ES2360073T3 - Método para diagnosticar cáncer de pulmón de células no pequeñas. - Google Patents

Abstract

Método para diagnosticar cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) o una predisposición a desarrollar cáncer de pulmón de células no pequeñas en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen asociado a cáncer de pulmón de células no pequeñas en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que un aumento de dicho nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen indica que dicho sujeto padece o está en riesgo de desarrollar NSCLC, en el que dicho gen asociado a NSCLC es KIF11.

Description

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.º de serie 60/555.789 presentada el 23 de marzo de 2004.

Campo de la Invención

Esta invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo del diagnóstico y terapia contra el cáncer. En particular a métodos para diagnosticar cánceres de pulmón de células no pequeñas, dados a conocer en la presente memoria, usando genes, KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1, que muestran expresión elevada en tales células cancerosas.

Antecedentes de la invención

El cáncer de pulmón es uno de los tumores humanos más comúnmente mortal. Se han notificado muchas alteraciones genéticas asociadas al desarrollo y la evolución del cáncer de pulmón. Aunque los cambios genéticos pueden ayudar a esfuerzos de pronóstico y predicciones de riesgo metastásico o responden a ciertos tratamientos, la información acerca de un número único o limitado de marcadores moleculares generalmente no proporciona resultados satisfactorios para el diagnóstico clínico de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Mitsudomi et al., Clin Cancer Res 6: 405563 (2000); Niklinski et al., Lung Cancer. 34 Suppl 2: S53-8 (2001); Watine, BMJ320: 379-80 (2000)). El NSCLC es con diferencia la forma más común, justificando casi 80% de tumores de pulmón (Society, A.C. Cancer Facts and Figures 2001 (2001)). La tasa de supervivencia de 10 años global sigue siendo tan sólo de 10% a pesar de los recientes avances en la terapia de modalidad múltiple, porque la mayor parte de los NSCLC no se diagnostican hasta estadios avanzados (Fry, W.A. et al., Cancer 86; 1867-76 (1999)). Aunque los regímenes de quimioterapia basados en platino se consideran los patrones de referencia para el tratamiento de NSCLC, esos fármacos pueden extender la supervivencia de pacientes con NSCLC avanzado sólo aproximadamente seis semanas (Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, BMJ. 311: 899-909 (1995)). Están investigándose para esta enfermedad numerosas terapias seleccionadas como objetivo, incluyendo inhibidores de tirosina cinasa, pero hasta el momento se han logrado resultados prometedores en sólo un número limitado de pacientes y algunos receptores padecen reacciones adversas graves a (Kris M.N.R., Herbst R.S. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 21: 292a(A1166) (2002)).

Se han notificado muchas alteraciones genéticas asociadas al desarrollo y a la evolución del cáncer de pulmón, pero siguen siendo inciertos los mecanismos moleculares precisos (Sozzi, G. Eur. J. Cancer 37: 63-73 (2001)). A lo largo de la última década han surgido agentes citotóxicos recientemente desarrollados incluyendo paclitaxel, docetaxel, gemcitabina y vinorelbina para ofrecer múltiples elecciones terapéuticas para pacientes con NSCLC avanzado; sin embargo, cada uno de los nuevos regímenes puede proporcionar beneficios de supervivencia modestos en comparación con las terapias a base de cisplatino (Schiller, J.H. et al., N. Engl. J. Med. 346: 92-98 (2002); Kelly, K. et al., J. Clin. Oncol. 19: 3210-3218 (2001)). Por tanto, los médicos esperan con entusiasmo nuevas estrategias terapéuticas, tales como el desarrollo de agentes seleccionados como diana moleculares.

Un enfoque eficaz para identificar moléculas desconocidas implicadas en rutas de carcinogénesis es el análisis sistemático de niveles de expresión de miles de genes en microalineamientos de ADNc (Kikuchi, T. et al., Oncogene 22: 2192-2205 (2003); Kakiuchi, S. et al., MoI. Cancer Res. 1: 485-499 (2003); Zembutsu, H. et al., Int. J. Oncol. 23: 29-39 (2003); Suzuki, C. et al., Cancer Res. 63: 7038-7041 (2003)) y puede poner de manifiesto dianas candidatas para el desarrollo de marcadores tumorales y fármacos anticancerígenos novedosos. Para aislar dianas moleculares novedosas para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de NSCLC, se prepararon poblaciones puras de células tumorales a partir de 37 tejidos de cáncer mediante microdisección con captura por láser y se analizaron perfiles de expresión de todo el genoma de células de NSCLC en un microalineamiento de ADNc que contenía 23.040 genes (Kikuchi, T. et al., Oncogene 22: 2192-2205 (2003)). En el transcurso de estos experimentos, se identificaron KOC1 (n.º de registro de GenBank NM_006547) y neuromedina U (NMU; n.º de registro de GenBank NM_006681) como genes que se sobreexpresaban frecuentemente en tumores de pulmón y eran indispensables para el crecimiento de células de NSCLC.

La comunicación entre células es un requisito previo para el desarrollo y mantenimiento de organismos multicelulares. Se han observado desde hace tiempo varios sistemas de intercambio de información intercelular tales como la sinapsis química, uniones de huecos y plasmodesmos en células vegetales, pero un nuevo sistema de transporte que implica una estructura nanotubular altamente sensible, nanotubos de tunelización (TNT) entre las células, se notificó sólo recientemente en células de mamífero (Rustom, A. et al., Science 303, 1007- 1010 (2004). Una estructura de este tipo facilitaría la transferencia selectiva de orgánulos y vesículas de membrana; por tanto los TNT en células somáticas de mamífero podrían contribuir a un sistema(s) de transporte entre células portando factores de transcripción o ribonucleopartículas (RNP), como en las plantas (Nakajima, K. et al., Nature 413, 307-311 (2001); Lucas, WJ. et al., Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 2, 849-857 (2001)). Algunos investigadores han documentado interacciones entre algunas proteínas de unión a ARN y proteínas motoras como cinesina y dineína dentro de las células somáticas de mamífero, así como también transporte de ARNm intercelular en células embrionarias de mamífero (Brendza, R.R et al., Science 289, 21202122 (2000); Chennathukuzhi, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 100, 15566-15571 (2003); Villace, P. et al., Nucleic Acids Res. 32, 2411-2420 (2004). ; Morales, CR. et al. Dev. Biol.246, 480-494 (2002).). Sin embargo, no ha surgido ninguna notificación describiendo un sistema de transporte de ARNm intercelular en células somáticas de mamífero que implican un complejo de proteínas de unión a ARN y proteínas motoras.

Se ha notificado el fenómeno de localización de ARNm en ovocitos y embriones en desarrollo de Drosophila y Xenopus y en células somáticas tales como fibroblastos y neuronas (King, MX. et al., Bioessays 21: 546-557 (1999); Mowry, K.L., Cote, CA. FASEB J. 13: 435-445 (1999); Lasko, P. J. Cell Biol. 150: F51-56 (2000); Steward, O. Neuron 18: 9-12 (1997)). El ARNm de beta-actina (ACTB) se localiza en las laminillas conductoras de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) (Lawrence, J.B., Singer, R.H. Cell 45: 407-415 (1986)) y en el cono de crecimiento de neuronas en desarrollo (Bassell, GJ. et al., J. Neurosci. 18: 251-265 (1998)). La localización de ARNm de ACTB depende del zip-code, un elemento que actúa en cis ubicado en la UTR en 3' del ARNm (Kislauskis, E.H. et al., J. Cell Biol. 123: 165-172 (1993)). El factor que actúa en trans, proteína de unión a zip-code 1 (ZBP1), se purificó mediante afinidad con el zip-code de ARNm de ACTB (Ross, A.F. et al., MoI. Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997)). Tras la identificación de ZBP1, se identificaron homólogos adicionales en un amplio rango de organismos incluyendo Xenopus, Drosophila, ser humano y ratón (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14: 2729-2733 (1997); Deshler, J.O. et al., Science 276: 1128-1131 (1997); Doyle,

G.A. et al., Nucleic Acids Res. 26: 5036-5044 (1998)). Los miembros de la familia de ZBP1 se expresan en fibroblastos embrionarios germinales y en varios tipos de cáncer (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14: 2729-2733 (1997); Mueller, F. et al., Br. J. Cancer 88; 699-701 (2003)). Las proteínas de tipo ZBP1 contienen dos motivos de reconocimiento de ARN (RRM) en la parte NH2-terminal de la proteína y cuatro dominios de homología de hnRNP K (KH) en el extremo COOH-terminal.

KOC1 (alias proteína de unión a ARNm de IGF-II 3: IMP-3) es una de las IMP (IMP-I, IMP-2 y IMP-3), que pertenecen a los miembros de la familia ZBP1 y muestran múltiples uniones a ARNm de IGF-II líder 3 y el ARN de H19 con huella genética recíproca (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14: 2729-2733 (1997)). Aunque inicialmente se notificó que KOC1 se sobreexpresaba en cáncer pancreático (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14: 2729-2733 (1997); Mueller, F. et al., Br. J. Cancer 88: 699-701 (2003)), su función precisa en células de cáncer o incluso en células somáticas de mamífero normales sigue siendo incierta.

KOC1 es ortóloga a la proteína de unión a ARN de Vg1 de Xenopus (Vg1RBP/Vera), que media la localización de ARNm de Vg1 en el polo vegetal del ovocito durante la maduración de ovocitos, y IMP-1 es ortóloga a la ZBP1. IMP está ubicada principalmente en el citoplasma y su distribución celular oscila desde una concentración distintiva en regiones perinucleares y lamelipodios hasta un patrón completamente deslocalizado. El ARN de H10 localizado conjuntamente con IMP y la eliminación del sitio de unión de alta afinidad conducen a la deslocalización del ARN truncado (Runge, S. et al., J. Biol. Chem. 275: 29562-29569 (2000)), lo que sugiere que las IMP están implicadas en el tráfico citoplasmático de ARN. Pudo asociarse IMP-1 con microtúbulos (Nielsen, F.C. et al., J. CellSet 115: 2087-2097 (2002); Havin, L. et al., Genes Dev. 12: 1593-1598 (1998)), y es probable que esté implicada una proteína motora tal como cinesina, miosina y dienina. Por otra parte, la localización de ARNm de Oskar en el polo posterior requiere cinesina I (Palacios, I.M., St. Johnston D. Development 129: 5473-5485 (2002); Brendza, R.P. et al., Science 289: 2120-2102 (2000)).

KIF11 (alias EG5) es un miembro de la familia de cinesinas y desempeña un papel en la estabilización y/o determinación de la estabilidad de alineamientos de microtúbulos específicos que se forman durante la división celular. Este papel puede englobar la capacidad de KIF11 de influir en la distribución de otros componentes de proteína asociados con la división celular (Whitehead, CM., Rattner, J.B. J. Cell ScL 111: 2551-2561 (1998); Mayer, T.U. et al., Science 286: 971-974 (1999)).

NMU es un neuropéptido que se aisló por primera vez a partir de médula espinal porcina. Tiene una actividad potente en los músculos lisos (Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130: 1078-1085 (1985); Domin, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 140: 1127-1134 (1986); Conlon, J.M. et al., J. Neurochem. 51 : 988-991 (1988); Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156: 355-360 (1988); Domin, J. et al., J. Biol. Chem. 264: 2088120885 (1989), O'Harte, F. et al., Peptides 12: 809-812 (1991); Kage, R. et al., Regul. Pept. 33: 191-198 (1991); Austin,

C. et al., J. MoI. Endocrinol. 12: 257-263 (1994); Fujii, R. et al., J. Biol. Chem. 275: 21068-21074 (2000)), y en especies de mamífero NMU se distribuye predominantemente en el tracto gastrointestinal y el sistema nervioso central (Howard,

A.D. et al., Nature 406: 70-74 (2000); Funes, S. et al., Peptides 23: 1607-1615 (2002)). Las actividades periféricas de NMU incluyen la estimulación del músculo liso, la elevación de la tensión arterial, la alternación del transporte de iones en el intestino y la regulación de alimentación (Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130: 1078-1085 (1985)); sin embargo no se ha tratado el papel de NMU durante la carcinogénesis. Los neuropéptidos actúan de manera periférica como factores paracrinos y autocrinos para regular diversos procesos fisiológicos y actúan como neurotransmisores o neuromoduladores en el sistema nervioso. En general, los receptores que median la señalización mediante la unión de neuropéptidos son miembros de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) que tienen siete dominios de extensión transmembrana. Dos receptores conocidos para NMU, NMU1R y NMU2R, muestran un alto grado de homología con otros receptores de neuropéptidos tales como GHSR y NTSR1, para los que los correspondientes ligandos conocidos son grelina (GHRL) y neurotensina (NTS), respectivamente. NMU1R (FM3/GPR66) y NMU2R (FM4) tienen siete dominios transmembrana alfa-helicoidales predichos que contienen motivos altamente conservados, tal como otros miembros de la familia de GPCR rodopsina (Fujii, R. et al., J. Biol Chem. 275: 21068-21074 (2000); Howard, A.D. et al., Nature 406: 70-74 (2000); Funes, S. et al., Peptides 23: 1607-1615 (2002)).

Una estructura de asparaginamida C-terminal y el núcleo heptapeptídico C-terminal de la proteína NMU son esenciales para su actividad contráctil en células de músculo liso (Westfall, T.D. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 301: 987-992 (2002); Austin, C J. MoI. Endocrinol. 14: 157-169 (1995)). Estudios recientes han aportado pruebas de que NMU actúa al nivel hipotalámico para inhibir la ingesta de alimentos; por tanto esta proteína podría ser un regulador fisiológico de la alimentación y peso corporal (Howard, A.D. et al., Nature 406: 70-74 (2000); Maggi, CA. et al., Br. J. Pharmacol. 99: 186-188 (1990); Wren, A.M. et al., Endocrinology 143: 227-234 (2002); Ivanov, T.R. et al., Endocrinology 143: 38133821 (2002)). Sin embargo, hasta el momento ningún informe ha sugerido la implicación de la sobre expresión de NMU en la carcinogénesis.

Estudios diseñados para revelar los mecanismos de la carcinogénesis han facilitado ya la identificación de dianas moleculares para agentes antitumorales. Por ejemplo, han sido eficaces los inhibidores de la farnesiltransferasa (FTI) que se desarrollaron en un principio para inhibir la ruta de señalización de crecimiento relacionada con Ras, cuya activación depende de la farnesilación postraduccional, para tratar tumores dependientes de Ras en modelos de animal (He et al., Cell 99:335-45 (1999)). Se han realizado ensayos clínicos en seres humanos usando una combinación o fármacos anticancerígenos y anticuerpo monoclonal anti-HER2, trastuzumab, para antagonizar el receptor de protoncogén HER2/neu; y se han conseguido una respuesta clínica mejorada y una supervivencia global de pacientes con cáncer de mama (Lin et al., Cancer Res. 61 :6345-9 (2001 )). Un inhibidor de la tirosina cinasa, STI-571, que inactiva selectivamente las proteínas de fusión bcr-abl, se ha desarrollado para tratar leucemias mielógenas crónicas en las que la activación constitutiva de la bcr-abl tirosina cinasa desempeña un papel crucial en al transformación de leucocitos. Se diseñan agentes de estos tipos para suprimir la actividad oncogénica de productos génicos específicos (Fujita et al., Cancer Res. 61:7722-6 (2001)). Por tanto, los productos génicos comúnmente regulados por incremento en células cancerosas pueden servir como posibles dianas para desarrollar agentes anticancerígenos novedosos.

Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) reconocen péptidos de epítopo derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) presentados en la molécula de clase I de MHC, y lisan células tumorales. Puesto que el descubrimiento de la familia de MAGE como primer ejemplo de los TAA, se han descubierto muchos otros TAA usando enfoques inmunológicos (Boon, Int. J. Cancer 54: 177-80 (1993); Boon y van der Bruggen, J. Exp. Med. 183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178: 489-95 (1993); Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347-52 (1994)). Algunos de los TAA descubiertos están ahora en la fase de desarrollo clínico como dianas de inmunoterapia. Los TAA descubiertos hasta el momento incluyen MAGE (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991)), gp100 (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347-52 (1994)), SART (Shichijo et al., J. Exp. Med. 187: 277-88 (1998)), y NY-ESO-1 (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-8 (1997)). Por otra parte, los productos génicos que se había demostrado que se sobreexpresaban específicamente en células tumorales, han demostrado que se reconocen como dianas induciendo respuestas inmunitarias celulares. Tales productos génicos incluyen p53 (Umano et al., Brit. J, Cancer 84: 1052-7 (2001)), HER2/neu (Tanaka et al., Brit. J. Cancer 84: 94-9 (2001)), CEA (Nukaya et al., Int. J. Cancer 80: 92-7 (1999)), etcétera.

A pesar del progreso significativo en investigación básica y clínica en lo que respecta a los TAA (Rosenbeg et al., Nature Med. 4: 321-7 (1998); Mukherji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8078-82 (1995); Hu et al., Cancer Res. 56: 2479-83 (1996)), sólo están disponibles un número limitado de TAA candidatos para el tratamiento de cáncer. Los TAA expresados de manera abundante en células de cáncer y al mismo tiempo expresión que se limita a células de cáncer serían candidatos prometedores como dianas inmunoterapéuticas. Además, se espera que la identificación de nuevos TAA que inducen respuestas inmunitarias antitumorales específicas y potentes fomente el uso clínico de estrategia de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon y can der Bruggen, J. Exp. Med. 183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178: 489-95 (1993); Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347-52 (1994); Shichijo et al., J. Exp. Med. 187: 277-88 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J. Natl Cancer Inst. 88: 1442-5 (1996); Butterfield et al., Cancer Res. 59: 3134-42 (1999); Vissers et al., Cancer Res. 59: 5554-9 (1999); van der Burg et al., J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka et al., Cancer Res.

57: 4465-8 (1997); Fujie et al., Int. J. Cancer 80: 169-72 (1999); Kikuchi et al., Int. J. Cancer 81 : 459-66 (1999); Oiso et al., Int. J. Cancer 81: 387-94 (1999)).

Se ha notificado repetidamente que células mononucleares de sangre periférica estimuladas con péptido (PBMC) de ciertos donadores sanos producen niveles significativos de IFN- en respuesta al péptido, pero raras veces ejercen citotoxicidad frente a células tumorales de una manera limitada de HLA-A24 o -A0201 en ensayos de liberación de 51Cr (Kawano et al., Cancer Res. 60: 3550-8 (2000); Nishizaka et al., Cancer Res. 60: 4830-7 (2000); Tamura et al., Jpn. J. Cancer Res. 92: 762-7 (2001)). Sin embargo, tanto HLA-A24 como HLA-A0201 son uno de los alelos de HLA populares en japoneses, así como también caucasianos (Date et al., Tissue Antigens 47: 93-101 (1996); Kondo et al., J. Immunol.

155: 4307-12 (1995); Kubo et al., J. Immunol. 152: 3913-24 (1994); Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams et al., Tissue Antigen 49: 129 (1997)). De ese modo, los péptidos antigénicos de cáncer presentados en estos HLA pueden ser especialmente útiles para el tratamiento de cánceres entre japoneses y caucasianos. Además, se sabe que la inducción de CTL de baja afinidad in vitro normalmente resulta del uso de péptido a una alta concentración, generando un nivel alto de complejos MHC/péptido específico en células presentadoras de antígeno (APC), que activarán de manera eficaz éstos CTL (Alexander-Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 4102-7 (1996)).

La patente estadounidense n.º 6.544.766 describe métodos para producir cinesinas a partir de, por ejemplo, células bacterianas. La patente estadounidense n.º 6.472.521 describe un oligonucleótido que corresponde a un fragmento particular de una secuencia de ácido nucleico que codifica para eg5 humano. El documento WO 03/030832 describe nucleótidos antisentido que seleccionan como diana a genes de cinesina humanos para tratar enfermedades que implican la proliferación aberrante. El documento WO 03/099224 describe compuestos antisentido para modular la expresión de cinesina de tipo 1. Kaiser, A. et al., J. Biol. Chem. (1999) 274(27):18925-18931, identifican la proteína HsEg5 relacionada con cinesina como un gen que responde a ácido retinoico todo trans (ATRA) expresado de manera diferencial en células de carcinoma pancreático. En Weil, D. et al., BioTechniques (2002) 33:1244-1248, se notifica que un ARN de interferencia pequeño (ARNsi) que selecciona como diana a ARNm de la cinesina Eg5 induce una mitosis rápida que proporciona un ensayo para la optimización de la transfección de ARNsi. En Sharp, D.J et al., J. Cell Biol. (1999)144(1):125-138, se notifica que KLP61F, la cinesina bipolar mitótica esencial, actúa en un mecanismo de filamentos deslizantes para mantener separados los polos del huso acromático durante la metafase y anafase A y conducir el alargamiento del huso acromático durante la anafase B. Blangy A. et al., Cell (1995) 83:1159-1169, notifican que la microinyección de anticuerpos frente a Eg5 humano (HsEg5) bloquea la migración de centrosomas y hace que las células HeLa impidan la mitosis con alineamientos de microtúbulos monoastrales. Houliston, E. et al., Devel. Biol. (1994) 164(1):147-159, examinaron la distribución y abundancia de cambios de la proteína Eg5 relacionada con cinesina durante la oogénesis y desarrollo temprano en Xenopus laevis. La patente estadounidense n.º 6.331.396 describe métodos que emplean un alineamiento con sondas génicas para su uso para identificar y caracterizar proteínas que simulan o inhiben la actividad de todas los interferones. Se describen métodos y composiciones para la construcción de microalineamientos de ADNc a medida en la patente estadounidense n.º 6.706.867. Se describen en el documento WO 01/31335 usos de ácidos nucleicos que codifican para la cinesina KSP y sus productos génicos para identificar moduladores de la proliferación celular. Yarrow et al., Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2003 6:279-286, describen métodos de selección de células para identificar compuestos que dan como resultado el arresto mitótico. Se dan a conocer en el documento WO 01/94629 procedimientos para determinar el estado canceroso de una célula de prueba, basándose en la determinación de la expresión de un gen que se expresa de manera diferencial en comparación con células no cancerosas.

Aunque se han realizado avances en el desarrollo de fármacos de selección como diana molecular para la terapia contra el cáncer, los intervalos de tipos de tumor que responden así como también la eficacia de los tratamientos todavía están muy limitados. Por tanto, es urgente desarrollar nuevos agentes anticancerígenos que seleccionan como diana moléculas altamente específicas para células malignas y que probablemente no causan reacciones adversas o causan reacciones adversas mínimas. Para logara el objetivo se necesitan identificar moléculas cuyos mecanismos fisiológicos están bien definidos. Una estrategia poderosa para estos fines combinaría la selección de genes regulados por incremento en células de cáncer basándose en la información genética obtenida en microalineamientos de ADNc con la selección de alto rendimiento de sus efecto en el crecimiento celular, mediante la inducción de fenotipos de pérdida de función con sistemas de ARNi (Kikuchi, T. et al., Oncogene 22: 2192-2205 (2003)).

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La invención descrita en la presente memoria proporciona un método para diagnosticar cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) o una predisposición a desarrollar cáncer de pulmón de células no pequeñas en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen asociado a cáncer de pulmón de células no pequeñas en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que un aumento de dicho nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen indica que dicho sujeto padece o está en riesgo de desarrollar NSCLC, en el que dicho gen asociado a NSCLC es KIF11.

La invención proporciona un método in vitro para identificar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula de prueba que expresa dicho gen asociado a NSCLC con un compuesto de prueba;

(2)

detectar el nivel de expresión de dicho gen asociado a NSCLC; y

(3)

determinar el compuesto que suprime dicho nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen,

en el que dicho gen asociado a NSCLC es KIF11 y dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

La invención proporciona un método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

(1)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido de KIF11,

(2)

detectar la actividad de unión entre el polipéptido y el compuesto de prueba; y

(3)

seleccionar un compuesto que se une al polipéptido en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC. La invención proporciona un método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido codificado por un polinucleótido de KIF11;

(b)

detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a); y

(c)

seleccionar un compuesto que suprime la actividad biológica del polipéptido de KIF11 en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de prueba

en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

La invención proporciona un método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

(1)

poner en contacto un compuesto de prueba con un célula que expresa KIF11; y

(2)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de KIF11, en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC. La invención proporciona un método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(1)

poner en contacto un compuesto de prueba con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional de KIF11 y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora transcripcional;

(2)

medir la actividad de dicho gen indicador; y

(3)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho gen indicador, tal como se compara con un control,

en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

La invención proporciona un método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

(1)

poner en contacto un polipéptido de KIF11 o equivalente funcional del mismo con polipéptido de KOC1 o equivalente funcional del mismo en presencia de un compuesto de prueba;

(2)

detectar la unión entre los polipéptidos; y

(3)

seleccionar el compuesto de prueba que inhibe la unión entre los polipéptidos.

La invención proporciona un método in vitro para medir la actividad de transporte de ARN de un polipéptido, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i.

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

con un ARN que va a transportarse y en la condición que puede formar el transportador de ARN;

(b)

detectar el nivel del ARN transportado; y

(c)

medir la actividad de transporte de ARN correlacionando el nivel del ARN transportado de la etapa (b) con la actividad de transporte de ARN.

La invención proporciona un método in vitro para identificar un agente que modula la actividad de transporte de ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto el agente con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

con un ARN que va a transportarse y en la condición que puede formar el transportador de ARN;

(b)

detectar el nivel del ARN transportado; y

(c)

comparar el nivel del ARN transportado con un nivel de control en ausencia del agente indicando un aumento o disminución del nivel del ARN transportado en comparación con el nivel de control que el compuesto de prueba modula la actividad de transporte de ARN.

La invención proporciona un kit para detectar una actividad de un compuesto de prueba para regular la actividad de transporte de ARN, comprendiendo dicho kit una célula aislada que expresa los componentes de a a d, y un medio de cultivo que soporta el crecimiento celular,

(a)

un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i.

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

(b)

un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i.

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 (KOC1);

ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105;

iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 105; y

iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 104, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105; y

(c)

un ARN que va a transportarse; y

(d)

DCTN1.

La invención proporciona el uso de

i. una composición antisentido, comprendiendo dicha composición una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia codificante de KIF11;

ii. una composición de ARNsi que comprende un ARNsi, en el que dicha composición reduce la expresión de KIF11; o

iii. un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un polipéptido codificado por KIF11;

para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto.

La invención proporciona el uso de un polipéptido codificado por KIF11 o un fragmento inmunológicamente activo de dicho polipéptido, o un polinucleótido que codifica para el polipéptido para la preparación de una vacuna para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto.

La invención proporciona una molécula bicatenaria que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en la que la cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de KIF11 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 32, 33 y 34, y en la que la cadena antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es complementaria a dicha cadena sentido, hibridando dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido una con otra para formar dicha molécula bicatenaria, e inhibiendo dicha molécula bicatenaria, cuando se introduce en una célula que expresa un gen KIF11, la expresión de dicho gen, siendo además la molécula bicatenaria un oligonucleótido de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un ARNsi frente al gen KIF11, en la que el ARNsi comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 32, 33 y 34 como secuencia diana y que tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.

La invención proporciona un método para predecir un pronóstico de NSCLC, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

detectar el nivel de expresión de KIF11 en una muestra recogida de un paciente cuyo pronóstico de NSCLC va a predecirse, y

(b)

indicar un mal pronóstico cuando se detecta una elevación del nivel de expresión de KIF11.

Se da a conocer un método para diagnosticar o determinar una predisposición a cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en un sujeto determinando un nivel de expresión de un gen asociado a cáncer de pulmón de células no pequeñas que se selecciona del grupo de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 en una muestra biológica derivada de un paciente. Un aumento del nivel de expresión de cualquiera de los genes en comparación con un nivel de control normal de los genes indica que el paciente padece o está en riesgo de desarrollar NSCLC.

También se dan a conocer métodos para proporcionar un pronóstico de un paciente al que se le ha diagnosticado NSCLC. En particular, los métodos implican detectar la expresión de KOC1, KIF11, o KOC1 en combinación con la expresión de KIF11.

Un “nivel de control normal” indica un nivel de expresión de cualquiera de los genes detectados en un individuo sano, normal o en una población de individuos que se sabe que no padecen NSCLC. Un nivel de control es un único patrón de expresión derivado de una única población de referencia o de una pluralidad de patrones de expresión. Al contrario de un “nivel de control normal”, el “nivel de control” es un nivel de expresión del gen detectado en un individuo o una población de individuos cuya base del estado de enfermedad se conoce (es decir, canceroso o no canceroso). De ese modo, el nivel de control puede determinarse basándose en el nivel de expresión del gen en un individuo sano, normal, en una población de individuos que se sabe que no padecen NSCLC, un paciente con NSCLC o una población de los pacientes. El nivel de control que corresponde al nivel de expresión del gen en un paciente de cáncer de pulmón de células no pequeñas o una población de los pacientes se denomina “nivel de control de NSCLC”. Además el nivel de control puede ser una base de datos de patrones de expresión a partir de células sometidas a prueba previamente.

Un aumento del nivel de expresión de uno cualquiera de los genes de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 detectados en una muestra biológica de prueba en comparación con un nivel de control normal indica que el sujeto (del cual se obtuvo la muestra) padece NSCLC. Alternativamente, el nivel de expresión de uno cualquiera o de todos los genes en una muestra biológica puede compararse con un nivel de control de NSCLC del(de los) mismo(s) gen(es).

La expresión génica aumenta o disminuye 10%, 25% 50% o más en comparación con el nivel de control.

Alternativamente, la expresión génica aumenta o disminuye 1, 2, 5 o más veces en comparación con el nivel de control. La expresión se determina detectando la hibridación, por ejemplo, en un chip o un alineamiento, de una sonda génica de NSCLC con un transcrito génico de una muestra biológica derivada del paciente. La muestra biológica derivada del paciente puede ser cualquier muestra derivada de un sujeto, por ejemplo, un paciente que se sabe o se sospecha que tiene NSCLC. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser un tejido que contenga esputo, sangre, suero, plasma o célula de pulmón.

Se da a conocer un perfil de expresión de referencia de cáncer de pulmón de células no pequeñas que comprende un patrón de niveles de expresión génica de dos o más genes seleccionados del grupo de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1.

También se da a conocer un kit que comprende dos o más reactivos de detección que detecta la expresión de uno o más de los genes seleccionados del grupo de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 (por ejemplo, detectando ARNm y polipéptido). También se proporciona un alineamiento de polinucleótidos que se une a uno o más de los genes seleccionados del grupo de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Los kits dados a conocer también pueden comprender reactivos usados para detectar la expresión de KIF11 y KOC1 que van a usarse para el pronóstico de NSCLC.

También se dan a conocer kits para la detección de compuestos que regulan la actividad de transporte de ARN. Los kits pueden comprender una célula que expresa un polipéptido de KIF11, o equivalente funcional, un polipéptido de KOC1, o equivalente funcional, y ARN que va a transportarse, y DCTN1. Los kits de la invención también pueden usarse para seleccionar compuestos para tratar o prevenir NSCLC. Los kits pueden comprender un polipéptido de KOC1, o equivalente funcional, y un ARN que se une por el polipéptido de KOC1 o equivalente funcional.

Se dan a conocer en la presente memoria métodos para identificar compuestos que inhiben el nivel de expresión de un gen asociado a NSCLC (KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1) poniendo en contacto una célula de prueba que expresa un gen asociado a NSCLC con un compuesto de prueba y determinando el nivel de expresión del gen asociado a NSCLC. La célula de prueba puede ser una célula de NSCLC. Una disminución del nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal del gen indica que el compuesto de prueba es un inhibidor de la expresión o función del gen asociado a NSCLC. Por tanto, si un compuesto suprime el nivel de expresión de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en comparación con un nivel de control, se espera que el compuesto reduzca un síntoma de NSCLC.

Alternativamente, se da a conocer en la presente memoria un método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC. El método incluye poner en contacto un polipéptido seleccionado del grupo de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 con aun compuesto de prueba, y seleccionar el compuesto de prueba que se une a o suprime la actividad biológica del polipéptido. La descripción proporciona además un método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, que incluye las etapas de poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que expresa proteína de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 o a la que se le ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 situado secuencia arriba de un gen indicador, y entonces seleccionar el compuesto de prueba que reduce el nivel de expresión de la proteína de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 o proteína codificada por el gen indicador. Según estos métodos de selección, se espera que el compuesto de prueba que suprime la actividad biológica o el nivel de expresión en comparación con un nivel de control reduzca un síntoma de NSCLC. Además, la presente descripción proporciona un método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, en el que se detecta la unión entre KIF11 y KOC1, o GHSR1b o NTSR1 y NMU. Se espera que compuestos que inhiben la unión entre KIF11 y KOC1, o GHSR1b o NTSR1 y NMU reduzcan un síntoma de NSCLC.

Se detectó un sistema de transporte de ARN intracelular e intercelular novedoso en carcinomas de pulmón, que implica la transactivación de KOC1 y KIF11. Un complejo de estas dos moléculas en tumores de pulmón pudo unir ARNm que codificaban para proteínas que se sabía que actuaban en la adhesión intercelular, la evolución de células de cáncer y la oncogénesis, y los transportaban a células vecinas a través de estructuras intercelulares ultrafinas. En particular, las pruebas proporcionadas en este caso muestran que KOC1 se une a KIF11 en el dominio RRM en la región N-terminal de KOC1. Además, las pruebas proporcionas en este caso muestran la inhibición de su unión mediante mutantes de KOC1 negativos dominantes que suprimen de manera eficaz el crecimiento de células de NSCLC in vitro. Por ejemplo, los fragmentos de KOC1 (o ácidos nucleicos que codifican para los mismos) que comprenden los dominios RRM de KOC1 pueden usarse como fragmentos negativos dominantes para suprimir la proliferación celular y de ese modo tratar el cáncer. Alternativamente, el fragmento de KOC1 puede comprender el dominio homólogo a la ribonucleoproteína K (KH).

La descripción también proporciona métodos para identificar polipéptidos y otros compuestos que modulan la actividad de transporte de ARN. Por ejemplo, un polipéptido puede someterse a prueba para determinar la actividad de transporte de ARN poniendo en contacto el polipéptido con un polipéptido de KIF11 o un equivalente funcional del mismo con un ARN que puede transportarse por KIF11 en condiciones adecuadas para el transporte de ARN. Alternativamente, los agentes que modulan la actividad de transporte de ARN pueden someterse a prueba poniendo en contacto un agente de prueba con un polipéptido de a KIF11 o un equivalente funcional del mismo con un ARN que puede transportarse por KIF11 en condiciones adecuadas para el transporte de ARN. Los agentes de prueba son útiles para tratar NSCLC sometiendo a prueba los agentes para determinar la capacidad de inhibir la unión entre un polipéptido de KOC1, o un equivalente funcional, y un ARN que se une por KOC1 o el complejo de KOC1 y KIF11.

El análisis inmunohistoquímico de microalineamientos de tejido de cáncer de pulmón demostró que la transactivación de KOC1 y KIF11 estaba asociada de manera significativa al mal pronóstico de pacientes con cáncer de pulmón.

También se proporcionan métodos para tratar o prevenir NSCLC y composiciones que van a usarse para tales métodos. Los métodos terapéuticos incluyen un método para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto administrando al sujeto una composición de un ARN de interferencia corto, antisentido (ARNsi) o un ribozima que reduce la expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o una composición que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une y suprime la función de un polipéptido codificado por el gen. Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria también pueden comprender un mutante de KOC1 negativo dominante (o ácidos nucleicos que codifican para el mismo) que comprende un fragmento de KOC1 que contiene uno o más dominios RRM y/o dominios KH de KOC1.

También se dan a conocer vacunas y métodos de vacunación. Por ejemplo, un método para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto se lleva a cabo administrando al sujeto una vacuna que contiene un polipéptido codificado por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o un fragmento inmunológicamente activo del polipéptido. Un fragmento inmunológicamente activo es un polipéptido que es de longitud más corta que la proteína que se produce de manera natural de longitud completa y que induce una respuesta inmunitaria tras la introducción en el organismo. Por ejemplo, un fragmento inmunológicamente activo incluye un polipéptido de al menos 8 residuos de longitud que estimula una célula inmunitaria tal como una célula T o una célula B in vivo. La estimulación de las células inmunitarias puede medirse detectando la proliferación celular, elaboración de citocinas (por ejemplo, IL-2) o producción de anticuerpo.

Otros métodos terapéuticos incluyen aquéllos en los que se administra un compuesto seleccionado mediante el método de selección dado a conocer.

También se dan a conocer moléculas bicatenarias que comprenden una cadena sentido y una cadena antisentido. La cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos correspondiente a una secuencia diana comprendida dentro del ARNm de un gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, y la cadena antisentido es una secuencia complementaria a la cadena sentido. Tales moléculas bicatenarias dadas a conocer en la presente memoria pueden usarse como ARNsi frente al gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Además, la descripción de refiere a vectores que codifican para las moléculas bicatenarias de la presente descripción.

La descripción también proporciona una composición para tratar y/o prevenir NSCLC usando cualquiera de los polinucleótidos antisentido o ARNsi frente al gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o un anticuerpo que se une a un polipéptido codificado por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Otras composiciones incluyen las que contienen un compuesto seleccionado mediante el método de selección de la presente descripción como principio activo.

Ha de entenderse que tanto el compendio de la invención anterior como la siguiente descripción detallada son de una realización preferida, y no limitativa de la invención u otras realizaciones alternativas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra fotografías que confirman la relación entre KOC1 y KIF11.

(a)

representa el resultado de la coinmunoprecipitación de KOC1 y KIF11 que confirma la interacción entre KOC1 y KIF11. Se cotransfectaron de manera transitoria células A549 con KIF11 con etiqueta de Flag y KOC1 con etiqueta de myc, se inmunoprecipitaron con agarosa anti-Flag M2, y posteriormente se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti-myc. Por el contrario, usando la misma combinación de vectores y células, las células se inmunoprecipitaron con agarosa anti-myc y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti-Flag M2. Se encontró una banda correspondiente a la proteína sometida a inmunotransferencia sólo cuando se cotransfectaron los dos constructos.

(b)

representa el resultado de la tinción inmunocitoquímica que muestra la localización conjunta de KOC1 y KIF11. Se transfectaron de manera transitoria células COS-7 con KIF11 con etiqueta de FLAG y KOC1 con etiqueta de myc y se detectó su localización conjunta principalmente en el citoplasma usando anticuerpo anti-FLAG marcado con FITC y anticuerpo anti-myc marcado con rodamina.

(c)

representa el resultado de coinmunoprecipitación recíproca de KIF11 y KOC1 endógenos a partir de extractos de líneas de células de cáncer de pulmón A549 y LC319. (panel superior) Análisis de inmunotransferencia tipo Western de ambos extractos celulares inmunoprecipitados con anticuerpos anti-KOC1, detectándose la proteína de KIF11 en el inmunoprecipitado. (panel inferior) Inmunotransferencia tipo Western de extractos inmunoprecipitados con anticuerpos anti-KIF11, detectándose la proteína de KOC1 en el inmunoprecipitado.

(a)

representa el resultado de QRT-PCR que examina la expresión de KOC1 y KIF11 en muestras clínicas de NSCLC y tejidos de pulmón normal correspondientes. El eje Y indica la tasa de expresión relativa de los dos genes (KOC1 o KIF11/ACTB).

(b)

representa el resultado de QRT-PCR que examina la expresión de KOC1 y KIF11 entre 20 líneas de células de cáncer de pulmón.

(c)

representa el resultado del análisis de transferencia tipo Northern que detecta la expresión de KOC1 y KIF11 en tejidos humanos normales.

La figura 3 muestra fotografías que confirman la relación entre KOC1 y KIF11.

(a)

muestra la representación esquemática de cinco mutantes de deleción de KOC1 que carecen de una o ambas de las regiones terminales, con los extremos N y C-terminales etiquetados con FLAG y HA respectivamente. KH, dominio homólogo a ribonucleoproteína K.

(b)

representa el resultado de experimentos de inmunoprecipitación para la identificación de la región de KOC1 que se une a KIF11. Los constructos KOC1DEL4 y KOC1DEL5, que carecen de los dos motivos de reconocimiento de ARN, (RRM) no conservaron ninguna capacidad apreciable de interaccionar con KIF11 endógeno.

La figura 4 muestra fotografías que confirman la relación entre KOC1 y ARNm asociados a KOC1.

(a)

representa el resultado de inmunotransferencia tipo Western con mutantes de deleción de KOC1 inmunoprecipitados y ARNm de longitud completa de RAB35 marcado con DIG para la identificación de la región de unión a ARNm en KOC1.

(b)

representa el resultado de la transferencia tipo Northwestern con mutantes de deleción de KOC1 inmunoprecipitados y ARNm de longitud completa de RAB35 marcado con DIG para la identificación de la región de unión a ARNm en KOC1. Los KOC1DEL3 y KOC1DEL5, no se unieron a ninguno de estos ARNm, y el KOC1DEL4, que es un constructo con sólo los cuatro dominios KH, mostró afinidades de unión similares para ARNm con respecto al KOC1DEL2, un constructo sin los dos dominios KH C-terminales.

(c)

representa el resultado de IP-RT-PCR para la confirmación de microalineamiento IP y la capacidad de diversos mutantes de deleción de KOC1 transfectados en células A549 de unirse directamente a ocho ARNm endógenos representativos (CCT2, SBP2, SLC25A3, MB35, PSMB7, GL, PKP4 y WINS1) entre los 55 genes candidatos (véase la tabla 2).

La figura 2 muestra fotografías que confirman la activación conjunta de KOC1 y KIF11 en tumores de pulmón y tejidos normales.

La figura 5 muestra fotografías que muestran el movimiento de complejos de ribonucleoproteína de KOC1-KIF11-ARNm en células vivas de mamífero cultivadas.

(a)

son fotografías que muestran el transporte del complejo de proteína de KOC1-KIF11. Se localizaron conjuntamente partículas pequeñas que expresaban proteínas de KOC1 ciano fluorescentes (ECFP) y de KIF11 amarillo fluorescentes (EYFP), y se transfectaron juntas entre células COS-7 conectadas a través de estructuras intercelulares ultrafinas (flechas).

(b)

son fotografías que muestran el transporte del complejo de RNP de KOC1-ARNm de RAB35 de una célula COS-7 que contiene un alto nivel de complejo KOC1-RNP (célula A) con respecto a otra célula con un nivel inferior del complejo (simplemente teñido con CellTracker (azul); célula B). Se transfirieron las partículas pequeñas del complejo KOC1 (verde)-ARNm de RAB35 (rojo) así como también las partículas de KOC1 (verde) desde la célula A hasta la célula B a través de estructuras intercelulares ultrafinas (flechas).

La figura 6 muestra fotografías que muestran la localización de complejos de ribonucleoproteínas de KOC1-KIF11ARNm.

(a)

representa el resultado de la inmunoprecipitación de extractos celulares de A549 y LC319 que confirma la interacción directa entre DCTN1 y KIF11 endógenos (paneles superior e inferior).

La figura 7 muestra fotografías que muestran la traducción de ARNm asociados a KOC1 transportados en las células receptoras.

(a)

son fotografías que muestran la traducción de ARNm transportado en las células receptoras mediante hibridación in situ.

(b)

son fotografías que muestran la síntesis de proteínas basándose en ARNm transportado en células receptoras. Constructos con ARNm de RAB35 de longitud completa fusionados en marco a una secuencia de etiqueta de myc (panel superior). Localización conjunta de proteínas RAB35 con etiqueta de myc en el citoplasma de células receptoras

teñidas con CellTracker (azul) usando inmunocitoquímica (paneles inferiores).

(c)

son fotografías que muestran la síntesis de proteínas basándose en el ARNm transportado en células receptoras. Constructos con ARNm de RAB35 de longitud completa fusionados en marco a una secuencia de proteína EGFP.

(d)

son fotografías que muestran la síntesis de proteínas basándose en el ARNm transportado en células receptoras. Expresión de proteínas RAB35 fusionadas a EGFP en células receptoras positivas para CellTracker (azul) usando microscopia de vídeo de lapso de tiempo. Se mostraron imagen de EGFP y DIC relacionado.

(e)

son fotografías que muestran que no se encontró ninguna diferencia significativa en el nivel de proteínas de proteína fusionada RAB35-EGFP entre células COS-7 que se cotransfectaron con vectores de KOC1 con etiqueta de HA y RAB35-EGFP, y aquéllas con vectores de plásmido vacío y RAB35-EGFP. Esto indica que KOC1 probablemente no interfiera con la traducción de ARNm de RAB35-EGFP.

La figura 8 muestra el efecto de ARNsi de KIF11 en células.

(a)

representa la inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a KIF11. La expresión de KIF11 en respuesta a ARNsi específicos (si-KIF n.º 1, n.º 2 y n.º 3 ) o ARNsi control (EGFP, LUC, SC) en células A549, se analizó mediante RT-PCR semicuantitativa.

(b)

representa la viabilidad de células A549 en respuesta a si-KIF n.º 1, n.º 2, n.º 3, EGFP, LUC, o SC, evaluada mediante ensayos de MTT por triplicado.

La figura 9 muestra el efecto de KOC1 negativo dominante en células.

(a)

representa los resultado de inmunoprecipitación que confirma la interacción del mutante de deleción de KOC1 KOC1DEL3 con KIF11 endógeno en células LC319.

(b)

representa los resultados de inmunoprecipitación que confirma la reducción de la formación de complejo entre KOC1 y KIF11 endógenos en células LC319 que sobreexpresan los dominios RRM.

(c)

representa la viabilidad de células LC319 en respuesta al efecto negativo dominante dependiente de la dosis de KOC1DEL3 evaluada mediante ensayos de MTT por triplicado. El eje X indica la dosificación de ADN de plásmido de KOC1DEL3 (g) transfectado en las células LC319 en ensayos individuales.

(d)

representa los resultados de inmunoprecipitación que detecta la reducción de la formación de complejo entre KOC1 y KIF11 endógenos en células A549 que se transfectaron con el constructo KOC1DEL2.

(e)

representa los resultados de inmunoprecipitación que detecta la interacción del KOC1DEL2 con KIF11 endógeno en células A549.

(f)

representa la viabilidad de células A549 en respuesta al efecto negativo dominante dependiente de la dosis de KOC1DEL2 evaluada mediante ensayos de MTT por triplicado. El eje X indica la dosificación de ADN de plásmido de KOC1DEL2 ((g) transfectado en las células A549 en ensayos individuales.

La figura 10 muestra el efecto de ARNsi de RAB35 en células.

(a)

representa el resultado de RT-PCR semicuantitativa que analiza el efecto de silenciamiento de ARNm en respuesta a si-RAB35 o ARNsi control en células A549.

(b)

muestra resultados de ensayos de MTT de células A549 transfectadas con ARNsi específico o plásmidos control (EGFP, Scramble o Luciferasa). Las barras de errores representan la desviación estándar de ensayos por triplicado.

La figura 11 muestra la asociación de la sobreexpresión de KOC1 y KIF11 con peores resultados en NSCLC.

(a)

representa los resultados de la evaluación inmunohistoquímica de muestras representativas de tejidos de SCC reseccionados quirúrgicamente, usando anticuerpos policlonales anti-KOC1 (izquierda) y anti-KIF11 (derecha) en microalineamientos de tejido (X200).

(b)

representa los resultados del análisis de Kaplan-Meier de los tiempos de supervivencia específicos de tumor según la expresión de KOC1 (panel izquierdo) y la expresión de KIF11 (panel derecho) en microalineamientos de tejido.

La figura 12 es un modelo esquemático para el mecanismo del transporte de ARNm entre células e intracelular mediante complejos KOC1-KIF11-DCTN1 en microtúbulos. El complejo de ribonucleoproteína de KOC1, que incluye la proteína motora de KIF11 y DCTN1, transporta ARNm asociados a KOC1 a través de la estructura de microtúbulos dentro o entre células somáticas de mamífero. Este modelo sugiere que las células de cáncer en proliferación pueden comunicarse de manera activa acoplando este complejo molecular en un sistema que transporta ARNm críticos para la evolución o el crecimiento de cáncer de una célula a otra. La figura 8 muestra la relación entre NMU y GHSR1b/NTSR1.

La figura 13 (a) muestra el resultado del análisis de RT-PCR semicuantitativa que representa la expresión de NMU, receptores candidatos y sus ligandos conocidos detectados en líneas de células de NSCLC.

(b)

muestra la expresión de GHSR1b en tejidos humanos normales.

(c)

representa el resultado de tinción inmunocitoquímica usando anticuerpo anti-FLAG marcado con FITC que muestra la localización conjunta de NMU y GHSR1b/NTSR1 en la superficie celular de células COS-7 que se transfectaron de manera transitoria con GHSR1b o NTSR1 con etiqueta de FLAG.

(d)

representa la interacción de NMU con GHSR1b/NTSR1. Se transfectaron de manera transitoria células COS-7 con los mismos vectores, y se detectó la unión de NMU-25 marcado con rodamina a la superficie celular mediante citometría de flujo. Como controles negativos para estos ensayos se prepararon tres combinaciones de ligando/célula: 1) células COS-7 no transfectadas; 2) NMU-25-rodamina frente a células COS-7 no transfectadas; y 3) células COS-7 transfectadas sólo con GHSR1b o NTSR1.

(e)

representa los resultados del ensayo de unión receptor-ligando usando las células LC319 y PC-14 tratadas con NMU-25.

(f)

representa la producción de AMPc de células de NSCLC tratadas con NMU.

La figura 14 muestra el efecto de ARNsi en células.

(a)

representa la inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a GHSR1b y NTSR1. Se analizó la expresión de GHSR o NTSR1 en respuesta a ARNsi específicos (si-GHSR o si-NTSR1) o ARNsi control (EGFP, LUC, SCR) en células A549 y LC319 mediante RT-PCR semicuantitativa.

(b)

representa el resultado de ensayos de MTT por triplicado que evalúan la viabilidad de células A549 o LC319 en respuesta a si-GHSR, NTSR1, EGFP, LUC, o SCR.

La figura 15 muestra la validación de genes candidatos situados secuencia abajo de NMU.

(a)

representa la reducción dependiente del tiempo del transcrito NMU mediante si-NMU.

(b)

representa el resultado de experimentos de RT-PCR semicuantitativa de ARNm de células LC319 tratadas con si-NMU, confirmando los cebadores específicos de genes la reducción dependiente del tiempo de la expresión del gen diana candidato situado secuencia abajo.

(c)

representa el resultado de RT-PCR semicuantitativa usando ARNm de células LC319 incubadas con NMU-25 o BSA (control) (100 M) que detecta la inducción de FOXM1 como el gen diana candidato situado secuencia abajo de NMU.

La figura 16 muestra el efecto de ARNsi de FOXM1 en células.

(a)

representa la inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a FOXM1. Expresión de FOXM1 en respuesta a ARNsi específicos (si-FOXM1) o ARNsi control (EGFP, LUC, SCR) en células A549, analizada mediante RT-PCR semicuantitativa (panel superior). Viabilidad de células A549, evaluada mediante ensayos de MTT por triplicado, en respuesta a si-FOXM1, EGFP, LUC o SCR (panel inferior).

(b)

representa la inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a FOXM1. Expresión de FOXM1 en respuesta a ARNsi específicos (si-FOXM1) o ARNsi control (EGFP, LUC, SCR) en células LC319, analizada mediante RT-PCR semicuantitativa (panel superior). Viabilidad de células A549, evaluada mediante ensayos de MTT por triplicado, en respuesta a si-FOXM1, EGFP, LUC, o SCR (panel inferior).

La figura 17 es un modelo esquemático de la promoción del crecimiento de células de cáncer y la invasión a través de la interacción del receptor de NMU en la ruta de señalización oncogénica de NMU-GHSR1b autocrina. La unión de NMU a GHSR1b y/o NTSR1 conduce a la activación de la adenilato ciclasa, la acumulación de AMPc intracelular cAMP y la activación siguiente de proteína cinasa (PKA) dependiente de AMPc. La liberación de las subunidades catalíticas de PKA (C) de las subunidades reguladoras (R) dan como resultado la activación del gen FOXM1 situado secuencia abajo y/o genes diana relacionados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las palabras “un”, “uno” y “el/la” tal como se usan en la presente memoria significan “al menos uno” a menos que se indica específicamente lo contrario. Los términos “proteína” y “polipéptido” se usan de manera intercambiable. Además, los términos “gen”, “polinucleótido” y “ácidos nucleicos” se usan de manera intercambiable a menos que se indique específicamente lo contrario.

Para investigar los mecanismos de la carcinogénesis de pulmón e identificar genes que pueden ser útiles como dianas o marcadores de diagnóstico para el desarrollo de nuevas terapias moleculares, se estudiaron genes específicamente regulados por incremento en cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) por medio de microalineamiento de ADNc. A través del análisis, se identificaron un par de genes diana terapéuticos candidatos. Dos genes, proteína que contiene dominio KH que se sobreexpresa en cáncer (KOC1) y neuromedina U (NMU), se expresaron de manera abundante en muestras de NSCLC clínicas así como también líneas de células de NSCLC examinadas. Sin embargo, su expresión fue difícilmente detectable en tejido de pulmón no canceroso correspondiente. El crecimiento de células de NSCLC que sobreexpresaban NMU endógeno se inhibió significativamente mediante anticuerpo anti-NMU. Además, el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi frente a KOC1 y/o NMU suprimió la expresión del gen y dio como resultado la inhibición del crecimiento de las células NSCLC. Además, se identificó que KOC1 se unía al miembro 11 de la familia de cinesina (KIF11) de las células de cáncer, mientras que NMU se unía a los receptores acoplados a la proteína G neuropeptídica (GPCR), receptor 1b secretagogo de la hormona de crecimiento (GHSR1b) y receptor 1 de neurotensina (NTSR1). Se identificó que el sistema de ligando-receptor de NMU activaba la caja de cabeza de tenedor (“forkhead box”) M1 (FOXM1) de Homo sapiens. De manera interesante, GHSR1b, NTSR1, FOXM1 y KIF11 se sobreexpresaban todos específicamente en células de NSCLC.

La proteína de unión a ARN KOC1 y la proteína motora de microtúbulos KIF11 se requieren para la localización de algunos tipos de ARNm necesarios en la embriogénesis y carcinogénesis (figura 12). Tal como se notificó anteriormente por los presentes inventores, el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi específico para reducir la expresión de KOC1 dio como resultado la supresión del crecimiento. En este estudio, se demostró que KIF11 se asociaba con KOC1 en células de NSCLC y que era la diana para el efecto de promoción del crecimiento de KOC1 en tumores de pulmón. Los presentes inventores revelaron que KOC1 no sólo se localizaba conjuntamente con KIF11 en tejidos humanos normales, NSCLC, y líneas celulares, sino que también interaccionaban directamente con KIF11 en células de NSCLC in vitro, y que el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi para KIF11 reducía su expresión y conducía a la supresión del crecimiento. Los resultados muestran que la señalización de KOC1-KIF11 afecta al crecimiento de células de NSCLC. Tal como se muestra a continuación, los fragmentos negativos dominantes de KOC1 (por ejemplo, aquéllos que contienen los dominios RRM) pueden usarse para inhibir la proliferación de células de cáncer. Mediante el análisis de la expresión, se detectó un aumento de la expresión de KOC1 y KIF11 en la mayor parte de las muestras de NSCLC, pero no en tejidos de pulmón normales. Puesto que la mayor parte de las muestras de NSCLC clínicas usadas para el presente análisis estaban en una fase temprana y operable, KOC1 y KIF11 pueden usarse convenientemente como biomarcador para diagnosticar cáncer de pulmón en fase temprana, en combinación con biopsia transbronquial fibroscópica (TBB) o citología de esputo.

Por tanto, KOC1 y KIF11 son esenciales para una ruta oncogénica en NSCLC. Los datos notificados en este caso proporcionan pruebas para diseñar nuevos fármacos anticancerígenos, específicos para cáncer de pulmón, que seleccionan como diana la ruta de KOC1-KIF11. También muestran que ARNsi pueden usarse para tratar cánceres de pulmón avanzados, resistentes a quimioterapia.

Un aumento significativo de la fracción sub-G1 de las células de NSCLC transfectadas con ARNsi-NMU sugirió que el bloqueo de la ruta de señalización de NMU autocrina podría inducir apoptosis. Los presentes inventores también encontraron otras pruebas que apoyan la importancia de esta ruta en carcinogénesis; por ejemplo, la adición de NMU en el medio promueve el crecimiento de las células COS-7 de una manera dependiente de la dosis, y la adición de anticuerpo anti-NMU en el medio de cultivo inhibió este crecimiento celular potenciado por NMU, posiblemente neutralizando la actividad de NMU. Además, el crecimiento de células de NSCLC que sobreexpresaban de manera endógena NMU se inhibió de manera significativa mediante al anticuerpo anti-NMU. La expresión de NMU también dio como resultado la promoción significativa de la invasión de células COS-7 en ensayos in vitro. Estos resultados muestran que NMU es un factor de crecimiento importante para NSCLC y está asociado con la invasión de células de cáncer, actuando de manera autocrina, y que las moléculas de selección que seleccionan como diana la ruta de promoción del crecimiento del receptor NMU es un enfoque terapéutico útil para tratar NSCLC. Mediante análisis inmunohistoquímico, se detectó un aumento de la expresión de proteína NMU en la mayor parte de muestras de NSCLC (SCC, ADC, LCC y BAC) y SCLC, pero no en tejidos de pulmón normales. Puesto que NMU es una proteína secretada y la mayor parte de las muestras de NSCLC clínicas usadas por el presente análisis estaban en una fase temprana y operable, NMU puede usarse de manera conveniente como biomarcador para el diagnóstico de cáncer de pulmón en fase temprana, en combinación con biopsia transbronquial fibroscópica (TBB), citología de esputo o análisis de sangre.

Se sabe que dos receptores, NMU1R (FM3/GPR66) y NMU2R (FM4), interaccionan con NMU. Los resultados presentados en este caso, sin embargo, indicaban que estos dos receptores conocidos no eran las dianas para la ruta de señalización de NMU autocrina en NSCLC; en su lugar, GHSR1b y NTSR1 probaron ser las dianas para el efecto de promoción del crecimiento de NMU en tumores de pulmón. Los presentes inventores revelaron que NMU-25 se unía a estos receptores en la superficie celular, y que el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi para GHSR1b o NTSR1 reducían la expresión de los receptores y conducían a apoptosis. Los resultados muestran que NMU afecta al crecimiento de células de NSCLC actuando a través de GHSR1b y/o NTSR1 (figura 14). GHSR es un receptor conocido de grelina (GHRL), un péptido de 28 aminoácidos identificado recientemente que puede estimular la liberación de la hormona pituitaria del crecimiento y apetito en seres humanos (Lambert, P.D. et al., Proc. Natl. Acad. Set 98: 4652-4657 (2001); Petersenn, S. et al., Endocrinology 142: 2649-2659 (2001); Kim K. et al., Clin. Endocrinol. 54: 705-860 (2001); Kojima, M. et al., Nature 402: 656-660 (1999)). De los dos transcritos que se sabe que son receptores para GHRL, GHSR1a y GHSR1b, se detectó la sobreexpresión de sólo GHSR1b en líneas celulares y tejidos de NSCLC. Puesto que GHRL no se expresaba en los NSCLC examinados, se sospechó que GHSR1b tenía una función de promoción del crecimiento en tumores de pulmón a través de la unión a NMU, pero no a GHRL.

NTSR1 es uno de los tres receptores de neurotensina (NTS), un péptido del cerebro y gastrointestinal que cumple muchas funciones centrales y periféricas (Heasley, L.E. Oncogene 20: 1563-1569 (2001)). NTS modula la transmisión de dopamina y la secreción de hormonas pituitarias, y ejerce efectos hipotérmicos y analgésicos en el cerebro mientras que actúa como hormona periférica en el tracto digestivo y sistema cardiovascular. Otros han notificado que NTS se produce y secreta en varios cánceres humanos, incluyendo cánceres de pulmón de células pequeñas (SCLC) (Heasley,

L.E. Oncogene 20: 1563-1569 (2001)). La expresión de NTS se detectó en cuatro de las 15 líneas de células de NSCLC que se examinaron tal como se da a conocer en la presente memoria (figura 13a), pero el patrón de expresión de NTS no necesariamente concordaba con el de NMU o NTSR1. Por tanto, NTS puede contribuir, junto con NMU, al crecimiento de NSCLC a través de NTSR1 u otro(s) receptor(es) en un subconjunto pequeño de NSCLC. En los experimentos presentes, la mayor parte de las líneas de células cáncer y NSCLC clínicos que expresaban NMU también expresaban GHSR1b y/o NTSR1, lo que indica que estas interacciones ligando-receptor estaban implicadas en una ruta que es principal para la actividad de promoción del crecimiento de NMU en NSCLC.

La ruta de señalización de NMU afecta a la promoción del crecimiento de células de cáncer de pulmón mediante transactivación de un conjunto de genes situados secuencia abajo que incluyen FOXM1. Se sabía que FOXM1 se sobreexpresaba en varios tipos de cánceres humanos (Teh, M.T. et al., Cancer Res. 62, 4773-4780.; van den Boom, J. et al., (2003). Am. J. Pathol. 163, 1033-1043.; Kalinichenko, V.V. et al., (2004). Genes. Dev. 18, 830-850). La familia de genes de “cabeza de tenedor”, identificada por primera vez en Drosophila, comprende factores de transcripción con un motivo de unión a ADN de 100 aminoácidos conservado, y se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la regulación de la expresión de genes implicados en el crecimiento, proliferación, diferenciación, longevidad y transformación celular. Los ensayos de cotransfección en la línea celular HepG2 de hepatoma humano demostraron que la proteína FOXM1 estimulaba la expresión tanto de la ciclina B1 (CCNB1) como la ciclina D1 (CCND1) (Wang, X. et al., (2002). Proc. Nat. Acad. ScI 99, 16881- 16886.), lo que sugiere que estos genes de ciclina son dianas de transcripción de FOXM1 directas y que FOXM1 controla la red de transcripción de genes que son esenciales para la división celular y salen de la mitosis. Debe notarse que se observó la activación de CCNB1 en la mayor parte de una serie de NSCLC y su buena concordancia de la expresión con FOXM1 (datos no mostrados). La promoción del crecimiento celular en células de NSCLC mediante NMU podría reflejar la transactivación de FOXM1, lo que en consecuencia afectaría a la función de aquellas rutas moleculares. Por tanto, NMU, dos receptores recientemente revelados para esta molécula, GHSR1b y NTSR1, y su gen situado secuencia abajo FOXM1 están implicados en la ruta de señalización de promoción del crecimiento autocrino en NSCLC. Los datos notificados en este caso proporcionan la base para diseñar nuevos fármacos anticancerígenos, específicos para cáncer de pulmón, que seleccionan como diana la ruta de NMUGHSR1b/NTSR1-FOXM1. También muestran que ARNsi que interfieren con esta ruta pueden usarse para tratar cánceres de pulmón avanzados, resistentes a quimioterapia.

Estos datos muestran que la ruta de señalización de KOC1-KIF11 está frecuentemente regulada por incremento en carcinogénesis de pulmón y que NMU es un importante factor de crecimiento autocrino para NSCLC, que actúa a través de moléculas de receptor GHSR1b y NTSR1. De ese modo, la supresión selectiva de componentes de estos complejos puede suprimir el desarrollo y/o la evolución de carcinogénesis de pulmón y la selección como diana de estas rutas se usan de manera conveniente en estrategias terapéuticas y de diagnóstico para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón.

Diagnóstico de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)

Mediante la medición del nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en una muestra biológica derivada de un sujeto, puede determinarse la aparición de NSCLC o una predisposición a desarrollar NSCLC en el sujeto. La descripción implica determinar (por ejemplo, medir) el nivel de expresión de al menos uno, y hasta todos los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 en la muestra biológica.

Según la descripción, se detecta un transcrito génico del gen asociado a NSCLC, KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, para determinar el nivel de expresión del gen. El nivel de expresión de un gen puede detectarse detectando los productos de expresión del gen, incluyendo productos tanto transcripcionales como traduccionales, tales como ARNm y proteínas. Basándose en la información de secuencias proporcionada por las entradas de la base de datos de GenBank™ para las secuencias conocidas, pueden detectarse genes KIF11 (NM_004523), GHSR1b (NM_004122), NTSR1 (NM_002531) y FOXM1 (n.º NM_202003) y medirse usando técnicas bien conocidas para un experto en la técnica. Las secuencias de nucleótidos de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 se describen como SEC ID Nº: 1, 3, 5 y 106, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes se describen como SEC ID Nº: 2, 4, 6 y 107.

Por ejemplo, las secuencias dentro de las entradas de base de datos de secuencias correspondientes al gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 pueden usarse para construir sondas para detectar sus ARNm, por ejemplo, mediante análisis de hibridación por transferencia tipo Northern. La hibridación de la sonda con un transcrito génico en una muestra biológica del sujeto también puede llevarse a cabo en un alineamiento de ADN. Se prefiere el uso de un alineamiento para detectar el nivel de expresión de una pluralidad de los genes NSC (KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1). Como otro ejemplo, las secuencias pueden usarse para construir cebadores para amplificar específicamente genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en, por ejemplo, métodos de detección basados en amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa basada en la transcripción inversa (RT-PCR). Además, el nivel de expresión del gen KIF11 , GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 puede analizarse basándose en la cantidad de las proteínas expresadas codificadas por el gen. Un método para determinar la cantidad de la proteína expresada incluye métodos de inmunoensayo. Alternativamente, el nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 también puede determinarse basándose en la actividad biológica de la proteína expresada codificada por el gen. Por ejemplo, se sabe que una proteína codificada por el gen KIF11 se une a KOC1, y de ese modo el nivel de expresión del gen puede detectarse midiendo la capacidad de unión a KOC1 debido a la proteína expresada. Además, se sabe que la proteína KIF11 tiene una actividad de proliferación celular. Por tanto, el nivel de expresión del gen KIF11 puede determinarse usando tal actividad de proliferación celular como una señal. Por otra parte, se sabe que las proteínas GHSR1b y NTSR1 se unen a NMU, y también tienen una actividad de proliferación celular. De ese modo, de manera similar a KIF11 , los niveles de expresión de los genes GHSR1b y NTSR1 pueden detectarse midiendo su capacidad de unión a NMU o la actividad de proliferación celular debido a la proteína expresada.

Puede usarse cualquier material biológico como muestra biológica para determinar el nivel de expresión siempre que pueda detectarse cualquiera de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 en la muestra e incluye poblaciones de células de prueba (es decir, muestra de tejido derivada de un sujeto). Preferiblemente, la muestra biológica comprende una célula de pulmón (una célula obtenida del pulmón). Puede también medirse la expresión génica en sangre, suero u otros fluidos corporales tales como esputo. Además, la muestra de prueba puede ser células purificadas de un tejido.

El sujeto al que se le diagnostica NSCLC según el método es preferiblemente un mamífero e incluye ser humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo y vaca.

El nivel de expresión de uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en la muestra biológica se compara con el(los) nivel(es) de expresión de los mismos genes en una muestra de referencia. La muestra de referencia incluye una o más células con parámetros conocidos, es decir, es decir, cancerosa o no cancerosa. La muestra de referencia debe derivarse de un tipo de tejido similar al de la muestra de prueba. Alternativamente, el nivel de expresión de control puede determinarse basándose en una base de datos de información molecular derivada de células para la que se conoce la condición o el parámetro de ensayo.

Si un patrón del nivel de expresión génica en una muestra biológica indica o no la presencia de NSCLC depende de la composición de la población de células de referencia. Por ejemplo, cuando la población de células de referencia está compuesta por células no cancerosas, un nivel de expresión génica similar en la muestra biológica de prueba al del de la referencia indica que la muestra biológica de prueba es no cancerosa. Por otra parte, cuando la población de células de referencia está compuesta por células cancerosas, un perfil de expresión génica similar en la muestra biológica al del de la referencia indica que la muestra biológica de prueba incluye células cancerosas.

La muestra biológica de prueba puede compararse con múltiples muestras de referencia. Cada una de las múltiples muestras de referencia puede diferir en el parámetro conocido. Así, puede compararse una muestra de prueba con una muestra de referencia que se sabe que contiene, por ejemplo, células de NSCLC, y al mismo tiempo con una segunda muestra de referencia que se sabe que contiene, por ejemplo, células no de NSCLC (células normales).

Según la descripción, la expresión de uno o más de los genes asociados a NSCLC, KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1, se determina en la muestra biológica y se compara con el nivel de control normal del mismo gen. La expresión “nivel de control normal” se refiere a un perfil de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 que se encuentra normalmente en una muestra biológica derivada de una población que no padece NSCLC. El nivel de expresión del gen KIF11 , GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en las muestras biológicas de un sujeto control y de prueba puede determinarse al mismo tiempo o el nivel de control normal puede determinarse mediante un método estadístico basándose en los resultados obtenidos analizando el nivel de expresión del gene en muestras recogidas previamente de un grupo control. Un aumento del nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en la muestra biológica derivada de una muestra de tejido derivada de un paciente indica que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar NSCLC.

Un nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en una muestra biológica de prueba puede considerarse alterada cuando el nivel de expresión difiere del de la referencia en más de 1,0, 1,5, 2,0, 5,0, 10,0 o más veces. Alternativamente, un nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en una muestra biológica de prueba puede considerarse alterado, cuando el nivel de expresión aumenta o disminuye con respecto el de la referencia al menos 50%, 60%, 80%, 90% o más.

La diferencia en la expresión génica entre la muestra de prueba y una muestra de referencia puede normalizarse con un gen de control, por ejemplo, de mantenimiento. Por ejemplo, un polinucleótido de control incluye aquéllos cuyos niveles de expresión se sabe que no difieren entre las células cancerosas y no cancerosas. Los niveles de expresión del polinucleótido de control en las muestras de prueba y referencia pueden usarse para normalizar los niveles de expresión detectados para el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Los genes de control que van a usarse en la presente descripción incluyen -actina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa y proteína ribosómica P1.

El gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 de manera diferencial identificado en la presente memoria también permite monitorizar el transcurso del tratamiento de NSCLC. En este método, se proporciona una muestra biológica de prueba de un sujeto que está sometido a tratamiento para NSCLC. Si se desea, se obtienen múltiples muestras biológicas de prueba del sujeto en diversos momentos antes, durante o después del tratamiento. La expresión de uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en la muestra se determina entonces y se compara con una muestra de referencia con un estado conocido de NSCLC que no se ha expuesto al tratamiento.

Si la muestra de referencia contiene células no de NSCLC, una similitud en el nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en la muestra biológica de prueba y la muestra de referencia indica la eficacia del tratamiento. Sin embargo, una diferencia en el nivel de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en las muestras de prueba y referencia indica un pronóstico o resultado clínico menos favorable. En particular, un aumento de la expresión de KOC1, KIF11, o KOC1 en combinación con un aumento de la expresión de KIF11 está asociado de manera significativa con un mal pronóstico.

El término “eficaz” se refiere a que el tratamiento conduce a una reducción de la expresión de un gen patológicamente regulado por incremento (incluyendo los genes indicadores presentes, KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1), o una disminución del tamaño, prevalencia o potencial metastásico de NSCLC en un sujeto. Cuando se aplica un tratamiento profilácticamente, “eficaz” quiere decir que el tratamiento retrasa o previene la aparición del NSCLC o mitiga un síntoma clínico de NSCLC. La evaluación de NSCLC puede realizarse usando protocolos clínicos convencionales. Además, la eficacia de un tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar NSCLC. Por ejemplo, NSCLC se diagnostica histopatológicamente o mediante identificación de anomalías sintomáticas tales como tos crónica, ronquera, tos con sangre, pérdida de peso, pérdida del apetito, dificultad para respirar, respiración sibilante, episodios repetidos de bronquitis o neumonía y dolor torácico.

Además, el presente método para diagnosticar NSCLC también puede aplicarse para evaluar el pronóstico de un paciente con cáncer comparando el nivel de expresión del gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1, FOXM1, o una combinación del mismo (por ejemplo, KOC1 y KIF11) en la muestra biológica derivada del paciente. Alternativamente, el nivel de expresión del(de los) gen(es) en la muestra biológica puede medirse sobre un espectro de fases de enfermedad para evaluar el pronóstico de l paciente.

Un aumento del nivel de expresión del gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en comparación con un nivel de control normal indica un pronóstico menos favorable. Una similitud en el nivel de expresión del gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en comparación con un nivel de control normal indica un pronóstico más favorable del paciente. Preferiblemente, el pronóstico de un sujeto puede evaluarse comparando el perfil de expresión del gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. En algunas realizaciones, se determinan niveles de expresión de KIF11 y KOC1.

Perfil de expresión

La descripción también proporciona un perfil de expresión de referencia de NSCLC que comprende un patrón de niveles de expresión génica de dos o más de los genes KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. El perfil de expresión sirve como control para el diagnóstico de NSCLC o predisposición para desarrollar la enfermedad, monitorizar el transcurso del tratamiento y evaluar el pronóstico de un sujeto con la enfermedad.

Kits dados a conocer en la presente memoria

Se da a conocer en la presente memoria un kit que comprende dos o más reactivos de detección, por ejemplo, un ácido nucleico que se une específicamente a o identifica uno o más de los genes KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Tales ácidos nucleicos que se unen específicamente a o que identifican uno o más de los genes KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 se dan como ejemplo mediante secuencias de oligonucleótidos que son complementarias a una parte de polinucleótidos KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 o anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por el gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Los reactivos están envasados juntos en forma de un kit. Los reactivos, tales como un ácido nucleico o anticuerpo (o bien unidos a una matriz sólida o bien envasados por separado con reactivos para unirlos a la matriz), un reactivo de control (positivo y/o negativo) y/o un medio de detección del ácido nucleico o anticuerpo se envasan preferiblemente en recipientes separados. Pueden incluirse en el kit instrucciones (por ejemplo, por escrito, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. El formato de ensayo del kit puede ser hibridación tipo Northern o ELISA sándwich conocidos en la técnica.

Por ejemplo, un reactivo de detección se inmoviliza en una matriz sólida tal como una tira porosa para formar al menos un sitio de detección. La región de detección o medición de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios de detección, conteniendo cada sitio de detección un reactivo de detección. Una tira de prueba también puede contener sitios para controles negativos y/o positivos. Alternativamente, el(los) sitio(s) de control está(n) ubicado(s) en una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los diferentes sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de reactivos inmovilizados, es decir, una cantidad superior en el primer sitio de detección y cantidades menores en sitios posteriores. Tras la adición de una muestra biológica prueba, el número de sitios que presentan una señal detectable proporciona una indicación cuantitativa de la cantidad del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o polipéptidos codificados por el gen presente en la muestra. Los sitios de detección pueden configurarse de cualquier forma detectable y están normalmente en forma de una barra o punto que abarca la anchura de una tira de prueba.

Alternativamente, el kit contiene un alineamiento de sustrato de ácido nucleico que comprende dos o más de las secuencias de gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. La expresión de 2 ó 3 de los genes representados por KIF11, GHSR1b, NTSR1, y FOXM1 se identifican conforme al nivel de unión a un chip o una tira de prueba de alineamiento. El alineamiento de sustrato puede ser en, por ejemplo, un sustrato sólido, por ejemplo un “chip” tal como se describe en la patente estadounidense n.º 5.744.305.

En algunas realizaciones, los kits pueden usarse para predecir un pronóstico de NSCLC. Los kits en estas realizaciones pueden comprender un reactivo para detectar ARNm que codifica para la secuencia de aminoácidos de KIF11 o KOC1, un reactivo para detectar las proteínas o reactivos para detectar la actividad biológica de la proteína de KIF11 o KOC1.

También se dan a conocer en la presente memoria kits para la detección de un compuesto que regula la actividad de transporte de ARN. Los kits pueden comprender una célula que expresa un polipéptido de KIF11, o equivalente funcional, un polipéptido de KOC1, o equivalente funcional, y ARN que va a transportarse, y DCTN1.

Los kits dados a conocer también pueden usarse para seleccionar compuestos para tratar o prevenir NSCLC. Los kits pueden comprender un polipéptido de KOC1, o equivalente funcional, y un ARN que se une por el polipéptido de KOC1

o equivalente funcional. En la presente descripción puede usarse como ARN que va a transportarse cualquier ARN transportable con actividad de transportador de ARN del complejo KOC1-KIF11. Puede seleccionarse ARN preferido a partir de transcritos de genes mostrados en la tabla 2, o fragmentos de los mismos. Un ARN que va a transportarse también puede marcarse para detectar la actividad de transportador de ARN. Además, en la presente descripción, el polipéptido de KOC1 y KIF11, o equivalente funcional del mismo se expresa como proteína de fusión con proteína generadora de señales para la observación en microscopio o sistemas de obtención de imágenes celulares. Por ejemplo, ECFP, EYFP y EGFP pueden usarse para la proteína generadora de señales.

Alineamiento y pluralidades

La descripción también incluye un alineamiento de sustrato de ácidos nucleicos que comprende uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Los ácidos nucleicos en el alineamiento corresponden específicamente a una o más secuencias de polinucleótidos representadas por los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. El nivel de expresión de 2, 3 ó 4 de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 se identifica detectando la unión del ácido nucleico al alineamiento.

La descripción también incluye una pluralidad aislada (es decir una mezcla de dos o más ácidos nucleicos) de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos están en una fase líquida o una fase sólida, por ejemplo, inmovilizados en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa. La pluralidad incluye uno o más de los polinucleótidos representados por los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Según una realización adicional dada a conocer en la presente memoria, la pluralidad incluye 2, 3 ó 4 de los polinucleótidos representados por los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1.

Chips

El chip de ADN es un dispositivo que es conveniente para comparar los niveles de expresión de varios genes al mismo tiempo. Pueden llevarse a cabo perfiles de expresión basados en chip de ADN, por ejemplo, mediante el método que se da a conocer en “Microarray Biochip Technology “ (Mark Schena, Eaton Publishing, 2000), etc.

Un chip de ADN comprende sondas de alta densidad inmovilizadas para detectar varios genes. Así los niveles de expresión de muchos genes pueden estimarse al mismo tiempo mediante un análisis de un solo ciclo. Concretamente, puede determinarse el perfil de expresión de una muestra con un chip de ADN. El método basado en el chip de ADN de la presente descripción comprende las siguientes etapas de:

(1)

sintetizar ARNa o ADNc correspondientes a los genes marcadores;

(2)

hibridar los ARNa o ADNc con sondas para los genes marcadores; y

(3)

detectar el ARNa o ADNc que hibrida con las sondas y cuantificar la cantidad de ARNm del mismo.

El término “ARNa” se refiere a ARN transcrito a partir de un ADNc de molde con ARN polimerasa. Está comercialmente disponible un kit de transcripción de ARNa para obtener perfiles de expresión basados en chip de ADN. Con un kit de este tipo puede sintetizarse ARNa a partir de ADNc unido a promotor T7 como molde usando ARN polimerasa de T7. Por otra parte, mediante PCR que usa cebador aleatorio, puede amplificarse ADNc usando como molde un ADNc sintetizado a partir de ARNm.

Alternativamente, el chip de ADN comprende sondas, sobre las que se han colocado manchas, para detectar los genes marcadores de la descripción (gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1). No existe límites en el número de genes marcadores manchados en el chip de ADN, y pueden usarse 1, 2, 3 o todos los genes, KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Cualquier otro gen así como también los genes marcadores pueden colocarse como manchas en el chip de ADN. Por ejemplo, una sonda para un gen cuyo nivel de expresión difícilmente se altera puede colocarse como mancha en el chip de ADN. Un gen de este tipo puede usarse para normalizar resultados de ensayo cuando se pretende que los resultados de ensayo se comparen entre múltiples chips o entre diferentes ensayos.

Una sonda se diseña para cada gen marcador seleccionado, y se coloca como mancha en un chip de ADN. Una sonda de este tipo puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido que comprende 5-50 residuos de nucleótidos. Los expertos en la técnica conocen un método para sintetizar tales oligonucleótidos en un chip de ADN. Pueden sintetizarse ADN más largos mediante PCR o químicamente. Los expertos en la técnica también conocen un método para manchar ADN largo, que se sintetiza mediante PCR o similares, en un portaobjeto. Puede usarse un chip de ADN que se obtiene mediante el método tal como se describió anteriormente para diagnosticar NSCLC según la presente descripción.

El chip de ADN preparado se pone en contacto con ARNa, seguido por la detección de la hibridación entre la sonda y ARNa. El ARNa puede marcarse previamente con un tinte fluorescente. Puede usarse un tinte fluorescente tal como Cy3 (rojo) y Cy5 (verde) para marcar una ARNa. Los ARNa de un sujeto y un control se marcan con diferentes tintes fluorescentes, respectivamente. La diferencia en el nivel de expresión entre los dos puede estimarse basándose en una diferencia de la intensidad de señal. La señal del tinte fluorescente en el chip de ADN puede detectarse un escáner y analizarse usando un programa especial. Por ejemplo, el Suite de Affymetrix es un paquete de software para análisis de chip de ADN.

Identificación de compuestos que inhiben la expresión de gen asociado a NSCLC

Un compuesto que inhibe la expresión o actividad de un gen diana asociado a NSCLC (gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1) se identifica poniendo en contacto una célula de prueba que expresa el gen asociado a NSCLC con un compuesto de prueba y determinando el nivel de expresión o la actividad del gen asociado a NSCLC. Una disminución de la expresión en comparación con el nivel de control normal indica que el compuesto es un inhibidor del gen asociado a NSCLC. Tales compuestos identificados según el método son útiles para inhibir NSCLC.

La célula de prueba puede ser una población de células e incluye cualquier célula siempre que la célula exprese el(los) gen(es) diana asociado(s) a NSCLC. Por ejemplo, la célula de prueba puede ser una línea celular inmortalizada derivada de una célula de NSCLC. Alternativamente, la célula de prueba puede ser una célula transfectada con cualquiera de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1, o que se ha transfectado con la secuencia reguladora (por ejemplo, promotor) de cualquiera de los genes que está unida operativamente a un gen indicador.

Selección de compuestos

Con el uso del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, proteínas codificadas por el gen o región reguladora transcripcional del gene, pueden seleccionarse compuestos que alteran la expresión del gene o la actividad biológica de un polipéptido codificado por el gen. Se espera que tales compuestos sirvan como compuestos farmacéuticos para tratar o prevenir NSCLC.

Por tanto, la presente descripción proporciona un método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC usando el polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Una realización de este método de selección comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido codificado por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1; (b) detectar la actividad de unión entre el polipéptido dado a conocer en la presente memoria y el compuesto de prueba; y (c) seleccionar el compuesto que se une al polipéptido.

Tal como se explica en más detalle a continuación, KOC1 y KIF11 forman un complejo que tiene actividad de transporte de ARN. De ese modo, la presente descripción proporciona métodos para polipéptidos y otros compuestos que modulan la actividad de transporte de ARN. Por ejemplo, puede someterse a prueba un polipéptido para determinar la actividad de transporte de ARN poniendo en contacto un polipéptido de KIF11 (SEC ID Nº: 2) o un equivalente funcional del mismo con un ARN que puede transportarse por KIF11 en condiciones adecuadas para el transporte de ARN. El nivel de ARN transportado puede medirse usando técnicas bien conocidas, tales como mediante inmunoprecipitación de ARN, tal como se describe en detalle a continuación.

Un equivalente funcional de un polipéptido de KIF11 es un polipéptido que tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 y, por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11), en la que uno o más aminoácidos (normalmente menos de cinco) se sustituyen, delecionan o insertan. Alternativamente, el polipéptido puede ser uno que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología (también denominada identidad de secuencia) con respecto a SEC ID Nº: 2. En otras realizaciones, el polipéptido puede estar codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas (tal como se define a continuación) con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1.

En algunas realizaciones, el polipéptido de KIF11 o equivalente funcional se pone en contacto con un polipéptido de KOC1 o equivalente funcional del mismo. Un equivalente funcional de un polipéptido de KOC1 es un polipéptido que tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 y, por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105, en la que uno o más aminoácidos (normalmente menos de cinco) se sustituyen, delecionan o insertan. Alternativamente, el polipéptido puede ser uno que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología (también denominada identidad de secuencia) con respecto a SEC ID Nº: 105. En otras realizaciones, el polipéptido puede estar codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas (tal como se define a continuación) con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 104. En algunas realizaciones, un equivalente funcional comprende al menos un dominio RRM o KH.

La descripción también proporciona métodos para identificar agentes que modulan la actividad de transporte de ARN. En estos métodos, un agente que se sospecha que modula la actividad de transporte de ARN con un polipéptido de KIF11 o equivalente funcional. Se detecta el nivel de ARN transportado y se compara con el nivel en un control en ausencia del agente.

El polipéptido que va a usarse para la selección puede ser un polipéptido recombinante o una proteína de origen natural

o un péptido parcial de los mismos. El polipéptido que va a ponerse en contacto con un compuesto de prueba puede ser, por ejemplo, un polipéptido purificado, una proteína soluble, una forma unida a un vehículo o una proteína de fusión fusionada con otros polipéptidos.

Como método para seleccionar proteínas que se unen al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, pueden usarse muchos métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Una selección de este tipo puede realizarse, por ejemplo, mediante un método de inmunoprecipitación usando métodos bien conocidos en la técnica. Las proteínas dadas a conocer en la presente memoria pueden producirse de manera recombinante usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, un gen que codifica para cualquiera de los polipéptidos de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 se expresa en células animales insertando el gen en un vector de expresión para genes foráneos, tal como pSV2neo, pcDNAI, pcDNA3.1, pCAGGS y pCD8. El promotor que va a usarse para la expresión puede ser cualquier promotor que puede usarse comúnmente e incluyen, por ejemplo, el promotor temprano de SV40 (Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, Londres, 83-141 (1982)), el promotor EF- (Kim et al., Gene 91 : 217-23 (1990)), el promotor CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-200 (1991)), el promotor RSV LTR (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)) el promotor SR (Takebe et al., MoI Cell Biol 8: 466 (1988)), el promotor temprano inmediato de CMV (Seed y Aruffo, Proc, Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), el promotor tardío de SV40 (Gheysen y Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), el promotor tardío de adenovirus (Kaufman et al., MoI Cell Biol 9: 946 (1989)), el promotor HSV TK, etcétera. La introducción del gen en células animales para expresa un gen foráneo puede realizarse según cualquier método, por ejemplo, el método de electroporación (Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 131126 (1987)), el método de fosfato de calcio (Chen y Okayama, MoI Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), el método de DEAE dextrano (Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman y Milman, MoI Cell Biol 4: 1642-3 (1985)), el método de lipofectina (Derijard, B Cell 7: 1025-37 (1994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)), etcétera. El polipéptido NSC también puede expresarse como proteína de fusión que comprende un sitio de reconocimiento (epítopo) de un anticuerpo monoclonal introduciendo el epítopo del anticuerpo monoclonal, cuya especificidad se ha revelado, en el extremo N o C-terminal del polipéptido. Puede usarse un sistema de epítopo-anticuerpo disponible comercialmente (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Están disponibles comercialmente vectores que puede expresar una proteína de fusión con, por ejemplo, -galactosidasa, proteína de unión a maltosa, glutatión S-transferasa, proteína de fluorescencia verde (GFP), etcétera, mediante el uso de sus múltiples sitios de clonación.

También se notifica una proteína de fusión preparada introduciendo sólo epítopos pequeños que consisten en de varios a una docena de aminoácidos de manera que no cambie la propiedad del polipéptido original mediante la fusión. Pueden usarse epítopos, tales como polihistidina (etiqueta de His), agregado HA de influenza, c-myc humano, FLAG, glicoproteína del virus de estomatitis vesicular (VSV-GP), proteína del gen 10 de T7 (etiqueta de T7), glicoproteína del virus de herpes simple humano (etiqueta de HSV), etiqueta de E (un epítopo en fago monoclonal) y similares, y anticuerpos monoclonales que los reconocen, como sistema de epítopo-anticuerpo para seleccionar proteínas que se unen al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

En inmunoprecipitación, se forma un complejo inmunitario añadiendo estos anticuerpos al lisado celular preparado usando un detergente apropiado. El complejo inmunitario consiste en el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, un polipéptido que comprende la capacidad de unión con el polipéptido, y un anticuerpo. También puede realizarse la inmunoprecipitación usando anticuerpos frente al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, además del uso de anticuerpos frente a los epítopos anteriores, anticuerpos que pueden prepararse según métodos convencionales y pueden estar de cualquier forma, tal como anticuerpos monoclonales o policlonales, e incluye antisuero obtenido mediante la inmunización de un animal tal como un conejo con el polipéptido, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como también anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos humanizados).

Específicamente pueden prepararse anticuerpos frente al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 usado como antígeno para obtener un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie animal, pero preferiblemente se deriva de un mamífero tal como un ser humano, ratón o rata, más preferiblemente de un ser humano. El polipéptido usado como antígeno puede producirse de manera recombinante o aislarse a partir de fuentes naturales. Según la presente descripción, el polipéptido que va a usarse como antígeno de inmunización puede ser una proteína completa o un péptido parcial del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Un péptido parcial puede comprender, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal o carboxilo (C)-terminal del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1.

Cualquier animal mamífero puede inmunizarse con el antígeno, pero preferiblemente se tiene en cuenta la compatibilidad con células primarias usadas para la fusión celular. En general, se usan animales de Rodentia, Lagomorpha o Primates. Los animales de Rodentia incluyen, por ejemplo, ratón, rata y hámster. Los animales de Lagomorpha incluyen, por ejemplo, conejo. Los animales de Primates incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo mundo) tal como Macaca fascicularis, mono rhesus, papión sagrado y chimpancés.

Se conocen en la técnica métodos para inmunizar animales con antígenos. La inyección intraperitoneal o inyección subcutánea es un método convencional para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, los antígenos pueden diluirse y suspenderse en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígeno puede mezclarse con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional, tal como el adyuvante completo de Freund, preparado en emulsión y entonces administrado en animales mamíferos. Preferiblemente, esto va seguido de varias administraciones del antígeno mezclado con una cantidad de manera apropiada del adyuvante incompleto de Freund cada de 4 a 21 días. Puede usarse un vehículo apropiado para la inmunización. Tras la inmunización tal como anteriormente, se examina el suero mediante un método convencional para determinar un aumento de la cantidad de anticuerpos deseados.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales frente al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 mediante recogida de sangre del mamífero inmunizado que se examina para determinar el aumento de anticuerpos deseados en el suero, y separando la sangre del suero mediante cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales incluyen suero que contiene los anticuerpos policlonales, así como también puede aislarse del suero la fracción que contiene los anticuerpos policlonales. Puede prepararse la inmunoglobulina G o M a partir de una fracción que reconoce sólo el polipéptido de KIF11 , GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con el polipéptido, y purificando además esta fracción usando una columna de proteína A o proteína G.

Para preparar anticuerpos monoclonales, se recogen células inmunitarias del mamífero inmunizado con el antígeno y se comprueba el aumento del nivel de anticuerpos deseados en el suero tal como se describió anteriormente y se someten a la fusión celular. Las células inmunitarias usadas para la fusión celular se obtienen preferiblemente del bazo. Otras células primarias preferidas que van a fusionarse con el inmunocito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos, y más preferiblemente células de mieloma que tienen una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas mediante fármacos.

Las células de mieloma y el inmunocito anteriores pueden fusionarse según métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein et al., (Galfre y Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Pueden seleccionarse hibridomas resultantes obtenidos mediante la fusión celular cultivándolos en un medio de selección convencional, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular se deja continuar normalmente en el medio HAT durante de varios días a varias semanas, siendo suficiente el tiempo para permitir que todas las otras células mueran, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas). Entonces, se realiza la dilución limitativa convencional para seleccionar y clonar una célula de hibridoma que produce el anticuerpo deseado.

Además del método anterior, en el que se inmuniza un animal no humano con un antígeno para preparar un hibridoma, pueden inmunizarse linfocitos humanos tales como los infectados por el virus EB con el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, células que expresan el polipéptido, o sus lisados in vitro. Entonces, los linfocitos inmunizados se fusionan con células de mieloma derivadas de ser humano que pueden dividirse de manera indefinida, tal como U266, para dar un hibridoma que produce un anticuerpo humano deseado que puede unirse al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 puede obtenerse (solicitud de patente japonesa publicada no examinada n.º (JP-A) Sho 63-17688).

Los hibridomas obtenidos se trasplantan posteriormente en la cavidad abdominal de un ratón y se extraen las células ascíticas. Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden purificarse mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, una columna de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambios iónico DEAE o una columna de afinidad a la que se acopla cualquiera de las proteínas diana dadas a conocer en la presente memoria (polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1). El anticuerpo puede usarse no sólo en el presente método de selección, sino también para la purificación y detección del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, y sirve además como candidato para agonistas y antagonistas del polipéptido. Además, este anticuerpo puede aplicarse al tratamiento con anticuerpos de enfermedades relacionadas con el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 incluyendo NSCLC tal como se describió anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales así obtenidos pueden prepararse de manera recombinante usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck y Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, un ADN que codifica para un anticuerpo puede clonarse a partir de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertarse en un vector apropiado e introducirse en células huésped para preparar un anticuerpo recombinante. Tal anticuerpo recombinante puede usarse también para la presente selección.

Además, un anticuerpo usado en la selección y sucesivamente puede ser un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado, siempre que se un a uno o más de los polipéptidos de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), en el que los fragmentos Fv de las cadenas H y L están ligadas mediante un ligador apropiado (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Más específicamente, un fragmento de anticuerpo puede generarse tratando un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, puede construirse un gen que codifica para el fragmento de anticuerpo, insertarse en un vector de expresión y expresarse en una célula huésped apropiada (véase, por ejemplo, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better y Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun y Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121 : 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Un anticuerpo puede modificarse mediante conjugación con una variedad de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). Pueden obtenerse anticuerpos modificados a través de modificación química de un anticuerpo. Estos métodos de modificación son convencionales en el campo.

Alternativamente, puede obtenerse un anticuerpo como anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de anticuerpo no humano y la región constante derivada de un anticuerpo humano, o como anticuerpo humanizado, que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de anticuerpo no humano, la región de marco (FR) derivada de anticuerpo humano y la región constante. Tales anticuerpos pueden prepararse usando tecnología conocida.

Puede realizarse la humanización sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. También pueden usarse anticuerpos completamente humanos que comprenden regiones variables humanas además de las regiones constante y de marco humanas. Tales anticuerpos pueden producirse usando diversas técnicas conocida en la técnica. Por ejemplo, los métodos in vitro implican el uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticuerpo humano presentados en bacteriófago (por ejemplo, Hoogenboom & Winter, J. MoI. Biol. 227:381 (1991). De manera similar, pueden prepararse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina humanos se han inactivado parcial o completamente. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.150.584, 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016.

Pueden purificarse anticuerpos obtenidos tal como anteriormente hasta homogeneidad. Por ejemplo, la separación y purificación del anticuerpo puede realizarse según los métodos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y aislarse mediante el uso combinado y seleccionado de manera apropiada de cromatografías en columna, tales como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, precipitación por sales, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, enfoque isoeléctrico, y otros (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero no se limitan a los mismos. Puede usarse una columna de proteína A y columna de proteína G como columna de afinidad. Las columna de proteína A a modo de ejemplo que van a usarse incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS, y Sepharose F.F. (Pharmacia).

La cromatografía a modo de ejemplo incluye, con excepción de la de afinidad, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de adsorción, y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Los procedimientos de cromatografía pueden llevarse a cabo mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC y FPLC.

Puede precipitarse un complejo inmunitario, por ejemplo con Sepharose de proteína A o Sepharose de proteína G cuando el anticuerpo es un anticuerpo IgG de ratón. Si el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 se prepara como proteína de fusión con un epítopo, tal como GST, puede formarse un complejo inmunitario de la misma manera que en el uso del anticuerpo frente al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, usando una sustancia que se une específicamente a estos epítopos, tal como glutatión-Sepharose 4B.

Puede realizarse la inmunoprecipitación siguiendo o según, por ejemplo, los métodos en la bibliografía (Harlow y Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nueva York (1988)).

Se usa comúnmente SDS-PAGE para el análisis de proteínas inmunoprecipitadas y puede analizarse la proteína unida mediante el peso molecular de la proteína usando geles con una concentración apropiada. Puesto que la proteína unida al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 es difícil de detectar mediante un método de tinción común, tal como la tinción con Coomassie o tinción con plata, la sensibilidad de detección para la proteína puede mejorarse mediante el cultivo de células en medio de cultivo que contiene isotopo radiactivo, 35S-metionina o 35S-cisteína, marcado de proteínas en las células y detección de las proteínas. Puede purificarse la proteína diana directamente en el gel de SDS-poliacrilamida y puede determinarse su secuencia cuando se ha revelado el peso molecular de la proteína.

Como método para seleccionar proteínas que se unen a cualquiera de los polipéptidos de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 que usan el polipéptido, puede usarse, por ejemplo, el análisis de inmunotransferencia tipo West-Western (Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)). Específicamente, una proteína que se une al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 puede obtenerse preparando una biblioteca de ADNc a partir de células, tejidos, órganos (por ejemplo, tejidos tales como células de pulmón) o células cultivadas (particularmente las derivadas de células de NSCLC) que se espera que expresen una proteína que se una al polipéptido de KIF11 , GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 usando un vector de fago (por ejemplo, ZAP), expresando la proteína en LB-agarosa, fijando la proteína expresada en un filtro, haciendo reaccionar el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 purificado y marcado con el filtro anterior y detectando las placas que expresan proteínas unidas al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 según la marca. Puede marcarse el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 utilizando la unión entre biotina y avidina, o utilizando un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o un péptido

o polipéptido (por ejemplo, GST) que se fusiona con el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. También pueden usarse métodos que usan radioisótopos o fluorescencia y similares.

Alternativamente, en otra realización del método de selección de la presente descripción, puede usare un sistema de dos híbridos que utiliza células (“sistema de dos híbridos MATCHMAKER”, “kit de ensayo de dos híbridos MATCHMAKER de mamífero”, “sistema de un solo híbrido MATCHMAKER” (Clontech); “sistema de vector de dos híbridos HybriZAP” (Stratagene); las referencias “Dalton y Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields y Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).

En el sistema de dos híbridos, el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 se fusiona con la región de unión a SRF o región de unión a GAL4 y se expresa en células de levadura. Se prepara una biblioteca de ADNc a partir de células que se espera que expresen una proteína que se une al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, de manera que la biblioteca cuando se expresa, se fusiona con la región de activación transcripcional VP16 o GAL4. La biblioteca de ADNc se introduce entonces en las células de levadura anteriores y el ADNc derivado de la biblioteca se aísla de los clones positivos detectados (cuando se expresa una proteína que se une al polipéptido dado a conocer en la presente memoria en células de levadura, la unión de los dos activa un gen indicador, haciendo que los clones positivos sean detectables). Una proteína codificada por el ADNc puede prepararse introduciendo el ADNc aislado anteriormente en E. coli y expresando la proteína.

Como gen indicador puede usarse, por ejemplo, gen Ade2, gen lacZ, gen CAT, gen luciferasa y similares además del gen HIS3.

También puede seleccionarse un compuesto que se une al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 usando cromatografía de afinidad. Por ejemplo, el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 puede inmovilizarse en un vehículo de una columna de afinidad, y un compuesto de prueba, que contiene una proteína que puede unirse al polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, se aplica a la columna. En la presente memoria un compuesto de prueba puede ser, por ejemplo, extractos celulares, lisados celulares, etc. Tras cargar el compuesto de prueba, se lava la columna y pueden prepararse los compuestos unidos al polipéptido de KIF11 , GHSR1b, NTSR1 o FOXM1.

Cuando el compuesto de prueba es una proteína, se analiza la secuencia de aminoácidos de la proteína obtenida, se sintetiza un oligoADN basándose en la secuencia, se exploran bibliotecas de ADNc usando el oligoADN como sonda para obtener un ADN que codifica para la proteína.

Puede usarse un biosensor que usa el fenómeno de resonancia de plasmón de superficie como medio para detectar o cuantificar el compuesto unido tal como se da a conocer en la presente memoria. Cuando se usa un biosensor de este tipo, la interacción entre el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y un compuesto de prueba puede observarse en tiempo real como señal de resonancia de plasmón de superficie, usando sólo una pequeña cantidad de polipéptido y sin marcado (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Por tanto, es posible evaluar la unión entre el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y un compuesto de prueba usando un biosensor tal como BIAcore.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para seleccionar moléculas que se unen cuando se expone un polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 inmovilizado a compuestos químicos sintéticos, o bancos de sustancias naturales o una biblioteca de presentación de péptidos en fago aleatoria, y los métodos de selección que usan rendimiento elevado basándose en técnicas químicas combinatorias (Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) para aislar no sólo proteínas sino también compuestos químicos que se unen a la proteína KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 (incluyendo agonista y antagonista).

Alternativamente, la presente descripción proporciona un método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC que usa polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 que comprende las etapas tal como sigue:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1;

(b)

detectar la actividad biológica del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 de la etapa (a); y

(c)

seleccionar un compuesto que suprime la actividad biológica del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de prueba.

Puesto que las proteínas codificadas por cualquiera de los genes de KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 tienen la actividad de promover la proliferación celular de células de NSCLC, puede seleccionarse un compuesto que inhibe esta actividad de una de estas proteínas usando esta actividad como señal.

Puede usarse cualquier polipéptido para seleccionar siempre que comprenda la actividad biológica de las proteínas KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Tal actividad biológica incluye la actividad de proliferación celular y la capacidad de unión con otras proteínas de las proteínas codificadas por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Por ejemplo, puede usarse una proteína humana codificada por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y también pueden usarse polipéptidos funcionalmente equivalentes a estas proteínas. Tales polipéptidos pueden expresarse de manera endógena

o exógena por las células.

El compuesto aislado mediante esta selección es un candidato para antagonistas del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. El término “antagonista” se refiere a moléculas que inhiben la función del polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 uniéndose al mismo. Además, un compuesto aislado mediante esta selección es un candidato para compuestos que inhiben la interacción in vivo de polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 con moléculas (incluyendo ADN y proteínas).

Cuando la actividad biológica que va a detectarse en el presente método es la proliferación celular, puede detectarse, por ejemplo, preparando células que expresan el polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, cultivando las células en presencia de un compuesto de prueba, y determinando la velocidad de la proliferación celular, midiendo el ciclo celular y similares, así como también midiendo la actividad de formación de colonias.

Tal como se trató en detalle anteriormente, controlando los niveles de expresión del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, puede controlarse la aparición y evolución de NSCLC. De ese modo, pueden identificarse compuestos que pueden usarse en el tratamiento o la prevención de NSCLC, a través de selecciones que usan los niveles de expresión de uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 como señales. En el contexto de la presente descripción, tal selección puede comprender, por ejemplo, las siguientes etapas:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que expresa uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1; y

(b)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de uno o más de los genes en comparación con el nivel de expresión detectado en ausencia del compuesto de prueba.

Las células que expresan al menos uno de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 incluyen, por ejemplo, líneas celulares establecidas a partir de células de NSCLC; tales células pueden usarse para la selección anterior dada a conocer en la presente memoria (por ejemplo, A549, NCI-H226, NCI-H522, LC319). Puede estimarse el nivel de expresión mediante métodos bien conocidos por el experto en al técnica. En el método de selección, un compuesto que reduce el nivel de expresión de al menos uno de los genes puede seleccionarse como agentes candidatos que van a usarse para el tratamiento o la prevención de NSCLC.

Alternativamente, el método de selección de la descripción puede comprender las siguientes etapas:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con una célula dentro de la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional de uno o más de los genes marcadores y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora transcripcional, en el que los genes marcadores se seleccionan del grupo

de KIF11, GHSR1b, NTSR1, y FOXM1;

(b)

medir la actividad de dicho gen indicador; y

(c)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho gen indicador tal como se compara con un control.

Se conocen bien en la técnica genes indicadores y células huésped adecuados. El constructo indicador requerido para la selección puede prepararse usando la región reguladora transcripcional de un gen marcador. Cuando los expertos en la técnica conocen la región reguladora transcripcional de un gen marcador, puede prepararse un constructo indicador usando la información de secuencias previa. Cuando la región reguladora transcripcional de un gen marcador sigue estando no identificada, puede aislarse un segmento de nucleótidos que contiene la región reguladora transcripcional a partir de una biblioteca genómica basándose en la información de secuencias de nucleótidos del gen marcador (por ejemplo, basada en la información de secuencias situadas en el sentido de 5').

En una realización adicional del método para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC dado a conocer en la presente memoria, el método utiliza la capacidad de unión de KIF11 con KOC1, o GHSR1b o NTSR1 con NMU.

Tal como se describió anteriormente, los presentes inventores revelaron que KOC1 no sólo se localizaba conjuntamente con KIF11 en tejidos normales humanos, NSCLC y líneas celulares, sino que también interaccionaba directamente con KIF11 en células de NSCLC in vitro, y que el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi para KIF11 reducía su expresión y conducía a la supresión del crecimiento. Los resultados sugieren que la señalización de KOC1-KIF11 afecta al crecimiento de células de NSCLC. De ese modo, se espera que la inhibición de la unión entre KOC1 y KIF11 conduzca a la supresión de la proliferación celular, y compuestos que inhiben la unión sirven como compuestos farmacéuticos para tratar o prevenir NSCLC. Este método de selección incluye las etapas de: (a) poner en contacto un polipéptido de KIF11 o equivalente funcional del mismo con KOC1, o un equivalente funcional del mismo, en presencia de un compuesto de prueba; (b) detectar la unión entre el polipéptido y KOC1 ; y (c) seleccionar el compuesto de prueba que inhibe la unión entre el polipéptido y KOC1.

Además, tal como se describió anteriormente, los presentes inventores revelaron GHSR1b y NTSR1 como las posibles dianas para el efecto de promoción del crecimiento de NMU en tumores de pulmón. Los presentes inventores revelaron que NMU-25 se unía a estos receptores en la superficie celular, y que el tratamiento de células de NSCLC con ARNsi para GHSR1 o NTSR1 reducía la expresión de los receptores y conducía a apoptosis. Los resultados sugieren que NMU afecta al crecimiento de las células de NSCLC actuando a través de GHSR1b y/o NTSR1 (figura 14). De ese modo, se espera que la inhibición de la unión entre GHSR1b o NTSR1 y NMU conduce a la supresión de la proliferación celular, y compuestos que inhiben la unión sirven como compuestos farmacéuticos para tratar o prevenir NSCLC. Este método de selección incluye las etapas de: (a) poner en contacto un polipéptido GHSR1b o NTSR1 o equivalente funcional del mismo con NMU en presencia de un compuesto de prueba; (b) detectar la unión entre el polipéptido y NMU; y (c) seleccionar el compuesto de prueba que inhibe la unión entre el polipéptido y NMU.

Los polipéptidos KOC1 y KIF11, o polipéptidos GHSR1b o NTSR1 y NMU que van a usarse para la selección pueden ser un polipéptido recombinante o una proteína de origen natural, o pueden ser también un péptido parcial de los mismos siempre que conserve la capacidad de unión entre sí. Tales péptidos parciales que conservan la capacidad de unión se denominan en la presente memoria “equivalentes funcionales”. Los polipéptidos KOC1 y KIF11, o polipéptidos GHSR1b o NTSR1 y NMU que van a usarse en la selección pueden ser, por ejemplo, un polipéptido purificado, una proteína soluble, una forma unida a un vehículo o una proteína de fusión fusionada con otros polipéptidos.

Como método para seleccionar compuestos que inhiben la unión entre KOC1 y KIF11, o GHSR1b o NTSR1 y NMU, pueden usarse muchos métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Una selección de este tipo puede llevarse a cabo como sistema de ensayo in vitro, por ejemplo, en un sistema celular. Más específicamente, en primer lugar, o bien KOC1 o KIF11, o GHSR1b o NTSR1, o bien NMU se une a un soporte, y la otra proteína se añade junto con un compuesto de prueba al mismo. A continuación, la mezcla se incuba, se lava y se detecta y/o se mide la otra proteína unida al soporte.

Ejemplos de soportes que pueden usarse para unir proteínas incluyen polisacáridos insolubles, tales como agarosa, celulosa y dextrano; y resinas sintéticas, tales como poliacrilamida, poliestireno y silicio; pueden usarse preferiblemente perlas y placas disponibles comercialmente (por ejemplo, placas de múltiples pocillos, chip biosensor, etc.) preparadas a partir de los materiales anteriores. Cuando se usan perlas, pueden rellenar una columna. Alternativamente, el uso de perlas magnéticas también se conoce en la técnica y permite aislar fácilmente proteínas unidas en las perlas por medio de magnetismo.

La unión de una proteína a un soporte puede realizarse según métodos rutinarios, tales como unión química y adsorción física. Alternativamente, una proteína puede unirse a un soporte por medio de anticuerpos que reconocen específicamente a la proteína. Además, la unión de una proteína a un soporte puede realizarse por medio de avidina y biotina.

La unión entre proteínas se lleva a cabo en tampón, por ejemplo, pero no se limita a, tampón fosfato y tampón Tris, siempre que el tampón no inhiba la unión entra las proteínas.

En la presente descripción, puede usarse un biosensor que usa el fenómeno de resonancia de plasmón de superficie como medio para detectar o cuantificar la proteína unida. Cuando se usa un biosensor de este tipo, la interacción entre las proteínas puede observarse en tiempo real como señal de resonancia de plasmón de superficie, usando sólo una pequeña cantidad de polipéptido y sin marcado (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Por tanto, es posible evaluar la unión entre KOC1 y KIF11, o GHSR1b o NTSR1 y NMU usando un biosensor tal como BIAcore.

Alternativamente, pueden marcarse o bien KOC1 o KIF11, o GHSR1b o NTSR1, o bien NMU, y puede usarse la marca de la proteína de unión para detectar o medir la proteína unida. Específicamente, tras el marcado previo de una de las proteínas, la proteína marcada se pone en contacto con la otra proteína en presencia de un compuesto de prueba, y entonces se detectan o se miden las proteínas unidas según la marca tras el lavado.

Pueden usarse sustancias de marcado tales como radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, P, 3P, 35S, 125I, 131I), enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, β-glucosidasa), sustancias fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina) y biotina/avidina, para el marcado de una proteína en el presente método. Cuando la proteína se marca con radioisótopo, la detección o medición puede llevarse a cabo mediante contador de centelleo en medio líquido. Alternativamente, pueden detectarse o medirse proteínas marcadas con enzimas añadiendo un sustrato de la enzima para detectar el cambio enzimático del sustrato, tal como la generación de color, con un absorciómetro. Además, en caso en el que se use una sustancia fluorescente como marca, la proteína unida puede detectarse o medirse usando un fluorofotómetro.

Además, puede también detectarse o medirse la unión de KOC1 y KIF11, o GHSR1b o NTSR1 y NMU usando anticuerpos frente a KOC1 y KIF11, o GHSR1b o NTSR1 y NMU. Por ejemplo, tras poner en contacto el polipéptido de KOC1 inmovilizado en un soporte con un compuesto de prueba y KIF11, la mezcla se incuba y lava, y puede realizarse la detección o medición usando un anticuerpo frente a KIF11. Alternativamente, puede inmovilizarse KIF11 en un soporte y como anticuerpo puede usarse un anticuerpo frente a KOC1. Cuando se usa la combinación de GHSR1b o NTSR1 y NMU, puede inmovilizarse el polipéptido GHSR1b o NTSR1 en un soporte con un compuesto de prueba y NMU, se incuba y se lava la mezcla, y puede realizarse la detección o medición usando un anticuerpo frente a NMU. Alternativamente, puede inmovilizarse NMU en un soporte, y como anticuerpo puede usarse un anticuerpo frente a GHSR1b o NTSR1.

En caso de usar un anticuerpo en la presente selección, el anticuerpo se marca preferiblemente con una de las sustancias de marcado mencionadas anteriormente, y se detecta o se mide basándose en la sustancia de marcado. Alternativamente, puede usarse el anticuerpo frente a KOC1 o KIF11, o GHSR1b o NTSR1, o NMU como anticuerpo primario que va a detectarse con un anticuerpo secundario que está marcado con una sustancia de marcado. Además, el anticuerpo unido a la proteína en la selección de la presente descripción puede detectarse o medirse usando una columna de proteína G o proteína A.

Alternativamente, en otra realización del método de selección dado a conocer en la presente memoria, puede usarse un sistema de dos híbridos que utiliza células (“sistema de dos híbridos MATCHMAKER”, “kit de ensayo de dos híbridos MATCHMAKER de mamífero”, “sistema de un solo híbrido MATCHMAKER” (Clontech); “sistema de vector de dos híbridos HybriZAP” (Stratagene); las referencias “Dalton y Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields y Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).

En el sistema de dos híbridos, por ejemplo, el polipéptido de KOC1 se fusiona a la región de unión a SRF o la región de unión a GAL4 y se expresa en células de levadura. El polipéptido de KIF11 que se une al polipéptido de KOC1 se fusiona con la región de activación transcripcional VP16 o GAL4 y también se expresa en las células de levadura en la existencia de un compuesto de prueba. Alternativamente, puede fusionarse polipéptido de KIF11 con la región de unión a SRF o la región de unión a GAL4, y el polipéptido de KOC1 con la región de activación transcripcional de VP16 o GAL4. Cuando se usa la combinación de GHSR1b o NTSR1 y NMU en el sistema de dos híbridos, por ejemplo, el polipéptido de GHSR1b o NTSR1 se fusiona con la región de unión a SRF o la región de unión a GAL4 y se expresa en células de levadura. El polipéptido de NMU que se une al polipéptido de GHSR1b o NTSR1 se fusiona con la región de activación transcripcional de VP16 o GAL4 y también se expresa en las células de levadura en la existencia de un compuesto de prueba. Alternativamente, puede fusionarse polipéptido de NMU con la región de unión a SRF o la región de unión a GAL4, y el polipéptido de GHSR1b o NTSR1 con la región de activación transcripcional de VP16 o GAL4. Cuando el compuesto de prueba no inhibe la unión entre KOC1 y KIF11, o GHSR1b o NTSR1 y NMU, la unión de los dos activa un gen indicador, haciendo que los clones positivos sean detectables.

Como gen indicador puede usarse, por ejemplo, gen Ade2, gen lacZ, gen CAT, gen luciferasa y similares además del gen HIS3.

Además, cuando se usa la combinación de GHSR1b o NTSR1 y NMU en el método de selección, puesto que GHSR1b y NTSR1 son polipéptidos que se expresan de manera natural en la superficie celular, en una realización preferida del presente método de selección, los polipéptidos se expresan en la superficie de una célula viva. Cuando los polipéptidos se expresan en la superficie de una célula viva, la unión entre el polipéptido y NMU puede detectarse mediante métodos de detección de la señalización autocrina y paracrina que conduce a la estimulación del crecimiento de células tumorales (Heasley, Oncogene 20: 1563-1569 (2001)). Por ejemplo, la unión entre el polipéptido de GHSR1 o NTSR1 y NMU pude detectarse mediante:

(1)

detección de la concentración de calcio o AMPc en la célula (por ejemplo ensayo FLIPR, Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 435-438, 2000; Nature 406: 70-74, 2000; J. Biol. Chem. 275:21068-21074, 2000);

(2)

detección de la activación del polipéptido;

(3)

detección de la interacción entre el polipéptido y la proteína G (por ejemplo ensayo FLIPR, Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 435-438, 2000; Nature 406: 70-74, 2000; J. Biol. Chem. 275:21068-21074, 2000, o ensayo de unión con péptido marcado con 125I);

(4)

detección de la activación de fosfolipasa C o su ruta situada secuencia abajo (Oncogene 20:1563-1569, 2001);

(5)

detección de la activación de cinasas de la cascada de proteína cinasa, tales como Raf, MEK, ERKs, y proteína cinasa D (PKD) (Oncogene 20:1563-1569, 2001);

(6)

detección de la activación de un miembro de la familia Src/Tec/Bmx de tirosina cinasas (Oncogene 20:1563-1569, 2001);

(7)

detección de la activación de un miembro de la familia Ras y Rho, regulación de un miembro de los miembros JNK de las familias MAP, o la reorganización del citoesqueleto de actina (Oncogene 20:1563-1569, 2001);

(8)

detección de la activación de cualquier complejo de señal mediado por la activación del polipéptido;

(9)

detección del cambio en la localización subcelular del polipéptido incluyendo la endocitosis/internalización inducida por ligando del (J Cell Sci., 113: 2963-2975, 2000; J Histochem. Cytochem. 48:1553-1563, 2000; Endocrinology Octubre 23, 2003. as doi: 10. 1210/en. 2003-0974);

(10)

detección de la activación de cualquier factor de transcripción situado secuencia abajo de los polipéptidos o la activación de su gen situado secuencia abajo; y

(11)

detección de la proliferación, transformación celular o cualquier otro fenotipo oncogénico de la célula.

Puede usarse cualquier compuesto de prueba, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de fermentación de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos vegetales, proteínas purificadas o brutas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos micromoleculares sintéticos y compuestos naturales, en los métodos de selección de la presente descripción. El compuesto de prueba dado a conocer en la presente memoria también puede obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo (1) bibliotecas biológicas, (2) bibliotecas en fase de disolución o fase sólida paralelas dirigibles espacialmente, (3) métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución, (4) el método de biblioteca de “un compuesto por soporte” y (5) métodos de biblioteca sintética que usa selección por cromatografía de afinidad. Los métodos de biblioteca biológica que usan la selección por cromatografía de afinidad se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que los otro cuatro enfoques puede aplicarse a bibliotecas de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas de compuestos (Lam, Anticancer DrugDes. 12: 145 (1997)). Pueden encontrarse en la técnica ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares (DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 (1994); Cho et al., Science 261: 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 (1994); Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994)). Pueden presentarse bibliotecas de compuestos en disolución (véase Houghten, Bio/Techniques 13: 412 (1992)) o en perlas (Lam, Nature 354: 82 (1991)), chips (Fodor, Nature 364: 555 (1993)), bacterias (patente estadounidense n.º 5.223.409), esporas (patente estadounidense n.º 5.571.698; 5.403.484, y 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865 (1992)) o fago (Scott y Smith, Science 249: 386 (1990); Delvin, Science 249: 404 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 (1990); Felici, J. MoI. Biol. 222: 301 (1991); solicitud de patente estadounidense 2002103360). El compuesto de prueba expuesto a una célula o proteína según los métodos de selección dados a conocer en la presente memoria puede ser un único compuesto o una combinación de compuestos. Cuando se usa una combinación de compuestos en los métodos de selección de la invención, los compuestos pueden ponerse en contacto secuencial o simultáneamente.

Un compuesto aislado mediante los métodos de selección dados a conocer en la presente memoria es un candidato para fármacos que inhiben la actividad de polipéptido de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, para tratar o prevenir enfermedades atribuidas a, por ejemplo, enfermedades de proliferación celular, tales como NSCLC. Un compuesto en el que una parte de la estructura del compuesto obtenido mediante los presentes métodos de selección dados a conocer en la presente memoria se transforma mediante adición, deleción y/o sustitución, se incluye en los compuestos obtenidos mediante los métodos de selección dados a conocer en la presente memoria. Un compuesto eficaz para suprimir la expresión de genes sobreexpresados, es decir, el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, se considera que tiene un beneficio clínico y puede someterse a prueba adicionalmente para determinar su capacidad para prevenir el crecimiento de células de cáncer en modelos de animal o sujetos de prueba.

Selección de un agente terapéutico para tratar y/o prevenir NSCLC que es apropiado para un individuo particular

Las diferencias en la composición genética de individuos pueden dar como resultado diferencias en sus capacidades relativas de metabolizar diversos fármacos. Un compuesto que se metaboliza en un sujeto para actuar como agente anti-NSCLC puede manifestarse por si mismo induciendo un cambio en el patrón de expresión génica en las células del sujeto desde esa característica de un estado canceroso hasta una característica de patrón de expresión génica de un estado no canceroso. Por consiguiente, los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 expresados de manera diferencial dados a conocer en la presente memoria permiten la selección de un supuesto inhibidor terapéutico o profiláctico de NSCLC de manera específicamente adecuada para un sujeto sometiendo a prueba compuestos candidatos en una célula de prueba (o población de células de prueba) derivada del sujeto seleccionado.

Para identificar un agente anti-NSCLC, que es apropiado para un sujeto específico, se expone una célula de prueba o población de células de prueba derivada del sujeto a un agente terapéutico y se determina la expresión de uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1.

La célula de prueba es o la población de células de prueba contiene una célula de NSCLC que expresa un gen asociado a NSCLC. Preferiblemente, la célula de prueba es o la población de células de prueba contiene un célula de pulmón. Por ejemplo, la célula de prueba o población de células de prueba se incuba en presencia de un agente candidato y se mide el patrón de expresión génica de la célula de prueba o población de células y se compara con uno o más perfiles de referencia, por ejemplo, un perfil de expresión de referencia de NSCLC o un perfil de expresión de referencia no de NSCLC.

Una disminución de la expresión de uno o más de KIF11, GHSR1b, NTSR1, y FOXM1 en una célula de prueba o población de células de prueba con respecto a una población de células de referencia que contiene NSCLC es indicativo de que el agente es terapéutico.

El agente de prueba puede ser cualquier compuesto o composición. Por ejemplo, el agente de prueba es un agente inmunomodulador.

Métodos para tratar o prevenir NSCLC

La presente descripción proporciona un método para tratar, mitigar o prevenir NSCLC en un sujeto. Se administran compuestos terapéuticos profiláctica o terapéuticamente a sujetos que padecen o están en riesgo de (o son susceptibles de) desarrollar NSCLC. Tales sujetos se identifican usando métodos clínicos convencionales o detectando un nivel aberrante de expresión o actividad de gen o polipéptido KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. La administración profiláctica se produce antes de la manifestación síntomas clínicos patentes de la enfermedad, de manera que se previene o alternativamente se retrasa la evolución de una enfermedad o trastorno.

El método incluye disminuir la expresión o función, o ambas, de uno o más productos génicos de genes cuya expresión aumenta de manera aberrante (“gen sobreexpresado”; gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1) en una célula de NSCLC con respecto a células normales del mismo tipo de tejido del que se derivan las células de NSCLC. La expresión puede inhibirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un sujeto puede tratarse con una cantidad eficaz de un compuesto que reduce la cantidad de uno o más de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en el sujeto. La administración del compuesto puede ser sistémica o local. Tales compuestos terapéuticos incluyen compuestos que reducen el nivel de expresión de tal gen que existe de manera endógena en las células de NSCLC (es decir, compuestos que regulan por disminución la expresión del(de los) gen(es) sobreexpresado(s), genes KIF11, GHSR1b y/o NTSR1). La administración de tales compuestos terapéuticos contrarresta los efectos de gen(es) sobreexpresado(s) de manera aberrante en las células de NSCLC de un sujeto y se espera que mejore el estado clínico del sujeto. Tales compuestos pueden obtenerse mediante el método de selección de la presente descripción descrito anteriormente.

Los compuestos que modulan la actividad de una proteína codificada por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 que puede usarse para tratar o prevenir NSCLC de la presente descripción incluyen además de proteínas, ligando cognado que se produce de manera natural de estas proteínas, péptidos, peptidomiméticos y otras moléculas pequeñas.

Alternativamente, la expresión de este(estos) gen(es) sobreexpresado(s) (KIF11, GHSR1b, NTSR1 y/o FOXM1) puede inhibirse mediante la administración al sujeto de un ácido nucleico que inhibe o antagoniza la expresión del(de los) gen(es) sobreexpresado(s). Pueden usarse oligonucleótidos antisentido, ARNsi o ribozimas que interrumpen la expresión del(de los) gen(es) sobreexpresado(s) para inhibir la expresión del(de los) gen(es) sobreexpresado(s).

Tal como se indicó anteriormente, pueden usarse oligonucleótidos antisentido que corresponden a cualquier secuencia de nucleótidos del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 para reducir el nivel de expresión del gene. Los oligonucleótidos antisentido que corresponden a genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 que se regulan por incremento en NSCLC son útiles para el tratamiento o prevención de NSCLC. Específicamente, los oligonucleótidos antisentido frente a los genes pueden actuar uniéndose a cualquiera de los correspondientes polipéptidos codificados por esos genes, o ARNm correspondientes a los mismos, inhibiendo de ese modo la transcripción o traducción de los genes, promoviendo la degradación de los ARNm y/o inhibiendo la expresión de proteínas codificadas por los nucleótidos KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1, y finalmente inhibiendo la función de las proteínas. El término “oligonucleótidos antisentido” tal como se usa en la presente memoria engloba ambos nucleótidos que son completamente complementarios a la secuencia diana y aquéllos que tienen un apareamiento erróneo de uno o más nucleótidos, siempre que los oligonucleótidos antisentido puedan hibridar específicamente con la secuencia diana. Por ejemplo, loa oligonucleótidos antisentido dados a conocer en la presente memoria incluyen polinucleótidos que tienen una homología (también denominada como identidad de secuencia) de al menos 70% o superior, preferiblemente en 80% o superior, más preferiblemente 90% o superior, incluso más preferiblemente 95% o superior a lo largo de un intervalo de al menos 15 nucleótidos contiguos hasta la secuencia de longitud completa de cualquiera de las secuencias de nucleótido del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Pueden usarse algoritmos conocidos en la técnica para determinar la homología. Además, también pueden usarse derivados o productos modificados de los oligonucleótidos antisentido como oligonucleótidos antisentido dados a conocer en la presente memoria. Los ejemplos de tales productos modificados incluyen modificaciones de fosfonato de alquilo inferior tales como de tipo de fosfonato de metilo o de tipo fosfonato de etilo, modificaciones de fosforotioato y modificaciones de fosforoamidato.

También pueden definirse moléculas de ARNsi de la descripción mediante su capacidad para hibridar específicamente con ARNm o ADNc de los genes dados a conocer en la presente memoria. Para los fines de esta descripción, los términos “hibridar” o “hibridar específicamente” se usan para referirse a la capacidad de dos moléculas de ácido nucleico de hibridar en “condiciones de hibridación rigurosas”. La expresión “condiciones de hibridación rigurosas” se refiere a condiciones en las que una molécula de ácido nucleico hibridará con su secuencia diana, normalmente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no de manera detectable para otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas superiores. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente de 5-10ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (en fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (cuando las secuencias diana estén presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación específica

o selectiva, una señal positiva es al menos dos veces una hibridación de fondo, preferiblemente 10 veces una hibridación de fondo. Condiciones rigurosas de hibridación a modo de ejemplo pueden ser las siguientes: 50% de formamida, 5x SSC, y 1% de SDS, incubar a 42ºC, o, 5x SSC, 1% de SDS, incubar a 65ºC, con lavado en 0,2x SSC, y 0,1% de SDS a 50ºC. Los oligonucleótidos antisentido y derivados de los mismos actúan en células que producen las proteínas codificadas por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 uniéndose al ADN o ARNm que codifica para la proteína, inhibiendo la transcripción o traducción de los mismos, promoviendo la degradación de los ARNm e inhibiendo la expresión de la proteína, dando como resultado de ese modo la inhibición de la función de proteína.

Un oligonucleótido antisentido y derivados del mismo pueden prepararse en una preparación externa, tal como un linimento o un cataplasma, mezclando con un material de base adecuado que es inactivo frente al derivado.

Los oligonucleótidos antisentido dados a conocer en la presente memoria inhiben la expresión de al menos una proteína codificada por uno cualquiera de los genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1, y de ese modo son útiles para suprimir la actividad biológica de la proteína.

Los polinucleótidos que inhiben uno o más productos génicos de genes sobreexpresados también incluyen ARN de interferencia pequeños (ARNsi) que comprenden una combinación de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína sobreexpresada codificada por el gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. El término “ARNsi” se refiere a una molécula de ARN bicatenaria que evita la traducción de un ARNm diana. Pueden usarse técnicas convencionales para introducir ARNsi en la célula en el tratamiento o la prevención dados a conocer en la presente memoria incluyendo aquéllos en los que ADN es un molde a partir del cual se transcribe ARN.

El ARNsi se construye de manera que un único transcrito tiene tanto las secuencias sentido como la antisentido complementaria del gen diana, por ejemplo, una horquilla.

El método se usa para suprimir la expresión génica de una célula con expresión regulada por incremento del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. La unión de ARNsi con el transcrito de gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en la célula diana da como resultado una reducción de la producción de proteína KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 por la célula. La longitud del oligonucleótido es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos y puede ser tan larga como el transcrito que se produce de manera natural. Preferiblemente, el oligonucleótido es de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, el oligonucleótido es inferior a aproximadamente 75, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. Los ARNsi preferibles de la presente descripción incluyen los polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 32, 33, 34, 35, 36, 37 ó 108 como secuencia diana, que demostraron todos ser eficaces para suprimir la viabilidad celular de las líneas de células de NSCLC. Específicamente, un ARNsi preferible usado en la presente descripción tiene la fórmula general:

5'-[A]-[B]-[A']-3'

en la que [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de KIF11, GHSR1b, NTSR1

o FOXM1; [B] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en de aproximadamente 3 a aproximadamente 23 nucleótidos; y [A'] es una secuencia de ribonucleótidos complementaria a [A]. en la presente memoria, la expresión “secuencia diana de gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1” se refiere a una secuencia que, cuando se introduce en líneas de células de NSCLC, es eficaz para suprimir la viabilidad celular. La secuencia diana preferida del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 incluye las secuencias de nucleótidos que comprenden: SEC ID Nº: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y

108. La secuencia complementaria [A'] y [A] hibridan una con otra para formar una doble cadena, y toda la molécula de ARNsi con la fórmula general 5 '-[A]-[B]-[A']-3 ' forma una estructura de bucle en horquilla. Tal como se usa en la presente memoria, el término “complementaria” se refiere a un apareamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleótidos de un polinucleótido, y la hibridación o unión de unidades de nucleótidos indica la interacción física o química entre las unidades en condiciones apropiadas para formar un dúplex estable (configuración bicatenaria) que contiene pocos o ningún apareamiento erróneo. En una realización preferida, tales dúplex contienen no más de 1 apareamiento erróneo por cada 10 pares de bases. Los dúplex particularmente preferidos son completamente complementarios y no contienen apareamientos erróneos. El ARNsi frente al ARNm del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 que va a usarse en la presente descripción contiene una secuencia diana más corta que el ARNm completo del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, y tiene una secuencia de 500, 200 o 75 nucleótidos como longitud completa. También se da a conocer en la presente memoria un vector que contiene uno o más de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, y una célula que contiene los vectores. Los ácidos nucleicos aislados de la presente descripción son útiles para ARNsi frente a KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 o DNA que codifica para el ARNsi. Cuando se usan los ácidos nucleicos para ARNsi o codifican para el ADN de los mismos, la cadena sentido es preferiblemente más larga de aproximadamente 19 nucleótidos, y más preferiblemente más larga de aproximadamente 21 nucleótidos.

Además, la secuencia de nucleótidos de los ARNsi puede diseñarse usando un programa informático de diseño de ARNsi disponible del sitio web de Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Las secuencias de nucleótidos para el ARNsi se seleccionan mediante el programa informático basándose en el siguiente protocolo:

Selección de sitios diana de ARNsi:

1.

Comenzar con el codón de iniciación AUG del transcrito, realizar un barrido para obtener secuencias de dinucleótidos AA. Registrar la aparición de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en el sentido de 3' como posibles sitios diana de ARNsi. Tuschl, et al. Genes Dev 13(24): 3191-7 (1999), no recomiendan diseñar frente a ARNsi frente a las regiones no traducidas en el sentido de 5' y 3' (UTR) y regiones próximas al codón de iniciación (en el intervalo de 75 bases) ya que éstas pueden ser más ricas en sitios de unión a proteína reguladora, y de ese modo el complejo de endonucleasa y ARNsi que se diseñaron frente a estas regiones puede interferir con la unión de proteínas de unión a UTR y/o complejos de iniciación de la traducción.

2.

Comparar los posibles sitios diana con la base de datos del genoma humano y no considerar ninguna secuencia diana con homología significativa con otras secuencias codificantes. La búsqueda de la homología puede realizarse usando BLAST, que puede encontrarse en el servidor de NCBI en: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

3.

Seleccionar secuencias diana de cualificación para la síntesis. En el sitio web de Ambion, pueden seleccionarse varias secuencias diana preferibles a lo largo de la longitud del gen para la evaluación.

Los ARNsi inhiben la expresión de la proteína sobreexpresada KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y es de ese modo útil para suprimir la actividad biológica de la proteína. Por tanto, una composición que comprende el ARNsi es útil para tratar o prevenir cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Los ácidos nucleicos que inhiben uno o más productos génicos de genes sobreexpresados KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 también incluyen ribozimas frente al(a los ) gen(es).

Los ribozimas inhiben la expresión de la proteína sobreexpresada KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y son de ese modo útiles para suprimir la actividad biológica de la proteína. Por tanto, una composición que comprende el ribozima es útil para tratar o prevenir NSCLC.

Generalmente, los ribozimas se clasifican en ribozimas grandes y ribozimas pequeños. Un ribozima grande se conoce cono una enzima que escinde el enlace éster de fosfato de ácidos nucleicos. Tras la reacción con el ribozima grande, el sitio que ha reaccionado consiste en un grupo 5'-fosfato y 3'-hidroxilo. El ribozima grande se clasifica además en (1) ARN de intrón de grupo I que cataliza la transesterificación en el sitio de corte y empalme en 5' mediante guanosina; (2) ARN de intrón de grupo II que cataliza el autocorte y empalme a través de una reacción de dos etapas por medio de una estructura en lazo lariat; y componente de ARN de la ribonucleasa P que escinde el precursor de ARNt en el sitio de 5' a través de la hidrólisis. Por otra parte, los ribozimas pequeños tienen un tamaño más pequeño (aproximadamente 40 pb) en comparación con los ribozimas grandes y escinden ARN para generar un grupo 5'-hidroxilo y un 2'-3'-fosfato cíclico. Los ribozimas de tipo cabeza de martillo (Koizumi et al., FEBS Lett. 228: 225 (1988)) y ribozimas de tipo horquilla (Buzayan, Nature 323: 349 (1986); Kikuchi y Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751 (1992)) se incluyen en los ribozimas pequeños. Se conocen en la técnica métodos para diseñar y construir ribozimas (véase Koizumi et al., FEBS Lett. 228: 225 (1988); Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17: 7059 (1989); Kikuchi y Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751 (1992)) y pueden construirse ribozimas que inhiben la expresión de una proteína sobreexpresada NSC basándose en la información de secuencia de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 según métodos convencionales para producir ribozimas.

Los ribozimas inhiben la expresión de proteína sobreexpresada KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y son de ese modo útiles para suprimir la actividad biológica de la proteína. Por tanto, una composición que comprende el ribozima es útil para tratar o prevenir NSCLC.

Alternativamente, la función de uno o más productos génicos de los genes sobreexpresados se inhibe administrando un compuesto que se une a o de otro modo inhibe la función de los productos génicos. Por ejemplo, el compuesto es un anticuerpo que se une al producto génicos o a los productos génicos sobreexpresados.

La presente descripción se refiere al uso de anticuerpos, particularmente anticuerpos frente a una proteína codificada por cualquiera de los genes regulados por incremento KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o un fragmento del anticuerpo. Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina que tiene una estructura específica que interacciona (se une) específicamente con una molécula que comprende el antígeno usado para sintetizar el anticuerpo (es decir, el producto génico regulado por incremento) o con un antígeno relacionado de manera próxima con el mismo. Un anticuerpo que se une con el nucleótido sobreexpresado KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 puede estar en cualquier forma, tal como anticuerpos monoclonales o policlonales, e incluye antisuero obtenido mediante la inmunización de un animal tal como un conejo con el polipéptido, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética. Además, el anticuerpo usado en el método para tratar o prevenir NSCLC dado a conocer en la presente memoria puede ser un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo modificado, siempre que se una a una o más de las proteínas codificadas por los genes marcadores (gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 gene). Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo usados en el presente método para tratar o prevenir NSCLC pueden modificarse, e incluyen anticuerpos quiméricos y modificados químicamente. Tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse según los métodos mencionados anteriormente, anteriormente.

Cuando el anticuerpo obtenido va a administrarse al organismo humano (tratamiento con anticuerpos), un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado es preferible para reducir la inmunogenicidad.

Por ejemplo, pueden inmunizarse animales transgénicos que tienen un repertorio de genes de anticuerpo humanos con un antígeno tal como polipéptido KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, células que expresan el polipéptido, o sus lisados. Entonces se recogen las células que producen anticuerpos de los animales y se fusionan con células de mieloma para obtener un hibridoma, del cual pueden prepararse anticuerpos humanos frente al polipéptido (véanse los documentos WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, WO96-33735 y WO96-34096).

Alternativamente, una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos, puede inmortalizarse mediante un oncogén y usarse para preparar anticuerpos monoclonales.

Al presente descripción proporciona un método para tratar o prevenir NSCLC, usando un anticuerpo frente a un polipéptido sobreexpresado KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Según el método, se administra una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo frente al polipéptido KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Se administra un anticuerpo frente a un polipéptido sobreexpresado KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 en una dosificación suficiente para reducir la actividad de la proteína KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo que se une a un marcador de superficie celular específico para células tumorales como herramienta para la administración de fármacos. De ese modo, por ejemplo, puede administrarse un anticuerpo frente a un polipéptido sobreexpresado KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 conjugado con un agente citotóxico en una dosificación suficiente para dañar células tumorales.

Además, pueden usarse mutantes negativos dominantes de las proteínas dados a conocer en la presente memoria para tratar o prevenir NSCLC. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos de KOC1 que se unen específicamente a KIF11. Tal como se usa en la presente memoria “fragmento negativo dominante de KOC1” es una forma mutada de KOC1 que puede formar un complejo con cualquiera de KIF11 y ARN que va a transportarse de manera que disminuye la actividad de transportador de ARN del complejo. De ese modo, un fragmento negativo dominante es uno que no es equivalente funcional al polipéptido KOC1 de longitud completa. Los fragmentos negativos dominantes preferidos son aquéllos que comprenden al menos un dominio RRM de KOC1. Alternativamente, en otra realización, los fragmentos negativos dominantes tienen dos dominios RRM y de cero a tres dominios KH. Por ejemplo, KOC1DEL2 (2x RRM + 2x KH) y KOC1DEL3 (2x RRM sin KH) son fragmentos preferibles para el efectos negativo dominante. Las secuencias de aminoácidos de KOC1DEL2 y KOC1DEL3 consisten en positions de 1 a 406 y 1-197 de SEC ID Nº: 105, respectivamente. Los fragmentos son normalmente inferiores a aproximadamente 300 aminoácidos, normalmente inferiores a aproximadamente 200 aminoácidos.

La presente descripción se refiere también a un método para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una vacuna que comprende un polipéptido codificado por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 o un fragmento inmunológicamente activo de dicho polipéptido, o un polinucleótido que codifica para el polipéptido o el fragmento del mismo. La administración del polipéptido induce una inmunidad antitumoral en un sujeto. De ese modo, la presente descripción proporciona un método para inducir inmunidad antitumoral. El polipéptido o los fragmentos inmunológicamente activos del mismo son útiles como vacunas contra el NSCLC. En algunos casos las proteínas o fragmentos de las mismas pueden administrarse en forma unida al receptor de células T (TCR) o presentada en una células presentadora de antígenos (APC), tal como un macrófago, células dendrítica (DC) o células B. Debido a la fuerte capacidad de presentación de antígenos de DC, el uso de DC es el más preferible entre las APC.

En la presente descripción, la expresión “vacuna contra el NSCLC” se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad antitumoral o inmunidad para suprimir NSCLC tras la inoculación en animales. En general, la inmunidad antitumoral induce respuestas inmunitarias tales como las siguientes:

-

inducción de linfocitos citotóxicos contra tumores,

-

inducción de anticuerpos que reconocen tumores, e

-

inducción de producción de citocinas antitumorales.

Por tanto, cuando una determinada proteína induce una cualquiera de estas respuestas inmunitarias tras la inoculación en un animal, se decide que la proteína tiene efecto que induce inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral mediante una proteína puede detectarse observando in vivo o in vitro la respuesta del sistema inmunitario en el huésped contra la proteína.

Por ejemplo, se conoce bien un método para detectar la inducción de linfocitos T citotóxicos. Una sustancia foránea que se introduce en el organismo vivo se presenta a células T y células B mediante la acción de células presentadoras de antígenos (APC). Las células T que responden frente al antígeno presentado por APC de manera específica de antígeno se diferencian en células T citotóxicas (o linfocitos T citotóxicos; CTL) debido a la estimulación por el antígeno y entonces proliferan (esto se denomina activación de células T).

Por tanto, puede evaluarse la inducción de CTL mediante un determinado péptido presentando el péptido a célula T mediante APC, y detectando la inducción de CTL. Además, APC tiene el efecto de activar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos y células NK. Puesto que las células T CD4+ son también importantes en la inmunidad antitumoral, puede evaluarse la acción de inducción de inmunidad antitumoral del péptido usando el efecto de activación de estas células como indicadores.

Se conoce bien en la técnica un método para evaluar la acción de inducción de CTL usando células dendríticas (DC) como APC. DC es una APC representativa que tiene la acción de inducción de CTL más fuerte entre las APC. En este método, el polipéptido de prueba se pone en contacto inicialmente con DC y entonces esta DC se pone en contacto con células T. La detección de células T que tienen efectos citotóxicos contra las células de interés tras el contacto con DC muestra que el polipéptido de prueba tiene una actividad de inducción de las células T citotóxicas. Puede detectarse la actividad de CTL contra tumores, por ejemplo, usando la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr como indicador. Alternativamente, también se conoce bien el método para evaluar el grado de daño de células tumorales usando la actividad de captación de 3H-timidina o liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador.

Aparte de DC, también pueden usarse células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como APC. Se notifica que la inducción de CTL va a potenciarse mediante el cultivo de PBMC en presencia de GM-CSF e IL-4. De manera similar, se muestra que CTL va inducirse mediante el cultivo de PBMC en presencia de hemocianina de lapa californiana (KLH) e IL-7.

Los polipéptidos de prueba que se confirma que tienen actividad de inducción de CTL mediante estos métodos son polipéptidos que tienen efecto de activación de DC y actividad de inducción de CTL posterior. Por tanto, los polipéptidos que inducen CTL contra células tumorales son útiles como vacunas contra el NSCLC. Además, las APC que adquieren la capacidad de inducir CTL contra el NSCLC poniéndose en contacto con los polipéptidos son útiles como vacunas contra el NSCLC. Además, también pueden usarse CTL que adquieren citotoxicidad debido a la presentación de los antígenos polipeptídicos mediante APC como vacunas contra el NSCLC. Tales métodos terapéuticos para NSCLC que usan la inmunidad antitumoral debido a APC y CTL se denominan inmunoterapia celular.

Generalmente, cuando se usa un polipéptido para la inmunoterapia celular, se sabe que la eficacia de la inducción de CTL aumenta combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen estructuras diferentes y poniéndolos en contacto con DC. Por tanto, cuando se estimula DC con fragmentos de proteína, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.

Alternativamente, la inducción de la inmunidad antitumoral mediante un polipéptido puede confirmarse observando la inducción de producción de anticuerpos frente a tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos frente a un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando se suprime el crecimiento, la proliferación o la metástasis de las células tumorales mediante esos anticuerpos, puede determinarse que el polipéptido tiene una capacidad de inducir inmunidad antitumoral.

Se induce inmunidad antitumoral administrando la vacuna dada a conocer en la presente memoria y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y la prevención de NSCLC. La terapia contra o la prevención de la aparición de NSCLC incluye cualquiera de las etapas, tales como inhibición del crecimiento de células de NSCLC, involución de células de NSCLC y supresión de la aparición de células de NSCLC. La disminución de la mortalidad de individuos que tienen NSCLC, disminución de genes marcadores (además de genes KIF11, GHSR1b y/o NTSR1) en sangre, mitigación de síntomas detectables que acompañan al NSCLC y similares también se incluyen en la terapia o prevención de NSCLC. Tales efectos terapéuticos y preventivos son de manera preferible estadísticamente significativos. Por ejemplo, en observación, en un nivel de significancia de 5% o menos, en el que el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra el NSCLC se compara con una administración control sin vacuna. Por ejemplo, pueden usarse para los análisis estadísticos la prueba de t de Student, la prueba de U de Mann-Whitney o ANOVA.

La proteína mencionada anteriormente que tiene actividad inmunológica, o un polinucleótido o vector que codifica para la proteína puede combinarse con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria frente a la proteína cuando se administrad junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes incluyen toxina del cólera, toxina de salmonella, alumbre y similares, per no se limitan a los mismos. Además, la vacuna dada a conocer en la presente memoria puede combinarse de manera apropiada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua esterilizada, solución salina fisiológica, tampón fosfato, líquido de cultivo y similares. Además, la vacuna puede contener en caso necesario, estabilizadores, agentes de suspensión, conservantes y similares. La vacuna se administra sistémica o localmente. Puede realizarse la administración de vacunas mediante administración única o reforzarse mediante múltiples administraciones.

Cuando se usa APC o CTL como vacuna dada a conocer en la presente memoria, puede tratarse o prevenirse NSCLC, por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recogen las PBMC del sujeto que recibe tratamiento

o prevención, se ponen en contacto las células con el polipéptido ex vivo, y tras la inducción de APC o CTL, pueden administrarse las células al sujeto. También pueden inducirse APC introduciendo un vector que codifica para el polipéptido en las PBMC ex vivo. Las APC o CTL inducidas in vitro pueden clonarse antes de la administración. Mediante la clonación y crecimiento de células que tienen alta actividad de daño de células diana, puede realizarse de manera más eficaz la inmunoterapia celular. Además, las APC y CTL aisladas de esta manera pueden usarse para inmunoterapia celular no sólo contra los individuos de los que se derivan las células sino también contra tipos similares de enfermedades en otros individuos.

Además, la presente descripción proporciona un método para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto, en el que un compuesto obtenido según cualquiera de los métodos de selección descritos anteriormente se administra al sujeto. Cualquier compuesto que se obtiene según cualquiera de los métodos de selección dados a conocer en la presente memoria puede administrarse al sujeto siempre que reduzca la expresión o función, o ambas, de uno o más productos génicos de genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1.

ARNsi y vectores que codifican para los mismos

La transfección de vectores que expresan ARNsi para KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 conduce a la inhibición del crecimiento de células de NSCLC. De ese modo, es otro aspecto de la presente descripción proporcionar una molécula bicatenaria que comprende una cadena sentido y cadena antisentido, molécula que actúa como ARNsi para KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 y un vector que codifica para la molécula bicatenaria.

La molécula bicatenaria dada a conocer en la presente memoria comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en la que la cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, y en la que la cadena antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es complementaria a dicha cadena sentido, hibridando dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido una con otra para formar dicha molécula bicatenaria, e inhibiendo dicha molécula bicatenaria la expresión de dicho gen cuando se introduce en una célula que expresa un gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1.

La molécula bicatenaria dada a conocer en la presente memoria puede ser un polinucleótido derivado de su entorno original (es decir, cuando es una molécula que se produce de manera natural, el entorno natural), modificada física o químicamente de su estado natural, o sintetizada químicamente. Según la presente descripción, tales moléculas bicatenarias incluyen aquéllas compuestas por ADN o ARN y derivados de los mismos. Un ADN está compuesto de manera adecuada por bases tales A, T, C y G, y se sustituye T por U en un ARN.

Tal como se describió anteriormente, el término “complementario” se refiere a un apareamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleótidos de un polinucleótido, y la hibridación o unión de unidades de nucleótidos indica la interacción física o química entre las unidades en condiciones apropiadas para formar un dúplex estable (configuración bicatenaria) que contiene pocos o ningún apareamiento erróneo. En una realización preferida, tales dúplex contienen no más de 1 apareamiento erróneo por cada 10 pares de bases. Los dúplex particularmente preferidos son completamente complementarios y no contienen ningún apareamiento erróneo.

La molécula bicatenaria dada a conocer en la presente memoria contiene una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a un secuencia diana de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 más corta que el ARN completo del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. En la presente memoria, la expresión “una secuencia diana del gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1” se refiere a una secuencia que, cuando se introduce en líneas de células de NSCLC, es eficaz para suprimir la viabilidad celular. Específicamente, la secuencia diana comprende al menos aproximadamente 10, o de manera adecuada de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo de SEC ID Nº: 1, 3, 5 y 106. Es decir, la cadena sentido de la presente molécula bicatenaria consiste en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, de manera adecuada más larga de 19 nucleótidos, y más preferiblemente más larga de 21 nucleótidos. Las secuencias diana preferidas incluyen las secuencias de SEC ID Nº: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 108. La presente molécula bicatenaria que incluye la cadena sentido y la cadena antisentido es un oligonucleótido más corto de aproximadamente 100, preferiblemente 75, más preferiblemente 50 y de la manera mas preferible 25 nucleótidos de longitud. Una molécula bicatenaria adecuada de la presente descripción es un oligonucleótido de una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos. Además, con el fin de potenciar la actividad de inhibición de los ARNsi, el nucleótido “u” puede añadirse al extremo en 3' de la cadena antisentido de la secuencia diana. El número de “u” que van a añadirse es al menos 2, generalmente de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 5. Los “u” añadidos forman una única cadena en el extremo en 3' de la cadena antisentido del ARNsi. En estas realizaciones, las moléculas de ARNsi de la descripción se modifican normalmente tal como se describió anteriormente para las moléculas antisentido. También son posibles otras modificaciones, por ejemplo, ARNsi conjugados con colesterol han mostrado propiedades farmacológicas mejoradas (Song et al. Nature Med. 9:347-351 (2003):).

Además, la molécula bicatenaria de la presente descripción puede ser un único transcrito de ribonucleótidos que comprende la cadena sentido y la cadena antisentido unidas por medio de una secuencia de ribonucleótidos monocatenaria. Concretamente, la presente molécula bicatenaria puede tener la fórmula general:

5'-[A]-[B]-[A']-3'

en la que [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de KIF11, GHSR1b, NTSR1

o FOXM1;

[B] es una secuencia de ribonucleótidos (secuencia de bucle) que consiste en de 3 a 23 nucleótidos; y

[A'] es una secuencia de ribonucleótidos complementara a [A]. la secuencia complementaria [A'] y [A] hibridan una con otra para formar una doble cadena y la molécula de ARNsi completa con la fórmula general 5'-[A]-[B]-[A']-3' forma una estructura de bucle en horquilla.

La región [A] hibrida con [A'], y entonces se forma un bucle que consiste en la región [B]. La secuencia de bucle puede seleccionarse de las descritas en http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html, o las descritas en Jacque, J. -M. et al., Nature 418 : 435-438 (2002). Los ejemplos adicionales de la secuencia de bucle que puede incluirse en las presentes moléculas bicatenarias incluyen:

CCC, CCACC o CCACACC: Jacque, J. M. et al., Nature, Vol. 418: 435-438 (2002);

UUCG: Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology 20:500-505 (2002); Fruscoloni, P. et al., Proc. Natl Acad. ScI USA 100(4): 1639-1644 (2003); y

UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M. et al.,. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467 (2002).

Los ARNsi preferibles que tienen estructura de bucle en horquilla dada a conocer en la presente memoria se muestran a continuación. En la siguiente estructura, la secuencia de bucle puede seleccionarse del grupo que consiste en: CCC,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

UUCG, CCACC, CCACACC y UUCAAGAGA. Entres estas secuencias, la secuencia de bucle más preferible es UUCAAGAGA (correspondiente a “ttcaagaga” en un ADN):

guuaguguac gaacuggag-[B]-cuccaguuc guacacuaac (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 32);

gugucucugu uggagaucu-[B]-agaucucca acagagacac (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 33);

gaaggcaguu gaccaacac-[B]-guguugguc aacugccuuc (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 34);

ccucuaccug uccagcaug-[B]-caugcugga cagguagagg (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 35);

guucaucagc gccaucugg-[B]-ccagauggc gcugaugaac (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 36);

ggucgucaua caggucaac-[B]-guugaccug uaugacgacc (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 37); y

gcagcagaaa cgaccgaau-[B]-auucggucg uuucugcugc (para la secuencia diana de SEC ID Nº: 108).

La presente descripción proporciona además un vector que codifica para la molécula bicatenaria dada a conocer en la presente memoria. El vector codifica para un transcrito que tiene una estructura secundaria y que comprende la cadena sentido y la cadena antisentido, y de manera adecuada comprende una secuencia de ribonucleótidos monocatenaria que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido. El vector comprende preferiblemente una secuencia reguladora adyacente a la región que codifica para la presente molécula bicatenaria que dirige la expresión de la molécula en una célula adecuada. Por ejemplo, las moléculas bicatenarias dadas a conocer en la presente memoria se transcriben de manera intercelular clonando su secuencia codificante en un vector que contiene, por ejemplo, una unidad de transcripción de ARN pol III del ARN nuclear pequeño (ARNsn) U6 o el promotor de ARN H1 humano.

Alternativamente, los presentes vectores se producen, por ejemplo, clonando la secuencia diana en un vector de expresión de modo que la secuencia objetivo se une operativamente a una secuencia reguladora del vector de una manera que permite la expresión del mismo (transcripción de la molécula de ADN) (Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology 20: 500-505 (2002)). Por ejemplo, la transcripción de una molécula de ARN que tiene una secuencia antisentido con respecto a la secuencia diana se conduce por un primer promotor (por ejemplo, una secuencia de promotor unida al extremo en 3' del ADN clonado) y la que tiene la cadena sentido con respecto a la secuencia diana por un segundo promotor (por ejemplo, una secuencia de promotor unida en el extremo en 5' del ADN clonado). Las cadenas sentido y antisentido expresadas hibridan entre sí in vivo para generar un constructo de ARNsi para silenciar un gen que comprende la secuencia diana. Además, pueden administrarse dos constructos (vectores) para producir respectivamente las cadenas sentido y antisentido de un constructo de ARNsi.

Para introducir los vectores en una célula puede usarse el agente que potencia la transfección. FuGENE (Rochediagnostices), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen) y Nucleofector (Wako pure Chemical) son útiles como agente que potencia la transfección.

Composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir NSCLC

La presente descripción proporciona composiciones para tratar o prevenir NSCLC que comprende un compuesto seleccionado mediante el presente método para seleccionar un compuesto que modifica la expresión o actividad de un gen asociado a NSCLC.

Cuando se administra un compuesto aislado mediante el método de selección dado a conocer en la presente memoria como compuesto farmacéutico para seres humanos y otros mamíferos, tales como ratones, ratas, cobaya, conejos, gatos, perros, oveja, cerdos, ganado, monos, papiones o chimpancés para tratar una enfermedad de proliferación celular (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), el compuesto aislado puede administrarse directamente o puede formularse en una forma farmacéutica usando métodos de preparación farmacéuticos convencionales. Tales formulaciones farmacéuticas de las presentes composiciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutánea y intravenosa), o para la administración mediante inhalación o insuflación. Las formulaciones están envasadas opcionalmente en unidades de dosificación individuales.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas, cápsulas en forma de sello o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo. Las formulaciones también incluyen polvos, gránulos, disoluciones, suspensiones o emulsiones. El principio activo se administra opcionalmente como bolo, electuario o pasta. Los comprimidos y las cápsulas para la administración oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, agentes de carga, lubricantes, disgregantes o agentes humectantes. Un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes de formulación. Los comprimidos sometidos a compresión pueden prepararse mediante la compresión en una máquina adecuada de los principios activos en forma de flujo libre tal como polvo o gránulos, opcionalmente se mezclan con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, agente de lubricación, tensioactivo o agente de dispersión. Pueden prepararse comprimidos moldeados moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse según métodos bien conocido en la técnica. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, disoluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes de emulsión, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservantes. Los comprimidos pueden formularse opcionalmente de modo que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo in vivo. Un envase de comprimidos puede contener un comprimido que va a tomarse cada mes. La formulación o dosis del fármaco en estas preparaciones hace que una dosificación adecuada pueda adquirirse dentro del intervalo indicado.

Las formulaciones para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que hace que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Alternativamente, las formulaciones pueden presentarse para infusión continua. Pueden prepararse suspensiones y disoluciones de inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

Las formulaciones para la administración rectal incluyen supositorios con vehículos convencionales tales como mantequilla de cacao o polietilenglicol. Las formulaciones para la administración tópica en la boca, por ejemplo, bucalmente o sublingual incluyen pastillas para chupar, que contienen el principio activo en una base aromatizada tal como sacarosa, goma acacia o tragacanto, y pastillas que comprenden el principio activo en una base tal como gelatina, glicerina, sacarosa o goma acacia. Para la administración intranasal de un principio activo, puede usarse una pulverización líquida o polvo dispersable o en forma de gotas. Las gotas pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes de dispersión, agentes de solubilización o agentes de suspensión.

Para la administración mediante inhalación, se administran las composiciones de manera conveniente a partir de un insuflador, nebulizador, envases presurizados u otros medios convenientes de administración de una pulverización de aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propulsor adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En case de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida.

Alternativamente, para la administración mediante inhalación o insuflación, las composiciones pueden tener la forma de una composición en polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvos de un principio activo y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosificación unitaria en, por ejemplo, cápsulas, cartuchos, gelatina o envases de blíster a partir de los que puede administrarse el polvo con la ayuda de un inhalador o insufladores.

Otras formulaciones incluyen dispositivos que pueden implantarse y parches adhesivos; que liberan un agente terapéutico.

Cuando se desee, las formulaciones descritas anteriormente, pueden emplearse adaptadas para ofrecer una liberación sostenida del principio activo. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros principios activos tales como agentes antimicrobianos, inmunosupresores o conservantes.

Debe entenderse que además de los componentes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta descripción pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, las adecuadas para la administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.

Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son las que contienen una dosis eficaz, tal como se menciona a continuación, del principio activo o una fracción apropiada del mismo.

Para cada uno de los estados mencionados anteriormente, las composiciones, por ejemplo, polipéptidos y compuestos orgánicos se administran por vía oral o mediante inyección en una dosis de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 250 mg/kg por día. El intervalo de dosis para seres humanos adultos es generalmente de desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 17,5 g/día, preferiblemente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 g/día, y de la manera más preferible de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g/día. Los comprimidos u otras formas de presentación de dosificación unitaria proporcionados en unidades individuales pueden contener de manera conveniente una cantidad que es eficaz en tal dosificación o como múltiplo de la misma, por ejemplo, unidades que contienen de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 500 mg, normalmente desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 500 mg.

La dosis empleada dependerá de varios factores, incluyendo la edad y el sexo del sujeto, el trastorno preciso que está tratándose y su gravedad. También puede variar la vía de administración dependiendo del estado y su gravedad.

La presente descripción proporciona además una composición para tratar o prevenir NSCLC que comprende un principio activo que inhibe la expresión de uno cualquiera de los genes seleccionados del grupo de genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1. Tal principio activo puede ser un oligonucleótido antisentido, ARNsi o ribozima frente al gen, o derivados, tales como vector de expresión del oligonucleótido antisentido, ARNsi o ribozima. El principio activo puede prepararse en una preparación externa, tal como un linimento o un cataplasma, mezclando con un material de base adecuado que es inactivo frente al derivados.

También puede formularse el principio activo en caso necesario, en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposoma, inyecciones, disoluciones, gotas nasales y agentes de liofilización añadiendo excipientes, agentes isotónicos, solubilizadores, conservantes, calmantes y similares. Éstos pueden prepararse según métodos convencionales para preparar compuestos farmacéuticos que contienen ácido nucleico.

Preferiblemente, el derivado de oligonucleótido antisentido, derivado de ARNsi o derivado de ribozima se administra al paciente mediante aplicación directa al sitio afectado o mediante inyección en un vaso sanguíneo de modo que alcance el sitio afección. También puede usarse un medio de montaje en la composición para aumentar la durabilidad y permeabilidad de membrana. Los ejemplos de medios de montaje incluyen liposoma, poli-L-lisina, lípido, colesterol, lipofectina y derivados de los mismos.

La dosificación tales composiciones puede ajustarse de manera adecuada según el estado del paciente y usarse en cantidades deseadas. Por ejemplo, puede administrarse un intervalo de dosis de 0,1 a 100 mg/kg, preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg.

Otra realización dada a conocer en la presente memoria es una composición para tratar o prevenir NSCLC que comprende un anticuerpo frente a un polipéptido codificado por uno cualquiera de los genes seleccionados del grupo de genes KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 o fragmentos del anticuerpo que se unen al polipéptido.

Aunque existen algunas diferencias según los síntomas, la dosis de un anticuerpo o fragmentos del mismo para tratar o prevenir NSCLC es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg por día, preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg por día y más preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 20 mg por día, cuando se administra por vía oral a un adulto normal (60 kg de peso).

Cuando se administra por vía parenteral, en forma de una inyección a un adulto normal (60 kg de peso), aunque existen algunas diferencias según el estado del paciente, los síntomas de la enfermedad y el método de administración, es conveniente para inyectar por vía intravenosa una dosis de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 30 mg por día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg por día y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg por día. También es posible, en el caso de animales también, administrar una cantidad reducida para 60 kg de peso corporal.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y ayudar a un experto a preparar y usar la misma. Los ejemplos no pretenden de ningún modo limitar de otro modo el alcance de la invención.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen métodos y materiales adecuados a continuación.

MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LOS MÉTODOS DADOS A CONOCER EN LA PRESENTE MEMORIA

Materiales y métodos

(1)

Pacientes y muestras de tejido

Se han obtenido muestras de NSCLC primario, de las cuales 22 se clasificaron como adenocarcinomas (ADC), 14 como carcinomas de células escamosas (SCC) y una como carcinoma adenoescamoso, anteriormente con consentimiento informado de 37 pacientes (Kikuchi, T. et al., Oncogene 22, 2192-2205 (2003)). Se obtuvieron quince NSCLC primarios adicionales, incluyendo siete ADC y ocho SCC, junto con muestras de tejido de pulmón normal adyacentes de pacientes que se sometieron a intervención quirúrgica en nuestros institutos.

(2)

Líneas celulares

las 30 líneas celulares de NSCLC humano y cuatro de SCLC usadas en este estudio fueron las siguientes: adenocarcinomas (ADC) A427, A549, NCI-H23, NCI-H522, LC174, LC176, LC319, PC3, PC9, PC14, PC14-PE6, NCIH1373, NCI-H1435, NCI-H1793, SK-LU-1, NCI-H358, NCI-H1650 y SW1573; carcinomas adenoescamosos (ASC) NCIH226, NCI-H596 y NCI-H647; carcinomas de células escamosas (SCC) RERF-LC-AI, SW-900, SK-MES-1, EBC-1, LU61, NCI-H520, NCI-H1703, y NCI-H2170; carcinoma de células grandes (LCC) LX1; y SCLC DMS114, DMS273, SBC-3 y SBC-5. Se hicieron crecer células epiteliales de vías respiratorias pequeñas humanas, SAEC, en medio optimizado (SAGM) adquirido de Cambrex Bio Science Inc. También se manejaron células BEAS2B, una línea celular epitelial bronquial humana. Se hicieron crecer treinta y cuatro líneas de células de cáncer de NSCLC o SCLC humanas y dos líneas de células del epitelio bronquial normal en monocapas en medio apropiado complementado con 5 o 10% de suero bobino fetal (véase la tabla 1).

Tabla 1

Nombre de línea celular Medio Proveedor

adenocarcinoma (ADC)

A427 EMEM(10% de FBS) ATCC(HTB-53) A549 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CCL-185) NCI-H23 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5800) NCI-H522 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5810) LC174 RPMI-1640(10% de FBS) Centro Aichi contra el

Cáncer LC176 RPMI-1640(10% de FBS) Centro Aichi contra el Cáncer LC319 RPMI-1640(10% de FBS) Centro Aichi contra el

Cáncer PC-3 DMEM(10% de FBS) Universidad de Tokushima PC-9 DMEM(10% de FBS) Universidad de Tokushima PC14 RPMI-1640(10% de FBS) Universidad de Tokushima PC14-PE6 RPMI-1640(10% de FBS) Universidad de Tokushima NCI-H1373 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5866) NCI-H1435 F12+DMEM(5% de FBS)+EGF(+) Banco SNU NCI-H1793 F12+DMEM(5% de FBS)+Glu Banco SNU SK-LU-1 DMEM(10% de FBS) Banco SNU BAC NCI-H358 RPMI-1640(10% de FBS) Banco SNU BAC NCI-H 1650 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5883) BAC SW1573 Leibovitz's L-15(10% de FBS) ATCC(CRL-2170)

Carcinoma adenoescamoso (ASC)

NCI-H226 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5826) NCI-H647 RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5834) NCI-H596 RPMI-1640(10% de FBS) Banco SNU

Carcinoma de células escamosas (SCC)

RERF-LC-AI DMEM(10% de FBS) Universidad de Tokushima

SW-900 Leibovitz's L-15(10% de FBS) Banco SNU SK-MES-1 DMEM(10% de FBS) Banco SNU 38

5

10

15

EBC-1

DMEM(10% de FBS) Universidad de Tokushima

LU61

DMEM(10% de FBS) Instituto Central de

Animales Experimentales

NCI-H520

RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(HTB-182)

NCI-H1703

RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-5889)

NCI-H2170

RPMI-1640(10% de FBS) ATCC8(CRL-5928)

Carcinoma de células grandes (LCC)

LX1

DMEM(10% de FBS) Instituto Central de

Animales Experimentales

Carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC)

DMS114

RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-2066)

DMS273

RPMI-1640(10% de FBS) Fundación Japonesa de

Investigación Contra el

Cáncer

SBC-3

RPMI-1640(10% de FBS) Universidad de Tokushima

SBC-5

EMEM(10% de FBS) Universidad de Tokushima

Células epiteliales de vías respiratorias pequeñas

SAEC

SAGM Cambrex Bio Science Inc.

Línea celular bronquial humana

BEAS2B

RPMI-1640(10% de FBS) ATCC(CRL-9609)

(3) Análisis de RT-PCR semicuantitativa Se extrajo ARN total de células cultivadas y tejidos clínicos usando reactivo Trizol (Life Technologies, Inc.) según el protocolo del fabricante. Se trataron los ARN extraídos y los ARN de poli(A) de tejido humano normal DNasa I (Nippon Gene) y se transcribieron de manera inversa usando cebador oligo(dT) y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen).

Se llevaron a cabo experimentos de RT-PCR semicuantitativa con los siguientes cebadores específicos de gen sintetizados o con cebadores específicos de beta-actina (ACTB) como control interno: KOC1, 5'-TAAATGGCTTCAGGAGACTTCAG-3' (SEQ.ID.NO.7) y 5'-GGTTTTAAATGCAGCTCCTATGTG-3' (SEQ.ID.NO.8); KIF11, 5'-CTGAACAGTGGGTATCTTCCTTA-3' (SEQ.ID.NO.9) y 5'-GATGGCTCTTGACTTAGAGGTTC-3' (SEQ.ID.NO.10); NMU, 5'-TGAAGAGATTCAGAGTGGACGA-3' (SEQ.ID.NO.11) y 5'-ACTGAGAACATTGACAACACAGG-3' (SEQ.ID.NO.12); NMU1R, 5'-AAGAGGGACAGGGACAAGTAGT-3' (SEQ.ID.NO.13) y 5'-ATGCCACTGTTACTGCTTCAG-3' (SEQ.ID.NO.14); NMU2R, 5'- GGCTCTTACAACTCATGTACCCA-3' (SEQ.ID.NO.15) y 5'-TGATACAGAGACATGAAGTGAGCA-3' (SEQ.ID.NO.16); GHSR1a, 5'-TGGTGTTTGCCTTCATCCT-3' (SEQ.ID.NO.17) y

5

10

15

20

25

30

35

40

5'-GAATCCCAGAAGTCTGAACA-3 ' (SEQ.ID.NO.18); GHSR1b, 5'-ACGGTCCTCTACAGTCTCA-3' (SEQ.ID.NO.19) y 5'-CACAGGGAGAGGATAGGA-3' (SEQ.ID.NO.20); NTSR1, 5'-AGTGGGCTCAGAGTCTAGCAAAT-3' (SEQ.ID.NO.21) y 5'-TATTGAGAGATACACGGGGTTTG-3' (SEQ.ID.NO.22); GHRL, 5'-TGAGCCCTGAACACCAGAGAG-3' (SEQ.ID.NO.23) y 5'-AAAGCCAGATGAGCGCTTCTA-3' (SEQ.ID.NO.24); NTS, 5'-TCTTCAGCATGATGTGTTGTGT-3' (SEQ.ID.NO.25) y 5'-TGAGAGATTCATGAGGAAGTCTTG-3' (SEQ.ID.NO.26); ACTB, 5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ.ID.NO.27) y 5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ.ID.NO.28). Se optimizaron las reacciones de PCR para el número de ciclos para garantizar la intensidad de producto dentro de la

fase logarítmica de amplificación. Análisis de RT-PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) y análisis de transferencia tipo Northern Se midieron los niveles de expresión de los genes KOC1 y KIF11 mediante QRT-PCR usando el sistema de detección

de secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Se extrajo ARN total de células cultivadas y tejido clínico usando reactivo Trizol (Life Technologies, Inc.) según el protocolo del fabricante. Se trataron los ARN extraídos y los ARN de poli(A) de tejido humano normal con DNasa I (Nippon Gene) y se transcribieron de manera inversa usando cebador oligo (dT) y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Se usó la ACTB humana de ensayo predesarrollado TaqMan (Applied Biosystems; n.º 4333762F) para determinar el gen ACTB como control cuantitativo. Se diseñaron un par de cebadores y una sonda TaqMan para cada gen usando el software Primer Express tal como sigue:

KOC1, 5'-ACGAACTCATTTGCTCACTCCTT-3' (sentido) (SEQ.ID.NO.98), 5'-ACCCACACCCAACACAATTGT-3' (antisentido) (SEQ.ID.NO.99), ' 5'-ACAGCAAAGCCC-3' (sonda TaqMan-MGB) (SEQ.ID.Nb.100); KIF11, 5'-TTCACCCTGACAGAGTTCACAAA-3' (sentido) (SEQ.ID.NO.101) 5'-GGGTGGTCTCCCATAATAGCAA-3' (antisentido) (SEQ.ID.NO.102), 5'-AGCCCACTTTAGAGTATAC-3' (sonda TaqMan-MGB) (SEQ.ID.NO.103). Se realizó una PCR para cada gen y el gen ACTB en un único tubo por duplicado. Se expresaron los resultados como el

promedio de estas dos pruebas independientes.

(4) Análisis de transferencia tipo Northern

se hibridaron las transferencias de tejido múltiples humano (BD Biosciences Clontech) con productos de PCR marcados con 32P de KOC1, KIF11 y GHSR1. Se prepararon sondas de ADNc de KOC1, KIF11 y GHSR1 mediante RT-PCR usando cebadores similares como anteriormente. Se realizó una hibridación previa, hibridación y lavado según las recomendaciones del proveedor. Se autorradiografiaron las transferencias con pantallas BAS de intensificación (BIORAD) a temperatura ambiente (TA) durante de 30 a 168 horas.

Generación de anticuerpos anti-KOC1 y anti-KIF11

Se prepararon plásmidos que expresaban KOC1 (longitud completa) y KIF11 (secuencia de aminoácidos parcial que corresponde a codones 361-1056), conteniendo cada uno el epítopo con etiqueta de His en el extremo N-terminal, usando vector pET28 (Novagen). Se expresaron proteínas recombinantes en la cepa de Escherichia coli BL21 codonplus (Stratagene), se purificaron usando resina TALON (BD Biosciences Clontech) según el protocolo del proveedor, y se inocularon en conejos. Se purificaron los sueros inmunitarios en columnas de afinidad según la metodología convencional. Se usaron anticuerpos anti-KOC1 y anti-KIF11 purificados por afinidad para el análisis de inmunotransferencia tipo Western, inmunoprecipitación e inmunotinción. Se confirmó mediante el análisis de inmunotransferencia tipo Western que el anticuerpo anti-KOC1 es específico para KOC1 y no reacciona de manera cruzada con otras proteínas homólogas, IMP-1 y IMP-2 usando lisados de células NCI-H520, que no expresaban ninguna de las IMP-1, -2, y -3 endógenas, pero que se habían transfectado con vector de expresión de IMP-1, -2, y -3 con etiqueta de HA.

Construcción de mutantes de deleción de KOC1 y ensayos de inmunoprecipitación para la identificación de la 5 región de unión de KOC1-KIF11

Se clonaron KOC1 y varios de sus dominios (figura 3a) en sitios apropiados del vector pCAGGS con etiqueta de HA C-terminal y con etiquetas de FLAG N-terminal. Se inmunoprecipitaron células COS-7 transfectadas sólo con un mutante de deleción de KOC1 con agarosa anti-HA (SIGMA). Se detectaron bandas de KIF11 endógeno con anticuerpo antiKIF11 purificado por afinidad mediante inmunotransferencia tipo Western.

10 Tabla 3 Secuencia de cebadores para la construcción del mutante de deleción mediante RT-PCR

F

SEC ID Nº. R SEC ID Nº.

Longitud completa

5'-ATGAACAAACTGTATATCGG-3' 69 5'-CTTCCGTCTTGACTGAGG-3' 70

KOC1 DEL1

5'-ATGAACAAACTGTATATCGG-3' 71 5'-ATGAGCTTCAAGTTTCACC-3' 72

KOC1 DEL2

5'-ATGAACAAACTGTATATCGG-3' 73 5'-CTCCGTTTCTGATTGCTC-3' 74

KOC1 DEL3

5'-ATGAACAAACTGTATATCGG-3' 75 5'AGGCAAATCACATGGTTTCTG3' 76

KOC1 DEL4

5'-TTGCCTCTGCGCCTGCTG-3' 77 5'-CTTCCGTCTTGACTGAGG-3' 78

KOC1 DEL5

5'-TTGCCTCTGCGCCTGCTG-3' 79 5'-CTCCGTTTCTGATTGCTC-3' 80

Inmunoprecipitación de ARN y selección de microalineamiento de ADNc para la identificación de ARNm asociados a KOC1

Se adoptó el protocolo de inmunoprecipitación de ARN de Niranjanakumari et al. (Niranjanakumari, S. et al. Methods 26,

15 182-190 (2002)) para analizar las interacciones de ARN-proteína que implican a KOC1 in vivo. Se aislaron ARN inmunoprecipitados a partir de cinco líneas de células de cáncer de pulmón (A549, LC319, PC14, RERF-LC-AI y SKMES-1). Se transcribió de manera inversa una alícuota de 2,5 g de ARN amplificados (ARNa) basados en T7 de cada ARN inmunoprecipitado (ARN-IP) y del ARN total (control) en presencia de Cy5-dCTP y Cy3-dCTP respectivamente tal como se describió anteriormente (Kikuchi, T. et al. Oncogene 22, 2192-2205 (2003)), para la hibridación con un

20 microalineamiento de ADNc que representa 32.256 genes (análisis de microalineamiento IP). Para confirmar la unión a KOC1 de los ARNm identificados mediante análisis de microalineamiento IP se llevaron a cabo experimentos RT-PCR usando cebadores específicos de genes y ARN de extractos de células de NSCLC inmunoprecipitados con anticuerpo anti-KOC1 (IP-RT-PCR). Para confirmar la región de KOC1 requerida para la unión a los ARNm asociados a KOC1, también se llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia tipo Northwestern tal como a continuación y la IP-RT-PCR de

25 ARNm asociados a KOC1 de estos extractos inmunoprecipitados transfectados con diversos mutantes de deleción de KOC1.

5

10

15

20

25

30

Tabla 4 Secuencia de cebadores para IP-RT-PCR

F

SEC ID Nº. R SEC ID Nº.

CCT2

5'-TTATCCTGAACAGCTCT TTGGTG-3' 81 5'-AAGCGAAGGTCAGCTAAATA TCC3' 82

SBP2

5'-CTTTCTGAGCACACTAC GGATCT-3' 83 5'-AAGCCCTCTTACTTACAGGG AAA-3' 84

SLC25A3

5'-GGTTCCCCTGGATTTAG TGAA-3' 85 5'-CAACAGTAAATCTGAAACTC TTGCC-3' 86

RAB35

5'-GACAAAGGTAGCAAGA GGATTTC-3' 87 5'-CTGGTGTTAAACTCGGTTCT TC-3' 88

PSMB7

5'-CTAGTGAGTGAGGCTAT TGCAGC-3' 89 5'-GTCTCTTCTAGCACCTCAAT CTCC3' 90

GL

5'-ATCTGACTTTCTGTCCA CTGCAT-3' 91 5'-TAATTCAGCATAAGCCAAAG CC-3' 92

PKP4

5'-ACACAGTATGGACTGAA ATCGAC-3' 93 5'-CACCTCAATCTGAACAAGGT TAG-3' 94

WINS1

5'-GGCCTCTCAAAGTCTGG TAGATT-3' 95 5'-ATATTCCCACTTCAGAGACG ACA-3' 96

Análisis de inmunotransferencia tipo Northwestern

Se llevaron a ebullición extractos inmunoprecipitados de células transfectadas con los mutantes de deleción de KOC1 (M) en 2x tampón de muestra SDS, se sometieron a electroforesis a través de geles de poliacrilamida de gradiente 1020% (BIO-RAD) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Hybond-P). Se bloqueó entonces la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (Tris-HCl 10 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, ARNt de levadura 1 mg/ml), y se lavó dos veces con 50 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,8) durante 5 min y se incubó con sonda de ARN marcada con DIG en 5 ml de tampón NWB (Tris-HCl 10 mM (pH 7,8), EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavó la membrana cuatro veces con tampón NWB y entonces se detectó la sonda de ARN unida a las proteínas usando el kit de detección de ácidos nucleicos DIG (Roche) según el protocolo del proveedor.

Obtención de imágenes de células vivas de proteínas KOC1 y KIF11 y ARNm de RAB35 asociado a KOC1

Se prepararon plásmidos que expresaban proteína KOC1 fusionada a ECFP (ECFP-KOC1) usando vectores pECFP-N1 (BD Biosciences Clontech). También se prepararon plásmidos que expresaban proteína KIF11 fusionada a EYFP (EYFP-KIF11) usando vectores pEYFP-N1 (BD Biosciences Clontech). Se capturaron imágenes de lapso de tiempo de células COS-7 transfectadas con plásmidos que expresaban proteínas ECFP-KOC1 o EYFP-KIF11 durante 5-15 horas mediante el sistema de obtención imágenes de células vivas (Power IX81, OLYMPUS) y un microscopio confocal (TCS SP2-AOBS, Leica Microsystems; FV1000 FLUOVIEW, OLYMPUS). Se realizó la transcripción in vitro de plásmidos linealizados que portan la secuencia de ADNc de longitud completa de un gen asociado a KOC1, RAB35, usando el protocolo de laboratorios DAVIS (http://www.ed.ac.uk/~ilan). Para generar ribosondas fluorescentes para la localización conjunta in vivo con KOC1, se transcribieron los plásmidos usando el kit de formación de caperuza mCAP ARN (Stratagene) en presencia de UTP marcado con Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). Se construyeron plásmidos que expresaban proteína KOC1 fusionada a EGFP (EGFP-KOC1) proteína, se prepararon usando vectores pEGFP-N1 (BD Biosciences Clontech). Para la obtención de imágenes de células vivas de ARNm de RAB35 marcado con Alexa Fluor 546 y EGFP-KOC1 localizados conjuntamente, se transfectaron adicionalmente células COS-7, que se habían transfectado inicialmente con pEGFP-KOC1, 36 horas más tarde con ARNm de RAB35 marcado con Alexa Fluor 546 (3 g por placa de cultivo 3,5 cm) en presencia de inhibidor de RNasa (TAKARA). Se transfectaron las muestras de ARN y ADN de plásmido usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según los protocolos del fabricante. Se lavaron las células dos veces con PBS, y se añadió medio nuevo 90 min tras la transfección con el ARNm marcado. Se dejó que las células se recuperaran en la incubadora (37ºC, 5% de CO2) durante 30 min antes de la obtención imágenes de células vivas durante 3-6 horas con un microscopio confocal (FV1000 FLUOVIEW, OLYMPUS). Para investigar el transporte específico de ARNm por el complejo KOC1-RNP desde una célula hasta otra célula, se prepararon dos células derivadas de COS-7 diferentes; las células COS-7 transfectadas con ARNm de RAB35 marcado con Alexa Fluor 546 y de pEGFP-KOC1 y las otras células CΟS-7 primarias simplemente marcadas con CellTracker (Molecular Probes) según los protocolos del proveedor. Se mezclaron estas dos poblaciones de células y se cultivaron conjuntamente durante 12 horas antes de la obtención de imágenes de células vivas con el microscopio confocal durante 6 horas.

Para investigar la traducción del ARNm transportado por el complejo KOC1-RNP en las células receptoras se prepararon dos tipos de células derivadas de COS-7; un tipo eran células COS-7 cotransfectadas con KIF11 y KOC1 con etiqueta de pCAGGS-FLAG. Después de 24 horas de cultivo, se volvió a transfectar el plásmido que contenía ARNm de longitud completa de RAB35 fusionado a EGFP en estas células. El otro tipo eran células COS-7 simplemente marcadas con CellTracker (azul). Se mezclaron estos dos tipos de células y se cultivaron conjuntamente durante 24 horas antes de la obtención de imágenes de células vivas con microscopio de vídeo durante 12 horas. Se examinó la síntesis de ARNm de RAB35 con etiqueta de EGFP y las correspondientes proteínas en las células receptoras teñidas con CellTracker (azul) así como también en la estructura ultrafina entre las dos células, mediante hibridación in situ y microscopía de vídeo de lapso de tiempo.

Hibridación in situ fluorescente

Se llevó a cabo la hibridación in situ con sondas marcadas con DIG complementarias a ARNm de EGFP o RAB35 a 60ºC durante 16 horas. Se detectó la marca de DIG usando NBT-BCIP, un sustrato de color de fosfatasa alcalina. Se lavaron las células, se montaron y se visualizaron en el microscopio de luz. Se hibridaron las células fijadas con una mezcla de sonda marcada con DIG complementaria a ARNm de RAB35 durante 16 horas en 50% de formamida/ 2X SSC a 42ºC. Se lavaron las células, se montaron y visualizaron en microscopio confocal.

(5) Ensayo de interferencia de ARN

Para preparar el vector de plásmido que expresaba ARN de interferencia corto (ARNsi), se amplificó el fragmento genómico del gen H1RNA que contenía su región de promotor mediante PCR usando un conjunto de cebadores, 5'TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3' (SEC ID Nº: 44), y 5'-CC AAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3' (SEC ID Nº: 45) y ADN de placenta humana como molde. Se purificó el producto y se clonó en el vector de plásmido pCR2.0 usando un kit de clonación TA según el protocolo del proveedor (Invitrogen). El fragmento de BamHI y XhoI que contenía H1RNA estaba dentro de pcDNA3.1(+) entre los nucleótidos 1257 y 56, y se amplificó el fragmento mediante PCR usando

5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3' (SEC ID Nº: 46) y

5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3' (SEC ID Nº: 47).

El ADN ligado pasó a ser el molde para la amplificación por PCR con cebadores,

5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3' (SEC ID Nº: 48) y

5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3' (SEC ID Nº: 49).

Se digirió el producto con HindIII, y posteriormente se autoligó para producir el plásmido del vector psiH1BX3.0 que tenía una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 50.

Se insertó el fragmento de ADN que codifica para ARNsi en el hueco en los nucleótidos 489-492 tal como se indica (-) en la siguiente secuencia de plásmido (SEC ID Nº: 50).

Usando 30 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), se transfectaron 10 g de vector de expresión de ARNsi en líneas de células de NSCLC, A549 y LC319, que sobreexpresaban ambas de manera endógena KOC1, KIF11, NMU, GHSR1b, NTSR1, RAB35 y FOXM1. Más de 90% de las células transfectadas expresaron el ARNsi sintético, y se suprimió de manera eficaz la expresión endógena de genes diana (KIF11, GHSR1b, NTSR1, RAB35 o FOXM1) en estas células. Se cultivaron las células transfectadas durante cinco días en presencia de concentraciones apropiadas de geneticina (G418), y entonces se midió el número de células y la viabilidad celular mediante los ensayos de MTT por triplicado y la tinción con Giemsa. Las secuencias diana de los oligonucleótidos sintéticos para ARNi eran las siguientes: control 1 (EGFP: gen de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), un mutante de EGFP de Aequorea victoria), 5'GAAGCAGCACGACTTCTTC-3' (SEQ.ID.NO. 29); control 2 (Luciferasa: gen de la luciferasa de Photinus pyralis), 5'CGTACGCGGAATACTTCGA-3' (SEQ.ID.NO. 30); control 3 (Scramble: gen de cloroplasto de Euglena gracilis que codifica para ARNr 5S y 16S), 5'-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3' (SEQ.ID.NO. 31);

ARNsi-KIF11-1 (n.º 1), 5'-GTTAGTGTACGAACTGGAG-3' (SEQ.ID.NO. 32);

ARNsi-KIF11-2 (n.º 2), 5'-GTGTCTCTGTTGGAGATCT-3' (SEQ.ID.NO. 33);

ARNsi-KIF11-3 (n.º 3), 5'-GAAGGCAGTTGACCAACAC-3' (SEQ.ID.NO. 34);

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ARNsi-GHSR-1 (si-GHSR-1), 5'-CCTCTACCTGTCCAGCATG-3' (SEQ.ID.NO. 35); ARNsi-NTSR1-1 (si-NTSR1-1), 5'GTTCATCAGCGCCATCTGG-3' (SEQ.ID.NO. 36);

ARNsi-NTSR1-2 (si-NTSR1-2), 5'-GGTCGTCATACAGGTCAAC-3' (SEQ.ID.NO. 37), ARNsi-RAB35 (si-RAB35), 5'-GAGATGTTCAACTGCATCA-3' (SEQ.ID.NO. 114), ARNsi-FOXM1 (si-FOXM1), 5'GCAGCAGAAACGACCGAAT-3' (SEQ.ID.NO. 108).

Los oligonucleótidos usados para estos ARNsi se muestran a continuación. Se preparó cada constructo clonando el siguiente oligonucleótido bicatenario en el sitio Bbsl en el vector psiH1BX3.0. La correspondiente posición de nucleótidos con respecto a la secuencia de ácido nucleico de KIF11, GHSR1b, NTSR1, RAB35 y FOXM1 de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 112 y 106 se enumera para cada secuencia de oligonucleótidos. Cada oligonucleótido es una combinación de una secuencia de nucleótidos sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido de la secuencia diana de KIF11, GHSR1b, NTSR1, RAB35 y FOXM1. Las secuencias de nucleótidos de la estructura de bucle en horquilla de cada ARNsi también se muestran a continuación, (se eliminan los sitios de reconocimiento de endonucleasas de cada secuencia de estructura de bucle con horquilla).

KIF11 si1 288-306 (para la secuencia diana de gttagtgtac gaactggag/ SEC ID Nº:32) (inserto F) Tccc gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEC ID Nº :51 (inserto R) Aaaa gttagtgtacgaactggag tctcttgaa ctccagttcgtacactaac/SEC ID Nº:52 (horquilla) gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEC ID Nº:53 KIF11 si2 612-630 (para la secuencia diana de gtgtctctgt tggagatct/ SEC ID Nº:33) (inserto F) Tccc gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEC ID Nº: 54 (inserto R) Aaaa gtgtctctgt tggagatct tctcttgaa agatctccaacagagacac/SEC ID Nº:55 (horquilla) gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEC ID Nº: 56 KIF11 si3 1700-1718 (para la secuencia diana de gaaggcagtt gaccaacac/ SEC ID Nº:34) (inserto F) Tccc gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEC ID Nº:57 (inserto R) Aaaa gaaggcagtt gaccaacac tctcttgaa gtgttggtcaactgccttc/SEC ID Nº:58 (horquilla) gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEC ID Nº: 59 GHSR1b si1 237-255 (para la secuencia diana de cctctacctg tccagcatg/ SEC ID Nº:35) (inserto F) Tccc cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEQ ID NO: 60 (inserto R) Aaaa cctctacctg tccagcatg tctcttgaa catgctggacaggtagagg/SEC ID Nº:61 (horquilla) cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEC ID Nº: 62 NTSR1 si1 933-951 (para la secuencia diana de gttcatcagc gccatctgg/ SEC ID Nº:36) (inserto F) Tccc gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEC ID Nº:63 (inserto R) Aaaa gttcatcagc gccatctgg tctcttgaa ccagatggcgctgatgaac/SEC ID Nº: 64 (horquilla) gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEC ID Nº:65 NTSR1 si2 1074-1092 (para la secuencia diana de ggtcgtcata caggtcaac/ SEC ID Nº:37) (inserto F) Tccc ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEC ID Nº: 66 (inserto R) Aaaa ggtcgtcata caggtcaac tctcttgaa gttgacctgtatgacgacc/SEC ID Nº: 67 (horquilla) ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEC ID Nº:68 RAB35 si 620-638 (para la secuencia diana de gagatgttca actgcatca/ SEC ID Nº:114) (inserto F) Tccc gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc/SEC ID Nº:115 (inserto R) Aaaa gagatgttca actgcatca tctcttgaa tgatgcagt tgaacatctc /SEC ID Nº :116

(horquilla) gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc /SEC ID Nº:117

FOXM1 si 1240-1258 (para la secuencia diana de gcagcagaaacgaccgaat/ SEC ID Nº:108)

(inserto F) Tccc gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc /SEC ID Nº:109

(inserto R) Aaaa gcagcagaaa cgaccgaat tctcttgaa attcggtcg tttctgctgc /SEC ID Nº:110

(horquilla) gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc /SEC ID Nº: 111.

Para validar el sistema de ARNi de la presente descripción, se confirmaron inicialmente los ARNsi control individuales (EGFP, Luciferasa, y Scramble) usando RT-PCR semicuantitativa para reducir la expresión de los correspondientes genes diana que se han transfectado de manera transitoria en células COS-7. Se confirmó la regulación por disminución de la expresión de KIF11, GHSR1b, NTSR1 , RAB35 y FOXM1 mediante sus respectivos ARNsi (si-KIF11-1, si-KIF11-2, si-KIF11-3, si-GHSR-1, si-NTSR1-1, si-NTSR1-2, si-RAB35 y si-FOXM1), pero no mediante controles, con RT-PCR semicuantitativa en líneas celulares usadas para este ensayo.

Ensayos negativos dominantes

Se realizaron ensayos negativos dominantes usando los mutantes de deleción de KOC1 para investigar el papel funcional del complejo KOC1-KIF11 en el crecimiento o la supervivencia de células de cáncer de pulmón. Se transfectaron en células LC319 el constructo KOC1DEL3 y KOC1DEL2 (figura 3a; 10 g), el plásmido vacío (10 g), o mezclas de plásmido de ambos constructos en la dosis final de 10 g de ADN (KOC1DEL3 o KOC1DEL2 frente a vacío (g), 7,5 : 2,5; 5 : 5; o 2,5 : 7,5, individualmente). Se cultivaron las células transfectadas durante 7 días en presencia de G418 y se midió su viabilidad mediante ensayos de MTT por triplicado.

(6) Coinmunoprecipitación y espectrometría de masas MALDI-TOF

Se transfectaron células LC319 de línea de células de cáncer de pulmón humano con vector de expresión de KOC1 (FLAG NH2-terminal, HA COOH-terminal) pCAGGS-n3FH con etiqueta bilateral o vector vacío (transfección vacía). Se extrajeron células en tampón IP (0,5% de NP-40, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, e inhibidor de proteasas) durante 30 min en hielo. Se centrifugaron los extractos a 14.000 rpm durante 15 min, y se sometieron los sobrenadantes a inmunoprecipitación usando agarosa M2 anti-Flag (Sigma- Aldrich) y perlas anti-HA (Sigma-Aldrich) durante 1-2 horas. Se lavaron las perlas seis veces con tampón IP y se eluyó la proteína llevando a ebullición las perlas en tampón de muestra Laemmli tras eliminar la fracción de lavado final. Se resolvió la proteína eluida mediante SDS-PAGE y se tiñó con tinción de plata. Se extrajo una banda de 125 kDa mediante extracción en gel y se usó para la secuenciación mediante espectrometría de masas usando la espectrometría de masas MALDI-TOF. Este análisis identificó KIF11 como el producto de 125 kDa.

Para confirmar la interacción entre KOC1 y KIF11, se contransfectaron de manera transitoria células A549 con KIF11 con etiqueta de Flag y KOC1 con etiqueta de myc y se inmunoprecipitaron las células con agarosa M2 anti-Flag. Posteriormente, se inmunotransfirieron las células con anticuerpo anti-myc (9E10; Santa Cruz). A continuación, usando la misma combinación de vectores y células, se inmunoprecipitaron las células con agarosa anti-myc (SIGMA) y se inmunotransfirieron con anticuerpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich).

Para confirmar adicionalmente esta interacción, se cotransfectaron de manera transitoria células A549 con KIF11 con etiqueta de Flag y KOC1 con etiqueta de myc, y se detectó la localización conjunta de KIF11 marcado con FITC y KOC1 marcado con rodamina principalmente en el citoplasma mediante tinción inmunocitoquímica usando anticuerpo anti-FLAG marcado con FITC y anticuerpo anti-myc marcado con rodamina, tal como se describe a continuación.

(7) Inmunocitoquímica

Se cultivaron células A549 que se hicieron crecer en cubreobjetos durante 24 horas tras el paso, y se cotransfectaron con KIF11 con etiqueta de Flag y KOC1 con etiqueta de myc. Tras la incubación de 24 horas, se fijaron las células con acetona/metanol (1:1) durante 5 min en hielo, se bloquearon en CAS BLOCK (ZYMED) durante 7 min a TA, y entonces se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-Flag (SIGMA) durante 1 hora a TA. Se lavaron las células fijadas 3 veces con PBS, se hicieron reaccionar con IgG-FITC anti conejo durante 1 hora a TA. Entonces se bloquearon de nuevo las células y se incubaron con anticuerpo anti-myc (9E10; Santa Cruz) durante 1 hora a TA. Finalmente, se aplicó IgGrodamina anti-ratón a las células durante 1 hora a TA. Se visualizaron las células en un microscopio confocal TCS SP2AOBS de Leica.

Análisis de microalineamiento de tejido e inmunohistoquímica

Se construyeron microalineamientos de tejido tumoral usando NSCLC fijados en formalina tal como se publicó en otra

5

15

25

35

45

parte (Kononen, J. et al., Nat. Med. 4, 844-847 (1998); Sauter, G. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2, 962-972 (2003)). Se evaluó la positividad de KOC1 y KIF11 de manera semicuantitativa como ausente o positivo según la intensidad de tinción, por tres investigadores independientes sin conocimiento previo de los datos de seguimiento clínico.

(8) Ensayo de unión ligando-receptor

Para identificar la unión directa de NMU-25 a sus receptores candidatos, GHSR1a, GHSR1b y NTSR1, se realizaron los siguientes experimentos. Se amplificó toda la región codificante de cada gen receptor mediante RT-PCR usando cebadores

GHSR1a (5'-GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3' (SEQ.ID.NO. 38) y 5'CGCGGATCCGCGTGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCC-3' (SEQ.ID.NO. 39)), GHSR1b (5'GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3' (SEQ.ID.NO. 40) y 5'CGCGGATCCGCGGAGAGAAGGGAGAAGGCACAGGGA-3' (SEQ.ID.NO. 41)), y NTSR1 (5'GGAATTCCATGCGCCTCAACAGCTCCGCGCCGGGAA-3' (SEQ.ID.NO. 42) y 5'CGCGGATCCGCGGTACAGCGTCTCGCGGGTGGCATTGCT-3' (SEQ.ID.NO. 43)). Se digirieron los productos con EcoR1 y BamH1 y se clonaron en sitios apropiados del vector p3XFLAG-CMV10 (Sigma-Aldrich Co.). Se transfectaron células COS-7 con plásmidos de expresión de GHSR1b o NTSR1 usando FuGENE6, tal como se describió anteriormente. Se cultivaron células COS-7 con péptido NMU-25 marcado con rodamina 0,5 M (NMU-25-rodamina: Phoenix Pharmaceuticals. Inc.) durante 12 horas, se lavaron cinco veces en PBS(-), y se fijaron en disolución de paraformaldehído 4% durante 60 min a temperatura ambiente. Entonces, se incubaron las células con anticuerpos frente a proteínas GHSR1a, GHSR1b o NTSR1 con etiqueta de FLAG (Sigma-Aldrich Co.), se tiñeron con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con FITC (Cappel) y se visualizaron bajo microscopio confocal láser (TCS SP2 AOBS: Leica Microsystems). Además, se prepararon tres controles negativos diferentes para este ensayo: 1) células COS-7 no transfectadas sin la adición de NMU-25-rodamina; 2) células COS-7 no transfectadas tratadas con NMU-25-rodamina; y 3) células COS-7 transfectadas con GHSR1a, GHSR1 o NTSR1 sin NMU-25-rodamina. Las células COS-7 transfectadas con un receptor de NMU conocido (NMU1R) sirvieron como control positivo para el ensayo.

Para confirmar la unión de NMU-25 a los receptores candidatos, se realizó un análisis de citometría de flujo usando la misma serie de células COS-7. Específicamente, se colocaron en placa células COS-7 en una densidad de 1 X 105 células/placa de 100 mm y se transfectaron con cualquiera de los vectores de expresión de GHSR1b, NTSR1 o NMU1R; 24 horas tras la transfección se incubaron las células con NMU-25-rodamina 0,5 M durante 12 horas, se lavaron, se trataron con tripsina, se recogieron en PBS, y se lavaron una vez más en PBS. Se determinó la población de células que se unían a NMU-25 marcado con rodamina mediante citometría de flujo.

Para confirmar adicionalmente la unión de NMU-25 a los receptores candidatos endógenos en las células de NSCLC, se realizó el ensayo de unión receptor-ligando usando las células LC319 y PC-14. Brevemente, estas células tratadas con tripsina se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo transparente y pared negra 24 horas antes del ensayo. Se retiró el medio y se incubaron las células con Cy5-NMU-25 con un exceso de 10 veces de competidor no marcado. Se incubó la placa en la oscuridad durante 24 horas a 37ºC y se escaneo en el sistema de detección celular 8200 (Applied Biosystems). El Software de análisis 8200 crea una imagen en escala de grises digitalizada, cuantifica la cantidad de fluorescencia unida en la superficie de cada célula y enumera las células fluorescentes.

Medición de niveles de AMPc

Se sembraron las células LC319 tratadas con tripsina en una placa de microtitulación de 96 pocillos (5,0 x 104 células) y se cultivaron en medio RPMI-1640 (+) 10% de FCS durante 24 horas, y entonces se cambio el medio por medio RPMI1640 sin suero / IBMX (isobutilmetilxantina) 1 mM durante 20 min antes del ensayo. Se incubaron las células con péptidos NMU-25 durante 20 min antes de medir el nivel de AMPc usando el sistema cAMP EIA (Amersham Biosystems).

Ensayo de movilización de Ca2+ intracelular

Se sembraron células LC319 tratadas con tripsina en una placa de microtitulación de 384 pocillos, de fondo transparente, pared negra recubierta con poli-D-lisina (1,0 x 104 células/ml) 24 horas antes del ensayo. Se cargaron las células durante 1 hora con tinte indicador fluorescente Fluo-4-AM 1 mM en el tampón de ensayo (solución salina de equilibrio de Hank, HEPES 20 mM, probenecid 2,5 mM), se lavaron tres veces con tampón de ensayo y entonces se colocaron de nuevo en la incubadora durante 10 min antes del ensayo en un lector de placas de obtención de imágenes fluorométrico (FLIPR, Molecular Devices). Se usó el cambio máximo de fluorescencia con respecto al nivel inicial para determinar la respuesta de las células frente a la estimulación de péptidos NMU-25.

Identificación de genes situados secuencia abajo de NMU mediante microalineamiento de ADNc

Se transfectaron células LC319 con o bien ARNsi frente a NMU (si-NMU) o bien Luciferasa (ARNsi control). Se extrajeron ARNm 12, 24 y 36 horas tras la transfección. Se marcaron con tinte Cy5 o Cy3 y se sometieron a hibridación conjunta en portaobjetos de microalineamiento de ADNc que contenían 32.256 genes tal como se describió (Kakiuchi, S., et al., (2004). Hum. MoI. Genet. 13, 3029-3043., Ochi, K. et al., (2004). Int. J. Oncol 24, 647-655.). Tras la normalización de los datos, se analizaron adicionalmente los genes con señales superiores al valor de corte. Los genes cuya intensidad disminuyó significativamente según la reducción dependiente del tiempo de la expresión de NMU se seleccionaron inicialmente usando análisis de agrupación SOM. Se realizó la validación de genes candidato situados secuencia abajo de NMU usando experimentos de RT-PCR semicuantitativa de los mismos ARNm de las células LC319 usadas para la hibridación de microalineamiento, con cebadores específicos de gen enumerados a continuación.

FLJ42024 (5 '-AAAAAGGGGATGCCTAGAACTC-3' (SEQ.ID.NO.118) y

5'-CTTTCAGCACGTCAAGGACAT-3' (SEQ.ID.NO.119)),

GCDH (5'-ACACCTACGAAGGTACACATGAC-3' (SEQ.ID.NO.120) y

(5'-GCTATTTCAGGGTAAATGGAGTC-3' (SEQ.ID.NO.121)),

CDK5RAP1 (5'-CAGAGATGGAGGATGTCAATAAC-3' (SEQ.ID.NO.122) y

(5'-CATAGCAGCTTTAAAGAGACACG-3' (SEQ.ID.NO.123)),

LOC134145 (5'-CCACCATAACAGTGGAGTGGG-3' (SEQ.ID.NO.124)

(5'-CAGTTACAGGTGTATGACTGGGAG-3' (SEQ.ID.NO.125)),

NUP188 (5'-CTGAATACAACTTCCTGTTTGCC-3' (SEQ.ID.NO.126) y

(5'-GACCACAGAATTACCAAAACTGC-3' (SEQ.ID.NO.127)).

La expresión de los genes candidatos se detectó adicionalmente mediante RT-PCR semicuantitativa usando ARNm aislados a las 72 y 96 horas de células LC319 tratadas con NMU-25 1 μM o BSA en el punto de tiempo de 0 y 48 horas.

Resultados

(1)

Identificación de KIF11 como proteína que interacciona con KOC1

Se extrajeron células LC319 transfectadas con vector pCAGGS-n3FH-KOC1 y se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal M2 anti-Flag, y posteriormente se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal anti-HA. Se tiñó el complejo de proteína que incluía KOC1 con tinción de plata en gel SDS-PAGE. Se extrajo una banda de 125 kDa que estaba ausente en la transfección vacía y se determinó que era KIF11 (NM_004523 ; SEQ.ID.NO.1) mediante secuenciación mediante espectrometría de masas.

(2)

Confirmación de la interacción entre KOC1 y KIF11

Se inmunoprecipitaron las células A549 cotransfectadas con KIF11 con etiqueta de Flag y KOC1 con etiqueta de myc, las células transfectadas con o bien KIF11 o bien KOC1, y las células no transfectadas con agarosa M2 anti-Flag y posteriormente se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-myc. Por el contrario, la misma serie de células A549 se inmunoprecipitaron con agarosa anti-myc y se inmunotransfirieron con anticuerpo M2 anti-Flag. Se halló una única banda sólo cuando ambos constructos se contransfectaron (figura 1a). La inmunocitoquímica mostró que KIF11 marcado con FITC con etiqueta de FLAG estaba localizado conjuntamente en el citoplasma de A549 con KOC1 marcado con rodamina con etiqueta de myc (figura 1b).

A continuación, se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia tipo Western que el anticuerpo anti-KOC1 es específico a KOC1 y no reacciona de manera cruzada con otras proteínas homólogas, IMP-1 e IMP-2 usando lisado de células H520, que se había confirmado que no expresaban IMP-1, -2, y -3 (KOC1) endógena, pero se habían transfectado con el vector de expresión de IMP-1, -2, y -3 (KOC1) con etiqueta de HA. Se extrajeron lisados de células LC319 transfectadas con vector pCAGGS-KOC1 con etiqueta de FLAG o vector vacío (control) y se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG. El complejo de proteína que incluye KOC1 se tiñó con SilverQuest (Invitrogen) en un gel SDS-PAGE. Se detectó una banda de 125 kDa específicamente en inmunoprecipitados de lisados de células transfectadas con plásmidos que expresan KOC1, pero no en lisados control (plásmidos vacíos). El análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF posterior identificó esta proteína de 125 kDa como KIF11, un miembro de la familia de cinesinas. Se confirmó la interacción directa entre KOC1 y KIF11 endógeno mediante experimentos de inmunoprecipitación con extractos de A549 y LC319, usando anticuerpos policlonales anti-KOC1 y anti-KIF11 purificados por afinidad (figura 1c).

(3) Expresión de KIF11 en NSCLC de pulmón. Se confirmó un aumento de la expresión de KIF11 en 12 de 16 casos de NSCLC (5 de 8 ADC y en 7 de 8 SCC). Además se observó la regulación por incremento de KIF11 en 14 de las 15 líneas de células de NSCLC.

Se volvió a examinar posteriormente tejidos de NSCLC primario y líneas de células de cáncer de pulmón y se halló un aumento de la expresión de KIF11 en 18 muestras clínicas de NSCLC así como en todas las 20 líneas de células de NSCLC o SCLC examinadas mediante RT-PCR cuantitativa (figura 2a,b). Los niveles de ARNm de los genes KOC1 y KIF11 con respecto a los genes ACTB estaban significativamente correlacionados (r = 0,702, P = 0,0029 mediante la correlación de clasificación de Spearman). Estos dos genes estaban coactivados en casi todas las líneas de células de cáncer de pulmón (r = 0,458, P = 0,0359 mediante la correlación de clasificación de Spearman).

(4) Expresión KIF11 en tejidos humanos normales

La transferencia tipo Northern con ADNc de KIF11 como sonda identificó transcritos de 4,5 y 5,5 kb como bandas muy débiles, sólo observadas en placenta, testículos y médula ósea, entre los 23 tejidos examinados humanos normales. Se consideró que la secuencia de ADNc notificada de KIF11 correspondía al transcrito más grande. Para investigar el transcrito correspondiente a la banda más pequeña, se transcribió de manera inversa ARNm aislados de tejidos de los testículos y líneas de células de NSCLC. Se amplificó toda la secuencia de ADNc de KIF11 mediante PCR usando cuatro conjuntos de cebadores, pero no se halló ningún transcrito de corte y empalme alternativo en estas muestras. Por tanto, la banda más pequeña puede reflejar la hibridación cruzada con el transcrito de algún(algunos) gen(es) relacionado(s). El patrón de expresión de KIF11 en tejidos humanos normales estaba significativamente correlacionado con el de KOC1 (figura 2c).

Identificación de la región de unión a KIF11 en KOC1

Para determinar el dominio específico de KOC1 requerido para la interacción con KIF11, se transfectó en células COS-7 uno de los cinco constructos de deleción de KOC1 con secuencias con etiqueta de FLAG NH2 (N)-terminal o de HA COOH (C)-terminal (KOC1DEL1-5; figura 3a). La inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal anti-HA indicó que los constructos KOC1DEL4 y KOC1DEL5, que carecían los dos de los dos motivos de reconocimiento de ARN (RRM), no pudieron interaccionar con KIF11 endógeno, mientras que todos los constructos de KOC1 que tenían los dos RRM conservaban la afinidad de unión por KIF11 (figura 3b).

Aislamiento de ARNm asociados al complejo KOC1-KIF11 usando inmunoprecipitación de ARN y microalineamiento de ADNc
La proteína KOC1 se conoce por mostrar múltiples uniones a la región en 3’ de ARNm líder de IGF2, posiblemente a través de dos RRM funcionales y cuatro dominios homólogos a K (KH) (Nielsen, J. et al., MoI. Cell Biol. 19, 1262- 1270 (1999).). sin embargo, no se detectó ninguna expresión de ARNm de IGF2 en ninguna de las líneas de células de cáncer de pulmón o muestras clínicas de tejido de NSCLC examinadas. Por tanto, aclarar la función de KOC1 en carcinogénesis de pulmón, se buscó ARNm que interaccionará(n) con KOC1 y de ese modo pudieran desempeñar papeles importantes en el crecimiento y/o la evolución del cáncer de pulmón. En primer lugar se inmunoprecipitaron ARNm usando anticuerpo anti-KOC1 y cinco líneas de células de NSCLC (A549, LC319, PC14, RERF-LC-AI y SK-MES1). Entonces, se hibridaron conjuntamente los ARNm inmunoprecipitados marcados con Cy5 (IP-ARNm) y los ARNm totales marcados con Cy3 aislados de cada línea celular correspondiente, en microalineamientos de ADNc humanos (IP-microalineamiento). Entre los 32.256 genes seleccionados, se identificó un total de 55 que estaban enriquecidos en IP-ARNm en comparación con ARN total en al menos cuatro de las cinco líneas de células de NSCLC sometidas a prueba (véase la tabla 2), y se confirmó el enriquecimiento de todos los candidatos mediante RT-PCR usando los IP-ARNm como moldes (IP-RT-PCR). Para examinar la especificidad de la inmunoprecipitación de ARN, se realizaron experimentos de RT-PCR con ARNm de beta-actina (ACTB) usando IP-ARNm como molde; no precipitó ninguna ACTB mediante el anticuerpo anti-KOC1. Como controles de fondo de la inmunoprecipitación de ARN, se precipitaron los ARNm usando IgG de conejo normal y cinco líneas de células de NSCLC, y se confirmó que ninguno de los ocho ARNm asociados a KOC1 sometidos a prueba (CCT2, SBP2, SLC25A3, RAB35, PSMB7, GL, PKP4 y WINS1) precipitó mediante la IgG de conejo normal. También se confirmó una elevación de la expresión de mucho de los genes candidatos en muestras de NSCLC mediante RT-PCR (datos no mostrados). Para examinar si la formación del complejo KOC1-KIF11 requiere la presencia conjunta de estos ARNm asociados a KOC1, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación usando lisados celulares que se trataron o no se trataron in vitro con 30 unidades de RNasa T1 (SIGMA), y no se encontró ninguna diferencia en la interacción de las dos proteínas en presencia o ausencia de ARNm, lo que sugiere que la formación de complejo KOC1-KIF11 probablemente no requiere estos ARNm específicos.
Mediante el seguimiento de esta estrategia se ha podido mostrar que KOC1 y KIF11 no sólo se sobreexpresan conjuntamente en la gran mayoría de las líneas celulares y muestras clínicas de NSCLC, sino que también un complejo formado por los productos de estos genes es indispensable para el crecimiento y la evolución de células de NSCLC, contribuyendo a un sistema de transporte de ARNm intra e intercelular. El transporte de ARNm intracelular mediante proteínas de unión a ARN se ha notificado en ovocitos y embriones en desarrollo de Drosophila y Xenopus, y en células somáticas tales como fibroblastos y neuronas (King, M.L. et al., Bioessays 21, 546-557 (1999); Mowry, K.L. & Cote, CA. Faseb. J.13, 435-445 (1999); Lasko, P., J Cell Biol. 150, F51-56 (2000); Steward, O. Neuron 18, 9-12 (1997)). El ARNm
de beta-actina se transporta a las laminillas conductoras de fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y a los conos de crecimiento de neuronas en desarrollo (Lawrence, J.B. & Singer, R.H. Cell 45, 407-415 (1986); Bassell, GJ. et al., J. Neurosci. 18, 251-265 (1998)). La localización de ARNm de ACTB depende del “zip-code”, un elemento que actúa en cis en la UTR de 3’ del ARNm (Kislauskis, E.H. et al., J. Cell Biol.123, 165-172 (1993)). El respectivo factor que actúa en 5 trans, proteína de unión a zip-code 1 (ZBP1), se identificó mediante purificación por afinidad con el zip-code de ARNm de ACTB; (Ross, A.F. et al., MoI. Cell Biol.H, 2158-2165 (1997)) Se han identificado desde hace tiempo homólogos de ZBP1 en una amplia gama de organismos incluyendo Xenopus, Drosophila, ratón y ser humano (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14, 2729-2733 (1997); Deshler, J.O. et al., Science 276, 1128-1131 (1997); Doyle, GA. et al., Nucleic Acids Res. 26, 5036-5044 (1998)). Las proteínas de tipo ZBP1 contienen dos RRM en la región N-terminal y cuatro 10 dominios hnRNP KH (ribonucleoproteína de homología K) en el extremo C-terminal. KOC1, una de las proteínas de unión a ARNm de IGF2, se considera que es un miembro de la familia de ZBP1; muestra múltiples uniones con la región en 3’ del ARNm líder de IGF2 (Nielsen, J. et al., MoI. Cell Biol. 19, 1262-1270 (1999)) y se sobreexpresa en varios tipos de cánceres (Mueller-Pillasch, F. et al., Oncogene 14, 2729-2733 (1997); Zhang, J.Y. et al., Clin. Immunol .100, 149-156 (2001); Mueller, F. et al., Br. J. Cancer 88, 699-701 (2003); Wang, T. et al., Br. J. Cancer 88, 887-894 (2003)). Sin 15 embargo, puesto que no se detectó la expresión de la región en 3’ del ARNm líder de IGF2 en la mayor parte de las muestras clínicas o líneas de células de NSCLC examinadas, se sospechó que KOC1 podría mediar el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la interacción con, y el transporte de, otros ARNm. Cuando se acometieron los experimentos de inmunoprecipitación de ARN acoplados con microalineamientos de ADNc (IP-microalineamiento), se identificaron docenas de ARNm candidatos que probablemente se asocien a KOC1 en células de NSCLC (véase la 20 tabla 2). Esa lista incluye genes que codifican para proteínas con funciones de adhesión celular (PKP4, L1CAM1), invasión y evolución de células de cáncer (IGFBP2), y unión de GTP pequeñas (RAB35), (Papagerakis, S. et al., Hum. PatholM, 565-572 (2003); Fogel, M. et al., Cancer Lett. 189, 237-247 (2003); Wang, H. et al., Cancer Res. 63, 43154321 (2003); Zhao, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1060-1065 (2002)) y muchos de ellos se expresaron en altos niveles en muestras clínicas de NSCLC (datos no mostrados). La activación de un sistema que
25 transporta ARNm cuyos productos se asocian al crecimiento o movimiento de células es muy interesante, e investigaciones adicionales a lo largo de esta línea podrían conducir a un mejor entendimiento de la carcinogénesis pulmonar.
Tabla 2

CLASIFICACIÓN(1)

GEN REGISTRO A549 LC319 PC14 RERF SKMES1 SUM*

1

LOC283050 AA843724 6,0 7,7 5,4 6,4 9,2 34,7

2

KIAA0169 R49113 6,2 8,9 4,9 5,7 6,8 32,5

3

CCT2 AF026166 4,1 8,0 5,4 5,7 9,1 32,3

4

LOH11CR2A NM_014622 9,1 5,6 5,8 3,9 4,5 28,8

5

SNTB2 AA625860 6,0 5,0 6,8 4,0 5,0 26,9

6

CFLAR U97074 5,3 5,7 3,8 4,3 5,9 25,0

7

SBP2 AF380995 5,0 6,1 3,9 2,9 6,1 24,0

8

LOC56267 AA420728 4,8 5,4 5,4 2,5 5,0 23,1

9

SLC25A3 NM_002635 3,5 5,8 2,9 4,1 5,3 21,7

10

IFIT1 M24594 4,4 4,2 3,8 3,6 5,2 21,2

11

OSTalpha H79642 2,3 5,9 5,6 3,8 2,8 20,4

12

FILIP1 XM_029179 10,3 2,3 2,1 2,7 2,5 19,9

13

ZNF415 AY283600 3,5 5,2 3,3 4,0 3,8 19,8

14

RAB35 BX344673; NM_006861 3,0 4,1 4,2 4,0 4,6 19,8

15

APG-1 AW966019 0,0 6,2 6,2 2,5 4,4 19,4

16

INPP4B AA759168 3,4 3,2 4,4 3,6 4,5 19,1

17

na Al160370 3,6 4,1 2,9 4,6 3,1 18,3

18

N33 NM_006765 4,5 0,0 4,0 4,7 5,0 18,1

19

RPS3A BX343424 1,6 4,5 3,2 3,1 4,3 16,8

20

PSMB7 BM837906 4,0 4,2 2,2 3,1 2,9 16,5

21

GIT2 NM_057169 3,4 4,2 2,3 2,9 3,4 16,1

22

GL AJ420489 4,4 3,2 3,2 2,3 2,9 16,0

23

SOS2 XM_043720 2,1 3,5 2,5 2,3 4,7 15,1

24

L1CAM M77640 3,4 2,9 2,5 2,6 3,6 14,9

25

BRUNOL4 BM671360 2,8 3,8 1,7 2,5 4,1 14,9

26

RRAGA U41654 2,9 4,3 2,4 2,4 2,8 14,8

27

IGFBP2 BC004312 3,9 3,7 2,0 2,5 2,6 14,8

28

SRPK1 BC038292 3,3 2,5 2,8 2,8 3,4 14,8

29

FLJ12649 R41135 1,2 2,8 2,6 3,4 4,5 14,4

30

AGL NM_000028 4,0 2,8 2,6 2,5 2,4 14,3

31

FLJ23468 BX355581 3,0 3,4 3,0 2,1 2,4 13,9

32

MGC4730 BM665147 2,6 2,8 2,6 2,3 3,1 13,4

33

GAB2 NM_012296 3,7 3,4 1,3 2,8 2,2 13,4

34

USP15 AF106069 2,0 3,0 2,4 2,6 3,2 13,1

35

KIAA0657 AB014557 0,0 4,7 2,2 3,0 3,1 13,1

36

C6orf134 Al146643 3,2 0,0 2,5 2,7 4,5 12,8

37

MSCP AK093931 2,5 3,0 4,2 3,0 0,0 12,7

38

ACAA2 D16294 2,1 2,0 3,0 2,6 3,1 12,7

39

PKP4 AI681111 3,2 2,5 2,9 1,7 2,3 12,6

40

RGS5 BX537427 2,0 3,0 1,3 3,4 2,8 12,5

41

CYFIP1 BC005097 2,2 2,1 2,6 1,3 4,0 12,2

42

PLAGL2 AK026951 1,2 2,7 2,3 2,4 3,3 11,9

43

EHD4 AW779971 2,7 2,3 2,3 1,9 2,6 11,9

44

KIAA1666 XM_300791 2,1 2,9 2,4 2,3 2,2 11,9

45

RAP80 BX537376 2,4 2,1 3,0 1,8 2,5 11,7

46

LOC118812 BG537484 0,0 2,3 2,3 3,2 3,7 11,5

47

UTX AF000993 1,0 2,2 2,8 3,2 2,2 11,4

48

PCBP3 AK094301 2,4 2,9 1,3 2,3 2,5 11,4

49

AP3S2 BC002785 2,4 2,3 1,2 2,8 2,3 11,0

50

WINS1 AA741459 1,4 3,0 2,2 2,1 2,2 10,9

51

na(2) AF504647 0,8 2,0 2,1 2,1 3,6 10,7

52

LOC203859 AL832374 2,0 2,6 2,5 3,4 0,0 10,5

53

HNMT NM_006895 2,3 2,0 1,9 2,1 2,2 10,5

54

LOC282965 XM_210833 1,1 2,8 2,0 2,2 2,0 10,1

55

PDK2 AK055119 1,0 2,4 2,2 2,4 2,0 10,0

N/C(3)

ACTB BC053988 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

5
10
15
20
25
30
35
40

(1)

Los conjuntos de sonda se clasifican mediante la suma (*) del valor de cambio múltiplo (IP-ARNm / ARN de entrada) de todas las cinco líneas celulares.

(2)

na : no anotado

(3)

N/C : control negativo

Identificación de la región de unión a ARNm en KOC1
Para determinar la región de KOC1 que se requiere para la unión a ARNm asociados a KOC1, se realizó un análisis de inmunotransferencia tipo Northwestern usando proteínas recombinantes inmunoprecipitadas de mutantes de deleción de KOC1 expresados en células A549 (figura 4a) y ARNm de RAB35 marcado con DIG, que es uno de los ARNm asociados a KOC1. El KOC1DEL3, que carece de cuatro dominios KH, y KOC1DEL5, que carece de dos RRM en el extremo N-terminal y de dos dominios KH en el extremo C-terminal, no se unieron al ARNm de RAB35. Por otra parte, el KOC1DEL4, que es un constructo con sólo los cuatro dominios KH y el KOC1DEL2, un constructo sin dos dominios KH en el extremo C-terminal mostraron afinidades de unión muy débiles por ARNm en comparación con el constructo de KOC1 de longitud completa (figura 4b), lo que sugiere la importancia de dos RRM así como de los dos dominios KH en el extremo C-terminal para la unión a ARNm asociados a KOC1.
Se expresó adicionalmente cinco de los mutantes de deleción de KOC1 en células A549 y se realizaron experimentos de inmunoprecipitación dos veces con los lisados celulares, en primer lugar con anticuerpo monoclonal anti-HA y después con anticuerpo M2 monoclonal anti-FLAG. Usando IP-ARNm, se examinó la capacidad de cada proteína delecionada de unirse a ocho ARNm endógenos (CCT2, SBP2, SLC25A3, RAB35, PSMB7, GL, PKP4 y WINS1) seleccionados de la lista anterior (véase la tabla 2). Los resultados eran completamente concordantes con los del análisis de inmunotransferencia de tipo Northwestern, independientemente de la confirmación de que tanto los dos dominios KH en el extremo C-terminal como los dos RRM en el extremo N-terminal son indispensables para la unión eficaz de KOC1 a ARNm (figura 4c).
Transporte intra e intercelular dependiente de microtúbulos de un complejo de ribonucleoproteínas KOC1-KIF11 y ARNm asociados a KOC1
Para investigar funcionalmente los papeles funcionales de KOC1 y KIF11, se prepararon plásmidos diseñados para expresar ECFP-KOC1 (ciano) y EYFP-KIF11 (amarillo). Entonces se transfectaron los dos plásmidos juntos en células COS-7, y se examinó su localización usando microscopio de vídeo de inmunofluorescencia y microscopia confocal en tiempo real. Las células que expresan tanto KOC1 como KIF11 sobresalen en los procesos y entonces se conectan con células con células adyacentes (datos no mostrados). Una observación más detallada de células vivas encontró que KOC1 había formado un complejo con KIF11 (complejo de RNP KOC1-KIF11; partícula verde) que se transportaba de una célula a otra a través de una estructura ultrafina que conectaba las dos células (figura 5a). El movimiento del complejo KOC1-KIF11 parecía ser unidireccional de una célula a otra.
Además, para examinar si el complejo KOC1-KIF11 podía transportar específicamente ARNm asociados a KOC1 de una célula que tiene un alto nivel de complejo KOC1-RNP a otra que tiene un nivel inferior del complejo, se mezclaron y se cultivaron conjuntamente dos poblaciones de células diferentes; una son las células COS-7 que se habían transfectado con pEGFP-KOC1 (verde) así como también ARNm de RAB35 de longitud completa con Alexa Fluor 546 (rojo), y la otra son células COS-7 primarias simplemente marcadas con CellTracker (azul). Se observó que se transfirieron no sólo partículas KOC1 (verde), sino también partículas RNP de ARNm de KOC1-RAB35 (amarillo) a través de la estructura ultrafina de las células primeras a las últimas (figura 5b). Usando la hibridación in situ en células A549 en las que se sobreexpresaron tanto KOC1 como KIF11, se confirmó adicionalmente que el ARNm de RAB35 endógeno (verde) estaba localizado en las estructuras intercelulares ultrafinas así como también en el citoplasma (datos no mostrados).
También se investigó la ubicación endógena de partículas KOC1 y KIF11 en la estructura ultrafina de microtúbulos que
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puentean células A549 individuales mediante un estudio inmunocitoquímico, usando anticuerpo anti-KOC1 o anti-KIF11 purificado por afinidad como anticuerpo primario e IgG anti-conejo marcado con Alexa 594 como anticuerpo secundario (Molecular Probe) y anticuerpo monoclonal anti-alfa-tubulina-FITC. Las células A549 tratadas con 10 μM del agente que interrumpe los microtúbulos nocodazol (SIGMA) durante cuatro horas mostraron colapso y agregación de KOC1 y KIF11 endógenos, junto con la despolimerización de microtúbulos en el citoplasma. Además, no se encontró ninguna partícula en la estructura residual entre las células. El resultado sugirió la posibilidad de un mecanismo de transporte dependiente de microtúbulos que implica el complejo KOC1-KIF11. Para clarificar adicionalmente el mecanismo detallado mediante el cual el complejo KOC1-KIF11 transporta ARNm en células de NSCLC, se ha(n) buscado otro(s) componente(s) que podrían interaccionar con KIF11. La inmunoprecipitación con anticuerpo policlonal anti-KIF11 usando un liado de células LC319 identificó una proteína 150 kDa, que se determinó más adelante que era una dinactina 1 (DCTNl ; p150, homólogo adherido, Drosophila) mediante análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. DCTN1 es la subunidad más grande de DCTN, que se une a la proteína motora citoplasmática dineína y activa el transporte vesicular a lo largo de los microtúbulos (Holzbaur, E.L. & Tokito, M.K. Genomics 31, 398-399 (1996); Tokito, M.K. et al., MoI. Biol. Cell 7, 1167-1180 (1996)), o se une a KIF11 para participar probablemente en la separación del centrosoma (Blangy, A. et al.,
J. Biol. Chem. 272, 19418-19424 (1997)). Se observó la localización conjunta endógena de KOC1/KIF11 y DCTN1 en la estructura ultrafina entre las células A549 individuales mediante inmunocitoquímica, usando la combinación de anticuerpos policlonales anti-KOC1 o anti-KIF11 purificados por afinidad como anticuerpo primario e IgG anti-conejo marcado con Alexa 488 como anticuerpo secundario, y la combinación de anticuerpo monoclonal anti-DCTN1 (BD transduction Laboratories, n.º 610473) como anticuerpo primario e IgG anti-conejo marcado con anti-Alexa 594 como anticuerpo secundario. Y se confirmó la interacción directa entre KIF11 y DCTN1 endógenos mediante experimentos de inmunoprecipitación con extractos de células A549 y LC319, usando anticuerpo policlonal anti-KIF11 y anticuerpo monoclonal anti-DCTN1 (BD transduction Laboratories, n.º 610473) (figura 6a).
Para demostrar adicionalmente el transporte intercelular dependiente de KIF11 de ARNm, se examinó el efecto de monastrol, el inhibidor permeable a las células que inhibe específicamente la KIF11. Los informes anteriores indicaban que monastrol inhibía parcialmente la actividad ATPasa de KIF11 a través de la unión directamente al dominio motor (DeBonis, S. et al., Biochemistry 42, 338-349 (2003); Kononen, J. et al., Nat. Med. 4, 844-847 (1998)). El tratamiento de células A549 con monastrol 150 μM (SIGMA) durante 24 horas indujo la acumulación de KIF11 endógeno y EYFP-KIF11 exógeno en el centro del monoáster a lo largo de microtúbulos y la detención del ciclo celular en la mitosis con husos acromáticos monopolares, que se denominan “huso acromático monoastral”. El tratamiento de células A549 con 150 μM de monastrol durante 24 horas indujo la detención del ciclo celular de células mitóticas con husos acromáticos monopolares que se denominan “huso acromático monoastral” y también provocó la acumulación de KIF11 endógeno en el centro del monoáster a lo largo de microtúbulos. Por otra parte, la mayor parte de las células no mitóticas perdieron la protrusión en los procesos y entonces perdieron la conexión a células adyacentes en el plazo de 2 horas del tratamiento con monastrol. Otro análisis cuantitativo mediante el recuento del número de estructuras ultrafinas intercelulares (n = 252 estructuras) con microscopio de vídeo con lapso de tiempo demostró que más de la mitad de las conexión entre células en las células no mitóticas sometidas a prueba desaparecieron mediante el tratamiento con monastrol de una hora. Sin embargo, seis horas tras la liberación de las células de la exposición con monastrol, se reconstituyó la formación de puentes intercelulares y se observaron las células en procesos de mitosis normal, lo que indica que KIF11 era indispensable para la formación de estructuras intercelulares ultrafinas (datos no mostrados).
Algunas células perdieron la protrusión en los procesos y entonces no se conectaron con células adyacentes. Una observación más detallada de células vivas encontró que no se transportaba ningún complejo de RNP KOC1-KIF11 (partícula verde) de una célula a otra a través de una estructura ultrafina que conectaba las dos células, que posteriormente desapareció durante la observación.
En este estudio se demostró la interacción endógena de KOC1, KIF11 y DCTN1 en cánceres de pulmón humanos, y se reveló un posible papel de esos complejos en el transporte de ARNm de una célula a otra. DCTN1, la subunidad más grande de DCTN, se une a la proteína motora citoplasmática dineína y activa el transporte vesicular a lo largo de microtúbulos (Holzbaur, E.L. & Tokito, M.K. Genomics 31, 398-399 (1996)). La interacción dineína-DCTN es probablemente un componente clave del mecanismo de transporte axonal de vesículas y orgánulos (Holzbaur, E.L. & Tokito, M.K. Genomics 31, 398-399 (1996); Tokito, M.K. et al., MoI. Biol. Cell 7, 1167-1180 (1996)). La unión de DCTN a dineína es crítica según se notifica para la función neuronal, puesto que los anticuerpos que interrumpen específicamente esta unión, bloquean la movilidad vesicular a lo largo de microtúbulos. Se ha observado la interacción in vitro de DCTN1 y KIF11, y su localización conjunta durante la mitosis (Blangy, A. et al., J. Biol. Chem. 272, 1941819424 (1997)), pero ningún informe ha mostrado un sistema de transporte intercelular que implica este complejo. Puesto que en estos experimentos KIF11, un miembro de la familia de cinesinas, se sobreexpresaba en NSCLC junto con KOC1, se sugiere que la interacción directa de KOC1, KIF11, y DCTN1 podría desempeñar un papel significativo para establecer un alineamiento específico de microtúbulos entre células de cáncer de pulmón.
Síntesis de proteínas mediante ARNm asociados a KOC1 transportados en las células receptoras
Para aclarar si el transporte de ARNm mediante el complejo de RNP KOC1-KIF11 es fisiológicamente relevante (la célula receptora puede sintetizar la proteína mediante la traducción de los ARNm transportados), se construyó un vector de expresión de ARNm de RAB35 longitud completa, una de las dianas de unión del complejo KOC1/KIF11, fusionado en marco a secuencias de proteína EGFP con etiqueta de myc. Entonces se investigó si este ARNm quimérico podría ser transportable de una célula a otra y posteriormente traducirse en la producción de proteínas en la célula receptora. Se transfectaron células COS-7 que expresaban KIF11 y KOC1 con etiqueta de FLAG con constructos con este constructo que expresa ARNm de RAB35 (célula A). Las células COS-7 receptoras de ARNm primarias se tiñeron simplemente con CellTracker (azul; célula B). Se mezclaron estas dos poblaciones celulares juntas y se cultivaron conjuntamente durante 24 horas. En primer lugar se confirmó la transposición intercelular de ARNm de RAB35-EGFP entre las células A y B mediante hibridación in situ usando EGFP antisentido como sonda; tras el cultivo conjunto de las células durante 24 horas, se detectó una tinción débil de ARNm de RAB35-EGFP en la célula B teñida con CellTracker así como también en la estructura ultrafina entre los dos tipos de célula (figura 7a). Entonces se examinó la presencia de las proteínas RAB35 fusionadas a EGFP en las células de tipo B teñidas con CellTracker encontradas usando inmunocitoquímica y microscopía de vídeo con lapso de tiempo, respectivamente (figura 7b y 7c). Durante estas observaciones usando microscopía de vídeo con lapso de tiempo, no se transportó ninguna partícula de proteína EGFP visible desde las células tipo A a las tipo B, pero la proteína EGFP apareció gradualmente en el aparato del citoplasma, lo que parecía ser el retículo endoplasmático (RE) de las células de tipo B (Figure 7d). Estos resultados han indicado que KOC1 y KIF11 deben asociarse de manera funcional con un subconjunto de ARNm, que codifican para proteínas que inducen posiblemente la proliferación y/o adhesión celular, y que la presencia de KOC1 y KIF11 es indispensable para el transporte entre células. Aunque informes previos sugirieron que niveles de KOC1 altos podrían interferir en la traducción de ARNm unidos tales como el líder en la región en 3’ de IGF2, el experimento de la cotransfección de KOC1 y constructos de ARNm de RAB35-ΕGFP de longitud completa juntos en células COS-7 no detectó ninguna disminución de los niveles de proteína fusionada a RAB35-EGFP (figura 7e).
Los experimentos también revelaron la formación de procesos sobresalientes que conectan células adyacentes, y mostraron la distribución conjunta predominante de proteína KOC1 y ARNm de RAB35 transfectados en estructuras intercelulares ultrafinas en dos líneas de células de cáncer de pulmón (A549 y LC319) que expresaban altos niveles de KOC1 y KIF11 endógenos. Por otra parte, no se encontró localización específica de ARNm de RAB35 transfectados en células NCI-H520, que expresan KIF11 pero no KOC1. Esa observación respaldaba la importancia de la activación conjunta de KOC1 y KIF11 para la comunicación entre célula de cáncer. Entre los sistemas de comunicación entre células conocidos en cánceres humanos, la formación de uniones de huecos funcionales entre células de glioma maligno y células endoteliales vasculares parece influir en la angiogénesis en los tumores (Zhang, W. et al., Cancer Res. 59, 1994-2003 (1999); Zhang, W. et al., J. Neurosurg. 98, 846-853 (2003)). Sin embargo, con respecto a los conocimientos, éste es el primer informe para describir el transporte intercelular de ARNm por medio de partículas de ribonucleoproteínas combinadas con proteínas motoras en células somática de mamífero y para evaluar su importancia biológica para la formación de una red intercelular crítica para el crecimiento y la supervivencia de células de cáncer.
(5) Inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a KIF11
La transfección de cualquier plásmido de ARNsi para KIF11 en células A549 (figura 8a) o LC319 (datos no mostrados) suprimió la expresión de ARNm de KIF11 en comparación con células que contenían cualquiera de los tres ARNsi control y la transfección vacía. Según la expresión de ARNm reducida, las células A549 y LC319 mostraron reducciones significativas de la viabilidad celular y el número de colonias medidos mediante ensayos de MTT (figura 8b) y de formación de colonias (datos no mostrados). También se investigó el efecto mediante ARNsi frente a KIF11 sobre el transporte intercelular usando la videoscopía con lapso de tiempo. Se observó un fenómeno similar para el tratamiento con monastrol; algunas células redujeron la protrusión en los procesos y la desaparición de la estructura ultrafina que conectaba las dos células.
Para investigar la importancia funcional de la interacción KOC1-KIF11 para el crecimiento o la supervivencia de células de cáncer de pulmón, se examinó un fragmento de deleción de KOC1 que contenía los dos RRM, que podía interaccionar con KIF11 (KOC1DEL3; figura 3a, b) para determinar una función de supresión negativa dominante de la interacción directa entre KOC1 y KIF11 endógenos. Se transfectaron KOC1DEL3 y plásmido vacío (control) en células LC319 y se detectó la interacción de KOC1DEL3 con KIF11 endógeno. Se verificó además que la sobreexpresión de los dominios RRM reducen la formación de complejo entre KOC1 y KIF11 mediante inmunoprecipitación (figura 9a, b). De manera esperada, la transfección del fragmento dio como resultado reducciones dependientes de la dosis significativas de la viabilidad celular tal como se midió mediante el ensayo de MTT (P < 0,001, KOC1DEL3 frente a vacío figura 9c). También se confirmó que la transfección del constructo que contenía sólo dominios KH control no tiene efecto sobre la proliferación.
Además, para investigar la importancia funcional de la interacción de KOC1-KIF11 para el crecimiento o la supervivencia de células de cáncer de pulmón, se examinó un fragmento de deleción de KOC1, que carecía de los dos dominios KH en el extremo C-terminal indispensables para la unión a ARNm , pero podía interaccionar con KIF11 (KOC1DEL2; figura 3a, b), para determinar una función de supresión negativa dominante de la interacción directa entre KOC1 y KIF11 endógenos. Se transfectaron KOC1DEL2 y plásmido vacío (control) en células A549 y se detectó la interacción de KOC1DEL2 con KIF11 endógeno (figura 9d). se verificó además mediante inmunoprecipitación que la sobreexpresión de KOC1DEL2 reducía la formación de complejo entre KOC1 y KIF11 endógenos (figura 9e). De manera esperada, la transfección del fragmento negativo dominante dio como resultado reducciones dependientes de la dosis significativas de la viabilidad celular tal como se midió mediante el ensayo de MTT (P = 0,0006, KOC1DEL2 frente a vacío; figura 9f).
También se examinó algún(algunos) papel(es) biológico(s) de estos ARNm que transportan KIF11 para controlar el crecimiento o la supervivencia celular de células de cáncer de pulmón, se construyó un plásmido para expresar ARNsi frente a RAB35 (si-RAB35), que se identificó como los ARNm asociados al complejo KOC1-RNP. La transfección de los plásmidos (si-RAB35) en células A549 suprimió significativamente la expresión de RAB35 endógeno en comparación con los controles, y dio como resultado reducciones significativas de la viabilidad celular el número de colonias medidos mediante ensayos de MTT y de formación de colonias (figura 10a, b).
Asociación de la sobreexpresión de KOC1 y KIF11 con el mal pronóstico de pacientes con NSCLC
Se realizó un análisis inmunohistoquímico con anticuerpos policlonales anti-KOC1 y anti-KIF11 usando microalineamientos de tejido que consistían en 265 tejidos de NSCLC (figura 11a). De los 265 casos, la tinción de KOC1 fue positiva para 172 (64,9%); 129 casos fueron positivos para KIF11 (48,7%). El patrón de expresión de KOC1 era significativamente concordante con la expresión de KIF11 en estos tumores (X2 =60,8, P < 0,0001). Entonces se cuestionó si la sobreexpresión de KOC1 y/o KIF11 podría estar asociada con los resultados clínicos. Se encontró que la expresión de KOC1 en NSCLC estaba significativamente asociada con el estado de factor pT (X2 = 23,1, P < 0,0001) y con la supervivencia de 5 años específica de tumor (P = 0,0115 mediante la prueba Log-rank) (figura 11b, panel superior). La expresión de KIF11 en NSCLC estaba significativamente asociada con el factor pT (X2= 15,0, P < 0,0001), factor pN (X2 = 4,4, P = 0,0356), y supervivencia de 5 años (P = 0,0008 mediante la prueba de Log-rank) (figura 11b, panel inferior). Mediante el análisis de única variable, pT, pN, género y expresión de KOC1/KIF11 estaban cada uno relacionados significativamente con una mala supervivencia específica de tumor entre pacientes con NSCLC. Además, se determino que KOC1 y KIF11 eran factores de pronóstico independientes mediante análisis de múltiples variables usando un modelo de riesgo proporcional Cox (P = 0,0499 y P = 0,0259, respectivamente).
(6) Selección de receptores candidatos para NMU en NSCLC
Los dos receptores de NMU conocidos, NMU1R (FM3/GPR66) y NMU2R (FM4) desempeñan papeles importantes en la homeostasis energética (Fujii, R. et al., J. Biol. Chem. 275: 21068-21074 (2000); Howard, A.D. et al., Nature 406: 70-74 (2000); Funes, S. et al., Peptides 23: 1607-1615 (2002)). NMU1R está presente en muchos tejidos humanos periféricos (Fujii, R. et al., J. Biol. Chem. 275: 21068-21074 (2000); Howard, A.D. et al., Nature 406: 70-74 (2000); Funes, S. et al., Peptides 23: 1607-1615 (2002)), pero NMU2R está ubicado sólo en el cerebro. Para investigar si los genes NMU1R y NMU2R se expresaban en NSCLC, se analizó la expresión de estos receptores de NMU en pulmón y cerebro normales humanos, en líneas de células de NSCLC y en tejidos clínicos mediante experimentos de RT-PCR semicuantitativa. No se detectó ninguna de las expresiones de NMU1R ni NMU2R en ninguna de las muestras clínicas o líneas celulares examinadas, aunque se expresó NMU1R en pulmón y NMU2R en el cerebro (datos no mostrados), lo que sugiere que NMU podría estar mediando el crecimiento de las células de cáncer de pulmón a través de la interacción con otro(s) receptor(es).
Puesto que NMU2R y NMU1R se aislaron en principio como homólogos de GPCR neuropeptídicos conocidos, se especula que el(los) receptor(es) no identificado(s) es(son) miembro(s) de la misma familia que mostraría algún grado de homología con NMU1R/NMU2R. Por tanto, se buscaron receptores de NMU candidatos usando el programa BLAST. Los resultados y sus altos de niveles de expresión en NSCLC en los datos de perfil de expresión de los presentes inventores indicaron que GHSR1b (NM_004122; SEC ID Nº: 3 y 4) y NTSR1 (NM_002531 ; SEC ID Nº: 5 y 6) eran buenos candidatos. GHSR tiene dos transcritos, tipos 1a y 1b. El ADNc de tipo 1a humano de longitud completa codifica para un polipéptido predicho de 366 aminoácidos con siete dominios transmembrana, una característica típica de receptores acoplados de proteínas G. Un intrón individual divide su marco de lectura abierta en dos exones que codifica para dominios transmembrana 1-5 y 6-7, colocando de ese modo el GHSR1a en la clase que contiene intrones de GPCR. El tipo 1b es una variante de ARNm sin corte y empalme transcrita a partir de un exón individual que codifica para un polipéptido de 289 aminoácidos con cinco dominios transmembrana. El análisis de RT-PCR semicuantitativa que usa cebadores específicos para cada variante indicó que GHSR1a no se expresaba en NSCLC. Por otra parte, GHSR1b y NTSR1 se expresaban en un nivel relativamente alto en algunas líneas de células de NSCLC, pero de ninguna manera en pulmón normal (figura 13a). El producto GHSR1b tiene 46% de homología con NMU1R, y NTSR1 codifica para 418 aminoácidos con 47% de homología con NMU1R.
(7) Identificación de receptores candidato para NMU en NSCLC
Para confirmar la interacción directa entre NMU y GHSR1b/NTSR1, se transfectaron de manera transitoria células COS7 con plásmidos diseñados para expresar GHSR1b o NTSR1 con etiqueta de FLAG, y se cultivaron en presencia de NMU-25 marcada con rodamina. Entonces se examinó la localización de GHSR1b/NTSR1 con etiqueta de FLAG y NMU-25-rodamina en las células usando anticuerpos anti-FLAG conjugados con FITC, y se encontró que NMU-25 y cualquiera de los dos receptores están ubicados juntos en la membrana celular (figura 13c). La localización conjunta de NMU-25 con estos receptores no se observó en ensayos control que implican cualquiera de las siguientes combinaciones ligando/célula: 1) NMU-25-rodamina incubada con células COS-7 que no se transfectaron con ninguno de los plásmidos de receptor; 2) células COS-7 no transfectadas incubadas sin NMU-25-rodamina; y 3) células COS-7 transfectadas con cualquiera de los plásmidos de receptor, pero incubadas sin NMU-25-rodamina. El resultado se confirmó mediante citometría de flujo, que reveló la unión de NMU-25 marcada con rodamina a la superficie de células COS-7 que expresaban cualquiera de los dos receptores (figura 13d) y la unión de NMU-25 marcada con rodamina a la superficie de células COS-7 de una manera dependiente de la dosis.
(8) Expresión de GHSR1b en tejidos humanos normales
Ya que la expresión de GHSR1b en tejidos humanos normales no se notificó de manera precisa en ese momento, se determinó la distribución de GHSR1b usando transferencia tipo Northern de tejido múltiple humano. La transferencia tipo Northern con ADNc de GHSR1b como sonda identificó un transcrito de 0,9 kb como banda de señal muy débil en comparación con un transcrito de 1,1 kb de GHSR1a, observado en corazón, hígado, músculo esquelético, páncreas y estómago, entre los 23 tejidos humanos normales examinados (figura 13b).
Para confirmar adicionalmente la unión de NMU-25 a los GHSR1b y NTSR1 endógenos en las células de NSCLC, se realizó un ensayo de unión receptor-ligando usando las células LC319 y PC-14 tratadas con NMU-25. Se detectó la unión de NMU-25 marcada con Cy5 a la superficie de estas dos líneas celulares que expresaban los dos receptores, pero apenas expresaban NMU1R/NMU2R (figura 13e).
Se ha notificado que los ligandos biológicamente activos para GPCR se unen específicamente a sus receptores cognados y provocan un aumento de mensajeros secundarios tales como Ca2+ intracelular y niveles de AMPc. Por tanto, se determinó la capacidad de NMU de inducir estos mensajeros secundarios en células LC319 a través de su interacción con GHSR1b/NTSR1. Se observó la producción de AMPc, pero no el flujo de Ca2+ en células LC319, que expresaban tanto GHSR1b como NTSR1, de una manera dependiente de la dosis de NMU-25, cuando las células se cultivaron en presencia de NMU-25 en concentraciones finales de 3-100 M en el medio de cultivo. Los resultados demuestran que las células de NSCLC expresan GHSR1b/NTSR1 funcional (figura 13f, panel izquierdo). Se confirmó que este efecto era específico de NMU-25 añadiendo otros ligandos notificados para GHSR1b/NTSR1, GHRL o NTS (figura 13f, panel derecho). Además, GHRL y NTS provocaron la respuestas de movilización de calcio intracelular en células LC319 (datos no mostrados), lo que sugiere una variedad de función para GHSR1b y/o NTSR1 mal entendidos.
(9) Inhibición del crecimiento de células de NSCLC mediante ARNsi frente a GHSR/NTSR1
Adicionalmente se examinó la importancia biológica de la interacción del receptor de NMU en la carcinogénesis pulmonar usando plásmidos diseñados para expresar ARNsi frente a GHSR o NTSR1 (si-GHSR-1, si-NTSR1-1, y siNTSR1-2). La transfección de cualquiera de estos plásmidos en células A549 o LC319 suprimió la expresión del receptor endógeno en comparación con las células que contenían cualquiera de los tres ARNsi control (figura 14a). Según la expresión reducida de los receptores, las células A549 y LC319 mostraron reducciones significativas de la viabilidad celular (figura 14b) y el número de colonias (datos no mostrados). Estos resultados respaldan fuertemente la posibilidad de que NMU, mediante la interacción con GHSR1b y NTSR1, podría desempeñar un papel muy significativo en el desarrollo/evolución de NSCLC.
Identificación de genes situados secuencia abajo de NMU
Para aclarar adicionalmente la ruta de señalización de NMU e identificar genes situados secuencia abajo regulados por NMU, se transfectó ARNsi frente a NMU (si-NMU) o LUC (ARNsi control) en células LC319 que habían sobreexpresado NMU y se monitorizaron las regulaciones por disminución en la expresión génica usando un microalineamiento de ADNc que contenía 32.256 genes. Entre cientos de genes detectados mediante este método, se realizó un análisis de agrupamiento de mapa autoorganizado (SOM) para seleccionar adicionalmente genes candidatos. El agrupamiento de SOM es un método de extracción y visualización de datos desarrollado en un principio por Kohonen (Kohonen, T. (1990). The self-organizing map. IEEE 78, 1464-1480.) y aplicado al análisis de datos de expresión génica a partir de microalineamientos. El método de agrupamiento es similar al agrupamiento de k-medias (Kaech, S. M. ,et al., (2002). Cell 111, 837-851.) pero difiere en que los genes se dividen en grupos basándose en los patrones de expresión, y las relaciones entre grupos se ilustran mediante dos mapas dimensionales. Los genes que pasaron este filtro de variación se agruparon en 5 x 4 SOM.
Se seleccionó inicialmente 70 genes usando el análisis de agrupamiento de SOM, cuya intensidad disminuyó significativamente según la reducción de la expresión de NMU (Figure 15a). El análisis de RT-PCR semicuantitativa confirmó la reducción de transcritos candidatos de una manera dependiente del tiempo en células LC319 transfectadas con si-NMU, pero no con ARNsi control para LUC (figura 15b). También se confirmó que estos transcritos estaban regulados por incremento más de dos 2 veces en células LC319 que expresaban NMU exógeno, en comparación con los de tejidos de pulmón normales. Se evaluó la sobreexpresión de estos genes según la expresión de NMU así como en líneas celulares y tejidos de cáncer de pulmón (datos no mostrados). Finalmente se identificaron 6 genes diana NMU candidatos, que cumplieron los criterios de selección anteriores; FOXM1, FLJ42024, GCDH, CDK5RAP1, LOC134145 y NUP188 (figura 15b).
Se elevaron significativamente los niveles de ARNm de FOXM1 en cánceres de pulmón en comparación con tejidos de pulmón normales y su expresión mostró buena concordancia con NMU y dos receptores parar NMU, GHSR1b y NTSR1, mientras que la función de FOXM1 en la carcinogénesis sigue siendo incierta. Por tanto, se eligió FOXM1 para análisis adicionales. Para determinar la inducción específica de FOXM1 mediante la señalización de receptor-ligando de NMU, se cultivaron células LC319 que expresaban GHSR1b y NTSR1 en presencia de NMU-25 o BSA (control) en concentraciones finales de 100 M en los medios de cultivo. Las células tratadas con NMU-25 mostraron expresión superior de FOXM1 en comparación con las células control (figura 15c). Además, también se confirmó que FOXM1 estaba regulado por incremento en células LC319 que expresaban NMU exógena, en comparación con el de las células control transfectadas con vector vacío (datos no mostrados).
Entonces se examinó la importancia biológica de la activación de FOXM1 mediante la señalización de NMU para determinar el crecimiento o la supervivencia de células de cáncer de pulmón, usando plásmidos diseñados para expresar ARNsi frente a FOXM1 (si-FOXM1). La transfección de si-FOXM1 en células A549 o LC319 suprimió la expresión del FOXM1 endógeno en comparación con las células que contenían cualquiera de los tres ARNsi control (figura 16a y 16b). Según la expresión reducida de FOXM1, las células A549 y LC319 mostraron reducciones significativas de la viabilidad celular y el número de colonias (figura 16a y b). Estos resultados demuestran fuertemente que NMU, mediante la interacción con GHSR1b/NTSR1 y posterior activación de sus dianas situadas secuencia abajo, tales como FOXM1, podría afectar significativamente al crecimiento de células de cáncer de pulmón.
Los datos de microalineamiento de células LC319 tratadas con ARNsi para NMU presentados en la presente memoria demostraron que la ruta de señalización de NMU podría afectar a la promoción de células de cáncer de pulmón mediante la transactivación de un conjunto de genes situados secuencia abajo que implican transcritos cuyos productos de proteína pueden actuar como factor de transcripción y pueden controlar el crecimiento celular o participar en la transducción de señal. Se proporcionan pruebas de que el factor de transcripción de FOXM1 es una diana situada secuencia abajo de la señalización de NMU mediante ensayos biológicos adicionales. Se sabía que FOXM1 se sobreexpresaba en varios tipos de cánceres humanos (Teh, M. T. et al., Cancer Res. 62, 4773-4780.; van den Boom, J. et al., (2003). Am. J. Pathol. 163, 1033-1043.; Kalinichenko, V.V. et al., (2004). Genes. Dev. 18, 830-850). La familia de genes de “cabeza de tenedor”, identificada en un principio en Drosophila, comprende factores de transcripción con un motivo de unión a ADN de 100 aminoácidos conservado y se ha demostrado que desempeña papeles importantes en la regulación de la expresión de genes implicados en el crecimiento, la proliferación, la diferenciación, la longevidad y la transformación celular. Los ensayos de cotransfección en la línea de células HepG2 de hepatoma humano demostraron que la proteína FOXM1 estimulaba la expresión de tanto la ciclina B1 (CCNB1) como ciclina D1 (CCND1) (Wang, X. et al., (2002). Proc. Nat. Acad. Sci. 99, 16881-16886.), lo que sugiere que estos genes de ciclina son dianas de transcripción de FOXM1 directa y que FOXM1 controla la red de transcripción de genes que son esenciales para la división celular y salen de la mitosis. Debe notarse que se observó la activación de CCNB1 en la mayor parte de una serie de NSCLC examinados y su buena concordancia de la expresión con FOXM1 (datos no mostrados). Por otra parte, también se demostró que p27 (Kip1) y p19 (Arf) (CDKN2A) interaccionan con FOXM1 e inhiben la actividad transcripcional de FOXM1 (Kalinichenko, V.V. et al., (2004). Genes. Dev. 18, 830-850). La promoción del crecimiento celular en células de NSCLC mediante NMU podría reflejar la transactivación de FOXM1, que en consecuencia afectaría a la función de esas rutas moleculares.
Mediante análisis inmunohistoquímico en microalineamiento de tejidos se detectó un aumento de la expresión de proteína NMU en la mayoría de muestras de NSCLC (SCC, ADC, LCC y BAC) y SCLC, pero no en tejidos de pulmón normal. Puesto que NMU es una proteína secretada y la mayor parte de las muestras clínicas de NSCLC usadas para este análisis estaban en una fase temprana y operable, NMU podría servir como biomarcador para el diagnóstico de cáncer de pulmón en fase temprana, en combinación con biopsia transbronquial fibroscópica (TBB) o análisis de sangre.
En resumen, se ha demostrado que NMU y dos receptores recientemente desarrollados para esta molécula, GHSR1b y NTSR1, probablemente desempeñan un papel esencial para una ruta de promoción de crecimiento autocrino en NSCLC modulando la transcripción de genes diana situados secuencia abajo. Los datos notificados en la presente memoria sugieren fuertemente la posibilidad de diseñar nuevos fármacos anticancerígenos, específicos para el cáncer de pulmón, que seleccionan como diana la ruta de NMU-GHSR1b/NTSR1. También sugieren un potencial para los propios ARNsi de interferir con este ruta, como enfoque novedoso para el tratamiento de cánceres de pulmón avanzados, resistentes a la quimioterapia.
Aplicabilidad industrial
La expresión de genes humanos KIF11, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 se eleva notablemente en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tal como se compara con tejidos de pulmón normales. Por consiguiente, estos genes pueden usarse de manera conveniente como marcadores de diagnóstico de NSCLC y las proteínas codificadas por los mismos pueden usarse en ensayos de diagnóstico de NSCLC.
Los presentes inventores han demostrado también que la expresión de KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1 promueve el crecimiento celular mientras que el crecimiento celular se suprime mediante ARN de interferencia pequeños correspondientes al gen KIF11, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1. Estos hallazgos muestran que cada una de las proteínas KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 y FOXM1 estimulan la actividad oncogénica. Así, cada una de estas oncoproteínas es una diana útil para el desarrollo de compuestos farmacéuticos anticancerígenos. Por ejemplo, pueden encontrar utilidad terapéutica agentes que bloquean la expresión de KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, o previenen su actividad, como agentes anticancerígenos, particularmente agentes anticancerígenos para el tratamiento de NSCLC. Los ejemplos de tales agentes incluyen oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia pequeños y ribozimas frente al gen KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1, y anticuerpos que reconocen al polipéptido KIF11, KOC1, GHSR1b, NTSR1 o FOXM1.
Aunque la invención se ha descrito en detalle y con referencia a realizaciones específicas de la misma, será evidente para un experto en la técnica que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones en la misma.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. UNIVERSIDAD DE TOKIO
<120> MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR CÁNCER DE PULMÓN DE CÉLULAS NO PEQUEÑAS
<130> ONC-A0401P
<150> DOCUMENTO US 60/555.789
<151> 23-03-2004
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<223> Una secuencia diana para ARNsi
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Claims (36)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para diagnosticar cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) o una predisposición a desarrollar cáncer de pulmón de células no pequeñas en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen asociado a cáncer de pulmón de células no pequeñas en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que un aumento de dicho nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen indica que dicho sujeto padece o está en riesgo de desarrollar NSCLC, en el que dicho gen asociado a NSCLC es KIF11.

2. 2.

   Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho aumento es al menos 10% mayor que dicho nivel de control normal.

3. 3.

   Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho método comprende además determinar el nivel de expresión de una pluralidad de genes asociados a NSCLC.

4. 4.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho nivel de expresión se determina mediante un método cualquiera seleccionado del grupo que consiste en:

   (1)

   detectar ARNm del gen asociado a NSCLC;

   (2)

   detectar la proteína codificada por el gen asociado a NSCLC; y

   (3)

   detectar la actividad biológica de la proteína codificada por el gen asociado a NSCLC.

5. 5.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho nivel de expresión se determina detectando la hibridación de una sonda de gen asociado a NSCLC con un transcrito génico de dicha muestra biológica derivada del paciente.

6. 6.

   Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha etapa de hibridación se lleva a cabo en un alineamiento de ADN.

7. 7.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha muestra biológica comprende esputo o sangre.

8. 8.

   Método in vitro para identificar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, que comprende las etapas de:

   (1)

   poner en contacto una célula de prueba que expresa dicho gen asociado a NSCLC con un compuesto de prueba;

   (2)

   detectar el nivel de expresión de dicho gen asociado a NSCLC; y

   (3)

   determinar el compuesto que suprime dicho nivel de expresión en comparación con un nivel de control normal de dicho gen,

   en el que dicho gen asociado a NSCLC es KIF11 y dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

9. 9.

   Método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha célula de prueba es una célula de NSCLC.

10. 10.

    Método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (1)

    poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido de KIF11,

    (2)

    detectar la actividad de unión entre el polipéptido y el compuesto de prueba; y

    (3)

    seleccionar un compuesto que se une al polipéptido.

11. 11. Método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (a)

    poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido codificado por un polinucleótido de KIF11;

    (b)

    detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a); y

    (c)

    seleccionar un compuesto que suprime la actividad biológica del polipéptido de KIF11 en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de prueba

    en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

12. 12.

    Método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha actividad biológica es la actividad de proliferación

    celular.

13. 13.

    Método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (1)

    poner en contacto un compuesto de prueba con un célula que expresa KIF11; y

    (2)

    seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de KIF11, en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.

14. 14.

    Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha célula es una célula de NSCLC.

15. 15.

    Método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (1)

    poner en contacto un compuesto de prueba con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional de KIF11 y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora transcripcional;

    (2)

    medir la actividad de dicho gen indicador; y

    (3)

    seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho gen indicador, tal como se compara con un control,

    en el que dicho compuesto es para su uso para tratar o prevenir NSCLC.
16. 16. Método in vitro para seleccionar un compuesto para tratar o prevenir NSCLC, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (1)

    poner en contacto un polipéptido de KIF11 o equivalente funcional del mismo con polipéptido de KOC1 o equivalente funcional del mismo en presencia de un compuesto de prueba;

    (2)

    detectar la unión entre los polipéptidos; y

    (3)

    seleccionar el compuesto de prueba que inhibe la unión entre los polipéptidos.

17. 17.

    Método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el equivalente funcional de polipéptido de KIF11 comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a KOC1.

18. 18.

    Método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el equivalente funcional de polipéptido de KOC1 comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a KIF11.

19. 19.

    Método in vitro para medir la actividad de transporte de ARN de un polipéptido, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (a)

    poner en contacto un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    i.

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

    ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

    iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    con un ARN que va a transportarse y en la condición que puede formar el transportador de ARN;

    (b)

    detectar el nivel del ARN transportado; y

    (c)

    medir la actividad de transporte de ARN correlacionando el nivel del ARN transportado de la etapa (b) con la actividad de transporte de ARN.

20. 20.

    Método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la condición que puede formar el transportador de ARN se proporciona en la existencia del polipéptido de KOC1 o equivalente funcional del mismo.

21. 21.

    Método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el equivalente funcional del polipéptido de KOC1 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    (i)

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 (KOC1);

    (ii)

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105;

    (iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 105; y

    (iv) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 104, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105;
22. 22. Método in vitro para identificar un agente que modula la actividad de transporte de ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:

    (a)

    poner en contacto el agente con un polipéptido selecccionado del grupo que consiste en:

    i.

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

    ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

    iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    con un ARN que va a transportarse y en la condición que puede formar el transportador de ARN;

    (b)

    detectar el nivel del ARN transportado; y

    (c)

    comparar el nivel del ARN transportado con un nivel de control en ausencia del agente indicando un aumento o disminución del nivel del ARN transportado en comparación con el nivel de control que el compuesto de prueba modula la actividad de transporte de ARN.

23. 23. Kit para detectar una actividad de un compuesto de prueba para regular la actividad de transporte de ARN, comprendiendo dicho kit una célula aislada que expresa los componentes de a a d, y un medio de cultivo que soporta el crecimiento celular,

    (a)

    un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    i.

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11);

    ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 2; y

    iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

    (b)

    un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    i.

    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105 (KOC1);

    ii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105, en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan o insertan, y dicho polipéptido tiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105;

    iii. un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de homología con SEC ID Nº: 105; y

    iv. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 104, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 105; y

    (c)

    un ARN que va a transportarse; y

    (d)

    DCTN1.

24. 24. Uso de

    (i)

    una composición antisentido, comprendiendo dicha composición una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia codificante de KIF11;

    (ii)

    una composición de ARNsi que comprende un ARNsi, en el que dicha composición reduce la expresión de KIF11; o

    (iii) un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un polipéptido codificado por KIF11;

    para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto.

25. 25.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el ARNsi es una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEC ID Nº: 32, 33 y 34 como secuencia diana.

26. 26.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el ARNsi tiene la fórmula general 5'-[A]-[B]-[A']-3'

    en la que [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 32, 33 y 34; [B] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos; y [A'] es una secuencia de ribonucleótidos complementaria a [A].

27. 27.

    Uso de un polipéptido codificado por KIF11 o un fragmento inmunológicamente activo de dicho polipéptido, o un polinucleótido que codifica para el polipéptido para la preparación de una vacuna para tratar o prevenir NSCLC en un sujeto.

28. 28.

    Molécula bicatenaria que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en la que la cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de KIF11 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 32, 33 y 34, y en la que la cadena antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es complementaria a dicha cadena sentido, hibridando dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido una con otra para formar dicha molécula bicatenaria, e inhibiendo dicha molécula bicatenaria, cuando se introduce en una célula que expresa un gen KIF11, la expresión de dicho gen, siendo además la molécula bicatenaria un oligonucleótido de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.

29. 29.

    Molécula bicatenaria de acuerdo con la reivindicación 28, siendo dicha molécula bicatenaria un único transcrito de ribonucleótidos que comprende la cadena sentido y la cadena antisentido unidas por medio de una secuencia de ribonucleótidos monocatenaria.

30. 30.

    Vector que codifica para la molécula bicatenaria según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29.

31. 31.

    Vector de acuerdo con la reivindicación 30, codificando el vector para un transcrito que tiene una estructura secundaria y comprende la cadena sentido y la cadena antisentido.

32. 32.

    Vector de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el transcrito comprende además una secuencia de ribonucleótidos monocatenaria que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido.

33. 33.

    Vector de acuerdo con la reivindicación 32, en el que dicho polinucleótido tiene la fórmula general

    5'-[A]-[B]-[A']-3'

    en la que [A] es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 32, 33 y 34; [B] es una secuencia de nucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos; y [A'] es una secuencia de nucleótidos complementaria a [A].

34. 34.

    Composición farmacéutica que comprende un ARNsi frente al gen KIF11, en la que el ARNsi comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 32, 33 y 34 como secuencia diana y que tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.

35. 35.

    Método para predecir un pronóstico de NSCLC, comprendiendo el método las etapas de:

    5 (a) detectar el nivel de expresión de KIF11 en una muestra recogida de un sujeto cuyo pronóstico de NSCLC va a predecirse, e

    (b) indicar un mal pronóstico cuando se detecta una elevación del nivel de expresión de KIF11.
36. 36. Método de acuerdo con la reivindicación 35, en el que el nivel de expresión se detecta mediante uno cualquiera del método seleccionado del grupo que consiste en:

    10 (a) detectar el ARNm que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11),

    (b)

    detectar la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11), y

    (c)

    detectar la actividad biológica de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (KIF11).