ES2362376T3 - Nanopartículas para la administración de ácido nucleico. - Google Patents

Nanopartículas para la administración de ácido nucleico. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARNip que comprende las etapas de: a. Proporcionar una solución de quitosana b. Proporcionar una solución de ARNip c. Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b d. Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que se formen nanopartículas de quitosana/ARNip - en el que la nanopartícula de quitosana/ARNip no comprende un reticulante inicial y - en el que el peso molecular de la quitosana es mayor de 10 kDa y - en el que la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%.

Description

Antecedentes
La administración de ácidos nucleicos en células diana es de interés por diversas razones. Por ejemplo, el uso de
5 plásmidos de expresión y moléculas antisentido como fármacos de terapia génica ha estado impedido por malas técnicas de administración. Además, una técnica de administración mejorada podría expandir el uso de los llamados aptámeros, para incluir también dianas celulares. Los aptámeros son ácidos nucleicos que se pliegan en una estructura tridimensional que les permite interaccionar con moléculas diana con elevada afinidad y especificidad.
Otra clase de ácidos nucleicos que ha traído una atención masiva recientemente son los ARN interferentes pequeños y los microARN. Estos complejos de ARN bicatenarios pueden mediar diversas modificaciones de ácidos nucleicos diana en la célula. En este proceso, la cadena antisentido del complejo actúa como guía, ya que la cadena antisentido puede hibridar con ácidos nucleico diana que tienen tramos de complementariedad de secuencia con la cadena antisentido.
La eliminación mediada por ARN de la expresión proteica a nivel de ARN mensajero (ARNm) ofrece una nueva
15 estrategia terapéutica para superar enfermedades. El proceso por el cual el ARN interferente pequeño (ARNip) modula la escisión inducida enzimáticamente del ARNm homólogo y la interrupción concomitante de la expresión génica (interferencia de ARN) se ha estudia extensivamente como una herramienta para investigar los procesos celulares en células de mamífero. La interferencia de ARN se ha demostrado usando ARNip dirigido contra genes responsables de patogénesis vírica, cáncer y afecciones inflamatorias. Como consecuencia, la posibilidad de silenciar genes implicados en enfermedades usando ARNip ha conducido a una rápida evolución en el área del descubrimiento de fármacos.
Las moléculas de ARN también pueden incluir el silenciamiento transcripcional. El silenciamiento transcripcional inducido por ARN es una forma de interferencia de ARN por el cual moléculas cortas de ARN - microARN (miARM) o ARN interferente pequeño (ARNip) - desencadenan la regulación negativa de la transcripción de un gen particular o
25 región genómica. Esto se consigue habitualmente por modificación de histonas, a menudo por metilación, o por la inducción de formación de heterocromatina.
La eficacia de un fármaco se determina por la capacidad de migrar a través del cuerpo y alcanzar sitios diana a niveles terapéuticamente relevantes. La inyección de ARNip desnudo en ratones ha provocado una eliminación génica localizada. Un inconveniente, sin embargo, es el requisito de elevadas dosis debido a la inestabilidad del ARN y la captación celular no específica e impracticabilidad de este procedimiento para uso humano. Se han desarrollado sistemas de administración virales y no virales para superar las barreras extracelulares e intracelulares que restringen el uso terapéutico de fármacos basados en ácido nucleico.
Las nanopartículas de polielectrolito formadas por el autoensamblaje de ADN plasmídico con policationes, ampliamente usado en administración génica, se han adoptado para el uso de ARNip. Los vectores de polímero
35 catiónico y ARNip basado en lípidos han demostrado entrar en las células y mediar la interferencia de ARN específica in vitro e in vivo. La eficacia de los sistemas de nanopartículas está limitada por la rápida eliminación de la circulación por la captura de células fagocíticas mononucleares o por interacciones catiónicas no específicas con membranas biológicas y tejido conectivo. Un enfoque alternativo para la administración de fármacos tanto local como sistémico es la explotación de las vías mucosas, por ejemplo, nasal, para evitar el mecanismo de eliminación hepática del primer paso asociado con administración intravenosa. El polisacárido quitosana, usado satisfactoriamente para la administración de fármacos nasales debido a sus propiedades mucoadhesivas y de permeación en la mucosa, se ha utilizado en la formación de nanopartículas de polielectrolitos que contienen plásmidos para la expresión génica en sitios respiratorios y tejido sistémico.
El documento WO03092739 desvela un procedimiento para producir un complejo de quitosana y ácido nucleico. Los
45 oligómeros catiónicos usados en la producción tiene un peso molecular entre 500 y 10.000 Da, y el ácido nucleico se selecciona entre el grupo que consiste en ARN y ADN.
El documento WO 2005/113770 desvela nanopartículas revestidas con quitosana cargadas con ARNip anti-RhoA administrado por vía IV. El peso molecular de la quitosana en las nanopartículas varía de 2000 a 8000 Da.
El documento WO 03/030941 desvela la preparación de una composición impregnando partículas de quitosana con una solución concentrada de ASO, y después por secado rápido de modo que suceda la unión del ADN o ARN a la quitosana.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al campo de ácidos nucleicos y su administración en células. En particular, la invención se refiere a nanopartículas que comprenden moléculas de ARNip y procedimientos para la preparación de dichas nanopartículas usando quitosana. Son de interés porque pueden usarse en investigación básica y potencialmente como medicamentos.
Descripción detallada de la invención
El término quitosana como se usa en este documento tiene el mismo significado que el general en la técnica. Es decir, quitosana se refiere a un polisacárido lineal compuesto por D-glucosamina -(1-4)-enlazada (unidad desacetilada) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) distribuidas aleatoriamente. La quitosana se produce típicamente por desacetilación de quitina, que es el elemento estructural en el exoesqueleto de crustáceos (cangrejos, camarones, etc.). El grado desacetilación en quitosanas comerciales está en el intervalo del 60-100%.
Un objeto de la presente invención es proporcionar una nanopartícula para la administración de moléculas de ARNip, en particular moléculas de ARNip que son capaces de modular la expresión génica u otras actividades bioquímicas en la célula.
Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una nanopartícula de ARNip y quitosana que comprende las etapas de:
a.
Proporcionar una solución de quitosana
b.
Proporcionar una solución de ARNip
c.
Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b
d.
Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que las nanopartículas de quitosana/ARNip formen una solución de ARNip, donde las nanopartículas de quitosana/ARNip no comprenden un reticulante inicial, y donde el peso molecular de la quitosana es de más de 10 kDa y, donde la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%.
En una realización preferida de la invención, la solución de ARNip comprende moléculas de ARNip de una longitud de menos de 100 nucleótidos. En otras realizaciones, las moléculas de ARNip son de una longitud de menos de 90 nucleótidos, de menos de 80 nucleótidos, de menos de 70 nucleótidos, de menos de 60 nucleótidos, de menos de 50 nucleótidos, de menos de 40 nucleótidos, de menos de 30 nucleótidos y de menos de 22 nucleótidos, respectivamente.
En una realización preferida de la invención, la solución de ARNip comprende complejos de ARNip de una o más moléculas de ARNip, donde la cantidad total de nucleótidos en el complejo de ARNip es de menos de 100 nucleótidos. En otras realizaciones, la cantidad total de nucleótidos es de menos de 90 nucleótidos, de menos de 80 nucleótidos, de menos de 70 nucleótidos, de menos de 60 nucleótidos, de menos de 50 nucleótidos, de menos de 40 nucleótidos y de menos de 30 nucleótidos, respectivamente.
Moléculas de ARN y complejos
Una molécula de ARNip como se usa en este documento es un tramo de ribonucleótidos unidos covalentemente. Cuando interaccionan dos o más moléculas de ARN, por ejemplo, a través del apareamiento de bases, se forma un complejo de ARN. Por tanto, como se usa en este documento, un complejo de ARN comprende dos o más moléculas de ARN. Las moléculas de ARN de un complejo pueden ser idénticas o pueden ser diferentes entre sí.
Preferiblemente, son capaces de formar pares de bases entre sí de tal modo que se forme un dúplex sobre parte de
o la longitud completa de las moléculas de ARN.
Las moléculas de ARN pueden modificarse por modificaciones químicas y pueden comprender desoxinucleótidos, nucleótidos LNA, fosforotioatos, etc.
Que las moléculas de ARN de tamaño relativo pequeño puedan formar nanopartículas junto con la quitosana es sorprendente ya que la quitosana se ha usado previamente para la formación de nanopartículas con plásmidos que son mucho más grandes. Un plásmido pequeño es típicamente de al menos 5000 pares de bases, es decir, 10.000 nucleótidos. Además, los plásmidos son típicamente 100% bicatenarios.
El ARN es un ARN interferente pequeño (ARNip).
Reticulante inicial
El procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARN, la quitosana no comprende un reticulante inicial.
La expresión reticulante inicial se usa para un reticulante que se añade a la quitosana para formar una partícula, antes de añadir la molécula de ARN. Las nanopartículas de quitosana/plásmido pueden preformarse usando un reticulante inicial tal como polifosfato. Por tanto, se cree que la estructura y actividad de una partícula formada sin un reticulante inicial difiere de la de una partícula formada con un reticulante inicial. En particular, el uso de un reticulante inicial parece implicar que el ARN se distribuirá en la superficie de la partícula preformada, mientras que cuando se usa el ARN como reticulante, el ARN se distribuirá uniformemente a través de la partícula. Se espera que una distribución uniforme tenga un efecto positivo sobre la bioestabilidad de las moléculas de ARN de la nanopartícula, ya que serán menos accesibles para las RNasas.
Además, la omisión del reticulante inicial proporciona un procedimiento más fácil de preparación. En lugar de un procedimiento de dos etapas, donde las partículas se forman primero y después se añade el ARN, se proporciona un procedimiento de una etapa en el que el ARN y la quitosana se mezclan para formar nanopartículas directamente.
Por tanto, en una realización preferida, el ARN funciona como reticulante en la formación de una nanopartícula. En otras palabras, el ARN es el componente de formación activa.
Concentraciones
Concentración de ARN
En una realización del procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARN, la solución de ARN comprende ARN a una concentración seleccionada entre el grupo que consiste en al menos 5 M, al menos 10 M, al menos 20 M, al menos 30 M, al menos 40 M, al menos 50 M, al menos 60 M, al menos 70 M, al menos 80 M, al menos 90 M y al menos 100 M.
Concentración de quitosana
En otra realización, la solución de quitosana comprende quitosana a una concentración entre el grupo que consiste en al menos 50 g/ml, al menos 60 g/ml, al menos 70 g/ml, al menos 80 g/ml, al menos 90 g/ml, al menos 110 g/ml, al menos 120 g/ml, al menos 130 g/ml, al menos 140 g/ml, al menos 150 g/ml, al menos 160 g/ml, al menos 170 g/ml, al menos 180 g/ml, al menos 190 g/ml, al menos 200 g/ml, al menos 250 g/ml, al menos 500 g/ml, al menos 750 g/ml y al menos 1000 g/ml.
Grado de desacetilación
La quitosana tiene un grado de desacetilación seleccionado entre el grupo que consiste en al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos 80%, al menos el 85% y al menos el 95%.
Peso molecular de la quitosana
El peso molecular de la quitosana es de más de 10 kDa. En otra realización, el peso molecular es de más de 50 kDa e incluso más preferiblemente es un peso molecular de más de 80 kDa.
Como se resume en la sección de ejemplos, las muestras de quitosana con un peso molecular por encima de 80 kDa y un grado de desacetilación por encima del 50% son particularmente favorables.
Proporción N:P
Los parámetros mencionados anteriormente pueden usarse todos para controlar las características de la nanopartícula formada.
Otro parámetro importante es la llamada proporción N:P, definida en este documento como proporción de grupos amino de quitosana (N) a grupos fosfato de ARN (P).
En una realización preferida, la nanopartícula se forma a una proporción N:P mayor de 50. Los experimentos documentan que el aumento de la proporción N:P, conduce a partículas más grandes. En otras realizaciones, la proporción N:P se selecciona entre el grupo que consiste en una proporción N:P mayor de 60, mayor de 70, mayor de 80, mayor de 90, mayor de 100 y mayor de 150.
En esta realización preferida, donde la proporción N:P es mayor de 50, la solución de ARNip comprende ARN a una concentración inferior a 100 M, tal como inferior a 90 M, inferior a 80 M, inferior a 70 M, inferior a 60 M, inferior a 50 M, inferior a 40 M, inferior a 30 M, inferior a 20 M, inferior a 10 M, inferior a 5 M o inferior a 1 M.
Cuando se emplea una elevada proporción N:P y una baja concentración de ARN, pueden formarse nanopartículas que comprenden quitosana débilmente unida.
Como el grado de quitosana débilmente unida depende tanto de la concentración de ARN en la solución de ARNip como de la proporción N:P, los especialistas en la técnica apreciarán como manipular estos parámetros para crear nanopartículas con quitosana unida débilmente. Por ejemplo, una elevada concentración de ARN de la solución de ARN puede usarse, si también se mantiene la proporción N:P elevada, es decir, se usa una elevada concentración de quitosana.
En una realización, la nanopartícula que comprende quitosana unida débilmente tiene una elevada proporción N:P.
Una nanopartícula con quitosana unida débilmente es de interés, por ejemplo, para mejorar la administración a la mucosa. Por lo tanto, en una realización, la nanopartícula con quitosana unida débilmente es para administración a la mucosa.
Una partícula nanoparticulada con un carácter discreto es de interés, por ejemplo, para administración sistémica. Dicha partícula también puede formarse controlando diversos parámetros implicados en el procedimiento para forma la nanopartícula. Particularmente, una baja proporción N:P favorece la formación de una nanopartícula discreta. Como se ha mencionado anteriormente, la concentración de ARN y quitosana pueden variarse manteniendo al mismo tiempo una proporción N:P razonablemente constante.
Procedimiento concentrado frente a proporción N:P
En esta realización, la proporción N:P es inferior a 70 tal como, aunque sin limitación, una proporción N:P inferior a 60, inferior a 50, inferior a 40, inferior a 30, inferior a 20 o inferior a 10, respectivamente.
En una realización, la nanopartícula de carácter discreto tiene una baja proporción N:P.
En otra realización, la concentración de la solución de ARNip es de al menos 100 M, tal como, aunque sin limitación, al menos 250 M, al menos 200 M, al menos 150 M, al menos 90 M, al menos 80 M, al menos 70 M, al menos 60 M o al menos 50 M, respectivamente.
Usando una elevada concentración de ARN en la solución de ARNip resulta que tiene varias ventajas. Como se resume en la sección de ejemplos, cuando las partículas se forman usando una solución de ARNip con una concentración de 250 M, las partículas son más discretas y monodispersas, en comparación con partículas formadas usando una solución de ARN prediluida de 20 M (como puede observarse a partir de las mediciones PDI en la tabla 3). Además, resulta sorprendente que las nanopartículas formadas usando la solución de ARNip concentrada tienen un efecto más específico, es decir, no dan lugar a cualquier eliminación no específica, que puede ser el caso para partículas formadas usando una solución de ARNip con una concentración inferior de ARN.
Además, usando una alta concentración de ARN en la solución de ARNip permite la formación de partículas a un bajo pH tal como pH 4,5, que a su vez hace que las partículas sean más estables. Usando un pH ligeramente superior de 5,5 también es posible. Un pH de 5,5 puede disminuir los efectos perjudiciales del tampón acetato sobre la viabilidad celular.
Además, usando una alta concentración de ARN en la solución de ARNip implica que la cantidad de ARN en las partículas aumente, lo que disminuye la cantidad de solución de partículas que tiene que administrarse a una célula u organismo.
En otra realización, la concentración de quitosana es de menos de 250 g/ml.
En una realización preferida particular, la concentración de quitosana es menos de 250 g/ml, mientras que la concentración de ARN es mayor de 100 M.
Controlando las concentraciones de ARN y quitosana, y de este modo la proporción N:P, también puede controlarse el tamaño de las partículas (como se documenta en la sección de ejemplos). Por tanto, en una realización, el tamaño de la partícula está entre 10 y 500 M.
En otra realización, las partículas formadas son de forma discreta y tienen un índice de polidispersidad inferior a 0,4.
Administración
Las nanopartículas pueden usarse tanto para administración sistémica como para administración a la mucosa.
Además, tanto las nanopartículas de forma discreta como las nanopartículas con quitosana unida débilmente pueden usarse para administración en aerosol.
Las gotas del aerosol pueden controlarse controlando el tamaño de las nanopartículas o parámetros tales como las presiones de aire y líquido en los dispositivos de aerosolización. Por tanto, en una realización, las gotas del aerosol están caracterizadas en que son más pequeñas de 30 m de diámetro.
Además del procedimiento para preparar una nanopartícula, otro aspecto de la invención es la nanopartícula formada por el procedimiento.
Procedimiento de tratamiento
Se describe un procedimiento de tratamiento que comprende las etapas de:
a.
Proporcionar una nanopartícula preparada por el procedimiento de la invención
b.
Administrar dicha nanopartícula a un sujeto que lo necesite.
Como la parte de ARN de la nanopartícula puede usarse para modular la actividad de una diana particular, una nanopartícula que comprenda el ARNip puede usarse para tratamiento. Si, por ejemplo, el ARN es un ARNip, la secuencia del ARNip puede diseñarse de modo que la secuencia esté dirigida específicamente a un ARNm. Por tanto, si se sabe que una proteína particular está causando enfermedad o una afección no deseada, la expresión de la proteína puede regularse negativamente usando un ARNip que se dirija al ARNm que codifica la proteína. De este modo, la enfermedad o afección puede aliviarse. Esto es muy conocido en el campo del ARN interferentes pequeños y microARN. También puede usarse ARN antisentido para dirigirse con especificidad de secuencia a un ARNm. Los aptámeros típicamente tendrán una proteína como diana, que sin embargo, también los hacen adecuados para agentes terapéuticos.
El tratamiento comprende la administración de la nanopartícula a la mucosa.
La mucosa se selecciona entre el grupo de administración al tracto respiratorio (tracto respiratorio superior y/o inferior), administración oral (esófago, estómago, intestino delgado y grueso) o tracto genitourinario (por ejemplo, ano, vagina).
Otro aspecto de la invención es una nanopartícula preparada por el procedimiento descrito anteriormente para su uso como medicamento.
Y otro aspecto más de la invención usa la nanopartícula preparada por los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para tratamiento seleccionado entre el grupo de tratamiento del cáncer, tratamiento de infecciones víricas tales como influenza, e infecciones bacterianas, por ejemplo, tuberculosis y tratamientos de afecciones inflamatorias tales como artritis, enfermedad de Cronh y fiebre del heno.
Herramienta de investigación
Se describe un procedimiento para administrar ARN a un mamífero o célula que comprende:
a.
Proporcionar una nanopartícula preparada por el procedimiento de la invención.
b.
Someter dicha célula a la nanopartícula en condiciones que permitan la entrada del ARN.
Dicho procedimiento es, por ejemplo, de interés en investigación básica. Por tanto, el ARNip se usa para generar una eliminación de un gen diana. Dichos experimentos pueden usarse para estudiar la función del gen diana o para estudiar vías de interacción. Dichos estudios pueden ser parte de los llamados ensayos de validación de dianas donde el objetivo es establecer si un gen o producto génico particular puede ser una diana potencial para intervención terapéutica, por ejemplo, por un ARNip. La intervención terapéutica también puede hacerse con una molécula pequeña, un péptido o una proteína tal como un anticuerpo.
La sección de ejemplos demuestra que las nanopartículas de la invención pueden administrar de forma eficaz ARN al interior de células primarias, lo que es típicamente muy difícil en la técnica. En un aspecto del procedimiento para administrar ARN a un mamífero o a una célula, la célula es una célula primaria.
En otro aspecto, la célula es parte de un mamífero. En otro aspecto más, dicho mamífero no es humano.
Otro aspecto más se refiere a un procedimiento para mediar la interferencia de ARN en una célula u organismo que comprende las etapas de
a.
Proporcionar una nanopartícula preparada por el procedimiento descrito anteriormente
b.
Someter dicha célula u organismo a la nanopartícula en condiciones que permitan la entrada del ARN
c.
Mediar de este modo el silenciamiento génico de un gen correspondiente al ARN de la nanopartícula
Leyendas de las figuras:
Fig. 1
Influencia de la concentración de quitosana y ARNip sobre la formación de nanopartículas de quitosana/ARNip.
Imágenes microscópicas de fuerza atómica de nanopartículas de quitosana/ARNip formadas usando 250 g/ml de quitosana; N:P 71 (Panel A), N:P 6 (Panel B) y quitosana 1 mg/ml; N:P 285 (Panel C), N:P 23 (Panel D). Los insertos muestran representaciones de partículas grandes dentro de la imagen. (Imagen grande 6x6 m, barra de escala 600 nm; Inserto 1x1 m, barra de escala 250 nm).
Fig. 2
Captación de células vivas de nanopartículas de quitosana/ARNip en células NIH 3T3.
Se usó microscopia de fluorescencia para visualizar la captación celular y la translocación de ARNip marcado con Cy5 (100 nM/pocillo) dentro de las nanopartículas de quitosana (A, 1 h; c, 4 h; y C, 24 h). Las imágenes muestran la superposición fluorescente de ARNip (marcado con Cy5 rojo) y los núcleos (marcado con Hoechst azul) adyacente a la imagen de contraste de fase (barra de escala, 10 Am).
Fig. 3
Interferencia de ARN mediada por nanopartículas en la línea celular EGFP-H1299.
(A) Transfección de la línea celular EGFP-H1299 con nanopartículas de quitosana/ARNip específicas de EGFP (NP)
o TransIT/TKO/ARNip específico de EGFP (TKO) durante 4 h (ARNip 50 nM/pocillo) con o sin cloroquina (10 M/pocillo). La disminución en la intensidad de fluorescencia media de EGFP, detectada por citometría de flujo a las 48 h después de la transfección, se usó como medida de la eliminación de EGFP (normalizado al porcentaje de células EGFP no tratadas de control, las barras de error representan +/- DT). También se muestran controles de nanopartículas de quitosana/ARNip no coincidentes con EGFP (NP) o TransIT/TKO/ARNip no coincidente con EGFP (TKO). (B) Viabilidad celular EGFP-H1299 después del tratamiento con las mismas formulaciones usadas en el estudio de transfección (normalizado a al porcentaje de células no tratadas de control) (las barras de error representan +/- DT).
Fig. 4
Interferencia de ARN mediada por nanopartículas en macrófagos primarios.
Se muestra la eliminación de EGFP en macrófagos aislados de ratones transgénicos EGFP. (A) Micrografía fluorescente que muestra la captación de nanopartículas de quitosana después de 4 h (Panel A, imagen clara; Panel B, ARNip marcado con Cy5 (rojo)). Macrófagos EGFP no tratados (Panel C, imagen clara; Panel D, fluorescencia de EGFP celular (verde)). Fluorescencia celular de macrófagos 24 h después de la transfección con ARNip específico de EGFP (100 nM/pocillo durante 4 h) con TransIT-TKO (TKO) (Panel E-F) y nanopartículas de quitosana (NP) (Panel G-H). (B) Análisis citométrico de flujo de la fluorescencia de la fluorescencia EGFP de macrófagos. Además, se presenta el análisis de células transfectadas con ARNip 200 nM. Se usaron macrófagos primarios peritoneales aislados de ratones no verdes como un EGFP negativo.
Fig. 5
Interferencia de ARN pulmonar en el ratón EGFP transgénico.
Se contó la cantidad de células endoteliales que expresan EGFP de los bronquiolos, por microscopia de fluorescencia, en secciones pulmonares de 3 m tomadas de ratones EGFP (n=2-3) dosificados por vía nasal con nanopartículas de quitosana/EGFP-ARNip (30 g de ARNip por día durante 5 días) (dos experimentos diferentes presentados). Las imágenes representativas muestran la fluorescencia de EGFP (verde) y los núcleos teñidos con DAPI (azul) solapantes dentro de la región del bronquiolo de ratones de control (Panel A) y ratones tratados con nanopartículas de quitosana/ARNip específico de EGFP (Panel B). Se presentan las cantidades de células EGFP positivas expresadas como un porcentaje (%) de 200 células epiteliales contadas en C (experimento 1, ratones no tratados usados como control) y la cantidad total de células EGFP positivas (#) del pulmón izquierdo completo se presentan en D (experimento 2, EGFP no coincidente usado como control).
Fig. 6
Protección de las nanopartículas contra la degradación de ARNip inducida por el suero.
Se visualizó la migración electroforética de quitosana/ARNip (N:P 71 y 6) en presencia de suero de ternera fetal (FCS) al 10% (4 h, 37ºC) +/- poli(ácido aspártico) (PAA) (30 min, 37ºC) usando un gel de poliacrilamida al 10% (150230V, 2 h). Carril 1, ARNip desnudo; Carril 2, ARNip desnudo en FCS al 10%; Carril 3, nanopartículas (N:P 71); Carril 4, nanopartículas (N:P 71) en FCS al 10 %; Carril 5, nanopartículas (N:P 71) en FCS+PAA; Carril 6, nanopartículas (N:P 6); Carril 7, nanopartículas (N:P 6) en FCS; Carril 8, nanopartículas en FCS+PAA. Las nanopartículas se cargaron a la misma concentración de ARNip.
Fig. 7
Evaluación de citotoxicidad celular de nanopartículas de quitosana/ARNip.
Las nanopartículas de quitosana/ARNip formadas usando 250 g/ml de quitosana; N:P 71 (A), N:P 6 (B) y 1 mg/ml de quitosana; N:P 285 (C), N:P 23 (D) se añadieron a células NIH 3T3 a una concentración de ARNip 50 nM. Después de 24 h, se usó la captación celular de CellTitre Aqueous, un reactivo en solución, para medir la viabilidad celular (normalizado al porcentaje de células no tratadas de control) (las barras de error representan +/- DT).
Fig. 8
Eliminación de la proteína de fusión de leucemia BCR/ABL-1 en la línea celular K562 (Ph+).
Se transfectaron células K562 (Ph+) con ARNip específico de BCR/ABL 50 nM dentro de partículas de quitosana durante 24 h. A las 48 h después de la transfección, se detectó la cantidad de proteína BCR y BCR/ABL por transferencia de western usando un anticuerpo policlonal de conejo contra el extremo N de BCR. (A) Secuencia diana de ARNm de BCR/ABL-1, (B) ARNip específico de BCR/ABL-1, (C) Carril 1, línea celular no tratada; Carril 2, nanopartículas de ARNip no específico/quitosana; Carril 3, nanopartículas de ARNip específico de BCR/ABL1/quitosana. El transcrito no dirigido hnRNP C1 se usa como control interno. El histograma expresa los niveles de proteína detectados como un porcentaje de la eliminación de BCR/ABL-1.
Fig. 9
Efecto del Pm y el DD de la quitosana sobre el tamaño (A), el potencial zeta (B) de formulaciones de quitosana/ARNip.
Fig. 10
Imágenes AFM de formulaciones de quitosana/ARNip formadas con diferentes muestras de quitosana a una proporción N:P de 50:1 sobre superficie de mica.
Fig. 11
Efecto del Pm y el DD de la quitosana sobre la estabilidad del complejo de formulaciones de quitosana/ARNip.
Carril 1: ARNip-eGFP; Carril 2: C9-95/GFP; Carril 3: C12-77/GFP; Carril 4: C65-78/GFP; Carril 5: C114-84/GFP; Carril 6: C170-84/GFP; Carril 7: C173-54/GFP; Carril 8: C9-95/GFP + poli(ácido aspártico) (PAA); Carril 9: C1277/GFP + PAA; Carril 10: C65-78/GFP + PAA; Carril 11: C114-84/GFP + PAA; Carril 12: C170-84/GFP + PAA; Carril
13: C173-54/GFP + PAA. Fig. 12 Eficacia de silenciamiento génico y citotoxicidad de nanopartículas de quitosana/ARNip a una proporción N:P de
50:1.
(A) Transfección in vitro de nanopartículas preparadas con 6 muestras de quitosana de diferente Pm y DD; (B)
ensayo de citotoxicidad de nanopartículas preparadas con 6 muestras de quitosana de diferente Pm y DD. Se incluyen células no transfectadas (control), nanopartículas preparadas con reactivo de trasnfección comercial, Mirus TransIT TKO®, como control positivo.
Fig. 13 Eficacia de silenciamiento génico y citotoxicidad de nanopartículas de quitosana/ARNip a una proporción N:P de
150:1.
(A) Transfección in vitro de nanopartículas preparadas con 6 muestras de quitosana de diferente Pm y DD; (B)
ensayo de citotoxicidad de nanopartículas preparadas con 6 muestras de quitosana de diferente Pm y DD. Se incluyen células no transfectadas (control), nanopartículas preparadas con reactivo de trasnfección comercial, Mirus TransIT TKO®, como control positivo.
Fig. 14
Efecto de proporciones N:P sobre la estabilidad del complejo de nanopartículas formuladas con quitosana (C17084). Carril: ARNip-eGFP; Carril 2: 2:1; Carril 3: 10:1; Carril 4: 50:1; Carril 5: 150:1. Fig. 15 AFM que muestra la comparación morfológica de nanopartículas formadas usando adiciones directas de ARNip
(procedimiento concentrado) o ARNip prediluido (procedimiento diluido).
Ejemplos Ejemplo 1
Resultados Caracterización fisicoquímica Se descubrió que todas las formulaciones de quitosana/ARNip tenían un radio hidrodinámico inferior a 350 nm por
análisis PCS (Tabla 1). Tabla 1: Espectroscopia de correlación de fotones de nanopartículas de quitosana//ARNip
Tamaño (nm)/(Índice de Polidispersión) Potencial zeta (mV)
Formulación Ausencia de sal Presencia de sal
10 min 1h 24h
A (N:P 71) 181,6 (0,22) 173,2 (0,23) 175,9 (0,23) 176,4 (0,22) 26,8 (1,06) B (N:P6) 223,6 (0,19) 219,7 (0,21) 232,3 (0,23) 228,1 (0,20) 18,8 (2,11)
C (N:P 285) 139,0 (0,48) 132,8 (0,49) 138,0 (0,52) 136,3 (0,51) 29,5 (0,50) D (N:P 23) 328,0 (0,24) 310,0 (0,23) 314,2 (0,24) 319,4 (0,23) 31,1 (0,74)
A, B 250 g/ml de quitosana (Pm 114 kDa) y C, D 1 mg/ml de quitosana (Pm 114 kDa), incubación en NaCl 0,15 M antes de tomarse las lecturas; el tamaño y el potencial promedio de 3 determinaciones, la DT del potencial zeta en paréntesis.
El tamaño de formación de nanopartículas dependía de la proporción N:P (definida como la proporción de grupos amino de quitosana (N) a grupos fosfato de ARN (P)) con un aumento en tamaño a N:P inferior. A bajas concentraciones de quitosana (250 g/ml), las nanopartículas formadas a N:P 71 (formulación A) medía 181,6 nm 10 pero aumentaba hasta 223,6 nm a N:P 6 (formulación B). De forma similar, a altas concentraciones de quitosana (1 mg/ml) el radio hidrodinámico de la nanopartícula aumentaba de 139 nm a N:P 285 (formulación C) a 328 nm a N:P 23 (formulación D). Esto sugiere que más enlaces ARNip forman puentes entre las cadenas de quitosana a niveles de ARNip aumentados lo que conduce a mayor incorporación de quitosana y posible agregación entre partículas. La observación de que el nivel de saturación de quitosana se alcanzaba en todas las formulaciones (verificado por 15 detección de quitosana en el filtrado de partículas, datos no mostrados) confirma a ARNip como el determinante del tamaño de la nanopartícula. La adición de sal durante 24 h no tenía efecto sustancial sobre el radio hidrodinámico de las formulaciones estudiadas. Esto puede deberse a fuerzas repulsivas entre las partículas que son significativamente más fuertes que la auto asociación hidrófoba después de la neutralización de la carga. Las mediciones del potencial zeta mostraron que todas las formulaciones tenían una carga positiva neta mayor de 18 mV 20 (A, 26,8, B, 18,8, C, 29,5 y D 31,1), lo que refleja un exceso de quitosana a N:P mayor de 1,0 (confirmado por análisis en gel de urea ácida de quitosana, datos no mostrados). La disminución del potencial zeta (18,8 mV) en B formado a niveles inferiores de quitosana (250 g/ml) y alto ARNip refleja una mayor incorporación de quitosana y reducción en el material libre. La microscopia de fuerza atómica reveló una distribución polidispersada de nanopartículas predominantemente esféricas (Fig. 1). Era evidente una población de complejos discretos
25 extremadamente pequeños (54-78 nm) en todas las formulaciones (Fig. 1A-D). También se observaron estructuras grandes mayores de 250 nm (el tamaño depende de la concentración de quitosana y ARNip), lo que sugiere el reclutamiento de estructuras más pequeñas en agregados (Fig. 1 insertos A-D). Se formaron complejos de una longitud promedio de 600 nm con las concentraciones más altas de quitosana y ARNip (Fig. 1 inserto D).
La migración electroforética de ARNip se usó para investigar la formación de complejos y la estabilidad de las
30 nanopartículas (figura 6). El retardo del ARN dentro del gel mostró una formación de complejos entre la quitosana y el ARNip a N:P 71 y 6. De forma interesante, se observó una migración más lenta a mayor proporción N:P lo que sugiere la influencia de cantidades aumentadas de un exceso de quitosana libre sobre la estabilidad de las partículas. El requisito del desplazamiento polianiónico con PAA para liberar el ARN de las nanopartículas confirmó las interacciones electrostáticas de quitosana/ARNip. Además, el ARNip intacto se mantuvo después de la liberación
35 de las nanopartículas incubadas en suero (N:P 71 y 6) mientras que el ARN desnudo no formulado se degradaba. Esto sugiere que la quitosana protege de forma eficaz al ARNip contra la descomposición por nucleasas.
Estudios celulares
Se investigó el tráfico intracelular de nanopartículas que contenían ARNip marcado con Cy5 (N:P 36) en células NIH 3T3 vivas usando microscopia de epifluorescencia semi-confocal (Fig. 2). La fluorescencia resaltada dentro de las 40 regiones apicales de las células, que definen los límites celulares, fue visible después de 1 h (Fig. 2A). A las 4 h, la
fluorescencia podía observase dentro de todas las áreas de la célula incluyendo las regiones nucleares (Fig. 2B). La fluorescencia fue más difusa en aspecto en comparación con imágenes tomadas a 1 h, lo que sugiere posible disociación de las partículas y liberación de ARNip. En contraste, se observó fluorescencia limitada después de 4 h en células transfectadas con ARNip marcado con Cy5 con TransIT-TKO (Fig. 2D). Se halló fluorescencia en toda la célula después de 24 h tanto con nanopartículas como con TransIT-TKO (Fig. 2C y 2E, respectivamente).
Se evaluó la citotoxicidad celular de partículas formuladas con quitosana y TransIT-TKO en células NIH 3T3 usando un ensayo de viabilidad basado en tetrazolio (Fig. 7). Las nanopartículas de quitosana formadas a N:P 71 (formulación A) y 285 (formulación C) redujeron la viabilidad celular (31,5% y 39,8%, respectivamente) cuando se añadían a una concentración de ARNip 50 nM por pocillo. En contrate, y de acuerdo con las células tratadas con TransIT-TKO, la viabilidad celular se mantuvo con nanopartículas de quitosana formuladas a bajo N:P (6 y 23) (formulación B y D, respectivamente) usando la misma concentración de ARNip. Esto sugiere que el exceso de quitosana en las nanopartículas formadas a alto N:P puede disminuir la viabilidad celular con relación a la posible toxicidad asociada con quitosana de alto peso molecular que se ha presentado previamente. Estos datos proporcionaron información y directrices para el desarrollo de formulaciones no citotóxicas (por debajo de N:P 71) llevadas a estudios de transfección posteriores (referencia la a Fig. 3B).
La interferencia de ARN de la expresión de proteínas endógenas se investigó en la línea celular H1299 que contenían un casete de expresión de EGFP integrado de forma estable y en macrófagos primarios de un ratón transgénico EGFP usando nanopartículas que contenían EGFP-ARNip. La disminución en la intensidad de fluorescencia media de EGFP, detectada por citometría de flujo a las 48 h después de la transfección, se usó como medida de la eliminación de EGFP. La Figura 3A muestra una eliminación significativa de EGFP (77,9%) en células H1299 48 h después de la transfección después de una transfección inicial de 4 h con nanopartícula de quitosana
(N:P
57); niveles comparables a TransIT-TKO (78,0%). La eliminación no estaba significativamente influida en presencia del agente endosomolítico cloroquina (66,4%) lo que sugiere la capacidad del sistema de nanopartículas de escapar a los compartimentos endosómicos antes de la interacción del ARN con el ARNm diana. Las nanopartículas de quitosana que contenían ARNip no coincidente de EGFP (desapareamiento de 4 pares de bases) no mostraron eliminación de EGFP, confirmando la especificidad de eliminación. La viabilidad celular en células H1299 se mantuvo después de la adición de las diferentes formulaciones usadas para la transfección (Fig. 3B), disminuyendo la probabilidad de efectos de toxicidad.
La capacidad del sistemas de nanopartículas (N:P 36) de mediar la interferencia en células primarias se evaluó en macrófagos peritoneales aislados de ratones EGFP transgénicos (Fig. 4A y 4B). Los macrófagos, visualizados por microscopia de fluorescencia, mostraron una pérdida casi completa de la fluorescencia EGFP después de 24 h después de la transfección con nanopartículas de quitosana (Fig. 4A, Panel G-H) en comparación con el control no tratado (Fig. 4A, Panel C-D), lo que indica una eliminación significativa. En contraste, las células transfectadas con TransIT-TKO mantenían la expresión de EGFP (Fig. 4A, Panel E-F). Esta tendencia se verificó usando mediciones citométricas de flujo de las muestras (Fig. 4B). Se hallaron altos niveles de eliminación de EGFP en células tratadas con nanopartículas (86,9%) en comparación con TransIT-TKO (sin eliminación detectada) (Fig. 4B). Esto se correlaciona con la ávida captación en macrófagos mostrada por nanopartículas que contenían ARNip marcado con Cy5 (Fig. 4A, Panel A-B). Se ensayó la capacidad de las nanopartículas de eliminar la expresión del oncogen BCR/ABL-1, encontrado en leucemia mielógena crónica, para demostrar el potencial terapéutico del sistema de quitosana (Fig. 8). La línea celular K562 que expresa BCR/ABL-1 se transfectó transitoriamente con nanopartículas
(N:P
57) en complejo con un ARNip específico de fusión o no específico. El análisis de transferencia de western usando un anticuerpo que reconocía la parte N-terminal de BCR demostró una eliminación de BCR/ABL-1 de 90% en células transfectadas con nanopartículas que contenían ARNip específico de BCR/ABL-1.
Interferencia de ARN pulmonar
Se usó un modelo de ratón EGFP transgénico para investigar la capacidad de sistemas basados en quitosana de mediar la eliminación de EGFP después de administración nasal. Ninguno de los ratones pareció tener ningún efecto adverso a partir de la administración nasal diaria de nanopartículas de quitosana (N:P 6) durante el periodo de 5 días. Los ratones se sometieron a una fijación por perfusión del cuerpo completo después del tratamiento con ARNip y se investigaron las secciones pulmonares por microscopia de fluorescencia. En dos experimentos diferentes, los ratones dosificados con nanopartículas que contenían ARNip de EGFP, mostraron claramente cantidades reducidas de células epiteliales que expresaban EGFP en los bronquiolos (43% en comparación con los ratones de control no tratados (experimento 1, Fig 5C) y 37% en comparación con el control no coincidente de EGFP (experimento 2, Fig. 5D)). Se muestran imágenes representativas del control (Fig. 5A) y la eliminación (Fig. 5B). Este fenómeno se observó tanto en las regiones inferiores como superiores del pulmón. La cantidad de células verdes como un porcentaje de 200 células por sección tisular (experimento 1, Fig. 5C) o las cantidades totales en el pulmón izquierdo completo (experimento 2, Fig. 5D) se calculó por recuento estereológico. La presencia de núcleos teñidos con DAPI demostró un límite del bronquiolo epitelial intacto en ratones de control y dosificados con nanopartículas después del tratamiento y procesamiento histológico.
Análisis
Introducimos un nuevo sistema de administración de ARNip basado en quitosana para protocolos de interferencia con ARN, estando basado el fundamento en la explotación de las propiedades de la quitosana para permitir la administración a la mucosa.
Se formaron nanopartículas por autoensamblaje de ARNip a bajas (250 g/ml) y altas (1 mg/ml) concentraciones de quitosana con el ARN de suficiente longitud (21 nucleótidos) para cumplir los requisitos de 6-10 enlaces salinos para
5 formación de un sistema corporativo entre las especies de polielectrolitos. El análisis AFM reveló una población predominante de partículas discretas pequeñas en el intervalo de tamaño de 50 nm y un subpoblación más grande que variaba entre 200-500 nm, lo que sugiere una agregación entre partículas después de la formación de partículas inicial dirigida por entropía. Esto se confirmó por mediciones PCS, que mostraron radios hidrodinámicos pequeños y grandes distribuidos alrededor de una media 180-330 nm. De acuerdo con los requisitos de administración de fármacos, se demostró la liberación de ARNip estructuralmente intacto a partir de las nanopartículas por electroforesis; un pre-requisito esencial para el silenciamiento de genes por ARN mediado por nanovehículos.
Se midió una reducción específica de cómo mucho el 77,9% de la fluorescencia EGFP en una línea celular de carcinoma pulmonar humano EGFP-H1299 transfectada durante 4 h con nanopartículas de quitosana. Estos niveles fueron similares a la eliminación observada en células transfectadas durante el periodo más largo de 24 h con el 15 reactivo de transfección TransIT-TKO. El tiempo de transfección relativamente corto requerido cuando se usa quitosana es probablemente un resultado de la rápida acumulación de ARNip observada en células NIH 3T3 en un periodo de 4 h usando nanopartículas de quitosana. Las propiedades de captación celular de las nanopartículas de quitosana pueden atribuirse al pequeño tamaño de partícula y el exceso de carga positiva que facilita la integración con las membranas celulares. La transfección en presencia del agente endosomolítico cloroquina no aumentó la interferencia de ARN con el sistema de quitosana, lo que indica un mecanismo de escape endosómico para el sistema basado en quitosana. En apoyo a esto, se visualizó una distribución celular difusa de ARNip marcado con Cy5 en todo el citoplasma complejo sin evidencias de compartimentalización en células NIH 3T3. El potencial terapéutico de las nanopartículas de quitosana para la eliminación de proteínas relacionadas con enfermedades se demostró en células K562 que expresaban de forma endógena la proteína BCR/ABL-1. La transfección con un único
25 tratamiento de nanopartículas de quitosana que contenían ARNip con punto de rotura provocó una eliminación específica de alelo de 90%. El sistema de quitosana era el único agente de transfección química, incluyendo alternativas comerciales que mostraban de forma satisfactoria una eliminación de BCR/ABL-1 en esta línea celular en suspensión en nuestros experimentos. (Datos no mostrados). En comparación con otros sistemas de polietilenimina basados en policationes que han presentado eliminación en líneas celulares adherentes, nuestro trabajo muestra una eliminación eficaz en células tanto adherentes como en suspensión.
Los macrófagos son células importantes en enfermedad inflamatoria y vírica y por consiguiente una diana para las terapias de interferencia de ARN. En nuestro experimentos, se usaron macrófagos peritoneales aislados de ratones EGFP transgénicos para evaluar la eliminación basada en quitosana en células primarias y para proporcionar un modelo pre-in vivo apropiado. Se mostraron niveles de EGFP reducidos del 89,3% (en comparación con células no
35 tratadas) en 1 día después de un único tratamiento de 4 h con nanopartículas de quitosana, que se correlaciona con la rápida captación de nanopartículas de quitosana en estas células en menos de 4 h. En contraste, la transfección con TransIT-TKO no dio eliminación significativa de EGFP en las mismas condiciones. En nuestro conocimiento, este es el primer informe que muestra eliminación en macrófagos primarios con un sistema basado en policationes.
La vía nasal ofrece una alternativa no invasiva para la administración sistémica de agentes terapéuticos de ARNip. Proporciona acceso directo al tejido respiratorio y una vía de migración a los sitios sistémicos evitando la eliminación hepática de primer paso. Nuestra estrategia es explotar las propiedades muco-adhesivas y de permeación de la quitosana para una administración eficaz y la interferencia de ARN en los sitios respiratorios como un enfoque para tratar enfermedades pulmonares. El ratón EGFP transgénico usado en nuestros experimentos mostró eliminación significativa de EGFP (43% en comparación con el control no tratado y 37% en comparación con EGFP no
45 coincidente) dentro de las células epiteliales de los bronquiolos después de una dosis nasal de nanopartículas que contenían ARNip específico de EGFP. Esta en la primera documentación en nuestro conocimiento de eliminación dentro de este tipo celular después de administración nasal.
Materiales y procedimientos
Secuencias de ARNip
Se usaron dúplex de ARNip específicos de EGFP que contenían la secuencia: con sentido, 5'GACGUAAACGGCCACAAGUUC-3', anti-sentido, 3'-CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCA-5' y con sentido de EGFP-no coincidente, 5'-GACGUUAGACUGACAAGUUC-3', anti-sentido, 3'-CGCUGAAUCUGACCUGUGGUUCA-5' para estudios de caracterización de nanopartículas y trabajos de interferencia de EGFP. El ARNip de EGFP que contenía una cadena con sentido 5' marcada con Cy5 fluorescente se usó para estudios de captación celular. La secuencia
55 diana del ARNip de BCR/ABL-1: AAGCAGAGUUCAAAAGCCCUU, la secuencia diana de control: AAGGAGAAUAGCA-GAAUGCAU se usaron para eliminación de la proteína de translocación de leucemia.
Formación de nanopartículas de quitosana/ARNip. Se disolvió quitosana (114 kDa) en tampón acetato sódico (NaAc 0,2 M, pH 4,5) para obtener una solución de trabajo de 1 mg/ml o 250 g/ml. Se añadieron 20 l de ARNip (intervalo de 20-250 m) a 1 ml de quitosana filtrada mientras se agitaba y se dejó durante 1 h. Para calcular las proporciones
N:P específicas (definidas como la proporción molar de grupos amino de quitosana/grupos fosfato de ARN) se usó una masa por fosfato de 325 Da para el ARN y una mas por carga de quitosana de 167,88 (desacetilación del 84%).
Espectroscopia de correlación de fotones y determinación de la carga superficial en partículas de quitosana/ARNip.
El tamaño hidrodinámico de complejos de quitosana/ARNip se determinó por espectroscopia de correlación de fotones (PCS). La PCS se realizó a 25ºC en tampón acetato sódico por triplicado con un tiempo de muestreo y un análisis ajustados automáticamente. El tamaño de partículas se presenta como el promedio z de tres mediciones +/- DT. Para investigar el efecto de la sal sobre el tamaño hidrodinámico, se añadió cloruro sódico (concentración final 150 mM) a la solución de partículas en momentos puntuales establecidos antes de la medición. La carga superficial se midió por determinación del potencial z usando un Zetasizer Nano ZS en tampón acetato sódico.
Determinación de la morfología de las nanopartículas usando microscopía de fuerza atómica. Las nanopartículas de quitosana/ARNip se diluyeron 1/10 usando tampón acetato sódico filtrado en 0,2 m. Se inmovilizó un volumen de muestra de 15 l en mica recién escindida. Las muestras se purgaron con N2 y se hicieron imágenes en modo de derivación en condiciones ambiente en un nanoscópio IIIA (Digital Instruments) usando brazos NSG01 (NT-MDT) con un radio de punta menor de 10 nm. Se obtuvieron varias imágenes para cada muestra, asegurando la reproducibilidad de los datos.
Captación celular de nanopartículas de quitosana con ARNip marcado con Cy5. Se cultivaron células NIH 3T3 o macrófagos peritoneales de ratón en placas de 35 mm con partes inferiores de cubreobjetos de vidrio y se transfectaron con sentido marcado con Cy5 100 nM de ARNip de EGFP usando nanopartículas de quitosana (N:P 36) o el reactivo de transfección TransIT-TKO. Las células se transfectaron con las nanopartículas en medio DMEM libre de suero durante 1-4 h después de lo cual se añadió suero al 10%. La transfección con TransIT-TKO se hizo en medio que contenía suero de acuerdo con el protocolo Mirus. Después las células de transfección se sometieron a tinzión Hoechst para visualizar los núcleos. La captación del ARNip dúplex se controló por un microscopio de epifluorescencia semi-confocal Zeiss.
Interferencia de ARN en EGFP expresado en la línea celular humana y macrófagos murinos primarios. La línea celular de cáncer pulmonar humano H1299 producida para expresar de forma estable EGFP (vida media de EGFP 2 h) fue un presente de la Doctora Anne Chauchereau (CNRS, Villejuif, Francia). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (105 células/pocillo) en medio RPMI (que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina al 5%/estreptomicina, y factor de selección 418) 24 h antes de la transfección. El medio se retiró y se reemplazó con 250 l de medio fresco (con o sin FBS). Las células se transfectaron con nanopartículas de quitosana/ARNip o el reactivo de transfección TransIT-TKO a ARNip 50 nM (específico de EGFP o no coincidente de EGFP) por pocillo en presencia o ausencia de cloroquina (10 um por pocillo, añadido 10 minutos antes de la adición de ARNip). Después de 4 h, el medio se reemplazó con 0,5 ml de medio fresco que contenía FBS al 10%. Las células se dejaron durante 48 h y después se retiraron usando un protocolo de tripsina convencional y se resuspendieron en PBS que contenía paraformaldeído al 1%. La fluorescencia celular EGFP se midió usando un citómetro de flujo Becton Dickenson FACSCalibur. Se usa un diagrama de histograma con el logaritmo de la intensidad de fluorescencia verde en el eje x y la cantidad de células en el eje y para definir la intensidad de fluorescencia media de la población celular media definida por propiedades de dispersión (FSC, SSC, no mostrado).
Se sacrificaron animales EGFP transgénicos adultos (C57BL/6-Yg (ACTbEGFP)10sb/J) (Jackson Laboratories, Maine, Estados Unidos de América) por dislocación cervical y se inyectó por intraperitoneal 5 ml de medio MEM que contenía FBS al 20%. El abdomen se agitó suavemente, se expuso el peritoneo y se abrió, y se retiró el medio usando una jeringa. El medio se centrifugó (2500 rpm durante 10 minutos) y el sedimento se resuspendió en medio MEM que contenía FBS al 50%. La suspensión se sembró en una placa de 12 pocillos. Los macrófagos se dejaron adherir durante 2 h antes de retirar el medio (que contenía células no adherentes). Después se añadió medio fresco que contenía penicilina al 5%/estreptomicina a las células. Después de 40 h, se retiró el medio y se reemplazó con medio MEM sin FBS y se añadieron nanopartículas de quitosana/ARNip o TransIT-TKO/ARNip. Después de 4 h, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco que contenía FBS al 10%. Después de 24 h, las células se procesaron y se analizaron para la fluorescencia EGFP usando un citómetro de flujo BD FACSCalibur o se visualizaron usando un microscopio de epifluorescencia semi-confocal Zeiss. Los macrófagos no tratados aislados de ratones C57BL/6J se usaron como controles no fluorescentes.
Interferencia de ARN pulmonar en ratón EGFP. Los ratones EGFP transgénicos (C57BL/6-Yg(ACTbEGFP)10sb/J) usados para los estudios de ARNip in vivo se alojaron en condiciones SFP bajo estricta supervisión veterinaria en Pipeline Biotech A/S (Trige, Dinamarca). Las partículas de quitosana/ARNip se concentraron a 1 mg/ml de ARNip usando concentradores de centrifugal VivaSpin20 (punto de corte de PM de 10 kDa, Vivascience) antes de la dosificación. En dos experimentos diferentes, se administró por vía intranasal un total de 30 l de partículas (15 l por fosa nasal) cada día durante 5 días consecutivos a los ratones EGFP (los ratones C57BL/6J no dosificados se usaron como control en el experimento 1 y EGFP no coincidente como control en el experimento 2). En el día 6, los ratones se anestesiaron con una inyección de 0,14 ml de mezcla de zoletil/mezcla de torbugesic y se fijan por perfusión de forma manual con solución tamponada con fosfato de formaldehído al 4% (Volusol, VWR International). Los pulmones se recogieron, incluyeron en parafina y se cortaron exhaustivamente en secciones de 3 m y se muestreó cada 100º sección junto con la siguiente. Las secciones se transfirieron en DAPI (Sigma, San Louis, Estados Unidos de América) para la tinción con contraste y se montaron en húmedo en un portaobjetos super frost. Los portaobjetos se analizaron en un microscopio de fluorescencia (Olympus BX 51, Tokio, Japón) con un filtro UV/GFP, un objetivo 20X, una cámara digital montada (Olympus DP-70), y una fase motorizada junto con el software CAST (Visiopharm, Copenhague, Dinamarca). Se contó la cantidad de células bronquiales epiteliales que expresaban EGFP por un fraccionador físico.
Ejemplo 2
Materiales y procedimientos
Materiales
Las muestras de quitosana usadas en este estudio se prepararon todas usando procedimientos convencionales (Vårum KM y col., 1994; Ottøy MH y col., 1996; Hirano S y col. 1976; Muzzarelli RAA, Rocchetti R 1985; Khan y col., 2002). Dúplex de ARNip-EGFP (21 pb), secuencia con sentido: 5'-GACGUAAACGGCCACAAGUUC-3', secuencia antisentido: 3'-CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCA-5') y ARNip-EGFP con cuatro desapareamientos de bases (21 pb), secuencia con sentido: 5'-GACUUA-GACUGACACAAGUUC-3', secuencia antisentido: 3'CGCUGAAUCUGACUGUGUUCA-5').
Formulación de nanopartículas de quitosana/ARNip
La quitosana se disolvió en tampón acetato sódico 0,2 M (ajustado a pH 5,5 con hidróxido sódico) a una concentración de 10 mg/ml (solución madre). Se disolvieron 20 l de ARNip (20 m) (salvo que se especifique específicamente) en agua sin RNasa (hasta 100 ó 200 l) y se añadieron a 800 l o 900 l de quitosana filtrada (se usó una concentración diferente de quitosanas, diluidas a partir de la solución madre, para formar complejos con el ARNip a diferentes proporciones N:P) agitando al mismo tiempo y se dejaron durante 1 hora.
Determinación del tamaño y la carga superficial de las nanopartículas de quitosana/ARNip
El tamaño de las nanopartículas se determinó por Espectografía de Correlación de Fotones (PCS) y el potencial zeta por velocimentría Doppler láser (LDV) a 25ºC usando un Zetasizer Nano ZS. El tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas formuladas a diferentes parámetros se presentan como los valores medios de tres mediciones  DT (desviación típica).
Observación de la morfología de nanopartículas de quitosana/ARNip por AFM
Se realizó una captación de imágenes AFM con un Nanoscopio comercial IIIa Multimode SPM de Digital Instruments (Veeco Instruments, Santa Bárbara, CA) en condiciones ambientales. Las muestras se prepararon depositando una gota de 1 l de solución de nanopartículas de quitosana/ARNip sobre superficies de mica recién cortadas y se dejaron secar al aire. Se usaron puntas de silicio con forma en V convencionales (brazos ultra-afilados, NSC11, MikroMasch Alemania) con una frecuencia de resonancia de 45 kHz, una constante de resorte de 1,5 N/m y un radio de punta de 10,0 nm. Las imágenes AFM se obtuvieron en modo de derivación a tasas de exploración de 12 Hz. Las imágenes se aplanaron usando el algoritmo de software DI (excluyendo las partículas del área aplanada) y después se analizaron automáticamente usando el software comercial Scanning Probe Image Processor (SPIP) (Image Metrology ApS).
Evaluación de la estabilidad de las nanopartículas de quitosana/ARNip usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
Se investigó la estabilidad de las nanopartículas de y la integridad del ARNip usando un ensayo de polidesplazamiento. Las muestras se incubaron +/- poli(ácido L-aspártico) (PAA) (5 mg/ml) a una proporción de 1:4 (PAA: complejo) a 37ºC durante 30 minutos. Las muestras después se analizaron por electroforesis usando un gel de poliacrilamida al 10% (Tris-Borato 50 nM, pH 7,9, EDTA 1 mM) a 150-230 V durante 2 h, se tiñeron con tinzión de ácido nucleico SYBR Gold y se visualizaron usando un iluminador de UV.
Silenciamiento génico en una línea celular humana que expresa EGFP
Se sembraron células verdes H1299 (vida media 2 h) en placas de 24 pocillos (105 células/pocillo) en ,edio RPMI (que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina al 5%/estreptomicina, y factor de selección 418) 24 h antes de la transfección. El medio se retiró y se reemplazó con 250 l de medio sin suero y se añadieron nanopartículas de quitosana/ARNip o reactivo de transfección TransIT-TKO a una concentración de ARNip de 50 nM por pocillo. Después de 4 h, se reemplazó el medio con 0,5 ml de medio fresco que contenía FBS al 10%. Las células se dejaron durante 44 h y después se retiraron usando un protocolo de tripsina convencional y se resuspendieron en PBS que contenía paraformaldeido al 1%. Se midió la fluorescencia celular EGFP usando un citómetro de flujo Becton Dickenson FACSCalibur.
Evaluación de la citotoxicidad de nanopartículas de quitosana/ARNip
La citotoxicidad celular de las nanopartículas de quitosana/ARNip en células verdes H1299 se determinó usando un ensayo de viabilidad basado en tetrazolio. Se sembraron células verdes H1299 en medio de cultivo RPMI 1640 + GlutaMax I suplementado con FBS al 10%, penicilina al 1%/estreptomicina y G418, a una densidad de 10.000 células por pocillo en una placa de 96 en un volumen total de pocillo de 100 l, 24 h antes del ensayo. El medio se
5 retiró y se añadieron las partículas de quitasana/ARNip por triplicado y se incubaron durante 4 h en medio sin suero (100 l/pocillo) después de lo cual el medio se reemplazó con medio que contenía suero al 10% (100 l/pocillo).Después de 44 h, se añadieron 20 l de solución de ensayo de proliferación CellTitre 96 Aqueous (Promega Corporation, Estados Unidos de América) a la placa y se dejaron durante 3 h antes medir la absorvancia a 490 nm usando un lector de placas de 96 pocillos (Quant, BioTek Instruments, Inc., Estados Unidos de América).
10 Resultados y análisis
Efecto del Pm y DD de la quitosana sobre el tamaño, el potencial zeta y la morfología de las nanopartículas de quitosana/ARNip
El Pm y el DD son parámetros importantes para la interacción de la quitosana con especies polianiónicas. El Pm se correlaciona con el tamaño físico de las moléculas de quitosana, un alto Pm forma moléculas más largas y más 15 flexibles mientras que Pm inferiores forman moléculas más cortas y tienen cadenas moleculares más rígidas. El valor DD significa el porcentaje de grupos amino primarios desacetilados a lo largo de la cadena molecular, que posteriormente determina la densidad de carga positiva cuando la quitosana se disuelve en condiciones ácidas. Mayores DD dan mayor carga positiva y mayor capacidad de unión a ARNip. Se prepararon muestras de quitosana con Pm 10, 60, 100 y 170 kDa por despolimerización del producto de quitosana disponible en el mercado
20 Chitopharm. Como se presenta en la Tabla 2, la muestra polimérica de 170 kDa también estaba disponible en una forma más acetilada por reacetilación controlada para alcanzar un DD del 55%. Las nanopartículas de quitosana/ARNip se formularon a una proporción N:P de 50 usando diferentes muestras e quitosana (Tabla 2) y se estudió el tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas (Fig. 9).
Tabla 2
Muestras de quitosana con diferente Pm y DD
Muestra C10-95* C10-80 C60-80 C100-80 C170-80 C170-55
Pm (kDa) 10 10 60 100 170 170
DD (%) 95 80 80 80 80 55
*Los números indican Pm (peso molecular, kDa) y DD (el grado de desacetilación, %).
25 Se prepararon nanopartículas usando quitosana C9-95 (bajo Pm y alto DD) que medían  3500 nm y se disminuyó a  500 nm con quitosana C12-77 (bajo Pm y medio DD). Todas las demás muestras de quitosana con DD medio y bajo (C60-78, C100-80, C170-80 y C170-55) produjeron partículas con un tamaño de aproximadamente 200 nm (Fig. 9A). El potencial zeta de todas las formulaciones estaba en intervalo de 10 a 20 mV, lo que sigiere una carga superficial positiva neta debido al exceso de quitosana (Fig. 9B). La carga aumentó ligeramente con el Pm, con la
30 excepción de C170-55 que disminuye probablemente debido a la densidad de carga reducida (DD 55%).
La formación de partículas y el tamaño relativo se confirmó por AFM (Fig. 10A-F). Los complejos grandes formados por la quitosana C10-95 podría ser debido a cadenas más cortas y más rígidas que impedían estericamente la interacción y la incorporación de moléculas de ARNip produciendo un autoensamblaje en forma de barra o círculo y agregación en lugar de formaciones compactas (Fig. 10A). La quitosana C12-77 formaba nanopartículas pero con
35 signos claros de agregación (Fig. 10B). Las muestras de quitosana con mayor Pm y medio DD (C60-80, C100-80 y C170-80) tienen suficiente longitud de cadena y densidad de carga para formar complejos y condensar el ARNip en nanopartículas (Fig. 10C-E).
La molécula de ARNip está compuesta por 21 pb con un Pm de 13,36 kDa, que es 5-10 veces más pequeñas que las moléculas de quitosana (Pm 60-170 kDa) usadas para formar complejos entre polielectrolitos. Por tanto, cuando
40 se mezclan, las moléculas de ARNip probablemente son más fácilmente atraídas por la fuerza electrostática de los grupos amino protonados en las mismas moléculas de quitosana o las adyacentes provocando una conexión de cadenas y un enmarañamiento para formar las nanopartículas.
La muestra de quitosana C170-55 con bajo DD y Pm relativo elevado también puede formar nanopartículas (Fig. 10B), lo que sugiere que moléculas con DD relativamente bajo proporcionan suficiente longitud de cadena y carga
45 para formar complejos con el ARNip. Las interacciones hidrófobas y los enlaces de hidrógenos entre los restos de glucosamina de la quitosana y la estructura específica de las bases orgánicas del nucleótido también pueden contribuir a la densa formación de nanopartículas.
Efecto del Pm y el DD de la quitosana sobre la estabilidad de las nanopartículas de quitosana/ARNip
Se examinó la influencia del Pm y el DD de la quitosana sobre la estabilidad de las partículas observando el comportamiento de migración electroforética en ausencia o presencia de PAA (Fig. 11). En general, la alta estabilidad del complejo estaba correlacionada con la densa morfología de las partículas de tamaño nanométrico mostrada con mayor Pm y DD. Cuando se usaron las muestras de quitosana C10-95 y C10-80, el comportamiento de migración era casi igual que el del control de ARNip (Fig. 11, carriles 1-3) que no mostraba el efecto de retardo habitual con los complejos de polielectrolitos. Esto sugiere que la quitosana con inferior Pm de 10 kDa (incluso con un DD tan alto como del 95%) no puede formar complejos y compactar el ARNip en partículas estables, lo que es contrario a los plásmidos de ADN de más 24 unidades (aproximadamente 4,7 kDa) que forman nanopartículas estables de quitosana/ADN. Una explicación podría ser que las cadenas más largas de ADN pueden ser capaces de compensar las cadenas de quitosana más largas en el procedimiento de ensamblaje. No se observó efecto de retardo sobre la migración del ARNip cuando se usaba C170-55 (Fig. 11, carril 7), lo que sugiere que los complejos con quitosana de baja desacetilación tienen menos interacción de cargas y por consiguiente son inestables. La quitosana con mayor densidad de carga (C60-80, C100-80 y C170-80) retardada la migración del ARNip (Fig. 11, carriles 3-6) verificando la necesidad de una elevada carga para la estabilidad del complejo. En contraste, las nanopartículas de quitosana/ARNip formadas usando quitosanas de Pm y DD comparables muestran un retardo de ADN complejo a inferior proporción N:P de 2:1.
La estabilidad de las nanopartículas es necesaria para la protección de ARNip extracelular; sin embargo, el desensamblaje es esencial para permitir que el ARN media el silenciamiento génico a través de la interacción de componentes intracelulares tales como RISC. Se ha observado que los complejos altamente estables de quitosana/ADN son beneficiosos para la protección del ADN en la vía celular endosómica-lisosómica, pero la liberación insuficiente del ADN de estas partículas al núcleo reduce la expresión génica. Esto implica que un equilibrio suficiente entre la protección y la liberación es de gran importancia para una funcionalidad biológica apropiada que también puede aplicarse a la administración de ARNip.
Usando un procedimiento de intercambio de polianiones, el ARNip se desplazaba rápidamente desde los complejos después de la adición de PAA polianiónico. (Fig. 11, carriles 8-13). Esto sugiere una débil interacción electrostática entre la quitosana y el ARNip que puede disociarse en condiciones intracelulares que permiten la liberación de ARNip y su funcionalidad concomitante. De forma importante, estos ARNip desplazados estaban estructuralmente intactos que confirmó la integridad mantenida del ARNip después de la formación de las nanopartículas.
Silenciamiento génico y citotoxicidad in vitro de nanopartículas de quitosana/ARNip
Se usó la línea celular EGFP de expresión estable (células verdes H1299) para investigar la eficacia del silenciamiento génico de las diversas formulaciones de quitosana/ARNip. En comparación con las células no transfectadas (control negativo), las formulaciones de quitosana/ARNip (N:P 50) preparadas con bajo Pm (C10-95, C10-80) o bajo DD (C170-55) mostraron una casi ausencia o baja eliminación de EGFP, mientras que las preparadas a partir de mayor Pm o DD mostraron mayores eficacias de silenciamiento génico del 45% (C60-80), 54% (C170-80) y 65% (C100-80). En comparación, el TransIT TKO comercial (control positivo) produjo una eliminación de EGFP del 85%. Un ensayo de citotoxicidad realizado usando la misma formulación de quitosana mostró una reducción del 20-40% en la viabilidad celular comparable con el TransIT TKO comercial (Fig. 12B).
Cuando la proporción N:P de las nanopartículas de quitosana/ARNip se aumentaba hasta 150:1, el silenciamiento génico se aumentaba hasta 80% en formulaciones que usaban formulaciones de quitosana de elevado Pm (C10080 y C170-80) comparables con el TransIT TKO comercial (Fig. 13A). La especificidad de la eliminación se confirmó usando formulaciones de ARNip no coincidentes. En contraste, de nuevo se consiguieron bajos niveles de eliminación con quitosanas de bajo Pm y DD. En general, se halló un ligero aumento en la citotoxicidad con formulaciones a N:P 150 en comparación con N:P 50 que puede reflejar la cantidad de quitosana libre en exceso en el sistema. Los niveles, sin embargo, no fueron mayores que los observados para el TransIT TKO comercial (Fig. 13B).
Los resultados de eliminación biológica son completamente coherentes con las propiedades fisicoquímicas descritas de las nanopartículas de quitosana/ARNip, lo que sugiere una correlación entre la estabilidad de las nanopartículas y la eficacia del silenciamiento génico in vitro. Las muestras de quitosana con elevado Pm en el intervalo de 100-170 kDa y un DD cercano al 80% son muy adecuadas para la formulación de sistemas vehículo de ARNip. Estas formulaciones proporcionan un equilibrio eficaz entre la protección y la liberación apropiadas, produciendo elevadas eficacias de silenciamiento génico in vitro equivalente a las que pueden conseguirse con sistemas de formulación comerciales existentes. Como se ha analizado previamente, las muestras de quitosana con elevado Pm y DD tienen cadenas moleculares más largas y una densidad de carga más elevada, lo que posibilita una eficaz interacción del ARNip y la formación de nanopartículas discretas. Las nanopartículas formadas con C100-80 y C170-80 tienen pequeño tamaño, mayor carga superficial y mayor estabilidad del complejo, lo que debe posibilitar que lleguen a endocitarse más fácilmente en las células y a soportar las condiciones endosómicas-lisosómicas antes de la liberación de la carga, provocando una mayor eficacia de silenciamiento génico. Además, con el aumento de la proporción N:P hasta 150:1, la estabilidad del complejo de las nanopartículas aumentaba, indicado por la movilidad más lenta del ARNip en complejo con C170-80 (Fig. 14). El aumento de la estabilidad podría atribuirse niveles aumentados de quitosana unida débilmente a mayor N:P. El exceso de quitosana unida débilmente a la superficie exterior de las nanopartículas puede no sólo promover la unión a superficies celulares aniónicas y la posterior endocitosis, sino que también proporciona protección contra la descomposición del ARNip por enzimas lisosómicas durante el proceso de tráfico intracelular. La explotación de las propiedades endosomolíticas de la quitosana permite
5 la entrada del ARNip en el citoplasma antes de la interacción con RISC. La quitosana se ha usado para aumentar la administración a la mucosa; puede utilizarse el aumento de quitosana sobre la superficie de las nanopartículas para aplicaciones de ARNi en la mucosa.
Conclusión
Se usaron complejos entre polielectrolitos entre la quitosana y el ARNip para formar nanopartículas para la
10 administración de ARNip y aplicaciones de silenciamiento génico. Se demostró que las propiedades fisicoquímicas tales como el tamaño, el potencial zeta y la estabilidad del complejo de las nanopartículas eran muy dependientes de los parámetros estructurales Pm y DD del polímero de quitosana. Se descubrió que las nanopartículas de quitosana/ARNip formadas usando formas de alto Pm (100-170 kDa) y DD (80%) de quitosana a N:P 150 eran las más estables y mostraban la mayor eliminación génica in vitro (80%). Este trabajo demuestra la aplicación de la
15 quitosana como un vehículo no viral para el ARNip y el papel central de las propiedades físicas poliméricas en la optimización de los protocolos de silenciamiento génico.
Ejemplo 3
Este ejemplo muestra una comparación morfológica de las nanopartículas formadas usando adiciones directas de ARNip (procedimiento concentrado) o ARNip pre-diluido (procedimiento diluido) (Tabla 3).
20 Tabla 3: Espectroscopia de correlación de fotones de nanopartículas de quitosana/ARNip preparadas por el procedimiento concentrado o diluido
Formulación Tamaño (nm)/índice de polidispersidad
Quitosana (1mg/ml) 20 m* ARNip 242,9/ 0,57 Quitosana (1 mg/ml) 20 m ARNip 193,0/ 0,37 Quitosana (1 mg/ml) 250 m ARNip 377,1/ 0,23 Quitosana (250 g/ml) 20 m* ARNip 821,2/ 0,83 Quitosana (250 g/ml) 20 m ARNip 206,6/ 0,25 Quitosana (250 g/ml) 250 m ARNip 225,0/ 0,14
*ARNip añadido en volumen diluido; tamaño promedio de 3 determinaciones
El experimento muestra que el uso de una solución de ARN con una elevada concentración de ARN da partículas más pequeñas con un índice de polidispersidad disminuido en comparación con el uso de una concentración inferior 25 de ARN.
Los efectos en la microscopía de fuerza atómica de las cantidades variables de quitosana y ARNip sobre la morfología de las nanopartículas se muestran en la Figura 15.
Esto demuestra una formación más discreta de nanopartículas usando el procedimiento concentrado.
Referencias
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Aarhus Universitet Besenbacher, Flemming Howard, Kenneth Alan Kjems, Jørgen Liu, Xiudong
<120> Nanopartículas para la administración de ácido nucleico
<130> 40738pc01
<160> 10
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 1 gacguaaacg gccacaaguu c 21
<210> 2
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 2 acuuguggcc guuuacgucg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 3 gacguuagac ugacaaguuc 20 <210>4
<211> 23
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 4 acuugguguc cagucuaagu cgc
<210> 5
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 5 aagcagaguu caaaagcccu u
<210> 6
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 6 aaggagaaua gcagaaugca u
<210> 7
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 7 gacguaaacg gccacaaguu c
<210> 8
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 8 acuuguggcc guuuacgucg c
23
21
21
21
21 <210> 9
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
5
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
<400> 9
gacuuagacu gacacaaguu c
21
<210> 10
10
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido de ARN
15
<400> 10
cgcugaaucu gacuguguuc a
21

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Un procedimiento para preparar una nanopartícula de quitosana/ARNip que comprende las etapas de:
    a.
    Proporcionar una solución de quitosana
    b.
    Proporcionar una solución de ARNip
    c.
    Mezclar la solución de la etapa a con la solución de la etapa b
    d.
    Incubar la solución de la etapa c en condiciones de formación de complejos de modo que se formen nanopartículas de quitosana/ARNip
    -
    en el que la nanopartícula de quitosana/ARNip no comprende un reticulante inicial y
    -
    en el que el peso molecular de la quitosana es mayor de 10 kDa y
    -
    en el que la quitosana tiene un grado de desacetilación de al menos el 60%.
  2. 2.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la solución de ARNip comprende ARNip a una concentración de al menos 5 M.
  3. 3.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución de quitosana comprende quitosana a una concentración de al menos 50 g/ml.
  4. 4.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la nanopartícula se forma a una proporción N:P mayor de 50.
  5. 5.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución de ARNip comprende ARNip a una concentración inferior a 100 M.
  6. 6.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la nanopartícula se forma a una proporción N:P inferior a 70.
  7. 7.- El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 ó 6, en el que la concentración del ARNip es mayor de 100 M.
  8. 8.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de quitosana es menor de 250 g/ml.
  9. 9.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tamaño de la partícula está entre 10 y 500 nm.
  10. 10.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas formadas son de forma discretas y tienen un índice de polidispersidad inferior a 0,4.
  11. 11.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula es para administración sistémica o para administración a la mucosa.
  12. 12.- El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula es para administración en aerosol.
  13. 13.- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las gotas del aerosol se caracterizan porque son más pequeñas de 30 m de diámetro.
  14. 14.- Una nanopartícula preparada por el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  15. 15.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso como medicamento.
  16. 16.- Uso de una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, infección vírica tal como la influenza, y la tuberculosis y afecciones inflamatorias tales como artritis, enfermedad de Crohn, y fiebre del heno.
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