug compound.

Eliminación de agente terapéutico libre Elimination of free therapeutic agent

[0229] Puede haber presente agente terapéutico no conjugado tarde en el procedimiento de generación del profármaco. Por ejemplo, durante la etapa de acoplamiento del conjugado de (grupo estabilizante)-(oligopéptido) con doxorrubicina como agente terapéutico se descubrió, en algunos casos, que la reacción no se desarrollaba completamente. Quedaba aproximadamente el 2-4% de doxorrubicina residual en el producto acoplado. Los intentos iniciales para eliminar completamente la doxorrubicina del producto mediante lavados ácidos no dio como resultado una eliminación completa. La eliminación completa del agente terapéutico libre se efectuó mediante el procedimiento resumido en el Ejemplo 47 y la FIG. 11, que utiliza resina o perlas de atrapamiento. [0229] Unconjugated therapeutic agent may be present late in the prodrug generation procedure. For example, during the coupling stage of the conjugate of (stabilizing group) - (oligopeptide) with doxorubicin as a therapeutic agent it was discovered, in some cases, that the reaction did not develop completely. Approximately 2-4% of residual doxorubicin remained in the coupled product. Initial attempts to completely remove doxorubicin from the product by acid washes did not result in complete elimination. The complete elimination of the free therapeutic agent was carried out by the procedure summarized in Example 47 and FIG. 11, which uses resin or entrapment beads.

[0230] El producto bruto, que contiene el intermediario y doxorrubicina residual, se disolvió en DMF y se añadieron perlas o resina de metilisocianato de poliestireno o poliestireno-cloruro de sulfonilo. La reacción se agitó durante 60 minutos. El grupo amino libre de la doxorrubicina reacciona con el grupo isocianato o cloruro de sulfonilo en las perlas para formar un derivado de urea o sulfonamida. Las perlas sólidas con doxorrubicina unida a las mismas se separaron después del producto deseado por filtración. El producto deseado permanece en la solución de DMF. Esta estrategia parece ser un método muy suave y eficaz para eliminar agente terapéutico residual del producto. [0230] The crude product, which contains the intermediate and residual doxorubicin, was dissolved in DMF and beads or polystyrene methylisocyanate or polystyrene-sulfonyl chloride resin were added. The reaction was stirred for 60 minutes. The free amino group of doxorubicin reacts with the isocyanate or sulfonyl chloride group in the beads to form a urea or sulfonamide derivative. Solid beads with doxorubicin bound thereto were separated after the desired product by filtration. The desired product remains in the DMF solution. This strategy seems to be a very gentle and effective method to remove residual therapeutic agent from the product.

[0231] Por lo tanto, en la presente memoria se describe un método de generación de un compuesto como se usa en el método de la reivindicación 1, que comprende: [0231] Therefore, a method of generating a compound as used in the method of claim 1 is described herein, comprising:

(1) seleccionar un oligopéptido protegido con Fmoc de fórmula Fmoc-(AA)n-AAP2-AAP1-AAP' -(AA)m, en la que: (1) select an Fmoc protected oligopeptide of formula Fmoc- (AA) n-AAP2-AAP1-AAP '- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, n and m are whole numbers,

AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

AAP1' representa cualquier aminoácido, y AAP1 'represents any amino acid, and

(2) acoplar el oligopéptido protegido con Fmoc a un agente terapéutico por activación del oligopéptido protegido con Fmoc con un agente activante en presencia del agente terapéutico para formar un conjugado de oligopéptido protegido con Fmoc-agente terapéutico, (2) coupling the Fmoc protected oligopeptide to a therapeutic agent by activating the Fmoc protected oligopeptide with an activating agent in the presence of the therapeutic agent to form an Fmoc protected oligopeptide conjugate-therapeutic agent,

(3)(3): desproteger el conjugado de oligopéptido protegido con Fmoc-agente terapéutico por contacto del mismo con una base para formar un conjugado de oligopéptido-agente terapéutico, y deprotecting the Fmoc-therapeutic agent protected oligopeptide conjugate by contacting it with a base to form an oligopeptide-therapeutic agent conjugate, and

(4)(4): acoplar el conjugado de oligopéptido-agente terapéutico a un grupo estabilizante como se define en la reivindicación 1, para formar el compuesto. coupling the oligopeptide-therapeutic agent conjugate to a stabilizing group as defined in claim 1, to form the compound.

Preferentemente, n es de 0 a 3, m es 0 a 3 y m + n no es más de 3. Preferably, n is from 0 to 3, m is 0 to 3 and m + n is not more than 3.

[0232] Como alternativa, un método de generación de un compuesto como se usa en el método de la reivindicación 1, comprende las etapas siguientes: [0232] Alternatively, a method of generating a compound as used in the method of claim 1, comprises the following steps:

(1)(one): seleccionar un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1'-(AA)m , en la que: select an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1' representa cualquier aminoácido, y cada AA representa independientemente un aminoácido n and m are whole numbers, AAP2 represents any amino acid, AAP1 represents any amino acid, AAP1 'represents any amino acid, and each AA independently represents an amino acid

(2)(2): acoplar el oligopéptido a un grupo estabilizante protegido con éster alquílico mencionado en la reivindicación 1, para formar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido, coupling the oligopeptide to an alkyl ester protected stabilizer group mentioned in claim 1, to form a stabilizer group conjugate protected with alkyl ester oligopeptide,

(3)(3): acoplar el conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido a un agente terapéutico por activación del conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido con un agente activante en presencia de un agente terapéutico para formar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido-agente terapéutico, y coupling the stabilized group conjugate with alkyl ester-oligopeptide to a therapeutic agent by activating the stabilized group conjugate protected with alkyl ester-oligopeptide with an activating agent in the presence of a therapeutic agent to form a stabilized group conjugate protected with alkyl ester - oligopeptide-therapeutic agent, and

(4) (4): desproteger el conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido-agente terapéutico para formar el compuesto. deprotect the stabilized group conjugate protected with alkyl ester-oligopeptide-therapeutic agent to form the compound.

[0233] Un compuesto descrito en la presente memoria y usado en el método de la reivindicación 1 también puede generarse mediante las etapas siguientes: [0233] A compound described herein and used in the method of claim 1 can also be generated by the following steps:

(1)(one): seleccionar un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1'-(AA)m, en la que: select an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA) m, in which:

(2)(2): acoplar el oligopéptido a un grupo estabilizante protegido con éster alílico mencionado en la reivindicación 1, para formar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alílico-oligopéptido, coupling the oligopeptide to a stabilized group protected with allyl ester mentioned in claim 1, to form a stabilized group conjugate protected with allyl ester-oligopeptide,

(3)(3): acoplar el conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alílico-oligopéptido a un agente terapéutico por activación del conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alílico-oligopéptido con un agente activante en presencia de un agente terapéutico, para formar un conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alílico-oligopéptido-agente terapéutico, y coupling the stabilized group conjugate with allyl ester-oligopeptide to a therapeutic agent by activating the stabilized group conjugate protected with allyl ester-oligopeptide with an activating agent in the presence of a therapeutic agent, to form a stabilized group conjugate protected with ester allyl-oligopeptide-therapeutic agent, and

(4)(4): desproteger el conjugado de grupo estabilizante protegido con éster alílico-oligopéptido-agente terapéutico para formar el compuesto. deprotect the stabilized group conjugate protected with allyl ester-oligopeptide-therapeutic agent to form the compound.

[0234] Otro método más para generar un compuesto descrito en la presente memoria y usado en el método de la reivindicación 1 comprende las etapas siguientes: [0234] A further method for generating a compound described herein and used in the method of claim 1 comprises the following steps:

(1) seleccionar un oligopéptido protegido con tritilo de la fórmula tritil-(AA)n-AAP2-AAP1-AAP1'-(AA)m, en la que: n y m son números enteros, AAP2 representa cualquier aminoácido, (1) select a trityl protected oligopeptide of the formula trityl- (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA) m, in which: n and m are whole numbers, AAP2 represents any amino acid,

AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1 represents any amino acid,

AAP1' representa cualquier aminoácido, y AAP1 'represents any amino acid, and

(2)(2): acoplar el oligopéptido protegido con tritilo a un agente terapéutico por activación del oligopéptido protegido con tritilo con un agente activante en presencia de un agente terapéutico, generando de este modo un conjugado de oligopéptido protegido con tritilo-agente terapéutico, coupling the trityl protected oligopeptide to a therapeutic agent by activating the trityl protected oligopeptide with an activating agent in the presence of a therapeutic agent, thereby generating a trityl protected oligopeptide conjugate-therapeutic agent,

(3)(3): desproteger el conjugado de oligopéptido protegido con tritilo-agente terapéutico en condiciones ácidas para formar un conjugado de oligopéptido-agente terapéutico, y deprotecting the trityl-therapeutic agent protected oligopeptide conjugate under acidic conditions to form an oligopeptide-therapeutic agent conjugate, and

(4) (4): acoplar el conjugado de oligopéptido-agente terapéutico con un grupo estabilizante como se define en la reivindicación 1 para formar el compuesto. coupling the oligopeptide-therapeutic agent conjugate with a stabilizing group as defined in claim 1 to form the compound.

[0235] Otra etapa posible en relación con cualquiera de estos métodos es eliminar el agente terapéutico no acoplado mediante el uso de perlas o resina de atrapamiento. Además, el compuesto puede neutralizarse con una sal farmacéuticamente aceptable si se desea. [0235] Another possible step in relation to any of these methods is to remove the uncoupled therapeutic agent by using beads or entrapment resin. In addition, the compound can be neutralized with a pharmaceutically acceptable salt if desired.

Compuestos específicos Specific compounds

[0236] El compuesto descrito en la presente memoria incluye los ejemplos específicos siguientes: [0236] The compound described herein includes the following specific examples:

[0237] Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Met-Ala-Leu-Dox y Suc-Phe-Ala-Leu-Dox. [0237] Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc -Met-Ala-Leu-Dox and Suc-Phe-Ala-Leu-Dox.

[0238] Son ejemplos de compuestos escindibles por CD10 pero resistentes a la escisión por TOP los siguientes: Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. [0238] Examples of compounds cleavable by CD10 but resistant to cleavage by TOP are the following: Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox.

Ejemplos Examples

Ejemplo 1: Example 1:

Actividad específica de proteína de homogeneizados celulares Specific activity of cell homogenate protein

[0239] Diversos sedimentos de células humanas cultivadas se homogeneizaron en un tampón HEPES 100 mM pH 7,2 y el homogeneizado se incubó durante hasta 1 h a 37 ºC con 12,5 g/ml de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox, Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox. Además, se incluyó fosforamidón 1 M, un inhibidor de CD10 en las incubaciones con homogeneizado de células LNCaP. Para estimar la actividad específica se estimó el contenido de proteína en la porción soluble de los homogeneizados. Los resultados expresados como actividad específica de proteína (FIG. 12) indican que las células LNCaP que se sabe que contienen CD10 muestran la mayor actividad hidrolizante de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Esta actividad se inhibe por fosforamidón. Las células PC-3 que no expresan CD10 hidrolizan los otros tres sustratos, pero no Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. [0239] Various sediments of cultured human cells were homogenized in a 100 mM HEPES buffer pH 7.2 and the homogenate was incubated for up to 1 h at 37 ° C with 12.5 /g / ml Suc-Ala-Leu-Ala- Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox, Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox. In addition, 1M phosphoramidon, a CD10 inhibitor, was included in incubations with LNCaP cell homogenate. To estimate the specific activity, the protein content in the soluble portion of the homogenates was estimated. The results expressed as protein specific activity (FIG. 12) indicate that LNCaP cells known to contain CD10 show the highest hydrolyzing activity of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. This activity is inhibited by phosphoramidon. PC-3 cells that do not express CD10 hydrolyse the other three substrates, but not Suc-Ile-Ala-Leu-Dox.

[0240] Se extirparon quirúrgicamente xenoinjertos de tumores de ratón de diversas fuentes, se homogeneizaron en un tampón HEPES 100 mM pH 7,2 y se incubaron durante hasta 1 h a 37 ºC con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox 12,5 g/ml. Se midió la proteína y los resultados se describen como actividad específica de proteína. Los resultados, ilustrados en la FIG 13, indican que las células LNCaP contienen la mayor actividad hidrolizante de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, mientras que las células HL-60 no muestran actividad hidrolizante de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. [0240] Xenografts of mouse tumors from various sources were surgically removed, homogenized in a 100 mM HEPES buffer pH 7.2 and incubated for up to 1 h at 37 ° C with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox 12.5 g / ml. Protein was measured and the results are described as specific protein activity. The results, illustrated in FIG 13, indicate that LNCaP cells contain the highest hydrolyzing activity of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, while HL-60 cells show no hydrolyzing activity of Suc-Ile-Ala-Leu- Dox

Ejemplo 2: Example 2:

Hidrólisis por CD10 purificada Purified CD10 hydrolysis

[0241] Se incubaron cantidades iguales de CD10 de riñón porcino purificada (Elastin Products Company) con 12,5 g/ml de diversos compuestos de peptidil-doxorrubicina durante hasta 10 h a 37 ºC en TrisHCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,1%. Los productos de reacción se analizaron mediante HPLC con detección de fluorescencia. Las velocidades eran esencialmente lineales durante el periodo de incubación. El producto observado era Leu-doxorrubicina. La Tabla 1 proporciona el porcentaje de cada compuesto de ensayo que se hidrolizó a lo largo del periodo de diez horas. Además, estos resultados se expresan respecto a un compuesto ensayo patrón, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. [0241] Equal amounts of purified porcine kidney CD10 (Elastin Products Company) were incubated with 12.5 µg / ml of various peptidyl doxorubicin compounds for up to 10 h at 37 ° C in 50 mM TrisHCl, pH 7.4, NaCl 150 mM, 0.1% Triton X-100. The reaction products were analyzed by HPLC with fluorescence detection. The speeds were essentially linear during the incubation period. The product observed was Leu-doxorubicin. Table 1 provides the percentage of each test compound that was hydrolyzed over the ten hour period. In addition, these results are expressed with respect to a standard test compound, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox.

TABLA 1. Hidrólisis por CD10 TABLE 1. CD10 hydrolysis

Sustrato Substratum: % hidrólisis/10 h Fracción hidrolizada respecto a patrón % hydrolysis / 10 h Hydrolyzed fraction with respect to pattern

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 10,9 1,0 10.9 1.0

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 12,5 1,1 12.5 1.1

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 22,1 2,0 22.1 2.0

Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox: 0 0 0 0

Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox: 0 0 0 0

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 8,3 0,75 8.3 0.75

Suc-Met-Ala-Leu-Dox Suc-Met-Ala-Leu-Dox: 37,7 3,5 37.7 3.5

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 0 0 0 0

5 Ejemplo 3: 5 Example 3:

El efecto del agente unido al péptido sobre la escisión por CD10 The effect of the peptide bound agent on the cleavage by CD10

[0242] Para ensayar el efecto de velocidad catalizado por CD10 de la estructura en la posición de “toxina” del [0242] To test the effect of CD10 catalyzed velocity of the structure at the "toxin" position of the

10 profármaco, la velocidad hidrolítica de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se comparó con la del análogo en el que paranitroanilida (pNA) sustituye a la doxorrubicina, es decir, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-pNA. Se incubó CD10 de riñón porcino (Elastin Products Company) con los dos sustratos en condiciones idénticas (37 ºC, pH 7,4, Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,01%) y la velocidad de liberación de Leu-Dox se comparó con la velocidad de liberación de Leu-pNA. Los resultados indicaban que el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-pNA se escinde 590 veces más 10 prodrug, the hydrolytic velocity of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was compared with that of the analogue in which paranitroanilide (pNA) replaces doxorubicin, that is, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu -pNA. Porcine kidney CD10 (Elastin Products Company) was incubated with the two substrates under identical conditions (37 ° C, pH 7.4, 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0.01% Triton X-100) and the speed of Leu-Dox release was compared with the release rate of Leu-pNA. The results indicated that the Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-pNA is cleaved 590 times more

15 rápidamente que el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Esto indica que la estructura (o sitio de unión) de la toxina en estos compuestos de profármaco activados por tumores puede influir en la velocidad de escisión. 15 quickly than the Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. This indicates that the structure (or binding site) of the toxin in these tumor-activated prodrug compounds may influence the rate of excision.

Ejemplo 4: EJEMPLO DE REFERENCIA Example 4: EXAMPLE OF REFERENCE

20 Exploración de profármacos potenciales 20 Exploration of potential prodrugs

[0243] Son manifestaciones preferidas de esta invención compuestos de profármaco que no se escindan por trouasa u oligopeptidasa Thimet, pero que se escindan por CD10. Por lo tanto, se prefiere la exploración de compuestos para determinar la ausencia de capacidad de escisión por trouasa. Se usaron tres preparaciones [0243] Preferred manifestations of this invention are prodrug compounds that are not cleaved by Thimet trouasa or oligopeptidase, but which are cleaved by CD10. Therefore, the exploration of compounds is preferred to determine the absence of cleavage capacity by trouasa. Three preparations were used

25 diferentes de trouasa de células de carcinoma para explorar diversos compuestos de ensayo. Estas tres preparaciones eran las siguientes: 25 different carcinoma cell trouasa to explore various test compounds. These three preparations were as follows:

(a) homogeneizado de células MCF 7/6 (carcinoma de mama) (a) homogenized MCF 7/6 cells (breast carcinoma)

(b) medios acondicionados de MCF 7/6 (carcinoma de mama), y 30 (c) combinación de fracciones de intercambio aniónico de extracto de células HeLa (carcinoma cervical). (b) conditioned media of MCF 7/6 (breast carcinoma), and 30 (c) combination of anion exchange fractions of HeLa cell extract (cervical carcinoma).

a. Preparación de homogeneizado de células MCF 7/6 to. Preparation of homogenate of MCF 7/6 cells

[0244] Se cultivaron células MCF 7/6 hasta la confluencia en un medio sin suero que contenía DMEM:F12 (1:1), [0244] MCF 7/6 cells were grown to confluence in a serum-free medium containing DMEM: F12 (1: 1),

35 albúmina de suero bovino 50 mg/l, ITS-X (insulina 10 mg/l, transferrina 5,5 mg/l, selenito sódico 6,7 mg/l, etanolamina 2 mg/l) y concentrado lipídico (Gibco nº 21900-030). Se recogieron 100 ml de células por centrifugación a 4 ºC 10.000 x g durante 20 min y decantación del sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (Gibco) y se centrifugó a 18.000 x g durante 10 minutos. Después de la decantación del sobrenadante, las células (aproximadamente 300 l en húmedo) se homogeneizaron por trituración en 1,7 ml de 35 bovine serum albumin 50 mg / l, STI-X (insulin 10 mg / l, transferrin 5.5 mg / l, sodium selenite 6.7 mg / l, ethanolamine 2 mg / l) and lipid concentrate (Gibco No. 21900 -030). 100 ml of cells were collected by centrifugation at 4 ° C 10,000 x g for 20 min and decantation of the supernatant. The pellet was resuspended in 2 ml phosphate buffered saline (Gibco) and centrifuged at 18,000 x g for 10 minutes. After decantation of the supernatant, the cells (approximately 300 µl wet) were homogenized by trituration in 1.7 ml of

40 tampón HEPES 10 mM, pH 7,2 (sal de sodio). El homogeneizado se centrifugó a 18.000 x g a 4 ºC durante 5 min y el sobrenadante se dividió en alícuotas y se almacenó a ≤-20 ºC para su uso posterior en la exploración de compuesto. 40 HEPES 10 mM buffer, pH 7.2 (sodium salt). The homogenate was centrifuged at 18,000 x g at 4 ° C for 5 min and the supernatant was divided into aliquots and stored at ≤ -20 ° C for later use in compound exploration.

b. Preparación de medios acondicionados de MCF 7/6 b. Preparation of MCF 7/6 conditioned media

45 [0245] Se cultivaron células MCF 7/6 hasta la confluencia en medio DMEM/F12 (1:1) que contenía suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina al 0,05% (p/v), penicilina 250 UI/ml y estreptomicina 100 g/ml. Después, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se incubaron 24 h a CO2 al 5%, 37 ºC, en DMEM/F12 (1:1), BSA al 0,02%, ITS-X (insulina 10 mg/l, transferrina 5,5 mg/l, selenito sódico 6,7 g/l, etanolamina 2 mg/l). Después, los medios acondicionados se decantaron y, usando un aparato de agitación celular con una membrana de ultrafiltración YM 10 (límite de 10.000 PM) (Millipore), se intercambiaron una vez con tampón HEPES 10 mM, pH 7,2 y se concentraron veinte veces. Esta solución se almacenó en alícuotas a -20 ºC para su uso en la [0245] MCF 7/6 cells were cultured to confluence in DMEM / F12 medium (1: 1) containing 10% fetal bovine serum, 0.05% L-glutamine (w / v), penicillin 250 IU / ml and streptomycin 100 g / ml. The cells were then washed twice with phosphate buffered saline and incubated 24 h at 5% CO2, 37 ° C, in DMEM / F12 (1: 1), 0.02% BSA, ITS-X (insulin 10 mg / l, transferrin 5.5 mg / l, sodium selenite 6.7 /g / l, ethanolamine 2 mg / l). Then, the conditioned media were decanted and, using a cell agitation apparatus with a YM 10 ultrafiltration membrane (10,000 PM limit) (Millipore), they were exchanged once with 10 mM HEPES buffer, pH 7.2 and twenty concentrated times. This solution was stored in aliquots at -20 ° C for use in the

5 exploración de compuesto. 5 compound scan.

c. Preparación de combinación de fracciones de intercambio aniónico de células HeLa C. Combination preparation of HeLa cell anion exchange fractions

[0246] Treinta mil millones de células HeLa producidas comercialmente (carcinoma cervical humano, Computer [0246] Thirty billion commercially produced HeLa cells (human cervical carcinoma, Computer

10 Cell Culture Center, Seneffe, Bélgica) se homogeneizaron con un sonicador y con un homogeneizador Dounce en 108 ml de solución acuosa de lisis. La solución de lisis contenía Triton X-100 al 0,02% p/v, azida sódica al 0,04% p/v y un cóctel de inhibidores de proteasas (2 comprimidos/50 ml Complete, comprimidos sin EDTA, Roche Molecular Biochemicals). El homogeneizado celular se centrifugó 30 minutos a 4 ºC a 5000 x g y el sedimento se homogeneizó en una segunda solución de lisis de 108 ml usando un homogeneizador Dounce y se centrifugó como anteriormente. 10 Cell Culture Center, Seneffe, Belgium) were homogenized with a sonicator and with a Dounce homogenizer in 108 ml of aqueous lysis solution. The lysis solution contained 0.02% w / v Triton X-100, 0.04% w / v sodium azide and a protease inhibitor cocktail (2 tablets / 50 ml Complete, tablets without EDTA, Roche Molecular Biochemicals ). The cell homogenate was centrifuged 30 minutes at 4 ° C at 5000 x g and the pellet was homogenized in a second 108 ml lysis solution using a Dounce homogenizer and centrifuged as before.

15 Los sobrenadantes se combinaron y se centrifugaron durante 90 min a 145.000 x g a 4 ºC. The supernatants were combined and centrifuged for 90 min at 145,000 x g at 4 ° C.

[0247] Se diluyó una porción del sobrenadante de ultracentrifugación 2 veces con un tampón de trietanolamina-HCl 20 mM, pH 7,2 que contenía Triton X-100 al 0,01% (p/v) y azida sódica al 0,02% (p/v) (tampón de equilibrado). Se cargaron treinta ml de la solución resultante, que corresponden a aproximadamente 180 mg de proteína, a 4 ºC 20 en una columna de cromatografía de intercambio aniónico a baja presión de 2,6 x 9,4 cm Source 15Q (Amersham Pharmacia Biotech) (1 ml/minuto). Después, la columna se lavó con 250 ml del tampón de equilibrado a un caudal de 1 ml/minuto. Las proteínas se eluyeron en un gradiente de concentración lineal de NaCl (0-0,5 M en el tampón de equilibrado, el volumen total del gradiente era de 1000 ml) a un caudal de 3 ml/minuto. Se recogieron fracciones de dos minutos y se usaron para la determinación de la actividad enzimática usando Ala-Leu-Ala-Leu-Dox como [0247] A portion of the ultracentrifugation supernatant was diluted 2 times with a 20 mM triethanolamine-HCl buffer, pH 7.2 containing 0.01% Triton X-100 (w / v) and 0.02 sodium azide % (w / v) (equilibration buffer). Thirty ml of the resulting solution, corresponding to approximately 180 mg of protein, was loaded at 4 ° C on a 2.6 x 9.4 cm low pressure anion exchange chromatography column Source 15Q (Amersham Pharmacia Biotech) (1 ml / minute). Then, the column was washed with 250 ml of the equilibration buffer at a flow rate of 1 ml / minute. The proteins were eluted in a linear concentration gradient of NaCl (0-0.5 M in the equilibration buffer, the total volume of the gradient was 1000 ml) at a flow rate of 3 ml / minute. Two minute fractions were collected and used for the determination of enzyme activity using Ala-Leu-Ala-Leu-Dox as

25 sustrato. Su transformación en Ala-Leu-Dox se cuantificó por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa utilizando detección de fluorescencia del resto de antraciclina. Las fracciones que contenían los mayores niveles de actividad se combinaron (fracciones nº 43-46; NaCl 0,13 M), se complementaron con inhibidores de proteasas (Complete, comprimidos sin EDTA, Roche Molecular Biochemicals), y se almacenaron como alícuotas a -80 ºC. 25 substrate. Its transformation into Ala-Leu-Dox was quantified by high performance liquid chromatography in reverse phase using fluorescence detection of the anthracycline residue. Fractions containing the highest levels of activity were combined (fractions 43-46; NaCl 0.13 M), supplemented with protease inhibitors (Complete, tablets without EDTA, Roche Molecular Biochemicals), and stored as aliquots at -80 ° C.

30 30

d. Ensayo de escisión d. Excision test

[0248] Se incubaron compuestos de ensayo durante 2 h a 37 ºC a una concentración de 12,5 g/ml con cada una de las tres preparaciones diferentes de enzima de células de carcinoma. Después de la incubación, se añadieron 35 tres volúmenes de acetonitrilo para detener la reacción y eliminar la proteína de la mezcla. La muestra se centrifugó a 18.000 g durante 5 minutos y se mezclaron 100 l de sobrenadante con 300 l de agua antes del análisis por HPLC. Para el análisis de HPLC, se inyectaron 50 l de muestra en una columna de cromatografía de 4,6 x 50 mm 2m TSK Super-ODS a 40 ºC y se eluyó con un gradiente lineal de 3 minutos de acetonitrilo del 26% al 68% en tampón acetato de amonio acuoso 20 mM pH 4,5 a 2 ml/min. La detección fue por fluorescencia usando una longitud [0248] Test compounds were incubated for 2 h at 37 ° C at a concentration of 12.5 µg / ml with each of the three different carcinoma cell enzyme preparations. After incubation, three volumes of acetonitrile were added to stop the reaction and remove the protein from the mixture. The sample was centrifuged at 18,000 g for 5 minutes and 100 µl of supernatant was mixed with 300 µl of water before HPLC analysis. For HPLC analysis, 50 µl of sample was injected into a 4.6 x 50 mm 2m TSK Super-ODS chromatography column at 40 ° C and eluted with a 3-minute linear gradient of 26% acetonitrile 68% in 20 mM aqueous ammonium acetate buffer pH 4.5 at 2 ml / min. The detection was by fluorescence using a length

40 de onda de excitación de 235 nm y una longitud de onda de emisión de 560 nm. 40 excitation wave of 235 nm and an emission wavelength of 560 nm.

[0249] Los compuestos de ensayo que no se escindieron (escisión <5% - 2 h) por las preparaciones de enzima en las condiciones dadas se muestra en la Tabla 2 a continuación. Con escasas excepciones, los resultados para la escisión por enzimas de células de carcinoma era idéntica para una fracción parcialmente purificada de células [0249] Test compounds that were not cleaved (cleavage <5% - 2 h) by enzyme preparations under the conditions given are shown in Table 2 below. With few exceptions, the results for enzyme cleavage of carcinoma cells were identical for a partially purified fraction of cells

45 HeLa, homogeneizado de células MCF 7/6 y medios acondicionados de MCF 7/6. 45 HeLa, homogenate of MCF 7/6 cells and conditioned media of MCF 7/6.

Tabla 2 Table 2

Nº: :: Grupo estabilizante (AA) (AA) (AA) (AA) Compuesto terapéutico Stabilizing group (AA) (AA) (AA) (AA) Therapeutic compound

1 one: Suc Ala Ile Ala Phe Dnr Suc Wing Ile To Phe Dnr

2 2: Suc Ala Ile Ala Ile Dnr Suc Wing Ile To Ile Dnr

3 3: Suc Tic Ile Ala Leu Dnr Suc Tic Ile To Leu Dnr

4 4: Suc Thi Ile Ala Leu Dnr Suc Thi Ile To Leu Dnr

5 5: Suc Nal Ile Ala Leu Dnr Suc Nal Ile To Leu Dnr

6 6: Suc Ala Ile Ala Leu Dnr Suc Wing Ile To Leu Dnr

7 7: Suc Amb Ile Ala Leu Dnr Suc Amb Ile To Leu Dnr

8 8: Suc Aib Ile Ala Leu Dnr Suc Aib Ile To Leu Dnr

9 9: Suc Ala Ile Ala Leu Dox Suc Wing Ile To Leu Dox

10 10: Suc Thi Ile Aib Leu Dnr Suc Thi Ile Aib Leu Dnr

11 eleven: Suc Nal Ile Aib Leu Dnr Suc Nal Ile Aib Leu Dnr

12 12: Suc PAla Ile Aib Leu Dnr Suc Shovel Ile Aib Leu Dnr

13 13: Suc Amb Ile Aib Leu Dox Suc Amb Ile Aib Leu Dox

14 14: Suc Aib Ile Aib Leu Dnr Suc Aib Ile Aib Leu Dnr

15 fifteen: Suc Ala Ile Gly Phe Dnr Suc Wing Ile Gly Phe Dnr

16 16: Suc Ala Ile Gly Ile Dnr Suc Wing Ile Gly Ile Dnr

17 17: Suc Tic Ile Gly Leu Dnr Suc Tic Ile Gly Leu Dnr

18 18: Suc Thi Ile Gly Leu Dnr Suc Thi Ile Gly Leu Dnr

19 19: Suc Nal Ile Gly Leu Dnr Suc Nal Ile Gly Leu Dnr

20 twenty: Suc Ala Ile Gly Leu Dnr Suc Wing Ile Gly Leu Dnr

21 twenty-one: Suc Amb Ile Gly Leu Dnr Suc Amb Ile Gly Leu Dnr

22 22: Suc Aib Ile Gly Leu Dnr Suc Aib Ile Gly Leu Dnr

23 2. 3: Suc Ala Ile Thr Ile Dnr Suc Wing Ile Thr Ile Dnr

24 24: Suc Ala Ile Tyr Ile Dnr Suc Wing Ile Tyr Ile Dnr

25 25: Suc Ala Ile Tyr Leu Dnr Suc Wing Ile Tyr Leu Dnr

26 26: Suc Ala Ile Tyr Gly Dox Suc Wing Ile Tyr Gly Dox

27 27: Suc Ø Ile Ala Leu Dox Suc OR Ile To Leu Dox

28 28: Suc Ø Ile N(Me)Ala Leu Dox Suc OR Ile N (Me) Wing Leu Dox

Ø = no presente Ø = not present

Ejemplo 5: Example 5:

Expresión de CD10 en líneas celulares CD10 expression in cell lines

5 [0250] CD10 (CD10) se expresa ampliamente en varios tipos tumorales (Chu y Arber, Am. J. Clin. Pathol. 113: 374-382 (2000)), incluyendo una alta proporción (61%) de tumores de próstata. También se ha demostrado que CD10 se expresa en algunas líneas celulares derivadas de tumor de próstata humano cultivadas in vitro. Por lo tanto, era de interés determinar si los profármacos peptídicos de la invención eran citotóxicos para líneas tumorales 5 [0250] CD10 (CD10) is widely expressed in several tumor types (Chu and Arber, Am. J. Clin. Pathol. 113: 374-382 (2000)), including a high proportion (61%) of prostate tumors . It has also been shown that CD10 is expressed in some cell lines derived from human prostate tumor grown in vitro. Therefore, it was of interest to determine whether the peptide prodrugs of the invention were cytotoxic for tumor lines

10 derivadas de próstata, así como de otros tipos tumorales, que expresan CD10 en su superficie. La línea tumoral de próstata LNCaP expresa altos niveles de CD10 (Krongrad, et al., Urol. Res. 25: 113-116 (1997); Liu, Cancer Res. 60: 3429-3434 (2000)). Varias líneas tumorales de próstata en cultivo también expresan otra endoproteasa asociada a superficie celular bien caracterizada, antígeno prostático específico (PSA). Las líneas celulares de próstata descritas en la Tabla 3 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se exploraron para determinar la 10 derived from prostate, as well as other tumor types, that express CD10 on its surface. The LNCaP prostate tumor line expresses high levels of CD10 (Krongrad, et al., Urol. Res. 25: 113-116 (1997); Liu, Cancer Res. 60: 3429-3434 (2000)). Several prostate tumor lines in culture also express another endoprotease associated with a well-characterized cell surface, prostate specific antigen (PSA). The prostate cell lines described in Table 3 were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and screened to determine the

15 expresión de CD10 por citometría de flujo usando un anticuerpo monoclonal específico de CD10 (Caltag Clon 5-1 B4). TABLA 3 Expression of CD10 by flow cytometry using a CD10 specific monoclonal antibody (Caltag Clone 5-1 B4). TABLE 3

Línea celular Cellphone line: Nº ATCC PSA CD10 ATCC No. PSA CD10

LNCaP LNCaP: CRL-1T40 + + CRL-1T40 + +

PC-3 PC-3: CRL-14S5 - - CRL-14S5 - -

Línea celular Cellphone line: Nº ATCC PSA CD10 ATCC No. PSA CD10

22Rv1 22Rv1: CRL-2505 + - CRL-2505 + -

[0251] Se realizó un análisis citométrico de flujo con un panel de líneas celulares para determinar la expresión de CD10. La FIG. 14 muestra que también se expresa CD10 a altos niveles en algunas líneas de linfoma de células B que no expresan PSA. Dichas líneas de células B incluyen células Ramos y Namalwa. También se demostró que las [0251] A flow cytometric analysis was performed with a panel of cell lines to determine the expression of CD10. FIG. 14 shows that CD10 is also expressed at high levels in some B-cell lymphoma lines that do not express PSA. Such B cell lines include Ramos and Namalwa cells. It was also shown that

5 células de carcinoma de próstata LNCaP expresaban altos niveles de CD10, mientras que las células HT29, PC-3 y BALL-1 no expresaban niveles detectables de este antígeno y sirvieron como control negativo para los estudios posteriores. Se encontró una escasa expresión de CD10 en carcinoma de colon LS174T y carcinoma de mama MCF-7. 5 LNCaP prostate carcinoma cells expressed high levels of CD10, while HT29, PC-3 and BALL-1 cells did not express detectable levels of this antigen and served as a negative control for subsequent studies. Poor expression of CD10 was found in LS174T colon carcinoma and MCF-7 breast carcinoma.

10 Ejemplo 6: 10 Example 6:

Actividad de profármaco activado por tumor en células LNCaP, HT-29 y PC-3 Tumor activated prodrug activity in LNCaP, HT-29 and PC-3 cells

[0252] Se cultivaron células adherentes, LNCaP (carcinoma de próstata), HT-29 (carcinoma de colon) y PC-3 [0252] Adherent cells, LNCaP (prostate carcinoma), HT-29 (colon carcinoma) and PC-3 were cultured

15 (carcinoma de próstata) en medios DMEM que contenían suero fetal de ternera (FCS) inactivado térmicamente al 10%. El día del estudio las células se desprendieron de la placa con una solución de tripsina. Las células recogidas se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 0,25 x 106 células/ml en DMEM que contenía FCS al 10%. Se añadieron 100 l de suspensión celular a placas de 96 pocillos y las placas se incubaron durante 3 horas para permitir que las células se adhiriesen. Después de esta incubación, se realizaron diluciones seriadas (incrementos 15 (prostate carcinoma) in DMEM media containing 10% thermally inactivated fetal calf serum (FCS). On the day of the study, the cells were detached from the plaque with a trypsin solution. The collected cells were washed and resuspended at a concentration of 0.25 x 106 cells / ml in DMEM containing 10% FCS. 100 µl of cell suspension was added to 96-well plates and the plates were incubated for 3 hours to allow the cells to adhere. After this incubation, serial dilutions were made (increments

20 de 3 veces) de doxorrubicina o compuestos de ensayo y se añadieron 100 l de compuestos por pocillo. Las placas se incubaron después durante 24 horas, se estimularon con 10 l de una 3H-timidina 100 Ci/ml y se incubaron durante 24 horas adicionales (tiempo de incubación total de 48 horas). Las placas se recogieron usando un recolector de 96 pocillos (Packard Instruments) y se contaron en un contador Packard Top Count. Curvas logísticas de cuatro parámetros se ajustaron a la incorporación de 3H-timidina en función de la molaridad del fármaco usando 20 times 3) of doxorubicin or test compounds and 100 µl of compounds were added per well. The plates were then incubated for 24 hours, stimulated with 10 µl of a 100 H-thymidine 3H-ml / ml and incubated for an additional 24 hours (total incubation time 48 hours). Plates were collected using a 96-well collector (Packard Instruments) and counted in a Packard Top Count counter. Logistic curves of four parameters were adjusted to the incorporation of 3H-thymidine depending on the molarity of the drug using

25 en programa informático Prism para determinar los valores de CI50. 25 in Prism software to determine IC50 values.

[0253] La CI50 del control positivo, Doxorrubicina, era de 0,02-0,08 M en las líneas celulares usadas. Los compuestos que mostraban el mayor grado de selectividad para células LNCaP eran Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-lle-NMeAla-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (Tabla 4). Las características comunes de estos tres profármacos son [0253] The IC50 of the positive control, Doxorubicin, was 0.02-0.08 M in the cell lines used. The compounds that showed the highest degree of selectivity for LNCaP cells were Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-lle-NMeAla-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (Table 4). The common characteristics of these three prodrugs are

30 que contienen una isoleucina en la posición de aminoácido 3. Compuestos tales como Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-NMe-Ala-Leu-Dox, que contienen una leucina en la posición de aminoácido 3, también muestran selectividad aunque el grado de selectividad es menor que el de los análogos de isoleucina. 30 containing an isoleucine at amino acid position 3. Compounds such as Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-NMe-Ala-Leu-Dox, which contain a leucine at amino acid position 3, also show selectivity although the degree of selectivity is less than that of isoleucine analogs.

TABLA 4. Actividad sobre células LNCaP, HT-29 y PC-3 TABLE 4. Activity on LNCaP, HT-29 and PC-3 cells

Compuesto Compound: CI50 (M) Proporción PC-3:LNCaP IC50 (M) Proportion PC-3: LNCaP

LNCAP LNCAP: HT29 PC-3 HT29 PC-3

DOX DOX: 0,016 0,052 0,075 5 0.016 0.052 0.075 5

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 0,19 38 57 300 0.19 38 57 300

Suc-Ile-NMeAla-Leu-Dox Suc-Ile-NMeAla-Leu-Dox: 0,51 36 66 129 0.51 36 66 129

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 0,87 19 28 32 0.87 19 28 32

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 1,0 36 50 50 1.0 36 fifty fifty

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 1,1 47 88 83 1.1 47 88 83

Suc-Leu-NMeAla-Leu-Dox Suc-Leu-NMeAla-Leu-Dox: 1,2 24 45 37 1.2 24 Four. Five 37

Suc-Ile-Pro-Leu-Dox Suc-Ile-Pro-Leu-Dox: 2,0 44 106 53 2.0 44 106 53

Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox: 9,4 42 51 5 9.4 42 51 5

Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Tyr-Leu-Dox: 14 23 46 3 14 2. 3 46 3

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 15 32 39 3 fifteen 32 39 3

Suc-Leu-Tyr-Gly-Dox Suc-Leu-Tyr-Gly-Dox: 15 25 64 4 fifteen 25 64 4

Ejemplo 7: Example 7:

Actividad de profármaco activado por tumor sobre células Ball-1, Ramos y Namalwa Tumor-activated prodrug activity on Ball-1, Ramos and Namalwa cells

5 [0254] Además de LNCaP, varias líneas de células B, tales como células Ramos y Namalwa, expresan CD10 (células CD10pos). Sin embargo, otra línea de células B, células BALL-1, no expresa CD10 y sirve como línea de células B negativa para CD10 (células CD10neg). [0254] In addition to LNCaP, several B cell lines, such as Ramos and Namalwa cells, express CD10 (CD10pos cells). However, another B cell line, BALL-1 cells, does not express CD10 and serves as a CD10 negative B cell line (CD10neg cells).

[0255] Se cultivaron células en suspensión, células BALL-1, Ramos y Namalwa, en medios RPMI que contenían [0255] Suspended cells, BALL-1, Ramos and Namalwa cells, were cultured in RPMI media containing

10 suero fetal de ternera (FCS) inactivado térmicamente al 10%. El día del estudio, las células se recogieron, se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml en RPMI que contenía FCS al 10%. Se añadieron 100 l de suspensión celular a placas de 96 pocillos. Se realizaron diluciones seriadas (incrementos de 3 veces) de doxorrubicina o compuestos de ensayo y se añadieron 100 l de compuestos por pocillo. Finalmente, se añadieron 10 l de una 3H-timidina 100 Ci/ml y las placas se incubaron durante 24 horas. Las placas se recogieron usando un 10 fetal calf serum (FCS) thermally inactivated at 10%. On the day of the study, the cells were collected, washed and resuspended at a concentration of 0.5 x 10 6 cells / ml in RPMI containing 10% FCS. 100 µl of cell suspension was added to 96-well plates. Serial dilutions (3-fold increments) of doxorubicin or test compounds were made and 100 µl of compounds were added per well. Finally, 10 µl of a 3H-thymidine 100 µCi / ml was added and the plates were incubated for 24 hours. Plates were collected using a

15 recolector de 96 pocillos (Packard Instruments) y se contaron en un contador Packard Top Count. Curvas logísticas de cuatro parámetros se ajustaron a la incorporación de 3H-timidina en función de la molaridad del fármaco usando el programa informático Prism para determinar los valores de CI50. 15 96-well collector (Packard Instruments) and counted in a Packard Top Count counter. Four-parameter logistic curves were adjusted for the incorporation of 3H-thymidine based on the molarity of the drug using the Prism software to determine IC50 values.

[0256] La mayor selectividad de observó con Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, que mostraba una selectividad de 120-172 [0256] The highest selectivity was observed with Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, which showed a selectivity of 120-172

20 veces por células Ramos y Namalwa, respectivamente, en comparación con células BALL-1 CD10neg (Tabla 5). El segundo análogo más selectivo era Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, con una diferencia de 30-35 veces entre células CD10pos y CD10neg. 20 times by Ramos and Namalwa cells, respectively, compared to BALL-1 CD10neg cells (Table 5). The second most selective analogue was Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, with a difference of 30-35 times between CD10pos and CD10neg cells.

TABLA 5. Actividad sobre células BALL (CD10neg)-1, Ramos (CD10pos) y Namalwa (CD10pos) TABLE 5. Activity on BALL cells (CD10neg) -1, Ramos (CD10pos) and Namalwa (CD10pos)

Compuesto Compound: CI50 (M) Proporción IC50 (M) Proportion

Ball-1 Ball-1: Ramos Namalwa Ball-1:Ramos Ball-1:Namalwa Bouquets Namalwa Ball-1: Bouquets Ball-1: Namalwa

DOX DOX: 0,02 0,01 0,01 1 2 0.02 0.01 0.01 one 2

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 50,00 0,42 0,29 120 172 50.00 0.42 0.29 120 172

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 78,67 2,63 2,27 30 35 78.67 2.63 2.27 30 35

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 26,00 6,43 6,47 4 4 26.00 6.43 6.47 4 4

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 17,00 6,93 5,77 2 3 17.00 6.93 5.77 2 3

Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox Suc-Leu-Tyr-Leu-Dox: 17,00 20,00 14,00 1 1 17.00 20.00 14.00 one one

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 23,33 22,67 17,33 1 1 23.33 22.67 17.33 one one

25 25

Ejemplo 8: Example 8:

[0257] Se cultivaron células adherentes, LNCaP (carcinoma de próstata), PC-3 (carcinoma de próstata) y 22 RV 1 (carcinoma de próstata) en medio DMEM que contenía suero fetal de ternera (FCS) inactivado térmicamente al 10%. 30 El día del estudio las células se desprendieron de la placa con una solución de tripsina. Las células recogidas se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 0,25 x 106 células/ml en DMEM que contenía FCS al 10%. Se añadieron 100 l de suspensión celular a placas de 96 pocillos y las placas se incubaron durante 3 horas para permitir que las células se adhiriesen. Después de esta incubación, se realizaron diluciones seriadas (incrementos de 3 veces) de doxorrubicina o compuestos de ensayo y se añadieron 100 l de compuestos por pocillo. Después, [0257] Adherent cells, LNCaP (prostate carcinoma), PC-3 (prostate carcinoma) and 22 RV 1 (prostate carcinoma) were cultured in DMEM medium containing 10% thermally inactivated fetal calf serum (FCS). 30 On the day of the study, the cells were detached from the plaque with a trypsin solution. The collected cells were washed and resuspended at a concentration of 0.25 x 106 cells / ml in DMEM containing 10% FCS. 100 µl of cell suspension was added to 96-well plates and the plates were incubated for 3 hours to allow the cells to adhere. After this incubation, serial dilutions (3-fold increments) of doxorubicin or test compounds were made and 100 µl of compounds were added per well. After,

35 las placas se incubaron durante 24 horas, se estimularon con 10 l de una 3H-timidina 100 Ci/ml y se incubaron durante 24 horas adicionales (tiempo de incubación total de 48 horas). Las placas se recogieron usando un recolector de 96 pocillos (Packard Instruments) y se contaron en un contador Packard Top Count. Curvas logísticas de cuatro parámetros se ajustaron a la incorporación de 3H-timidina en función de la molaridad del fármaco usando el programa informático Prism para determinar los valores de CI50. The plates were incubated for 24 hours, stimulated with 10 µl of a 3 H-thymidine 100 µCi / ml and incubated for an additional 24 hours (total incubation time 48 hours). Plates were collected using a 96-well collector (Packard Instruments) and counted in a Packard Top Count counter. Four-parameter logistic curves were adjusted for the incorporation of 3H-thymidine based on the molarity of the drug using the Prism software to determine IC50 values.

40 TABLA 6 40 TABLE 6

imagen1image 1

LnCAP CD10+PSA+ LnCAP CD10 + PSA +: PC-3 CD10-PSA 22RV1 CD10-PSA+ PC-3 CD10-PSA 22RV1 CD10-PSA +

CI50 (mM) IC50 (mM)

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 0,17 48,00 14,00 0.17 48.00 14.00

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 28,50 57,00 34,50 28.50 57.00 34.50

[0258] La Tabla 6 ejemplifica que las células que eran positivas para PSA y negativas para CD10 tales como 22RV1 no escindían fácilmente Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox o Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Los datos sugieren que CD10 es responsable de la escisión de estos compuestos y no PSA. [0258] Table 6 exemplifies that cells that were positive for PSA and negative for CD10 such as 22RV1 did not readily cleave Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox or Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. The data suggests that CD10 is responsible for the cleavage of these compounds and not PSA.

5 5

Ejemplo 9: Example 9:

La inhibición de CD10 disminuye la potencia de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox para células Ramos y LNCaP, pero no células Ball-1 CD10 inhibition decreases the potency of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox for Ramos and LNCaP cells, but not Ball-1 cells

10 [0259] Se evaluó el efecto de dos inhibidores conocidos de CD10 sobre la actividad de profármaco en células Ramos, LNCaP y Ball-1. Se determinó la CI50 de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox en presencia de una concentración creciente de los inhibidores de CD10, fosforamidón y tiorfano. El aumento de la concentración de fosforamidón dio como resultado una pérdida de potencia de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox con células Ramos y LNCaP, mientras que las [0259] The effect of two known CD10 inhibitors on prodrug activity in Ramos, LNCaP and Ball-1 cells was evaluated. The IC50 of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox was determined in the presence of an increasing concentration of the inhibitors of CD10, phosphoramidon and thiophane. The increase in phosphoramidon concentration resulted in a loss of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox potency with Ramos and LNCaP cells, while the

15 células BALL-1 no se vieron afectadas (Tabla 7). Así mismo, la CI50 de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se desplazó 7 veces en células LNCaP tratadas con 100 nM de fosforamidón (no se muestran los datos). La FIG. 15 muestra un ejemplo de algunas curvas de valoración con Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox en ausencia o presencia de fosforamidón 300 nM. 15 BALL-1 cells were not affected (Table 7). Likewise, the IC50 of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox was displaced 7 times in LNCaP cells treated with 100 nM phosphoramidon (data not shown). FIG. 15 shows an example of some titration curves with Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox in the absence or presence of 300 nM phosphoramidon.

20 TABLA 7. Inhibición por fosforamidón en células Ball-1, Ramos y LNCaP 20 TABLE 7. Phosphoramidon inhibition in Ball-1, Ramos and LNCaP cells

CI50 (M) IC50 (M)

CD 10neg 10neg CD: CD 10pos CD 10pos 10pos CD 10pos CD

Fosforamidón (nM) Phosphoramidon (nM): Ball-1 Ramos LNCaP Ball-1 Bouquets LNCaP

0 0: 22 0,51 0,24 22 0.51 0.24

30 30: 20 2,1 1,3 twenty 2.1 1.3

100 100: 21 5,3 3,3 twenty-one 5.3 3.3

300 300: 24 8,1 7,7 24 8.1 7.7

1000 1000: 25 9,7 11,3 25 9.7 11.3

3000 3000: 26 10,5 15,4 26 10.5 15.4

[0260] El tiorfano, el segundo inhibidor de CD10, también desplaza la CI50 de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox en células CD10+ (Tabla 8). Sin embargo, el tiorfano mostraba más actividad inhibitoria con LNCaP en comparación con células Ramos. [0260] Thiorphan, the second CD10 inhibitor, also displaces the IC50 of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox in CD10 + cells (Table 8). However, thiorphane showed more inhibitory activity with LNCaP compared to Ramos cells.

25 25

TABLA 8. Inhibición por tiorfano en células Ramos (CD10pos) y LNCaP (CD10pos) TABLE 8. Thiophane inhibition in Ramos cells (CD10pos) and LNCaP (CD10pos)

CI50 (M) IC50 (M)

CD10pos CD10pos
CD10pos CD10pos

DL-Tiorfano DL-Tiorfano: Ramos LNCaP Bouquets LNCaP

0 0: 0,25 0,51 0.25 0.51

30 30: 0,27 2,1 0.27 2.1

100 100: 0,31 5,3 0.31 5.3

300 300: 0,28 8,1 0.28 8.1

1000 1000: 0,44 9,7 0.44 9.7

CI50 (M) IC50 (M)

CD10pos CD10pos
CD10pos CD10pos

DL-Tiorfano DL-Tiorfano: Ramos LNCaP Bouquets LNCaP

3000 3000: 1,1 10,5 1.1 10.5

Ejemplo 10: Example 10:

Detección de CD10 asociada con una diana celular CD10 detection associated with a cell target

5 [0261] Se realizó un análisis inmunohistoquímico en muestras de tejido de LNCaP y PC3 tomadas de xenoinjertos desarrollados en ratones atímicos y después fijados en formalina. Se prepararon secciones tisulares y se inmunotiñeron con un anticuerpo específico para CD10 o un control negativo del mismo isotipo, después se sometieron a contratinción con hematoxilina. Las muestras de LNCaP mostraban un patrón de tinción asociado a [0261] An immunohistochemical analysis was performed on samples of LNCaP and PC3 tissue taken from xenografts developed in athymic mice and then fixed in formalin. Tissue sections were prepared and immunostained with a specific antibody for CD10 or a negative control of the same isotype, then subjected to hematoxylin counterstain. LNCaP samples showed a staining pattern associated with

10 membrana de superficie celular intenso por el anticuerpo específico de CD10, que estaba relativamente uniformemente distribuido alrededor de la periferia de todas las células en la muestra de tejido tumoral de todas las células LNCaP. Por el contrario, no se observó inmunorreactividad en el tejido de PC3. Los compuestos escindibles por CD10 pero no por TOP, tales como Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, eran eficaces en la inhibición del crecimiento de tumores LNCaP en ratones, mientras que no eran activos frente a células PC3 (véase el Ejemplo 6). Por lo tanto, la 10 Intense cell surface membrane by the CD10 specific antibody, which was relatively evenly distributed around the periphery of all cells in the tumor tissue sample of all LNCaP cells. On the contrary, no immunoreactivity was observed in PC3 tissue. The compounds cleavable by CD10 but not by TOP, such as Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, were effective in inhibiting the growth of LNCaP tumors in mice, while they were not active against PC3 cells (see Example 6). Therefore, the

15 inmunohistoquímica de CD10 es útil en la selección de tumores sensibles a profármacos escindibles por CD10. CD10 immunohistochemistry is useful in the selection of prodrug-sensitive tumors cleavable by CD10.

Ejemplo 11: Example 11:

El Suc-Ile-Ala-Leu-Dox es bien tolerado en ratones sanos Suc-Ile-Ala-Leu-Dox is well tolerated in healthy mice

20 [0262] El Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, un profármaco tripeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En un estudio de dosis máxima tolerada (MTD) de dosis única, a grupos de cinco ratones normales se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente durante 28 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de dosis ensayados eran 0, 23, 47, 70, 93 y [0262] Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, an exemplary tripeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In a single dose maximum tolerated dose (MTD) study, groups of five normal mice were administered intravenous doses of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 28 days and body weights were measured twice a week. The dose levels tested were 0, 23, 47, 70, 93 and

25 117 mg/kg, equivalentes a 0, 14, 28, 42, 56 y 70 mg de doxorrubicina/kg, respectivamente. No había toxicidad aguda y el único signo de toxicidad observado era una disminución en el peso corporal medio de grupo para el grupo de mayor dosis, que era inferior al del grupo de control con vehículo durante todo el estudio. Sin embargo, no hubo mortalidades y ningún animal mostró morbilidad. La dosis máxima tolerada (MTD) de dosis única a 28 días de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox no se alcanzó en este experimento y, por lo tanto, es superior que la mayor dosis ensayada, 117 25 117 mg / kg, equivalent to 0, 14, 28, 42, 56 and 70 mg of doxorubicin / kg, respectively. There was no acute toxicity and the only sign of toxicity observed was a decrease in the average body weight of the group for the higher dose group, which was lower than that of the vehicle control group throughout the study. However, there were no mortalities and no animals showed morbidity. The maximum tolerated dose (BAT) of a single dose at 28 days of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox was not reached in this experiment and, therefore, is higher than the highest dose tested, 117

30 mg/kg. Esta MTD (equivalente a 66 mg de doxorrubicina/kg) es al menos 16 veces superior que la de la doxorrubicina en solitario, que da como resultado mortalidad después de dosis superiores a 4 mg/kg. 30 mg / kg This BAT (equivalent to 66 mg of doxorubicin / kg) is at least 16 times higher than that of doxorubicin alone, which results in mortality after doses greater than 4 mg / kg.

Ejemplo 12: Example 12:

35 El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox es bien tolerado en ratones sanos 35 Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox is well tolerated in healthy mice

[0263] El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, un profármaco tetrapeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En un estudio de dosis máxima tolerada (MTD) de dosis única, a grupos de cinco ratones normales se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente 40 durante 28 días y se midieron los pesos corporales dos veces por semana. Los niveles de dosis ensayados eran 0, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/kg, equivalentes a 0, 14, 28, 42, 56 y 70 mg de doxorrubicina/kg, respectivamente. No se observó toxicidad aguda después de la administración. Se observó toxicidad, incluyendo parálisis y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su peso inicial) en los dos grupos de mayor dosis. El Día 14, cuatro animales en el grupo de dosis de 125 mg/kg se eutanasiaron debido a toxicidad relacionada con el tratamiento. El Día 21, dos [0263] Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox, an exemplary tetrapeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In a single dose maximum tolerated dose (MTD) study, groups of five normal mice were given intravenous bolus doses of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 28 days and body weights were measured twice a week. The dose levels tested were 0, 25, 50, 75, 100 and 125 mg / kg, equivalent to 0, 14, 28, 42, 56 and 70 mg of doxorubicin / kg, respectively. No acute toxicity was observed after administration. Toxicity was observed, including paralysis and significant body weight loss (> 20% of its initial weight) in the two higher dose groups. On Day 14, four animals in the 125 mg / kg dose group were euthanized due to treatment-related toxicity. Day 21, two

45 animales en el siguiente grupo de mayor dosis, es decir, 100 mg/kg, se eutanasiaron de forma similar. No se observó morbilidad en el grupo de dosis siguiente (75 mg/kg) y el peso corporal medio de grupo aumentó durante el estudio. 45 animals in the next higher dose group, that is, 100 mg / kg, were euthanized in a similar way. No morbidity was observed in the next dose group (75 mg / kg) and the average group body weight increased during the study.

[0264] Basándose en la supervivencia a Día 28, se estimó que el valor MTD de dosis única para Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox era de 75 mg/kg (equivalente a una dosis de 40 mg de doxorrubicina/kg). Por lo tanto, la MTD era 50 aproximadamente 10 veces superior que la MTD de la doxorrubicina en solitario, que se estimó que era de 4 mg/kg basándose en la dosis eficaz segura convencional (4-8 mg/kg). [0264] Based on survival on Day 28, it was estimated that the single dose MTD value for Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox was 75 mg / kg (equivalent to a dose of 40 mg doxorubicin / kg) Therefore, the MTD was about 10 times higher than the MTD of doxorubicin alone, which was estimated to be 4 mg / kg based on the conventional safe effective dose (4-8 mg / kg).

Ejemplo 13: Example 13:

55 El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se tolera mejor in vivo que la doxorrubicina 55 Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox is better tolerated in vivo than doxorubicin

[0265] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, un profármaco tetrapeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En un segundo estudio de dosis máxima tolerada de dosis única (SD-MTD), a grupos de cinco ratones ICR normales se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente durante 49 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de 5 dosis ensayados eran de 0, 50, 75 ó 100 mg/kg, equivalentes a 0, 28, 42 ó 56 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente. No hubo toxicidad aguda en las 24 horas siguientes a ningún nivel de dosis. Se observaron los signos de toxicidad dependientes de la dosis y del tiempo durante el estudio. Se observó toxicidad, incluyendo parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su peso inicial) en los grupos de dosis de 75 y 100 mg/kg. A Día 35 se observó mortalidad en el 40% del grupo de dosis de 75 mg/kg. Basándose en la supervivencia y en la ausencia de signos de toxicidad a Día 49, se determinó que la SDMTD para Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox era de 50 mg/kg (equivalente a 28 mg/kg de doxorrubicina). Esta dosis se toleraba muy bien y no se observaron efectos adversos. Por lo tanto, la SD-MTD era aproximadamente 1,8 veces superior en base molar que la SD-MTD para la doxorrubicina en solitario (16 mg/kg). Véase la Tabla 9. Esta es una determinación de SD-MTD aproximada basándose en un intervalo de dosis a incrementos equivalentes a 14 mg/kg [0265] Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox, an exemplary tetrapeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In a second study of maximum single dose tolerated dose (SD-MTD), groups of five normal ICR mice were administered intravenous doses of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 49 days and body weights were measured twice a week. The 5 dose levels tested were 0, 50, 75 or 100 mg / kg, equivalent to 0, 28, 42 or 56 mg / kg of doxorubicin, respectively. There was no acute toxicity within 24 hours at any dose level. The dose and time dependent toxicity signs were observed during the study. Toxicity was observed, including partial paralysis of the lower limb and significant body weight loss (> 20% of its initial weight) in the dose groups of 75 and 100 mg / kg. On Day 35, mortality was observed in 40% of the 75 mg / kg dose group. Based on survival and the absence of signs of toxicity on Day 49, the SDMTD for Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was determined to be 50 mg / kg (equivalent to 28 mg / kg doxorubicin) . This dose was tolerated very well and no adverse effects were observed. Therefore, SD-MTD was approximately 1.8 times higher on a molar basis than SD-MTD for doxorubicin alone (16 mg / kg). See Table 9. This is an approximate SD-BAT determination based on a dose range at increments equivalent to 14 mg / kg.

15 de doxorrubicina a lo largo del intervalo ensayado. 15 of doxorubicin throughout the range tested.

Tabla 9 Table 9

Nombre de compuesto Compound name: SD-MTD (mg/kg) SD-MTD (mg/kg Dox =) SD-MTD Proporción molar (Dox=) SD-MTD (mg / kg) SD-MTD (mg / kg Dox =) SD-MTD Molar Ratio (Dox =)

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 16 1 16 16 one

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 50 28 1,8 fifty 28 1.8

Ejemplo 14: Example 14:

El Suc-Leu-Ala-Leu-Dox se tolera mejor in vivo que la doxorrubicina Suc-Leu-Ala-Leu-Dox is better tolerated in vivo than doxorubicin

[0266] El Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, un profármaco tripeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. [0266] Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, an exemplary tripeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice.

En un segundo estudio de dosis máxima tolerada de dosis única (SD-MTD), a grupos de cinco ratones ICR normales 25 se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Leu-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron In a second study of maximum single dose tolerated dose (SD-MTD), groups of five normal ICR mice 25 were administered intravenous doses of Suc-Leu-Ala-Leu-Dox intravenously. Mice were observed

diariamente durante 49 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de dosis daily for 49 days and body weights were measured twice a week. Dose levels

ensayados eran 0, 47, 59, 71, 94, 117, 140 ó 164 mg/kg, equivalentes a 0, 28, 35, 42, 56, 70, 84 ó 98 mg/kg de tested were 0, 47, 59, 71, 94, 117, 140 or 164 mg / kg, equivalent to 0, 28, 35, 42, 56, 70, 84 or 98 mg / kg of

doxorrubicina, respectivamente. No hubo toxicidad aguda en las 24 horas siguientes a ningún nivel de dosis. Se doxorubicin, respectively. There was no acute toxicity within 24 hours at any dose level. Be

observaron los signos de toxicidad dependientes de la dosis y del tiempo durante el estudio. Se observó toxicidad, observed the dose and time dependent toxicity signs during the study. Toxicity was observed,

incluyendo parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su including partial paralysis of the lower limb and significant body weight loss (> 20% of your

peso inicial) en los grupos de dosis de 94 mg/kg y superior. Basándose en la supervivencia y en la ausencia de initial weight) in the dose groups of 94 mg / kg and above. Based on survival and the absence of

signos de toxicidad a Día 49, se determinó que la SD-MTD para el Suc-Leu-Ala-Leu-Dox era de 71 mg/kg Signs of toxicity on Day 49, it was determined that the SD-BAT for Suc-Leu-Ala-Leu-Dox was 71 mg / kg

(equivalente a 42 mg/kg de doxorrubicina). Por lo tanto, la SD-MTD era aproximadamente 2,6 veces superior en (equivalent to 42 mg / kg doxorubicin). Therefore, the SD-MTD was approximately 2.6 times higher in

base molar que la SD-MTD para doxorrubicina en solitario (16 mg/kg). Véase la Tabla 10. Esta es una determinación 35 de SD-MTD aproximada basándose en un intervalo de dosis a incrementos equivalentes a 7 ó 14 mg/kg de Molar base than SD-MTD for doxorubicin alone (16 mg / kg). See Table 10. This is an approximate determination of SD-BAT based on a dose range at increments equivalent to 7 or 14 mg / kg of

doxorrubicina a lo largo del intervalo ensayado. doxorubicin throughout the range tested.

TABLA 10 TABLE 10

Nombre de compuestoSD-MTD Compound Name SD-MTD: (mg/kg) SD-MTD (mg/kg Dox =) SD-MTD Proporción molar (Dox=) (mg / kg) SD-MTD (mg / kg Dox =) SD-MTD Molar Ratio (Dox =)

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 16 1 16 16 one

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 71 42 2,6 71 42 2.6

Ejemplo 15: Example 15:

El Suc-Ile-Ala-Leu-Dox se tolera mejor in vivo que la doxorrubicina Suc-Ile-Ala-Leu-Dox is better tolerated in vivo than doxorubicin

[0267] El Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, un profármaco tripeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En [0267] Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, an exemplary tripeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In

45 un segundo estudio de dosis máxima tolerada de dosis única (SD-MTD), a grupos de cinco ratones ICR normales se les administraron por vía intravenosa dosis en embolada de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente durante 49 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de dosis ensayados eran 0, 94, 117, 140 ó 164 mg/kg, equivalentes a 0, 56, 70, 84 ó 98 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente. No hubo toxicidad aguda en las 24 horas siguientes a ningún nivel de dosis. Se observaron los signos de toxicidad dependientes de la dosis y del tiempo durante el estudio. Se observó toxicidad, incluyendo parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su peso inicial) en los grupos de mayor dosis. Los signos de toxicidad eran parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad a 164 mg/kg a Día 14, pérdida de peso a 140 mg/kg a Día 14 en un animal y a 117 mg/kg a Día 21 también en un animal. Basándose en la supervivencia y en la ausencia de signos de toxicidad a Día 49, se determinó que la SDMTD para Suc-Ile-Ala-Leu-Dox era de 94 mg/kg (equivalente a 56 mg/kg de doxorrubicina), que es 3,5 veces 45 a second study of maximum tolerated single dose (SD-MTD), groups of five normal ICR mice were administered intravenously intravenous doses of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 49 days and body weights were measured twice a week. The dose levels tested were 0, 94, 117, 140 or 164 mg / kg, equivalent to 0, 56, 70, 84 or 98 mg / kg of doxorubicin, respectively. There was no acute toxicity within 24 hours at any dose level. The dose and time dependent toxicity signs were observed during the study. Toxicity was observed, including partial paralysis of the lower limb and significant body weight loss (> 20% of its initial weight) in the higher dose groups. Signs of toxicity were partial paralysis of the lower limb at 164 mg / kg on Day 14, weight loss at 140 mg / kg on Day 14 in an animal and 117 mg / kg on Day 21 also in an animal. Based on survival and the absence of signs of toxicity on Day 49, it was determined that the SDMTD for Suc-Ile-Ala-Leu-Dox was 94 mg / kg (equivalent to 56 mg / kg doxorubicin), which is 3.5 times

5 superior en base molar que la SD-MTD para la doxorrubicina en solitario (16 mg/kg). Véase la Tabla 11. Esta es una determinación de SD-MTD aproximada basándose en un intervalo de dosis a incrementos equivalentes a 14 mg/kg de doxorrubicina a lo largo del intervalo ensayado. 5 higher on a molar basis than SD-MTD for doxorubicin alone (16 mg / kg). See Table 11. This is an approximate SD-MTD determination based on a dose range at increments equivalent to 14 mg / kg of doxorubicin over the range tested.

TABLA 11 TABLE 11

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 16 1 16 16 one

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 94 58 3,5 94 58 3.5

10 10

Ejemplo 16: Example 16:

El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se tolera mejor in vivo que la doxorrubicina Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox is better tolerated in vivo than doxorubicin

15 [0268] El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, un profármaco tetrapeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En un segundo estudio de dosis máxima tolerada de dosis única (SD-MTD), a grupos de cinco ratones ICR normales se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente durante 49 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de dosis ensayados eran 0, 50, 75 ó 100 mg/kg, equivalentes a 0, 28, 42 ó 56 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente. [0268] Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox, an exemplary tetrapeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In a second study of maximum tolerated single dose (SD-MTD), groups of five normal ICR mice were administered intravenous doses of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 49 days and body weights were measured twice a week. The dose levels tested were 0, 50, 75 or 100 mg / kg, equivalent to 0, 28, 42 or 56 mg / kg of doxorubicin, respectively.

20 No hubo toxicidad aguda en las 24 horas siguientes a ningún nivel de dosis. Se observaron los signos de toxicidad dependientes de la dosis y del tiempo durante el estudio. Se observó toxicidad, incluyendo parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su peso inicial) en el grupo de mayor dosis. A Día 21, tres animales en la dosis de 100 mg/kg se eutanasiaron debido a pérdida de peso o parálisis. No se observó morbilidad o mortalidad en el grupo de dosis de 75 mg/kg. Basándose en la supervivencia y en la 20 There was no acute toxicity within 24 hours at any dose level. The dose and time dependent toxicity signs were observed during the study. Toxicity was observed, including partial paralysis of the lower limb and significant body weight loss (> 20% of its initial weight) in the highest dose group. On Day 21, three animals at the dose of 100 mg / kg were euthanized due to weight loss or paralysis. No morbidity or mortality was observed in the dose group of 75 mg / kg. Based on survival and

25 ausencia de signos de toxicidad a Día 49, se determinó que la SD-MTD para Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox era de 75 mg/kg (equivalentes a 42 mg/kg de doxorrubicina), que es 2,6 veces superior en base molar que la SD-MTD para doxorrubicina en solitario (16 mg/kg). Véase la Tabla 12. Esta es una determinación de SD-MTD aproximada basándose en un intervalo de dosis a incrementos equivalentes a 14 mg/kg de doxorrubicina a lo largo del intervalo ensayado. In the absence of signs of toxicity on Day 49, it was determined that the SD-BAT for Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox was 75 mg / kg (equivalent to 42 mg / kg of doxorubicin), which is 2 , 6 times higher on a molar basis than the SD-MTD for doxorubicin alone (16 mg / kg). See Table 12. This is an approximate SD-MTD determination based on a dose range at increments equivalent to 14 mg / kg of doxorubicin over the range tested.

30 30

TABLA 12 TABLE 12

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 16 1 16 16 one

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 75 42 2,6 75 42 2.6

Ejemplo 17: Example 17:

35 Metabolismo de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox 35 Metabolism of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox

[0269] El metabolismo y el aclaramiento de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox se estudió en ratones normales. A los ratones se les administró Suc-Ile-Ala-Leu-Dox a una sola dosis en embolada intravenosa de 117 mg/kg. Se obtuvieron muestras de plasma a 1 y 4 horas. Se transfirieron muestras de plasma de 100 l a tubos de microcentrífuga (1,5 ml) y se [0269] The metabolism and clearance of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox was studied in normal mice. The mice were administered Suc-Ile-Ala-Leu-Dox at a single dose in an intravenous stroke of 117 mg / kg. Plasma samples were obtained at 1 and 4 hours. 100 µl plasma samples were transferred to microcentrifuge tubes (1.5 ml) and

40 añadió un patrón interno de daunorrubicina (20 l a 0,5 mg/ml) junto con acetonitrilo (400 l). Los tubos se taparon y se agitaron vorticialmente brevemente, seguido de centrifugación a 14.000 rpm. Se retiraron 420 l de cada tubo y se secaron al vacío. Cada muestra se reconstituyó en 65 l de tampón formiato de amonio acuoso 20 mM, pH 4,5 (AF) que contenía acetonitrilo (20%) antes del análisis por cromatografía líquida en fase inversa en combinación con espectrometría de masas en tándem (LC MS/MS). 40 added an internal standard of daunorubicin (20 μl to 0.5 mg / ml) together with acetonitrile (400 μl). The tubes were capped and vortexed briefly, followed by centrifugation at 14,000 rpm. 420 µl were removed from each tube and dried under vacuum. Each sample was reconstituted in 65 µl of 20 mM aqueous ammonium formate buffer, pH 4.5 (AF) containing acetonitrile (20%) before analysis by reverse phase liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry (LC MS / MS).

45 [0270] Se recogió orina a las 2 y 24 horas post-administración de parejas de ratones en jaulas metabólicas. Las muestras de orina se diluyeron con AF que contenía acetonitrilo (20%) para dar una concentración de analito diana dentro del intervalo práctico del ensayo de LC MS/MS. Se pusieron 30 l de cada muestra diluida en un tubo Eppendorf (1,5 ml) y se añadió un patrón interno de daunorrubicina (20 l a 0,5 mg/ml) junto con 50 l de AF que [0270] Urine was collected at 2 and 24 hours post-administration of pairs of mice in metabolic cages. Urine samples were diluted with AF containing acetonitrile (20%) to give a concentration of target analyte within the practical range of the MS / MS LC assay. 30 μl of each diluted sample was placed in an Eppendorf tube (1.5 ml) and an internal daunorubicin standard (20 μl to 0.5 mg / ml) was added together with 50 μl of AF which

50 contenía acetonitrilo (20%). Cada muestra se analizó después mediante LC MS/MS. 50 contained acetonitrile (20%). Each sample was then analyzed by LC MS / MS.

[0271] Un HPLC Agilent Hop1100 con detector DAD y programa informático Chemstation se acopló a un espectrómetro de masas PE Sciex API 365 con una fuente de ionización por electronebulización. Se realizó la HPLC en una columna de fase inversa TSK-Gel Super ODS, 2 mm, 4,6 x 50 mm (TosoHaas) equipada con un disco de [0271] An Agilent Hop1100 HPLC with DAD detector and Chemstation software was coupled to a Sciex API 365 PE mass spectrometer with an electrospray ionization source. HPLC was performed on a TSK-Gel Super ODS reverse phase column, 2 mm, 4.6 x 50 mm (TosoHaas) equipped with a disc of

5 vigilancia HAIGUARD C18 (Higgins Analytical) y frita de acero inoxidable (Upchurch Scientific). La cromatografía se realizó a temperatura ambiente. El caudal era de 0,5 ml/min. El volumen de inyección era de 50 l. Se realizó la elución en gradiente usando una fase móvil de tampón AF acuoso 20 mM, pH 4,5, con cantidades crecientes de acetonitrilo. El API 365 se hizo funcionar a 365 ºC en un modo de control de reacción múltiple, ajustado para controlar parejas de iones precursor-fragmento de analito específicos. La integración de los cromatogramas se realizó mediante el programa informático MacQuant (PE Sciex) y la cuantificación de cada analito se obtuvo por comparación con curvas de calibración obtenidas previamente. Se usó daunorrubicina como patrón interno en todos los casos. 5 surveillance HAIGUARD C18 (Higgins Analytical) and stainless steel frit (Upchurch Scientific). Chromatography was performed at room temperature. The flow rate was 0.5 ml / min. The injection volume was 50 µl. Gradient elution was performed using a mobile phase of 20 mM aqueous AF buffer, pH 4.5, with increasing amounts of acetonitrile. API 365 was operated at 365 ° C in a multiple reaction control mode, adjusted to control pairs of specific analyte precursor-fragment ions. The integration of the chromatograms was performed using the MacQuant software (PE Sciex) and the quantification of each analyte was obtained by comparison with previously obtained calibration curves. Daunorubicin was used as an internal standard in all cases.

[0272] Como se observa en la Tabla 13 y en la FIG. 16, el Suc-Ile-Ala-Leu-Dox se aclaró de la circulación muy [0272] As seen in Table 13 and in FIG. 16, the Suc-Ile-Ala-Leu-Dox cleared the circulation very

15 rápidamente, detectándose aproximadamente el 1,1% de la dosis administrada a 1 hora, mientras que a las 4 horas era prácticamente indetectable. Para el cálculo del porcentaje de la dosis administrada, se estimó que el volumen de plasma era el 40% del volumen de sangre, que se calculó como el 7% del peso corporal del animal. A las 2 y 24 horas se detectó el compuesto precursor en orina al 3,9% y 15,0% de la dosis administrada, demostrando que el riñón es un órgano de excreción principal para el profármaco (FIG. 17). 15 rapidly, detecting approximately 1.1% of the dose administered at 1 hour, while at 4 hours it was virtually undetectable. For the calculation of the percentage of the administered dose, it was estimated that the plasma volume was 40% of the blood volume, which was calculated as 7% of the animal's body weight. At 2 and 24 hours the precursor compound was detected in 3.9% and 15.0% of the administered dose, demonstrating that the kidney is a major excretion organ for the prodrug (FIG. 17).

TABLA 13 TABLE 13

Plasma (% dosis adm.) Plasma (% adm. Dose)

Orina (% dosis adm.) Urine (% adm. Dose)

1 h 4 h 1 h 4 h

2 h 24 h 2 h 24 h

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox

1,14 0,001.14 0.00

3,92 15,0 3.92 15.0

Ala-Leu-Dox Ala-Leu-Dox

0,00 0,000.00 0.00

0,00 0,00 0.00 0.00

Leu-Dox Leu-Dox

0,02 0,000.02 0.00

1,17 2,25 1.17 2.25

Dox Dox

0,00 0,000.00 0.00

0,06 0,36 0.06 0.36

[0273] No se detectó Ala-Leu-Dox en plasma ni orina. El metabolito peptídico principal era Leu-Dox. La doxorrubicina era prácticamente indetectable en plasma, pero se encontró en orina a niveles reducidos a las 2 y 24 [0273] Ala-Leu-Dox was not detected in plasma or urine. The main peptide metabolite was Leu-Dox. Doxorubicin was virtually undetectable in plasma, but was found in urine at reduced levels at 2 and 24

25 horas. Los niveles tanto de precursor como de metabolitos eran superiores en orina a las 24 horas que a las 2 horas. Esto es muy probablemente el resultado de la excreción de orina posterior de los ratones, en relación con el tiempo de recogida de orina inicial (2 horas). Los valores de orina representan una acumulación de 0-2 horas y de 2-24 horas, por lo tanto, la excreción urinaria posterior (después de 2 horas) se acumularía en la muestra de 2-24 horas. 25 hours Both precursor and metabolite levels were higher in urine at 24 hours than at 2 hours. This is most likely the result of subsequent excretion of mice from mice, in relation to the initial urine collection time (2 hours). Urine values represent an accumulation of 0-2 hours and 2-24 hours, therefore, subsequent urinary excretion (after 2 hours) would accumulate in the sample of 2-24 hours.

[0274] Se produjo un bajo nivel de escisión y activación del profármaco Suc-Ile-Ala-Leu-Dox en la sangre de ratones normales. La mínima toxicidad observada con Suc-Ile-Ala-Leu-Dox al alto nivel de dosis ensayado (Ejemplo 11) confirma que no hay casi producción sistémica del metabolito activo doxorrubicina, que, cuando está presente sistémicamente, es tóxico para tejidos normales. [0274] There was a low level of excision and activation of the prodrug Suc-Ile-Ala-Leu-Dox in the blood of normal mice. The minimum toxicity observed with Suc-Ile-Ala-Leu-Dox at the high dose level tested (Example 11) confirms that there is almost no systemic production of the active metabolite doxorubicin, which, when systemically present, is toxic to normal tissues.

35 Ejemplo 18: 35 Example 18:

Metabolismo de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Metabolism of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox

[0275] El metabolismo y el aclaramiento de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se estudió en ratones normales a los que se administró una sola dosis en embolada intravenosa a 117 mg/kg de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Se obtuvieron muestras de plasma a las 1 y 4 horas de ratones separados. Se recogió la orina a las 2 y 24 horas post-administración de parejas de ratones en jaulas metabólicas. Las muestras de plasma y orina se prepararon y se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 17. [0275] The metabolism and clearance of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox was studied in normal mice to which a single dose was administered in intravenous embolate at 117 mg / kg of Suc-Ala-Ile- Ala-Leu-Dox. Plasma samples were obtained at 1 and 4 hours from separate mice. Urine was collected at 2 and 24 hours post-administration of pairs of mice in metabolic cages. Plasma and urine samples were prepared and analyzed as described in Example 17.

45 [0276] El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se aclaraba de la circulación muy rápidamente: aproximadamente el 1,0% de la dosis administrada podía detectarse en plasma a 1 hora, mientras que era prácticamente indetectable a las 4 horas (Tabla 14 y FIG. 18). A las 2 y 24 horas la orina contenía el 12,7% y 4,81% de la dosis administrada, indicando que el riñón es un órgano de excreción principal para el profármaco (FIG. 19). [0276] Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox cleared the circulation very quickly: approximately 1.0% of the administered dose could be detected in plasma at 1 hour, while it was practically undetectable at 4 hours (Table 14 and FIG. 18). At 2 and 24 hours the urine contained 12.7% and 4.81% of the administered dose, indicating that the kidney is a major excretion organ for the prodrug (FIG. 19).

TABLA 14 TABLE 14

Plasma (% dosis adm.) Plasma (% adm. Dose): Orina (% dosis adm.) Urine (% adm. Dose)

1 h 1 hour: 4 h 2 h 24 h 4 h 2 h 24 h

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 1,03 0,00 12,7 4,81 1.03 0.00 12.7 4.81

Ala-Leu-Dox Ala-Leu-Dox: 0,00 0,00 0,01 0,00 0.00 0.00 0.01 0.00

Leu-Dox Leu-Dox: 0,04 0,00 4,69 2,29 0.04 0.00 4.69 2.29

Dox Dox: 0,01 0,00 0,21 0,51 0.01 0.00 0.21 0.51

[0277] El metabolito Ala-Leu-Dox era prácticamente indetectable en plasma y se encontró a niveles muy reducidos en orina a las 2 horas. El metabolito peptídico principal era Leu-Dox, que podía detectarse a bajos niveles en plasma a 1 hora, así como en orina a las 2 horas y 24 horas. Estaba presente escasa doxorrubicina libre en plasma, sin embargo, se detectaron niveles comparativamente elevados en orina, demostrando que se está produciendo un [0277] The metabolite Ala-Leu-Dox was virtually undetectable in plasma and was found at very low levels in urine at 2 hours. The main peptide metabolite was Leu-Dox, which could be detected at low levels in plasma at 1 hour, as well as in urine at 2 hours and 24 hours. Low plasma free doxorubicin was present, however, comparatively high levels were detected in urine, demonstrating that a

5 metabolismo bastante completo. 5 quite complete metabolism.

[0278] En estas muestras, los niveles tanto del precursor como de los metabolitos eran superiores en orina a las 2 horas que a las 24 horas. La suma de la cantidad de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y metabolitos recogidos a las 0-2 horas y a las 2-24 horas es similar a la de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (véase el Ejemplo 17). Por lo tanto, no hay una [0278] In these samples, both precursor and metabolite levels were higher in urine at 2 hours than at 24 hours. The sum of the amount of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and metabolites collected at 0-2 hours and 2-24 hours is similar to that of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (see Example 17). Therefore, there is not one

10 diferencia fisiológicamente significativa entre el aclaramiento de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. 10 physiologically significant difference between the clearance of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox.

Ejemplo 19: Example 19:

Ventajas de los profármacos sobre el agente terapéutico no conjugado Advantages of prodrugs over the unconjugated therapeutic agent

15 [0279] Los profármacos de la invención proporcionan ventajas de tratamiento sobre el agente terapéutico en su forma no conjugada. [0279] The prodrugs of the invention provide treatment advantages over the therapeutic agent in its unconjugated form.

[0280] En los estudios de dosis máxima tolerada (MTD) de dosis única, a grupos de ratones normales se les [0280] In the single dose maximum tolerated dose (MTD) studies, groups of normal mice are given

20 administraron dosis en embolada intravenosas del profármaco. Los ratones se observaron diariamente durante 28 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Se estimó que la MTD era igual a la dosis mayor que no producía muertes en ratones después de 28 días. Como se muestra en la Tabla 15, la SD-MTD de dosis única de los profármacos que contienen isoleucina varía de 1,6 veces a 2,5 veces mayor que la de doxorrubicina en solitario. 20 administered intravenous doses of prodrug intravenously. Mice were observed daily for 28 days and body weights were measured twice a week. BAT was estimated to be equal to the higher dose that did not cause deaths in mice after 28 days. As shown in Table 15, the single-dose SD-MTD of prodrugs containing isoleucine ranges from 1.6 times to 2.5 times greater than that of doxorubicin alone.

25 [0281] En estudios de dosis de repetición en ratones que llevan tumores, a grupos de diez ratones se les administraron diversas cantidades de profármaco por un total de cinco dosis a intervalos de cinco días o 1 semana. Después de una observación frecuente a lo largo de 60 días, se identificó la dosis que demostró estar dentro de límites de toxicidad aceptables como la dosis de repetición máxima tolerada. Como se observa en la Tabla 15, la RD-MTD de los profármacos era aproximadamente 6,5 veces superior a la de la doxorrubicina en solitario. La [0281] In repeat dose studies in mice carrying tumors, groups of ten mice were given various amounts of prodrug for a total of five doses at intervals of five days or 1 week. After frequent observation over 60 days, the dose that was found to be within acceptable toxicity limits was identified as the maximum tolerated repeat dose. As seen in Table 15, the RD-MTD of prodrugs was approximately 6.5 times higher than that of doxorubicin alone. The

30 dosificación de repetición de los profármacos a o por debajo de su RD-MTD prolonga significativamente la supervivencia de ratones que llevan tumores LS174t, mientras que la de la doxorrubicina es completamente ineficaz. Por lo tanto, la conclusión continúa siendo la misma en el sentido de que los profármacos permiten que se administre una cantidad mucho mayor de agente terapéutico al cuerpo en su totalidad y en las proximidades de la célula diana. The repeated dosage of prodrugs at or below their RD-MTD significantly prolongs the survival of mice carrying LS174t tumors, while that of doxorubicin is completely ineffective. Therefore, the conclusion remains the same in that prodrugs allow a much larger amount of therapeutic agent to be administered to the body as a whole and in the vicinity of the target cell.

35 35

Tabla 15 Table 15

Compuesto Compound: SD MTD (mg/kg)* MTD de dosis de repetición (mg/kg)* Frecuencia de dosis de repetición Metabolito principal en plasma SD MTD (mg / kg) * BAT of repeat dose (mg / kg) * Repeat dose frequency Main metabolite in plasma

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 75 (42) 53 (30) Q 5Dx5 Leu-Dox 75 (42) 53 (30) Q 5Dx5 Leu-Dox

Suc-lle-Ala-Leu-Dox Suc-lle-Ala-Leu-Dox: 94 (56) n.d. n.d. Leu-Dox 94 (56) n.d. n.d. Leu-Dox

SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox: 50 (28) 57 (32) Q 7Dx5 Ala-Leu-Dox 50 (28) 57 (32) Q 7Dx5 Ala-Leu-Dox

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 59 (35) 52 (31) Q 5Dx5 Leu-Dox 59 (35) 52 (31) Q 5Dx5 Leu-Dox

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 (16) 4 (4) Q 7Dx5 n.a. 16 (16) 4 (4) Q 7Dx5 n.a.

n.d. = no determinada; n.a. = no aplicable *: los valores entre paréntesis son la dosis equivalente de doxorrubicina n.d. = not determined; n.a. = not applicable *: values in brackets are the equivalent dose of doxorubicin

Ejemplo 20: Example 20:

40 El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox es bien tolerado en ratones que llevan tumores 40 Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox is well tolerated in mice that carry tumors

[0282] El agente terapéutico profarmacológico Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox es significativamente mejor tolerado que la doxorrubicina en condiciones de dosis de repetición. Como se esperaría, cuando se administra una dosis similar a la MTD de dosis única (75 mg/kg) (véase el Ejemplo 16) como una dosis de repetición, era peor tolerada. En 45 estudios de dosis de repetición en ratones que llevan tumores, a tres grupos de diez ratones se les administraron 0, 53 ó 68 mg/kg de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (equivalentes a 0, 30 y 38 mg de doxorrubicina/kg) por un total de cinco dosis idénticas (Q5DX5), y se observaron frecuentemente durante 60 días. Todos los animales tratados perdían [0282] The procharmacological therapeutic agent Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox is significantly better tolerated than doxorubicin under repeated dose conditions. As would be expected, when a dose similar to single dose BAT (75 mg / kg) (see Example 16) was administered as a repeat dose, it was worse tolerated. In 45 repeat dose studies in mice carrying tumors, three groups of ten mice were administered 0, 53 or 68 mg / kg of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (equivalent to 0, 30 and 38 mg of doxorubicin / kg) for a total of five identical doses (Q5DX5), and were frequently observed for 60 days. All treated animals lost

peso progresivamente durante todo el estudio, mientras que el grupo de control con vehículo ganó hasta un 12% del peso corporal inicial medio (FIG. 20). Dos animales tratados en el grupo de alta dosis se sacrificaron debido a signos de toxicidad, con pérdida de peso corporal superior al 20% de su peso inicial. Los signos de toxicidad eran similares a los observados después de una sola dosis elevada (véase el Ejemplo 16), y concordaban con el perfil de toxicidad weight progressively throughout the study, while the vehicle control group gained up to 12% of the average initial body weight (FIG. 20). Two animals treated in the high dose group were sacrificed due to signs of toxicity, with body weight loss exceeding 20% of their initial weight. The signs of toxicity were similar to those observed after a single high dose (see Example 16), and were consistent with the toxicity profile

5 conocido de doxorrubicina en roedores. Por lo tanto, la toxicidad acumulada era el resultado de una dosificación de repetición a estos niveles de dosis relativamente elevados. Sin embargo, las exposiciones globales máximas a doxorrubicina de los animales en los dos grupos de dosis después de 5 dosis eran de 150 y 190 mg/kg, respectivamente, que es significativamente superior (8 a 10 veces) que el nivel de dosis de repetición tolerado de doxorrubicina (4 mg/kg o 20 mg/kg de exposición total después de 5 dosis). Sin embargo, la RD-MTD de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox era aproximadamente equivalente a 150 mg/kg de doxorrubicina, que era al menos 6-5 veces superior que el nivel de dosis solicitado tolerado de doxorrubicina (dosis eficaz RD segura convencional de 20 mg/kg de exposición total después de 5 dosis de 4 mg/kg). 5 known of doxorubicin in rodents. Therefore, the accumulated toxicity was the result of a repeat dosage at these relatively high dose levels. However, the maximum global exposures to doxorubicin of the animals in the two dose groups after 5 doses were 150 and 190 mg / kg, respectively, which is significantly higher (8 to 10 times) than the repeat dose level tolerated of doxorubicin (4 mg / kg or 20 mg / kg of total exposure after 5 doses). However, the RD-MTD of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox was approximately equivalent to 150 mg / kg of doxorubicin, which was at least 6-5 times higher than the tolerated requested dose level of doxorubicin ( conventional safe effective effective dose of 20 mg / kg of total exposure after 5 doses of 4 mg / kg).

Ejemplo 21: Example 21:

15 fifteen

El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox es mejor tolerado in vivo que la doxorrubicina Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox is better tolerated in vivo than doxorubicin

[0283] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, un profármaco tetrapeptídico ejemplar de la invención, es bien tolerado en ratones. En un segundo estudio de dosis máxima tolerada de dosis única (SD-MTD), a grupos de cinco ratones ICR normales se les administraron dosis en embolada intravenosas de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Los ratones se observaron diariamente durante 49 días y los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Los niveles de dosis ensayados eran de 0, 50, 75 ó 100 mg/kg, equivalentes a 0, 28, 42 ó 56 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente. No hubo toxicidad aguda en las 24 horas siguientes a ningún nivel de dosis. Se observaron los signos de toxicidad dependientes de la dosis y del tiempo durante el estudio. Se observó toxicidad, incluyendo [0283] Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox, an exemplary tetrapeptide prodrug of the invention, is well tolerated in mice. In a second study of maximum single dose tolerated dose (SD-MTD), groups of five normal ICR mice were administered intravenous doses of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Mice were observed daily for 49 days and body weights were measured twice a week. The dose levels tested were 0, 50, 75 or 100 mg / kg, equivalent to 0, 28, 42 or 56 mg / kg of doxorubicin, respectively. There was no acute toxicity within 24 hours at any dose level. The dose and time dependent toxicity signs were observed during the study. Toxicity was observed, including

25 parálisis parcial de la parte inferior de la extremidad y pérdida de peso corporal significativa (>20% de su peso inicial) en los grupos de dosis de 75 y 100 mg/kg. A Día 35 se observó mortalidad en el 40% del grupo de dosis de 75 mg/kg. Basándose en la supervivencia y en la ausencia de signos de toxicidad a Día 49, se determinó que la SDMTD para Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox era de 50 mg/kg (equivalente a 28 mg/kg de doxorrubicina). Esta dosis era muy bien tolerada y no se observaron efectos adversos. Por lo tanto, la SD-MTD era aproximadamente 1,8 veces superior en base molar que la SD-MTD para doxorrubicina en solitario (16 mg/kg). Véase la Tabla 16. Esta es una determinación de SD-MTD aproximada basándose en un intervalo de dosis a incrementos equivalentes a 14 mg/kg de doxorrubicina a lo largo del intervalo ensayado. 25 partial paralysis of the lower limb and significant body weight loss (> 20% of its initial weight) in the dose groups of 75 and 100 mg / kg. On Day 35, mortality was observed in 40% of the 75 mg / kg dose group. Based on survival and the absence of signs of toxicity on Day 49, the SDMTD for Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was determined to be 50 mg / kg (equivalent to 28 mg / kg doxorubicin) . This dose was very well tolerated and no adverse effects were observed. Therefore, SD-MTD was approximately 1.8 times higher on a molar basis than SD-MTD for doxorubicin alone (16 mg / kg). See Table 16. This is an approximate SD-MTD determination based on a dose range at increments equivalent to 14 mg / kg of doxorubicin over the range tested.

TABLA 16 TABLE 16

Compuesto Compound: SD-MTD (mg/kg) SD-MTD (mg/kg Dox equiv.) SD-MTD Proporción Molar (Dox equiv.) SD-MTD (mg / kg) SD-MTD (mg / kg Dox equiv.) SD-MTD Molar Ratio (Dox equiv.)

Doxorrubicina Doxorubicin: 16 16 1 16 16 one

35 35

Ejemplo 22: Example 22:

El Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox es eficaz en ratones que llevan tumores Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox is effective in mice that carry tumors

[0284] El agente terapéutico Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox ha demostrado ser eficaz en la prolongación de la supervivencia de ratones y la inhibición del crecimiento de tumores humanos en un modelo de xenoinjerto de ratón que utiliza el carcinoma colorrectal resistente a doxorrubicina LS174t. Por ejemplo, grupos de diez ratones atímicos a los que se implantó subcutáneamente trozos de LS174t que se dejó que crecieran hasta aproximadamente 50 mg, se trataron por vía intravenosa con 0, 53 ó 68 mg/kg de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (equivalente a 0, 30 ó 38 mg/kg de [0284] The therapeutic agent Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox has been shown to be effective in prolonging the survival of mice and inhibiting the growth of human tumors in a mouse xenograft model using colorectal carcinoma doxorubicin resistant LS174t. For example, groups of ten athymic mice that were subcutaneously implanted with pieces of LS174t that were allowed to grow to approximately 50 mg were treated intravenously with 0.53 or 68 mg / kg of Suc-Ala-Ile-Ala -Leu-Dox (equivalent to 0, 30 or 38 mg / kg of

45 doxorrubicina) a intervalos de cinco días durante un total de cinco dosis idénticas (Q5DX5). Los tumores y los pesos corporales se midieron dos veces por semana durante hasta 60 días. Como se observa en la FIG. 21, ambas dosis eran eficaces en la reducción del crecimiento de tumores en comparación con animales de control con vehículo. Hubo 4 y 2 supervivientes a largo plazo en los grupos de baja y alta dosis, respectivamente, en comparación con 0 en el grupo de control con vehículo. El día de supervivencia medio (MDS) en animales cuyos tumores alcanzaron 1,5 g antes del Día 60 era significativamente mejor en los grupos de dosis reducida (29,7 días) y elevada (23,4 días) que en el grupo de control con vehículo (18,2 días). Por lo tanto, el Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox era eficaz en este modelo tumoral humano agresivo, en el que la doxorrubicina en solitario a su dosis tolerada (3 mg/kg) en este régimen de dosificación es históricamente ineficaz. 45 doxorubicin) at five-day intervals for a total of five identical doses (Q5DX5). Tumors and body weights were measured twice a week for up to 60 days. As shown in Fig. 21, both doses were effective in reducing tumor growth compared to vehicle control animals. There were 4 and 2 long-term survivors in the low and high dose groups, respectively, compared to 0 in the vehicle control group. The average survival day (MDS) in animals whose tumors reached 1.5 g before Day 60 was significantly better in the reduced dose (29.7 days) and elevated (23.4 days) groups than in the control group with vehicle (18.2 days). Therefore, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox was effective in this aggressive human tumor model, in which doxorubicin alone at its tolerated dose (3 mg / kg) in this dosage regimen is historically ineffective.

55 Ejemplo 23: 55 Example 23:

Eficacia de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox contra tumores LNCaP en ratones atímicos Efficacy of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox against LNCaP tumors in nude mice

[0285] Se ha demostrado que el agente terapéutico Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox es eficaz en la inhibición del crecimiento de tumores humanos en un modelo de xenoinjerto de ratón que utiliza el carcinoma de próstata LNCaP. Grupos de seis o siete ratones atímicos a los que se inyectó subcutáneamente 4 millones de células LNCaP se 5 trataron por vía intravenosa con solución salina, 5 mg/kg de doxorrubicina o 59 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (equivalente a 33 mg/kg de doxorrubicina) a intervalos de siete días por un total de cinco dosis idénticas (Q7DX5). Los ratones se pesaron y los tumores se midieron (mediante un calibrador) al menos una vez por semana antes del inicio de la dosificación (Día 0), después dos veces por semana durante el estudio. Inmediatamente antes del inicio de la dosificación (Día de estudio -2 a Día 0), los ratones se aleatorizaron en diversos grupos basándose en el peso [0285] The therapeutic agent Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox has been shown to be effective in inhibiting the growth of human tumors in a mouse xenograft model using LNCaP prostate carcinoma. Groups of six or seven athymic mice in which 4 million LNCaP cells were injected subcutaneously were treated intravenously with saline, 5 mg / kg of doxorubicin or 59 mg / kg of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu -Dox (equivalent to 33 mg / kg of doxorubicin) at seven-day intervals for a total of five identical doses (Q7DX5). The mice were weighed and the tumors were measured (by a calibrator) at least once a week before the start of dosing (Day 0), then twice a week during the study. Immediately before the start of dosing (Study Day -2 to Day 0), mice were randomized in various groups based on weight

10 de los tumores. El peso tumoral medio era de aproximadamente 250 mg a Día 0. Los ratones se eutanasiaron después de que los tumores alcanzaran un peso límite de 1,5 g (punto final del cáncer), o cuando los ratones experimentaron una pérdida de peso superior al 25% (punto final tóxico). Los estudios se terminaron a Día 60. Un ratón al que se le administró doxorrubicina se excluyó de la evaluación porque el tumor se ulceró. 10 of the tumors. The average tumor weight was approximately 250 mg at Day 0. The mice were euthanized after the tumors reached a weight limit of 1.5 g (cancer endpoint), or when the mice experienced a weight loss greater than 25 % (toxic endpoint). The studies were completed on Day 60. A mouse given doxorubicin was excluded from the evaluation because the tumor was ulcerated.

15 [0286] En ratones atímicos, los tumores del grupo de control con vehículo crecieron relativamente lentamente (FIG. 22) y el tumor mostraba características de crecimiento heterogéneas, variando el sacrificio al punto final de peso tumoral del Día 29 al Día 60 (no se muestran los datos). Se produjo una pérdida progresiva de peso corporal en los ratones de control, que perdieron el 15% de peso medio a lo largo del estudio (FIG. 23). Dicha pérdida de peso caquéctica es posiblemente debida a los xenoinjertos de LNCaP y se ha descrito por otro grupos (DeFeo[0286] In athymic mice, tumors of the vehicle control group grew relatively slowly (FIG. 22) and the tumor showed heterogeneous growth characteristics, varying the sacrifice to the endpoint of tumor weight from Day 29 to Day 60 (no the data is displayed). There was a progressive loss of body weight in control mice, which lost 15% of average weight throughout the study (FIG. 23). Said cachectic weight loss is possibly due to LNCaP xenografts and has been described by other groups (DeFeo

20 Jones et al., "A peptide-doxorubicin ’prodrug’ activated by prostate-specific antigen selectively kills prostate tumor cells positive for prostate-specific antigen in vivo", Nature Medicine 6(11): 1248-1252 (2000)). Los ratones que no llevaban tumores de los mismos envíos mantuvieron el peso y los ratones centinela eran normales por vigilancia de la salud de la colonia. Los ratones que recibieron Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y doxorrubicina tenían una pérdida de peso media superior al 20% (FIG. 23). Los efectos combinados de la pérdida de peso basal en ratones que llevaban 20 Jones et al., "A peptide-doxorubicin" prodrug "activated by prostate-specific antigen selectively kills prostate tumor cells positive for prostate-specific antigen in vivo", Nature Medicine 6 (11): 1248-1252 (2000)). Mice that did not carry tumors from the same consignments maintained weight and sentinel mice were normal by monitoring the health of the colony. The mice that received Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox and doxorubicin had an average weight loss greater than 20% (FIG. 23). The combined effects of baseline weight loss in mice carrying

25 tumores debida a los tumores, y la pérdida de peso debida a los compuestos de ensayo dio como resultado que tanto el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox como la doxorrubicina superasen la pérdida de peso permitida, siendo inaceptablemente tóxicos a los regímenes de dosificación relativamente elevados ensayados, sacrificándose 7 de 7 y 4 de 5 ratones, respectivamente, por pérdida de peso excesiva en estos grupos de tratamiento (Tabla 17). 25 tumors due to tumors, and weight loss due to test compounds resulted in both Suc-la Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and doxorubicin exceeding the permitted weight loss, being unacceptably toxic to the relatively high dosage regimens tested, sacrificing 7 of 7 and 4 of 5 mice, respectively, for excessive weight loss in these treatment groups (Table 17).

30 TABLA 17. Eficacia contra tumores LNCaP en ratones atímicos 30 TABLE 17. Efficacy against LNCaP tumors in nude mice

Compuesto Compound: Peso tumoral % Inhibición del crecimiento tumoral Supervivientes (día 60) Punto final del cáncer Punto final tóxico Tumor weight % Tumor growth inhibition Survivors (day 60) End point of cancer Toxic end point

Solución salina Saline solution: D14: 840  112 D21: 941  137 - 2 4 0 D14: 840  112 D21: 941  137 - 2 4 0

Doxorrubicina^ Doxorubicin ^: D14: 567  77 D14: 32  16 D21: N/A 1 0 4 D14: 567  77 D14: 32  16 D21: N / A one 0 4

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: D14: 391  70 D21: 318  67 D14: 53  15* D21: 66  11* 0 0 7 D14: 391  70 D21: 318  67 D14: 53  15 * D21: 66  11 * 0 0 7

*: Estadísticamente diferente del control al nivel de p de 0,01 (prueba t bilateral para datos no relacionados) *: Statistically different from the control at the p level of 0.01 (bilateral t test for unrelated data)

[0287] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox inhibía completamente el crecimiento de tumores LNCaP (FIG. 22; Tabla 17). No se determinó el punto final de supervivencia en este estudio debido a las características de crecimiento lento de los tumores, continuando los animales en el grupo de control hasta la fecha de fin de estudio designada (Día 60). El [0287] Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox completely inhibited the growth of LNCaP tumors (FIG. 22; Table 17). The endpoint of survival was not determined in this study due to the slow growth characteristics of the tumors, the animals continuing in the control group until the designated end-of-study date (Day 60). He

35 peso tumoral medio de todos los ratones cuando se sacrificaron en el grupo de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox era significativamente inferior que el del grupo de doxorrubicina en solitario (232 mg y 967 mg, respectivamente; calculado, no se muestra). En su conjunto, el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox era superior a la doxorrubicina en la inhibición del crecimiento tumoral. The mean tumor weight of all mice when they were sacrificed in the Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox group was significantly lower than that of the doxorubicin group alone (232 mg and 967 mg, respectively; calculated, not it shows). Overall, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was superior to doxorubicin in inhibiting tumor growth.

40 40

Ejemplo 24: Example 24:

Eficacia contra tumores LNCaP en ratones SCID Efficacy against LNCaP tumors in SCID mice

45 [0288] El estudio de xenoinjerto de LNCaP se repitió después con modificaciones de la forma siguiente: se usaron ratones SCID con dosis inferiores adicionales tanto de doxorrubicina como de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ensayadas para obtener una respuesta a la dosis bien tolerada y limitar la dosificación a dos dosis, separadas por seis días, para minimizar los efectos aditivos del compuesto sobre la pérdida de peso basal relacionada con el tumor. Por [0288] The LNCaP xenograft study was then repeated with modifications as follows: SCID mice were used with additional lower doses of both doxorubicin and Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox tested to obtain a response at the well-tolerated dose and limit the dosage to two doses, separated by six days, to minimize the additive effects of the compound on the tumor-related baseline weight loss. By

50 consiguiente, a grupos de diez ratones CB17.SCID a los que se inyectó subcutáneamente 2,5 millones de células LNCaP se trataron por vía intravenosa con solución salina, 3 ó 4 mg/kg de doxorrubicina o 40, 50 ó 62 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (equivalentes a 22, 28 y 35 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente) a intervalos de seis días durante un total de dos dosis idénticas (Q6DX2). Los ratones se pesaron y los tumores se midieron (mediante un calibrador) al menos una vez por semana antes del inicio de la dosificación (Día 0), después dos veces por semana durante el estudio. Inmediatamente antes del inicio de la dosificación (Día de estudio -2 a Día 0), los ratones 50 consequently, to groups of ten CB17.SCID mice to which 2.5 million LNCaP cells were injected subcutaneously were treated intravenously with saline, 3 or 4 mg / kg of doxorubicin or 40, 50 or 62 mg / kg of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (equivalent to 22, 28 and 35 mg / kg of doxorubicin, respectively) at six-day intervals for a total of two identical doses (Q6DX2). The mice were weighed and the tumors were measured (by a calibrator) at least once a week before the start of dosing (Day 0), then twice a week during the study. Immediately before the start of dosing (Study Day -2 to Day 0), mice

5 se aleatorizaron en diversos grupos basándose en el peso de los tumores. El peso tumoral medio era de aproximadamente 200 mg a Día 0. Los ratones se eutanasiaron después de que los tumores alcanzaran un peso límite de 1,5 g (punto final del cáncer), o cuando los ratones experimentaron una pérdida de peso superior al 25% (punto final tóxico). Los estudios se terminaron a Día 60. 5 were randomized in various groups based on the weight of the tumors. The average tumor weight was approximately 200 mg at Day 0. The mice were euthanized after the tumors reached a weight limit of 1.5 g (cancer endpoint), or when the mice experienced a weight loss greater than 25 % (toxic endpoint). The studies were completed on Day 60.

10 [0289] Los ratones del grupo de control con vehículo a los que se implantó el tumor LNCaP disminuyeron de nuevo gradualmente en peso desde el momento del implante, y a Día 22 tenían una pérdida de peso media de aproximadamente el 19% (FIG. 24). Una meseta en la pérdida de peso corporal en todos los ratones en el estudio a aproximadamente el Día 12 coincidía con un cambio de dieta de pienso de roedor convencional a un pienso de roedor de alto contenido en grasa, realizado para controlar la caquexia relacionada con el tumor observada. 10 [0289] The mice in the vehicle control group to which the LNCaP tumor was implanted gradually decreased in weight from the time of implantation, and on Day 22 they had an average weight loss of approximately 19% (FIG. 24 ). A plateau in the loss of body weight in all the mice in the study at approximately Day 12 coincided with a change of conventional rodent feed diet to a high fat rodent feed, performed to control the cachexia related to observed tumor

15 [0290] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox a los tres niveles de dosis inhibía significativamente el crecimiento tumoral a Día 12, el último día de medición en el que estaban vivos todos los ratones. Se observó una tendencia de aumento de la eficacia relacionado con la dosis, aunque la eficacia era máxima a 50 mg/kg. El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (40 mg/kg) inhibía el crecimiento tumoral en mayor medida que la doxorrubicina a 3 ó 4 mg/kg, ninguna de las cuales [0290] Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox at the three dose levels significantly inhibited tumor growth at Day 12, the last day of measurement in which all mice were alive. A trend of increased dose-related efficacy was observed, although the efficacy was maximum at 50 mg / kg. Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (40 mg / kg) inhibited tumor growth to a greater extent than doxorubicin at 3 or 4 mg / kg, none of which

20 consiguió una significación estadística (FIG. 25 y Tabla 18). 20 achieved statistical significance (FIG. 25 and Table 18).

[0291] Los ratones que recibieron 40 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox tenían aproximadamente el mismo porcentaje de pérdida de peso media desde el inicio de la dosificación que el control, y menos que ambos grupos con doxorrubicina (FIG. 24). Varios ratones que recibieron 50 y 62 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox tuvieron un [0291] Mice that received 40 mg / kg of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox had approximately the same percentage of average weight loss since the start of dosing as the control, and less than both groups with doxorubicin (FIG. 24). Several mice that received 50 and 62 mg / kg of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox had a

25 nivel inaceptable de pérdida de peso superior al 20% a Día 22 (FIG. 24 y Tabla 18). 25 unacceptable level of weight loss greater than 20% on Day 22 (FIG. 24 and Table 18).

TABLA 18. Eficacia contra tumores LNCaP en ratones SCID
TABLE 18. Efficacy against LNCaP tumors in SCID mice

Compuesto Compound: Dosis (mg/kg) Peso tumoral % Inhibición de crecimiento tumoral Supervivientes (día 22) Punto final tóxico Dose (mg / kg) Tumor weight % Inhibition of tumor growth Survivors (day 22) Toxic end point

Solución salina Saline solution: - 416  36 - 9 1 - 416  36 - 9 one

Doxorrubicina Doxorubicin: 4 310  25 26 6 8 2 4 310  25 26 6 8 2

Doxorrubicina Doxorubicin: 3 328  35 21  8 9 1 3 328  35 21  8 9 one

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 62 196  22 53  5* 4 6 62 196  22 53  5 * 4 6

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 50 168  29 60  7* 5 5 fifty 168  29 60  7 * 5 5

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 40 244  25 41  6* 10 0 40 244  25 41  6 * 10 0

En su conjunto, el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox era eficaz y superior a la doxorrubicina en la inhibición del crecimiento 30 tumoral de LNCaP después de 2 tratamientos semanales. As a whole, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was effective and superior to doxorubicin in inhibiting tumor growth of LNCaP after 2 weekly treatments.

Ejemplo 25: Example 25:

Eficacia de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox y Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox sobre xenoinjertos de LNCaP Efficacy of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox and Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox on LNCaP xenografts

[0292] Las células de carcinoma de próstata humano LNCaP expresan altos niveles de CD10 en la superficie. SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Gly-Dox se ensayaron a un solo nivel de dosis Q7Dx5. Grupos de ocho ratones atímicos NCr macho a los que se inyectó por vía subcutánea 4 millones de células LNCaP, se trataron por vía intravenosa con solución salina, 5 mg/kg de doxorrubicina, 59 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (equivalentes 40 a 33 mg/kg de doxorrubicina) o 73 mg/kg de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (equivalentes a 47 mg/kg de doxorrubicina; u 81 mg/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) a intervalos de siete días por un total de cinco dosis idénticas (Q7DX5) (Tabla 19). Los ratones se pesaron y los tumores se midieron (mediante un calibrador) al menos una vez por semana antes del inicio de la dosificación (Día 0), después dos veces por semana durante el estudio. Inmediatamente antes del inicio de la dosificación (Día de estudio -2 a Día 0), los ratones se aleatorizaron en diversos grupos basándose en el 45 peso de los tumores. El peso tumoral medio era de aproximadamente 250 mg a Día 0. Los ratones se eutanasiaron después de que los tumores alcanzaran un peso límite de 1,5 g (punto final del cáncer), o cuando los ratones experimentaron una pérdida de peso superior al 25% (punto final tóxico). Los estudios se terminaron a Día 60. Un [0292] LNCaP human prostate carcinoma cells express high levels of CD10 on the surface. SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Gly-Dox were tested at a single dose level Q7Dx5. Groups of eight male NCr athymic mice that were injected subcutaneously with 4 million LNCaP cells were treated intravenously with saline, 5 mg / kg of doxorubicin, 59 mg / kg of Suc-Ala-Leu-Ala -Leu-Dox (equivalent 40 to 33 mg / kg of doxorubicin) or 73 mg / kg of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (equivalent to 47 mg / kg of doxorubicin; or 81 mg / kg of Suc-Ala -Leu-Ala-Leu-Dox) at seven-day intervals for a total of five identical doses (Q7DX5) (Table 19). The mice were weighed and the tumors were measured (by a calibrator) at least once a week before the start of dosing (Day 0), then twice a week during the study. Immediately before the start of dosing (Study Day -2 to Day 0), mice were randomized into various groups based on the weight of the tumors. The average tumor weight was approximately 250 mg at Day 0. The mice were euthanized after the tumors reached a weight limit of 1.5 g (cancer endpoint), or when the mice experienced a weight loss greater than 25 % (toxic endpoint). The studies were completed on Day 60. A

ratón al que se le administró doxorrubicina se excluyó de la evaluación porque el tumor se ulceró. Mouse given doxorubicin was excluded from the evaluation because the tumor ulcerated.

TABLA 19 TABLE 19

Compuesto Compound: Dosis (mg/kg) Peso tumoral (mg) Inhibición del crecimiento tumoral (% sobre el control) Toxicidad (Pérdida de peso >25%) Dose (mg / kg) Tumor Weight (mg) Inhibition of tumor growth (% over control) Toxicity (Weight loss> 25%)

Solución salina Saline solution: - D12: 806  135 (n = 6) D14: 840  112 (n = 6) D21: 941  137(n = 6) 0 0/6 - D12: 806  135 (n = 6) D14: 840  112 (n = 6) D21: 941  137 (n = 6) 0 0/6

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 75 D14:391  70(n = 7) D21: 318  67 (n = 7) D14: 53** D21: 66,2** 7/7 75 D14: 391  70 (n = 7) D21: 318  67 (n = 7) D14: 53 ** D21: 66.2 ** 7/7

Doxorrubicina Doxorubicin: 5 D14: 567  77 (n = 6) 32,5 4/6 5 D14: 567  77 (n = 6) 32.5 4/6

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 110 D12: 795  177 (n = 7) 1,4 1/7 110 D12: 795  177 (n = 7) 1.4 1/7

**: Estadísticamente diferente del control (p < 0,01, bilateral) **: Statistically different from the control (p <0.01, bilateral)

5 [0293] El SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox interrumpió completamente el crecimiento del tumor LNCaP, indujo la regresión del tumor de todos los ratones tratados y era más eficaz que la doxorrubicina (Tabla 19). Curiosamente, el Suc-Leu-Ala-Gly-Dox administrado a una concentración molar un 37% mayor que el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox no era eficaz en absoluto. En este estudio, el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se administró a aproximadamente su RD-MTD en otros modelos de tumores (LS174T y MX-1). Sin embargo, esta dosis demostró ser demasiado elevada en 5 [0293] SucAla-Leu-Ala-Leu-Dox completely disrupted the growth of the LNCaP tumor, induced tumor regression of all treated mice and was more effective than doxorubicin (Table 19). Interestingly, the Suc-Leu-Ala-Gly-Dox administered at a molar concentration 37% higher than the Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was not effective at all. In this study, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was administered to approximately its RD-MTD in other tumor models (LS174T and MX-1). However, this dose proved to be too high in

10 ratones que llevan tumores LNCaP, ya que incluso los ratones de control con vehículo con tumores LNCaP experimentaron una pérdida de peso corporal de aproximadamente el 15% de promedio. Dicha pérdida de peso caquéctica (desgaste físico general y malnutrición habitualmente asociadas con enfermedad crónica) es posiblemente debida a los xenoinjertos de LNCaP y se ha descrito por otros grupos (DeFeo-Jones et al., Nature Medicine 6(11): 1248-1252 (2000)). Sorprendentemente, el Suc-Leu-Ala-Gly-Dox administrado a una dosis un 10% 10 mice carrying LNCaP tumors, since even vehicle control mice with LNCaP tumors experienced an average body weight loss of approximately 15%. Such cachectic weight loss (general physical wasting and malnutrition usually associated with chronic disease) is possibly due to LNCaP xenografts and has been described by other groups (DeFeo-Jones et al., Nature Medicine 6 (11): 1248-1252 (2000)). Surprisingly, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox administered at a dose of 10%

15 mayor que la dosis eficaz ensayada en el modelo de HT-29 (Ejemplo 26) no era eficaz pero todavía se toleraba en el modelo de LNCaP. No obstante, la ausencia relativa de eficacia y la toxicidad a dosis relativamente elevadas de Suc-Leu-Ala-Gly concuerda con la idea de que CD10 desempeña un papel importante para la escisión in vivo de profármacos activados por tumores. 15 greater than the effective dose tested in the HT-29 model (Example 26) was not effective but was still tolerated in the LNCaP model. However, the relative lack of efficacy and toxicity at relatively high doses of Suc-Leu-Ala-Gly agrees with the idea that CD10 plays an important role for in vivo excision of tumor-activated prodrugs.

20 Ejemplo 26: EJEMPLO DE REFERENCIA 20 Example 26: REFERENCE EXAMPLE

Eficacia de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox contra HT-29, una línea celular CD10neg Efficacy of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox against HT-29, a CD10neg cell line

[0294] Un estudio de xenoinjerto de ratón demostró la eficacia de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox sobre el crecimiento de [0294] A mouse xenograft study demonstrated the efficacy of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox on the growth of

25 carcinoma de colon humano (HT-29) y el resultado en términos de supervivencia a largo plazo. Ratones atímicos macho jóvenes sanos se inyectaron por vía subcutánea con 5 millones de células HT-29. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mg de peso, se inició un tratamiento cada 7 días por 5 dosis de grupos de 8, 10 ó 12 ratones con vehículo, doxorrubicina 4 mg/kg, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox 40 ó 67 mg/kg. Se midió el tamaño del tumor y los pesos corporales dos veces por semana durante hasta 60 días. 25 human colon carcinoma (HT-29) and the result in terms of long-term survival. Healthy young male athymic mice were injected subcutaneously with 5 million HT-29 cells. When the tumors reached approximately 100 mg in weight, treatment was started every 7 days for 5 doses of groups of 8, 10 or 12 mice with vehicle, doxorubicin 4 mg / kg, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox 40 or 67 mg / kg Tumor size and body weights were measured twice a week for up to 60 days.

30 [0295] Se observó un aumento de la supervivencia de los ratones dependiente de la dosis. El Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, administrado a 40 mg/kg y 67 mg/kg (concentración equivalente a 42 mg/kg y 70 mg/kg de doxorrubicina) se toleraba muy bien y prolongaba enormemente la supervivencia de los ratones que llevaban tumores. Los ratones tratados con doxorrubicina tenían una MDS de 30 días. El día de supervivencia medio se aumentó a 39 y 41 días en [0295] An increase in dose-dependent survival of mice was observed. Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, administered at 40 mg / kg and 67 mg / kg (concentration equivalent to 42 mg / kg and 70 mg / kg of doxorubicin) was well tolerated and greatly prolonged the survival of mice They carried tumors. Mice treated with doxorubicin had an MDS of 30 days. The average survival day was increased to 39 and 41 days in

35 los grupos tratados con Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, en comparación con 26 días en el grupo de control con vehículo. (Tabla 20). Las altas dosis de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox disminuían la velocidad de crecimiento del tumor significativamente sobre el grupo de control con vehículo (Tabla 20). El compuesto se toleraba muy bien, sugiriendo que las dosis administradas estaban ambas por debajo de la MTD de dosis de repetición. 35 groups treated with Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, compared with 26 days in the vehicle control group. (Table 20). High doses of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox decreased the tumor growth rate significantly over the vehicle control group (Table 20). The compound was tolerated very well, suggesting that the doses administered were both below the MTD of repeated doses.

40 [0296] Por lo tanto, se estableció una respuesta a la dosis y se identificó una gran ventana terapéutica para Suc-Leu-Ala-Gly-Dox en el modelo de HT-29. Las células HT-29 no expresan CD10 in vitro y otras enzimas, tales como la oligopeptidasa thimet, podrían ser responsables de la escisión de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox en xenoinjertos de HT-29. [0296] Therefore, a dose response was established and a large therapeutic window for Suc-Leu-Ala-Gly-Dox was identified in the HT-29 model. HT-29 cells do not express CD10 in vitro and other enzymes, such as oligopeptidase thimet, could be responsible for the excision of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox in HT-29 xenografts.

TABLA 20 TABLE 20

Compuesto Compound: Dosis (mg/kg) Peso tumoral medio a Día 14 (mg) %TGI (Día 14, media) Peso Tumoral medio a Día 25 (mg) %TGI (Día 25, mediana) Día de supervivencia medio calculado (día) Prolongación del día de supervivencia medio sobre los controles Número de supervivientes a largo plazo Toxicidad (Pérdida de peso >20%) Dose (mg / kg) Mean tumor weight at Day 14 (mg) % TGI (Day 14, average) Average tumor weight at Day 25 (mg) % TGI (Day 25, median) Average survival day calculated (day) Extension of the average survival day over controls Number of long-term survivors Toxicity (Weight loss> 20%)

Solución salina Saline solution: - 733  72 (n = 12) 0% 1515 0% 25,7  2,6 (n = 11) 0% 0/11 0/11 - 733  72 (n = 12) 0% 1515 0% 25.7  2.6 (n = 11) 0% 11/11 11/11

Doxorrubicina Doxorubicin: 4,0 665  103 (n = 10) 9,3% 1046 30,9% 30,0  3,7 (n = 9) 16,7% 0/10 1/10 4.0 665  103 (n = 10) 9.3% 1046 30.9% 30.0  3.7 (n = 9) 16.7% 0/10 1/10

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 40 704  92 (n = 8) 4,0% 952 37,2% 38,8  6,6 (n = 7) 51,0% 1/7 0/7 40 704  92 (n = 8) 4.0% 952 37.2% 38.8  6.6 (n = 7) 51.0% 1/7 0/7

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 67 490  124 (n = 7) 33,2%* 857 43,5% 41,3  7,2 (n = 7) 60,7% * 3/7 0/7 67 490  124 (n = 7) 33.2% * 857 43.5% 41.3  7.2 (n = 7) 60.7% * 3/7 0/7

*: Estadísticamente diferente del control al nivel de p de 0,10 (bilateral). #: Algunos ratones se excluyeron de los análisis de crecimiento tumoral/supervivencia debido a la ulceración de los tumores. TGI: Inhibición del crecimiento tumoral sobre el control. *: Statistically different from the control at the p level of 0.10 (bilateral). #: Some mice were excluded from tumor growth / survival analyzes due to tumor ulceration. TGI: Inhibition of tumor growth over control.

Ejemplo 27: Example 27:

5 5

Susceptibilidad a la escisión por oligopeptidasa thimet y CD10 en comparación con la eficacia Susceptibility to excision by oligopeptidase thimet and CD10 compared to efficacy

[0297] Para evaluar adicionalmente el papel in vivo de CD10 en la escisión de compuestos de profármaco activados por tumores, se ensayaron compuestos de profármaco que contenían doxorrubicina con perfiles de [0297] To further assess the in vivo role of CD10 in the cleavage of tumor-activated prodrug compounds, prodrug compounds containing doxorubicin with profiles of

10 escisión distintos para oligopeptidasa thimet y CD10 en xenoinjertos de LNCaP desarrollados en ratones C.B17.SCID. Se evaluaron Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Gly-Dox. Todos los compuestos excepto el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (tres niveles) se administraron a dos niveles con el objetivo de obtener una respuesta a la dosis para todos los compuestos. Los perfiles de escisión para cada uno de los compuestos de ensayo se muestran en la Tabla 21. 10 different cleavage for oligopeptidase thimet and CD10 in xenografts of LNCaP developed in C.B17.SCID mice. Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc- were evaluated Leu-Ala-Gly-Dox. All compounds except Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (three levels) were administered at two levels in order to obtain a dose response for all compounds. The cleavage profiles for each of the test compounds are shown in Table 21.

15 fifteen

TABLA 21 TABLE 21

Compuesto Compound: Escindido por CD10 Escisión por oligopeptidasa thimet Split by CD10 Oligopeptidase thimet excision

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: + + + +

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: + - + -

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: + + + +

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: + - + -

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: - + - +

[0298] Sabiendo que los ratones atímicos que llevan tumores LNCaP tienen pérdida de peso, se seleccionaron niveles de dosis muy conservativos para cada compuesto que se estimó que eran dosis equitóxicas bien toleradas [0298] Knowing that athymic mice carrying LNCaP tumors have weight loss, very conservative dose levels were selected for each compound that was estimated to be well tolerated equitoxic doses

20 basándose en estudios anteriores y en los resultados de SD-MTD. El nivel de alta dosis para dosificación de repetición es habitualmente el 80% de su SD-MTD, y el nivel de dosis reducida es el 80% del nivel de alta dosis. Por consiguiente, a grupos de diez ratones CD17.SCID macho a los que se inyectó por vía subcutánea 2,5 millones de células LNCaP, se trataron por vía intravenosa con los compuestos a los niveles descritos en la Tabla 22 a intervalos de seis días durante un total de dos dosis idénticas (Q6DX2). 20 based on previous studies and the results of SD-MTD. The high dose level for repeat dosing is usually 80% of your SD-MTD, and the reduced dose level is 80% of the high dose level. Accordingly, to groups of ten male CD17.SCID mice that were injected subcutaneously with 2.5 million LNCaP cells, were treated intravenously with the compounds at the levels described in Table 22 at six-day intervals during a total of two identical doses (Q6DX2).

TABLA 22. Niveles de dosis
TABLE 22. Dose levels

Compuesto Compound: Dosis (mg/kg) Dosis de doxorrubicina equivalente (mg/kg) Dose (mg / kg) Dose of equivalent doxorubicin (mg / kg)

Vehículo Vehicle: - - - -

Doxorrubicina Doxorubicin: 4 4 4 4

Doxorrubicina Doxorubicin: 3 3 3 3

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 62 35 62 35

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 50 28 fifty 28

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 40 22 40 22

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 62 35 62 35

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 50 28 fifty 28

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 71 43 71 43

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 58 35 58 35

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 94 57 94 57

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 75 45 75 Four. Five

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 132 84 132 84

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 110 70 110 70

[0299] Los tumores LNCaP crecían bien en ratones SCID, pero los ratones SCID con xenoinjertos de tumores LNCaP experimentaban una pérdida de peso grave, ya que el 80% de los ratones de control tenían más del 25% de pérdida de peso al final del estudio. No obstante, la eficacia de diferentes tratamientos a niveles aproximadamente [0299] LNCaP tumors grew well in SCID mice, but SCID mice with xenografts of LNCaP tumors experienced severe weight loss, since 80% of control mice had more than 25% weight loss at the end of study. However, the effectiveness of different treatments at approximately levels

5 equitóxicos se compararon basándose en el tiempo que llevó al 50% de los ratones alcanzar una pérdida de peso tóxica y en el número total de ratones con pérdida de peso tóxica al final del estudio. Los resultados de esta comparación se muestran en la Tabla 23. 5 equitoxes were compared based on the time it took 50% of the mice to achieve toxic weight loss and the total number of mice with toxic weight loss at the end of the study. The results of this comparison are shown in Table 23.

TABLA 23 TABLE 23

Compuesto Compound: Dosis (mg/kg) Tiempo: Pérdida de peso del 50% (Día) Tiempo: Pérdida de peso del 100% (Día) % de pérdida de peso al final del estudio Inhibición del crecimiento Dose (mg / kg) Time: 50% weight loss (Day) Time: 100% weight loss (Day) % weight loss at the end of the study Growth inhibition

Control Control: 47 80% 47 80%

Doxorrubicina Doxorubicin: 4 33 80% 29% 4 33 80% 29%

Doxorrubicina Doxorubicin: 3 36 60% 29% 3 36 60% 29%

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 62 15 33 65% 62 fifteen 33 65%

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 50 19 40 67% fifty 19 40 67%

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 40 33 54 47% 40 33 54 47%

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 62 12 33 80% 62 12 33 80%

Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox: 50 33 80% 60% fifty 33 80% 60%

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 70,5 26 47 53% 70.5 26 47 53%

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 58,3 33 61 56% 58.3 33 61 56%

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 94 19 36 80% 94 19 36 80%

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 75 26 43 73% 75 26 43 73%

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 132 29 80% 40% 132 29 80% 40%

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox: 110 33 80% 40% 110 33 80% 40%

[0300] La clasificación de estos compuestos, de más eficaz a menos eficaz es: Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. El Suc-Leu-Ala-Gly-Dox es más eficaz que la doxorrubicina y menos eficaz que el Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. Como se esperaba en vista de la incapacidad de CD10 para escindir el Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (véase el Ejemplo 2) y de la ausencia de eficacia in vivo (véase el [0300] The classification of these compounds, from most effective to least effective is: Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Suc-Leu-Ala-Gly-Dox is more effective than doxorubicin and less effective than Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. As expected in view of the inability of CD10 to cleave the Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (see Example 2) and the lack of efficacy in vivo (see

15 Ejemplo 25), el Suc-Leu-Ala-Gly-Dox no era muy activo sobre tumores LNCaP. 15 Example 25), Suc-Leu-Ala-Gly-Dox was not very active on LNCaP tumors.

Ejemplo 28: Example 28:

Estudio de farmacocinética/metabolismo Pharmacokinetic / metabolism study

5 [0301] A seis grupos de ratones hembra normales ICR se les administró una sola dosis en embolada IV con aproximadamente 100 mol/kg de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox o 10 mol/kg de doxorrubicina (Dox). Se obtuvo plasma de tres animales individuales en cada grupo a los 5 minutos, 1, 2, 4 ó 6 h. Se analizaron las concentraciones de precursor, dipeptidildoxorrubicina (Ala-Leu-Dox, Ala-Gly-Dox), -aminoacil-doxorrubicina (Leu-Dox o Gly-Dox) y doxorrubicina en 5 [0301] Six groups of normal female ICR mice were given a single dose in IV stroke with approximately 100 mol / kg of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ala-Ile-Ala -Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Leu-Dox, Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, Suc-Leu-Ala-Gly-Dox or 10 mol / kg of doxorubicin (Dox). Plasma was obtained from three individual animals in each group at 5 minutes, 1, 2, 4 or 6 h. The concentrations of precursor, dipeptidyldoxorubicin (Ala-Leu-Dox, Ala-Gly-Dox), -aminoacyl-doxorubicin (Leu-Dox or Gly-Dox) and doxorubicin were analyzed in

10 extractos de las muestras de plasma usando un método de HPLC en gradiente de fase inversa con detección de fluorescencia (ex = 480 nm, em = 560). El tiempo de permanencia máximo del Ala-Gly-Dox no se confirmó porque no había disponible un patrón. Se determinaron las cantidades usando un ajuste de curva convencional lineal a mediciones de 10 a 2000 ng/ml de soluciones de doxorrubicina en plasma de ratón. 10 extracts from the plasma samples using a reverse phase gradient HPLC method with fluorescence detection (ex = 480 nm, em = 560). The maximum residence time of the Ala-Gly-Dox was not confirmed because a pattern was not available. Quantities were determined using a conventional linear curve fit at measurements of 10 to 2000 ng / ml of doxorubicin solutions in mouse plasma.

15 [0302] Los cursos de concentración-tiempo (FIG. 26) indican que los patrones metabólicos eran similares para todos los compuestos con la excepción del Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, que no se escinde por CD10. En particular, excepto por Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, el Leu-Dox era el metabolito principal durante las primeras dos horas, mientras que el conjugado con dipeptidilo Ala-Leu-Dox era un producto más minoritario que se formaba aproximadamente al mismo tiempo que el Leu-Dox. Esto concuerda con el patrón de escisión para CD10. La doxorrubicina aparecía [0302] The concentration-time courses (FIG. 26) indicate that the metabolic patterns were similar for all compounds with the exception of Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, which is not cleaved by CD10. In particular, except for Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, Leu-Dox was the main metabolite during the first two hours, while the dipeptidyl Ala-Leu-Dox conjugate was a more minor product that formed approximately at same time as the Leu-Dox. This is consistent with the cleavage pattern for CD10. Doxorubicin appeared

20 posteriormente, disminuyendo su concentración plasmática más lentamente con el tiempo que la de los otros metabolitos, como se esperaba a partir de la farmacocinética de la doxorrubicina actual y medida anteriormente (Van der Vijgh, "Comparative metabolism and pharmacokinetics of doxorubicin and 4’-epidoxorubicin in plasma, heart and tumor of tumor bearing mice", Cancer Chem-other Pharmacol 26(1) 9-12 (1990); y Tabrizi-Fard, et al., "Evaluation of the Pharmacokinetic Properties of a Doxorubicin Prodrug in Female ICR(CD1) Mice Following Intravenous 20 subsequently, decreasing its plasma concentration more slowly over time than that of the other metabolites, as expected from the pharmacokinetics of current and previously measured doxorubicin (Van der Vijgh, "Comparative metabolism and pharmacokinetics of doxorubicin and 4'- epidoxorubicin in plasma, heart and tumor of tumor bearing mice ", Cancer Chem-other Pharmacol 26 (1) 9-12 (1990); and Tabrizi-Fard, et al.," Evaluation of the Pharmacokinetic Properties of a Doxorubicin Prodrug in Female ICR (CD1) Mice Following Intravenous

25 Administration", Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 42: 324 (2001)) y por el grupo de control con doxorrubicina. Las áreas bajo las curvas de concentración plasmática-tiempo (Tabla 24) indican que la dosificación con Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, el único conjugado con peptidilo que no se esperaba que se escindiera por CD10, daba como resultado una exposición a Dox considerablemente menor que para los cuatro compuestos de peptidilo-doxorrubicina escindibles por CD10. Entre los compuestos escindibles por CD10, los que también pueden escindirse por 25 Administration ", Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 42: 324 (2001)) and by the doxorubicin control group. The areas under the plasma concentration-time curves (Table 24) indicate that the dosage with Suc- Leu-Ala-Gly-Dox, the only peptidyl conjugate that was not expected to be cleaved by CD10, resulted in a considerably lower exposure to Dox than for the four peptidyl doxorubicin compounds cleavable by CD10. CD10, which can also be split by

30 oligopeptidasa thimet (Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Leu-Dox) producían una exposición a doxorrubicina aproximadamente dos veces mayor (AUC) que el no compuesto correspondiente con isoleucina sustituyendo a la leucina en la posición P1 (Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, respectivamente). Estos compuestos sustituidos con isoleucina se escinden muy poco o nada por TOP. La disminución de dos veces en la AUC de la exposición a Dox también se observa con tripéptidos en comparación con su homólogo tetrapeptídico 30 oligopeptidase thimet (Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Leu-Dox) produced an exposure to doxorubicin approximately two times greater (AUC) than the corresponding non-compound with isoleucine replacing leucine in position P1 (Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox, respectively). These isoleucine substituted compounds are cleaved very little or nothing by TOP. The double decrease in AUC from Dox exposure is also observed with tripeptides compared to their tetrapeptide counterpart

35 correspondiente (Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox frente a Suc-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox frente a Suc-Ile-Ala-Leu-Dox). Debería señalarse que la exposición a doxorrubicina relativa después de la dosificación de estos compuestos se parece a la seguridad relativa expresada como dosis máxima tolerada en un estudio de seguridad en ratones. Por lo tanto, se consigue un mejor perfil de exposición a doxorrubicina. 35 (Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox in front of Suc-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox in front of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox ). It should be noted that exposure to relative doxorubicin after dosing of these compounds resembles the relative safety expressed as the maximum tolerated dose in a safety study in mice. Therefore, a better exposure profile to doxorubicin is achieved.

40 TABLA 24. Exposición plasmática expresada como AUC0-6h de precursor y metabolitos peptolíticos 40 TABLE 24. Plasma exposure expressed as AUC0-6h of precursor and peptolytic metabolites

Compuesto administrado Administered compound: Precursor AL-Dox o AG-Dox* L-Dox o G-Dox* (Mh) Dox Precursor AL-Dox or AG-Dox * L-Dox or G-Dox * (Mh) Dox

Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox: 806 3,2 40 3,4 806 3.2 40 3.4

Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox: 326 0,5 8,5 1,5 326 0.5 8.5 1.5

Suc-Leu-Ala-Leu-Dox Suc-Leu-Ala-Leu-Dox: 634 1,6 5,1 1,6 634 1.6 5.1 1.6

Suc-Ile-Ala-Leu-Dox Suc-Ile-Ala-Leu-Dox: 452 1,0 6,2 0,9 452 1.0 6.2 0.9

Suc-Leu-Ala-Gly-Dox* Suc-Leu-Ala-Gly-Dox *: 310 2,1 0,9 0,3 310 2.1 0.9 0.3

Doxorrubicina (Dox) Doxorubicin (Dox): N/A N/A N/A 3,3 N / A N / A N / A 3.3

* Los productos metabólicos para Suc-Leu-Ala-Gly-Dox son Ala-Gly-Dox (identidad no confirmada por patrón), Gly-Dox y Dox. * The metabolic products for Suc-Leu-Ala-Gly-Dox are Ala-Gly-Dox (identity not confirmed by employer), Gly-Dox and Dox.

[0303] Estos resultados concuerdan con la hipótesis de que la TOP que aparece normalmente en el cuerpo es un mecanismo de activación no tumoral para compuestos particulares que también son sustratos de CD10. Para compuestos que van a activarse por CD10 relacionada con tumores puede ser preferible diseñar el oligopéptido para [0303] These results agree with the hypothesis that the TOP that normally appears in the body is a non-tumor activation mechanism for particular compounds that are also substrates of CD10. For compounds to be activated by tumor-related CD10 it may be preferable to design the oligopeptide for

45 limitar su digestión por TOP, ya que los datos indican aproximadamente dos veces menos exposición a Dox cuando el compuesto no es un sustrato de TOP. Son ejemplos de dichos compuestos Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Ile-Ala-Leu-Dox. 45 limit its digestion by TOP, since the data indicates approximately twice less exposure to Dox when the compound is not a TOP substrate. Examples of such compounds are Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Ile-Ala-Leu-Dox.

[0304] Ejemplo 29: [0304] Example 29:

Análisis de líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con CD10 Analysis of Chinese hamster ovary (CHO) cell lines transfected with CD10

5 [0305] Para proporcionar pruebas directas de que CD10 puede escindir prefármacos peptídicos, se analizaron líneas celulares transfectantes con CD10. [0305] To provide direct evidence that CD10 can cleave peptide predrugs, cell lines transfectants with CD10 were analyzed.

[0306] Se clonó el ADNc de CD10 a partir de una genoteca de ADNc fetal humano mediante PCR usando tres 10 conjuntos de cebadores solapantes: [0306] The CD10 cDNA was cloned from a human fetal cDNA library by PCR using three sets of overlapping primers:

a5HindCD10 AAGCTTGCCGCCACCATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATG a3XbaCD10 TCTAGAAGGGAGGCCAAGTCGAGGTTGGTC b5XbaCD10 TCTAGAGATTACTATGAATGCACTGGAATC b3XhoCD10 CTCGAGGTACTCATTATTCAGTTTGTTATC c5XhoCD10 CTCGAGTTGAACTACAAAGAAGATGAATAC c3PacCD10 TTAATTAATCACCAAACCCGGCACTTCTTTTC a5HindCD10 AAGCTTGCCGCCACCATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATG a3XbaCD10 TCTAGAAGGGAGGCCAAGTCGAGGTTGGTC b5XbaCD10 TCTAGAGATTACTATGAATGCACTGGAATC b3XhoCD10 CTCGAGGTACTCATTATTCAGTTTGTTATC c5XhoCD10 CTCGAGTTGAACTACAAAGAAGATGAATAC c3PacCD10 TTAATTAATCACCAAACCCGGCACTTCTTTTC

[0307] La región codificante completamente ensamblada se subclonó en un vector de expresión de mamífero, cadena abajo del promotor hCMV-MIE. El análisis de la secuencia del ADN confirmó la identidad de secuencia con [0307] The fully assembled coding region was subcloned into a mammalian expression vector, downstream of the hCMV-MIE promoter. DNA sequence analysis confirmed sequence identity with

15 la secuencia codificante de CD10 humana (número de acceso Genbank Y00811).El plásmido de expresión se linealizó y se transfectó de forma estable en células CHO-S. Se seleccionaron clones de transfectantes que expresaban CD10 en 500 g/ml de higromicina y se exploraron por citometría de flujo para determinar la expresión de CD10 en superficie celular usando un anticuerpo anti-CD10-FITC disponible en el mercado. La FIG. 29 muestra la intensidad fluorescente media geométrica (Geo MFI) de clones de células CHO transfectantes. 15 the human CD10 coding sequence (Genbank accession number Y00811). The expression plasmid was linearized and stably transfected into CHO-S cells. Clones of transfectants expressing CD10 in 500 µg / ml of hygromycin were selected and screened by flow cytometry to determine the expression of CD10 on cell surface using a commercially available anti-CD10-FITC antibody. FIG. 29 shows the geometric mean fluorescent intensity (Geo MFI) of clones of transfectant CHO cells.

20 [0308] Los clones se ensayaron posteriormente en un ensayo de proliferación con 3H-timidina en presencia de doxorrubicina (Dox), Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox o Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Las células CHO parecen ser menos sensibles a doxorrubicina ya que el valor de CI50 promedio para Dox era de 570 nM, en comparación con 130 y 10 nM para células LnCAP y Ramos, respectivamente (Tabla 25). La Tabla 26 compara la actividad de Suc-Ala-Ile[0308] The clones were subsequently tested in a 3H-thymidine proliferation assay in the presence of doxorubicin (Dox), Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox or Suc-Ala-Leu-Ala-Leu- Dox CHO cells appear to be less sensitive to doxorubicin since the average IC50 value for Dox was 570 nM, compared with 130 and 10 nM for LnCAP and Ramos cells, respectively (Table 25). Table 26 compares the activity of Suc-Ala-Ile

25 Ala-Leu-Dox con Dox. Mientras que la CI50 para Dox y Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox sobre LnCAP (CD10 positivas) difiere en un factor de 3, se observó una diferencia de 49 con células CHO parentales. Este número se redujo hasta 16 veces con células CHO transfectadas con CD10. 25 Ala-Leu-Dox with Dox. While the IC50 for Dox and Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox over LnCAP (CD10 positive) differs by a factor of 3, a difference of 49 was observed with parental CHO cells. This number was reduced to 16 times with CHO cells transfected with CD10.

TABLA 25. Ensayo de proliferación con 3H-timidina con CHO transfectadas con CD10, CHO parentales, 30 LnCAP y Ramos TABLE 25. Proliferation assay with 3H-thymidine with CHO transfected with CD10, parental CHO, 30 LnCAP and Ramos

Doxorrubicina Doxorubicin: CI50 (mM) Suc--Ala-Leu-Ala-Leu Suc--Ala-Ile-Ala-Leu IC50 (mM) Suc--Ala-Leu-Ala-Leu Suc--Ala-Ile-Ala-Leu

LnCap LnCap: 0,13 0,51 0,39 0.13 0.51 0.39

Ramos Bouquets: 0,01 0,84 0,44 0.01 0.84 0.44

CHO parentales CHO parentals: 0,51 17,00 49,00 0.51 17.00 49.00

DB4 DB4: 0,31 5,40 4,20 0.31 5.40 4.20

Clon Nº 3 Clone No. 3: 0,55 19,00 19,00 0.55 19.00 19.00

Clon Nº 5 Clone No. 5: 0,81 24,00 19,00 0.81 24.00 19.00

Clon Nº 7 Clone No. 7: 0,64 13,00 11,00 0.64 13.00 11.00

Clon Nº 8 Clone No. 8: 0,57 10,00 8,40 0.57 10.00 8.40

TABLA 26. Ensayo de proliferación con 3H-timidina con células LnCAP, CHO parentales y CHO transfectadas con CD10: comparación de SucbAIAL y Dox CI50
TABLE 26. 3H-Thymidine Proliferation Assay with Parental LnCAP, CHO and CHO Cells Transfected with CD10: Comparison of SucbAIAL and Dox IC50

CI50 (mM) Proporción Doxorrubicina Suc--Ala-Ile-Ala-Leu Suc--Ala-Ile-Ala-Leu/Dox IC50 (mM) Proportion Doxorubicin Suc--Ala-Ile-Ala-Leu Suc--Ala-Ile-Ala-Leu / Dox

LnCap LnCap: 0,13 0,39 3 0.13 0.39 3

CHO parentales CHO parentals: 0,51 49,00 96 0.51 49.00 96

Clon Nº 7 Clone No. 7: 0,64 11,00 17 0.64 11.00 17

DB4 DB4: 0,31 4,20 14 0.31 4.20 14

Clon Nº 8 Clone No. 8: 0,57 8,40 15 0.57 8.40 fifteen

[0309] Para preguntarse directamente la cuestión de si las células que expresan CD10 son capaces de escindir el profármaco, se recogieron sobrenadantes de células CHO parentales o transfectadas con CD10 tratadas con los compuestos. Se incubaron CHO parentales y transfectadas con CD10 (clon 8) a 37 ºC con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu5 Dox 10 M (un sustrato para CD10) o Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, que no es un sustrato para CD10. Después de la incubación durante 1, 4 y 24 horas, se transfirió una alícuota de cada sobrenadante a una placa de 96 pocillos y se congeló a -20 ºC. Las muestras se descongelaron posteriormente y se analizaron mediante HPLC de fase inversa (columna TSK Super-ODS de 4,6 x 50 mm 2 m) con detección de fluorescencia después de la dilución con 3 volúmenes de acetonitrilo, eliminación del precipitado por centrifugación y dilución adicional en 3 volúmenes de 10 agua. Cuando se incubó con Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, no se observó ningún metabolismo detectable a Leu-Dox con la línea celular parental, mientras que el clon 8 (transfectado con CD10) generaba niveles significativos de Leu-Dox a partir de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (Tabla 27). Las células CHO transfectadas con CD10 no proporcionaban velocidades de escisión de Suc-Leu-Ala-Gly-Dox significativamente aumentadas en comparación con células CHO no transfectadas, lo que concuerda con la sugerencia de que este profármaco peptídico es un mal sustrato para [0309] To directly ask the question of whether cells expressing CD10 are capable of cleaving the prodrug, supernatants were collected from parental CHO cells or transfected with CD10 treated with the compounds. Parental CHOs transfected with CD10 (clone 8) at 37 ° C with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu5 Dox 10 M (a substrate for CD10) or Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, which is not a substrate for CD10. After incubation for 1, 4 and 24 hours, an aliquot of each supernatant was transferred to a 96-well plate and frozen at -20 ° C. The samples were subsequently thawed and analyzed by reverse phase HPLC (TSK Super-ODS column 4.6 x 50 mm 2 µm) with fluorescence detection after dilution with 3 volumes of acetonitrile, removal of the precipitate by centrifugation and additional dilution in 3 volumes of 10 water. When incubated with Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox, no detectable metabolism to Leu-Dox was observed with the parental cell line, while clone 8 (transfected with CD10) generated significant levels of Leu-Dox from Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (Table 27). CHO cells transfected with CD10 did not provide significantly increased Suc-Leu-Ala-Gly-Dox cleavage rates compared to untransfected CHO cells, which is consistent with the suggestion that this peptide prodrug is a poor substrate for

15 CD10. 15 CD10.

Tabla 27. Velocidades de conversión a Leu-Dox o Gly-Dox Table 27. Conversion rates to Leu-Dox or Gly-Dox

Sustrato Substratum: Suc-Ala-Leu-Ala-Leu Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox Suc-Ala-Leu-Ala-Leu Dox Suc-Leu-Ala-Gly-Dox

Parentales Parental: Clon 8 Parentales Clon 8 Clone 8 Parental Clone 8

Porcentaje conversión/hora Conversion Rate / Hour: 0 3,00 0,57 0,61 0 3.00 0.57 0.61

mM/hora mM / hour: 0 0,30 0,06 0,06 0 0.30 0.06 0.06

[0310] Para confirmar que las células CHO que expresan CD 10 eran capaces de escindir Suc-Ala-Ile-Ala-Leu[0310] To confirm that CHO cells expressing CD 10 were able to cleave Suc-Ala-Ile-Ala-Leu

20 Dox, se recogieron sobrenadantes 24 horas después de la exposición a cada uno de los compuestos siguientes: Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Gly-Dox. Los sobrenadantes se transfirieron a células HL60 sensibles a Dox (CD10 negativas) y se midió la proliferación celular 24 horas después. Los datos de proliferación con 3Htimidina muestran que mientras que los sobrenadantes de células CHO parentales o células CHO negativas para CD10 no inhibían la proliferación en presencia de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, dos células CHO positivas para CD10 20 Dox, supernatants were collected 24 hours after exposure to each of the following compounds: Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Gly-Dox. Supernatants were transferred to Dox-sensitive HL60 cells (CD10 negative) and cell proliferation was measured 24 hours later. Proliferation data with 3Htimidine show that while the supernatants of parental CHO cells or CHO cells negative for CD10 did not inhibit proliferation in the presence of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox, two CHO cells positive for CD10

25 representativas sí lo hacían (Tabla 28). Como control adicional, se añadió Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Gly-Dox recién preparados a HL60 y se realizaron mediciones de la CI50 24 horas después. Cuando los compuestos se añaden recién preparados a células HL60 (CD10 negativas), la escisión de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox no se produce, indicando de nuevo que CD10 es necesaria para la escisión. La confirmación de los datos se muestra cuando el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se comparó con Suc-Leu-Ala-Gly-Dox y los resultados concuerdan 25 representatives did (Table 28). As an additional control, freshly prepared Dox, Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Gly-Dox were added to HL60 and IC50 measurements were made 24 hours later. When freshly prepared compounds are added to HL60 cells (negative CD10), the excision of Suc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox does not occur, again indicating that CD10 is necessary for cleavage. The confirmation of the data is shown when the Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was compared with Suc-Leu-Ala-Gly-Dox and the results agree

30 con el hecho de que Suc-Ala-Leu-Ala-Leu se escinde por células transfectadas con CD10 y no por las líneas celulares parentales. [0311] 30 with the fact that Suc-Ala-Leu-Ala-Leu is cleaved by cells transfected with CD10 and not by parental cell lines. [0311]

TABLA 28. Proliferación de células HL60 en presencia de sobrenadante recogido de células CHO parentales 35 y células CHO positivas para CD10 tratadas con compuestos TABLE 28. Proliferation of HL60 cells in the presence of supernatant collected from parental CHO 35 cells and CHO positive cells for CD10 treated with compounds

CI50 (M) Dox Suc-Ala-IIe-Ala-Leu Leu-Ala-Gly-Dox IC50 (M) Dox Suc-Ala-IIe-Ala-Leu Leu-Ala-Gly-Dox

CHO parentales CHO parentals: 0,279 >25 >25 0.299 > 25 > 25

Clon 10 (CD10 neg.) Clone 10 (CD10 neg.): 0,417 >25 >25 0.417 > 25 > 25

Clon DB4 (CD10 pos.) Clone DB4 (CD10 pos.): 0,491 5,4 >25 0.491 5.4 > 25

Dox Dox: CI50 (M) Suc-Ala-IIe-Ala-Leu Leu-Ala-Gly-Dox IC50 (M) Suc-Ala-IIe-Ala-Leu Leu-Ala-Gly-Dox

Clon 8 (CD10 pos.) Clone 8 (CD10 pos.): 0,488 2,7 >25 0.488 2.7 > 25

HL60 con compuesto recién preparado HL60 with freshly prepared compound: 0,164 >50 >50 0.164 > 50 > 50

[0312] En resumen, los datos muestran que CD10 puede escindir el profármaco Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox o SucAla-Ile-Ala-Leu-Dox para liberar Leu-Dox. [0312] In summary, the data shows that CD10 can cleave the prodrug Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox or SucAla-Ile-Ala-Leu-Dox to release Leu-Dox.

5 Ejemplo 30: 5 Example 30:

Comparación de la inhibición del crecimiento tumoral por Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y doxorrubicina en el modelo de carcinoma de próstata LNCaP sensible a doxorrubicina Comparison of tumor growth inhibition by Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and doxorubicin in the doxorubicin-sensitive LNCaP prostate carcinoma model

10 [0313] Se realizó una comparación de la eficacia relativa de la inhibición tumoral de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox frente a la doxorrubicina en una línea celular tumoral positiva para CD10 (LNCaP) para establecer una respuesta a la dosis y un índice terapéutico comparables. [0313] A comparison was made of the relative efficacy of tumor inhibition of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox against doxorubicin in a tumor cell line positive for CD10 (LNCaP) to establish a response to comparable dose and therapeutic index.

[0314] En este modelo, 7,5 millones de células LNCaP resuspendidas en 0,1 ml de solución salina tamponada con [0314] In this model, 7.5 million LNCaP cells resuspended in 0.1 ml of saline buffered with

15 fosfato y 0,1 ml de Matrigel (Becton Dickinson) se inyectaron en el lateral de ratones atímicos macho alimentados con dieta de alto contenido en grasa. La dosificación se inició cuando el peso tumoral medio alcanzó aproximadamente 200 mg y los regimenes de dosificación se resumen en la Tabla 29. 15 phosphate and 0.1 ml of Matrigel (Becton Dickinson) were injected into the side of male nude mice fed a high-fat diet. Dosing was initiated when the average tumor weight reached approximately 200 mg and the dosage regimens are summarized in Table 29.

Eficacia Effectiveness

20 [0315] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox a los tres niveles de dosis (equivalentes molares de 18, 22 y 28 mg de doxorrubicina/kg) inhibía significativamente el crecimiento de tumores a Día 22, el último día de medición en el que estaban vivos todos los ratones (FIG. 30 y Tabla 29). No se observó ninguna tendencia de aumento de la eficacia de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox relacionado con la dosis, ya que la eficacia era máxima mediante el equivalente a 18 [0315] Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox at the three dose levels (molar equivalents of 18, 22 and 28 mg of doxorubicin / kg) significantly inhibited tumor growth at Day 22, the last measurement day on which all mice were alive (FIG. 30 and Table 29). No tendency to increase the efficacy of dose-related Suc-uAla-Leu-Ala-Leu-Dox was observed, since the efficacy was maximum by the equivalent of 18

25 mg/kg de Dox (FIG. 30). Además, las tres dosis de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox inhibían significativamente el crecimiento de tumores en mayor medida que la doxorrubicina administrada a 4 mg/kg. La doxorrubicina a esta dosificación no consiguió una significación estadística desde el control (Tabla 29). Ningún tumor alcanzó el punto final del cáncer predeterminado de >1 g en los tres grupos de dosis de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (FIG. 31). Por lo tanto, el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, pero no la doxorrubicina, prolongaba significativamente la supervivencia a 25 mg / kg Dox (FIG. 30). In addition, the three doses of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu-Dox significantly inhibited tumor growth to a greater extent than doxorubicin administered at 4 mg / kg. Doxorubicin at this dosage did not achieve statistical significance from the control (Table 29). No tumor reached the predetermined cancer endpoint of> 1 g in the three dose groups of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (FIG. 31). Therefore, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, but not doxorubicin, significantly prolonged survival at

30 ratones que llevaban tumores en comparación con el grupo de control (Tabla 29). 30 mice that carried tumors compared to the control group (Table 29).

Toxicidad Toxicity

[0316] Además, las tres dosis de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se toleraban muy bien sin puntos finales tóxicos [0316] In addition, the three doses of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox were tolerated very well without toxic endpoints

35 cuando se terminó el estudio a Día 36, y con una pérdida máxima del 3% de peso corporal ajustado a la media de grupo (restado el peso del tumor) (FIG. 32). Los ratones que recibieron 4 mg/kg de doxorrubicina tenían un punto final tóxico (pérdida de peso >20%) el Día 22 y una pérdida de aproximadamente el 7% de peso corporal ajustado a la media de grupo el Día 22. Los ratones del grupo de control también tenían una pérdida de peso ligera (pérdida de hasta el 5% de peso corporal ajustado a la media de grupo) y dos puntos finales tóxicos que podían ser el resultado 35 when the study was finished on Day 36, and with a maximum loss of 3% of body weight adjusted to the group average (subtracted from the tumor weight) (FIG. 32). Mice that received 4 mg / kg of doxorubicin had a toxic endpoint (weight loss> 20%) on Day 22 and a loss of approximately 7% of body weight adjusted to the group average on Day 22. The mice Control group also had a slight weight loss (loss of up to 5% of body weight adjusted to the group average) and two toxic endpoints that could be the result

40 del crecimiento del tumor (Tabla 29). 40 tumor growth (Table 29).

Tabla 29. Inhibición del crecimiento tumoral e índices de supervivencia en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de próstata LNCaP Table 29. Tumor growth inhibition and survival rates in the LNCaP prostate carcinoma xenograft model

Grupo Group: Compuesto Dosis# (mg/kg) N Peso tumoral (mg) TGI Supervivencia Punto final del cáncer Punto final tóxico Compound Dose # (mg / kg) N Tumor Weight (mg) TGI Survival End point of cancer Toxic end point

A TO: Solución salina - 8 D22: 677,4  185,2 - D36: 2 4 2 Saline solution - 8 D22: 677.4  185.2 - D36: 2 4 2

C C: Doxorrubicina 4 8 D22: 323,8  60,8 D22: 52,2  28,8% D36: 3 4 1 Doxorubicin 4 8 D22: 323.8  60.8 D22: 52.2  28.8% D36: 3 4 one

D D: Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 50 (equiv. a 28*Dox) 8 D22: 143,4  19,0 D22: 78,8  27,5%* D36: 8** 0 0 Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 50 (equiv. To 28 * Dox) 8 D22: 143.4  19.0 D22: 78.8  27.5% * D36: 8 ** 0 0

E AND: Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. a 22*Dox) 8 D22: 180,1  19,7 D22: 73,4  27,5%* D36: 8** 0 0 Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. To 22 * Dox) 8 D22: 180.1  19.7 D22: 73.4  27.5% * D36: 8 ** 0 0

F F: Suc-Ala-Leu-Ala Leu-Dox 32 (equiv. a 18*Dox) 8 D22: 116,3  30,2 D22: 82,8  27,7%* D36: 8** 0 0 Suc-Ala-Leu-Ala Leu-Dox 32 (equiv. To 18 * Dox) 8 D22: 116.3  30.2 D22: 82.8  27.7% * D36: 8 ** 0 0

#: Todos los compuestos se administraron Q7Dx3 Estadísticamente diferente del grupo de control y del grupo con doxorrubicina (*: p < 0,05; **: p < 0,01) #: All compounds were administered Q7Dx3 Statistically different from the control group and the doxorubicin group (*: p <0.05; **: p <0.01)

Los parámetros evaluados incluyen (1) peso tumoral medio a Día 22, el último punto temporal antes de que el primer ratón alcance el punto final del cáncer y/o tóxico; (2) TGI (inhibición del crecimiento tumoral a Día 22, porcentaje de inhibición del peso tumoral medio sobre el control); (3) supervivientes a Día 36, (4) tumores que alcanzan el tamaño The parameters evaluated include (1) average tumor weight at Day 22, the last time point before the first mouse reaches the endpoint of the cancer and / or toxic; (2) TGI (inhibition of tumor growth on Day 22, percentage of inhibition of mean tumor weight over control); (3) survivors on Day 36, (4) tumors that reach size

5 límite predeterminado de 1000 mg (punto final del cáncer) y (5) tolerabilidad del régimen de dosificación, por número de ratones que muestran un punto final tóxico (pérdida de peso corporal >20%). 5 predetermined limit of 1000 mg (cancer endpoint) and (5) tolerability of the dosing regimen, by number of mice showing a toxic endpoint (body weight loss> 20%).

[0317] En resumen, en este modelo de LNCaP sensible a doxorrubicina de crecimiento lento, las tres dosis de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox inhibían significativamente el crecimiento tumoral, prolongaban la supervivencia de los 10 ratones y se toleraban muy bien (FIG. 30-32). El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox es significativamente mejor que dosis aproximadamente equitóxicas de doxorrubicina en la inhibición del crecimiento de un tumor de próstata relativamente sensible a doxorrubicina de crecimiento lento. La doxorrubicina administrada a aproximadamente su dosis máxima tolerada (uno de ocho ratones perdieron peso y alcanzaron el punto final tóxico el Día 22) era eficaz sobre el tumor pero no consiguió una significación estadística desde el control en la inhibición del crecimiento [0317] In summary, in this slow-growing doxorubicin-sensitive LNCaP model, the three doses of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox significantly inhibited tumor growth, prolonged the survival of the 10 mice and tolerated very good (FIG. 30-32). Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox is significantly better than approximately equitox doses of doxorubicin in inhibiting the growth of a prostate tumor relatively sensitive to slow-growing doxorubicin. Doxorubicin administered at approximately its maximum tolerated dose (one of eight mice lost weight and reached the toxic endpoint on Day 22) was effective on the tumor but did not achieve statistical significance from control in growth inhibition.

15 tumoral o la prolongación de la supervivencia. Por lo tanto, el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox a los tres niveles inhibía significativamente el crecimiento de tumores LNCaP mejor que la doxorrubicina, y se identificó una ventana terapéutica relativamente amplia para Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox en el modelo de tumor de próstata humano LNCaP. Además, debido a su sensibilidad a la doxorrubicina, el modelo descrito en este ejemplo sirve como buen indicador de la liberación de doxorrubicina del resto de la molécula de profármaco. 15 tumor or prolongation of survival. Therefore, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox at all three levels significantly inhibited the growth of LNCaP tumors better than doxorubicin, and a relatively wide therapeutic window for Suc-Ala-Leu-Ala was identified. -Leu-Dox in the LNCaP human prostate tumor model. In addition, due to its sensitivity to doxorubicin, the model described in this example serves as a good indicator of the release of doxorubicin from the rest of the prodrug molecule.

20 twenty

Ejemplo 31: Example 31:

Comparación de la inhibición del crecimiento tumoral por Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y tripéptidos Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox y Suc-Leu-Ala-Gly-Dox en el modelo de carcinoma de próstata LNCaP sensible a Comparison of tumor growth inhibition by Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and tripeptides Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Gly-Dox in the carcinoma model of LNCaP prostate sensitive to

25 doxorrubicina 25 doxorubicin

[0318] Para evaluar adicionalmente los papeles in vivo de la CD10 extracelular frente a TOP (oligopeptidasa thimet) en la escisión de un compuesto de profármaco activado por tumor, se ensayaron compuestos de profármaco que contenían doxorrubicina con perfiles de escisión distintos para CD10 en xenoinjertos de LNCaP CD10positivos que [0318] To further assess the in vivo roles of extracellular CD10 versus TOP (oligopeptidase thimet) in the excision of a tumor-activated prodrug compound, prodrug compounds containing doxorubicin with different cleavage profiles for CD10 in xenografts were tested of LNCaP CD10 devices that

30 crecían en ratones atímicos. 30 grew in nude mice.

[0319] El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, un sustrato para tanto TOP como CD10, y el Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, un sustrato para CD10, pero un sustrato más débil para TOP, se administraron de forma equimolar al equivalente a 22 mg/kg de Dox Q7Dx3. El Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, un sustrato para TOP solamente, aunque un sustrato 35 comparativamente más débil que el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, se administró al equivalente a 70 mg/kg de Dox Q7Dx3 (un nivel que es tres veces superior a la dosificación de concentración molar de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox). El Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y el Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox inhibían enormemente el crecimiento tumoral (FIG. 33) y conseguían una TGI superior al 70% (inhibición del crecimiento tumoral) el Día 22 en comparación con el grupo de control (Tabla 30), un aumento estadísticamente significativo de la inhibición. El Suc40 Leu-Ala-Gly-Dox administrado a tres veces la concentración molar de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, inhibía el crecimiento tumoral en menor medida que el Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (TGI D22: 39,7  29,5% frente a 77,5  27,5%) y no conseguía una significación estadística desde el control (Tabla 30). Además, ningún tumor alcanzó el punto final del cáncer predeterminado de >1 g en ninguno de los grupos con el Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y el Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (FIG. 34). Los tres compuestos se toleraban muy bien sin puntos finales tóxicos cuando se terminó [0319] The Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, a substrate for both TOP and CD10, and the Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, a substrate for CD10, but a weaker substrate for TOP, they were administered equimolarly to the equivalent of 22 mg / kg of Dox Q7Dx3. Suc-Leu-Ala-Gly-Dox, a substrate for TOP only, although a comparatively weaker substrate than Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, was administered at the equivalent of 70 mg / kg of Dox Q7Dx3 (a level that is three times higher than the molar concentration dosage of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox). Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Ala-lle-Ala-Leu-Dox greatly inhibited tumor growth (FIG. 33) and achieved a TGI greater than 70% (tumor growth inhibition ) on Day 22 compared to the control group (Table 30), a statistically significant increase in inhibition. Suc40 Leu-Ala-Gly-Dox administered three times the molar concentration of Suc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox, inhibited tumor growth to a lesser extent than Suc-Ala-Ile-Ala-Leu- Dox (TGI D22: 39.7  29.5% versus 77.5  27.5%) and did not achieve statistical significance from the control (Table 30). In addition, no tumor reached the predetermined cancer endpoint of> 1 g in any of the groups with Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Leu-Ala-Gly-Dox (FIG. 34) . The three compounds tolerated very well without toxic endpoints when finished

45 el estudio a Día 36 (FIG. 35). 45 the study on Day 36 (FIG. 35).

Tabla 30. Inhibición del crecimiento tumoral e índices de supervivencia en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de próstata LNCaP Table 30. Tumor growth inhibition and survival rates in the LNCaP prostate carcinoma xenograft model

E AND: Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. a 22* Dox ) 8 D22: 180,1  19,7 D22: 73,4  27,5%* D36: 8** 0 0 Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. To 22 * Dox) 8 D22: 180.1  19.7 D22: 73.4  27.5% * D36: 8 ** 0 0

G G: Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. a 22* Dox) 8 D22: 152,1  19,3 D22: 77,5  27,5%* D36: 8** 0 0 Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox 40 (equiv. To 22 * Dox) 8 D22: 152.1  19.3 D22: 77.5  27.5% * D36: 8 ** 0 0

J J: Suc-Leu-Ala-Gly-Dox 110 (equiv. a 70* Dox) 8 D22: 408,8,1  75,7 D22: 39,7  29,5% D36: 6* 2 0 Suc-Leu-Ala-Gly-Dox 110 (equiv. To 70 * Dox) 8 D22: 408.8.1  75.7 D22: 39.7  29.5% D36: 6 * 2 0

#: Todos los compuestos se administraron Q7Dx3 Estadísticamente diferente del control y del grupo con doxorrubicina (*: p < 0,05; **: p < 0,01) #: All compounds were administered Q7Dx3 Statistically different from the control and the doxorubicin group (*: p <0.05; **: p <0.01)

5 Los parámetros evaluados incluyen (1) peso tumoral medio a Día 22, el último punto temporal antes de que el primer ratón alcance el punto final del cáncer y/o tóxico; (2) TGI (inhibición del crecimiento tumoral a Día 22, porcentaje de inhibición del peso tumoral medio sobre el control); (3) supervivientes a Día 36, (4) tumores que alcanzan el tamaño límite predeterminado de 1000 mg (punto final del cáncer) y (5) tolerabilidad del régimen de dosificación, por número 5 The parameters evaluated include (1) average tumor weight at Day 22, the last time point before the first mouse reaches the endpoint of the cancer and / or toxic; (2) TGI (inhibition of tumor growth on Day 22, percentage of inhibition of mean tumor weight over control); (3) survivors at Day 36, (4) tumors that reach the predetermined limit size of 1000 mg (endpoint of cancer) and (5) tolerability of the dosage regimen, by number

10 de ratones que muestran un punto final tóxico (pérdida de peso corporal >20%). 10 of mice that show a toxic endpoint (body weight loss> 20%).

[0320] La diferenciación de respuesta de eficacia a la dosis de Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox frente a Suc-Leu-Ala-Gly-Dox confirma claramente el papel crítico in vivo de CD10 en la escisión de compuestos de profármaco activados por tumores en tumores LNCaP CD10+. El que Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox y Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox tengan una [0320] The differentiation of dose efficacy response of Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox versus Suc-Leu-Ala-Gly-Dox clearly confirms the critical role in vivo of CD10 in compound cleavage of tumor-activated prodrugs in CD10 + LNCaP tumors. That Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox and Suc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox have a

15 eficacia similar sobre xenoinjertos de LNCaP sugiere que CD10 desempeña un papel más dominante que TOP en la escisión de compuestos de profármaco activados por tumores en tumores LNCaP CD10+. 15 similar efficacy on LNCaP xenografts suggests that CD10 plays a more dominant role than TOP in the excision of tumor-activated prodrug compounds in CD10 + LNCaP tumors.

Métodos analíticos para los ejemplos restantes Analytical methods for the remaining examples

20 [0321] Las secuencias peptídicas, sintetizadas usando estrategias de fase sólida o de solución, se usaron sin una purificación adicional si la HPLC analítica (métodos A, B y D) mostraba que el producto bruto tenía una pureza superior al 80%. Si el producto bruto no tenía una pureza superior al 80%, el producto se purificó adicionalmente usando el método C de HPLC preparativa. [0321] The peptide sequences, synthesized using solid phase or solution strategies, were used without further purification if the analytical HPLC (methods A, B and D) showed that the crude product had a purity greater than 80%. If the crude product was not more than 80% pure, the product was further purified using preparative HPLC method C.

25 Método A de HPLC 25 HPLC Method A

[0322] Se realizaron análisis de HPLC analítica en un Waters 2690 usando una columna C-18 (4 m, 3,9 x 150 mm DI, caudal 1 ml/min) que se eluía con un gradiente de disolvente A (TFA al 0,1%/H2O) y disolvente B (TFA al 0,1%/ACN), y los datos se procesaron a  254 nm usando el sistema Waters Millennium. El gradiente de HPLC [0322] Analytical HPLC analyzes were performed on a Waters 2690 using a C-18 column (4 µm, 3.9 x 150 mm ID, flow rate 1 ml / min) eluted with a solvent gradient A (TFA at 0.1% / H2O) and solvent B (0.1% TFA / ACN), and the data was processed at  254 nm using the Waters Millennium system. HPLC gradient

30 analítica comenzaba con el 90% de disolvente A y terminaba con el 100% de disolvente B durante un periodo de 14 minutos (lineal). La pureza de los compuestos para este método y los siguientes se evaluó como el porcentaje relativo del área bajo la curva de los picos. The analytical process started with 90% of solvent A and ended with 100% of solvent B for a period of 14 minutes (linear). The purity of the compounds for this method and the following were evaluated as the relative percentage of the area under the curve of the peaks.

Método B de HPLC HPLC method B

35 [0323] Se realizaron análisis de HPLC analítica en un Waters 2690 usando una columna C-8 (3,5 m, 4,6 x 150 mm DI, caudal 1 ml/min) que se eluía con un gradiente de disolvente A (formiato de amonio 20 mM al 80% y acetonitrilo al 20%) y disolvente B (formiato de amonio 20 mM al 20% y acetonitrilo al 80%), y los datos se procesaron a  254 nm usando el sistema Waters Millennium. El gradiente de HPLC analítica comenzaba con el [0323] Analytical HPLC analyzes were performed on a Waters 2690 using a C-8 column (3.5 µm, 4.6 x 150 mm ID, flow rate 1 ml / min) eluted with a solvent gradient A (80% 20 mM ammonium formate and 20% acetonitrile) and solvent B (20% 20 mM ammonium formate and 80% acetonitrile), and the data was processed at  254 nm using the Waters Millennium system. The analytical HPLC gradient began with the

40 100% de disolvente A al 100% de disolvente B durante un periodo de 30 minutos (lineal). 100 100% solvent A 100% solvent B for a period of 30 minutes (linear).

Método C de HPLC HPLC method C

[0324] Se consiguió la purificación preparativa de productos brutos usando un sistema Waters Delta Prep 4000 [0324] Preparative purification of raw products was achieved using a Waters Delta Prep 4000 system

45 usando una columna C-4 (15 m, 40 x 100 mm DI, caudal 30 ml/min) que se eluía con un gradiente de disolvente A (H2O) y disolvente B (MeOH). El gradiente de HPLC preparatoria comenzaba con el 80% de disolvente A y va hasta el 100% de disolvente B durante un periodo de 70 minutos (lineal). La detección con UV era a  254 nm. Using a C-4 column (15 µm, 40 x 100 mm ID, flow rate 30 ml / min) eluted with a gradient of solvent A (H2O) and solvent B (MeOH). The preparatory HPLC gradient started with 80% of solvent A and goes up to 100% of solvent B over a period of 70 minutes (linear). UV detection was at  254 nm.

Método D de HPLC HPLC Method D

[0325] Se efectuó una HPLC analítica en un instrumento Hewlett Packard usando una columna TSK superODS (Toso-Haas); disolvente A (TFA al 0,1% en agua); disolvente B (TFA al 0,1% en acetonitrilo); gradiente: del 30 al 36% de B en 2 minutos, del 36 al 41% de B en 10 minutos, del 41 al 90% de B en 3 minutos, 5 minutos al 90% de B, detección a longitud de onda  254 nm. [0325] An analytical HPLC was performed on a Hewlett Packard instrument using a TSK superODS column (Toso-Haas); solvent A (0.1% TFA in water); solvent B (0.1% TFA in acetonitrile); gradient: from 30 to 36% of B in 2 minutes, from 36 to 41% of B in 10 minutes, from 41 to 90% of B in 3 minutes, 5 minutes to 90% of B, wavelength detection  254 nm.

NMR yMS NMR and MS

[0326] Se realizaron determinaciones estructurales adicionales mediante técnicas de NMR y MS y los resultados confirmaron los compuestos reivindicados. [0326] Additional structural determinations were performed by NMR and MS techniques and the results confirmed the claimed compounds.

Método de TLC TLC method

[0327] Se llevó a cabo un análisis de TLC en placas 60F-254 nm-0,25 mm de gel de sílice (Merck) con DCM/MeOH/H2O/Ácido fórmico al 88% 85/15/1/2 para su elución. [0327] A TLC analysis was performed on 60F-254 nm-0.25 mm plates of silica gel (Merck) with DCM / MeOH / H2O / 88% formic acid 85/15/1/2 for elution

Test de ninhidrina Ninhydrin test

[0328] Se introdujeron unos pocos miligramos de producto en un tubo de ensayo y se añadieron dos gotas de Solución A (ninhidrina 50 mg/ml en etanol), dos gotas de Solución B (4 mg/ml de fenol en etanol), después dos gotas de Solución C (2 ml de KSCN 0,01 M, acuoso en 100 ml de piridina). La mezcla se dejó en un baño de agua en ebullición durante cinco minutos. En presencia de una amina libre la solución se vuelve morada. [0328] A few milligrams of product were introduced into a test tube and two drops of Solution A (50 mg / ml ninhydrin in ethanol), two drops of Solution B (4 mg / ml of phenol in ethanol) were added, then two drops of Solution C (2 ml of 0.01 M KSCN, aqueous in 100 ml of pyridine). The mixture was left in a boiling water bath for five minutes. In the presence of a free amine the solution turns purple.

Ejemplos de síntesis de oligopéptidos específicos Examples of synthesis of specific oligopeptides

Fuentes de reactivos disponibles en el mercado Reagent sources available in the market

[0329] La doxorrubicina y la daunorrubicina se suministraron por Meiji (Japón), el Pd(PPh3)4 por Strem chem (Newburyport, MA), PEG por Shearwater (Huntsville, Alabama), disolventes, HATU por Aldrich (Milwaukee, WI); todas las resinas y aminoácidos se suministraron por ABI (Foster City, CA), Novabiochem (San Diego, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Peptide International (Louisville, KY) o SynPep (Dublin, CA). [0329] Doxorubicin and daunorubicin were supplied by Meiji (Japan), Pd (PPh3) 4 by Strem chem (Newburyport, MA), PEG by Shearwater (Huntsville, Alabama), solvents, HATU by Aldrich (Milwaukee, WI) ; All resins and amino acids were supplied by ABI (Foster City, CA), Novabiochem (San Diego, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Peptide International (Louisville, KY) or SynPep (Dublin, CA).

Ejemplo 32: Example 32:

Síntesis de Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH Synthesis of Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH

[0330] Se sintetizó un tripéptido (Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH) usando la estrategia en fase sólida con química de Fmoc convencional. Una síntesis típica usaba resina alcoxi de Wang (carga 0,60 mmol/g). Se usaron aminoácidos protegidos con Fmoc para la síntesis peptídica en fase sólida. [0330] A tripeptide (Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH) was synthesized using the solid phase strategy with conventional Fmoc chemistry. A typical synthesis used Wang alkoxy resin (loading 0.60 mmol / g). Fmoc protected amino acids were used for solid phase peptide synthesis.

[0331] Para una escala de péptido 1 mM en resina, se preactivaron 3 equivalentes de aminoácidos con HBTU como agente activante durante 5 minutos antes de añadirse a la resina junto con 2 equivalentes de DIEA. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo durante 2 h y después se lavó con DMF (25 ml x 3) y DCM (25 ml x 3). La reacción de acoplamiento se repitió usando 2 equivalentes de aminoácidos usando condiciones similares. El desarrollo de la reacción se controló usando ensayo de ninhidrina y si el ensayo de ninhidrina indicaba una reacción incompleta después de 2 h, entonces se repetía la etapa de acoplamiento una tercera vez. La desprotección se efectuó usando piperidina al 20% en DMF durante 15-20 minutos. La etapa de acoplamiento se repitió con el siguiente aminoácido hasta que se ensambló el péptido deseado en la resina. La escisión final del péptido de la resina se efectuó por tratamiento de la resina con una solución de TFA al 95% y agua al 5%. Después de agitar la mezcla de reacción durante 2 h a temperatura ambiente, la resina se filtró a presión reducida y se lavó dos veces con TFA. Los filtrados se combinaron y el péptido se precipitó por adición de 400 ml de éter frío. El péptido se filtró a presión reducida y se secó para dar Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH (pureza por HPLC del 92% por el método A). El péptido bruto se caracterizó mediante LC/MS y se usó para la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. [0331] For a 1 mM resin peptide scale, 3 equivalents of amino acids were preactivated with HBTU as the activating agent for 5 minutes before being added to the resin together with 2 equivalents of DIEA. The coupling reaction was carried out for 2 h and then washed with DMF (25 ml x 3) and DCM (25 ml x 3). The coupling reaction was repeated using 2 equivalents of amino acids using similar conditions. The reaction development was monitored using ninhydrin test and if the ninhydrin test indicated an incomplete reaction after 2 h, then the coupling step was repeated a third time. Deprotection was performed using 20% piperidine in DMF for 15-20 minutes. The coupling step was repeated with the following amino acid until the desired peptide was assembled into the resin. The final cleavage of the resin peptide was carried out by treating the resin with a solution of 95% TFA and 5% water. After stirring the reaction mixture for 2 h at room temperature, the resin was filtered under reduced pressure and washed twice with TFA. The filtrates were combined and the peptide was precipitated by the addition of 400 ml of cold ether. The peptide was filtered under reduced pressure and dried to give Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH (HPLC purity of 92% by method A). The crude peptide was characterized by LC / MS and was used for the next step without further purification.

Ejemplo 33: Example 33:

Síntesis de Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH Synthesis of Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH

[0332] Se sintetizó un tetrapéptido (Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH) usando la estrategia en fase sólida con química de Fmoc convencional. Una síntesis típica usaba resina alcoxi de Wang (carga 0,60 mmol/g). Se usaron aminoácidos protegidos con Fmoc para la síntesis peptídica en fase sólida. Para una escala de péptido 1 mM en resina, se preactivaron 3 equivalentes de aminoácidos con HBTU como agente activante durante 5 minutos antes de añadirse a la resina junto con 2 equivalentes de DIEA. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo durante 2 h y después se lavó con DMF (25 ml x 3) y DCM (25 ml x 3). La reacción de acoplamiento se repitió usando 2 equivalentes de aminoácidos usando condiciones similares. El desarrollo de la reacción se controló usando un ensayo de ninhidrina y, si el ensayo de ninhidrina indicaba una reacción incompleta después de 2 h, entonces se repetía la etapa de acoplamiento una tercera vez. La desprotección se efectuó usando piperidina al 20% en DMF durante 15-20 minutos. La etapa de acoplamiento se repitió con el aminoácido siguiente hasta que se ensambló el péptido deseado en la resina. La escisión final del péptido de la resina se efectuó por tratamiento de la resina con una solución de TFA al 95% y agua al 5%. Después de agitar la mezcla de reacción durante 2 h a temperatura ambiente, la resina se filtró a presión reducida y se lavó dos veces con TFA. Los filtrados se combinaron y el péptido se precipitó por adición de 400 ml de éter frío. El péptido se filtró a presión reducida y se secó para dar Fmoc-Ile-AlaLeu-OH (pureza por HPLC del 92% por el método A). El péptido bruto se caracterizó por MS y se usó para la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. [0332] A tetrapeptide (Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH) was synthesized using the solid phase strategy with conventional Fmoc chemistry. A typical synthesis used Wang alkoxy resin (loading 0.60 mmol / g). Fmoc protected amino acids were used for solid phase peptide synthesis. For a 1 mM resin peptide scale, 3 equivalents of amino acids were preactivated with HBTU as the activating agent for 5 minutes before being added to the resin together with 2 equivalents of DIEA. The coupling reaction was carried out for 2 h and then washed with DMF (25 ml x 3) and DCM (25 ml x 3). The coupling reaction was repeated using 2 equivalents of amino acids using similar conditions. The development of the reaction was monitored using a ninhydrin test and, if the ninhydrin test indicated an incomplete reaction after 2 h, then the coupling step was repeated a third time. Deprotection was performed using 20% piperidine in DMF for 15-20 minutes. The coupling step was repeated with the following amino acid until the desired peptide was assembled into the resin. The final cleavage of the resin peptide was carried out by treating the resin with a solution of 95% TFA and 5% water. After stirring the reaction mixture for 2 h at room temperature, the resin was filtered under reduced pressure and washed twice with TFA. The filtrates were combined and the peptide was precipitated by the addition of 400 ml of cold ether. The peptide was filtered under reduced pressure and dried to give Fmoc-Ile-AlaLeu-OH (92% HPLC purity by method A). The crude peptide was characterized by MS and was used for the next step without any further purification.

Ejemplo 34: Example 34:

Síntesis de Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox Synthesis of Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox

[0333] Se disolvió doxorrubicina HCl (2,34 g, 4,03 mmol) y Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH (2,4 g, 4,48 mmol) a temperatura ambiente en DMF anhidro (150 ml). A esta solución agitada rápidamente, se añadió DIEA (1,56 ml, 8,96 mmol) en una parte y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0 ºC usando un baño de hielo y se añadieron 1,87 g (4,92 mmol) de HATU lentamente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante otros 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadió agua helada (200 ml) a la mezcla de reacción, lo que dio como resultado la formación de un precipitado rojo. El precipitado se recogió sobre una frita gruesa, se lavó con 3 x 50 ml de agua y 3 x 50 de éter dietílico, y se secó a presión reducida para dar Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox (rendimiento del 89%, pureza por HPLC del 94% por el método A). Este producto se caracterizó por MS y se usó para la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. [0333] Doxorubicin HCl (2.34 g, 4.03 mmol) and Fmoc-Ile-Ala-Leu-OH (2.4 g, 4.48 mmol) were dissolved at room temperature in anhydrous DMF (150 ml). To this rapidly stirred solution, DIEA (1.56 ml, 8.96 mmol) was added in one part and the reaction mixture was stirred for 15 minutes at room temperature. The reaction mixture was cooled to 0 ° C using an ice bath and 1.87 g (4.92 mmol) of HATU was added slowly over 10 minutes. The reaction mixture was stirred for another 60 minutes at room temperature. Ice water (200 ml) was added to the reaction mixture, which resulted in the formation of a red precipitate. The precipitate was collected on a thick frit, washed with 3 x 50 ml of water and 3 x 50 of diethyl ether, and dried under reduced pressure to give Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox (89% yield, purity by HPLC of 94% by method A). This product was characterized by MS and was used for the next stage without any further purification.

Ejemplo 35: Example 35:

Síntesis de Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Synthesis of Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox

[0334] Se disolvió doxorrubicina HCl (1,43 g, 2,5 mmol) y produjo Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH (1,6 g, 2,6 mmol) a temperatura ambiente en DMF anhidro (150 ml). A esta solución agitada rápidamente, se añadió DIEA (1 ml, 5,7 mmol) en una parte y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0 ºC usando un baño de hielo, y se añadieron 1,07 g (2,8 mmol) de HATU lentamente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante otros 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadió agua helada (200 ml) a la mezcla de reacción, lo que dio como resultado la formación de un precipitado rojo. El precipitado se recogió sobre una frita gruesa, se lavó con 3 x 50 ml de agua y 3 x 50 de éter dietílico, y se secó a presión reducida para dar Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (rendimiento del 88%, pureza por HPLC del 92% por el método A). Este producto se caracterizó por MS y se usó para la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. [0334] Doxorubicin HCl (1.43 g, 2.5 mmol) was dissolved and produced Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OH (1.6 g, 2.6 mmol) at room temperature in anhydrous DMF (150 ml). To this rapidly stirred solution, DIEA (1 ml, 5.7 mmol) was added in one part and the reaction mixture was stirred for 15 minutes at room temperature. The reaction mixture was cooled to 0 ° C using an ice bath, and 1.07 g (2.8 mmol) of HATU was added slowly over 10 minutes. The reaction mixture was stirred for another 60 minutes at room temperature. Ice water (200 ml) was added to the reaction mixture, which resulted in the formation of a red precipitate. The precipitate was collected on a thick frit, washed with 3 x 50 ml of water and 3 x 50 of diethyl ether, and dried under reduced pressure to give Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (yield of 88%, HPLC purity of 92% by method A). This product was characterized by MS and was used for the next stage without any further purification.

Ejemplo 36: Example 36:

Síntesis de Suc-Ile-Ala-Leu-Dox a partir de Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox Synthesis of Suc-Ile-Ala-Leu-Dox from Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox

[0335] A una solución de Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox (4,4 g, 4,13 mmol) en 20 ml de DMF seco, se añadió piperidina (20,4 ml, 206 mmol) en una parte, dando como resultado un cambio de color de rojo a morado. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 ºC usando un baño de nieve carbónica/acetona. Después se añadieron 21,2 g (210 mmol) de anhídrido succínico a la mezcla de reacción enfriada en una parte. La reacción se agitó rápidamente a -5 ºC durante 5 minutos, después a temperatura ambiente durante otros 90 minutos. Se añadieron 750 ml de éter dietílico anhidro a la mezcla de reacción, lo que dio como resultado la formación de un precipitado rojo. Este precipitado se aisló en una frita de vidrio medio, se lavó con 2 x 50 ml de éter dietílico y se secó a presión reducida para dar Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (rendimiento del 80%, pureza por HPLC del 88% por el método B). El producto final se purificó usando el método C de HPLC preparativa y se caracterizó por LC/MS, que dio un peso molecular del 939 (peso molecular esperado de 940). [0335] To a solution of Fmoc-Ile-Ala-Leu-Dox (4.4 g, 4.13 mmol) in 20 ml of dry DMF, piperidine (20.4 ml, 206 mmol) was added in one part, resulting in a color change from red to purple. The reaction mixture was stirred for 5 minutes at room temperature and then cooled to -20 ° C using a carbonic / acetone snow bath. Then 21.2 g (210 mmol) of succinic anhydride was added to the reaction mixture cooled in one part. The reaction was rapidly stirred at -5 ° C for 5 minutes, then at room temperature for another 90 minutes. 750 ml of anhydrous diethyl ether was added to the reaction mixture, which resulted in the formation of a red precipitate. This precipitate was isolated on a medium glass frit, washed with 2 x 50 ml of diethyl ether and dried under reduced pressure to give Suc-Ile-Ala-Leu-Dox (yield 80%, HPLC purity 88% by method B). The final product was purified using preparative HPLC method C and characterized by LC / MS, which gave a molecular weight of 939 (expected molecular weight of 940).

Ejemplo 37: Example 37:

Síntesis de Suc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox a partir de Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Synthesis of Suc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox from Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox

[0336] A una solución de Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (4 g, 3,53 mmol) en 40 ml de DMF seco, se añadió piperidina (17,4 ml, 176 mmol) en una parte, dando como resultado un cambio de color de rojo a morado. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 ºC usando un baño de nieve carbónica/acetona. Después se añadieron 18 g (180 mmol) de anhídrido succínico a la mezcla de reacción enfriada en una parte. La reacción se agitó rápidamente a -5 ºC durante 5 minutos, después a temperatura ambiente durante otros 90 minutos. Se añadieron 750 ml de éter dietílico anhidro a la mezcla de reacción, lo que dio como resultado la formación de un precipitado rojo. Este precipitado se aisló en una frita de vidrio medio, se lavó con 2 x 50 ml de éter dietílico y se secó a presión reducida para dar Suc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (rendimiento del 78%, pureza por HPLC del 86% por el método B). El producto final se purificó usando el método C de HPLC preparativa y se caracterizó por LC/MS, que dio un peso molecular de 1011 (peso molecular esperado de 1012). [0336] To a solution of Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (4 g, 3.53 mmol) in 40 ml of dry DMF, piperidine (17.4 ml, 176 mmol) was added in one part, resulting in a color change from red to purple. The reaction mixture was stirred for 5 minutes at room temperature and then cooled to -20 ° C using a carbonic / acetone snow bath. Then 18 g (180 mmol) of succinic anhydride was added to the reaction mixture cooled in one part. The reaction was rapidly stirred at -5 ° C for 5 minutes, then at room temperature for another 90 minutes. 750 ml of anhydrous diethyl ether was added to the reaction mixture, which resulted in the formation of a red precipitate. This precipitate was isolated on a medium glass frit, washed with 2 x 50 ml of diethyl ether and dried under reduced pressure to give Suc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (yield 78%, purity by HPLC of 86% by method B). The final product was purified using preparative HPLC method C and characterized by LC / MS, which gave a molecular weight of 1011 (expected molecular weight of 1012).

Ejemplo 38: Example 38:

Síntesis de Fmoc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn Synthesis of Fmoc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn

[0337] El Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu (24,34 g, 0,04 mol) se añade a un matraz de fondo redondo con DMF (350 ml) y un agitador magnético. Después de disolverse el tetrapéptido, se añade bromuro de bencilo (4,76 ml, 0,04 mol), seguido de carbonato de cesio (13,04 g, 0,04 mol) a la solución con agitación. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1,5 h. Después, la mezcla de reacción se vierte lentamente a un matraz con 450 ml de agua helada. Precipita una gran cantidad de sólido blanco, que se recoge por filtración con succión. El producto se lava con agua (2 x 200 ml) y se pone en un desecador al vacío. [0337] Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu (24.34 g, 0.04 mol) is added to a round bottom flask with DMF (350 ml) and a magnetic stirrer. After the tetrapeptide is dissolved, benzyl bromide (4.76 ml, 0.04 mol) is added, followed by cesium carbonate (13.04 g, 0.04 mol) to the solution with stirring. The reaction mixture is stirred at room temperature for 1.5 h. Then, the reaction mixture is slowly poured into a flask with 450 ml of ice water. A large amount of white solid precipitates, which is collected by suction filtration. The product is washed with water (2 x 200 ml) and placed in a vacuum desiccator.

Ejemplo 39: Example 39:

Síntesis de -Ala-Ile-Ala-Leu-OBn Synthesis of -Ala-Ile-Ala-Leu-OBn

[0338] En un matraz de fondo redondo (25 ml), se disuelve Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (0,7 g, 1,0 mmol) en 5 ml de DMF anhidro. Se añade piperidina (1,2 ml, 12,1 mmol) a la solución y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 25 minutos. La reacción se inactiva con agua (6 ml) y se extrae con acetato de etilo (2 x 10 ml). La fase orgánica combinada se lava adicionalmente mediante agua (2 x 5 ml), salmuera (5 ml) y se seca sobre sulfato sódico. Se obtiene un sólido blanco (0,8 g) después de la eliminación del disolvente. [0338] In a round bottom flask (25 ml), Fmoc--Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (0.7 g, 1.0 mmol) is dissolved in 5 ml of anhydrous DMF. Piperidine (1.2 ml, 12.1 mmol) is added to the solution and the mixture is stirred at room temperature for 25 minutes. The reaction is quenched with water (6 ml) and extracted with ethyl acetate (2 x 10 ml). The combined organic phase is further washed with water (2 x 5 ml), brine (5 ml) and dried over sodium sulfate. A white solid (0.8 g) is obtained after solvent removal.

Ejemplo 40: Example 40:

Síntesis de MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn Synthesis of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn

[0339] En un matraz de fondo redondo (250 ml), se disuelve metil hemisuccinato (3,19 g, 24,2 mmol) en DMF anhidro (50 ml). Se añade DIEA (4,22 ml, 24,2 mmol) seguido de HBTU (9,17 g, 24,2 mmol) a la solución. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 45 minutos. A esta mezcla se añade una solución de Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (bruto, que contenía 10,14 g, 21,3 mmol) en DMF anhidro (150 ml). La mezcla se agita continuamente a temperatura ambiente durante 2,5 h. Después, la mezcla de reacción se vierte lentamente en un matraz con 200 ml de agua helada mientras se agita. Precipita una gran cantidad de sólido blanco, que se extrae mediante acetato de etilo (3 x 200 ml). La fase orgánica combinada se lava adicionalmente mediante agua (2 x 200 ml), salmuera (200 ml) y se seca sobre sulfato sódico. [0339] In a round bottom flask (250 ml), methyl hemisuccinate (3.19 g, 24.2 mmol) is dissolved in anhydrous DMF (50 ml). DIEA (4.22 ml, 24.2 mmol) is added followed by HBTU (9.17 g, 24.2 mmol) to the solution. The mixture is stirred at room temperature for 45 minutes. To this mixture is added a solution of Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (crude, containing 10.14 g, 21.3 mmol) in anhydrous DMF (150 ml). The mixture is continuously stirred at room temperature for 2.5 h. Then, the reaction mixture is slowly poured into a flask with 200 ml of ice water while stirring. A large amount of white solid precipitates, which is extracted by ethyl acetate (3 x 200 ml). The combined organic phase is further washed with water (2 x 200 ml), brine (200 ml) and dried over sodium sulfate.

Ejemplo 41: Example 41:

Síntesis de MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu Synthesis of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu

[0340] Se añade MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (1,0 g; 1,46 mmol) en un matraz Erlenmeyer con 100 ml de metanol. Se añaden 50 ml de metanol. La solución se transfiere a un recipiente de reacción de hidrogenación. A este recipiente, se añade Pd-C (90 mg, húmedo al 10%, agua al 50%; 0,042 mmol). Después de la hidrogenación durante 2 horas a temperatura ambiente, la reacción se detiene y se filtra el catalizador. [0340] MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-OBn (1.0 g; 1.46 mmol) in an Erlenmeyer flask with 100 ml of methanol is added. 50 ml of methanol are added. The solution is transferred to a hydrogenation reaction vessel. To this vessel, Pd-C (90 mg, 10% wet, 50% water; 0.042 mmol) is added. After hydrogenation for 2 hours at room temperature, the reaction is stopped and the catalyst is filtered.

Ejemplo 42: Example 42:

Acoplamiento de MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu y doxorrubicina usando el “método de urea” Coupling of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu and doxorubicin using the "urea method"

[0341] En una atmósfera de nitrógeno seco, se suspenden/disuelven 26,04 g (52,0 mmol) de MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu y 23,26 g (40,2 mmol) de clorhidrato de doxorrubicina en 800 ml de DMF seco saturado con urea (30% p/v) y 19,948 ml de DIEA. Esta mezcla se enfría a 0-3 ºC durante 25 minutos. En este punto, se añaden 21,2 g (56,0 mmol) como una solución en 100 ml de DMF saturado con urea durante 10 minutos (el volumen de esta solución debería mantenerse al mínimo). La mezcla de reacción se agita durante 10 minutos a de -2 a 2 ºC y se vierte en 4000 ml de salmuera helada, que contiene ácido acético al 2% v/v durante aproximadamente cinco minutos con agitación enérgica. El producto se elimina por filtración en un filtro de vidrio fritado de porosidad media, se lava generosamente con agua y se seca a presión reducida. [0341] In a dry nitrogen atmosphere, 26.04 g (52.0 mmol) of MeOSuc-laAla-Ile-Ala-Leu and 23.26 g (40.2 mmol) of doxorubicin hydrochloride are suspended / dissolved in 800 ml of dry DMF saturated with urea (30% w / v) and 19,948 ml of DIEA. This mixture is cooled to 0-3 ° C for 25 minutes. At this point, 21.2 g (56.0 mmol) are added as a solution in 100 ml of DMF saturated with urea for 10 minutes (the volume of this solution should be kept to a minimum). The reaction mixture is stirred for 10 minutes at -2 to 2 ° C and poured into 4000 ml of ice brine, containing 2% v / v acetic acid for approximately five minutes with vigorous stirring. The product is removed by filtration in a medium-porous fritted glass filter, generously washed with water and dried under reduced pressure.

Ejemplo 43: Example 43:

Síntesis de agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Synthesis of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox therapeutic agent

[0342] En un matraz de fondo redondo (50 ml), se disuelve MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu (0,25 g, 0,5 mmol) y doxorrubicina (0,29 g, 0,5 mmol) en DMF anhidro (20 ml). Después, la mezcla se agita durante 5 minutos, se añade DIEA (0,17 ml, 1,0 mmol) seguido de HBTU (0,19 g, 0,5 mmol) a la solución. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 h. Se elimina el DMF mediante un evaporador rotatorio, y el residuo se recoge en 4,0 ml de cloruro de metileno:metanol 1:1. A esta solución se añade lentamente 40 ml de éter mientras se agita. Se forma un precipitado y se recoge por filtración con succión. El sólido se lava con éter (2 x 10 ml) y se seca en un desecador al vacío. [0342] In a round bottom flask (50 ml), MeOSuc-laAla-Ile-Ala-Leu (0.25 g, 0.5 mmol) and doxorubicin (0.29 g, 0.5 mmol) are dissolved in anhydrous DMF (20 ml). After the mixture is stirred for 5 minutes, DIEA (0.17 ml, 1.0 mmol) is added followed by HBTU (0.19 g, 0.5 mmol) to the solution. The mixture is stirred at room temperature for 4 h. The DMF is removed by a rotary evaporator, and the residue is taken up in 4.0 ml of methylene chloride: methanol 1: 1. To this solution is slowly added 40 ml of ether while stirring. A precipitate forms and is collected by suction filtration. The solid is washed with ether (2 x 10 ml) and dried in a vacuum desiccator.

Ejemplo 44: Example 44:

Eliminación de doxorrubicina libre de MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox free doxorubicin removal

[0343] Se pone MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (200 mg, 0,194 mmol), DIEA (0,068 ml, 0,388 mmol) y DMF anhidro (10 ml) en un matraz de 50 ml equipado con una barra de agitación magnética. Cuando el MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se había disuelto completamente, se añade resina de isocianato (390 mg, 0,582, prehinchada en 5 ml de diclorometano durante 5 minutos) y la solución resultante se agita durante 2 h a temperatura ambiente con control por HPLC periódico. La mezcla de reacción se filtra después a través de una frita para eliminar la resina cuando las trazas de HPLC indican que la Dox se ha eliminado completamente. La resina se lava con 10 ml de DMF y los lavados con DMF se combinan con la mezcla de reacción filtrada. Los lavados de la mezcla de reacción filtrada se concentran después en un evaporador rotatorio equipado con una bomba de alto vacío y un baño de agua a 30 ºC. El residuo se suspende en 5 ml de DMF y la solución se añade después lentamente a una solución de éter dietílico anhidro agitada rápidamente. El producto se filtra después sobre una frita y se lava con éter dietílico y se seca a presión reducida para dar MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox. [0343] MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (200 mg, 0.194 mmol), DIEA (0.068 ml, 0.388 mmol) and anhydrous DMF (10 ml) are placed in a 50 ml flask equipped with a magnetic stir bar. When the MeOSuc--Ala-Ile-Ala-Leu-Dox had completely dissolved, isocyanate resin (390 mg, 0.582, pre-swollen in 5 ml of dichloromethane for 5 minutes) was added and the resulting solution was stirred for 2 h room temperature with periodic HPLC control. The reaction mixture is then filtered through a frit to remove the resin when the HPLC traces indicate that the Dox has been completely removed. The resin is washed with 10 ml of DMF and the DMF washes are combined with the filtered reaction mixture. The washings of the filtered reaction mixture are then concentrated in a rotary evaporator equipped with a high vacuum pump and a water bath at 30 ° C. The residue is suspended in 5 ml of DMF and the solution is then added slowly to a rapidly stirred anhydrous diethyl ether solution. The product is then filtered on a frit and washed with diethyl ether and dried under reduced pressure to give MeOSuc-Ala-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox.

Ejemplo 45: Example 45:

Hidrólisis del agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox mediante el uso de enzima entrecruzada Hydrolysis of the therapeutic agent MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox through the use of cross-linked enzyme

[0344] El agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (1,0 g, 0,975 mmol) y 100 ml de DMF se ponen en un matraz de 500 ml. La suspensión se agita enérgicamente con un agitador magnético. Cuando el agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se ha disuelto completamente, se añaden 400 ml de agua desionizada y la solución resultante se agita a 35 ºC. Una suspensión de 1 g de la enzima inmovilizada CLEC-PC lavada (Altus Biologics) se aclara en tres alícuotas de agua desionizada, después se resuspende en 10 ml de DMF acuoso al 20% antes del uso. La suspensión resultante se agita a 35 ºC con control por HPLC periódico. Cuando todo el agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox se ha consumido, la mezcla de reacción se filtra a través de un filtro de membrana de nylon de 0,45 m para eliminar la enzima CLEC-PC. La torta de CLEC-PC se lava con 3 x 10 ml de metanol y los lavados con metanol se combinan con la mezcla de reacción filtrada. Los lavados de la mezcla de reacción filtrada más metanol se concentran después hasta una goma roja en un evaporador rotatorio equipado con una bomba de alto vacío y un baño de agua a 30 ºC. La goma roja se suspende después en 50 ml de agua desionizada a temperatura ambiente y se agita rápidamente mediante un agitador mecánico. A esta suspensión se añade una solución de 77,8 mg de bicarbonato sódico (0,926 mmol, 0,95 eq.) en 100 ml de agua desionizada durante 2 minutos. La suspensión se agita a temperatura ambiente 20 minutos. La mezcla de reacción se filtra a través de un filtro de membrana de nylon de 0,45 M y se liofiliza. [0344] The therapeutic agent MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox (1.0 g, 0.975 mmol) and 100 ml of DMF are placed in a 500 ml flask. The suspension is vigorously stirred with a magnetic stirrer. When the therapeutic agent MeOSuc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox has completely dissolved, 400 ml of deionized water are added and the resulting solution is stirred at 35 ° C. A suspension of 1 g of the washed CLEC-PC immobilized enzyme (Altus Biologics) is rinsed in three aliquots of deionized water, then resuspended in 10 ml of 20% aqueous DMF before use. The resulting suspension is stirred at 35 ° C with periodic HPLC control. When all the MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox therapeutic agent has been consumed, the reaction mixture is filtered through a 0.45 µm nylon membrane filter to remove the CLEC-PC enzyme. The CLEC-PC cake is washed with 3 x 10 ml of methanol and the methanol washes are combined with the filtered reaction mixture. The washings of the filtered reaction mixture plus methanol are then concentrated to a red gum in a rotary evaporator equipped with a high vacuum pump and a water bath at 30 ° C. The red gum is then suspended in 50 ml of deionized water at room temperature and stirred rapidly by a mechanical stirrer. To this suspension is added a solution of 77.8 mg of sodium bicarbonate (0.926 mmol, 0.95 eq.) In 100 ml of deionized water for 2 minutes. The suspension is stirred at room temperature 20 minutes. The reaction mixture is filtered through a 0.45 µM nylon membrane filter and lyophilized.

Ejemplo 46: Example 46:

Hidrólisis del agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox mediante el uso de enzima soluble Hydrolysis of the therapeutic agent MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox through the use of soluble enzyme

[0345] Se suspenden 11,0 g (10,72 mmol) de agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox en 800 ml de agua de calidad de HPLC y se homogeneizan durante 60 minutos con un homogeneizador Ultraturrax T8 para dar una suspensión finamente dividida. Esta suspensión se agita (500 rpm) a 35 ºC y se ajusta a pH = 6,05 con NaHCO3. acuoso 76 mM. Después se añade 1,0 g de lipasa de C. antarctica "B" (Altus Biologics) y la mezcla de reacción se agita a 35 ºC durante 48 horas. Durante el tiempo de reacción de 48 h, el pH se mantiene entre 5,3 y 6,2 por adición periódica de NaHCO3 76 mM, y la reacción se controla periódicamente por HPLC. Después de que la reacción esté casi completa, la mezcla de reacción se ajusta entonces a pH = 7 con NaHCO3 acuoso 76 mM y se filtra a través de una almohadilla de Celite 521. La mezcla de reacción aclarada se acidifica después hasta aproximadamente pH 3 con 5 ml de ácido acético glacial. El precipitado se aísla por filtración con Celite 521, aclarando posteriormente la almohadilla de Celite con metanol. La solución de metanol se filtra a través de un filtro de vidrio fritado de 10-20 m y se seca mediante evaporación rotatoria. Este producto se convierte en la sal de sodio por disolución en 70 ml de NaHCO3 76 mM (0,95 eq.) y se liofiliza. El producto es idéntico al del Ejemplo 45. [0345] 11.0 g (10.72 mmol) of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox therapeutic agent are suspended in 800 ml of HPLC quality water and homogenized for 60 minutes with an Ultraturrax T8 homogenizer to give a finely divided suspension. This suspension is stirred (500 rpm) at 35 ° C and adjusted to pH = 6.05 with NaHCO3. aqueous 76 mM. Then 1.0 g of C. antarctica "B" lipase (Altus Biologics) is added and the reaction mixture is stirred at 35 ° C for 48 hours. During the 48 h reaction time, the pH is maintained between 5.3 and 6.2 by periodic addition of 76 mM NaHCO3, and the reaction is monitored periodically by HPLC. After the reaction is almost complete, the reaction mixture is then adjusted to pH = 7 with 76 mM aqueous NaHCO3 and filtered through a pad of Celite 521. The clarified reaction mixture is then acidified to approximately pH 3 with 5 ml glacial acetic acid. The precipitate is isolated by filtration with Celite 521, subsequently rinsing the Celite pad with methanol. The methanol solution is filtered through a 10-20 µm fritted glass filter and dried by rotary evaporation. This product is converted into the sodium salt by dissolving in 70 ml of 76 mM NaHCO3 (0.95 eq.) And freeze-dried. The product is identical to that of Example 45.

Ejemplo 47: Example 47:

Hidrólisis por lipasa de Candida antarctica "B" inmovilizada del agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox Lipase hydrolysis of immobilized Candida antarctica "B" of the therapeutic agent MeOSuc-laAla-Ile-Ala-Leu-Dox

[0346] Se disuelven 30,0 g de lipasa de Candida antarctica "B" (Altus Biologics) en 300 ml de agua y se dializa contra 3 x 4 l de NaHCO3 acuoso 50 mM (pH = 6,4). Se ponen 360 ml de Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS de Pharmacia en un embudo fritado de vidrio grueso y se aclaran con 5 x 450 ml de HCl acuoso 1 mM helado. La Sepharose activada con NHS aclarada se combina después con la solución de enzima dializada. La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ºC) durante 2,0 horas. El conjugado de Sepharose/enzima se aísla después sobre un filtro de vidrio fritado grueso, y después se agita en 1000 ml de TRIS acuoso 100 mM (pH = 7,45) durante 15 minutos. Esta suspensión se filtra y se incuba con otros 1000 ml de tampón TRIS acuoso 100 mM (pH = 7,45) a 4 ºC durante una noche. Por la mañana, la enzima inmovilizada se elimina por filtración y, después de lavarse con agua, se pone en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 2000 ml. Se añaden 43 g de agente terapéutico MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox y los sólidos se suspenden en 800 ml de agua desionizada. El matraz está equipado con un agitador por encima de la cabeza y un pH-stato ajustado para mantener el pH de la mezcla de reacción entre 5,9-6,2 por control de una bomba de jeringa. La bomba de jeringa está cargada con NaHCO3 0,1 M. El desarrollo de la reacción se sigue mediante HPLC. Después de que la reacción esté casi completa, la enzima inmovilizada se elimina por filtración y la fase líquida se liofiliza. Los sólidos secos se suspenden después en aproximadamente 11 ml de THF seco y se eliminan por filtración. [0346] 30.0 g of Candida antarctica "B" lipase (Altus Biologics) are dissolved in 300 ml of water and dialyzed against 3 x 4 l of 50 mM aqueous NaHCO3 (pH = 6.4). 360 ml of Pharmacia NHS activated Sepharose 4 Fast Flow is placed in a fritted thick glass funnel and rinsed with 5 x 450 ml of ice cold 1 mM aqueous HCl. The clarified NHS activated Sepharose is then combined with the dialyzed enzyme solution. The resulting suspension is stirred at room temperature (approximately 22 ° C) for 2.0 hours. The Sepharose / enzyme conjugate is then isolated on a coarse fritted glass filter, and then stirred in 1000 ml of 100 mM aqueous TRIS (pH = 7.45) for 15 minutes. This suspension is filtered and incubated with another 1000 ml of 100 mM aqueous TRIS buffer (pH = 7.45) at 4 ° C overnight. In the morning, the immobilized enzyme is removed by filtration and, after washing with water, it is placed in a round bottom flask with three 2000 ml mouths. 43 g of MeOSuc-Ala-Ile-Ala-Leu-Dox therapeutic agent are added and the solids are suspended in 800 ml of deionized water. The flask is equipped with a stirrer above the head and a pH-stato adjusted to maintain the pH of the reaction mixture between 5.9-6.2 by control of a syringe pump. The syringe pump is loaded with 0.1 M NaHCO3. The reaction is monitored by HPLC. After the reaction is almost complete, the immobilized enzyme is filtered off and the liquid phase is lyophilized. The dried solids are then suspended in approximately 11 ml of dry THF and filtered off.

Ejemplo 48: Example 48:

Síntesis a gran escala de la forma con protección N-terminal metil succinilo del agente terapéutico Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Large-scale synthesis of the N-terminal methyl succinyl protection form of the therapeutic agent Ala-Leu-Ala-Leu-Dox

[0347] Se disolvieron 69,6 g de doxorrubicina HCl (120 mmol) y 100 g de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu (199 mmol) en DMF anhidro (10 l) en nitrógeno. Se añadió 76 ml de DIEA (434 mmol) a la mezcla de reacción y la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente en nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió después hasta 0 ºC durante 10 minutos. En un matraz separado se preparó una solución de 864 g de HATU (220 mmol) en DMF (500 ml). La solución de HATU se añadió lentamente durante 20 minutos a la mezcla de reacción mientras que la mezcla de reacción se mantuvo a 0 ºC. La mezcla de reacción se agitó a 0 ºC durante 30 minutos. [0347] 69.6 g of doxorubicin HCl (120 mmol) and 100 g of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu (199 mmol) were dissolved in anhydrous DMF (10 L) in nitrogen. 76 ml of DIEA (434 mmol) was added to the reaction mixture and the reaction mixture was stirred for 10 minutes at room temperature under nitrogen. The reaction mixture was then cooled to 0 ° C for 10 minutes. A solution of 864 g of HATU (220 mmol) in DMF (500 ml) was prepared in a separate flask. The HATU solution was added slowly for 20 minutes to the reaction mixture while the reaction mixture was maintained at 0 ° C. The reaction mixture was stirred at 0 ° C for 30 minutes.

[0348] Se preparó una solución de NaCl (7,5 kg, al menos 30% p/v) en agua (25 l) y se enfrió a 0 ºC. La mezcla de reacción se añadió después lentamente a la solución de salmuera enfriada con agitación enérgica durante 120 minutos. El color de la solución permaneció rojo, una solución azul hubiera indicado que el pH necesitaba de ajuste inmediato a entre 5,8-6,0 por adición de ácido acético. La temperatura se mantuvo a aproximadamente 5 ºC. El precipitado rojo se eliminó por filtración sobre un filtro de vidrio fritado de porosidad media, se lavó con agua y se secó a presión de vacío sobre P2O5 para dar 115 g de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. [0348] A solution of NaCl (7.5 kg, at least 30% w / v) in water (25 L) was prepared and cooled to 0 ° C. The reaction mixture was then added slowly to the brine solution cooled with vigorous stirring for 120 minutes. The color of the solution remained red, a blue solution would have indicated that the pH needed immediate adjustment to between 5.8-6.0 by the addition of acetic acid. The temperature was maintained at approximately 5 ° C. The red precipitate was removed by filtration on a medium-porous fritted glass filter, washed with water and dried under vacuum pressure on P2O5 to give 115 g of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox.

Ejemplo 49: Example 49:

Tratamiento de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox con perlas de Ps-isocianato para eliminar trazas de doxorrubicina Treatment of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox with Ps-isocyanate beads to eliminate traces of doxorubicin

[0349] Se disolvieron 146,4 g de perlas de PS-isocianato (240 mmol; suministrado por Argonaut Lab, San Carlos, CA) en 1,5 litros de DMF anhidro y se dejó que se hincharan durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Las perlas hinchadas se filtraron a través de un embudo fritado de vidrio y se lavaron con 500 ml adicionales de DMF anhidro. Se disolvieron 115 g de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (112 mmol) en 1000 ml de DMF anhidro y se añadieron 2,1 ml de DIEA (12 mmol) seguido de las perlas de PS-isocianato hinchadas. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y se controló usando HPLC hasta que la cantidad del pico de doxorrubicina era inferior al 0,1%. Esto lleva de 2 a 12 h dependiendo del tamaño del lote. Se realizaron análisis de HPLC analítica usando una Columna Water 2690: Waters Symmetry Shield C8 3,5 m M 4,6 x 150 mm (nº cat. WAT094269), disolvente: Aformiato de amonio acuoso 20 mM al 80% (pH = 4,5) acetonitrilo al 20%, disolvente: B-formiato de amonio acuoso 20 mM al 20% (pH = 4,5). Temperatura de columna: temperatura ambiente controlada, temperatura de muestra: 4 ºC, tiempo de procesamiento: 37,5 minutos, detector: 254 nm, caudal: 1,0 ml/min, cantidad de inyección 10 g (0,5 mg/ml x 0,02 ml), fase móvil A y B. Gradiente: gradiente lineal de 37,5 minutos de fase móvil A al 100% a fase móvil B al 100% con un retraso de equilibrado de 7,5 minutos. [0349] 146.4 g of PS-isocyanate beads (240 mmol; supplied by Argonaut Lab, San Carlos, CA) were dissolved in 1.5 liters of anhydrous DMF and allowed to swell for 5-10 minutes at temperature ambient. The swollen beads were filtered through a fritted glass funnel and washed with an additional 500 ml of anhydrous DMF. 115 g of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (112 mmol) was dissolved in 1000 ml of anhydrous DMF and 2.1 ml of DIEA (12 mmol) was added followed by swollen PS-isocyanate beads. The reaction mixture was stirred at room temperature and monitored using HPLC until the amount of the doxorubicin peak was less than 0.1%. This takes from 2 to 12 h depending on the size of the lot. Analytical HPLC analyzes were performed using a Water 2690 Column: Waters Symmetry Shield C8 3.5 Mm M 4.6 x 150 mm (Cat. No. WAT094269), solvent: 80% 20% aqueous ammonium formate (pH = 4 , 5) 20% acetonitrile, solvent: 20 mM 20% aqueous ammonium formate (pH = 4.5). Column temperature: controlled room temperature, sample temperature: 4 ° C, processing time: 37.5 minutes, detector: 254 nm, flow rate: 1.0 ml / min, injection quantity 10 g (0.5 mg / ml x 0.02 ml), mobile phase A and B. Gradient: 37.5 minute linear gradient from 100% mobile phase A to 100% mobile phase B with a balance delay of 7.5 minutes.

[0350] A las seis horas la cantidad del pico de doxorrubicina era inferior al 0,1%, la mezcla de reacción se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado grueso para eliminar las perlas. Se preparó una solución de salmuera (al menos 30% p/v) de 1,1 kg de NaCl en 3,5 l de agua y se enfrió a 0 ºC. La mezcla de reacción filtrada se añadió después lentamente a la solución de salmuera enfriada con agitación enérgica durante 45 minutos. El color de la solución permaneció rojo, una solución azul hubiera indicado que el pH necesitaba de ajuste inmediato a entre 5,86,0 por adición de ácido acético. El precipitado rojo se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado medio, se lavó con agua y se secó a presión de vacío sobre P2O5 para dar MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox libre de cualquier doxorrubicina residual. [0350] At six hours the amount of the doxorubicin peak was less than 0.1%, the reaction mixture was filtered through a thick sintered glass funnel to remove the beads. A brine solution (at least 30% w / v) of 1.1 kg of NaCl in 3.5 L of water was prepared and cooled to 0 ° C. The filtered reaction mixture was then added slowly to the brine solution cooled with vigorous stirring for 45 minutes. The color of the solution remained red, a blue solution would have indicated that the pH needed immediate adjustment to between 5.86.0 by the addition of acetic acid. The red precipitate was filtered through a medium sintered glass funnel, washed with water and dried under vacuum pressure on P2O5 to give MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox free of any residual doxorubicin.

[0351] El MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox se disolvió en 1 l de MeOH y la solución de metanol se añadió después lentamente a 14 l de éter etílico enfriado con agitación enérgica durante 60 minutos. El precipitado rojo se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado medio, se lavó con éter (1 l) y se secó a presión de vacío para dar 110 g de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Se determinó que la pureza era del 96,5% por HPLC, como se ha descrito en el Ejemplo 37. MS m/z calc. para C50H67N5O18 1025, encontrada 1048 (M++Na). [0351] The MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was dissolved in 1 L of MeOH and the methanol solution was then added slowly to 14 L of ethyl ether cooled with vigorous stirring for 60 minutes. The red precipitate was filtered through a medium sintered glass funnel, washed with ether (1 L) and dried under vacuum pressure to give 110 g of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. The purity was determined to be 96.5% by HPLC, as described in Example 37. MS m / z calc. for C50H67N5O18 1025, found 1048 (M ++ Na).

Ejemplo 50: Example 50:

Hidrólisis enzimática de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox para dar Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox Enzymatic hydrolysis of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox to give Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox

[0352] La enzima CLEC-CAB (Lipasa de Candida antartica "B") se adquirió (en Altus Biologics., Boston, MA) en forma de solución, en la que la concentración de la enzima está definida por el peso de enzima seca por mililitro de solución. La suspensión de enzima bruta se agitó durante unos pocos minutos para obtener una solución homogénea. 504 ml (328 mmol) de esta solución homogénea se dividieron en alícuotas en un matraz. Se añadieron 2,5 l de agua desionizada y la suspensión se agitó durante 10 minutos usando un agitador magnético. La solución de enzima se filtró usando un embudo fritado de vidrio grueso sin llevar la enzima a sequedad. La enzima se transfirió de nuevo a un matraz. La enzima se suspendió en agua y se filtró tres veces más. [0352] The CLEC-CAB enzyme (Candida Antarctic Lipase "B") was purchased (in Altus Biologics., Boston, MA) as a solution, in which the enzyme concentration is defined by the weight of dry enzyme per milliliter of solution. The crude enzyme suspension was stirred for a few minutes to obtain a homogeneous solution. 504 ml (328 mmol) of this homogeneous solution was divided into aliquots in a flask. 2.5 L of deionized water was added and the suspension was stirred for 10 minutes using a magnetic stirrer. The enzyme solution was filtered using a fritted funnel of thick glass without bringing the enzyme to dryness. The enzyme was transferred back to a flask. The enzyme was suspended in water and filtered three more times.

[0353] La torta de enzima se resuspendió en 550 ml de agua desionizada y se transfirió a un matraz RB. A esta suspensión se añadieron 109 g de MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (106 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (25 ºC). El pH de la mezcla de reacción se mantuvo entre 5,8 y 6,1 mediante un pH-stato equipado con una bomba de jeringa cargada con una solución de NaHCO3 1 N. El desarrollo de la reacción se siguió con control por HPLC periódico, como se ha descrito en el Ejemplo 49. Después de 24 horas, la reacción parece estar completa al 94%, según se determinó por HPLC. [0353] The enzyme cake was resuspended in 550 ml of deionized water and transferred to an RB flask. To this suspension was added 109 g of MeOSuc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (106 mmol) and the reaction mixture was stirred at room temperature (25 ° C). The pH of the reaction mixture was maintained between 5.8 and 6.1 by means of a pH-stato equipped with a syringe pump loaded with a solution of 1 N NaHCO3. The development of the reaction was monitored by periodic HPLC, as described in Example 49. After 24 hours, the reaction appears to be 94% complete, as determined by HPLC.

[0354] Para acelerar la reacción, era necesaria enzima CLEC después de 24 horas. 168 ml de la enzima CLEC (solución homogénea) se lavaron en un formato de columna como se ha descrito anteriormente. La torta de enzima se resuspendió en 1,1 l de agua desionizada y se añadió a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente con control por HPLC periódico y el pH se mantuvo entre 5,8 y 6,1. Después de 60 horas, la reacción era completa al 99,9%, según se controló por HPLC. [0354] To accelerate the reaction, CLEC enzyme was necessary after 24 hours. 168 ml of the CLEC enzyme (homogeneous solution) was washed in a column format as described above. The enzyme cake was resuspended in 1.1 L of deionized water and added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at room temperature with control by periodic HPLC and the pH was maintained between 5.8 and 6.1. After 60 hours, the reaction was 99.9% complete, as monitored by HPLC.

[0355] La enzima CLEC se eliminó de la mezcla de reacción por filtración a través de un filtro de 0,2 M y se aclaró con 500 ml de agua desionizada. Después, el filtrado se liofilizó para dar 95,2 g de Suc-Ala-Leu-Ala-LeuDox.Na, rendimiento físico del 87 %, MS m/z calc. para C49H65N5O18 1011, encontrada 1034 (M++Na). [0355] The CLEC enzyme was removed from the reaction mixture by filtration through a 0.2 µM filter and rinsed with 500 ml of deionized water. The filtrate was then lyophilized to give 95.2 g of Suc-laAla-Leu-Ala-LeuDox.Na, 87% physical yield, MS m / z calc. for C49H65N5O18 1011, found 1034 (M ++ Na).

[0356] El compuesto de profármaco, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, se caracterizó completamente mediante análisis del espectro de masas, FTIR, NMR. [0356] The prodrug compound, Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, was fully characterized by mass spectrum analysis, FTIR, NMR.

[0357] El análisis del espectro de masas de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox muestra claramente la presencia del pico de ión molecular (m/z) a 1034 (M+ +Na) que coincide con el m/z calculado para Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (C49H65N5O18Na) a 1033. [0357] The mass spectrum analysis of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox clearly shows the presence of the molecular ion peak (m / z) at 1034 (M + + Na) that coincides with the m / z calculated for Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (C49H65N5O18Na) at 1033.

[0358] La muestra de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox también se analizó por FITR. El espectro coincidía con el de un patrón de referencia del material anterior. Las asignaciones para las absorciones principales eran las siguientes: [0358] The sample of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox was also analyzed by FITR. The spectrum coincided with that of a reference pattern of the previous material. The allocations for the main absorptions were the following:

Hidroxilo 3379 cm-1 C-H 3000-2700 Carbonilos 1650-1725 Hydroxyl 3379 cm-1 C-H 3000-2700 Carbonyl 1650-1725

[0359] Finalmente, la muestra se analizó por NMR. Los desplazamientos químicos y asignaciones se enumeran en la Tabla 31 y se ilustran en la FIG. 28. Hay tres carbonos en la región de cetona, a 215,2, 187,7, 187,4 ppm, que concuerdan con la estructura de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. Los dos últimos tienen desplazamientos químicos similares, así que se asignan a (2) y (3), a 187,7 y 187,4 ppm. La cetona restante es por lo tanto (1). Surgen pruebas adicionales de estas asignaciones de los espectros HMQC y HMBC; ninguno de estos tres muestra ningún pico de HMQC, así que no están protonados, y sólo (1) tiene un acoplamiento C-H de largo alcance (HMBC), con el protón a 4,77 ppm, que es un singlete de dos protones, que es por lo tanto (4). A partir del espectro de HMQC, el carbono a 65,7 ppm está unido a estos protones. [0359] Finally, the sample was analyzed by NMR. Chemical shifts and assignments are listed in Table 31 and are illustrated in FIG. 28. There are three carbons in the ketone region, at 215.2, 187.7, 187.4 ppm, which match the structure of Suc-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. The last two have similar chemical shifts, so they are assigned to (2) and (3), 187.7 and 187.4 ppm. The remaining ketone is therefore (1). Additional tests of these assignments of the HMQC and HMBC spectra arise; none of these three shows any HMQC peak, so they are not protonated, and only (1) has a long range CH (HMBC) coupling, with the proton at 4.77 ppm, which is a two proton singlet, which It is therefore (4). From the HMQC spectrum, carbon at 65.7 ppm is attached to these protons.

[0360] La señal de 1H NMR a 3,96 ppm tiene el desplazamiento químico y el área de un grupo metoxi; estos protones están acoplados con el carbono a 57,2 ppm y se asignan al único metoxi en la estructura (5). El desplazamiento químico 13C también concuerda con un metoxi. El acoplamiento C-H de largo alcance de los protones es con el carbono a 162,3 ppm, que debe ser (6). [0360] The 1H NMR signal at 3.96 ppm has the chemical shift and the area of a methoxy group; these protons are coupled with carbon at 57.2 ppm and are assigned to the only methoxy in structure (5). The chemical shift 13C also matches a methoxy. The long-range C-H coupling of the protons is with carbon at 162.3 ppm, which must be (6).

[0361] El espectro de HMQC muestra que hay tres carbonos aromáticos protonados a 120,5, 120,3 y 137,2 ppm; los protones aromáticos no mostraban ningún acoplamiento C-H de largo alcance ni ningún acoplamiento entre protones adyacentes. Las señales de protones aromáticos son muy amplias, indicando un tiempo de relajación T2 corto, que explica la ausencia de cualquier acoplamiento observado. Dada esta ausencia de acoplamiento, no es posible asignar estos tres sitios de forma única, y se asignan en conjunto a (7), (8) y (9). [0361] The HMQC spectrum shows that there are three aromatic carbons protonated at 120.5, 120.3 and 137.2 ppm; the aromatic protons showed no long-range C-H coupling or any coupling between adjacent protons. The aromatic proton signals are very wide, indicating a short T2 relaxation time, which explains the absence of any observed coupling. Given this lack of coupling, it is not possible to assign these three sites in a unique way, and they are assigned together to (7), (8) and (9).

[0362] Los dos carbonos aromáticos no protonados a 157,2 y 156,1 ppm tienen desplazamientos químicos que concuerdan con (10) y (11), es decir, carbonos aromáticos unidos a oxígeno. No se observa ningún acoplamiento de largo alcance. [0362] The two aromatic carbons not protonated at 157.2 and 156.1 ppm have chemical shifts that match (10) and (11), that is, aromatic carbons attached to oxygen. No long range coupling is observed.

[0363] Las señales de 13C NMR a 112,3 y 112,0 ppm concuerdan con carbonos aromáticos orto respecto a la sustitución de oxígeno, y se asignan a (12) y (13). La señal de 13C NMR a 121,3 también muestra este efecto, así que se asigna a (14). Los tres carbonos aromáticos no protonados restantes se asignan a los últimos tres carbonos en la región, (15), (16) y (17). [0363] The 13C NMR signals at 112.3 and 112.0 ppm agree with ortho aromatic carbons with respect to oxygen substitution, and are assigned to (12) and (13). The 13C NMR signal at 121.3 also shows this effect, so it is assigned to (14). The remaining three non-protonated aromatic carbons are assigned to the last three carbons in the region, (15), (16) and (17).

[0364] La ausencia de cualquier acoplamiento C-H de largo alcance con cualquiera de los carbonos aromáticos es inesperada, e indica que el acoplamiento es muy pequeño o inexistente debido a tiempos de relajación T2 cortos o a una configuración planar. [0364] The absence of any long-range C-H coupling with any of the aromatic carbons is unexpected, and indicates that the coupling is very small or non-existent due to short T2 relaxation times or a planar configuration.

[0365] Hay seis carbonos de carbonilo a de 181 a 174 ppm; de estos, el que está a 180,6 ppm es el único con un desplazamiento químico que concuerda con una sal de sodio, así que se asigna a (18). El pico muestra acoplamiento C-H de largo alcance con los protones a 2,4 ppm, que no están resueltos. Los cinco carbonos de carbonilo restantes están todos dentro de un intervalo de desplazamiento químico de una ppm y no son posibles (19), (20), (21), (22), (23). [0365] There are six carbonyl carbons at 181 to 174 ppm; of these, the one at 180.6 ppm is the only one with a chemical shift that matches a sodium salt, so it is assigned to (18). The peak shows long-range C-H coupling with the protons at 2.4 ppm, which are not resolved. The remaining five carbonyl carbons are all within a chemical displacement range of one ppm and are not possible (19), (20), (21), (22), (23).

[0366] El carbono a 102,3 ppm tiene un desplazamiento químico que concuerda con un carbono unido a dos oxígenos separados, así que debe ser (24). Este tiene un acoplamiento C-H de largo alcance con el protón 1,74 ppm, que se asigna a (25). Este protón está acoplado con el carbono a 30,6 ppm. De los carbonos en la región C-O (de 80 a 60 ppm), sólo uno está protonado, a 77,4 ppm, así que debe ser (26). Este no tiene un acoplamiento C-H de largo alcance ni con el protón ni con el carbono. [0366] Carbon at 102.3 ppm has a chemical shift that matches a carbon attached to two separate oxygen, so it must be (24). This has a long-range C-H coupling with the 1.74 ppm proton, which is assigned to (25). This proton is coupled with carbon at 30.6 ppm. Of the carbons in the C-O region (from 80 to 60 ppm), only one is protonated, at 77.4 ppm, so it must be (26). This does not have a long-range C-H coupling with either the proton or the carbon.

[0367] Hay tres carbonos no asignados todavía en la región de 80 a 60 ppm, todos metinas unidas a oxígeno. Tienen desplazamientos químicos similares (71,2, 69,9 y 68,8 ppm), pero parece claro que el carbono a 68,8 ppm muestra un acoplamiento de largo alcance con el metilo en (28). El carbono a 69,9 también muestra un acoplamiento de largo alcance con el metilo en (28), así que debe ser adyacente a (27), y se asigna a (29). La metina restante es por lo tanto (30). [0367] There are three carbons not yet assigned in the region of 80 to 60 ppm, all oxygen-bound metins. They have similar chemical shifts (71.2, 69.9 and 68.8 ppm), but it seems clear that carbon at 68.8 ppm shows a long-range coupling with methyl in (28). The 69.9 carbon also shows a long-range coupling with the methyl in (28), so it must be adjacent to (27), and is assigned to (29). The remaining methine is therefore (30).

[0368] El protón a 3,6 ppm (29) muestra un acoplamiento C-H de largo alcance con un solo carbono a 47,3 ppm. El único carbono no asignado adyacente debe ser (31). Los protones de (31) se superponen con otros protones y no son posibles correlaciones de largo alcance. [0368] The proton at 3.6 ppm (29) shows a long-range C-H coupling with a single carbon at 47.3 ppm. The only adjacent unallocated carbon must be (31). The protons of (31) overlap with other protons and long-range correlations are not possible.

[0369] Los cuatro metilos restantes están en la región de isopropilo, y uno está a 1,25/1,34 ppm y debe corresponder al último metilo restante, (32). Los protones de este metilo muestran un acoplamiento de largo alcance con un solo carbono, a 51,3 ppm, que debe ser (33). Los protones de (33) se superponen gravemente con otros protones y no pueden usarse para ninguna correlación de largo alcance. [0369] The remaining four methyl are in the isopropyl region, and one is at 1.25 / 1.34 ppm and should correspond to the last remaining methyl, (32). Protons of this methyl show a long-range coupling with a single carbon, at 51.3 ppm, which should be (33). The protons of (33) overlap severely with other protons and cannot be used for any long-range correlation.

[0370] Los cuatro metilos restantes deben surgir de los isopropil metilos, en su conjunto etiquetados (34). Los protones de (34) muestran un acoplamiento de largo alcance entre los metilos emparejados y con los carbonos a 25,9/25,8 y 41,6/41,7 ppm; las metinas se asignan (35)/(36) y los metilenos (37)/(38). Todos estos protones se superponen a de 1,5 a 1,8 ppm, pero muestran un acoplamiento de largo alcance con las metinas a 54,7/53,5 ppm, que deben ser las adyacentes a las amidas y están asignadas (39)/(40). [0370] The remaining four methyl must arise from the isopropyl methyl, as a whole labeled (34). The protons of (34) show a long-range coupling between the paired methyl and with the carbons at 25.9 / 25.8 and 41.6 / 41.7 ppm; the metinas are assigned (35) / (36) and the methylenes (37) / (38). All these protons overlap at 1.5 to 1.8 ppm, but show a long-range coupling with the methines at 54.7 / 53.5 ppm, which must be those adjacent to the amides and are assigned (39) / (40).

[0371] Los cinco carbonos restantes, todos metilenos, muestran un acoplamiento de largo alcance con carbonilos, así que deben ser adyacentes a los mismos y están asignados (41), (42) y (43); los desplazamientos químicos de 1H NMR se superponen todos a 2,4 ppm y se corresponden con los carbonos a 37,2, 34,4 y 33,8 ppm. Puesto que el carbono a 37,2 es la mayor diferencia, se asigna al carbonilo de la sal de sodio (41), y los otros dos a los carbonilos de amida (42), (43). Los dos metileno restantes son demasiado similares para una asignación específica (44), (45). [0372] Hay un sitio sin asignar. Hay treinta protones en la región de 5,5 a 1,5 ppm, lo que concuerda con la estructura, incluyendo este sitio asignado. Por lo tanto, es probable que la señal del carbono esté oculta bajo la [0371] The remaining five carbons, all methylene, show a long-range coupling with carbonyls, so they must be adjacent to them and are assigned (41), (42) and (43); 1H NMR chemical shifts overlap all at 2.4 ppm and correspond to carbons at 37.2, 34.4 and 33.8 ppm. Since carbon at 37.2 is the biggest difference, it is assigned to the carbonyl of the sodium salt (41), and the other two to the amide carbonyls (42), (43). The remaining two methylene are too similar for a specific assignment (44), (45). [0372] There is an unassigned site. There are thirty protons in the region from 5.5 to 1.5 ppm, which is consistent with the structure, including this assigned site. Therefore, it is likely that the carbon signal is hidden under the

5 señal de disolvente a aproximadamente 50 ppm, lo que concordaría con metileno adyacente a un nitrógeno. 5 solvent signal at about 50 ppm, which would match with methylene adjacent to a nitrogen.

TABLA 31 TABLE 31

Desplazamientos químicos 13C y 1H Chemical shifts 13C and 1H: HMOC para 1H Asignación HMOC for 1H Assignment

215,2 215.2: 1 one

187,7 187.7: 2/3 2/3

187,4 187.4: 2/3 2/3

180,6 180.6: 18 18

176,1 176.1: 19-23 19-23

175,8 175.8: 19-23 19-23

175,4 175.4: 19-23 19-23

175,2 175.2: 19-23 19-23

174,1 174.1: 19-23 19-23

162,3 162.3: 6 6

157,2 157.2: 10/11 11/10

156,1 156.1: 10/11 11/10

137,2 137.2: 7,68 7/8/9 7.68 7/8/9

136,1 136.1: 15/16/17 15/16/17

135,6 135.6: 15/16/17 15/16/17

135 135: 15/16/17 15/16/17

121,3 121.3: 14 14

120,5 120.5: 7,68 7/8/9 7.68 7/8/9

120,3 120.3: 7,42 7/8/9 7.42 7/8/9

112,3 112.3: 12/13 12/13

112 112: 12/13 12/13

102,3 102.3: 5,34 24 5.34 24

77,4 77.4: 26 26

71,2 71.2: 4,97 30 4.97 30

69,9 69.9: 3,6 29 3.6 29

68,8 68.8: 4,24 27 4.24 27

65,7 65.7: 4,77 4 4.77 4

57,2 57.2: 3,96 5 3.96 5

54,7 54.7: 4,24 39/40 4.24 39/40

53,5 53.5: 4,32 39/40 4.32 39/40

51,3 51.3: 4,24 33 4.24 33

47,3 47.3: 4,15/4,12 31 4.15 / 4.12 31

41,6 41.6: 1,6 35/36 1.6 35/36

41,5 41.5: 1,6 35/36 1.6 35/36

37,2 37.2: 2,4 41 2.4 41

37 37: 3,45 44/45 3.45 44/45

34,4 34.4: 2,4 42/43 2.4 42/43

34 3. 4: 3-2,7 44/45 3-2.7 44/45

33,8 33.8: 2,4 42/43 2.4 42/43

30,6 30.6: 1,75 25 1.75 25

25,9 25.9: 1,6 37/38 1.6 37/38

25,8 25.8: 1,6 37/38 1.6 37/38

23,5 23.5: 0,9 34 0.9 3. 4

23,3 23.3: 0,9 34 0.9 3. 4

57 57

Desplazamientos químicos 13C y 1H 22,1 21,7 17,4 17,5 Chemical shifts 13C and 1H 22.1 21.7 17.4 17.5: HMOC para 1H 0,9 0,9 1,35/1,34 1,29/1,27 Asignación 34 34 32 28 HMOC for 1H 0.9 0.9 1.35 / 1.34 1.29 / 1.27 Assignment 34 34 32 28

LISTA DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

[0373] 5 <110> MEDAREX, INC. [0373] 5 <110> MEDAREX, INC.

<120> Compuestos de profármacos activados por CD10 <120> CD10 activated prodrug compounds

10 10: <130> AHB/FP6196349 <130> AHB / FP6196349

<140> EP 02746852.9 <141> 11-06-2002 <140> EP 02746852.9 <141> 06-11-2002

15 fifteen: <150> PCT/US02/21135 <151> 11-06-2002 <150> PCT / US02 / 21135 <151> 06-11-2002

20 twenty: <150> US 60/297.596 <151> 11-06-2001 <160> 126 <150> US 60 / 297,596 <151> 06-11-2001 <160> 126

<170> PatentIn versión 3.1 <170> PatentIn version 3.1

25 25: <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence

30 30: <220> <223> Sintetizada químicamente <220> <223> Chemically synthesized

35 35: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Beta-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Beta-alanine

<400> 1 <400> 1

imagen2image2

40 45 40 45: <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Sintetizada químicamente <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized

50 fifty: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Beta-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Beta-alanine

<400> 2 <400> 2

imagen2image2

<210> 3 <210> 3

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico <223> Tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid

<400> 3 <400> 3

<210> 4 <210> 4

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Tienilalanina <223> 2-Thienylalanine

<400> 4 <400> 4

imagen2image2

<210> 5 <210> 5

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Naftilalanina <223> 2-Naphthylalanine

<400> 5 <400> 5

<210> 6 <210> 6

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

imagen2image2

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido 4-(aminometil)benzoico <223> 4- (aminomethyl) benzoic acid

<400> 6 <400> 6

<210> 7 <210> 7

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 7 <400> 7

<210> 8 <210> 8

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 8 <400> 8

<210> 9 <210> 9

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Tienilalanina <220> <223> 2-Thienylalanine <220>

imagen2image2

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 9 <400> 9

<210> 10 <210> 10

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Naftilalanina <223> 2-Naphthylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 10 <400> 10

<210> 11 <210> 11

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 11 <400> 11

<210> 12 <210> 12

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido 4-(aminometil)benzoico <223> 4- (aminomethyl) benzoic acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 12 <400> 12

<210> 13 <210> 13

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 13 <400> 13

<210> 14 <210> 14

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 14 <400> 14

<210> 15 <210> 15

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 15 <400> 15

imagen2image2

<210> 16 <210> 16

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<400> 16 <400> 16

imagen2image2

<210> 17 <210> 17

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Tienilalanina <223> 2-Thienylalanine

<400> 17 <400> 17

<210> 18 <210> 18

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 2-Naftilalanina <223> 2-Naphthylalanine

<400> 18 <210> 19 <400> 18 <210> 19

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 19 <400> 19

<210> 20 <210> 20

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido 4-(aminometil)benzoico <223> 4- (aminomethyl) benzoic acid

<400> 20 <400> 20

<210> 21 <210> 21

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 21 <400> 21

<210> 22 <210> 22

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220> <213> Artificial Sequence <220>

imagen2image2

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 22 <400> 22

<210> 23 <210> 23

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 23 <400> 23

<210> 24 <210> 24

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 24 <400> 24

<210> 25 <210> 25

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 25 <400> 25

imagen2image2

<210> 26 <210> 26

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2) <222> (2) .. (2)

<223> N-metil-alanina <223> N-methyl-alanine

<400> 26 <400> 26

<210> 27 <210> 27

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 27 <400> 27

<210> 28 <210> 28

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 28 <400> 28

<210> 29 <210> 29

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2) <222> (2) .. (2)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<400> 29 <400> 29

imagen2image2

<210> 30 <210> 30

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 30 <400> 30

<210> 31 <210> 31

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 31 <400> 31

<210> 32 <210> 32

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 32 <400> 32

<210> 33 <210> 33

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 33 <400> 33

<210> 34 <210> 34

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 34 <210> 35 <400> 34 <210> 35

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 35 <400> 35

<210> 36 <210> 36

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 36 <400> 36

imagen2image2

<210> 37 <210> 37

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-beta-alanina <223> 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-beta-alanine

<400> 37 <400> 37

imagen2image2

<210> 38 <210> 38

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

5 5: <220> <223> Sintetizada químicamente <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Metil-succinil-beta-alanina <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Methyl-succinyl-beta-alanine

<400> 38 <400> 38

15 fifteen: <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia artificial <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence

<220> <223> Sintetizada químicamente <220> <223> Chemically synthesized

25 25: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1).. (1) <223> Succinil-beta-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Leucina-doxorrubicina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4) <223> Leucine-doxorubicin

<400> 39 <400> 39

35 35: <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia artificial <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence

<220> <223> Sintetizada químicamente <220> <223> Chemically synthesized

45 Four. Five: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Beta-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Beta-alanine

<400> 40 <400> 40

55 55: <210> 41 <210> 41

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 41 <400> 41

<210> 42 <210> 42

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-isoleucina <223> Succinyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 42 <400> 42

<210> 43 <210> 43

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-leucina <223> Succinyl-leucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

imagen2image2

<400> 43 <400> 43

imagen2image2

<210> 44 <210> 44

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 44 <400> 44

<210> 45 <210> 45

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-leucina <223> Succinyl-leucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3).. (3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 45 <400> 45

<210> 46 <210> 46

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1)

imagen2image2

<223> Succinil-leucina <223> Succinyl-leucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Glicina-doxorrubicina <223> Glycine-doxorubicin

<400> 46 <400> 46

<210> 47 <210> 47

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 47 <400> 47

<210> 48 <210> 48

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 48 <400> 48

<210> 49 <210> 49

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<400> 49 <400> 49

imagen2image2

<210> 50 <210> 50

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-alanina <223> Succinyl-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 50 <400> 50

<210> 51 <210> 51

<211> 5 <211> 5

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> p-Glutamato <223> p-Glutamate

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5) <222> (5) .. (5)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 51 <400> 51

imagen2image2

<210> 52 <210> 52

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

5 5: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> D-Alanine

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Leucina-daunorrubicina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4) <223> Leucine-daunorubicin

<400> 52 <400> 52

15 fifteen: <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence

<220> <223> Sintetizada químicamente <220> <223> Chemically synthesized

25 25: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Leucina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> D-Leucine

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Leucina-daunorrubicina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5) <223> Leucine-daunorubicin

<400> 53 <400> 53

35 35

<210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence

<220> <223> Sintetizada químicamente <220> <223> Chemically synthesized

45 Four. Five: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Leucina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> D-Leucine

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D-alanina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2) <223> D-Alanine

55 55: <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Leucina-daunorrubicina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (5) <223> Leucine-daunorubicin

imagen2image2

<400> 54 <400> 54

imagen2image2

<210> 55 <210> 55

<211> 6 <211> 6

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Acetil-histidina <223> Acetyl-histidine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6) <222> (6) .. (6)

<223> Glutamina-doxorrubicina <223> Glutamine-doxorubicin

<400> 55 <400> 55

<210> 56 <210> 56

<211> 7 <211> 7

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Morfolinocarbonil-histidina <223> Morpholinocarbonyl-histidine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7) <222> (7) .. (7)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 56 <400> 56

imagen2image2

<210> 57 <210> 57

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1)

<223> N-(2-hidroxipropil)metacrilamida-glicina <223> N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide-glycine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Glicina-doxorrubicina <223> Glycine-doxorubicin

<400> 57 <400> 57

imagen2image2

<210> 58 <210> 58

<211> 6 <211> 6

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> N-glutaril-(4-hidroxiprolil)-alanina <223> N-glutaryl- (4-hydroxypropyl) -alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ciclohexilglicina <223> Cyclohexylglycine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6) <222> (6) .. (6)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 58 <400> 58

imagen2image2

<210> 59 <210> 59

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> N-Cbz-Glicina <223> N-Cbz-Glycine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 59 <210> 60 <400> 59 <210> 60

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> N-Cbz-Glicina <223> N-Cbz-Glycine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-PABC-doxorrubicina <223> Leucine-PABC-doxorubicin

<400> 60 <400> 60

<210> 61 <210> 61

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 61 <400> 61

<210> 62 <210> 62

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <221> MISC_FEATURE <220> <221> MISC_FEATURE

imagen2image2

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 62 <400> 62

imagen2image2

<210> 63 <210> 63

<211> 6 <211> 6

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 63 <400> 63

<210> 64 <210> 64

<211> 5 <211> 5

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 64 <400> 64

<210> 65 <210> 65

<211> 11 <211> 11

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 65 <400> 65

imagen2image2

<210> 66 <210> 66

<211> 13 <211> 13

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido piroglutámico <223> Pyroglutamic acid

<400> 66 <210> 67 <400> 66 <210> 67

imagen2image2

<211> 8 <211> 8

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<400> 67 <400> 67

imagen2image2

<210> 68 <210> 68

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sustrato fluorogénico sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized fluorogenic substrate

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Dansilo-D-alanina <223> Dansyl-D-Alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> pN02-fenilalanina <223> pN02-phenylalanine

<400> 68 <400> 68

imagen2image2

<210> 69 <210> 69

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-éster bencílico <223> Leucine-benzyl ester

<400> 69 <210> 70 <400> 69 <210> 70

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<400> 70 <400> 70

<210> 71 <210> 71

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Alil-succinil-beta-alanina <223> Allyl-succinyl-beta-alanine

<400> 71 <400> 71

<210> 72 <210> 72

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Alil-succinil-beta-alanina <223> Allyl-succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 72 <210> 73 <400> 72 <210> 73

imagen2image2

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-metionina <223> Succinyl-methionine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 73 <400> 73

<210> 74 <210> 74

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-fenilalanina <223> Succinyl-phenylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 74 <400> 74

<210> 75 <210> 75

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <220> <223> Succinyl-beta-alanine <220>

imagen2image2

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-pNA <223> Leucine-pNA

<400> 75 <400> 75

imagen2image2

<210> 76 <210> 76

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 76 <400> 76

<210> 77 <210> 77

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4).. (4) <222> (4) .. (4)

<223> Fenilalanina-daunorrubicina <223> Phenylalanine-daunorubicin

<400> 77 <400> 77

imagen2image2

<210> 78 <210> 78

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Isoleucina-daunorrubicina <223> Isoleucine-daunorubicin

<400> 78 <400> 78

imagen2image2

<210> 79 <210> 79

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido succinil-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico <223> Succinyl-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4).. (4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 79 <400> 79

imagen2image2

<210> 80 <210> 80

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-tienilalanina <223> Succinyl-2-thienylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 80 <210> 81 <400> 80 <210> 81

imagen2image2

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-naftilalanina <223> Succinyl-2-naphthylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 81 <400> 81

<210> 82 <210> 82

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 82 <400> 82

imagen2image2

<210> 83 <210> 83

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido succinil-4-(aminometil)benzoico <223> Succinyl-4- (aminomethyl) benzoic acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 83 <400> 83

<210> 84 <210> 84

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido succinil-aminoisobutírico <223> Succinyl aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 84 <400> 84

<210> 85 <210> 85

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 85 <400> 85

<210> 86 <210> 86

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-tienilalanina <223> Succinyl-2-thienylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 86 <400> 86

<210> 87 <210> 87

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-naftilalanina <223> Succinyl-2-naphthylalanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 87 <400> 87

<210> 88 <210> 88

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <221> MISC_FEATURE <220> <221> MISC_FEATURE

imagen2image2

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 88 <400> 88

imagen2image2

<210> 89 <210> 89

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 89 <400> 89

imagen2image2

<210> 90 <210> 90

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido succinil-aminoisobutírico <223> Succinyl aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Ácido aminoisobutírico <223> Aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 90 <400> 90

<210> 91 <210> 91

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Fenilalanina-daunorrubicina <223> Phenylalanine-daunorubicin

<400> 91 <400> 91

<210> 92 <210> 92

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Isoleucina-daunorrubicina <223> Isoleucine-daunorubicin

<400> 92 <400> 92

<210> 93 <210> 93

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

imagen2image2

<223> Ácido-succinil-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico <223> Succinyl-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 93 <400> 93

<210> 94 <210> 94

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <213> Artificial sequence 15

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-tienilalanina <223> Succinyl-2-thienylalanine

<220> 25 <221> MISC_FEATURE <220> 25 <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 94 <400> 94

imagen2image2

<210> 95 <210> 95

<211> 4 <211> 4

<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial <212> PRT 35 <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-2-naftilalanina <223> Succinyl-2-naphthylalanine

45 <220> 45 <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 95 <400> 95

imagen2image2

<210> 96 <210> 96

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 96 <400> 96

imagen2image2

<210> 97 <210> 97

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 97 <400> 97

imagen2image2

<210> 98 <210> 98

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Ácido succinil-aminoisobutírico <223> Succinyl aminoisobutyric acid

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 98 <400> 98

imagen2image2

<210> 99 <210> 99

<211> 4 5 <212> PRT <211> 4 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina 15 <223> Succinyl-beta-alanine 15

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Isoleucina-daunorrubicina <223> Isoleucine-daunorubicin

<400> 99 <400> 99

<210> 100 25 <211> 4 <210> 100 25 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) 35 <223> Succinil-beta-alanina <222> (1) .. (1) 35 <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Isoleucina-daunorrubicina <223> Isoleucine-daunorubicin

<400> 100 <400> 100

imagen2image2

45 <210> 101 45 <210> 101

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE 55 <222> (1)..(1) <221> MISC_FEATURE 55 <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-daunorrubicina <223> Leucine-daunorubicin

<400> 101 <400> 101

<210> 102 <210> 102

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-beta-alanina <223> Succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Glicina-doxorrubicina <223> Glycine-doxorubicin

<400> 102 <400> 102

<210> 103 <210> 103

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-isoleucina <223> Succinyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 103 <400> 103

<210> 104 <210> 104

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220> <213> Artificial sequence <220>

imagen2image2

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2) <222> (2) .. (2)

<223> N-metil-alanina <223> N-methyl-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-isoleucina <223> Succinyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 104 <400> 104

<210> 105 <210> 105

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-isoleucina <223> Succinyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2) <222> (2) .. (2)

<223> N-metil-alanina <223> N-methyl-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 105 <400> 105

<210> 106 <210> 106

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <223> Succinil-leucina <222> (1) .. (1) <223> Succinyl-leucine

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2) <222> (2) .. (2)

<223> N-metil-alanina <223> N-methyl-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 106 <400> 106

<210> 107 <210> 107

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-isoleucina <223> Succinyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 107 <400> 107

<210> 108 <210> 108

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Succinil-leucina <223> Succinyl-leucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Glicina-doxorrubicina <223> Glycine-doxorubicin

<400> 108 <210> 109 <400> 108 <210> 109

imagen2image2

<211> 39 <211> 39

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

<400> 109 <400> 109

imagen2image2

<210> 110 <210> 110

<211> 30 <211> 30

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

imagen3image3

<210> 111 <210> 111

<211> 30 <211> 30

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

imagen4image4

<210> 112 <210> 112

<211> 30 <211> 30

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

imagen5image5

<210> 113 <210> 113

<211> 30 <211> 30

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

imagen6image6

<210> 114 <210> 114

<211> 32 <211> 32

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cebador sintetizado químicamente <223> Chemically synthesized primer

<400> 114 <400> 114

imagen2image2

<210> 115 <210> 115

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> 9-flourenilmetiloxicarbonil-isoleucina <223> 9-flourenylmethyloxycarbonyl-isoleucine

<400> 115 <400> 115

<210> 116 <210> 116

<211> 3 <211> 3

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-isoleucina <223> 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-isoleucine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3) <222> (3) .. (3)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 116 <400> 116

imagen2image2

<210> 117 <210> 117

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<400> 117 <400> 117

imagen2image2

<210> 118 <210> 118

<211> 4 5 <212> PRT <211> 4 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-beta-alanina 15 <223> 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-beta-alanine 15

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 118 <400> 118

imagen2image2

<210> 119 25 <211> 4 <210> 119 25 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) 35 <223> 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-beta-alanina <222> (1) .. (1) 35 <223> 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-OBn <223> Leucine-OBn

<400> 119 <400> 119

imagen2image2

45 <210> 120 45 <210> 120

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine

5 <220> 5 <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-OBn <223> Leucine-OBn

<400> 120 <400> 120

<210> 121 <210> 121

<211> 4 15 <212> PRT <211> 4 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina 25 <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine 25

<400> 121 <400> 121

<210> 122 <210> 122

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> 35 <223> Sintetizada químicamente <220> 35 <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) 45 <223> Leucina-doxorrubicina <222> (4) .. (4) 45 <223> Leucine-doxorubicin

<400> 122 <400> 122

<210> 123 <210> 123

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

55 <220> 55 <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

imagen2image2

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine

<400> 123 <400> 123

<210> 124 <210> 124

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Metil-hemisuccinil-beta-alanina <223> Methyl-hemisuccinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 124 <400> 124

<210> 125 <210> 125

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Beta-alanina <223> Beta-alanine

<400> 125 <400> 125

<210> 126 <210> 126

<211> 4 <211> 4

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Sintetizada químicamente <223> Chemically synthesized

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

imagen2image2

<222> (1)..(1) <222> (1) .. (1)

<223> Alil-succinil-beta-alanina <223> Allyl-succinyl-beta-alanine

<220> <220>

<221> MISC_FEATURE <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4) <222> (4) .. (4)

<223> Leucina-doxorrubicina <223> Leucine-doxorubicin

<400> 126 <400> 126

imagen2image2

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN REFERENCES CITED IN THE DESCRIPTION

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. This list of references cited by the applicant is solely for the convenience of the reader. It is not part of the European patent document. Despite the care taken in the collection of references, errors or omissions cannot be excluded and the EPO denies any responsibility in this regard.

imagen7image7

10 10

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción Different patent literature cited in the description

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de diseño de un profármaco in vitro, comprendiendo el método: 1. A method of designing an in vitro prodrug, the method comprising:

(1)(one): proporcionar un oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m, en la que: provide an oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ’- (AA) m, in which:

n y m son números enteros, AAP2 representa cualquier aminoácido, AAP1 representa cualquier aminoácido, AAP1’ representa cualquier aminoácido, y cada AA representa independientemente un aminoácido, n and m are whole numbers, AAP2 represents any amino acid, AAP1 represents any amino acid, AAP1 ’represents any amino acid, and each AA independently represents an amino acid,

(2)(2): unir el oligopéptido en un primer sitio de unión del oligopéptido a un grupo estabilizante que obstaculice la escisión del oligopéptido por enzimas presentes en sangre completa; binding the oligopeptide at a first site of binding of the oligopeptide to a stabilizing group that hinders cleavage of the oligopeptide by enzymes present in whole blood;

en el que el grupo estabilizante se selecciona entre: ácido succínico, ácido adípico, ácido glutárico, ácido ftálico, ácido diglicólico, ácido fumárico, ácido naftaleno dicarboxílico, ácido piroglutámico, ácido acético, ácido 1- o 2naftilcarboxílico, ácido 1,8-naftildicarboxílico, ácido aconítico, ácido carboxicinámico, ácido triazol dicarboxílico, ácido glucónico, ácido 4-carboxifenil borónico, ácido polietilen glicólico, ácido butano disulfónico, ácido maleico, ácido nipecótico, ácido isonipecótico, y está unido al extremo N-terminal, wherein the stabilizing group is selected from: succinic acid, adipic acid, glutaric acid, phthalic acid, diglycolic acid, fumaric acid, naphthalene dicarboxylic acid, pyroglutamic acid, acetic acid, 1- or 2-naphthylcarboxylic acid, 1,8-naphthyldicarboxylic acid , aconitic acid, carboxycinnamic acid, dicarboxylic triazole acid, gluconic acid, 4-carboxyphenyl boronic acid, polyethylene glycolic acid, disulfonic butane acid, maleic acid, nipecotic acid, isonipecotic acid, and is attached to the N-terminal end,

o entre: or between:

(3)(3): unir directa o indirectamente el oligopéptido a un agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, directly or indirectly binding the oligopeptide to a therapeutic agent at a second oligopeptide binding site,

en el que las etapas (2) y (3) pueden realizarse en cualquier orden o al mismo tiempo, y en el que además se forma un conjugado por realización de las etapas (1) a (3), in which steps (2) and (3) can be performed in any order or at the same time, and in which a conjugate is also formed by performing steps (1) to (3),

(4)(4): ensayar si el conjugado es escindible por CD 10 y PSA; y test whether the conjugate is cleavable by CD 10 and PSA; Y

(5)(5): seleccionar el conjugado como profármaco si: (i) la escisión del conjugado es superior al 10% por hora tras la incubación del conjugado y la enzima CD10 en condiciones experimentales que sirvan de modelo de las condiciones fisiológicas; y (ii) la velocidad de escisión por PSA no es superior al 15% de la velocidad de escisión de Suc-Ala-Leu-Ala-Leu conjugado por el extremo carboxilo terminal con el mismo agente terapéutico que el conjugado. select the conjugate as a prodrug if: (i) the conjugate cleavage is greater than 10% per hour after incubation of the conjugate and the CD10 enzyme under experimental conditions that serve as a model of physiological conditions; and (ii) the cleavage rate by PSA is not greater than 15% of the cleavage rate of Suc-laAla-Leu-Ala-Leu conjugated by the carboxyl terminal end with the same therapeutic agent as the conjugate.

2.2.: El método de la reivindicación 1, en el que n es de 0 a 3, m es de 0 a 3 y m + n no es más de 3, del oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m. The method of claim 1, wherein n is from 0 to 3, m is from 0 to 3 and m + n is not more than 3, from the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA ) m.

3.3.: El método de la reivindicación 1, en el que AAP1 del oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m se selecciona entre el grupo que consiste en arginina, alanina, glicina, leucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, glutamina, valina y serina. The method of claim 1, wherein AAP1 of the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 '- (AA) m is selected from the group consisting of arginine, alanine, glycine, leucine, methionine, proline , phenylalanine, tyrosine, glutamine, valine and serine.

4.Four.: El método de la reivindicación 1, en el que AAP1’ del oligopéptido de fórmula (AA)n AAP2 -AAP1-AAP1’-(AA)m se selecciona entre el grupo que consiste en leucina, isoleucina, fenilalanina, valina, tirosina y prolina. The method of claim 1, wherein AAP1 'of the oligopeptide of formula (AA) n AAP2 -AAP1-AAP1' - (AA) m is selected from the group consisting of leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tyrosine and proline .

5.5.: El método de la reivindicación 1, en el que AAP1-AAP1’ del oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m se selecciona entre el grupo que consiste en Arg-Leu, Gly-Trp, Arg-Ile, Arg-Phe, Arg-Val, Ala-Phe, Asp-Phe, Ala-Leu, Gly-Phe, Gly-Leu, Leu-Phe, Leu-Tyr, Met-Leu, Pro-Phe, Pro-Tyr, Pro-Leu, Phe-Leu, Phe-Phe, Tyr-Ile, Tyr-Pro, Tyr-Leu, Gln-Phe, Val-Tyr, Val-Phe y Ser-Leu. The method of claim 1, wherein AAP1-AAP1 'of the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1' - (AA) m is selected from the group consisting of Arg-Leu, Gly-Trp, Arg-Ile, Arg-Phe, Arg-Val, Ala-Phe, Asp-Phe, Ala-Leu, Gly-Phe, Gly-Leu, Leu-Phe, Leu-Tyr, Met-Leu, Pro-Phe, Pro- Tyr, Pro-Leu, Phe-Leu, Phe-Phe, Tyr-Ile, Tyr-Pro, Tyr-Leu, Gln-Phe, Val-Tyr, Val-Phe and Ser-Leu.

6.6.: El método de la reivindicación 1, en el que el oligopéptido incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en Ala-Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Ala-Ile-Ala-Leu, Leu-Ala-Leu, Met-Ala-Leu y Phe-Ala-Leu. The method of claim 1, wherein the oligopeptide includes a sequence selected from the group consisting of Ala-Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Ala-Ile-Ala-Leu, Leu-Ala-Leu , Met-Ala-Leu and Phe-Ala-Leu.

7.7.: El método de la reivindicación 1, en el que AAP1’ del oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m es un aminoácido hidrófobo. The method of claim 1, wherein AAP1 'of the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1' - (AA) m is a hydrophobic amino acid.

8.8.: El método de la reivindicación 1, en el que AAP2 del oligopéptido de fórmula (AA)n-AAP2-AAP1-AAP1’-(AA)m es un aminoácido hidrófobo. The method of claim 1, wherein AAP2 of the oligopeptide of formula (AA) n-AAP2-AAP1-AAP1 ′ - (AA) m is a hydrophobic amino acid.

9.9.: El método de la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en agentes alquilantes, agentes antiproliferativos, agentes de unión a tubulina, alcaloides de la vinca, enediinas, podofilotoxinas, la familia de fármacos de la pteridina, taxanos, antraciclinas, dolastatinas, inhibidores de la topoisomerasa, maitansinoides y agentes quimioterápicos de complejos de platino. The method of claim 1, wherein the therapeutic agent is selected from the group consisting of alkylating agents, antiproliferative agents, tubulin binding agents, vinca alkaloids, enediines, podophyllotoxins, the pteridine family of drugs, taxanes, anthracyclines, dolastatins, topoisomerase inhibitors, maitansinoids and chemotherapeutic agents of platinum complexes.

5 5

10. El método de la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en doxorrubicina, daunorrubicina, vinblastina, vincristina, caliqueamicina, etopósido, fosfato de etopósido, CC-1065, duocarmicina, KW-2189, metotrexato, metopterina, aminopterina, diclorometotrexato, docetaxel, paclitaxel, epitiolona, combretastatina, fosfato de combretastatina A4, dolastatina 10, dolastatina 11, dolastatina 15, topotecán, 10. The method of claim 1, wherein the therapeutic agent is selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, vinblastine, vincristine, calicheamycin, etoposide, etoposide phosphate, CC-1065, duocarmycin, KW-2189, methotrexate , metopterin, aminopterin, dichloromethotrexate, docetaxel, paclitaxel, epitiolone, combretastatin, combretastatin phosphate A4, dolastatin 10, dolastatin 11, dolastatin 15, topotecan,

10 camptotecina, mitomicina C, porfiromicina, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, fludarabina, tamoxifeno, arabinósido de citosina, arabinósido de adenosina, colchicina, halicondrina B, cisplatino, carboplatino, mitomicina C, bleomicina, melfalán, cloroquina, ciclosporina A, maitansina, un derivado de cualquiera de los anteriores y un análogo de cualquiera de los anteriores. 10 camptothecin, mitomycin C, porphyromycin, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, fludarabine, tamoxifen, cytosine arabinoside, adenosine arabinoside, colchicine, halicondrine B, cisplatin, carboplatin, mitomycin C, bleomycin, melphalanine, chloroquine, A, chloroquine , a derivative of any of the above and an analog of any of the foregoing.

15 fifteen