ES2362115T3 - Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de individuos que presentan proteína kit mutante. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de `N-(2-cloro-6-metilfenil)- 2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa en un individuo que tiene una quinasa KIT mutante, en la que dicho trastorno se selecciona entre mastocitosis, carcinoma de vejiga, carcinoma de mama, carcinoma de colón, carcinoma de riñón, carcinoma hepático, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma de estómago, carcinoma cervical, carcinoma de tiroides, seminoma testicular, carcinoma de piel, carcinoma de células escamosas, tumores estromáticos gastrointestinales, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma de Burkett, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia promielocítica, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, melanoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwannoma, osteosarcoma, xenoderma pigmentosum, queratoacantoma, cáncer folicular de tiroides, tumores de células germinales no seminomatoso refractario a la quimioterapia y sarcoma de Kaposi.

Description

La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad de las Solicitudes de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/689.113 presentada el 9 de junio de 2005, 60/736.668 presentada el 15 de noviembre de 2005 y 60/748.418 presentada el 8 de diciembre de 2005.

Campo de la invención

La divulgación del presente documento se refiere a proteínas KIT mutantes, y a procedimientos y composiciones de diagnóstico y terapéuticas útiles en el tratamiento de trastornos, por ejemplo cánceres, en los que están implicadas células que expresan dichas proteínas KIT mutantes.

Antecedentes de la invención

El proto-oncogén c-kit codifica la tirosina quinasa transmembrana de tipo III, proteína KIT, que es el receptor del factor de células madre (SCF). KIT se caracteriza estructuralmente por un dominio extracelular (EC) con cinco repeticiones de tipo inmunoglobulina, un solo dominio transmembrana, un dominio yuxtamembrana (“JM”) y un dominio tirosina quinasa citoplásmico. El dominio quinasa consiste en los lóbulos N-terminal (TK1) y C-terminal (TK2) que están separados por un inserto de quinasa hidrófilo. El dominio TK2 contiene el bucle de activación de quinasa (“AL”), una región de bisagra crítica de la quinasa que tiene que asumir una conformación particular para permitir una activación completa de la quinasa.

La secuencia de aminoácidos de una sola letra de la proteína KIT humana de tipo silvestre se muestra en la FIG. 8 (SEC ID Nº: 2) (NP_000213). La secuencia de ácido nucléico de KIT se codifica por los nucleótidos 1-2928 de la secuencia mostrada en la FIG. 9 (SEC ID Nº: 1).

En circunstancias normales, SCF se une a KIT induciendo la homodimerización del receptor que conduce a una actividad quinasa intrínseca y ocasionando la autofosforilación de restos de tirosina. Entonces, KIT se convierte en el sitio de acoplamiento para diversas moléculas de señalización de dominio SH2. El receptor KIT se expresa en melanocitos, mastocitos, células hematopoyéticas primitivas, células germinales primordiales, linfocitos intraepiteliales y células intersticiales de Cajal.

El mesilato de imatinib (también conocido como STI-571) es un potente inhibidor de tirosina quinasa KIT y actualmente es una regla de oro en tumores estromáticos gastrointestinales (“GIST”) avanzados, dirigiéndose a mutaciones de KIT sensibles a imatinib que se autoactivan que están localizadas principalmente en el dominio JM de esta proteína. Como se usa en el presente documento, el término “imatinib” se usa para hacer referencia al mesilato de imatinib o STI-571. Aunque el imatinib es un potente inhibidor de la actividad quinasa de KIT de tipo silvestre y de ciertas isoformas de KIT mutante JM, muchas isoformas de KIT mutante son resistentes a dosis de imatinib que pueden obtenerse clínicamente. El imatinib sólo puede unirse a la conformación inactiva o “cerrada” de KIT. Sin embargo, las mutaciones AL de KIT no sólo activan la actividad quinasa, sino que también estabilizan el bucle de activación en una conformación “abierta” que no permite la unión productiva de imatinib. Se encuentran mutaciones AL de KIT de activación en asociación con LMA, enfermedad de los mastocitos, en particular mastocitosis sistémica (“MS”), una subserie de células NK/T sinonasales y linfoma no Hodgkin, seminoma/disgerminoma y GIST resistente a imatinib. (Véanse, por ejemplo, los documentos US 2004/0253205; US 2005/0054617 y referencias citadas en los mismos).

Las mastocitosis son un grupo muy heterogéneo de trastornos caracterizados por una acumulación anormal de mastocitos en diferentes tejidos, principalmente en la piel y la médula ósea, pero también en el bazo, hígado, ganglios linfáticos y el tracto gastrointestinal, dependiendo de la naturaleza de la enfermedad, y pueden encontrarse aislados o algunas veces asociados con otras malignidades hematológicas en seres humanos. Se han descrito alteraciones del gen de KIT en una proporción significativa de los pacientes. Son particularmente interesantes mutaciones adquiridas que dan como resultado un receptor activado constitutivamente, posiblemente implicado en el mayor número de mastocitos en los tejidos. Debido a la extrema heterogeneidad de los neoplasmas de mastocitos, las enfermedades se han clasificado en categorías diferentes de mastocitosis (véase Metcalfe, J Invest Dermatol. 96:2S-4S (1991)). Los mastocitos están implicados en patologías tumorales, particularmente en mastocitosis sistémicas que son enfermedades hematológicas similares a síndromes mieloproliferativos. También puede encontrarse quinasa KIT mutante en mastocitosis asociadas con otras hemopatías malignas o, con menos frecuencia, en hemopatías aisladas tales como la leucemia mieloide aguda y síndromes mieloproliferativos o mielodisplásicos.

Las mutaciones puntuales de aumento de función de la KIT AL están asociadas con ciertos neoplasmas humanos, incluyendo trastornos sistémicos de mastocitos, LMA, seminoma y GIST (tanto GIST primario como GIST resistente a imatinib). En caso de trastornos de mastocitos, seminoma y LMA, la mutación de KIT asociada más comúnmente es el reemplazo del resto de ácido aspártico normal en el codón 816 del bucle de activación por un resto de valina (D816V) (Akin, C. y D.D. Melcalfe, Ann Rev Med 55 (2004) 419-32; Longley, B.J. y D.D. Metcalfe, Hematology-Oncology Clinics of North America 13. (2000) 697-701; Metcalfe, D.D. y C. Akin, Leukemia Res 25 (2001) 577-82; Tefferi, A. y A. Pardanani, Curr Opin Hematol 11 (2004) 58-64; Valent, P. y col., Hematol. Oncol Clin North Am 17 (2003) 1227-41). La mutación D816V da como resultado una activación constitutiva de la actividad quinasa de KIT y se prevé que ayuda a estabilizar a la AL en la conformación activa. Además de D816V, se han notificado otras mutaciones en las que está implicado el codón 816 en trastornos sistémicos de mastocitos (D816Y, D816F), LMA (D816Y) y/o seminomas (D816Y, D816H). De forma coherente con el modelo estructural de unión de imatinib a KIT, la actividad quinasa de todos estos mutantes es resistente a imatinib.

En vista de la resistencia a imatinib observada en ciertos cánceres con células que contienen ciertas isoformas mutantes de KIT, existe la necesidad de procedimientos y composiciones de diagnóstico y terapéuticas adaptadas para tratar esta afección. Particularmente, existe la necesidad de un tratamiento para cáncer, mastocitosis y trastornos relacionados en los que está implicada una quinasa KIT mutante. La divulgación proporcionada en el presente documento satisface esta necesidad.

Sumario

BMS-354825 es un inhibidor dual de SRC/ABL, competitivo con ATP (Lombardo, L. J., y col., J. Med. Chem., 47: 6658-6661 (2004)). Particularmente, BMS-354825 puede inhibir mutaciones BCR-ABL AL que se encuentran en algunos pacientes con LMC con resistencia clínica adquirida a imatinib. Algunos inhibidores de SRC/ABL de molécula pequeña también tienen potencia contra la quinasa KIT. La divulgación del presente documento se basa en el descubrimiento de que BMS-354825 inhibe la actividad quinasa de isoformas de KIT tanto mutantes como de tipo silvestre y, por lo tanto, es una terapia adecuada para el tratamiento de un huésped que padece una enfermedad asociada con una actividad quinasa anormal.

La estructura y uso de BMS-354825 como agente anticanceroso se describe en Lombardo, L. J., y col., J. Med. Chem., 47:6658-6661 (2004) y se describe en las siguientes patentes de Estados Unidos y solicitudes en trámite, incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad: Patente de Estados Unidos Nº 6.596.746, concedida el 22 de julio de 2003; Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/395.503, presentada el 24 de marzo de 2003.

El documento WO2004/085388 (BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY, 7 de octubre de 2004) desvela BMS354825 (compuesto IV) y un procedimiento para el tratamiento de un cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de BMS-354825, en el que el cáncer es leucemia mielógena crónica (LMC), tumor estromático gastrointestinal (GIST), cáncer de pulmón microcítico (CMP), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de ovario, melanoma, mastocitosis, tumores de células germinales, leucemia mielógena aguda (LMA); sarcomas pediátricos, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pancreático o cáncer de próstata.

Como se ha descrito anteriormente, ciertas mutaciones en la quinasa KIT hacen que KIT sea resistente a los efectos terapéuticos del imatinib. Un objeto de la presente divulgación es la identificación de un compuesto que puede inhibir la proliferación y/o inducir la apoptosis de células cancerosas que contienen dicha mutación de KIT resistente a imatinib. En el presente documento se proporciona dicho compuesto, útil para inhibir la proliferación y/o inducir la apoptosis de líneas celulares que son resistentes al tratamiento con imatinib.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona composiciones, kits y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de un huésped, preferentemente un ser humano, que tiene o es propenso a padecer una enfermedad asociada con una actividad anormal de proteína quinasa. Específicamente, la divulgación proporciona procedimientos para identificar una quinasa KIT mutante en un huésped que tiene una enfermedad asociada con una actividad anormal de proteína quinasa, y adaptar el tratamiento de dicho huésped basándose en la identificación de dicha quinasa KIT mutante.

La presente divulgación proporciona un procedimiento para determinar la respuesta de un individuo con un trastorno asociado con una proteína tirosina quinasa al tratamiento con ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma, en el que dicho individuo se ha tratado previamente con y ha desarrollado al menos una resistencia parcial a un primer inhibidor de quinasa, o no se ha sometido previamente a ningún tratamiento con inhibidores de quinasa, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo; (b) explorar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT; y (c) asignar el individuo a un grupo de respuesta positiva si se identifica una quinasa KIT mutante. En una realización, la quinasa KIT mutante comprende una mutación de aminoácidos que hace que dicha quinasa KIT sea constitutivamente activa. En otra realización, el trastorno asociado con proteína tirosina quinasa se selecciona del grupo que consiste en mastocitosis y cáncer. En una realización adicional, la quinasa KIT mutante comprende una mutación KIT resistente a imatinib.

La mutación de KIT resistente a imatinib puede comprender una mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº: 2. La mutación puede ser, por ejemplo, D816Y, D816F, D816V o D816H. En algunas realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una biopsia de tejido, sangre, suero, plasma, linfa, líquido ascítico, líquido quístico, orina, esputos, deposiciones, saliva, aspirado bronquial, líquido espinal y pelo. La muestra biológica puede ser una muestra de células de una biopsia de tejido o células cultivadas a partir de dicha muestra.

En algunas realizaciones, la muestra biológica puede comprender células sanguíneas, células extraídas de un tumor sólido o un lisado de una muestra de células.

La presente divulgación proporciona un procedimiento de exploración de una muestra biológica, por ejemplo células que no responden, o que han dejado de responder, o que tienen una respuesta reducida, a inhibidores de quinasa usados para inhibir la proliferación de dichas células. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un procedimiento de exploración de células de un individuo que padece cáncer que se está tratando con imatinib, y cuyas células no responden o han dejado de responder o tienen una respuesta reducida a imatinib, con respecto a la presencia de mutaciones de KIT descritas en el presente documento. La presente divulgación proporciona ciertas mutaciones de KIT que, si están presentes, proporcionan la base sobre la cual alterar el tratamiento de dicho individuo para inhibir la proliferación de dichas células.

La presente divulgación proporciona un procedimiento de exploración de células que no responden, o que han dejado de responder o que tienen una respuesta reducida a inhibidores de quinasa usados para inducir la apoptosis de dichas células. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un procedimiento de exploración de células de un individuo que padece cáncer que se está tratando con imatinib, y cuyas células no responden o han dejado de responder o tienen una respuesta reducida a imatinib, con respecto a la presencia de mutaciones de KIT descritas en el presente documento. La presente divulgación proporciona ciertas mutaciones de KIT que, si están presentes, proporcionan la base sobre la cual alterar el tratamiento de dicho individuo para inducir la apoptosis de dichas células.

La presente divulgación también proporciona un nuevo procedimiento basado en PCR específica de alelo para identificar individuos que padecen un trastorno producido por una quinasa KIT mutante. El procedimiento comprende la etapa de amplificar selectivamente la quinasa KIT mutante a partir de una muestra biológica de un individuo candidato que se sospecha que parece el trastorno, usando un cebador específico para la secuencia mutante y usando simultáneamente un cebador específico para la secuencia de KIT de tipo silvestre. El cebador específico de KIT de tipo silvestre está diseñado de tal forma que no puede extenderse por PCR.

En una realización, el procedimiento comprende la etapa de (a) obtener una muestra biológica a partir de un individuo que se sospecha que padece un trastorno producido por una quinasa KIT mutante, (b) proporcionar un primer cebador que es específico para un ácido nucleico que codifica la quinasa KIT mutante, (c) proporcionar un segundo cebador que es específico para un ácido nucleico que codifica la quinasa KIT de tipo silvestre, en el que el segundo cebador está modificado para prevenir la amplificación del ácido nucleico que codifica la quinasa KIT de tipo silvestre, (d) amplificar selectivamente el ácido nucleico que codifica la quinasa KIT mutante a partir de la muestra biológica usando el primer y segundo cebadores, y (e) detectar la presencia de un producto de amplificación, indicando la presencia de un producto de amplificación que el individuo padece un trastorno producido por una quinasa KIT mutante. En una realización, la quinasa KIT mutante es una mutación de KIT resistente a imatinib, o al menos parcialmente resistente a imatinib. En otra realización, la quinasa KIT mutante es una quinasa KIT mutante constitutivamente activa. La quinasa KIT mutante puede comprender una mutación en el resto de aminoácido 816 de la quinasa KIT. Las mutaciones ejemplares incluyen, sin limitación, D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones el trastorno es cáncer incluyendo, pero sin limitación, trastorno sistémico de mastocitos, leucemia, seminoma o tumor estromático gastrointestinal.

La presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína quinasa, preferentemente un trastorno asociado con una KIT mutante, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida (BMS-354825), o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización, la quinasa KIT mutante es una mutación de KIT resistente a imatinib, o al menos parcialmente resistente a imatinib. En otra realización, la quinasa KIT mutante es una quinasa KIT mutante constitutivamente activa. La quinasa KIT mutante puede comprender una mutación en el resto de aminoácido 816 de la quinasa KIT. Las mutaciones ejemplares incluyen, sin limitación, D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

También se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno asociado con KIT, particularmente un trastorno asociado con KIT mutante, que comprende obtener una muestra de células a partir de un paciente que padece dicho trastorno, ensayar las células con respecto a la presencia de una mutación de KIT, tal como una o más de las descritas en el presente documento, y tratar a dicho paciente con un compuesto o régimen de tratamiento para inhibir la proliferación y/o inducir la apoptosis de dichas células. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede se rapamicina.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica del individuo; (b) ensayar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de una quinasa KIT mutante; y, si se identifica una quinasa KIT mutante, (c) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de ’N-(2-cloro-6-metilfenil)2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, la quinasa KIT mutante comprende una mutación en la posición de aminoácido 816 de la quinasa KIT (SEC ID Nº:2). La mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº:2 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

También se proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica del individuo; (b) ensayar dicha muestra biológica con respecto a al menos la resistencia parcial a un primer inhibidor de quinasa; (c) ensayar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de una quinasa KIT mutante; y, si se determina que dicha muestra biológica es al menos parcialmente resistente a dicho primer inhibidor de quinasa y contiene una quinasa KIT mutante, entonces (d) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, el primer inhibidor de quinasa es el inhibidor de quinasa Bcr-Abl. En algunas realizaciones, la quinasa KIT mutante comprende una mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº:2. La mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº:2 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, el primer inhibidor de quinasa comprende imatinib. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La presente divulgación proporciona además un procedimiento para establecer un régimen de tratamiento para un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo; (b) explorar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT; y, si está presente al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT en dicha muestra biológica, (c) administrar a dicho individuo como parte de un régimen de tratamiento una composición farmacéutica que comprende ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, dicha al menos una mutación comprende una mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº: 2. La mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº:2 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos un inhibidor de quinasa adicional. En algunas realizaciones, el régimen de tratamiento comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825. La muestra biológica puede ser una biopsia de tejido, sangre, suero, plasma, linfa, líquido ascítico, líquido quístico, orina, esputos, deposiciones, saliva, aspirado bronquial, líquido espinal o pelo. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de células de biopsia de tejido o células cultivadas a partir de la misma. La muestra biológica puede comprender células sanguíneas, células extraídas de un tumor sólido o un lisado de una muestra de células. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para establecer un régimen de tratamiento para un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo; (b) ensayar dicha muestra biológica con respecto a al menos la resistencia parcial a un primer inhibidor de quinasa; (c) ensayar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT; y, si se determina que dicha muestra biológica es al menos parcialmente resistente a dicho primer inhibidor de quinasa y contiene una quinasa KIT mutante, entonces (d) administrar a dicho individuo como parte de un régimen de tratamiento una composición farmacéutica que comprende ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, dicha al menos una mutación comprende una mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº: 2. La mutación en la posición de aminoácido 816 de la SEC ID Nº: 2 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, el régimen de tratamiento comprende además la administración de al menos un inhibidor de quinasa adicional. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con una quinasa KIT mutante, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo; (b) ensayar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de una quinasa KIT mutante, siendo dicha quinasa KIT mutante constitutivamente activa; y, si está presente una quinasa KIT mutante constitutivamente activa en dicha muestra, entonces (c) administrar a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal

o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer asociado con una quinasa KIT mutante, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida (BMS-354825), o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización, la quinasa KIT mutante es una mutación de KIT resistente a imatinib. En otra realización, la quinasa KIT mutante es una quinasa KIT mutante constitutivamente activa. La quinasa KIT mutante puede comprender una mutación en el resto de aminoácido 816 de la quinasa KIT. Las mutaciones ejemplares incluyen, sin limitación, D816Y, D816F, D816V y D816H. En algunas realizaciones, el cáncer es un trastorno sistémico de mastocitos, leucemia, seminoma o tumor estromático gastrointestinal. En algunas realizaciones, el individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa, por ejemplo, imatinib. BMS-354825 puede administrarse solo o en combinación con imatinib u otros agentes que incluyen, pero sin limitación, otro inhibidor de proteína quinasa, especialmente un inhibidor de BCR ABL tal como AMN107, SKI 606, AZD0530 o AP23848 (ARIAD); un agente estabilizador de tubulina (por ejemplo pacitaxol, epotilona, taxano, Taxol, etc.); y un inhibidor de farnesil transferasa (FT) (por ejemplo BMS-214662). En algunas realizaciones, BMS-354825 se administra en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

La divulgación incluye un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, comprendiendo el procedimiento ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT hace que dicha quinasa KIT esté constitutivamente activada y, por lo tanto, administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación incluye además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, comprendiendo el procedimiento ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si se identifica dicha mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes a dicho primer inhibidor de quinasa y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con dicho primer inhibidor de tirosina quinasa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas de dicho individuo se han hecho resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes o al menos parcialmente resistentes a imatinib y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con imatinib u otros agentes que incluyen, pero sin limitación, Taxol u otros inhibidores de proteína tirosina quinasa. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/886.955; presentada el 8 de julio de 2004, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/265.843, presentada el 3 de noviembre de 2005 y Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/418.338, presentada el 4 de mayo de 2006, se describen combinaciones que comprenden BMS-354825 que pueden ser útiles para poner en práctica los procedimientos de la presente invención. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas de dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes a imatinib o al menos parcialmente resistentes y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825, incluyendo una dosis aumentada o reducida (por ejemplo, pacientes con ciertas mutaciones de KIT, por ejemplo, sin limitación, la mutación D816V o D816F, pueden requerir una dosis superior de BMS-354825 que pacientes con KIT de tipo silvestre u otras mutaciones de KIT), solo o en combinación con imatinib u otros agentes que incluyen, pero sin limitación, Taxol u otros inhibidores de proteína tirosina quinasa. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/886.955, presentada el 8 de julio de 2004, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/265.843, presentada el 3 de noviembre de 2005 y Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/418.338, presentada el 4 de mayo de 2006, se describen combinaciones que comprenden BMS-54825 que pueden ser útiles para poner en práctica los procedimientos de la presente invención. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si está presente dicha mutación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con dicho primer inhibidor de quinasa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si está presente dicha mutación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo en combinación con imatinib. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. El inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

La divulgación incluye un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, en el que el procedimiento comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dicha quinasa KIT esté activada constitutivamente y, por lo tanto, administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

La divulgación incluye además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, en el que el procedimiento comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si se identifica dicha mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes a dicho primer inhibidor de quinasa y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con dicho primer inhibidor de quinasa, en el que dicho primer inhibidor de quinasa es una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes o al menos parcialmente resistentes a imatinib y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con imatinib u otros agentes que incluyen, pero sin limitación, Taxol u otros inhibidores de proteína tirosina quinasa o en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/886.955; presentada el 8 de julio de 2004, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/265.843, presentada el 3 de noviembre de 2005 y Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/418.338, presentada el 4 de mayo de 2006, se describen combinaciones que comprenden BMS-354825 que pueden ser útiles para poner en práctica los procedimientos de la presente invención.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer, en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas de dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación en una quinasa KIT da como resultado que dichas células cancerosas sean resistentes a imatinib o al menos parcialmente resistentes y, si está presente al menos una mutación en dicha proteína quinasa KIT, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825, que incluye una dosis aumentada o reducida, solo o en combinación con imatinib u otros agentes que incluyen, pero sin limitación, Taxol u otros inhibidores de proteína tirosina quinasa o en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/886.955, presentada el 8 de julio de 2004, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/265.843, presentada el 3 de noviembre de 2005, y Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/418.338, presentada el 4 de mayo de 2006 se describen combinaciones que comprenden BMS-354825 que pueden ser útiles para poner en práctica los procedimientos de la presente invención.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si está presente dicha mutación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con dicho primer inhibidor de quinasa, en el que dicho primer inhibidor de quinasa es un inhibidor de mTOR.

La divulgación comprende además un procedimiento para tratar a un individuo que padece cáncer (especialmente un cáncer asociado con KIT), en el que dicho individuo recibe o ha recibido la administración de imatinib al que las células cancerosas en dicho individuo se han vuelto resistentes o al menos parcialmente resistentes, que comprende ensayar células de dicho individuo para determinar la presencia de al menos una mutación en una proteína quinasa KIT en dichas células, en el que dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D816V, D816F, D816Y y D816H y, si está presente dicha mutación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 solo o en combinación con imatinib, y en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

La presente divulgación proporciona kits para explorar y diagnosticar trastornos asociados con un desarrollo celular aberrante o incontrolado y con la expresión de un mutante de KIT como se describe en el presente documento.

La presente divulgación proporciona un kit para su uso en la determinación de una estrategia de tratamiento para un individuo con un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa, que comprende: (a) un medio para detectar una quinasa KIT mutante en una muestra biológica de dicho paciente; y, opcionalmente, (b) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit. En algunas realizaciones, el kit comprende dichas instrucciones y dicha estrategia de tratamiento comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ‘N-(2-cloro-6metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, la quinasa KIT mutante comprende una mutación en la posición 816 de SEC ID Nº: 2. La mutación en la posición 816 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816V, D816Y, D816F y D816H. En algunas realizaciones, el kit comprende además un medio para obtener una muestra biológica de dicho individuo.

También se proporciona un kit para su uso en el tratamiento de un individuo con un trastorno asociado a una quinasa KIT mutante, que comprende: (a) un medio para detectar una mutación en la posición de aminoácidos 816 de una quinasa KIT de una muestra biológica procedente de dicho individuo; (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de ‘N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida,

o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma; y (c) instrucciones para usar dicho kit. En algunas realizaciones, la quinasa KIT mutante comprende una mutación en la posición 816 de la SEC ID Nº: 2. La mutación en la posición 816 puede seleccionarse del grupo que consiste en D816V, D816Y, D816F y D816H. En algunas realizaciones, el kit comprende además un medio para obtener una muestra biológica de dicho individuo.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1 BMS-354825 inhibe de forma potente la actividad quinasa de la línea celular KIT WT M-07e. Se trataron células M-07e con concentraciones variables de BMS-354825 o mesilato de imatinib durante 90 minutos antes de la preparación de lisados celulares. Se realizó inmunotransferencia para formas fosforiladas (anticuerpo PY20) y formas totales de KIT para evaluar el efecto inhibidor de BMS-354825 o mesilato de imatinib sobre la activación de KIT (autofosforilación). La autofosforilación de KIT en estas células es dependiente de SCF y el BMS-354825 o imatinib inhibe la fosforilación de KIT con valores de CI50 de 1-10 nM (BMS-354825) y 100-1000 nM (imatinib), respectivamente. (FIG. 1B) se trataron células M-07e con BMS-354825 +/-SCF (100 ng/ml) o GM-CSF (100 ng/ml) durante 72 horas y se midió la proliferación celular usando un ensayo basado en XTT. BMS-354825 inhibió la proliferación de células M-07e estimuladas con SCF con un valor de CI50 de 5-10 nM, pero dosis de BMS-354825 de 1000 nM no tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento dependiente de GM-CSF de estas células. Se muestra el resultado de un experimento representativo (las barras de error indican una desviación típica). El gráfico de dosis-efecto indica el valor de CI50 calculado para los resultados experimentales mostrados en la figura del gráfico de barras.

FIG. 2 BMS-354825 inhibe de forma potente la actividad quinasa de la mutación de KIT murina D814Y que es homóloga a D814Y humana. Se trataron células p815 con concentraciones variables de BMS-354825 o mesilato de imatinib como se ha descrito anteriormente. La potencia de estos agentes se evaluó por inmunotransferencia para las formas fosforiladas y totales de KIT (FIG. 2A), un ensayo basado en XTT para evaluar la inhibición de la proliferación celular (FIG. 2B), y un ensayo de citometría de flujo de inducción de apoptosis (FIG. 2C). En las FIG. 2A-2C se muestran resultados experimentales representativos. Las barras de error en la FIG. 2B indican una desviación típica. Los gráficos de dosis-efecto indican el valor de CI50 calculado para los resultados experimentales mostrados inmediatamente a la izquierda. BMS-354825 inhibe de forma potente la autofosforilación de KIT y, por consiguiente, conduce a la inhibición de la proliferación celular y a la inducción de la apoptosis. Por el contrario, una alta dosis de imatinib (1.000 nM) inhibió parcialmente la autofosforilación de D814Y, pero sólo tuvo un efecto inhibidor moderado sobre la proliferación celular, y no induce la apoptosis en el intervalo de dosis ensayado.

FIG. 3 Las mutaciones de KIT D816V, D816F y D816Y demuestran sensibilidad diferencial a BMS-354825. Se trataron linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y con concentraciones variables de BMS-354825 o mesilato de imatinib durante 90 minutos. Se inmunoprecipitaron lisados de proteínas de estas células usando un anticuerpo anti-KIT, y/o se sometieron a inmunotransferencia secuencialmente usando anticuerpos contra restos de tirosina fosforilados (p-TYR), p-KIT específica de tirosina 568/570 y 703, o KIT total (FIG. 3A). En el panel (FIG. 3B), se sometieron directamente a inmunotransferencia lisados de proteínas, usando anticuerpos contra p-TYR o KIT. (FIG. 3A) BMS354825 inhibe de forma potente la autofosforilación de KIT mutante con valores de CI50 de aproximadamente 250100 nM (D816V), 10-100 nM (D816F) y 1-10 nM (D816Y). Como se muestra para D816V, la inmunotransferencia con el antisuero fosfo-KIT (Tyr719) del anticuerpo pan-fosfotirosilo (PY20) produce resultados idénticos. (FIG. 3B) BMS-354825 inhibe de forma potente las isoformas de KIT mutante en el mismo intervalo de dosificación que se muestra en la FIG. 2A. Por el contrario, el mesilato de imatinib no tiene ningún efecto significativo sobre la autofosforilación de D816V o D816F. Sin embargo, una alta dosis de imatinib (10.000 nM) inhibe completamente la autofosforilación de D816Y.

FIG. 4 La inhibición mediada por BMS-354825 de la actividad quinasa de KIT mutante AL bloquea la activación de rutas aguas abajo importantes. Se trataron líneas celulares que expresaban mutaciones de KIT AL con concentraciones variables de BMS-354825 durante 90 minutos antes del aislamiento de lisados celulares de proteínas. Se sometieron a inmunotransferencia 200 µg de lisado de proteínas de cada línea celular para formas fosforiladas (p-STAT3, p-AKT y p-MAPK1/2) y totales de STAT3, AKT y MAPK1/2. En todas las líneas celulares no tratadas se activan rutas aguas abajo que afectan a la fosforilación de quinasas AKT, STAT3 y MAP. El tratamiento con BMS-354825 conduce a una notable reducción en la concentración de formas activadas de STAT3, AKT y MAPK1/2.

FIG. 5 BMS-354825 inhibe la proliferación celular de linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y de una manera dependiente de la dosis. Se trataron linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y con BMS-354825, mesilato de imatinib o vehículo sólo durante 72 horas antes de medir la proliferación celular usando un ensayo basado en XTT. Se muestran resultados experimentales representativos en las figuras del gráfico de barras (las barras de error indican una desviación típica). Los gráficos de dosis-efecto indican el valor de CI50 calculado para los experimentos mostrados inmediatamente a la izquierda del gráfico. BMS-354825 inhibió satisfactoriamente la proliferación de linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y con un valor de CI50 de 150 nM (D816V, FIG. 5A), 100 nM (D816F, FIG. 5B) y 5 nM (D816Y, FIG. 5C), respectivamente. Por el contrario, imatinib no tiene o sólo tiene un efecto antiproliferativo moderado hasta un intervalo de dosis ensayada de 10.000 nM.

FIG. 6 BMS-354825 induce la apoptosis de linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y de una manera dependiente de la dosis. Se trataron linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y con BMS-354825, mesilato de imatinib o vehículo sólo durante 48-72 horas antes de evaluar la apoptosis usando un ensayo basado en citometría de flujo. En el diagrama de puntos de citometría de flujo se muestran resultados experimentales representativos. Los gráficos de dosis-efecto indican el valor de CI50 calculado para los experimentos de citometría de flujo mostrados inmediatamente a la izquierda. BMS354825 indujo de forma potente la apoptosis en linfocitos Ba/F3 KIT D816V/F/Y con valores de CI50 de 220 nM (D816V, FIG. 6A), 120 nM (D816F, FIG: 6B) y 15 nM (D816Y, FIG. 6C), respectivamente. Por el contrario, imatinib 1000 nM no indujo la apoptosis de ninguna de estas líneas celulares.

FIG. 7 BMS-354825 tiene potencia diferencial contra la isoforma de KIT mutante JM o WT en comparación con la isoforma de KIT mutante AL. Se trataron células CHO-K1 transfectadas de forma transitoria que llevaban KIT WT o una isoforma de KIT mutante con concentraciones variables de BMS-354825 durante 90 minutos. Además, se añadió ligando SCF a células transfectadas con la construcción de KIT WT. Se sometieron a inmunotransferencia lisados de proteína con anticuerpo anti-KIT, antes de la inmunotransferencia para restos de tirosina fosforilados (p-TYR) o KIT total. BMS-354825 inhibe de forma potente la fosforilación inducida por SCF de KIT WT con un valor de CI50 de aproximadamente 1-10 nM (“CHO KIT WT”). La autofosforilación de la mutación V560D JM se inhibe por BMS-354825 con un valor de CI50 de ~ 10 nM (“CHO KIT V560D”) y las mutaciones AL D816V y D816H se inhiben con valores de CI50 en el intervalo de 100 nM ((“CHO KIT D816V”; “CHO KIT D816H”; respectivamente)).

La FIG. 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina quinasa KIT humana de tipo silvestre (Nº de Acceso del Genbank gi|NP_000213; SEC ID Nº: 1).

La FIG. 9 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina quinasa KIT humana de tipo silvestre (Nº de Acceso del Genbank gi|34084; SEC ID Nº: 2).

La FIG. 10 muestra la inhibición de la actividad quinasa de c-KIT humana de tipo silvestre y mutante (D816V) por BMS-354825 (FIG. 10A y FIG. 10B) e imatinib (FIG. 10C y FIG. 10D). La actividad quinasa se analizó en c-KIT recombinante marcada con GST N-terminal (aminoácidos 544-final).

La FIG. 11 muestra la inhibición del crecimiento celular de la línea celular de mastocitosis murina p815 que lleva una mutación de cKIT (D814Y). Se cultivaron células en presencia de concentraciones variables de BMS-354825 (FIG. 11A) o imatinib (FIG. 11B). Se indican los días en cultivo en el momento del análisis. Las concentraciones de los inhibidores se indican en nM.

La FIG. 12 muestra que la inhibición mediada por dasatinib de la actividad quinasa de KIT mutante AL bloquea la activación de rutas aguas abajo importantes. Se cultivaron células con las mutaciones de KIT AL indicadas en presencia de concentraciones variables de BMS-354825, y se sometieron a inmunotransferencia lisados de proteínas de cada célula para determinar p-STAT3, p-AKT y p-MAPK1/2 fosforiladas, así como formas totales de STAT3 AKT y MAPK1/2. Se activaron rutas aguas abajo que afectan a la fosforilación de quinasas AKT, STAT3 y MAP en todas las líneas celulares no tratadas. Como se muestra, el tratamiento con dasatinib condujo a una notable reducción en la concentración de formas activadas de STAT3, AKT y MAPK1/2. Las concentraciones de los inhibidores se indican en nM.

La FIG. 13 muestra que la combinación de BMS-354825 (dasatinib) y rapamicina induce sinérgicamente la apoptosis y media los efectos antiproliferativos en una línea de mastocitos p815 (FIG. 13A). Además, se observó que dasatinib solo no inhibía el estado de fosforilación de p70S6quinasa, una quinasa aguas abajo de AKT y mTOR, mientras que la rapamicina sola o en combinación con dasatinib inhibía completamente la fosfo-p70S6quinasa en dosis terapéuticas relevantes (FIG. 13B). Las células se dejaron crecer en presencia de concentraciones variables de rapamicina con las concentraciones indicadas de BMS-354825. Las concentraciones se indican en nM.

La FIG. 14 muestra un isobolograma convencional (FIG. 14A) y conservativo (FIG. 14B) que compara los efectos antiproliferativos conseguidos en líneas celulares BaF3 KIT D816V por la combinación de BMS-354825 (“dasatinib”) y rapamicina para DE del 50%, 75% y 90%. Como se muestra, la combinación de BMS-354825 (“dasatinib”) y rapamicina es fuertemente sinérgica. Se cultivaron células en presencia de concentraciones variables de rapamicina con las concentraciones indicadas de BMS-354825. Las concentraciones se indican en nM.

La FIG. 15 muestra el gráfico de un índice de combinación para la combinación de BMS-354825 (“dasatinib”) y rapamicina que mide los efectos antiproliferativos conseguidos en líneas celulares BaF3 KIT D816V. Un valor de IC menor de 1 es indicativo de un efecto sinérgico, un valor de IC de 1 equivale a un efecto aditivo, mientras que un valor de IC mayor que 1 indica un efecto antagonista. Como se muestra, la combinación de BMS-354825 (“dasatinib”) y rapamicina es fuertemente sinérgica. Las células se cultivaron en presencia de concentraciones variables de rapamicina con las concentraciones indicadas de BMS-354825. Las concentraciones se indican en nM. Los valores de IC se calcularon usando el software Calcusyn (Biosoft) versión 1.1.1.

La FIG. 16 muestra las secuencias del cebador específico de mutante (SEC ID Nº: 6) y el cebador de bloqueo (SEC ID Nº: 7) en comparación con las secuencias de KIT de tipo silvestre y mutante. El cebador específico de mutante tiene un solo desacoplamiento (indicado por el *) inmediatamente 5’ con respecto a la sustitución 2447 T > A que da como resultado D816V, pero está acoplado con la A del mutante y permite la extensión. Cuando se une al alelo de tipo silvestre, este cebador está doblemente desacoplado en el extremo 3’ y constituye un mal sustrato para la extensión. El oligonucleótido de bloqueo está diseñado con una estrategia inversa, de tal forma que tiene un doble desacoplamiento con el alelo mutante. Además, el nucleótido 3’ terminal de este oligonucleótido está invertido químicamente (de 3’ a 5’) de forma que no puede servir como cebador (indicado por el x).

La FIG. 17 muestra la sensibilidad de AS-PCR para detectar D816V en ADN obtenido de parafina. Se extrajo ADN a partir de seminoma incluido en parafina, fijado con formalina, heterocigoto para KIT D816V (50% de alelo mutante) y se diluyó con cantidades crecientes de ADN de tipo silvestre de KIT (línea celular LoVo) antes de la amplificación por AS-PCR.

La FIG. 18 muestra resultados de AS-PCR de ADNc de KIT de tipo silvestre y mutante. Se ensayaron ADNc preparados a partir de subclones de Ba/F3 transfectados de forma estable que expresan diversas isoformas de ADNc de KIT por AS-PCR. Se obtuvieron señales de AS-PCR positivas (mínimo 2 mV) a partir de células que expresaban ADNc de D816V o D816F, pero no de células transfectadas con las formas de tipo silvestre o D816Y de KIT.

La FIG. 19 es una tabla que muestra los resultados de AS-PCR usando muestras de ADN de pacientes que se sabe que tienen mutaciones en el resto 816 en KIT.

La FIG. 20 A-B es una tabla que compara los resultados de AS-PCR, HPLC y secuenciación para detectar mutaciones en KIT usando muestras de ADN de pacientes con enfermedad de mastocitos sospechada clínicamente.

Descripción detallada

A menos que se definan de otra manera, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en el presente documento tengan los significados entendidos comúnmente por los expertos en la materia a la que pertenece la presente divulgación. En algunos casos, en el presente documento se definen términos con significados entendidos comúnmente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y no debe considerarse que la inclusión de dichas definiciones en el presente documento necesariamente representa una diferencia sustancial con lo que se entiende generalmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en el presente documento generalmente se entienden bien y se emplean comúnmente usando la metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular utilizadas ampliamente descritas en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995). Cuando sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se realizan generalmente de acuerdo con protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique otra cosa.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, se entenderá que la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende” implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos aproximadamente 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se entiende que incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” significa un polímero de al menos aproximadamente 6 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva se usan las designaciones convencionales de tres letras o una sola letra para los aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, se dice que un polinucleótido está “aislado” cuando está separado sustancialmente de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos de, por ejemplo, los genes de KIT mutante o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen de KIT mutante o fragmentos del mismo. Como se usa en el presente documento, se dice que un polipéptido está “aislado” cuando está sustancialmente separado de polipéptidos contaminantes que corresponden a polipéptidos distintos de los polipéptidos de KIT mutante o fragmentos de los mismos. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de polinucleótidos o polipéptidos para obtener dichos polinucleótidos y/o polipéptidos aislados.

Como se usa en el presente documento, se entiende que los términos “hibridar”, que “hibrida”, “hibrida” y similares, usados en el contexto de polinucleótidos, se refieren a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en formamida al 50%/SSC 6x/SDS al 0,1%/100 µg/ml de ADNmc (ADN monocatenario) en las que las temperaturas para la hibridación están por encima de 37 ºC y las temperaturas para el lavado en SSC 0,1x/SDS al 0,1% están por encima de 55 ºC, y aún más preferentemente a condiciones de hibridación rigurosas.

La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia y, generalmente, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas de mayor tamaño requieren mayores temperaturas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de rehibridar cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que mayores temperaturas relativas tenderían a hacer que las condiciones de reacción fueran más rigurosas, mientras que las menores temperaturas harían lo contrario. Si se desean detalles adicionales y la explicación de rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las “condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad” se conocen por los expertos en la materia y, como se define en el presente documento, pueden identificarse por aquellos que: (1) emplean una baja resistencia iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en SSC 0,2x (cloruro sódico citrato sódico) y formamida al 50% a 55 ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1x que contiene EDTA a 55 ºC.

Las “condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe por Sambrook y col., 1989,

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Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo no limitante de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante una noche a 37 ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón sometido a cizalla desnaturalizado a 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1x a aproximadamente 37-50 ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., de la manera necesaria para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

Para una designación abreviada de las variantes de mutantes de KIT descritas en el presente documento, debe indicarse que los números se refieren a la posición del resto de aminoácido a lo largo de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de KIT. Por ejemplo, D816 se refiere al aminoácido ácido aspártico en la posición 816. Las sustituciones de aminoácidos en una posición particular se escriben como el aminoácido de tipo silvestre, el número de posición y el aminoácido sustituido en dicha posición, en ese orden. Por ejemplo, D816V se refiere a una sustitución de ácido aspártico por valina en la posición 816. La identificación de aminoácidos usa el alfabeto de una sola letra de aminoácidos, es decir

Asp

D Acido aspártico lle I Isoleucina

Thr

T Treonina Leu L Leucina

Ser

S Serina Tyr Y Tirosina

Glu

E Acido glutámico Phe F Fenilalanina

Pro

P Prolina His H Histidina

Gly

G Glicina Lys K Lisina

Ala

A Alanina Arg R Arginina

Cys

C Cisteína Trp W Triptófano

Val

V Valina Gln Q Glutamina

Met

M Metionina Asn N Asparagina

En el contexto de las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término “identidad” se usa para identificar y expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son iguales. También en este contexto, el término “homología” se usa para identificar y expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son idénticas o similares, usando el criterio de aminoácidos conservados del análisis BLAST, como se entiende generalmente en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse valores de identidad y homología por WU-BLAST-2 (Altschul y col., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996): http://blast.wustl/edu/blast/README.html).

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos”, con respecto a las secuencias identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácido en la secuencia de KIT, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica y puede determinarse usando parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo algoritmos de asignación necesarios para conseguir un alineamiento máximo sobre las secuencias de longitud completa que se están comparando.

Los expertos en la materia sabrán cómo determinar el porcentaje de identidad entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los basados en el programa informático CLUSTALW (J.D. Thompson y col., 1994, Nucleic Acids Research, 2 (22): 4673-4680), o FASTDB, (Brutlag y col., 1990, Comp. App. Biosci., 6:237-245), como se conoce en la técnica. Aunque el algoritmo FASTDB típicamente no considera deleciones o adiciones de desacoplamiento interno en las secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación del % de identidad. Sin embargo, CLUSTALW tiene en cuenta los huecos de secuencia en sus cálculos de identidad.

El término “anticuerpos” se refiere a moléculas intactas así como a fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab’)2 y Fv, que son capaces de unirse a un determinante epitópico o antigénico. Pueden prepararse anticuerpos que se unen a polipéptidos de KIT o de KIT mutante usando polipéptidos intactos o fragmentos que contienen pequeños péptidos de interés, que pueden prepararse de forma recombinante para su uso como el antígeno de inmunización. El polipéptido u oligopéptido usado para inmunizar a un animal puede obtenerse a partir de la transición de ARN o sintetizarse químicamente, y puede conjugarse con una proteína de soporte, si se desea. Los soportes usados comúnmente que se acoplan químicamente a péptidos incluyen, pero sin limitación, albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH) y tiroglobulina. El péptido acoplado después se usa para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).

La expresión “determinante antigénico” se refiere a la parte de una molécula que hace contacto con un anticuerpo particular (es decir, un epítopo). Cuando se usa una proteína o fragmento para inmunizar a un animal huésped, numerosas regiones de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos que se unen específicamente a una región o estructura tridimensional dada de la proteína; cada una de estas regiones o estructuras se denomina determinante antigénico. Un determinante antigénico puede competir con el antígeno intacto (es decir, el inmunógeno usado para inducir la respuesta inmune) para la unión a un anticuerpo.

Las expresiones “unión específica” o “se une específicamente” se refieren a la interacción entre una proteína o péptido y una molécula de unión, tal como un agonista, un antagonista o un anticuerpo. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, un determinante antigénico o epítopo) de la proteína que se reconoce por la molécula de unión. Para los fines de la presente divulgación, pueden considerarse compuestos, por ejemplo moléculas pequeñas, por su capacidad de unirse específicamente a KIT de tipo silvestre y/o mutantes de KIT descritos en el presente documento.

Los términos “cáncer”, “canceroso” o “maligno” se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, leucemia, linfoma, blastoma, carcinoma y sarcoma. Otros ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva para el cromosoma Philadelphia (LLA Ph+), carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, linfoma de linfocitos citolíticos naturales de senos paranasales, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda y leucemia linfocítica crónica.

Son “trastornos asociados con proteína tirosina quinasa” los trastornos que se producen por una actividad aberrante de tirosina quinasa, y/o que se alivian por la inhibición de una o más de estas enzimas. Los trastornos incluidos en el alcance de la presente invención pueden incluir mastocitosis y cualquier síntoma asociado con mastocitosis. Más específicamente, los trastornos incluyen urticaria pigmentosa, mastocitosis tales como mastocitosis cutánea difusa, mastocitoma solitario en seres humanos, así como mastocitoma de perro y algunos subtipos raros tales como mastocitosis bulosa, eritrodérmica y telangiectática, mastocitosis con un trastorno hematológico asociado, tal como un síndrome mieloproliferativo o mielodisplásico, o leucemia aguda, trastorno mieloproliferativo asociado con mastocitosis, y leucemia de mastocitos. Dentro del alcance de trastornos asociados con proteína tirosina quinasa también se incluyen diversos cánceres que incluyen (pero sin limitación) los siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides, testículo, particularmente seminomas testiculares, y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores estromáticos gastrointestinales (“GIST”); tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas y linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimático, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimático incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscaroma y osteosarcoma; y otros tumores incluyendo melanoma, xenoderma pigmentosa, keratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides, teratocarcinoma, tumores de células germinales no seminomatosos refractarios a la quimioterapia y sarcoma de Kaposi.

Son trastornos asociados con proteína tirosina quinasa de interés particular en el presente documento los trastornos que se producen como resultado, al menos en parte, de una actividad de KIT (WT o mutante) aberrante y/o que se alivian por la inhibición de KIT (WT o mutante) denominados en este documento “trastornos asociados con KIT” o, en caso de cáncer, “cáncer asociado a KIT”.

“Quinasa KIT mutante” incluye una quinasa KIT con una secuencia de aminoácidos que difiere de la quinasa KIT de tipo silvestre por una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo, una sustitución del aminoácido D816 por otro aminoácido daría como resultado una quinasa KIT mutante. Se incluyen quinasas KIT mutantes que comprenden mutaciones en D816. El aminoácido D816 puede sustituirse por cualquiera de los otros aminoácidos disponibles. En una realización, D816 se sustituye por un aminoácido no ácido y no polar. En el presente documento se analizan varias quinasas KIT mutantes incluyendo las que tienen mutaciones D816V, D816F, D816Y y D816H. KIT necesariamente incluye v-KIT, c-KIT, KIT y otras formas.

“Trastorno asociado a quinasa KIT mutante” se usa para describir un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa en el que las células implicadas en dicho trastorno son o se han vuelto resistentes al tratamiento con un inhibidor de quinasa usado para tratar dicho trastorno como resultado de una mutación en la quinasa KIT. Como se desvela en el presente documento, tienen un interés particular mutaciones que dan como resultado una quinasa KIT constitutivamente activa. Por ejemplo, un compuesto inhibidor de quinasa puede usarse para tratar un estado canceroso, inhibiendo dicho compuesto la actividad de KIT de tipo silvestre que inhibirá la proliferación y/o inducirá apoptosis de células cancerosas. A lo largo del tiempo, puede introducirse una mutación en el gen que codifica la quinasa KIT, que puede alterar la secuencia de aminoácidos de la quinasa KIT y hacer que las células cancerosas se vuelvan resistentes al tratamiento con el compuesto. Como alternativa, ya puede estar presente una mutación dentro del gen que codifica la quinasa KIT, genéticamente o como consecuencia de un acontecimiento oncogénico, independiente del tratamiento con un inhibidor de proteína tirosina quinasa, que puede ser un factor que da como resultado la tendencia de estas células a diferenciarse en un estado canceroso o proliferativo, y también hacer que estas células sean menos sensibles al tratamiento con un inhibidor de proteína tirosina quinasa. Es de esperar que estas situaciones den como resultado, directa o indirectamente, un “trastorno asociado con quinasa KIT mutante” y el tratamiento de dicha afección requerirá un compuesto que sea al menos parcialmente eficaz contra la KIT mutante, preferentemente contra la KIT mutante y la KIT de tipo silvestre. En caso de que un individuo desarrolle al menos resistencia parcial al inhibidor de quinasa imatinib, el trastorno asociado con KIT mutante es uno que se produce como resultado de una mutación de KIT resistente a imatinib.

“Mutación de KIT resistente a imatinib” se refiere a una mutación específica en la secuencia de aminoácidos de KIT que confiere a las células que expresan dicha mutación resistencia al tratamiento con imatinib. Como se analiza en el presente documento, dichas mutaciones pueden incluir mutaciones en la posición D816 de KIT. Dentro de la divulgación se contempla una mutación en la secuencia de KIT seleccionada del grupo que consiste en D816V, D816Y, D816F y D816H.

“Inhibidor de mTOR” se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir el nivel de expresión y/o la actividad de mTOR. Son ejemplos no limitantes de dichas moléculas rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), temsirolimus (CCI779), wortmanina, AP23573, PI-103, 13,14-bis(cis-3,5-dimetil-1-piperazinil)-beta-elemento (IIi), 13,14-bis[2-(2tiofenil)etilamino]-beta-elemeno (IIm), 13,14-bis (ciclohexamino)-beta-elemeno (IIn), clofibrato y curcumina además de cualquier otro inhibidor de mTOR conocido en la técnica.

Los términos “tratar”, “tratamiento” y “terapia”, como se usan en el presente documento, se refieren a la terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

El término “mamífero”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.

A lo largo de la memoria descriptiva se proporcionan definiciones adicionales.

La divulgación proporciona un procedimiento para tratar cánceres, incluyendo tanto cánceres primarios como cánceres metastásicos, incluyendo tumores sólidos tales como los de mama, colon y próstata, así como linfomas y leucemias (incluyendo LMC, LMA Y LLA), cánceres de tejidos endoteliales, e incluyendo cánceres que son resistentes a otras terapias, incluyendo otras terapias que implican la administración de inhibidores de quinasa tales como imatinib. Específicamente, la divulgación proporciona el uso de BMS-354825 para tratar trastornos, por ejemplo cánceres, que son resistentes a otras terapias que implican la administración de inhibidores de quinasa tales como imatinib.

La divulgación estipula que BMS-354825, tanto como monoterapia como en terapias de combinación, será útil contra cánceres que son resistentes a uno o más agentes anticancerosos distintos, incluyendo, entre otros, cánceres que son resistentes en su totalidad o en parte a otros agentes anticancerosos, incluyendo específicamente imatinib y otros inhibidores de quinasa, e incluyendo específicamente cánceres que implican una o más mutaciones en una quinasa KIT.

La divulgación también contempla un procedimiento para identificar a un individuo para el tratamiento, que comprende explorar células de un individuo para identificar una quinasa KIT mutante expresada en dichas células, y si está presente una quinasa KIT mutante, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de dicha quinasa KIT mutante, o una cantidad terapéuticamente eficaz aumentada de un inhibidor de dicha quinasa KIT mutante. De acuerdo con la presente divulgación, la identificación de una mutación en la posición D816 de la quinasa KIT indicaría un individuo seleccionado para el tratamiento. Dentro de la invención se incluye una mutación D816 seleccionada del grupo que consiste en D816V, D816Y, D816F y D816H.

En la técnica se conocen procedimientos para identificar los aminoácidos y el ácido nucleico de una quinasa KIT mutante. Se contemplan técnicas de biología molecular convencionales para determinar de forma precisa una mutación KIT en las células de un individuo dado.

Pueden identificarse anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a una quinasa KIT mutante para identificar uno o más de los mutantes de KIT descritos en el presente documento. En el presente documento se contemplan anticuerpos que se unen específicamente a una quinasa KIT mutante y que no se unen (o se unen débilmente) a una proteína o polipéptidos de KIT de tipo silvestre. Los anticuerpos anti-quinasa KIT mutante incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos.

Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionen específicamente con una proteína quinasa KIT mutante particular y/o un epítopo dentro de un dominio estructural particular. Por ejemplo, son anticuerpos preferidos útiles para fines de diagnóstico los que reaccionan con un epítopo en una región mutada de la proteína KIT expresada en células cancerosas. Por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a una quinasa KIT mutante D816V, D816Y, D816F o D816H. Dichos anticuerpos pueden generarse usando la proteína quinasa KIT mutante descrita en el presente documento o usando péptidos derivados de diversos dominios de la misma, como un inmunógeno.

Los anticuerpos contra la quinasa KIT mutante de la divulgación pueden ser particularmente útiles en estrategias terapéuticas para cánceres (por ejemplo, GIST, leucemia mielógena crónica), ensayos de diagnóstico y pronóstico y metodologías de formación de imágenes. De forma similar, dichos anticuerpos pueden ser útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, en la medida en la que dicha quinasa KIT mutante también se expresa o sobreexpresa en otros tipos de cáncer. La divulgación proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de proteínas quinasas KIT mutantes y polipéptidos de las mismas. Dichos ensayos generalmente comprenden uno o más anticuerpos de quinasa KIT mutante capaces de reconocer y de unirse a una proteína quinasa KIT mutante, según sea apropiado, y pueden realizarse dentro de diversos formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) y similares. Además, la divulgación también proporciona procedimientos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar células cancerosas incluyendo, pero sin limitación, procedimientos de formación de imágenes que usan anticuerpos contra quinasa KIT mutante marcada. Dichos ensayos pueden usarse clínicamente en la detección, monitorización y pronóstico de cánceres.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a procedimientos para detectar polinucleótidos de quinasa KIT mutante y proteínas quinasas KIT mutantes, así como procedimientos para identificar una célula que expresa una quinasa KIT mutante. El perfil de expresión de las quinasas KIT mutantes hace que sean marcadores de diagnóstico de estados patológicos. El estado de productos del gen de la quinasa KIT mutante en muestras de pacientes puede analizarse por una diversidad de protocolos que son bien conocidos en la técnica, incluyendo los siguientes tipos no limitantes de ensayos: procedimientos de genotipificación sin PCR, procedimientos homogéneos de una sola etapa, detección homogénea con polarización de fluorescencia, pirosecuenciación, sistema de microplacas de ADN basado en “marcadores”, procedimientos basados en perlas, química de colorantes fluorescentes, ensayos de genotipificación basados en espectrometría de masas, ensayos de genotipo TaqMan, ensayos de genotipo Invader, ensayos de genotipo basados en microfluídica, análisis inmunohistoquímico, la diversidad de técnicas de transferencia de Northern que incluyen hibridación in situ, análisis de RT-PCR (por ejemplo, en muestras microdiseccionadas por captura láser), análisis de transferencia de western, análisis de matrices de tejidos y cualquier otro procedimiento conocidos en la técnica o descrito en otras partes de presente documento.

La determinación del estado de mutación del gen KIT en casos de LMA es relativamente sencilla, ya que las células tumorales típicamente dominan la sangre, el aspirado de médula ósea y las muestras de biopsia de médula ósea. Por el contrario, el análisis de mutación en mastocitosis presenta un desafío mayor. El grado de infiltración de mastocitos en órganos afectados varía ampliamente y puede representar una cantidad tan pequeña como del 1% de la población celular en una biopsia dada. En pacientes con GIST, se ha usado HPLC desnaturalizante para explorar mutaciones del gen KIT con una sensibilidad de aproximadamente un 10-20% de alelos mutantes. Los procedimientos usados para detectar mutaciones de KIT en pacientes con presunta MS incluyen amplificación y secuenciación de ADNc, análisis de ADN genómico por secuenciación directa, RFLP y SSCP, y PCR en tiempo real usando sondas de ácido péptido-nucleico, además de otros procedimientos desvelados en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica.

La presente divulgación proporciona procedimientos de alta sensibilidad para detectar mutaciones en KIT usando un ensayo basado en PCR. Este ensayo de PCR específico de alelo (AS-PCR) se basa en el uso de una combinación de cebador dirigido por mutación y un oligonucleótido de bloqueo de tipo silvestre, y puede detectar reproduciblemente KIT D816V o D816F presente a bajos niveles en ADN extraído de tejido incluido en parafina.

La sensibilidad del ensayo de AS-PCR puede aumentarse suprimiendo la amplificación del alelo de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, puede usarse una endonucleasa de restricción para escindir la secuencia de tipo silvestre antes de la amplificación, si se dispone de un sitio apropiado. Como alternativa, puede usarse un oligonucleótido de bloqueo para impedir el cebado o alargamiento de una secuencia diana. Un oligonucleótido de bloqueo construido de ácidos nucleicos cerrados puede suprimir sustancialmente la amplificación de la secuencia de tipo silvestre en un ensayo que emplea la polimerasa de fragmento Stoffel. Esta estrategia puede resultar útil cuando se producen varias mutaciones de interés en un exón dado.

Específicamente, la presente divulgación incluye los siguientes procedimientos de genotipificación no limitantes: Landegren, U., Nilsson, M. & Kwok, P. Genome Res 8, 769-776 (1998); Kwok, P., Pharmacogenomics 1, 95-100 (2000); Gut, I., Hum Mutat 17, 475-492 (2001); Whitcombe, D., Newton, C. & Little, S., Curr Opin Biotechnol 9, 602608 (1998); Tillib, S. & Mirzabekov, A., Curr Opin Biotechnol 12, 53-58 (2001); Winzeler, E. y col., Science 281, 1194-1197 (1998); Lyamichev, V. y col., Nat Biotechnol 17, 292-296 (1999); Hall, J. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8272-8277 (2000); Mein, C. y col., Genome Res 10, 333-343 (2000); Ohnishi, Y. y col., J Hum Genet 46, 471-477 (2001); Nilsson, M. y col., Science 265, 2085-208 8 (1994); Baner, J., Nilsson, M., Mendel-Hartvig, M. & Landegren, U., Nucleic Acids Res 26, 5073-5078 (1998); Baner, J. y col., Curr Opin Biotechnol 12, 11-15 (2001); Hatch, A., Sano, T., Misasi, J. & Smith, C., Genet Anal 15, 35-40 (1999); Lizardi, P. y col., Nat Genet 19,225-232 (1998); Zhong, X., Lizardi, P., Huang, X., Bray-Ward, P. & Ward, D., Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3940-3945 (2001); Faruqi,

F. y col. BMC Genomics 2,4 (2001); Livak, K., Gnet Anal 14, 143-149 (1999); Marras, S., Kramer, F. & Tyagi, S., Genet Anal 14, 151-156 (1999); Ranade, K. y col., Genome Res 11, 1262-1268 (2001); Myakishev, M., Khripin, Y., Hu, S. & Hamer, D., Genome Re 11, 163-169 (2001); Beaudet, L., Bedard, J., Breton, B., Mercuri, R. & Budarf, M., Genome Res 11, 600-608 (2001); Chen, X., Levine; L. & PY, K., Genome Res 9, 492-498 (1999); Gibson, N. y col., Clin Chem 43, 1336-1341 (1997); Latif, S., Bauer-Sardina, I., Ranade, K., Livak, K. & PY, K., Genome Res 11, 436440 (2001); Hsu, T., Law, S., Duan, S., Neri, B. & Kwok, P., Clin Chem 47, 1373-1377 (2001); Alderborn, A., Kristofferson, A. & Hammerling, U., Genome Res 10, 1249-1258 (2000); Ronaghi, M., Uhlen, M. & Nyren, P., Science 281, 363, 365 (1998); Ronaghi, M., Genome Res 11, 3-11 (2001); Pease, A. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5022-5026 (1994); Southern, E., Maskos, U. & Elder, J., Genomics 13, 1008-1017 (1993); Wang, D. y col., Science 280, 1077-1082 (1998); Brown, P. & Botstein, D., Nat Genet 21, 33-37 (1999); Cargill, M. y col. Nat Genet 22,231238 (1999); Dong, S. y col., Genome Res 11, 1418-1424 (2001); Halushka, M. y col., Nat Genet 22, 239-247 (1999); Hacia, J., Nat Genet 21, 42-47 (1999); Lipshutz, R., Fodor, S., Gingeras, T. & Lockhart, D., Nat Genet 21, 20-24 (1999); Sapolsky, R. y col., Genet Anal 14, 187-192 (1999); Tsuchihashi, Z. & Brown, P., J Virol 68, 5863 (1994); Herschlag, D., J Biol Chem 270, 20871-20874 (1995); Head, S. y col., Nucleic Acids Res 25, 5065-5071 (1997); Nikiforov, T. y col., Nucleic Acids Res 22, 4167-4175 (1994); Syvanen, A. y col., Genomics 12, 590-595 (1992); Shumaker, J., Metspalu, A. & Caskey, C., Hum Mutat 7, 346-354 (1996); Lindroos, K., Liljedahl, U., Raitio, M. & Syvanen, A., Nucleic Acids Res 29, E69-9 (2001); Lindblad-Toh, K. y col., Nat Genet 24, 381-386 (2000); Pastinen,

T. y col., Genome Res 10, 1031-1042 (2000); Fan, J. y col., Genome Res 10, 853-860 (2000); Hirschhorn, J. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12164-12169 (2000); Bouchie, A., Nat Biotechnol 19, 704 (2001); Hensel, M. y col., Science 269, 400-403 (1995); Shoemaker, D., Lashkari, D., Morris, D., Mittmann, M. & Davis, R. Nat Genet 14, 450456 (1996); Gerry, N. y col., J Mol Biol 292, 251-262 (1999); Ladner, D. y col., Lab Invest 81,1079-1086 (2001); Iannone, M. y col. ,Cytometry 39, 131-140 (2000); Fulton, R., McDade, R., Smith, P., Kienker, L. & Kettman, J. J., Clin Chem 43, 1749-1756 (1997); Armstrong, B., Stewart, M. & Mazumder, A., Cytometry 40, 102-108 (2000); Cai, H. y col., Genomics 69, 395 (2000); Chen, J. y col., Genome Res 10, 549-557 (2000); Ye, F. y col. Hum Mutat 17, 305316 (2001); Michael, K., Taylor, L., Schultz, S. & Walt, D., Anal Chem 70, 1242-1248 (1998); Steemers, F., Ferguson,

J. & Walt, D., Nat Biotechnol 18, 91-94 (2000); Chan, W. & Nie, S., Science 281, 2016-2018 (1998); Han, M., Gao, X., Su, J. & Nie, S., Nat Biotechnol 19, 631-635 (2001); Griffin, T. & Smith, L., Trends Biotechnol 18, 77-84 (2000); Jackson, P., Scholl, P. & Groopman, J., Mol Med Today 6, 271-276 (2000); Haff, L. & Smimov, I., Genome Res 7, 378-388 (1997); Ross, P., Hall, L., Smimov, I. & Haff, L., Nat Biotechnol 16, 1347-1351 (1998); Bray, M., Boerwinkle,

E. & Doris, P. Hum Mutat 17, 296-304 (2001); Sauer, S. y col., Nucleic Acids Res 28, E13 (2000); Sauer, S. y col., Nucleic Acids Res 28, E100 (2000); Sun, X., Ding, H., Hung, K. & Guo, B., Nucleic Acids Res 28, E68 (2000); Tang,

K. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 91, 10016-10020 (1999); Li, J. y col., Electrophoresis 20,1258-1265 (1999); Little, D., Braun, A., ODonnell, M. & Koster, H., Nat Med 3, 1413-1416 (1997); Little, D. y col. Anal Chem 69, 4540-4546 (1997); Griffin, T., Tang, W. & Smith, L., Nat Biotechnol 15, 1368-1372 (1997); Ross, P., Lee, K. & Belgrader, P., Anal Chem 69, 4197-4202 (1997); Jiang-Baucom, P., Girard, J., Butler, J. & Belgrader, P., Anal Chem 69, 4894-4898 (1997); Griffin, T., Hall, J., Prudent, J. & Smith, L., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6301-6306 (1999); Kokoris, M. y col., Mol Diagn 5, 329-340 (2000); Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. & Koster, H. (2001); y/o Taranenko, N. y col., Genet Anal 13, 87-94 (1996).

La presente divulgación también incluye los siguientes procedimientos de genotipificación adicionales: los procedimientos descritos y/o reivindicados en la Patente de Estados Unidos Nº 6.458.540; y los procedimientos descritos y/o reivindicados en la Patente de Estados Unidos Nº 6.440.707.

Pueden diseñarse sondas y cebadores de manera que sean específicos para dichos análisis de mutación y proceden de la secuencia de KIT de tipo silvestre, segmentos y secuencias complementarias de la misma.

Además, la divulgación proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de quinasa KIT mutante en una muestra biológica, tal como preparaciones celulares y similares. En la técnica son bien conocidos varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de quinasa KIT mutante y pueden emplearse en la puesta en práctica de este aspecto de la divulgación.

En una realización, un procedimiento para detectar un ARNm de quinasa KIT mutante en una muestra biológica comprende producir ADNc a partir de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc producido de esta manera usando polinucleótidos de quinasa KIT mutante como cebadores con sentido y antisentido para amplificar los ADNc de quinasa KIT mutante presentes; y detectar la presencia del ADNc de quinasa KIT mutante amplificado. Puede diseñarse cualquier número de combinaciones de sondas con sentido y antisentido apropiadas a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas para una quinasa KIT mutante y usarse para este fin.

La divulgación también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína quinasa KIT mutante en una muestra biológica. También son bien conocidos procedimientos para detectar una proteína quinasa KIT mutante e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia de Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, en una realización, un procedimiento para detectar la presencia de una proteína quinasa KIT mutante en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo de KIT, un fragmento reactivo con quinasa KIT mutante del mismo, o una proteína recombinante que contenga una región de unión a antígeno de un anticuerpo de quinasa KIT mutante; y después detectar la unión de la proteína quinasa KIT mutante en la muestra al mismo.

También se proporcionan procedimientos para identificar una célula que expresa quinasa KIT mutante. En una realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de quinasa KIT mutante comprende detectar la presencia del ARNm de quinasa KIT mutante en la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que usan sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas de quinasa KIT mutante marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para una quinasa KIT mutante, y otros procedimientos de detección de tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).

La divulgación incluye procedimientos de tratamiento basados en el descubrimiento de que ciertas quinasas KIT mutantes que confieren algún nivel de resistencia a inhibidores de quinasas tales como imatinib son sensibles a BMS-354825. De esta manera, los procedimientos de la presente divulgación pueden usarse para determinar si tratar o no a un individuo con un inhibidor de tirosina quinasa específico, tal como BMS-354825. Una realización es un procedimiento para identificar una mutación en un polinucleótido de KIT en una célula de mamífero, en el que la mutación en el polinucleótido de KIT está asociada con resistencia a la inhibición de la actividad de la quinasa KIT por imatinib, comprendiendo el procedimiento determinar la secuencia de al menos un polinucleótido de KIT expresado por la célula de mamífero y comparar la secuencia del polinucleótido KIT con la secuencia del polinucleótido KIT de tipo silvestre. Como se describe en el presente documento, el polinucleótido identificado puede codificar un polinucleótido que tiene al menos una diferencia de un aminoácido con la secuencia de aminoácidos de KIT de tipo silvestre.

Pueden establecerse regímenes de tratamiento basándose en la presencia de una o más quinasas KIT mutantes desveladas en el presente documento. Por ejemplo, la divulgación incluye explorar células de un individuo que puede padecer o padece un trastorno que se trata comúnmente con un inhibidor de quinasa. Dicho trastorno puede incluir mastocitosis o trastornos asociados con la misma, o cánceres descritos en el presente documento. Las células de un individuo se exploran usando procedimientos conocidos en la técnica para la identificación de una mutación en una quinasa KIT. Son mutaciones de interés las que dan como resultado una quinasa KIT que se activa constitutivamente. Las mutaciones específicas incluyen D816V (en la que el ácido aspártico en la posición 816 se ha reemplazado por una valina), D816F (en la que el ácido aspártico en la posición 816 se ha reemplazado por una fenilalanina), D816Y (en la que el ácido aspártico en la posición 816 se ha reemplazado por una tirosina) y D816H (en la que el ácido aspártico en la posición 816 se ha reemplazado por una histidina).

Si se encuentra una mutación de quinasa KIT de activación en las células de dicho individuo, pueden desarrollarse de forma apropiada regímenes de tratamiento. Por ejemplo, una mutación identificada puede indicar que dichas células son o se volverán resistentes a inhibidores de quinasa usados comúnmente. Dicho inhibidor incluye el inhibidor de quinasa imatinib. Si las células de un individuo son o se espera que se vuelvan resistentes al tratamiento con un inhibidor de quinasa tal como imatinib, entonces, como se desvela en el presente documento, el tratamiento incluiría el uso de BMS-354825. BMS-354825 puede administrarse solo o, como en el caso de una enfermedad dada tal como GIST, un individuo puede presentar células que expresan KIT WT así como células que expresan una o más quinasas KIT mutantes, en combinación con otros inhibidores de quinasa tales como imatinib, así como con otros agentes adecuados para tratar el trastorno.

Además, pueden establecerse regímenes de dosificación basándose en la presencia de una mutación de aminoácido específica en una quinasa KIT. Como se desvela en el presente documento, una mutación de aminoácido específica en la quinasa KIT puede hacer que dicha quinasa KIT mutante sea más sensible al tratamiento con un inhibidor de quinasa que otra sustitución de aminoácido. Como se describe, las células que presentan las quinasas KIT mutantes D816Y son más sensibles al tratamiento con BMS-354825 que células que presentan las quinasas KIT mutantes D816V o D816F. Este descubrimiento es útil para determinar el régimen de dosificación para un individuo cuyas células presentan dicha mutación. Por ejemplo, puede emplearse una dosificación menor de inhibidor BMS-354825 si las células presentan una quinasa KIT mutante D816Y; como alternativa, puede emplearse una dosificación superior de inhibidor BMS-354825 si las células presentan una quinasa mutante D816V o D816F. En una realización, un nivel aumentado o reducido de dasatinib sería aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% mayor que la dosis de dasatinib típica para una indicación particular o para un individuo, o aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ó 5 veces más dasatinib que la dosis de dasatinib típica para una indicación particular o para un individuo.

Una cantidad terapéuticamente eficaz del Compuesto I puede administrarse por vía oral como una sal de ácidos o hidrato del Compuesto I. La dosificación real empleada puede variar dependiendo de los requisitos del paciente y la gravedad de la afección a tratar. La determinación de la dosificación apropiada para una situación particular está dentro de la experiencia en la técnica. La cantidad eficaz de Compuesto I (y sal o hidrato del Compuesto I) puede determinarse por un experto habitual en la materia, e incluye cantidades de dosificación ejemplares para un ser humano adulto de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de Compuesto I al día, que pueden administrarse en una sola dosis o en forma de dosis divididas individuales, tales como 1, 2, 3 ó 4 veces al día. En una realización, el Compuesto I se administra dos veces al día a 70 mg. Como alternativa, puede dosificarse a 50, 70, 90, 100, 110 ó 120 BID, o 100, 140 ó 180 una vez al día. Se entenderá que el nivel de dosificación específico y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto particular puede variarse y dependerá de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de acción de ese compuesto, la especie, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el modo y tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la afección particular. Los sujetos preferidos para el tratamiento incluyen animales, más preferentemente especies de mamífero tales como seres humanos, y animales domésticos tales como perros, gatos y similares, propensos a trastornos asociados con proteína tirosina quinasa.

En el procedimiento desvelado anteriormente, la célula de mamífero puede ser una célula cancerosa humana. La célula cancerosa humana puede ser una obtenida a partir de un individuo tratado con imatinib. Opcionalmente, la sustitución de aminoácidos en el polipéptido de KIT expresado en dicha célula cancerosa humana confiere resistencia a la inhibición de la actividad tirosina quinasa por imatinib.

También se desvela en el presente documento un procedimiento para determinar la capacidad de respuesta de un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa a un inhibidor de quinasa, tal como BMS354825. Por ejemplo, puede determinarse que un individuo es un respondedor positivo (o sería de esperar que las células de dicho individuo tuvieran un grado de sensibilidad) a un cierto inhibidor de quinasa basándose en la presencia de una quinasa KIT mutante. Como se desvela en el presente documento, las células que presentan ciertas mutaciones en la posición de aminoácido 816 de la quinasa KIT desarrollan resistencia a imatinib. Por lo tanto, sería de esperar que los individuos que padecen un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa cuyas células presentan dicha mutación, fueran respondedores negativos al tratamiento con imatinib. El presente descubrimiento estableció por primera vez que las células con una mutación en la posición de aminoácido 816 en una quinasa KIT que confiere resistencia a imatinib son sensibles a BMS-354825. Por lo tanto, un individuo cuyas células presentan una quinasa KIT mutante como se desvela en el presente documento puede identificarse como un respondedor positivo a BMS-354825 a pesar de una respuesta negativa a imatinib. Después, se establecen regímenes de tratamiento para dichos individuos de acuerdo con esto.

En el presente documento también se proporcionan regímenes de tratamiento basados en la presencia de una quinasa KIT mutante. Un régimen de tratamiento es un curso de terapia administrado a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína quinasa que puede incluir el tratamiento con uno o más inhibidores de quinasa, así como otras terapias tales como radiación y/u otros agentes. Cuando se administra más de una terapia, las terapias pueden administrarse de forma concurrente o consecutiva (por ejemplo, puede administrarse más de un inhibidor de quinasa conjuntamente o en momentos diferentes, en un programa diferente). La administración de más de una terapia puede ser en momentos diferentes (es decir, consecutivamente) y seguir formando parte del mismo régimen de tratamiento. Como se desvela en el presente documento, por ejemplo, puede observarse que las células de un individuo que padece un trastorno asociado con proteína quinasa desarrollan resistencia a imatinib. Basándose en el presente descubrimiento de que dichas células pueden ser sensibles a BMS-354825, puede establecerse un régimen de tratamiento que incluye el tratamiento con BMS-354825 como una monoterapia, o en combinación con imatinib u otro inhibidor de quinasa. Además, BMS-354825 puede administrarse con radiación u otros tratamientos conocidos.

Por lo tanto, la presente divulgación incluye un procedimiento para establecer un régimen de tratamiento para un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa que comprende: (a) proporcionar una muestra de células de dicho individuo; (b) explorar dicha muestra de células con respecto a la presencia de al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT; y, si está presente al menos una mutación en una secuencia de quinasa KIT en dicha muestra de células, (c) administrar a dicho individuo como parte de un régimen de tratamiento una composición farmacéutica que comprende BMS-354825. Cuando se exploran las células de un individuo que padece un trastorno asociado con proteína quinasa, se puede buscar una mutación en la secuencia de ácido nucleico que codifica la quinasa KIT, o una mutación resultante en la secuencia de aminoácidos de la quinasa KIT.

Siempre que se use el término “BMS-354825” en el presente documento, se entiende (a menos que se indique otra cosa) que se refiere al compuesto ’N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida que tiene la siguiente estructura (I):

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así como a sales o hidratos farmacéuticamente aceptables de la misma. El compuesto (I) también se denomina N(2-cloro-6-metilfenil)-2-((6-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-2-metil-4-pirimidinil)amino)-1,3-tiazol-5-carboxamida de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC. El uso del término incluye (a menos que se indique otra cosa) solvatos (incluyendo hidratos) y formas polimórficas del compuesto (I) o sus sales o hidratos (tales como la forma monohidrato de (I) descrita en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/051.208, presentada el 4 de febrero de 2005, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). Las composiciones farmacéuticas de BMS-354825 incluyen todas las composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden BMS-354825 y uno

o más diluyentes, vehículos y/o excipientes tales como las composiciones descritas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/402.502, presentada el 12 de abril de 2006, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.

Por la expresión “un inhibidor de farnesil transferasa (por ejemplo BMS-214662)” en el presente documento, se entiende (a menos que se indique otra cosa) que el compuesto tiene la fórmula (II), (R)-2,3,4,5-tetrahidro-1-(1Himidazol-4-ilmetil)-3-(fenilmetil)-4-(2-tienilsulfonil)-1H-1,4-benzodiazepina-7-carbonitrilo, sal clorhidrato, es un agente anticanceroso. El compuesto de fórmula (II) es un inhibidor de FT citotóxico que se sabe que destruye preferentemente las células cancerosas que no están en proliferación. El compuesto de fórmula (II) puede ser útil además para destruir células madre.

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En la Patente de Estados Unidos Nº 6.011.029, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad, se describe el compuesto de fórmula (II), su preparación y usos del mismo. Los usos del compuesto de fórmula (II) también se describen en el documento WO2004/015130, publicado el 19 de febrero de 2004, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

En la puesta en práctica de los muchos aspectos de la divulgación del presente documento, pueden seleccionarse muestras biológicas de muchas fuentes tales como biopsias de tejidos (incluyendo muestras de células o células cultivadas a partir de las mismas; biopsia de médula ósea o tejido sólido, por ejemplo, células de un tumor sólido), sangre, células sanguíneas (glóbulos rojos o glóbulos blancos), suero, plasma, linfa, líquido ascítico, líquido quístico, orina, esputos, deposiciones, saliva, aspirado bronquial, CSF o pelo. Pueden usarse células de una muestra, o un lisado de una muestra celular.

El análisis de la expresión de una quinasa KIT mutante descrita en el presente documento también puede ser útil como herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una quinasa KIT mutante, por ejemplo, un polinucleótido de sRNAi o antisentido que bloquearía la expresión de la quinasa KIT mutante. La identificación de una molécula de un agente biológico que pudiera inhibir la actividad de la quinasa KIT mutante sería de valor terapéutico. Un agente que se une específicamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el aminoácido 816 de KIT, en el que el aminoácido 816 comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en D816V, D816Y, D816F y D816H, tiene valor terapéutico.

Las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente divulgación incluyen composiciones que comprenden un inhibidor de una quinasa KIT mutante en una cantidad eficaz para conseguir el fin deseado. La determinación de una dosis eficaz de una composición farmacéutica de la divulgación está bien dentro de la competencia de los expertos en la materia. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que mejora los síntomas o el estado. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población).

En la Solicitud de Patente de Estados de Estados Unidos Nº 10/395.503, presentada el 24 de marzo de 2003; y en Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volume 104: Abstract 20, "Hematologic and Cytogenetic Responses in Imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor BMS-354825: Results from a Phase I Dose Escalation Study.", por Moshe Talpaz, y col., se describen regímenes de dosificación que implican BMS-354825 útiles en la puesta en práctica de la presente invención.

Los compuestos de la divulgación pueden administrarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; por vía sublingual; bucal; parenteral; tal como por técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal tal como por pulverización de inhalación; tópicamente, tal como en forma de una crema o pomada; o por vía rectal tal como en forma de supositorios; en formulaciones de dosificación unitarias que contienen vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Los presentes compuestos pueden administrarse, por ejemplo, en una forma adecuada para la liberación inmediata o la liberación prolongada. La liberación inmediata o la liberación prolongada puede conseguirse mediante el uso de composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden los presentes compuestos o, particularmente en el caso de la liberación prolongada, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos o bombas osmóticas. Los presentes compuestos también pueden administrarse por liposomas.

Las composiciones ejemplares para administración oral incluyen suspensiones que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido algínico o alginato sódico como agente de suspensión, metilcelulosa como potenciador de la viscosidad y edulcorantes o agentes aromatizantes tales como los conocidos en la técnica; y comprimidos de liberación inmediata que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y/o lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, expansores, disgregantes, diluyentes y lubricantes tales como los conocidos en la técnica. Los presentes compuestos también pueden administrarse por la cavidad oral mediante administración sublingual y/o bucal. Son formas ejemplares que pueden usarse comprimidos moldeados, comprimidos obtenidos por compresión o comprimidos liofilizados. Las composiciones ejemplares incluyen las que formulan el presente o presentes compuestos con diluyentes de disolución rápida tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o ciclodextrinas. También pueden incluirse en dichas formulaciones excipientes de alto peso molecular tales como celulosas (avicel) o polietilenglicoles (PEG). Dichas formulaciones también pueden incluir un excipiente para ayudar a la adhesión a la mucosa tal como hidroxipropil celulosa (HPLC), hidroxipropil metil celulosa (HPMC), carboximetil celulosa sódica (SCMC), copolímero de anhídrido maleico (por ejemplo, Gantrez) y agentes para controlar la liberación tales como copolímero poliacrílico (por ejemplo, Carbopol 934). También pueden añadirse para facilitar la fabricación y uso lubricantes, deslizantes, aromatizantes, agentes colorantes y estabilizantes.

Las composiciones ejemplares para la administración de aerosol nasal o de inhalación incluyen soluciones en solución salina que pueden contener, por ejemplo, alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión tales como los conocidos en la técnica.

Las composiciones ejemplares para administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones inyectables que pueden contener, por ejemplo, diluyentes o disolventes aceptables para la vía parenteral, no tóxicos adecuados, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer, una solución isotónica de cloruro sódico u otros agentes de dispersión o humectantes y suspensión adecuados, incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos, y ácidos grasos, incluyendo ácido oleico.

Las composiciones ejemplares para administración rectal incluyen supositorios que pueden contener, por ejemplo, un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicoles, que son sólidos a las temperaturas habituales pero se licuan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.

Las composiciones ejemplares para administración tópica incluyen un vehículo tópico tal como Plastibase (aceite mineral gelificado con polietileno).

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un inhibidor de una quinasa KIT mutante puede ser una función de la mutación presente. Por ejemplo, las líneas celulares con ciertas mutaciones en la quinasa KIT son más sensibles a BMS-354825 que las líneas celulares con diferentes mutaciones de quinasa KIT. Como se desvela en el presente documento, las células que comprenden una mutación D816Y en la quinasa KIT son diez veces más sensibles a BMS-354825 que las líneas celulares que expresan una mutación D816V. Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825, cuando se trata a un individuo con células que expresan una mutación de KIT D816Y, puede ser menor que una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS-354825 cuando se trata a un individuo con células que expresan una mutación de KIT D816V. Un experto en la materia apreciará la diferencia en sensibilidad de las células de quinasa KIT mutante y determinará una dosis terapéuticamente eficaz de acuerdo con ello.

La presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína quinasa, preferentemente un trastorno asociado con una KIT mutante, por ejemplo, un cáncer asociado con KIT mutante, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de ‘N-(2-cloro6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización, la quinasa KIT mutante es una mutación de KIT resistente a imatinib. En otra realización, la quinasa KIT mutante es una quinasa KIT mutante constitutivamente activa. La quinasa KIT mutante puede comprender una mutación en el resto de aminoácido 816 de la quinasa KIT. Las mutaciones ejemplares incluyen, sin limitación, D816Y, D816F, D816V y D816H.

En una realización, el cáncer es un trastorno sistémico de mastocitos, leucemia, seminoma o tumor estromático gastrointestinal. En algunas realizaciones, el individuo recibe o ha recibido la administración de un primer inhibidor de quinasa, por ejemplo imatinib. BMS-354825 puede administrase solo o en combinación con imatinib u otro inhibidor de proteína quinasa, especialmente un inhibidor de BCR-ABL tal como AMN107, SKI 606, AZD0530 o AP23848 (ARIAD); y/o un agente estabilizador de tubulina (por ejemplo pacitaxol, epotilona, taxano, Taxol, etc.), y/o en combinación con un inhibidor de farnesil transferasa (por ejemplo BMS-214662). En algunas realizaciones, BMS354825 se administra en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa (en el que dicho individuo no se ha sometido previamente al tratamiento con un inhibidor de quinasa (es decir, no se ha tratado previamente con el mismo) o se ha tratado con uno o más inhibidores de quinasa (por ejemplo, se ha tratado con imatinib)), tal como un trastorno asociado con KIT (por ejemplo, un cáncer asociado con KIT), que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo (tal cual o manipulada (tal como lisada), por ejemplo, para facilitar el ensayo); (b) ensayar dicha muestra biológica con respecto a la presencia de una o más quinasas KIT mutantes; y, basándose en los resultados de dicho ensayo, tal como cuando están presentes una o más quinasas KIT mutantes en dicha muestra, entonces (c) administrar a dicho individuo BMS-354825, preferentemente como un agente activo en una composición farmacéutica, solo, o en combinación con otro inhibidor de quinasa y/o con otro agente adecuado para el tratamiento de dicho trastorno asociado con proteína tirosina quinasa, administrándose dicho otro inhibidor de quinasa y/u otro agente de forma simultánea o secuencial con la administración de BMS-354825), en el que, por ejemplo y sin limitación:

(1)

la identificación de al menos una quinasa KIT mutante que es al menos parcialmente sensible a la inhibición con BMS-354825 puede usarse opcionalmente para seleccionar el tratamiento con BMS-354825 preferentemente a otro u otros inhibidores de quinasa (por ejemplo, cuando se espera que BMS-354825 sea eficaz contra dicho mutante a dosis terapéuticamente útiles mejor toleradas por los pacientes que dosis de dicho otro u otros inhibidores de quinasa;

(2)

la identificación de al menos una quinasa KIT mutante puede usarse opcionalmente para seleccionar la dosis de BMS-354825, incluyendo para aumentar o reducir la dosis del mismo (para individuos no tratados previamente con BMS-354825 o que se están sometiendo al tratamiento con BMS-354825), por ejemplo, cuando la quinasa KIT mutante se inhibe por BMS-354825 en un grado menor o mayor, respectivamente, con respecto a la quinasa KIT WT; y/o

(3)

la identificación de al menos una quinasa KIT mutante puede usarse opcionalmente para seleccionar la co-administración de otro agente adecuado para el tratamiento de dicho trastorno asociado con proteína tirosina quinasa (incluyendo otro inhibidor de quinasa tal como imatinib) con BMS-354825, por ejemplo, cuando dicho agente es al menos parcialmente eficaz para inhibir dicha quinasa KIT mutante.

También se incluyen por la presente divulgación procedimientos racionales de exploración de diseño de fármacos. Con el descubrimiento de que BMS-354825 es un inhibidor eficaz de quinasas KIT mutantes resistentes a imatinib, un experto en la materia podrá diseñar compuestos en el contexto de una estructura cristalina de una quinasa KIT mutante unida a BMS-354825. Esta definición de la estructura cristalina permite que un experto en la materia evalúe la conformación de una quinasa KIT mutante y los restos de aminoácidos o dominio críticos para la unión y actividad del compuesto. De esta manera, la presente invención proporciona la base para una diversidad de análisis comparativos así como un diseño racional de fármacos.

A este respecto, la divulgación contempla un procedimiento para tratar a un mamífero que padece un trastorno asociado con KIT mutante que comprende administrar a un mamífero que necesita dicho tratamiento un compuesto que es un inhibidor selectivo y potente de una quinasa KIT mutante que puede obtenerse por un procedimiento de exploración, que comprende: (1) poner en contacto una quinasa KIT mutante con BMS-354825 en condiciones que permitan que la quinasa KIT mutante forme un complejo con BMS-354825, (2) resolver la estructura cristalina del complejo quinasa KIT mutante-BMS-354825 para identificar un dominio de unión, (3) diseñar compuestos que se espera que se ajusten dentro de un dominio de unión identificado, y (4) ensayar dichos compuestos diseñados con respecto a la actividad en la inhibición de dicha quinasa KIT mutante.

Para su uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, también se

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proporcionan kits. Dichos kits pueden comprender un medio de vehículo que está compartimentalizado para recibir en confinamiento próximo uno o más medios de recipiente tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los medios de recipiente uno de los elementos separados a usar en el procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sonda que está marcada o puede marcarse de forma detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína quinasa KIT mutante o un gen de quinasa KIT mutante o mensajero, respectivamente. Cuando el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit puede tener también recipientes que contienen nucleótidos para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisótopo.

El kit proporcionado típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes distintos que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para el uso. En el recipiente puede estar presente a un marcador para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para el uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente.

Los kit útiles en la puesta en práctica de procedimientos terapéuticos desvelados en el presente documento también pueden contener un compuesto que sea capaz de inhibir una quinasa KIT mutante. Específicamente se contempla un kit que comprende BMS-354825 útil para tratar mamíferos que padecen un trastorno asociado con KIT mutante. Por ejemplo, en el presente documento se contemplan kits útiles para identificar una quinasa KIT mutante en un paciente mamífero (por ejemplo, un ser humano) que padece un cáncer que es resistente o ha desarrollado resistencia a imatinib y en el que dichos kits también comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de BMS354825.

Los siguientes ejemplos representativos contienen información adicional importante, ejemplificaciones y pautas que pueden adaptarse a la puesta en práctica de la presente invención en sus diversas realizaciones y sus equivalentes. Estos ejemplos pretenden ayudar a ilustrar la invención, y no están destinados a limitar su alcance ni deben considerarse de esta manera.

Ejemplos

Materiales y Procedimientos para los Ejemplos 1-9

Líneas Celulares

La línea celular FLT3 Ba/F3 de tipo silvestre, una línea de pro-linfocitos B hematopoyética dependiente de interleucina 3 (IL-3) murina, la línea de células de ovario de hámster chino CHO-K1 y la línea de mastocitos murinos p815 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). La mutación murina D814Y descrita en esta línea celular es homóloga a la mutación D816Y de KIT humana. La línea celular M-07e dependiente del factor de steel humano (SLF) se obtuvo del Dr. Hal Broxmeyer (Departamento de Microbiología e Inmunología, Walther Oncology Center, Escuela Universitaria de Medicina de Indiana, Indianapolis, IN). Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (HyClone, South Logan, UT), Penicilina G al 1% (10.000 unidades/ml) y Estreptomicina (10.000 ug/mg), L-Glutamina 2 mM (ambas de Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añadió el sobrenadante que contenía IL3 filtrado (10%) de células WEHI-3 (ATCC, Manassas, VA) al medio de crecimiento para la línea celular Ba/F3 parental. Se cultivaron células M-07e usando el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos humano recombinante como un suplemento del crecimiento como se describe en Heinrich, y col., Blood, 96: 925-932 (2000).

Mutagénesis Dirigida y Generación de una Línea Celular Ba/F3 que Expresa Mutantes

KIT

El ADNc de KIT se proporcionó generosamente por el Dr. Axel Ullrich (Departamento de Bilogía Molecular, Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, Munich, Alemania) y se clonó en el plásmido del vector retroviral pLXSN (BD Biosciences, Palo Alto, CA), el vector plasmídico pCDNA3.1 o el plásmido M5gNeo (Lu, L., y col., Blood, 94:2319-2332 (1999)). Se usó mutagénesis dirigida para crear las mutaciones D816V, D816Y y D816F (QuickChange Kit, Stratagene, La Jolla, CA) y todas las mutaciones se confirmaron por secuenciación bidireccional (O’Farrell, A. M., y col., Blood, 101:3597-3605 (2003)). Se realizó transducción retroviral y se generaron líneas celulares Ba/F3 que expresaban de forma estable isoformas de KIT mutantes por selección doble de resistencia a G418 y crecimiento independiente de IL-3 (Yee, K. W., y col., Blood, 100:2941-2949 (2002); Yee, K. W., y col., Blood, 104:4202-4209 (2004); Tse, K. F., y col., Leukemia, 14:1766-1776 (2000); Schittenhelm, M. M., y col., manuscrito presentado (2005)). Se realizaron transfecciones transitorias de líneas celulares de hámster chino CHOK1 con isoformas de KIT de tipo silvestre (“WT”) o mutantes usando un ensayo de lipofección (kit LipofectAMINE adquirido en Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se trataron con BMS-354825 24 horas después de la transfección (Heinrich, M. C., y col., Journal of Clinical Oncology, 21:4342-4349 (2003)).

Anticuerpos y Reactivos

Se usaron un anticuerpo policlonal de conejo anti-KIT, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-STAT3 (ambos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), un anticuerpo de conejo anti-AKT (policlonal) (Cell Signaling Technology, Beverly MA) y un anticuerpo monoclonal de conejo anti-MAP quinasa 1/2 (Erk 1/2) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a una dilución de 1:5000 a 1:2000. Se usaron anticuerpos anti-fosfotirosina KIT (Tyr568/570 y Tyr703), un anti-fosfotreonina/tirosina MAP quinasa (Thr202/Tyr204), un anticuerpo anti-fosfotreonina (Thr308) y un anticuerpo anti-fosfoserina (Ser473) AKT, un anticuerpo anti-fosfotirosina (Tyr705) STAT3 y un anticuerpo anti-fosfotirosina no específico (clon pY20) a diluciones de 1:100 a 1:2000 (todos de Cell Signaling Technology, Beverly MA). El anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa y el anticuerpo de cabra anticonejo se usaron a diluciones de 1:5000 y 1:10000 respectivamente (BioRad; Hercules, CA). El reactivo de inmunoprecipitación de proteína A/G PLUS-Agarose se adquirió en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El compuesto de molécula pequeña BMS-354825 se obtuvo en Bristol-Myers Squibb (Princeton, NJ). El mesilato de imatinib (STI-571/Gleevec®) se adquirió en la farmacia del Hospital Universitario de Ciencias de la Salud de Oregón (Portland, OR). El imatinib y BMS-354825 se disolvieron en DMSO para crear soluciones madre 10 mM y se almacenó a -20ºC.

Transferencias de Western

Se expusieron ∼5 x 107 células a concentraciones variables de BMS-354825 y se cultivaron durante 90 minutos a 37 ºC en una atmósfera con un 5% de CO2. Los sedimentos celulares se lisaron con 100-150 µl de tampón de lisis de proteínas (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato al 0,25% con inhibidores añadidos aprotinina, AEBSF, leupeptina, pepstatina, ortovanadato sódico y piruvato sódico). Para los experimentos de inmunoprecipitación se usaron 500-2000 microgramos de proteína de lisados celulares y para los análisis de proteínas de células enteras por ensayos de inmunotransferencia de Western como se ha descrito previamente en Hoatlin, M. E., y col., Blood, 91:1418-1425 (1998) se usaron 75-200 microgramos de proteína de lisados celulares.

Ensayos de Proliferación

Las células se añadieron a placas de 96 pocillos a densidades de 30.000 células/pocillo. Se añadió BMS-354825 y la proliferación se midió a 72 horas usando un ensayo basado en XTT (Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN) (Heinrich, M. C., y col., Blood, 96:925-932 (2000)).

Ensayos de Apoptosis

Las células se incubaron con BMS-354825 durante 48-72 horas y se analizó la translocación de fosfatidilserina desde la capa interna a la capa externa de la membrana plasmática como un indicador precoz de apoptosis usando un kit AnnexinV-FITC (Immunotech, Marseille, Francia) (Heinrich, M. C., y col., Blood, 96:925-932 (2000)) y un citómetro de flujo FACScalibur cargado con el software de análisis CellQuest (BD, Heidelberg, Alemania).

Análisis de los Datos

Se crearon gráficos de dosis-efecto para calcular el valor de CI50 para el efecto de tratamiento de BMS-354825 para cada línea celular (Yee, K. W., y col., Blood, 104:4202-4209 (2004); Chou, T. C., y col., Adv. Enzyme Regul., 22:2755 (1984). (Software Calcusyn disponible en Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Los resultados se expresan como un valor de CI50, que es la concentración de fármaco necesaria para inhibir la proliferación celular (es decir, absorbancia a 492 nM) al 50% de la de las células de control no tratadas.

Ejemplo 1-BMS-354825 inhibe la actividad quinasa de isoformas de KIT mutante JM y de tipo silvestre

BMS-354825 es un potente inhibidor de quinasa SRC/ABL doble que actualmente está en estudios clínicos de fase I/II de LMC y tumores sólidos. Los presentes solicitantes muestran a continuación en el presente documento que BMS-354825 inhibía de forma potente la autofosforilación dependiente de ligando de la quinasa KIT de tipo silvestre en la línea celular de leucemia mieloide humana dependiente de SCF M-07e con un valor de CI50 de 1-10 nM. BMS354825 también inhibía la proliferación dependiente de SCF de estas células con un valor de CI50 similar (CI50 5-10 nM). En comparación, los valores de CI50 para la inhibición por imatinib de la autofosforilación y proliferación son 50100 nM, respectivamente (Heinrich, M. C., y col, Science, 299:708-710 (2003) (FIG. 1A-B). BMS-354825 tuvo poco efecto sobre la proliferación dependiente de GM-CSF de esas células (CI50 > 10.000 nM), lo que sugiere que el efecto de BMS-354825 sobre la proliferación dependiente de SCF se debe a su inhibición de la quinasa KIT en lugar de a efectos directos sobre quinasas cadena bajo (por ejemplo, miembros de la familia SRC) que podrían ser comunes tanto para KIT como para los receptores de GM-CSF (FIG. 1B).

Se producen mutaciones de aumento de función que implican el dominio yuxtamembrana de KIT (“JM”) en algunos casos de enfermedad de mastocitos (Akin, C., y col., Blood, 103:3222-3225 (2004)) y leucemia mielógena aguda (“LMA”) (Beghini, A., y col, Haematologica, 89:920-925 (2004)). Además, se encuentran mutaciones JM de KIT en aproximadamente dos tercios de los tumores estromáticos gastrointestinales (GIST), y esta subserie de GIST tiene la mejor respuesta clínica a imatinib (Heinrich, M. C., y col, Journal of Clinical Oncology, 21:4342-4349 (2003); Heinrich, M. C., y col., Blood, 96:925-932 (2000); Corless, C. L., y col., J. Clin. Oncol., 22:3813-3825 (2004); DebiecRychter, M., y col., Eur. J. Cancer, 40:689-695 (2004); Heinrich, M. C., y col., Hum. Pathol., 33:484-495 (2002)).

Los presentes solicitantes ensayaron la actividad de BMS-354825 contra mutaciones JM de KIT. Tanto BMS-354825 como imatinib inhibían la proliferación celular de las células mutantes V560G de KIT con un valor de CI50 de 5-10 nM (datos no mostrados). Sin embargo, BMS-354825 inducía la apoptosis de células mutantes V560G de KIT con un valor de CI50 de 14 nM, mientras que el valor de CI50 para imatinib era ~ 70 nM (datos no mostrados)

Ejemplo 2 -BMS-354825 inhibe la actividad quinasa de mutaciones AL de KIT resistentes a imatinib encontradas en malignidades hematológicas

Aunque el imatinib inhibe de forma potente la actividad quinasa de la quinasa KIT mutante JM y WT, tiene una actividad mínima contra quinasas KIT mutantes D816Y, D816F o D816V (Ma, Y., y col., Blood, 99:1741-1744 (2002)). La incapacidad del imatinib de inhibir estas isoformas mutantes de KIT se debe al enfrentamiento estérico entre imatinib y la conformación “abierta” (o activa) de la KIT AL (Lombardo, L. J., y col., J. Med. Chem., 47:66586661 (2004); Shah, N. P., y col., Science, 305:399-401 (2004)). El modelo estructural previsto de la unión de BMS354825 a ABL sugiere que los cambios en la conformación de AL podrían no afectar significativamente a la unión del fármaco. Por lo tanto, se ensayó la actividad de inhibición de BMS-354825 contra quinasas KIT mutantes que implican el codón 816 usando la línea celular de mastocitosis murina que se produce espontáneamente, p815, que expresa una mutación de KIT murina D814Y que es homóloga a la mutación D816Y humana. BMS-354825 inhibía de forma potente la autofosforilación de KIT con un valor de CI50 de 1-10 nM e inhibía la proliferación celular e inducía la apoptosis de células p815 con valores de CI50 de 10-25 nM y ~ 25 nM respectivamente (FIG. 2A-FIG. 2C). Por lo tanto, la inhibición de BMS-354825 de la quinasa KIT en células p815 está muy correlacionada con la inhibición de la proliferación celular y la inducción de apoptosis. Por el contrario, el imatinib 1200 nM sólo inhibía la proliferación de células p815 en un 30% y no inducía la muerte celular programada.

Ejemplo 3 – Efectos de diferentes sustituciones de aminoácidos de KIT con Ácido Aspártico 816 (D816) sobre la sensibilidad a BMS-354825

Para evaluar si BMS-354825 podría tener diferente potencia contra diferentes mutantes de KIT 816, tales como las mutaciones D816Y, D816V y D816F, los presentes solicitantes generaron líneas celulares Ba/F3 independientes del factor isogénico que expresaban mutaciones en el codón 816 asociadas con MS con un intercambio de ácido aspártico por valina (D816V), tirosina (D816Y) o fenilalanina (D816F). BMS-354825 inhibía la autofosforilación de las mutaciones de KIT humana D816V y D816F con un valor de CI50 de aproximadamente 100 nM. Sin embargo, el valor de CI50 para la inhibición de la autofosforilación de la mutación D816Y de KIT era significativamente menor (CI50 1-10 nM, FIG. 3A).

En comparación, el imatinib en dosis de hasta 10.000 nM no inhibía significativamente la autofosforilación de KIT en células D816V y D816F. Sin embargo, las células D816Y eran moderadamente sensibles a la terapia con imatinib con dosis > 1000 nM pero < 10.000 nM que inhibían completamente la autofosforilación de KIT (FIG. 3B). Estos descubrimientos están de acuerdo con los resultados para la línea celular P815 murina (D814Y) mostrada en la FIG. 2A-2C.

Ejemplo 4 -BMS-354825 inhibe la activación dependiente de KIT de rutas de señalización aguas abajo

Los presentes solicitantes también estudiaron los efectos de la inhibición de la quinasa KIT por BMS-354825 sobre el estado de activación de rutas de señalización aguas abajo dependientes de KIT, incluyendo MAPK, AKT y STAT3. La FIG. 4 muestra transferencias de western representativas para células Ba/F3 independientes del factor que expresan mutaciones de KIT humana D816V, D816F o D816Y. Para comparación, los presentes solicitantes también muestran los efectos de BMS-354825 sobre la activación de MAPK1/2, AKT y STAT3 en células p815. La MAP quinasa 1/2 (ERK1/2), STAT3 y AKT están activadas constitutivamente en estas células. La fosforilación de STAT3 y MAPK1 se inhibía de forma potente y completa en células tratadas con BMS-354825 con valores de CI50 que son similares a los observados para la inhibición de la autofosforilación de KIT. La activación de AKT se inhibe de forma potente pero incompleta usando dosis de BMS-354825 de 10-1000 nM. De forma similar, la activación de MAPK2 también se inhibía menos potentemente que MAPK1 (FIG. 4).

Ejemplo 5 – Efectos de BMS-354825 sobre la proliferación celular y supervivencia de células isogénicas que expresan KIT D816F/V/Y

De forma coherente con los resultados de los estudios bioquímicos de los presentes solicitantes, BMS-354825 inhibía la proliferación de células Ba/F3 KIT D816V y D816F con un valor de CI50 de 100-150 nM y con un valor de CI50 de 5 nM para la inhibición de la proliferación de células Ba/F3 D816Y. Por el contrario, el imatinib no tuvo ningún efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento de estas tres líneas celulares (CI50 > 10.000 nM, FIG. 5A-FIG. 5C). BMS-354825 también inducía de forma potente la apoptosis de las líneas celulares Ba/F3 KIT D816V y D816F con valores de CI50 calculados de 220 nM y 120 nM, respectivamente. El valor de CI50 para la inducción de apoptosis de la línea celular Ba/F3 D816Y fue de 15 nM (FIG. 6C). Como se muestra, BMS-354825 es al menos un log más potente contra KIT D816Y que contra KIT D816V/F (FIG. 6A-6C).

Ejemplo 6 -BMS-354825 es un log más potente contra isoformas de KIT WT o mutantes JM que contra isoformas de KIT mutantes AL

Para comparar KIT WT con KIT mutante AL en el mismo contexto celular, se realizaron experimentos adicionales en los que se transfectaron de forma transitoria células CHO con vectores de expresión que codificaban isoformas de KIT WT o mutantes. Las células transfectadas se trataron con BMS-354825 y se analizaron bioquímicamente como se ha descrito anteriormente. BMS-354825 inhibía la autofosforilación de KIT WT estimulada con SCF (análoga a M07eE) o KIT mutante JM con un valor de CI50 de 1-10 nM, mientras que el valor de CI50 para la inhibición de la autofosforilación de las mutaciones de KIT D816V y D816H (presentadas en < 5% de casos de MS (Valent, P., y col., Leak. Lymphoma, 46:35-48 (2005) y el 7% de casos de seminoma (Kemmer, K., y col., Am. J. Pathol., 164:305313 (2004)), fue de aproximadamente 100-500 nM (FIG. 7).

Ejemplo 7 – Inhibición de la actividad quinasa de c-KIT humana de tipo silvestre y mutante (D816V) por BMS-354825

En un volumen de reacción final de 25 µl, se incubó quinasa KIT WT o quinasa KIT mutante (D816V) (5-10 mU) con MOPS 8 mM pH 7,0, EDTA 0,2 mM, MnCl2 10 mM, poly(Glu/Tyr) a 0,1 mg/ml 4:1, MgAcetato 10 mM y [γ-33P-ATP] (actividad específica aproximadamente 500 cpm/pmol, concentración según se requiera). La reacción se inició por la adición de la mezcla de MgATP. Después de la incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo por la adición de 5 µl de una solución de ácido fosfórico al 3%. Después se aplicaron 10 µl de la reacción sobre un Filtermat A y se lavaron tres veces durante 5 minutos en ácido fosfórico 75 mM y una vez en metanol antes del secado y el recuento de centelleo. Como se muestra en la FIG. 10, BMS-354825 inhibe eficazmente la actividad quinasa de la quinasa KIT mutante que contiene una mutación D816V.

Ejemplo 8 – Inhibición del crecimiento celular de la línea celular de mastocitosis murina p815 que lleva un mutante de KIT (D814Y)

La línea celular de mastocitoma murino p815 que expresa la mutación D814Y (correspondiente a D816Y humana) se adquirió en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y tampón HEPES 25 mM a 37 ºC/5% de CO2. Como se muestra en la FIG. 11, el valor de CI50 para la inhibición del crecimiento celular para BMS-354825 fue 7 nM, mientras que el valor de CI50 para la inhibición del crecimiento celular en el caso de imatinib fue de 1700 nM.

Como se ha analizado anteriormente, las mutaciones puntuales de aumento de función del bucle de activación de KIT (“AL”) están asociadas con ciertos neoplasmas humanos, incluyendo trastornos de mastocitosis sistémica, LMA, seminoma y GIST (tanto GIST primario como resistente a imatinib). En el caso de trastornos de mastocitos, seminoma y LMA, la mutación de KIT asociada más comúnmente es el reemplazo del resto normal de ácido aspártico en el codón 816 del bucle de activación por un resto de valina (D816V). La mutación D816V da como resultado una activación constitutiva de la actividad de la quinasa KIT y se predice que ayuda a estabilizar a la AL en la conformación activa. Además de D816V, se han notificado otras mutaciones que implican el codón 816 en trastornos sistémicos de mastocitos (D816Y, D816F), LMA (D816Y) y/o seminomas (D816Y, D816IT). De forma coherente al modelo estructural de la unión de imatinib a KIT, la actividad quinasa de todos estos mutantes es resistente a imatinib.

Como se describe en el presente documento, se determinó que BMS-354825 era un potente inhibidor de KIT de tipo silvestre con un valor de CI50 para la inhibición de la autofosforilación y la proliferación celular de 5-10 nM. En comparación, el valor de CI50 para la inhibición de la autofosforilación y la proliferación en estas mismas células por imatinib fue de 10 a 20 veces mayor (~100 nM).

Las mutaciones yuxtamembrana (“JM”) de KIT comúnmente están asociadas con GIST humanos y con una minoría de casos de MS y LMA. BMS-354825 también inhibe de forma potente las mutaciones JM de KIT con un valor de CI50 de 1-10 nM. BMS-354825 tuvo una potencia similar a imatinib para la inhibición de la autofosforilación de KIT y la proliferación celular en una línea de mastocitos que expresa KIT mutante JM (datos no mostrados) y era incluso más potente que el imatinib para inducir la apoptosis de esta línea celular, con valores de CI50 de ~15 nM (BMS354825) y ~70 nM (imatinib), respectivamente (datos no mostrados).

BMS-354825 es un inhibidor mucho más potente de mutantes AL de KIT que imatinib, con valores de CI50 para la inhibición de la autofosforilación de mutantes D816 de KIT en el intervalo de 10-100 nM. La potencia de BMS354825 contra la quinasa KIT se ve influenciada diferencialmente por diversas mutaciones AL. Por ejemplo, KIT D816Y es 10 veces más sensible a BMS-354825 que KIT D816V o KIT D816F. Además, KIT D816F es aproximadamente 2 veces más sensible a BMS-354825 que KIT D816V.

Como se describe en el presente documento, la inhibición de la quinasa KIT en líneas celulares de mastocitosis humana (datos no mostrados) y p815 (mastocitosis murina) dio como resultado la inhibición de la proliferación celular y la inducción de apoptosis. Como se sabe que la inhibición de la quinasa KIT se requiere en el desarrollo para la formación de mastocitos; la inhibición de una quinasa oncogénica alternativa (FIP1L1-PDGFRA) da como resultado respuestas clínicas notables en MS variantes asociadas con esta alteración genómica; y la inhibición de KIT D816V por el inhibidor de quinasa PKC412 dio como resultado una mejora hematológica y clínica en un paciente con leucemia de mastocitos, los datos desvelados en el presente documento confirman el aspecto de la presente divulgación de que la inhibición terapéutica de la quinasa KIT sería eficaz para mastocitosis humanas que están asociadas con mutaciones D816 de KIT.

Como se analiza en el presente documento, es de esperar que BMS-354825 tenga una actividad biológica y clínica contra enfermedades humanas asociadas con mutaciones AL de KIT, incluyendo enfermedad de mastocitos, en particular mastocitosis sistémica (“MS”), LMA, seminoma y GIST resistente a imatinib.

Ejemplo 9 – Mutaciones de activación del bucle de activación (AL) de KIT están asociadas con ciertos neoplasmas humanos, incluyendo una subserie de pacientes con LMA y trastornos sistémicos de mastocitos (MS).

Las mutaciones AL de KIT tales como D816V que se encuentran típicamente en LMA y MS son resistentes a imatinib (IM, CI50 > 5-10 µM). Dasatinib (BMS-354825) es un nuevo inhibidor de quinasa con múltiples dianas, oral, que se dirige a BCR-ABL y SRC. Debido a su potente inhibición de estas quinasas, el dasatinib actualmente se está ensayando en pacientes con LMC/LLA Ph+ intolerante/resistente a imatinib en ensayos clínicos. Basándose en las observaciones previas de la capacidad de ciertos inhibidores de SRC/ABL de inhibir también la quinasa KIT, los presentes solicitantes propusieron la hipótesis de que el dasatinib podría inhibir la actividad quinasa de isoformas de KIT WT y mutantes. El potencial inhibidor de dasatinib contra KIT WT, isoformas mutantes de KIT y rutas aguas abajo dependientes de KIT se evaluó por inmunotransferencia. Además, los presentes solicitantes evaluaron los efectos de dasatinib sobre la proliferación celular e inducción de la apoptosis. Dasatinib inhibía de forma potente la autofosforilación de KIT WT, mutante yuxtamembrana (JM) y mutante AL. Basándose en la capacidad de dasatinib de unirse a BCR-ABL independientemente de la conformación de ATP AL (inactiva frente a activa), era de esperar que el dasatinib fuera insensible a la conformación de KIT AL. Por el contrario, los presentes solicitantes descubrieron que el valor de CI50 para la autofosforilación de KIT variaba significativamente entre las diferentes isoformas mutantes de KIT: KIT WT, D816Y, V560G (mutación JM) [CI50 1-10 nM] < D816F [CI50 100 nM] < D816V [CI50 200-250 nM]. Estos resultados indican que la conformación de la KIT AL influye en la potencia del dasatinib. La inhibición de la actividad quinasa de KIT por dasatinib reducía la proliferación celular e inducía la apoptosis en líneas celulares de leucemia/mastocitos que expresan isoformas de KIT mutantes. En estas líneas celulares, KIT activa las rutas aguas abajo importantes para la viabilidad celular y la supervivencia celular tales como RAS/MAPK, JAK/STAT y PI3K/AKT. El dasatinib bloqueaba potentemente la activación de MAPK1/2 y STAT3. La inhibición de KIT por dasatinib anulaba la fosforilación de AKT S473, pero no AKT T308. Esta inhibición parcial de la activación de AKT era insuficiente para inhibir la fosforilación de p70S6K, una quinasa aguas abajo de AKT y mTOR. La combinación de dasatinib con rapamicina, un inhibidor de mTOR conocido, tenía un efecto aditivo al efecto antiproliferativo sinérgico sobre células que expresaban KIT D816V. Los estudios de los presentes solicitantes sugieren que el dasatinib puede tener eficacia clínica contra neoplasmas humanos que están asociados con mutaciones de KIT de aumento de función tales como LMA o MS. La combinación de dasatinib con inhibidores de mTOR puede aumentar adicionalmente la eficacia contra malignidades dirigidas por KIT.

Se realizaron experimentos como se describe en el presente documento para las líneas celulares p815 murina y BaF3 D816V humana. Específicamente, los ensayos de apoptosis sobre las líneas celulares p815 fueron como se describe usando el ensayo del kit AnnexinV-FITC (Immunotech, Marseille, Francia) y como se describe en Heinrich,

M. C., y col. (Journal of Clinical Oncology, 21:4342-4349 (2003) para BaF3 D816V.

Como se muestra en la Figura 12, la inhibición mediada por dasatinib de la actividad de la quinasa KIT mutante AL bloquea la activación de rutas importantes aguas abajo, incluyendo STAT3, AKT y MAPK1/2.

Como se muestra en las Figuras 13 a 15, la combinación de dasatinib y rapamicina dio como resultado un efecto sinérgico fuerte sobre la antiproliferación celular y la apoptosis de células que llevan la mutación de KIT D816V.

La combinación de dasatinib y rapamicina dio como resultado índices de combinación (IC) de 0,30, 0,26 y 0,32 para los efectos antiproliferativos del 50, 75 y 90% (DE50, DE75 y DE90). Un IC < 1 es indicativo de un efecto sinérgico, un IC = 1 es indicativo de un efecto aditivo y un IC > 1 es indicativo de un efecto antagonista. Los valores de IC se calcularon usando el software Calcusyn (Biosoft) versión 1.1.1.

De acuerdo con los datos obtenidos hasta la fecha y como se demuestra en el presente documento, el dasatinib puede inhibir prácticamente toda la proliferación celular e inducir apoptosis en las líneas celulares ensayadas cuando se usa en dosis suficientes, mientras que se determinó que el efecto anti-proliferativo máximo de las rapamicinas era sólo de aproximadamente un 50-60% de inhibición usando dosis relevantes para tratar seres humanos. Sin embargo, los niveles tan bajos como de 4 nM de Dasatinib y 1 nM de rapamicina en células p815 (que llevan una mutación análoga al mutante D816Y humano) inducía la apoptosis de ~ 70% de células p815 en un experimento de AnnexinV/PI.

Sobre el nivel de proteínas, el dasatinib solo no podía inhibir el estado de fosforilación de la quinasa p70S6, que está aguas abajo de AKT y mTOR. Por el contrario, la rapamicina sola o en combinación con dasatinib inhibe completamente la fosfo-p70S6 quinasa en dosis terapéuticas relevantes. Esto podría explicar el efecto de citotoxicidad celular sinérgico observado en líneas celulares p815 y Ba/F3 KIT D816V (datos no mostrados) (véase la Figura 13B).

El efecto sinérgico de dasatinib y rapamicina puede apreciarse calculando el nivel teórico de estos compuestos necesario para conseguir un cierto nivel de efecto antiproliferativo o apoptosis, tanto individualmente como en combinación. Por ejemplo, para inhibir la proliferación celular en un 50% se necesitaría una dosis de dasatinib de aproximadamente 236 nM o una dosis de rapamicina de aproximadamente 7,2 nm basándose en el IC y los valores de isobolograma descritos en el presente documento. Sin embargo, usando una combinación de 40 nM de dasatinib

+ 0,8 nM de rapamicina, se obtendría una inhibición del 50% de la proliferación celular para el mutante D816V (el nivel 1 log superior de dasatinib necesario con respecto al D814Y es coherente con la menor sensibilidad al dasatinib observada para el mutante D816V). Como alternativa, si la inhibición deseada de la proliferación fuera del 95%, se necesitaría una concentración 600 nM de dasatinib y se necesitaría una concentración muy alta de rapamicina (> 1 micromolar) basándose en el IC y los valores de isobolograma descritos en el presente documento, sin que pueda conseguirse el último nivel de rapamicina posiblemente en seres humanos. Sin embargo, usando una combinación de una concentración de 295 nM de dasatinib y 5,9 nM de rapamicina, se podría conseguir este nivel de efecto antiproliferativo para el mutante D816V.

Materiales y Procedimientos para el Ejemplo 10

Muestras de Tumor y Líneas Celulares

Se obtuvieron muestras de tumor del Banco de Tejidos del Instituto del Cáncer de la Universidad de la Salud y Ciencias de Oregón (OHSU), de los Departamentos de Patología y Dermatología de OHSU, la Sección de Dermatología de la Universidad de Chicago, y el Departamento de Patología del Hospital Brigham y de Mujeres, Boston. Se obtuvieron células LoVo (una línea celular de cáncer de colon que es de tipo silvestre para KIT) de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Los clones transfectados de forma estable de células Ba/F3 (pro-linfocitos B hematopoyéticas dependientes de interleucina 3 murina) que expresan isoformas de tipo silvestre, D816V, D816F o D816Y de ADNc de KIT humana se describen en Schittenhelm y col. Cancer Res 66:473-81 (2006). En los experimentos de validación se usó ADN extraído de los subclones de Ba/F3.

Preparación de ADN

Se extrajo ADN de células LoVo y Ba/F3 con el mini kit de ADN QIAamp (Qiagen Nº 51306). Se usó el mismo kit para extraer ADN genómico de aspirados de sangre y de médula ósea, así como de tejido fijado con formalina (no incluido) y muestras de tejido incluido en parafina fijado con formalina, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

PCR Convencional

Se generaron 17 amplímeros de exón de KIT a partir de ADN genómico como se ha descrito previamente (Kemmer y col., Am J Pathol 164:305-13 (2004)). Para la reacción de PCR convencional (control), el cebador directo fue 5’ TGTATTCACAGAGACTTGGC 3’ (SEC ID Nº: 3) y el cebador inverso fue 5’ TAATGTTCAGCATACCATGCAA 3’ (SEQ ID Nº: 4). Este cebador inverso se empareja con secuencias en el intrón 17 de KIT y también se usó en la PCR específica de alelo. Para amplificar secuencias de ADNc de KIT a partir de subclones de Ba/F3, el mismo cebador directo se emparejó con el cebador inverso 5’ GCTCCCAAAGAAAAATCCCATAGG 3’ (SEC ID Nº: 5).

PCR Específica de alelo

Se realizaron reacciones PCR específicas de alelo usando 200 ng de ADN y una mezcla maestra basada en el kit Expand High Fidelity Polymerase (Roche Nº 11759078001), con 1,4 unidades de polimerasa, dNTP 160 µM (Stratagene, Cedar Creek, TX), cebador específico de mutación 400 nM (véase la Figura 16), oligonucleótido de bloqueo 200 nM (véase la Figura 16) y cebador inverso 800 nM (5’ TAATGTTCAGCATACCATGCAA 3’ (SEC ID Nº: 4)). Las condiciones de ciclo fueron las siguientes: 95ºC durante 1 minuto, seguida de 45 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y una incubación final de 7 minutos a 73ºC.

HPLC y Secuenciación del ADN

Los productos de PCR se analizaron en un sistema de HPLC desnaturalizante (WAVE™, Transgenomic, Inc., Omaha, NB), como se ha descrito previamente (Corless y col., J Clin Oncol 22:3813-25 (2004)). La secuenciación del DNA se realizó usando el kit terminador BIGDye (ABI) y se analizó en un secuenciador capilar ABI 310 (Heinrich y col., J Clin Oncol 21:4342-49 (2003)).

Ejemplo 10 -Ensayo de PCR específica de alelo para detectar mutaciones D816V y D816F

Las mutaciones oncogénicas de KIT contribuyen a la patogénesis de tumores estromáticos gastrointestinales, mastocitosis sistémica (MS) y algunos casos de leucemia mielógena aguda (LMA). Las sustituciones D816V y D816F en el bucle de activación de KIT dan como resultado una resistencia completa al inhibidor de quinasa imatinib (GleevecTM). Como estas mutaciones son particularmente comunes en MS y LMA, su detección tiene significado de diagnóstico y predictivo. Desafortunadamente, la fracción de células positivas para la mutación en muestras clínicas de pacientes con MS con frecuencia está por debajo del umbral del 20-30% necesario para la detección por la secuenciación directa del ADN. Los presentes solicitantes han desarrollado un ensayo de PCR específico de alelo (AS-PCR) usando un cebador específico de mutación en combinación con un oligonucleótido de bloqueo de tipo silvestre que amplifica reproduciblemente D816V o D816F con una sensibilidad estimada del 1% de alelo mutante en ADN extraído a partir de tejido incluido en parafina y fijado con formalina. El nivel de sensibilidad es incluso superior cuando se usa ADN de un tejido no fijado (por ejemplo, aspirado de médula ósea).

A) Mutación D816V

En la Figura 16 se muestra el cebador específico de mutación (MSP) y el oligonucleótido de bloqueo. El MSP se diseña para cebar a partir del mutante A de la sustitución T >A de D816V, pero incluye un desacoplamiento intencionado en el penúltimo nucleótido 3’. Cuando se alinea con la secuencia de tipo silvestre (WT), el MSP tiene un doble desacoplamiento en el extremo 3’, que limita su capacidad de cebar. El MSP también puede cebar desde el segundo nucleótido de la sustitución de dos nucleótidos que da como resultado D816F (Figura 6), que es otra mutación asociada con la mastocitosis sistémica. El MSP también puede amplificar D816I y D816M (ambos desacoplamientos perfectos), así como D816L (penúltimo desacoplamiento). Sin embargo, estas mutaciones no se han detectado en la mastocitosis sistémica. Por otra parte, no sería de esperar que se amplificaran las mutaciones asociadas con mastocitosis conocidas D816H y D816Y, ya que las dos están doblemente desacopladas en los dos últimos nucleótidos de MSP.

El diseño del oligonucleótido de bloqueo (B-oligo) es lo contrario de MSP, de tal forma que tiene un doble desacoplamiento con las secuencias mutantes D816V y D816F, pero sólo tiene un desacoplamiento con WT. Además, el nucleótido 3’ terminal del B-oligo se asoció en una configuración invertida químicamente (3’ a 5’) para eliminar cualquier posibilidad de cebado.

Se realizaron estudios usando ADN purificado de células que son heterocigotas para la mutación D816V. La secuencia esperada del producto amplificado se confirmó por secuenciación bidireccional. La temperatura de hibridación óptima fue de 55 ºC. La adicción de B-oligo aumentó la sensibilidad del ensayo de 10 a 100 veces. Se ensayaron relaciones molares entre MSP y B-oligo que variaban de 2:1 a 1:2 y se observaron los resultados más coherentes a una relación de 2:1, que se usó en todos los ensayos posteriores. Además, la duplicación de la concentración del cebador inverso con respecto al MSP produjo amplificaciones más coherentes.

La sensibilidad del ensayo AS-PCR para KITD816V se vio influenciada por la calidad del ADN molde. Las señales positivas fueron detectables rutinariamente a un nivel de alelo mutante del 0,1% usando ADN extraído a partir de células que son heterocigotas para la mutación D816V, diluido en ADN de tipo silvestre de células LoVo. El umbral de detección fue mayor cuando se diluyó ADN obtenido de parafina de un seminoma heterocigoto para D816V con el mismo ADN de LoVo de tipo silvestre (Figura 17). La mutación D816V en ADN obtenido en parafina se detectó de forma reproducible a un nivel del 1%. El control positivo usado para todas las reacciones de AS-PCR fue un tubo paralelo que contenía el mismo cebador inverso acoplado a un cebador directo de exón 17 genérico, que estaba en posición 5’ con respecto al cebador específico de alelo y produjo un amplicón de mayor tamaño.

B) Mutación D816F

KIT D816F es una mutación rara en la enfermedad de los mastocitos y no se ha notificado en seminoma o GIST. Se usó ADNc de un clon de Ba/F3 que expresaba KITD816F como molde para ensayar la detección de esta mutación. La mutación fue detectable en el intervalo del 1 al 5%.

C) Validación del Ensayo AS-PCR

El ensayo AS-PCR se validó mediante el análisis de cinco tipos de muestras. En primer lugar, se ensayaron 64 muestras de ADN genómico de tipo silvestre para el exón 17 de KIT en la reacción específica de alelo. No se observaron amplificaciones con la mezcla MSP/B-oligo, mientras que los cebadores de control mostraron señales fuertes. El estado de tipo silvestre de KIT en estas 64 muestras se determinó por exploración por HPLC desnaturalizante; también se demostró que 31 de las muestras eran de tipo silvestre para KIT por secuenciación directa. Como 20 de las muestras procedían de líneas celulares (n=3) o tejido tumoral recién congelado (6 LMA, 3 GIST, 7 condrosarcoma mixoide, 1 linfoma), la calidad del ADN no fue un factor en estas reacciones de AS-PCR. Las 44 muestras restantes procedían de tumores incluidos en parafina (GIST, sarcoma no GIST, hemangioma, carcinoma tímico, carcinoma de células renales, oncocitoma renal, fibromatosis) que llevan el exón 17 de KIT de tipo silvestre. Como control negativo en todas las reacciones posteriores se incluyó ADN genómico de una línea celular de tipo silvestre para el exón 17 de KIT (células LoVo).

También se ensayó un grupo de subclones de Ba/F3 que expresaban diversas isoformas de ADNc de KIT. Como se ilustra en la Figura 18, se obtuvieron señales de AS-PCR positivas a partir de células transfectadas de forma estable con ADNc de D816V o D816F, pero no de células que contenían las formas WT o D816Y de KIT. Las reacciones PCR de control para la secuencias del exón 17 de KIT fueron positivas en todos los casos. Como la diana de amplificación en estas líneas celulares fue ADNc, se usó un cebador inverso diferente en las reacciones AS-PCR. Los resultados ilustran la especificidad de la combinación MSP/B-oligo para las mutaciones D816V y D816F.

Se analizó una serie de tumores que se sabía que eran positivos para D816V con el ensayo AS-PCR. Éstos incluían 8 muestras de LMA (ADN de células recientes) y 3 muestras de seminoma incluido en parafina (Figura 19, muestras 1-11). Todas estas muestras produjeron amplímeros positivos por AS-PCR. Como se ha indicado anteriormente, los presentes solicitantes no pudieron validar adicionalmente la reacción AS-PCR para la mutación D816F porque ninguna de las muestras de tumores de los presentes solicitantes tenía esta sustitución.

D) Otras Mutaciones

Los presentes inventores examinaron después un grupo de tumores con mutaciones alternas del codón 816 usando el ensayo AS-PCR. Dos seminomas con D816H no amplificaban ningún producto por AS-PCR, como era de esperar (Figura 19, muestras 12 y 13). D816H también es una mutación encontrada en GIST de pacientes con resistencia adquirida a imatinib, y dos de estos tumores eran negativos por AS-PCR a pesar de las sólidas amplificaciones con los cebadores de control (Figura 19, muestras 14 y 15). Los GIST resistentes a imatinib con D816G o D816A también eran negativos a AS-PCR (Figura 19, muestras 16 y 17, respectivamente).

De forma interesante, 2 muestras de LMA que llevaban una mutación D816Y por PCR convencional y secuenciación se volvieron positivas por AS-PCR (Figura 19, muestras 18 y 19). Se prepararon subclones Topo (Invitrogen) y se secuenciaron a partir de estos productos de amplificación y se detectaron clones positivos para D816V a bajos niveles (Figura 19, 1 de 20 del caso 18, 1 de 10 del caso 19). Estos resultados son coherentes con la sensibilidad estimada del ensayo AS-PCR y proporcionan pruebas de que hay heterogeneidad entre mutaciones de KIT que se producen en LMA. La heterogeneidad de la mutación puede responder de la pequeña señal AS-PCR positiva observada en uno de los GIST resistente a imatinib que parecían ser D816H por secuenciación directa (Figura 19, muestra 20).

Ejemplo 11 -Exploración de Biopsias de Pacientes

Se exploró un grupo de biopsias de pacientes adultos con presunta mastocitosis con respecto a la mutación del exón 17 de KIT usando la reacción PCR convencional y HPLC, con secuenciación confirmatoria cuando fue necesario, y por AS-PCR. Entre 21 muestras de médula ósea (aspirados o núcleos), 6 fueron positivas por los dos ensayos, 7 fueron positivas únicamente por AS-PCR, y las otras 8 fueron negativas por los dos ensayos (Figura 20 A-B). Las médulas ensayadas eran predominantemente muestras de referencia de pacientes con presunta mastocitosis sistémica. Las muestras de médula de un paciente con leucemia de mastocitos (Figura 20 A-B, muestra 29) y un paciente con MS-LMA (Figura 20 A-B, muestra 30) fueron positivas tanto por el ensayo convencional como por el ensayo AS-PCR. Por el contrario, las muestras de médula de 3 pacientes con un diagnóstico clínico de MS-MPD (Figura 20 A-B, muestras 56-58) eran negativas por los dos ensayos. De manera interesante, se observó que una de ellas era positiva para una mutación JAK2 D617F.

Ocho biopsias de piel de pacientes con infiltrados de mastocitos se exploraron con respecto a mutaciones del exón 17 de KIT usando la reacción PCR convencional y HPLC, con secuenciación confirmatoria cuando fue necesario, y por AS-PCR. Tres fueron positivas tanto por el ensayo convencional como por AS-PCR, otra fue positiva sólo por AS-PCR, y las 4 restantes fueron completamente negativas (Figura 20 A-B). Como no se hizo ningún intento de microdiseccionar las áreas en las que estaban implicados los mastocitos, es posible que los casos negativos tuvieran demasiado pocos mastocitos como para permitir la detección incluso por AS-PCR. Como alternativa, los infiltrados pueden no haber estado relacionados con una neoplasia dirigida por KIT mutante. Otros ejemplos de tejidos que produjeron resultados AS-PCR positivos incluyeron una biopsia de colon, un ganglio linfático y una de dos muestras sanguíneas (Figura 20 A-B).

Los resultados resumidos en la Figura 20A-B demuestran una excelente correlación entre el ensayo PCR convencional/HPLC y los resultados de AS-PCR, pero con una clara ventaja para la última. Las biopsias secuenciales de un paciente particular son de interés a este respecto. Una biopsia de colon de un hombre de 61 años (Figura 20 A-B, muestra 32) era morfológicamente coherente con el diagnóstico clínico de mastocitosis sistémica, pero era negativo para una mutación del exón 17 por el ensayo convencional. El ensayo AS-PCR usando esta muestra produjo una señal claramente positiva. El paciente posteriormente desarrolló LMA y una muestra de sangre (Figura 20 A-B, muestra 31) fue positiva usando tanto el ensayo convencional (D816V para la secuenciación) como el ensayo AS-PCR.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BRISTOL MYERS SQUIBB LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA REPRESENTADOS POR EL DEPARTAMENTO DE ASUNTOS DE VETERANOS, UNIVERSIDAD DE LA SALUD Y CIENCIAS DE OREGÓN

<120> PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACIÓN Y TRATAMIENTO DE INDIVIDUOS QUE PRESENTAN PROTEÍNA KIT MUTANTE

<130> BMS/OHSU1PCT

<140> POR ASIGNAR

<141> 09-06-2006

<150> US60/689.113

<151> 09-06-2005

<150> US60/736.668

<151> 15-11-2005

<150> US60/748.418

<151> 08-12-2005 5 <160> 7

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2931

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2928)

<400> 1

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<210> 2

<211> 976

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 3

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10 <210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

15 <223> Cebador inverso <400>4

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<210> 5

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 5

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<210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 6

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<210> 7

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n es A (adenina) unidos en una configuración invertida químicamente (3’ a 5’)

<400> 7

imagen1

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de ‘N-(2-cloro-6-metilfenil)2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de la misma y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con proteína tirosina quinasa en un individuo que tiene una quinasa KIT mutante, en la que dicho trastorno se selecciona entre mastocitosis, carcinoma de vejiga, carcinoma de mama, carcinoma de colón, carcinoma de riñón, carcinoma hepático, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma de estómago, carcinoma cervical, carcinoma de tiroides, seminoma testicular, carcinoma de piel, carcinoma de células escamosas, tumores estromáticos gastrointestinales, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma de Burkett, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia promielocítica, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, melanoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwannoma, osteosarcoma, xenoderma pigmentosum, queratoacantoma, cáncer folicular de tiroides, tumores de células germinales no seminomatoso refractario a la quimioterapia y sarcoma de Kaposi.

2. 2.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicha quinasa KIT mutante es al menos parcialmente resistente a un primer inhibidor de quinasa.

3. 3.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que dicho primer inhibidor de quinasa es un inhibidor de quinasa Bcr-Abl.

4. 4.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho primer inhibidor de quinasa comprende imatinib.

5. 5.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el inhibidor de mTOR es rapamicina.

6. 6.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha quinasa KIT mutante es constitutivamente activa.

7. 7.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha quinasa KIT mutante comprende una mutación en la posición de aminoácidos 816 de la quinasa KIT (SEC ID Nº: 2).

8. 8.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicha mutación en la posición de aminoácidos 816 de la SEC ID Nº: 2 se selecciona del grupo que consiste en D816Y, D816F, D816V y D816H.

9. 9.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha quinasa KIT mutante comprende una mutación de KIT resistente a imatinib.

10. 10.

    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho trastorno es mastocitosis, tumor estromático gastrointestinal, leucemia mielógena aguda o seminoma testicular.