ES2359567T9 - Anticuerpo humanizado específico para el factor de necrosis tumoral-alfa. - Google Patents
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Description
Anticuerpo humanizado específico para el factor
de necrosis tumoral-\alpha.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
humanizado específico para el factor de necrosis
tumoral-\alpha humano definido en la
reivindicación 1.
El factor de necrosis
tumoral-\alpha humano (de aquí en adelante
denominado como "hTNF-\alpha") es un
homotrímero que consiste en tres subunidades proteicas de 17 kDa
(Eck M. J. et al., JBC, 267:
2119-2122, 1992; Smith R. A. et al.,
JBC, 262: 6951-6954, 1987). El
hTNF-\alpha es una citoquina inflamatoria
secretada de macrófagos y monocitos y funciona como transmisor de
señales en varias reacciones celulares tales como necrosis y
apoptosis (Beyaert R. et al., FEBS Lett., 340:
9-16, 1994). El
h-TNF-\alpha causa una acción
proinflamatoria que produce destrucción de tejido, tal como rotura
de cartílago y hueso (Saklatvala, Nature, 322:
547-549, 1986), inducción de moléculas de adhesión,
inducción de actividad de procoagulación en células vasculares
endoteliales (Pober JS et al., J. Immunol., 136;
1680-1687, 1986) y aumento en la adherencia de
neutrófilos y linfocitos (Pober et al, J. Immunol.
138: 3319-3324, 1987). Además, se ha sabido que el
hTNF-\alpha desempeña un papel importante en un
mecanismo de defensa contra enfermedades infecciosas y tumores
(Fiers W., FEBS Lett., 285: 199-212,
1991).
El hTNF-\alpha está implicado
en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones
bacterianas, cánceres y enfermedades degenerativas. Entre estas
enfermedades el hTNF-\alpha se ha considerado como
una proteína diana útil para un tratamiento fisiológico específico
de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica, y
espondilitis anquilosante.
Mientras tanto, también se ha sugerido usar un
inhibidor de hTNF-\alpha para el propósito de
tratar artritis reumatoide. Se ha descrito que
hTNF-\alpha se sobreexpresa en las células
sinoviales aisladas de la articulación reumatoide de fase temprana
(Buchan G. et al., Clin. Exp. Immunol., 73:
449-455, 1988) y las citoquinas relacionadas con
lesiones de artritis reumatoide disminuyen cuando las células
sinoviales anteriores se tratan con un anticuerpo monoclonal
anti-hTNF-\alpha (Butler D. M.
et al., Eur. Cytokine Netw., 6:
225-230, 1995). Además, se ha encontrado que un
anticuerpo anti-hTNF-\alpha o un
receptor recombinante soluble de hTNF-\alpha
suprimen la inflamación y destrucción de una articulación en un
modelo de artritis inducida por colágeno en ratón (Piguet P. F.
et al., Immunology, 77: 510-514, 1992;
Wooley P. H. et al., J Immunol., 151:
6602-6607, 1993; Williams R. O. et al.,
Immunology, 84: 433-439, 1995). Además, se ha
observado que la artritis inflamatoria se induce en un ratón
transgénico que sobreexpresa hTNF-\alpha (Keller
J. et al., EMBO J., 10: 4025-4031,
1991).
Estos resultados indican que
hTNF-\alpha desempeña un papel importante como un
regulador directo o indirecto que controla las citoquinas
inflamatorias en la artritis reumatoide. Según esto, ha habido una
necesidad para desarrollar un anticuerpo monoclonal que tenga gran
selectividad y reactividad hacia hTNF-\alpha para
el fin de tratar artritis
reumatoide.
reumatoide.
En general, un anticuerpo que tiene gran
selectividad y reactividad hacia un antígeno específico se prepara
mediante la inmunización de un ratón con el antígeno (Kohler G.
& Milstein C., Nature, 256; 495-497,
1975). Un anticuerpo monoclonal de ratón es ventajoso en que es
fácil preparar el anticuerpo y seleccionar un anticuerpo que tenga
gran reactividad. Sin embargo, también tiene un problema que se
forma un anticuerpo anti-ratón en un cuerpo humano
cuando se administra durante un tiempo largo (Dimaggio J. J., et
al., Cancer Chemother. Biol. Response Modif., 11:
177-203, 1990).
Para superar las propiedades indeseables de los
anticuerpos monoclonales de ratón, se ha desarrollado un anticuerpo
humanizado sustituyendo las regiones marco excepto los sitios de
unión al antígeno con las de un anticuerpo humano. Como un método
para preparar tal anticuerpo humanizado, actualmente se emplea un
método de injerto de CDR (región determinante de
complementariedad), en donde solo se injertan las CDR de un
anticuerpo de ratón en un anticuerpo humano. El anticuerpo
humanizado preparado mediante injerto de CDR tiene la ventaja de
reducir las respuestas inmunes in vivo (Riechmann, et
al., Nature, 332: 323, 1988; Nakatani et al.,
Protein Engineering, 7: 435, 1994), sin embargo, con
frecuencia pierde la gran selectividad y reactividad del anticuerpo
de ratón original (Carter P., et al., Proc. Natl. Acad Sci
USA, 89: 4285-4289, 1992).
Este es efectivamente el caso para el anticuerpo
monoclonal de ratón humanizado
anti-hTNF-\alpha descrito por
Wang y col. que, cuando se compara con el anticuerpo monoclonal
original anti TNF\alpha humano tiene capacidades neutralizantes
reducidas (Wang et al., Journal of Immunological methods,
171-184, 2000).
Los presentes inventores se han esforzado para
superar tales problemas del anticuerpo humanizado convencional y
han desarrollado un nuevo anticuerpo humanizado que se une
específicamente a hTNF-\alpha, que muestra una
afinidad de unión al antígeno similar a la del anticuerpo monoclonal
de ratón original e inmunogenicidad minimizada.
Según esto, la presente invención
proporciona:
1. Un anticuerpo humanizado específico para el
factor de necrosis tumoral-\alpha humano
(hTNF-\alpha), que comprende: a) una región
variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 36, 37 o 38; b) una región variable de la cadena
ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o 40;
c) una región constante de la cadena pesada idéntica a la de un
anticuerpo humano; y d) una región constante de la cadena ligera
idéntica a la de un anticuerpo humano.
2. El anticuerpo humanizado de 1, en donde la
afinidad de unión al antígeno (Kd) del anticuerpo varía desde 1 x
10^{-9} M hasta 1 x 10^{-13} M.
3. El anticuerpo humanizado de 1, en donde la
constante de disociación (K_{off}) del anticuerpo varía desde 1 x
10^{-6} s^{-1} hasta 1 x 10^{-9} s^{-1}, que se determina
mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR).
4. El anticuerpo humanizado de 1, en donde la
región variable de la cadena pesada del anticuerpo está codificada
por un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31,
32 o 33.
5. El anticuerpo humanizado de 1, en donde la
región variable de la cadena ligera del anticuerpo está codificada
por un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o
35.
6. Un vector de expresión para el anticuerpo
humanizado específico para hTNF-\alpha de 1, que
comprende un ADN que codifica una región variable de la cadena
pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37
o 38 y un ADN que codifica una región variable de la cadena ligera
que tiene una secuencia de aminoácidos de secuencia SEQ ID NO: 39 o
40.
7. Una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo humanizado de cualquiera de 1 a 5, para tratar una
enfermedad relacionada con hTNF-\alpha,
seleccionada del grupo que consiste en: artritis reumatoide,
enfermedad de Crohn, artritis psoriásica, psoriasis, septicemia,
asma, granulomatosis de Wegener, inflamación y espondilitis
anquilosante.
Los anteriores y otros objetos y características
de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente
descripción de la invención, cuando se toma junto con las figuras
acompañantes, que respectivamente muestran:
Fig. 1: Comparación de las secuencias de
aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (TSK114 H) de
un anticuerpo monoclonal de ratón que se une específicamente a
TNF-\alpha (SEQ ID NO: 47), subgrupo 1 de cadena
pesada (Hh1) de un anticuerpo humano (SEQ ID NO: 48) y las cadenas
pesadas (TNHV2, TNHV2k y TNHV1k) de los anticuerpos humanizados de
la presente invención (SEQ ID NO: 36 a 38);
Fig. 2: Comparación de las secuencias de
aminoácidos de la cadena ligera (TSK114 L) de un anticuerpo
monoclonal de ratón que se une específicamente a
TNF-\alpha (SEQ ID NO: 49), subgrupo 1 de cadena
ligera (Hk1) de un anticuerpo humano (SEQ ID NO: 50) y las cadenas
ligeras (TNLV2 y TNLV2d) de los anticuerpos humanizados de la
presente invención (SEQ ID NO: 39 y 40);
Fig. 3: Diagrama esquemático que muestra el
proceso para preparar el vector pHAB-TNHV2 HF que
expresa la cadena pesada del anticuerpo humanizado inventivo;
Fig. 4: Diagrama esquemático que muestra el
proceso para preparar el vector pHAB-TNHV2k HF que
expresa la cadena pesada del anticuerpo humanizado inventivo;
Fig. 5: Diagrama esquemático que muestra el
proceso para preparar el vector pHAB-TNHV1k HF que
expresa la cadena pesada del anticuerpo humanizado inventivo;
Fig. 6: Diagrama esquemático que muestra el
proceso para preparar el vector pHAB-TNLV2 LF que
expresa la cadena ligera del anticuerpo humanizado inventivo;
Fig. 7: Diagrama esquemático que muestra el
proceso para preparar el vector pHAB-TNLV2d LF que
expresa la cadena ligera del anticuerpo humanizado inventivo;
Fig. 8: Resultado de SDS-PAGE
del anticuerpo humanizado inventivo producido en una célula animal y
purificado después de ello; y
Fig. 9: Gráfico que muestra las afinidades de
unión para TNF-\alpha de un anticuerpo monoclonal
de ratón y los anticuerpos humanizados inventivos.
En los anticuerpos humanizados de la presente
invención, las CDR de las regiones variables de la cadena pesada y
ligera de los mismos derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón, y
las regiones marco excepto para las CDR así como las regiones
constantes de la cadena pesada y ligera derivan de un anticuerpo
humano. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado inventivo muestra
una afinidad de unión al antígeno (Kd) varía desde 1 x 10^{-9} M
hasta 1 x 10^{-13} M. Además, la constante de disociación
(K_{off}) del anticuerpo humanizado inventivo varía desde 1 x
10^{-6} s^{-1} hasta 1 x 10^{-9} s^{-1}, cuando se
determina mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR).
El anticuerpo humanizado de la presente
invención se puede preparar mediante un método de injerto de CDR a
partir del anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 (números de acceso
del depósito: KCTC 10514BP y KCTC 10515BP) específico para
hTNF-\alpha, en donde la región variable de la
cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 comprende
tres CDR de SEQ ID NO: 41 a 43 y la región variable de la cadena
ligera, tres CDR de SEQ ID NO: 44 a 46.
Primero, las secuencias de aminoácidos de las
regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del
anticuerpo monoclonal de ratón se comparan con secuencias humanas en
la base de datos GenBank y se seleccionan el subgrupo 1 de la
región variable de la cadena pesada humana (Hh1) definido por Kabat
que tiene la mayor similitud de secuencia a la cadena pesada del
anticuerpo de ratón, y el subgrupo 1 de la región variable de la
cadena ligera kappa humana (Hk1) que tiene la mayor similitud a la
cadena ligera del anticuerpo de ratón (Harris L. & Bajorath J.,
Protein Science, 4; 306-310, 1995).
Los genes que codifican las cadenas pesada y
ligera del anticuerpo humanizado se pueden amplificar usando estos
genes humanos seleccionados como moldes. En este procedimiento, cada
una de las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas
pesada y ligera del anticuerpo humanizado se puede modificar en base
a la información de estudios genéticos bien conocidos y análisis
estructurales de anticuerpos. Además, si ciertos residuos de
aminoácidos del anticuerpo monoclonal de ratón afectan a la afinidad
de unión al antígeno o son importantes para mantener la estructura
del anticuerpo, es preferible conservar las secuencias de
nucleótidos que codifican los residuos de aminoácidos sin
modificación (Kabat E.A. et al., D.H.H.S. número de
publicación (NIH) 91-3242, 1991; Chothia C.
et al., Nature, 342; 877-883, 1989;
Studnicka G.M. et al., Protein Engineering, 7;
805-814, 1994; Harris L. & Bajorath J.,
Protein Science, 4; 306-310, 1995).
Se puede preparar un gen que codifica la región
variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado sustituyendo
las regiones marco excepto el sitio de unión al antígeno en la
región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de
ratón TSK114 que se une específicamente a
hTNF-\alpha con el subgrupo 1 de cadena pesada
(Hh1) de un anticuerpo humano. Se puede preparar tal gen que
codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo
humanizado mediante los pasos de: diseñar cebadores para humanizar
el anticuerpo monoclonal de ratón usando el gen que codifica la
cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 como molde;
realizar PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando los
cebadores correspondientes; y ligar entre sí los productos de PCR
así amplificados usando enzimas de restricción y ADN ligasa. Los
genes que codifican la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo humanizado preparado de esta manera se han designado
TNHV2 (SEQ ID NO: 31), TNHV2k (SEQ ID NO: 32) y TNHV1k (SEQ ID NO:
33), que codifican los polipéptidos que tienen las secuencias de
aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37 y 38, respectivamente (véase la
Fig. 1).
Para preparar un gen que codifique la cadena
pesada de longitud completa del anticuerpo humanizado incluyendo el
gen que codifica la región variable de la cadena pesada humanizada,
se inserta el gen TNHV2, TNHV2k o TNHV1k en un vector apropiado,
por Ejemplo, un vector TOPO (kit de clonación TOPO TA, Invitrogen,
EE UU), para preparar vectores de expresión
pCR-TNHV2 Hv, pCR-TNHV2k Hv y
pCR-TNHV1k Hv. Se aísla un fragmento génico que
codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo
humanizado del vector de expresión pCR-TNHV2 Hv,
pCR-TNHV2k Hv o pCR-TNHV1k Hv y se
inserta en el vector pHAB-HC (número de acceso del
depósito: KCTC 10229BP; Publicación de la patente coreana accesible
al público No: 2004-12266) que contiene el gen que
codifica la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo
humano, para obtener el vector de expresión de la cadena pesada del
anticuerpo humanizado. Los vectores de expresión preparados de esta
manera se han designado pHAB-TNHV2 HF,
pHAB-TNHV2k HF y pHAB-TNHV1k
HF.
Los transformantes de E. coli TOP10F'
transformados con los vectores de expresión
pHAB-TNHV2 HF y pHAB-TNHV2k HF se
depositaron el 1 de septiembre de 2004 en la colección Coreana para
Cultivos Tipo (KCTC) (Dirección: Instituto de Investigación de
Biociencia y Biotecnología de Corea (KRIBB), #52,
Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,
305-333, República de Corea) con los números de
acceso KCTC 10691BP y KCTC 10692BP, respectivamente, y un
transformante de E. coli TOP10F' transformado con el vector
de expresión pHAB-TNHV1k HF se depositó el 13 de
junio de 2005 con la KCTC con el número de acceso KCTC 10818BP,
según los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos a los fines de
procedimientos en materia de patentes.
Los genes que codifican la cadena pesada de
longitud completa del anticuerpo humanizado se pueden aislar de los
vectores de expresión de la cadena pesada pHAB-TNHV2
HF, pHAB-TNHV2k HF y pHAB-TNHV1k HF,
y se han designado TNHV2 HF, TNHV2k HF y TNHV1k HF,
respectivamente.
Se puede preparar un gen que codifica la región
variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado sustituyendo
las regiones marco excepto el sitio de unión al antígeno en la
región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de
ratón TSK114 que se une específicamente a
hTNF-\alpha con el subgrupo 1 de cadena ligera
(Hk1) de un anticuerpo humano. Se puede preparar tal gen que
codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo
humanizado mediante los pasos de: diseñar cebadores para humanizar
el anticuerpo monoclonal de ratón usando el gen que codifica la
cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 como molde;
realizar PCR usando los cebadores correspondientes; y ligar entre
sí los productos de PCR así amplificados usando enzimas de
restricción y ADN ligasa. Los genes que codifican la región variable
de la cadena ligera del anticuerpo humanizado preparado de esta
manera se han designado TNLV2 y TNLV2d, que codifican los
polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:
39 y 40, respectivamente (véase la Fig. 2).
Para preparar un gen que codifique la cadena
ligera de longitud completa del anticuerpo humanizado incluyendo el
gen que codifica la región variable de la cadena ligera humanizada,
se inserta el gen TNLV2 o TNLV2d en un vector apropiado, por
Ejemplo, un vector TOPO, para preparar vectores de expresión
pCR-TNLV2 Lv y pCR-TNLV2d Lv. Se
aísla un fragmento génico que codifica la región variable de la
cadena ligera del anticuerpo humanizado del vector de expresión
pCR-TNLV2 Lv o pCR-TNLV2d Lv y se
inserta en el vector pHAB-KC (número de acceso del
depósito: KCTC 10230BP; Publicación de la patente coreana accesible
al público No: 2004-12268) que contiene el gen que
codifica la región constante de la cadena ligera de un anticuerpo
humano, para obtener el vector de expresión de la cadena ligera del
anticuerpo humanizado. Los vectores de expresión preparados de esta
manera se han designado pHAB-TNLV2 LF y
pHAB-TNLV2d LF.
Un transformante de E. coli TOP10F'
transformado con el vector de expresión pHAB-TNLV2
LF se depositó el 1 de septiembre de 2004 con la KCTC con el número
de acceso KCTC 10690BP, y un transformante de E. coli
TOP10F' transformado con el vector de expresión
pHAB-TNLV2d LF se depositó el 13 de junio de 2005
con la KCTC con el número de acceso KCTC 10817BP, según los
términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos a los fines de
procedimientos en materia de patentes.
Los genes que codifican la cadena ligera de
longitud completa del anticuerpo humanizado se pueden aislar de los
vectores de expresión de la cadena ligera pHAB-TNLV2
LF y pHAB-TNLV2d LF, y se han designado TNLV2 LF y
TNLV2d LF, respectivamente.
Se pueden transformar líneas de células CHO con
el vector de expresión de la cadena pesada humanizada
pHAB-TNHV2 HF y el vector de expresión de la cadena
ligera humanizada pHAB-TNLV2 LF usando una solución
de transformación apropiada tal como GenePORTER (GTS, EE UU) para
obtener un transformante que produzca el anticuerpo humanizado
específico para hTNF-\alpha, y el transformante se
ha designado CHO-YHB1406. Además, se puede preparar
otro transformante usando el vector de expresión de la cadena
pesada humanizada pHAB-TNHV2k HF y el vector de
expresión de la cadena ligera humanizada pHAB-TNLV2
LF o pHAB-TNLV2d LF según el mismo método descrito
anteriormente. Estos transformantes se han designado
CHO-YHB1411 y
CHO-YHB1411-2. Además, se puede
preparar otro transformante usando el vector de expresión de la
cadena pesada humanizada pHAB-TNHV1k HF y el vector
de expresión de la cadena ligera humanizada
pHAB-TNLV2d LF según el mismo método descrito
anteriormente, y se ha designado
CHO-YHB1406-2.
Para purificar el anticuerpo humanizado de la
presente invención de las líneas celulares transformantes, se puede
cultivar el transformante CHO-YHB1406,
CHO-YHB1411,
CHO-YHB1411-2 o
CHO-YHB1406-2 en un medio de cultivo
apropiado, y se puede someter el sobrenadante del cultivo a
cromatografía en columna usando proteína A (Amersham Bioscience,
Suecia) o inmunoglobulina G anti-humana de cabra
(Zymed Laboratories Inc., EE UU). Los anticuerpos humanizados
purificados de esta manera se han designado YHB1406, YHB1411,
YHB1411-2 e YHB1406-2,
respectivamente.
Se puede determinar la afinidad de unión al
antígeno del anticuerpo humanizado mediante, por Ejemplo, ELISA
competitivo, ELISA en fase sólida o resonancia de plasmón de
superficie. Los anticuerpos humanizados YHB1406, YHB1411,
YHB1411-2 e YHB1406-2 que se unen
específicamente a hTNF-\alpha muestran afinidades
de unión al antígeno que varían desde 1 x 10^{-9} M hasta 1 x
10^{-13} M, lo que demuestra que los anticuerpos humanizados de
la presente invención tienen actividades de unión al antígeno
similares a las del anticuerpo monoclonal de ratón original,
mientras que muestran inmunogenicidad significativamente reducida y
por tanto, se pueden usar eficazmente para tratar enfermedades
relacionadas con hTNF-\alpha. Además, la constante
de disociación (K_{off}) del anticuerpo humanizado inventivo
determinada por SPR varía desde 1 x 10^{-6} s^{-1} hasta 1 x
10^{-9} s^{-1}, lo que refleja un grado muy bajo de disociación
del complejo antígeno-anticuerpo.
Para este propósito, el anticuerpo humanizado de
la presente invención se puede usar como un principio activo en una
composición farmacéutica para tratar una enfermedad relacionada con
hTNF-\alpha tal como artritis reumatoide,
enfermedad de Crohn, artritis psoriásica, psoriasis, septicemia,
asma, granulomatosis de Wegener, inflamación y espondilitis
anquilosante.
Las composiciones de la presente invención se
pueden formular de modo que se proporcione una liberación rápida,
sostenida o retrasada del principio activo después de la
administración a un paciente empleando cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica. La composición puede
comprender excipientes, diluyentes, rellenos, disgregantes,
edulcorantes, lubricantes y sabores farmacéuticamente aceptables. La
composición farmacéutica preferiblemente se formula para la
administración intravenosa, mediante inyección intravenosa rápida o
infusión intravenosa sostenida, o para la liberación de una cápsula
implantada. Una formulación típica para la administración
intravenosa utiliza solución salina fisiológica como diluyente.
La dosis del anticuerpo realmente administrada a
un paciente se debe determinar a la luz de varios factores
relevantes incluyendo el anticuerpo específico a ser administrado,
el tiempo de administración y la formulación en la composición, vía
de administración, la enfermedad a ser tratada, y el peso corporal,
edad, género, estado de salud y dieta de un paciente. Una dosis
típica puede variar desde 0,01 mg/kg/día hasta 1.000 mg/kg/día. Más
típicamente, la dosis puede variar desde 0,1 mg/kg/día hasta 10
mg/kg/día.
Se pretende que los siguientes Ejemplos ilustren
adicionalmente la presente invención sin limitar su ámbito.
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Ejemplo
1
Se llevó a cabo PCR usando como molde un gen que
codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal de ratón TSK114 (números de acceso de depósito: KCTC
10514BP y KCTC 10515BP) específico para TNF-\alpha
y un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 14, para amplificar el gen
A que codifica la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo humanizado que lleva una secuencia líder. El producto de
PCR amplificado se sometió a electroforesis en un gel de agarosa y
se recuperó del gel usando el kit de extracción QIAgel
(Qiagen,
EE UU).
EE UU).
El gen A obtenido de esta manera se sometió a
PCR con un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 7 o SEQ ID NO: 6 y 14
para amplificar fragmentos de ADN, y se realizó una PCR solapante
usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 1 y 14. El producto de PCR amplificado se incubó con el
vector TOPO (kit de clonación TOPO TA, Invitrogen Inc., EE UU) a
temperatura ambiente durante 45 minutos para ser clonado, y el
vector clonado se transformó en E. coli TOP10F' (Invitrogen
Inc., EE UU). Después de incubar las E. coli transformadas
en medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, el plásmido se
aisló de las E. coli, y se digirió con EcoRI (BioLabs
Inc., EE UU) para preparar el gen B de alrededor de 450 pb que
codifica la región variable de la cadena
pesada.
pesada.
Se llevó a cabo la PCR usando el gen B como
molde y un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 9 o SEQ ID NO: 8 y 14
para amplificar fragmentos de ADN, y se llevó a cabo una PCR
solapante usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de
cebadores de SEQ ID NO: 1 y 14. De la misma manera que se ha
descrito anteriormente, el producto de PCR amplificado se clonó en
un vector TOPO y se digirió con EcoRI para preparar un gen C
que codifica la región variable de la cadena pesada.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el gen C se sometió a PCR con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 1 y 11 o SEQ ID NO: 10 y 14 para amplificar fragmentos de
ADN y se realizó una PCR solapante usando los fragmentos de ADN
resultantes con un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 14. El
producto de PCR amplificado de esta manera se clonó en un vector
TOPO para obtener el gen D que codifica la región variable de la
cadena pesada. El gen D se sometió a PCR con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 4 y 14 o SEQ ID NO: 1 y 5 para amplificar fragmentos de
ADN y se realizó una PCR solapante usando los fragmentos de ADN
resultantes con un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 14. De la
misma manera que se ha descrito anteriormente, el producto de PCR
amplificado de esta manera se clonó en un vector TOPO para obtener
un gen E que codifica la región variable de la cadena pesada.
Además, se llevó a cabo PCR usando el gen E como
molde y un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 3 o SEQ ID NO: 2 y 14
para amplificar fragmentos de ADN y se realizó una PCR solapante
usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 1 y 14. De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el producto de PCR se clonó en un vector TOPO para
obtener el gen TNHV2 (SEQ ID NO: 31) que codifica la región variable
de la cadena pesada y el vector TOPO con TNHV2 insertado se designó
pCR-TNHV2
Hv.
Hv.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, se llevó a cabo PCR usando TNHV2 como molde y un par
de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 13 o SEQ ID NO: 12 y 14 para
amplificar fragmentos de ADN y se realizó una PCR solapante usando
los fragmentos de ADN resultantes con un par de cebadores de SEQ ID
NO: 1 y 14. El producto de PCR se clonó en un vector TOPO para
obtener otro gen que codifica la región variable de la cadena
pesada. El gen se designó TNHV2k (SEQ ID NO: 32) y el vector TOPO
con el gen TNHV2k insertado se designó
pCR-TNHV2k
Hv.
Hv.
Además, de la misma manera que se ha descrito
anteriormente, se llevó a cabo PCR usando el gen TNHV2k como molde
y un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 15, y el producto de PCR se
clonó en un vector TOPO para obtener aún otro gen que codifica la
región variable de la cadena pesada. El gen se designó TNHV1k (SEQ
ID NO: 33) y el vector TOPO con TNHV1k insertado se designó
pCR-TNHV1k Hv.
Los pares de cebadores y condiciones de reacción
empleados en cada reacción de PCR se muestran en la Tabla 1. Cada
reacción de PCR se realizó en las siguientes condiciones de 30
ciclos como se muestra en la Tabla 1 después de una
desnaturalización inicial de 7 minutos a 95ºC, y una extensión final
de 10 minutos a 72ºC.
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Ejemplo
2
Para construir el gen que codifica la cadena
pesada de longitud completa usando el gen que codifica la región
variable de la cadena pesada insertada en el vector
pCR-TNHV2 Hv preparado en el Ejemplo 1, se empleó el
vector pHAB-HC (KCTC 10229BP, publicación de
patente coreana accesible al público No. 2004-12266)
que contiene el gen que codifica la región constante de la cadena
pesada del anticuerpo humano.
Primero, para insertar el gen TNHV2 que codifica
la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado en
el vector de expresión pHAB-HC,
pCR-TNHV2 Hv se trató con HindIII/ApaI
(BioLabs, Inc., EE UU) a 37ºC durante 2 horas, se sometió a
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se tiñó con bromuro de
etidio (EtBr), y se observó un fragmento del gen de alrededor de
450 pb.
Además, pHAB-HC se trató con
HindIII/ApaI, se sometió a electroforesis y se tiñó, y se
observó un fragmento del vector digerido de alrededor de 6,5 kb.
Después de ello, los fragmentos génicos observados se recuperaron
de los geles usando un kit de extracción QIAgel (Qiagen, EE UU), se
trataron con ADN ligasa de T4 (BioLabs, Inc., EE UU) a 16ºC durante
la noche y se transformaron en E. coli TOP10F' para obtener
un transformante. El transformante se cultivó en un medio LB
suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina durante la noche, y se
aisló un plásmido del mismo. El plásmido aislado se trató con
HindIII/NotI y se sometió a electroforesis en gel de
agarosa, para obtener un gen de cadena pesada de longitud completa
de alrededor de 1,4 kb del anticuerpo humanizado.
El gen de la cadena pesada de longitud completa
del anticuerpo humanizado preparado de esta manera se designó TNHV2
HF. Además, el vector de expresión con TNHV2 HF insertado se designó
pHAB-TNHV2 HF (Fig. 3) y se transformó en E.
coli TOP10F' para obtener un transformante, que se depositó el 1
de septiembre de 2004 en la colección Coreana para Cultivos Tipo
(KCTC) (dirección: Instituto de Investigación de Biociencia y
Biotecnología de Corea (KRIBB), #52, Oun-dong,
Yusong-ku, Taejon, 305-333,
República de Corea) con el número de acceso KCTC 10691BP.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, también se preparó el gen de longitud completa de la
cadena pesada del anticuerpo humanizado usando los genes TNHV2k o
TNHV1k, y los genes de la cadena pesada de longitud completa del
anticuerpo humanizado preparados de esta manera se designaron TNHV2k
HF o TNHV1k HF, respectivamente. Además, el vector de expresión de
la cadena pesada del anticuerpo humanizado con el gen de la cadena
pesada de longitud completa, TNHV2k HF o TNHV1k HF, insertado se
designó pHAB-TNHV2k HF o pHAB-TNHV1k
HF (Figs. 4 y 5), respectivamente, y la E. coli TOP10F'
transformada con pHAB-TNHV2k HF o
pHAB-TNHV1k HF se depositó el 1 de septiembre de
2004 o el 13 de junio de 2005, respectivamente, en la Colección
Coreana para Cultivos Tipo (KCTC) con los números de acceso KCTC
10692BP y KCTC 10818BP, respectivamente.
Ejemplo
3
Se llevó a cabo PCR usando como molde el gen que
codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo
monoclonal de ratón TSK114 que reconoce específicamente
TNF-\alpha y un par de cebadores de SEQ ID NO: 16
y 30, para amplificar un gen A que codifica la región variable de la
cadena ligera que contiene una secuencia líder. El gen A se sometió
a electroforesis en gel de agarosa y tinción con EtBr y se recuperó
del gel usando un kit de extracción QIAgel.
El gen A purificado de esta manera se sometió a
PCR con un par de cebadores de SEQ ID NO: 16 y 25 o SEQ ID NO: 24 y
30 para amplificar fragmentos de ADN y se llevó a cabo una PCR
solapante usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de
cebadores de SEQ ID NO: 16 y 30. El producto de PCR amplificado se
incubó con el vector TOPO (kit de clonación TOPO TA, Invitrogen
Inc., EE UU) a temperatura ambiente durante 45 minutos y el vector
clonado se transformó en E. coli TOP10F' para obtener un
transformante. Después de incubar el transformante en medio LB que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina durante la noche, el plásmido
se aisló de E. coli y se digirió con EcoRI (BioLabs
Inc., EE UU) para obtener el gen B de alrededor de 400 pb que
codifica la región variable de la cadena ligera.
Se realizó PCR usando el gen B como molde y un
par de cebadores de SEQ ID NO: 26 y 30 o SEQ ID NO: 16 y 27 para
amplificar fragmentos de ADN y se llevó a cabo una PCR solapante
usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 16 y 30. De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el producto de PCR amplificado se clonó en un vector
TOPO y se digirió con EcoRI para preparar el gen C que
codifica la región variable de la cadena ligera.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el gen C se sometió a PCR con un par de cebadores de
SEQ ID NO: 16 y 23 o SEQ ID NO: 22 y 30 para amplificar fragmentos
de ADN y se llevó a cabo una PCR solapante usando los fragmentos de
ADN resultantes con un par de cebadores de SEQ ID NO: 16 y 30. De la
misma manera que se ha descrito anteriormente, el producto de PCR
amplificado de esta manera se clonó en un vector TOPO para obtener
el gen D que codifica la región variable de la cadena ligera.
Se obtuvo el gen E que codifica la región
variable de la cadena ligera realizando PCR usando el gen D como
molde con un par de cebadores de SEQ ID NO: 18 y 30 o SEQ ID NO: 16
y 19 para amplificar fragmentos de ADN y se llevó a cabo una PCR
solapante usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de
cebadores de SEQ ID NO: 16 y 30. De la misma manera que se ha
descrito anteriormente, el producto de PCR amplificado de esta
manera se clonó en un vector TOPO.
Se obtuvo el gen F que codifica la región
variable de la cadena ligera realizando PCR usando el gen E como
molde con un par de cebadores de SEQ ID NO: 20 y 30 o SEQ ID NO: 16
y 21 para amplificar fragmentos de ADN y se llevó a cabo una PCR
solapante usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de
cebadores de SEQ ID NO: 16 y 30. De la misma manera que se ha
descrito anteriormente, el producto de PCR amplificado de esta
manera se clonó en un vector TOPO.
Además, se realizó PCR usando el gen F como
molde y un par de cebadores de SEQ ID NO: 28 y 30 o SEQ ID NO: 16 y
29 para amplificar fragmentos de ADN y se llevó a cabo una PCR
solapante usando los fragmentos de ADN resultantes con un par de
cebadores de SEQ ID NO: 16 y 30. De la misma manera que se ha
descrito anteriormente, el producto de PCR se clonó en el vector
TOPO para obtener el gen TNLV2 (SEQ ID NO: 34) que codifica la
región variable de la cadena ligera, y el vector TOPO con el gen
TNLV2 insertado se designó pCR-TNLV2 Lv.
Además, de la misma manera que se ha descrito
anteriormente, se llevó a cabo PCR usando TNHV2 como molde y un par
de cebadores de SEQ ID NO: 16 y 17 para amplificar un fragmento de
ADN y el fragmento se sometió a PCR usando un cebador de SEQ ID NO:
30 como un megacebador para obtener un gen que codifica la región
variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado. El gen se
designó TNLV2d (SEQ ID NO: 35) y el vector TOPO con TNLV2d
insertado se designó pCR-TNLV2d Lv.
Los pares de cebadores y las condiciones de PCR
empleadas en las reacciones de PCR anteriores se describen en la
siguiente Tabla 2. Cada una de las reacciones de PCR se realizó en
las condiciones de 30 ciclos como se muestra en la Tabla 2 después
de una desnaturalización inicial de 7 minutos a 95ºC, y una
extensión final de 10 minutos a
72ºC.
72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para construir el gen que codifica la cadena
ligera de longitud completa humanizada usando el gen que codifica
la región variable de la cadena ligera insertado en el vector
pCR-TNLV2 Lv preparado en el Ejemplo 3, se empleó
el vector de expresión pHAB-KC (KCTC 10230BP,
publicación de patente coreana accesible al público No.
2004-12268) que contiene el gen que codifica la
región constante de la cadena ligera del anticuerpo humano.
Primero, para insertar el gen TNLV2 que codifica
la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado en
el vector de expresión pHAB-KC,
pCR-TNLV2 Lv se trató con
HindIII/BsiWI (BioLabs, Inc., EE UU) a 37ºC durante 2
horas, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se
tiñó con bromuro de etidio (EtBr) y se observó una fragmento del
gen de alrededor de 400 pb.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el vector de expresión pHAB-KC
también se trató con HindIII/BsiWI y se observó un
fragmento del vector digerido de alrededor de 6,5 kb. Después de
ello, los fragmentos génicos observados se recuperaron de los geles
usando un kit de extracción QIAgel (Qiagen, EE UU), se trataron con
ADN ligasa de T4 (BioLabs, Inc., EE UU) a 16ºC durante la noche y se
transformaron en E. coli TOP10F' para obtener un
transformante. El transformante se cultivó en un medio LB
suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina durante la noche, y se
aisló un plásmido del medio de cultivo. El plásmido aislado se trató
con HindIII/NotI (BioLabs, Inc., EE UU) y se sometió
a electroforesis en gel de agarosa, para obtener un gen de cadena
ligera de longitud completa de alrededor de 0,7 kb del anticuerpo
humanizado.
\newpage
El gen de la cadena ligera de longitud completa
del anticuerpo humanizado preparado de esta manera se designó TNLV2
LF. Además, el vector de expresión con TNLV2 LF insertado se designó
pHAB-TNLV2 LF (Fig. 6) y se transformó en E.
coli TOP10F' para obtener un transformante, que se depositó el 1
de septiembre de 2004 en la colección Coreana para Cultivos Tipo
(KCTC) con el número de acceso KCTC 10690BP.
De la misma manera que se ha descrito
anteriormente, se preparó un gen de la cadena ligera de longitud
completa usando el gen TNLV2d y el gen de la cadena ligera de
longitud completa del anticuerpo humanizado preparado de esta
manera se designó TNLV2d LF. Además, el vector de expresión con
TNLF2d LF insertado se designó pHAB-TNLV2d LF (Fig.
7) y se transformó en E. coli TOP10F' para obtener un
transformante, que se depositó el 13 de junio de 2005 en la
colección Coreana para Cultivos Tipo (KCTC) con el número de acceso
KCTC
10817BP.
10817BP.
Ejemplo
5
Para medir la actividad del anticuerpo
humanizado en células animales, el vector de expresión de la cadena
pesada pHAB-TNHV2 HF preparado en el Ejemplo 2 y el
vector de expresión de la cadena ligera pHAB-TNLV2
LF preparado en el Ejemplo 4 se transfectaron en la línea celular
CHO (ATCC CRL-9096, EE UU) como sigue.
Primero, se hicieron crecer células CHO en medio
DMEM/F12 (JHR Inc., EE UU) suplementado con 2,0 g/l de bicarbonato
de sodio (Sigma, EE UU) y SBF al 10% inactivado por
calor(Gibco BRL, EE UU) en un incubador con CO_{2} a 37ºC
humidificado durante 2 a 3 días. Las células cultivadas se
recogieron centrifugando la solución de cultivo a 1.200 rpm y
temperatura ambiente (25ºC) durante 5 minutos, se tiñeron con
az\mul de tripán al 0,4% (Gibco BRL, EE UU) y se contaron con un
hematocitómetro. Las células se sembraron en una botella
T-75 en una cantidad de alrededor de 3x10^{5}
células para ser subcultivadas.
Las células CHO sembradas se dejaron proliferar
hasta que ocuparon la superficie de la botella a una densidad del
60 al 90%. Se mezclaron 10 \mug de pHAB-TNHV2 HF,
10 \mug de pHAB-TNLV2 y 80 \mul de solución
GenePORTER (GTS, EE UU) para transfección con 5 ml de medio
DMEM/F12 (sin suero). Después de mantener la mezcla a temperatura
ambiente durante 10 a 45 minutos, el medio de cultivo se retiró de
la botella y las células CHO subcultivadas se incubaron con la
mezcla en un incubador con CO_{2} a 37ºC humidificado durante 3 a
5 horas, para obtener un transfectante designado
CHO-YHB1406.
Según la misma manera que se ha descrito
anteriormente, el vector de expresión de la cadena pesada
pHAB-TNHV2k HF y el vector de expresión de la
cadena ligera pHAB-TNLV2 LF, el vector de expresión
de la cadena pesada pHAB-TNHV2k HF y el vector de
expresión de la cadena ligera pHAB-TNLV2d LF, o el
vector de expresión de la cadena pesada pHAB-TNHV1k
HF y el vector de expresión de la cadena ligera
pHAB-TNLV2d LF, que se prepararon en los Ejemplos 2
y 4, respectivamente, se transfectaron en células CHO para obtener
transfectantes, que se designaron CHO-YHB1411,
CHO-YHB1411-2 y
CHO-YHB1406-2, respectivamente.
Ejemplo
6
Las células transfectantes
CHO-YHB1406 obtenidas en el Ejemplo 5 se sembraron
en una botella T-75 que contenía medio DMEM/F12
suplementado con suero bovino fetal al 10% en una cantidad de
2x10^{5} células, y la botella se incubó en un incubador con
CO_{2} a 37ºC humidificado durante 7 días para expresar el
anticuerpo humanizado. El medio de cultivo se recogió, se
centrifugó y se filtró para obtener una solución de cultivo sin
células que comprendía anticuerpos.
Para purificar el anticuerpo humanizado de la
solución, se emplearon columnas de flujo rápido de sepharosa 4
conjugada con proteína A (Pharmacia) e inmunoglobulina G
anti-humana de cabra (Zymed Laboratories Inc., EE
UU), respectivamente. El medio de cultivo que comprendía los
anticuerpos se aplicó a una columna de flujo rápido de sepharosa 4
conjugada a proteína A para dejar que el anticuerpo humanizado se
uniera a la proteína A, y se introdujo en la columna un tampón de
glicina (pH 2,5) para eluir el anticuerpo humanizado. Después, el
eluido se neutralizó mezclándolo con Tris-HCl 1 M
(pH 8,0) en una relación en volumen de 1:10, y se sometió a una
columna de flujo rápido de sepharosa 4 conjugada con IgG
anti-humana de cabra para permitir que la columna
capturara específicamente la proteína del anticuerpo.
El anticuerpo humanizado se eluyó según el mismo
método que se ha descrito anteriormente, y el anticuerpo humanizado
purificado se designó YHB1406.
Según la misma manera que se ha descrito
anteriormente, se cultivaron los transfectantes
CHO-YHB1411,
CHO-YHB1411-2 y
CHO-YHB1406-2, preparados en el
Ejemplo 5, y los anticuerpos producidos por los mismos se
purificaron, respectivamente, para obtener los anticuerpo
humanizados purificados designados YHB1411,
YHB1411-2 e
YHB-1406-2, respectivamente.
Como resultado de analizar los anticuerpos
humanizados purificados con SDS-PAGE, se observaron
bandas de alrededor de 50 kDa y alrededor de 25 kDa, que se
identificaron como la cadena pesada y la cadena ligera del
anticuerpo humanizado, respectivamente (Fig. 8).
Ejemplo
7
Los anticuerpos humanizados purificados en el
Ejemplo 6 se cuantificaron con ELISA competitivo, y sus actividades
de unión al antígeno se analizaron usando un
hTNF-\alpha recombinante (Biosource, EE UU). Para
la cuantificación del anticuerpo, se añadieron 100 ng de
inmunoglobulina G.A.M. anti-humana de cabra (Zymed
Laboratories, Inc., EE UU) en cada pocillo de una microplaca
(Dynatech Laboratories Inc., EE UU) y la placa se mantuvo a 4ºC
durante la noche para recubrirla con la inmunoglobulina. En este
momento, se usó el anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 como
control.
Para medir la afinidad de unión al antígeno del
anticuerpo humanizado al antígeno hTNF-\alpha
recombinante, se mezclaron soluciones del antígeno (100 \mul de
cada una) a varias concentraciones que variaban desde 10^{-11} a
10^{-7} M con 5 ng de anticuerpo monoclonal de ratón TSK114,
anticuerpos humanizados YHB1406, YHB1411, YHB1411-2
e YHB1406-2, respectivamente y se hicieron
reaccionar a 37ºC durante 2 horas. Cada uno de los reactivos se
añadió a la placa recubierta con 0,4 \mug del antígeno y la placa
se mantuvo a 37ºC durante alrededor de 1,5 horas. Se diluyó un
anticuerpo policlonal de cabra anti-humano (BioRad,
EE UU) conjugado con peroxidasa de rábano a una relación 1:1000 y
se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la solución de anticuerpo
diluido. La placa se mantuvo a 37ºC durante 1 hora. Después de
terminar la reacción, se midió la densidad óptica de cada pocillo
usando un kit substrato de peroxidasa de rábano (BioRad, EE UU).
Se calcularon las concentraciones del anticuerpo
unido al antígeno y del anticuerpo sin unir a partir de las
densidades ópticas medidas, y se determinó la afinidad de unión al
antígeno de los anticuerpos humanizados a partir de ellas (Friguet
B. et al., J. Immunol. Meth., 77:
305-319, 1985). Los resultados se muestran en la
Tabla 3 y la Figura 9.
Como se puede ver en la Tabla 3 y la Figura 9,
las afinidades de unión al antígeno de los anticuerpos humanizados
YHB1406, YHB1411, YHB1411-2 e
YHB1406-2 eran similares a la del anticuerpo
monoclonal de ratón TSK114.
Ejemplo
8
Se determinaron las capacidades de los
anticuerpos humanizados inventivos para neutralizar el antígeno
hTNF-\alpha in vitro empleando la línea
celular WHEI 164 (ATCC CRL-1751, EE UU), como sigue
(Khabar KSA et al., Immunol. Lett. 46;
107-110, 1995).
Se diluyeron el anticuerpo monoclonal de ratón
TSK114 y los anticuerpos humanizados YHB1406, YHB1411,
YHB1411-2 e YHB1406-2 en tampón PBS
a varias concentraciones que variaban desde 0,024 ng/ml a 1,0
\mug/mL, respectivamente, y cada 100 \mul de las diluciones
resultantes se añadieron a los pocillos de una placa de cultivo de
96 pocillos. Se añadieron 50 \mul de solución de
hTNF-\alpha (100 pg/mL) a cada pocillo y se llevó
a cabo una reacción a 37ºC durante 1 hora. Después, se añadieron a
cada pocillo 50 \mul de líneas de células WHEI 164 (1 x 10^{6}
células/ml) tratadas con actinomicina D 2 \mug/ml (Sigma, EE
UU).
Las células se cultivaron a 37ºC durante 24
horas, y se retiraron 100 \mul de la solución de cultivo. Se
añadieron a cada pocillo de la placa de cultivo 20 \mul de una
solución de metil tiazol tetrazolio (MTT, Sigma, EE UU) diluida en
tampón PBS a una concentración de 5 mg/mL y la placa se incubó a
37ºC durante 4 horas para desarrollar el color. A continuación, se
añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución HCl 0,1
N-SDS al 10% (Sigma, EE UU) para disolver por
completo el precipitado coloreado y se midió la absorbancia de cada
pocillo a 595 nm.
A partir de los datos de absorbancia obtenidos
anteriormente, se dibujó una curva de índice de supervivencia de
las líneas celulares WHEI 164 frente a concentración de anticuerpo.
Se calculó la concentración de los anticuerpos que inhibía la
muerte celular en un 50% (IC_{50}) a partir de la curva, y los
resultados se muestran en la Tabla 4.
Como se muestra en la Tabla 4, la IC_{50} del
anticuerpo monoclonal de ratón (TSK114) fue 4,7 ng/mL, y las de los
anticuerpos humanizados inventivos YHB1406, YHB1411,
YHB1411-2 e YHB1406-2 fueron 9,2
ng/mL, 6,7 ng/mL, 5,5 ng/mL y 6,5 ng/mL, respectivamente. Este
resultado muestra que los anticuerpos humanizados tienen capacidades
de neutralización del antígeno in vitro similares a las del
anticuerpo monoclonal de ratón.
Ejemplo
9
Se midieron las afinidades de unión a
hTNF-\alpha de un anticuerpo monoclonal de ratón y
de un anticuerpo humanizado mediante el método de resonancia de
plasmón de superficie (SPR). Específicamente, se inmovilizó
hTNF-\alpha (Biosource, EE UU) en un chip sensor
CM5 (Biacore, Suecia) a una concentración de 200 \mug/ml y se
hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal de ratón TSK114 o
anticuerpo humanizado YHB-1411-2 a
25, 50, 100, 200 y 400 nM, respectivamente. Después, se midieron
las constantes de asociación y disociación de las reacciones
mediante Biacore2000 (Biacore, Suecia).
A partir de las constantes de asociación y
disociación medidas anteriormente, se calcularon las afinidades de
unión al antígeno de los anticuerpos y los resultados se muestran en
la Tabla 5.
Como se muestra en la Tabla 5, el anticuerpo
humanizado inventivo YHB1411-2 mostró una afinidad
de unión al antígeno alta del nivel de picomoles (10^{-12} M) y
una constante de disociación baja. Además, la afinidad de unión al
antígeno del anticuerpo humanizado YHB1411-2 fue
mayor en alrededor de 3 veces que la del anticuerpo monoclonal de
ratón TSK114.
<110> YUHAN CORPORATION
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<120> ANTICUERPO HUMANIZADO ESPECÍFICO
PARA EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL-\alpha
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<130> EP52431HV12pau
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<140> EP 05 823 880.9
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<141>
2005-12-29
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<150> PCT/KR2005/004634
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<151>
2005-12-29
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<150> KR
10-2004-0115709
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<151>
2004-12-29
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<211> 33
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<211> 33
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<220>
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<223> cebador
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<211> 27
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (7)
1. Un anticuerpo humanizado específico para el
factor de necrosis tumoral-\alpha humano
(hTNF-\alpha) que comprende:
- a)
- una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37 o 38;
- b)
- una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o 40;
- c)
- una región constante de la cadena pesada idéntica a la de un anticuerpo humano; y
- d)
- una región constante de la cadena ligera idéntica a la de un anticuerpo humano.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1, en donde la afinidad de unión al antígeno (Kd) del anticuerpo
varía desde 1 x 10^{-9} M hasta 1 x 10^{-13} M.
3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1, en donde la constante de disociación (K_{off}) del anticuerpo
varía desde 1 x 10^{-6} s^{-1} hasta 1 x 10^{-9} s^{-1}, que
se determina mediante resonancia de plasmón de superficie
(SPR).
4. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1, en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo
está codificada por un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de
SEQ ID NO: 31, 32 o 33.
5. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1, en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo
está codificada por un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de
SEQ ID NO: 34 o 35.
6. Un vector de expresión para el anticuerpo
humanizado de la reivindicación 1, que comprende un ADN que codifica
una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37 o 38 y un ADN que codifica una
región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de
aminoácidos de secuencia SEQ ID NO: 39 o 40.
7. Una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
para tratar una enfermedad relacionada con
hTNF-\alpha, seleccionada del grupo que consiste
en: artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica,
psoriasis, septicemia, asma, granulomatosis de Wegener, inflamación
y espondilitis anquilosante.
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