ES2358657B1 - ELECTROCHEMICAL SENSOR FOR THE DETECTION OF ANALYTES IN LIQUID MEDIA. - Google Patents

Abstract

Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos.#La invención define un sensor electroquímico para detectar analitos en medios líquidos con estructura multicapa (Figura 1) que comprende, entre otras, una primera capa (1) que comprende un material carbonoso depositada sobre un sustrato, constituyendo dicha capa el sistema de electrodos del sensor electroquímico que está compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; y una cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo seleccionada entre (d1) y (d2), donde:#(d1) comprende una capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha capa de politiofeno; y#(d2) es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno.Electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media. # The invention defines an electrochemical sensor for detecting analytes in liquid media with multilayer structure (Figure 1) comprising, among others, a first layer (1) comprising a carbonaceous material deposited on a substrate, said layer constituting the electrochemical sensor electrode system which is composed of at least one reference electrode, a working electrode and a counter electrode; and a fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel deposited only on the lower end of the working electrode selected between (d1) and (d2), where: # (d1) comprises a layer comprising a polythiophene deposited on the end bottom of the working electrode and a layer comprising a non-conductive polymer gel deposited on said polythiophene layer; and # (d2) is a conductive polymer gel layer comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene.

Description

Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos. Electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media.

Campo de la invención Field of the Invention

La invención se refiere al campo de los sensores electroquímicos para la detección de analitos en medios líquidos. En particular, la invención se refiere a sensores electroquímicos que incluyen electrodos sensores basados en materiales conductores de bajo coste (materiales carbonosos y politiofenos) los cuales, depositados sobre un soporte adecuado con una geometría óptima permiten, mediante técnicas electroquímicas, la detección de concentraciones mínimas de compuestos en medios líquidos. Así, el sensor electroquímico de la invención combina límites de detección mínimos a la vez que bajos costes de producción. The invention relates to the field of electrochemical sensors for the detection of analytes in liquid media. In particular, the invention relates to electrochemical sensors that include sensor electrodes based on low-cost conductive materials (carbonaceous materials and polythiophenes) which, deposited on a suitable support with optimal geometry allow, by electrochemical techniques, the detection of minimum concentrations of compounds in liquid media. Thus, the electrochemical sensor of the invention combines minimum detection limits as well as low production costs.

Antecedentes de la invención Background of the invention

El ámbito medioambiental, agroalimentario y médico-sanitario requieren herramientas de control y detección eficaces que, aplicadas a problemáticas concretas, permitan una mejora en la calidad de vida. Así, se hace cada vez más necesario en el campo del medio ambiente el control de pesticidas y tóxicos en aguas; y en el campo alimentario, el control de pesticidas o patógenos en los alimentos previamente a su introducción en el mercado, así como la detección rápida del deterioro de los alimentos. Igualmente, en el campo médico-sanitario es imprescindible identificar la presencia de organismos externos en el cuerpo humano y su concentración, así como el diagnóstico precoz de enfermedades. The environmental, agri-food and medical-health field requires effective control and detection tools that, applied to specific problems, allow an improvement in the quality of life. Thus, it becomes increasingly necessary in the field of the environment the control of pesticides and toxic in waters; and in the food field, the control of pesticides or pathogens in food prior to its introduction in the market, as well as the rapid detection of food spoilage. Similarly, in the medical-health field it is essential to identify the presence of external organisms in the human body and their concentration, as well as the early diagnosis of diseases.

Los métodos analíticos tradicionales se basan en cromatografía líquida, gaseosa o espectrometría de masas. En líneas generales, estos son métodos muy fiables, con altos grados de detección. Sin embargo, son métodos caros y excesivamente lentos. Además, se basan en la recolecta de muestras para un posterior análisis, por lo que no permiten un control en línea. Existe por ello la necesidad de disponer de herramientas analíticas que requieran una preparación de muestra mínima, que posibiliten una medida rápida, que sean portátiles y aplicables in situ, y que permitan actuar a tiempo frente a situaciones adversas. Traditional analytical methods are based on liquid chromatography, gas or mass spectrometry. In general, these are very reliable methods, with high degrees of detection. However, they are expensive and excessively slow methods. In addition, they are based on the collection of samples for further analysis, so they do not allow online control. There is therefore a need to have analytical tools that require a minimum sample preparation, that allow a quick measurement, that are portable and applicable in situ, and that allow timely action against adverse situations.

Estas tecnologías deben cumplir dos requerimientos. En primer lugar, un alto grado de sensibilidad, siendo éste un factor limitante y, en segundo lugar, que estos grados de sensibilidad se obtengan en base a tecnologías de bajo coste, portátiles y a las que puedan acceder los múltiples usuarios. These technologies must meet two requirements. First, a high degree of sensitivity, this being a limiting factor and, secondly, that these degrees of sensitivity are obtained based on low-cost, portable technologies that can be accessed by multiple users.

La Unión Europea ha fijado un límite máximo de residuos pesticidas en alimentos que ronda los 0,1 microgramos por kilogramo de alimento. Así, las exigencias de control y detección derivadas de esta normativa son enormes. Se exige el desarrollo de nuevas herramientas de control y monitorización que permitan no sólo la detección de esas trazas de compuesto, sino una tecnología de detección que pueda ser empleada en cualquier momento y lugar. Esto es, que esté al alcance de agricultores, empresas agroalimentarias, expendedores de pesticidas, laboratorios o cualquier agente interesado en controlar la presencia de pesticidas en los vegetales y frutas frescas. The European Union has set a maximum limit of pesticide residues in food that is around 0.1 micrograms per kilogram of food. Thus, the control and detection requirements derived from this regulation are enormous. It requires the development of new control and monitoring tools that allow not only the detection of these traces of compound, but a detection technology that can be used at any time and place. That is, it is available to farmers, agrifood companies, pesticide dispensers, laboratories or any agent interested in controlling the presence of pesticides in fresh vegetables and fruits.

En cuanto al sector médico-sanitario, se requieren tecnologías de detección de organismos externos en el cuerpo humano y su concentración para el diagnóstico precoz de enfermedades. Cuanto mayor sea el grado de sensibilidad, antes se dispondrá del diagnóstico, permitiendo así un control y tratamiento adecuado. Las tecnologías de bajo coste favorecerán, a su vez, el uso regular en la consulta del médico, o incluso un diagnóstico personal o doméstico, evitando la necesidad de análisis caros y lentos en los laboratorios hospitalarios. As for the medical-health sector, technologies for the detection of external organisms in the human body and their concentration are required for the early diagnosis of diseases. The higher the degree of sensitivity, the earlier the diagnosis will be available, thus allowing adequate control and treatment. Low-cost technologies will, in turn, favor regular use in the doctor's office, or even a personal or domestic diagnosis, avoiding the need for expensive and slow analyzes in hospital laboratories.

Se han descrito en el estado de la técnica diferentes sensores electroquímicos basados en la deposición de varias pistas de material sobre un sustrato aislante que puede ser plástico o cerámico. Las pistas pueden ser depositadas mediante serigrafía, litografía, deposición en estado vapor, esprayado, o técnicas de deposición similares. La primera capa consiste en un material conductor metálico que define la geometría de los electrodos (electrodo o electrodos de trabajo o sensores, electrodo de referencia y contraelectrodo). Esta primera capa de material conductor metálico suele ser típicamente de plata, si bien se han descrito otros posibles materiales metálicos tales como oro, platino, paladio, cobre o tungsteno (US 5,120,420, US 5,798,031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152, US 2007/0080073). La segunda capa consiste habitualmente en un material conductor depositado sobre el electrodo de trabajo y sobre el contraelectrodo que puede ser metálico tal como una pasta a base de oro, plata, platino, paladio, cobre o tungsteno, por ejemplo; o no-metálico tal como una pasta fabricada en base a un material de carbono (grafito o negro de humo, por ejemplo) (US 5,120,420, US 5,798,031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152, US 2007/0080073), o en base a un polímero conductor (WO 2007/026152). En algunos casos, existe una tercera capa que suele consistir en una pasta de Ag/AgCl, depositada únicamente sobre el electrodo de referencia (US 2005/0183953 A1). Asimismo, sobre el electrodo de trabajo se puede depositar una cuarta capa de material aislante, típicamente de material polimérico que puede ser un gel polimérico (celulosa, poli(alcohol vinílico), gelatina, Tween-20, Tritón X-100, Surfinol, etc.) para el atrapamiento físico de un compuesto biológico participante en la detección electroquímica (US 2005/0183953 A1). Este compuesto biológico es responsable de la especificidad y detección electroquímica y puede ser una enzima, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos o vitaminas, por ejemplo (US 2005/0183953 A1, US 5,120,420, US 5,798,031, FR 2 798 145). Different electrochemical sensors based on the deposition of several tracks of material on an insulating substrate that can be plastic or ceramic have been described in the state of the art. The tracks can be deposited by screen printing, lithography, vapor deposition, spraying, or similar deposition techniques. The first layer consists of a metallic conductive material that defines the geometry of the electrodes (working electrode or electrodes or sensors, reference electrode and counter electrode). This first layer of metallic conductive material is typically typically silver, although other possible metallic materials such as gold, platinum, palladium, copper or tungsten have been described (US 5,120,420, US 5,798,031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152 , US 2007/0080073). The second layer usually consists of a conductive material deposited on the working electrode and on the counter electrode which can be metallic such as a paste based on gold, silver, platinum, palladium, copper or tungsten, for example; or non-metallic such as a paste made from a carbon material (graphite or carbon black, for example) (US 5,120,420, US 5,798,031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152, US 2007/0080073), or based on a conductive polymer (WO 2007/026152). In some cases, there is a third layer that usually consists of an Ag / AgCl paste, deposited only on the reference electrode (US 2005/0183953 A1). Likewise, a fourth layer of insulating material, typically of polymeric material, which can be a polymeric gel (cellulose, polyvinyl alcohol), gelatin, Tween-20, Triton X-100, Surfinol, etc. can be deposited on the working electrode. .) for the physical entrapment of a biological compound participating in electrochemical detection (US 2005/0183953 A1). This biological compound is responsible for the specificity and electrochemical detection and can be an enzyme, proteins, oligonucleotides, polynucleotides or vitamins, for example (US 2005/0183953 A1, US 5,120,420, US 5,798,031, FR 2 798 145).

Esta última capa de material en el electrodo de trabajo puede incorporar un mediador. El mediador actúa aceptando electrones desde la enzima o donando electrones a la misma una vez que la reacción electroquímica ha ocurrido. Así, en algunos casos, el mediador puede actuar regenerando la enzima oxido-reductasa. Los mediadores descritos son complejos de metales de transición como los derivados de ferroceno o ferrocianuros (US 5,653,863), pero también pueden tratarse de benzoquinonas y naftoquinonas (US 4,746,607), compuestos nitrosos o hidroxilaminas (EP 0 354 441), flavinas, fenazinas, fenotiazinas, o indofenoles (EP 0 330 517). This last layer of material in the working electrode can incorporate a mediator. The mediator acts by accepting electrons from the enzyme or by donating electrons to it once the electrochemical reaction has occurred. Thus, in some cases, the mediator can act by regenerating the enzyme oxido-reductase. The mediators described are transition metal complexes such as those derived from ferrocene or ferrocyanides (US 5,653,863), but they can also be benzoquinones and naphthoquinones (US 4,746,607), nitrous compounds or hydroxylamines (EP 0 354 441), fl avinas, phenazines, phenothiazines , or indophenols (EP 0 330 517).

No se ha descrito en el estado de la técnica la utilización de politiofenos como agentes mediadores en la fabricación de sensores electroquímicos, una familia de polímeros conductores intrínsecos de elevada estabilidad y procesables a partir de dispersiones acuosas. Las patentes US 4,959,430 y US 4,987,042 describen diferentes procedimientos de preparación de dispersiones basadas en poli(etilen-dioxi-tiofeno) y las patentes US 5,766,515 y US 5,370,981 su uso en forma de electrodo transparente en dispositivos electroluminiscentes y para preparar plásticos antiestáticos, respectivamente. Asimismo, en el documento FR 2 798 145 se describe el uso de politiofenos, entre muchos otros polímeros conductores electroquímicamente sintetizados, como soporte para el anclaje de sondas de reconocimiento específico, ya que contienen grupos funcionales en los que se enlazan dichas sondas. Por otro lado, en el documento WO 2007/026152 se describe el uso de politiofenos, entre otros polímeros conductores, como componente del electrodo sustituyendo al material de carbono en la segunda capa, pero no como mediador. The use of polythiophenes as mediating agents in the manufacture of electrochemical sensors, a family of intrinsic conductive polymers of high stability and processable from aqueous dispersions has not been described in the prior art. US 4,959,430 and US 4,987,042 describe different methods of preparing dispersions based on poly (ethylene-dioxy-thiophene) and US patents 5,766,515 and US 5,370,981 for use in the form of a transparent electrode in electroluminescent devices and for preparing antistatic plastics, respectively. Likewise, in FR 2 798 145 the use of polythiophenes, among many other electrochemically synthesized conductive polymers, is described as a support for anchoring specific recognition probes, since they contain functional groups in which said probes are linked. On the other hand, WO 2007/026152 describes the use of polythiophenes, among other conductive polymers, as a component of the electrode replacing the carbon material in the second layer, but not as a mediator.

Igualmente, tampoco se han descrito sensores electroquímicos que prescindan de la primera capa de material conductor metálico, dando lugar a una tecnología de bajo coste. Likewise, electrochemical sensors that dispense with the first layer of metallic conductive material have not been described, resulting in low cost technology.

Así pues, continúa existiendo en el estado de la técnica la necesidad de sensores electroquímicos alternativos de bajo coste, que no incorporen materiales costosos, y cuyo diseño posibilite la detección de analitos con una máxima sensibilidad. Thus, the need for low-cost alternative electrochemical sensors, which do not incorporate expensive materials, and whose design enables the detection of analytes with maximum sensitivity, continues to exist in the state of the art.

El sensor electroquímico de la presente invención que usa politiofenos como mediadores y una primera capa a base de material carbonoso permite la detección de analitos en un medio líquido con un alto grado de sensibilidad y con menor coste, posibilitando el análisis de concentraciones mínimas de estos analitos en cualquier momento, en cualquier lugar y por parte de múltiples usuarios. The electrochemical sensor of the present invention that uses polythiophenes as mediators and a first layer based on carbonaceous material allows the detection of analytes in a liquid medium with a high degree of sensitivity and with lower cost, enabling the analysis of minimum concentrations of these analytes at any time, anywhere and by multiple users.

Objeto de la invención Object of the invention

La presente invención, por tanto, tiene por objeto proporcionar un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos. The present invention, therefore, is intended to provide an electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para preparar dicho sensor electroquímico. Another object of the present invention is a process for preparing said electrochemical sensor.

Breve descripción de las figuras Brief description of the fi gures

La figura 1 muestra la vista superior del sensor electroquímico de la invención, en la que puede verse su estructura multicapa. Figure 1 shows the top view of the electrochemical sensor of the invention, in which its multilayer structure can be seen.

La figura 2 muestra una vista lateral del sensor electroquímico de la invención en el que la cuarta capa es la capa (d1), que comprende una primera capa (4a) que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una segunda capa (4b) que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre la capa de politiofeno. Figure 2 shows a side view of the electrochemical sensor of the invention in which the fourth layer is the layer (d1), which comprises a first layer (4a) comprising a polythiophene deposited on the lower end of the working electrode and a second layer (4b) comprising a non-conductive polymer gel deposited on the polythiophene layer.

La figura 3 muestra una vista lateral del sensor electroquímico de la invención en el que la cuarta capa es la capa (d2), que es una capa de gel polimérico conductor depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno. Figure 3 shows a side view of the electrochemical sensor of the invention in which the fourth layer is the layer (d2), which is a layer of conductive polymer gel deposited only on the lower end of the working electrode and comprising a polymer gel Nonconductive and a polythiophene.

La figura 4 muestra el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en función de la concentración del pesticida clorpirifós oxon determinada en un sensor electroquímico de la invención que comprende una primera capa de grafito y una cuarta capa que comprende, a su vez, una capa de PEDOT sobre la que se deposita una capa de PVA (capa (d1)). Figure 4 shows the percentage of inhibition of the enzyme acetylcholinesterase as a function of the concentration of the pesticide chlorpyrifos oxon determined in an electrochemical sensor of the invention comprising a first layer of graphite and a fourth layer comprising, in turn, a layer of PEDOT on which a layer of PVA is deposited (layer (d1)).

La figura 5 muestra el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en función de la concentración del pesticida clorpirifós oxon determinada en un sensor electroquímico de la invención que comprende una primera capa de grafito y una cuarta capa de PEDOT y PVA (capa (d2)). Figure 5 shows the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase as a function of the concentration of the pesticide chlorpyrifos oxon determined in an electrochemical sensor of the invention comprising a first layer of graphite and a fourth layer of PEDOT and PVA (layer (d2)) .

La figura 6 muestra el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en función de la concentración del pesticida clorpirifós oxon determinada en un sensor electroquímico de la invención que comprende una primera capa de grafito y una capa intermedia de cobalto ftalocianina sobre la que se deposita la cuarta capa de PEDOT y PVA (capa (d2)). Figure 6 shows the percent inhibition of the enzyme acetylcholinesterase as a function of the concentration of the pesticide chlorpyrifos oxon determined in an electrochemical sensor of the invention comprising a first layer of graphite and an intermediate layer of cobalt phthalocyanine on which the fourth is deposited PEDOT and PVA layer (layer (d2)).

La figura 7 muestra el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en función de la concentración del pesticida clorpirifós oxon determinada en un sensor electroquímico de la invención que comprende una capa intermedia de plata depositada sobre el sustrato y sobre la que se deposita una primera capa de grafito y una cuarta capa que comprende, a su vez, una capa de PEDOT sobre la que se deposita una capa de PVA (capa (d1)). Figure 7 shows the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase as a function of the concentration of the pesticide chlorpyrifos oxon determined in an electrochemical sensor of the invention comprising an intermediate layer of silver deposited on the substrate and on which a first layer of graph and a fourth layer comprising, in turn, a layer of PEDOT on which a layer of PVA is deposited (layer (d1)).

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

La presente invención proporciona un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos, en adelante “sensor electroquímico de la invención”, que comprende: The present invention provides an electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media, hereinafter "electrochemical sensor of the invention", comprising:

(a) (to)

una primera capa (1) que comprende un material carbonoso depositada sobre un sustrato, constituyendo dicha capa el sistema de electrodos del sensor electroquímico que está compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; a first layer (1) comprising a carbonaceous material deposited on a substrate, said layer constituting the electrochemical sensor electrode system which is composed of at least one reference electrode, a working electrode and a counter electrode;

(b) (b)

una segunda capa (2) que comprende un material metálico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia; a second layer (2) comprising a metallic material deposited only on the lower end of the reference electrode;

(c) (C)

una tercera capa (3) que comprende un material aislante depositada sobre una parte del sistema de electrodos, siendo dicha parte la que queda entre la superficie de análisis (3a) y los contactos eléctricos (3b) del equipo de medida, de modo que quede expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos; a third layer (3) comprising an insulating material deposited on a part of the electrode system, said part being the one between the analysis surface (3a) and the electrical contacts (3b) of the measuring equipment, so that it remains exposed only the lower part of the electrodes of the electrode system;

(d) (d)

una cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo seleccionada entre (d1) y (d2), donde: a fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel deposited only on the lower end of the working electrode selected between (d1) and (d2), where:

(d1) comprende una capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del elec(d1) comprises a layer comprising a polythiophene deposited on the lower end of the elec

trodo de trabajo y una capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha working chunk and a layer comprising a non-conductive polymer gel deposited on said

capa de politiofeno; y polythiophene layer; Y

(d2) es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno. (d2) is a conductive polymer gel layer comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene.

Esta estructura multicapa del sensor electroquímico de la invención puede verse en la Figura 1, en la que se representa la geometría óptima del mismo, si bien podría presentar otras posibles geometrías. This multilayer structure of the electrochemical sensor of the invention can be seen in Figure 1, in which the optimal geometry thereof is represented, although it could have other possible geometries.

En el contexto de la invención el término “electrodo de referencia” se refiere a un electrodo que tiene un potencial de equilibrio estable y conocido, y que se utiliza para medir el potencial contra otros electrodos en un sistema electroquímico. In the context of the invention the term "reference electrode" refers to an electrode that has a stable and known equilibrium potential, and is used to measure the potential against other electrodes in an electrochemical system.

Asimismo, en el contexto de la invención el término “electrodo de trabajo” se refiere al electrodo en el que, en un sistema electroquímico, se produce la reacción de interés. El electrodo de trabajo se usa a menudo en combinación con un contraelectrodo y un electrodo de referencia en un sistema de tres electrodos, si bien puede haber más de un electrodo de trabajo dando lugar a un sistema de electrodos o multielectrodo. Dependiendo de si la reacción en el electrodo es una reducción o una oxidación, el electrodo de trabajo se puede considerar un cátodo o un ánodo. Also, in the context of the invention the term "working electrode" refers to the electrode in which, in an electrochemical system, the reaction of interest occurs. The working electrode is often used in combination with a counter electrode and a reference electrode in a three electrode system, although there may be more than one working electrode resulting in an electrode or multi electrode system. Depending on whether the reaction at the electrode is a reduction or an oxidation, the working electrode can be considered a cathode or an anode.

Igualmente, en el contexto de la invención el término “contraelectrodo” se refiere a un electrodo no polarizable que completa el circuito de la celda. En celdas de laboratorio, el contraelectrodo, por lo general, es un conductor inerte como el platino o grafito. Likewise, in the context of the invention the term "counter electrode" refers to a non-polarizable electrode that completes the cell circuit. In laboratory cells, the counter electrode is usually an inert conductor such as platinum or graphite.

Así, en una realización particular, el sistema de electrodos del sensor electroquímico de la invención está compuesto por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. En otra realización particular, el sistema de electrodos del sensor electroquímico de la invención está compuesto por un electrodo de referencia, dos o más electrodos de trabajo y un contraelectrodo. Thus, in a particular embodiment, the electrochemical sensor electrode system of the invention is composed of a reference electrode, a working electrode and a counter electrode. In another particular embodiment, the electrochemical sensor electrode system of the invention is composed of a reference electrode, two or more working electrodes and a counter electrode.

En el contexto de la invención, la expresión “detección de analitos en medios líquidos” se refiere tanto a la determinación cualitativa como a la determinación cuantitativa de un analito contenido en un medio líquido (disolución, dispersión, etc.) sometido a ensayo. In the context of the invention, the expression "analyte detection in liquid media" refers to both the qualitative determination and the quantitative determination of an analyte contained in a liquid medium (solution, dispersion, etc.) under test.

Dicha determinación se realiza bien por inmersión del sensor electroquímico de la invención en el medio líquido que contiene el analito, o bien por deposición de una gota de dicho medio líquido sobre la superficie de análisis (3a) del sensor electroquímico de la invención. Said determination is made either by immersion of the electrochemical sensor of the invention in the liquid medium containing the analyte, or by deposition of a drop of said liquid medium on the analysis surface (3a) of the electrochemical sensor of the invention.

El sustrato puede ser cualquier sustrato apropiado conocido por el experto en la materia. Así, en una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el sustrato es una lámina de plástico, textil o papel. En una realización preferida, la lámina de plástico está constituida por polímeros de alto punto de fusión o alta temperatura de transición vítrea, preferiblemente poli (etilen tereftalato) o poli(carbonato). En otra realización preferida, la lámina de plástico está constituida por poli (cloruro de vinilo) plastificado, cauchos termoplásticos, fibras o tejidos poliméricos. The substrate may be any appropriate substrate known to the person skilled in the art. Thus, in a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the substrate is a sheet of plastic, textile or paper. In a preferred embodiment, the plastic sheet is constituted by polymers of high melting point or high glass transition temperature, preferably poly (ethylene terephthalate) or poly (carbonate). In another preferred embodiment, the plastic sheet is constituted by plasticized polyvinyl chloride, thermoplastic rubbers, fibers or polymeric fabrics.

La primera capa (1) que comprende un material carbonoso se deposita sobre el sustrato de manera que delimita la geometría del sistema de electrodos, tal y como se ha indicado previamente. En una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el material carbonoso de la primera capa se selecciona entre grafito, negro de humo y nanotubos de carbono. En una realización preferida, el material carbonoso es grafito. Así, este puede ser una pasta o tinta de grafito, es decir, una dispersión de grafito. The first layer (1) comprising a carbonaceous material is deposited on the substrate so as to delimit the geometry of the electrode system, as previously indicated. In a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the carbonaceous material of the first layer is selected from graph, carbon black and carbon nanotubes. In a preferred embodiment, the carbonaceous material is graphite. Thus, this can be a paste or graphite ink, that is, a dispersion of graphite.

En una realización particular del sensor electroquímico de la invención, este comprende una capa intermedia que comprende un material metálico y que se deposita sobre el sustrato antes de depositar la primera capa de material carbonoso. Dicho material metálico es cualquier material metálico apropiado del estado de la técnica. Así, en una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el material metálico de esta capa intermedia opcional se selecciona entre plata, oro, platino, paladio, cobre y tungsteno. En una realización preferida, el material metálico de esta capa intermedia opcional es plata. En este caso, esta capa intermedia delimitará la geometría del sistema de electrodos. In a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, this comprises an intermediate layer comprising a metallic material and which is deposited on the substrate before depositing the first layer of carbonaceous material. Said metallic material is any appropriate metallic material of the prior art. Thus, in a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the metallic material of this optional intermediate layer is selected from silver, gold, platinum, palladium, copper and tungsten. In a preferred embodiment, the metallic material of this optional intermediate layer is silver. In this case, this intermediate layer will delimit the geometry of the electrode system.

La segunda capa (2) se deposita únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia y puede comprender cualquier material metálico adecuado seleccionado por el experto en la materia. Así, en una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el material metálico es Ag/AgCl (plata/cloruro de plata) o Hg/Hg2Cl2 (calomelanos). En una realización preferida, el material metálico es Ag/AgCl. The second layer (2) is deposited only on the lower end of the reference electrode and may comprise any suitable metallic material selected by the person skilled in the art. Thus, in a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the metallic material is Ag / AgCl (silver / silver chloride) or Hg / Hg2Cl2 (calomelanos). In a preferred embodiment, the metallic material is Ag / AgCl.

Para proteger del entorno la capa de material carbonoso y delimitar el área de exposición a la muestra que contiene el analito se emplea una tercera capa de material aislante. La tercera capa (3), por tanto, se deposita sobre una parte del sistema de electrodos, siendo dicha parte la que queda entre la superficie de análisis (3a) y los contactos eléctricos (3b) del equipo de medida, de modo que quede expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos. El equipo de medida empleado puede ser cualquier equipo de medida adecuado del estado de la técnica tal como un potenciostato, por ejemplo. To protect the layer of carbonaceous material from the environment and delimit the area of exposure to the sample containing the analyte, a third layer of insulating material is used. The third layer (3), therefore, is deposited on a part of the electrode system, said part being the one between the analysis surface (3a) and the electrical contacts (3b) of the measuring equipment, so that it remains exposed only the lower part of the electrodes of the electrode system. The measuring equipment used can be any suitable measuring equipment of the state of the art such as a potentiostat, for example.

Esta tercera capa (3) comprende cualquier material aislante del estado de la técnica adecuado tal como una silicona, una resina epoxi, una pintura acrílica o una pintura vinílica, por ejemplo. This third layer (3) comprises any suitable insulating material of the state of the art such as a silicone, an epoxy resin, an acrylic paint or a vinyl paint, for example.

La cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico se deposita únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y se selecciona entre dos posibles capas (d1) y (d2): The fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel is deposited only on the lower end of the working electrode and is selected from two possible layers (d1) and (d2):

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la capa (d1) comprende una primera capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo infelayer (d1) comprises a first layer comprising a polythiophene deposited on the infe end

rior del electrodo de trabajo y una segunda capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada rior of the working electrode and a second layer comprising a deposited non-conductive polymer gel

sobre dicha capa de politiofeno; y on said polythiophene layer; Y

--

la capa (d2) se corresponde con una única capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno. The layer (d2) corresponds to a single layer of conductive polymer gel comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene.

En una realización particular del sensor electroquímico de la invención, la cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico y que se deposita únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo, es la capa (d1) que comprende una primera capa (4a) que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una segunda capa (4b) que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha capa de politiofeno (Figura 2). In a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel and which is deposited only on the lower end of the working electrode, is the layer (d1) comprising a first layer (4a ) comprising a polythiophene deposited on the lower end of the working electrode and a second layer (4b) comprising a non-conductive polymeric gel deposited on said polythiophene layer (Figure 2).

En otra realización particular del sensor electroquímico de la invención, la cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico y que se deposita únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo, es la capa (d2) que es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno (Figura 3). Esta capa tiene carácter conductor debido a que contiene un polímero conductor como es el politiofeno. In another particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel and which is deposited only on the lower end of the working electrode, is the layer (d2) which is a polymer gel layer conductor comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene (Figure 3). This layer has a conductive character because it contains a conductive polymer such as polythiophene.

En una realización preferida, el sensor comprende una capa intermedia adicional que comprende un mediador electroquímico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y sobre la que se deposita la capa (d2) de gel polimérico conductor. En este caso, el politiofeno del gel polimérico conductor actuará principalmente como conductor. El mediador electroquímico empleado en esta capa intermedia opcional puede ser cualquier mediador adecuado del estado de la técnica. Así, en una realización aún más preferida, el mediador electroquímico se selecciona entre cobalto ftalocianina (CoPh), 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano (TCNQ), hidroquinona (HQ), quinona (Q), tetratiafulvaleno (TTF) y ferroceno (FC). En una realización mucho más preferida, el mediador electroquímico es cobalto ftalocianina (CoPh). In a preferred embodiment, the sensor comprises an additional intermediate layer comprising an electrochemical mediator deposited only on the lower end of the working electrode and on which the conductive polymer gel layer (d2) is deposited. In this case, the conductive polymer gel polythiophene will act primarily as a conductor. The electrochemical mediator used in this optional intermediate layer may be any suitable mediator of the prior art. Thus, in an even more preferred embodiment, the electrochemical mediator is selected from cobalt phthalocyanine (CoPh), 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hydroquinone (HQ), quinone (Q), tetrathiafulvalene (TTF) and ferrocene (FC). In a much more preferred embodiment, the electrochemical mediator is cobalt phthalocyanine (CoPh).

En una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el politiofeno de la cuarta capa (4) contiene unidades estructurales repetitivas de fórmula (I), In a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the fourth layer polythiophene (4) contains repetitive structural units of formula (I),

en la que R1 yR2 son independientemente un grupo alquilo C1-C12 o forman un grupo 1, n-alquileno C1-C12, siendo n = 1-12, opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, vinileno, bencilo, fenilo, halógeno, wherein R1 and R2 are independently a C1-C12 alkyl group or form a 1, n-C1-C12 alkylene group, where n = 1-12, optionally substituted by a C1-C12 alkyl group, C2-C12 alkene, vinyl, benzyl, phenyl, halogen,

o por un grupo funcional éster, amino, amido o éter opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1-C12. or by an ester, amino, amido or ether functional group optionally substituted by a C1-C12 alkyl group.

En una realización preferida, en el politiofeno de fórmula (I) los grupos R1 yR2 forman un grupo alquileno seleccionado entre metileno, 1,2-etileno y 1,3-propileno. En una realización aún más preferida, en el politiofeno de fórmula (I) los grupos R1 yR2 forman un grupo 1,2-etileno. In a preferred embodiment, in the polythiophene of formula (I) the groups R1 and R2 form an alkylene group selected from methylene, 1,2-ethylene and 1,3-propylene. In an even more preferred embodiment, in the polythiophene of formula (I) the groups R1 and R2 form a 1,2-ethylene group.

Dichos politiofenos en su estado oxidado pueden incorporar adicionalmente grupos aniónicos estabilizando los portadores de carga de tipo positivo deslocalizados en las cadenas poliméricas. Así, en otra realización particular del sensor electroquímico de la invención, el politiofeno de la cuarta capa comprende un dopante aniónico. En una realización preferida, el dopante aniónico es un anión inorgánico seleccionado entre un anión sulfato, cloruro y bromuro. En otra realización preferida, el dopante aniónico es un anión orgánico con grupos sulfonato o fosfato seleccionado entre un ácido p-toluen-sulfónico y un ácido p-toluen-fosfónico. En otra realización preferida, el dopante aniónico es un polianión orgánico seleccionado entre ácidos carboxílicos poliméricos, ácidos sulfónicos poliméricos, o copolímeros de ácidos vinilcarboxílicos y ácidos vinilsulfónicos con otros monómeros polimerizables. En una realización aún más preferida, el dopante aniónico es un polianión orgánico seleccionado entre poli (ácido acrílico), poli(ácido metacrílico) y poli(ácido maleico). En otra realización aún más preferida, el dopante aniónico es un polianión orgánico seleccionado entre ácido poli(estiren sulfónico) y ácido poli(vinil sulfónico). En otra realización aún más preferida, el dopante aniónico es un polianión orgánico seleccionado entre copolímeros de ácidos vinilcarboxílicos y ácidos vinilsulfónicos con estireno y monómeros acrílicos o metacrílicos. En otra realización aún más preferida, el dopante aniónico es un polianión orgánico cuyo peso molecular está comprendido entre 15.000 y 300.000 Daltons. Said polythiophenes in their oxidized state can additionally incorporate anionic groups by stabilizing the positive-type charge carriers delocalized in the polymer chains. Thus, in another particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the fourth layer polythiophene comprises an anionic dopant. In a preferred embodiment, the anionic dopant is an inorganic anion selected from a sulfate, chloride and bromide anion. In another preferred embodiment, the anionic dopant is an organic anion with sulfonate or phosphate groups selected from a p-toluenesulfonic acid and a p-toluene phosphonic acid. In another preferred embodiment, the anionic dopant is an organic polyanion selected from polymeric carboxylic acids, polymeric sulfonic acids, or copolymers of vinylcarboxylic acids and vinyl sulfonic acids with other polymerizable monomers. In an even more preferred embodiment, the anionic dopant is an organic polyanion selected from poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid) and poly (maleic acid). In another even more preferred embodiment, the anionic dopant is an organic polyanion selected from poly (styrene sulfonic acid) and poly (vinyl sulfonic acid). In another even more preferred embodiment, the anionic dopant is an organic polyanion selected from copolymers of vinylcarboxylic acids and vinyl sulfonic acids with styrene and acrylic or methacrylic monomers. In another even more preferred embodiment, the anionic dopant is an organic polyanion whose molecular weight is between 15,000 and 300,000 Daltons.

El gel polimérico no conductor de la cuarta capa (4) será cualquier gel polimérico no conductor del estado de la técnica que absorba en su interior la disolución que contiene el analito, preferiblemente un hidrogel polimérico entrecruzado. Así, en una realización particular del sensor electroquímico de la invención, el gel polimérico no conductor se selecciona de entre poli (alcohol vinílico), glutaraldehído, hidroxi-etilcelulosa, derivados de polimetilmetacrilato, derivados de polietilenglicol y Nafión. En una realización preferida, el gel polimérico no conductor es poli (alcohol vinílico) fotoentrecruzable. The non-conductive polymeric gel of the fourth layer (4) will be any non-conductive polymeric gel of the state of the art that absorbs inside the solution containing the analyte, preferably a crosslinked polymeric hydrogel. Thus, in a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the non-conductive polymer gel is selected from polyvinyl alcohol, glutaraldehyde, hydroxy ethyl cellulose, polymethylmethacrylate derivatives, polyethylene glycol and Naphlon derivatives. In a preferred embodiment, the non-conductive polymer gel is photo-crosslinkable polyvinyl alcohol.

En una realización particular del sensor electroquímico de la invención, la cuarta capa (4) comprende además un compuesto biológico. Dicho compuesto biológico reacciona específicamente con determinados analitos, permitiendo cuantificarlos mediante una señal electroquímica. En una realización preferida, el compuesto biológico se selecciona entre enzimas, coenzimas, anticuerpos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, glucoproteínas, lipoproteínas, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, por ejemplo polinucleótidos tipo ARN o ADN de origen sintético o biológico, monosacáridos, oligosacáridos y bacterias. In a particular embodiment of the electrochemical sensor of the invention, the fourth layer (4) further comprises a biological compound. Said biological compound reacts specifically with certain analytes, allowing them to be quantified by an electrochemical signal. In a preferred embodiment, the biological compound is selected from enzymes, coenzymes, antibodies, oligopeptides, polypeptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, for example RNA or DNA polynucleotides of synthetic or biological origin, monosaccharides, oligosaccharides and bacteria

En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la preparación del sensor electroquímico de la invención, en adelante “el procedimiento de la invención”, que comprende: In another aspect of the invention there is provided a process for the preparation of the electrochemical sensor of the invention, hereinafter "the process of the invention", comprising:

(A) (TO)

obtener sobre el sustrato la primera capa que comprende un material carbonoso y que constituye el sistema de electrodos compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; obtaining on the substrate the first layer comprising a carbonaceous material and constituting the electrode system composed of at least one reference electrode, a working electrode and a counter electrode;

(B) (B)

obtener la segunda capa que comprende un material metálico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia; obtaining the second layer comprising a metallic material only on the lower end of the reference electrode;

(C) (C)

obtener la tercera capa que comprende material aislante sobre la parte del sistema de electrodos que queda entre la superficie de análisis y los contactos eléctricos del equipo de medida de modo que deje expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos; y obtaining the third layer comprising insulating material on the part of the electrode system that remains between the analysis surface and the electrical contacts of the measuring equipment so as to expose only the lower part of the electrodes of the electrode system; Y

(D) (D)

obtener la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo obtain the fourth layer comprising polythiophene and polymer gel only on the lower end of the working electrode

En una realización particular del procedimiento de la invención, la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico se obtiene mediante un método seleccionado entre (D1) y (D2), donde: In a particular embodiment of the process of the invention, the fourth layer comprising polythiophene and polymer gel is obtained by a method selected from (D1) and (D2), where:

(D1) comprende obtener la capa que comprende un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y obtener después la capa que comprende un gel polimérico sobre la capa que comprende un politiofeno; y (D1) comprises obtaining the layer comprising a polythiophene on the lower end of the working electrode and then obtaining the layer comprising a polymeric gel on the layer comprising a polythiophene; Y

(D2) comprende obtener la capa que comprende un gel polimérico y un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo. (D2) comprises obtaining the layer comprising a polymer gel and a polythiophene on the lower end of the working electrode.

En una realización preferida, la obtención de la cuarta capa comprende: In a preferred embodiment, obtaining the fourth layer comprises:

(i) (i)

la aplicación de disoluciones verdaderas, dispersiones coloidales o dispersiones estables de partículas finamente divididas, bien acuosas bien base disolvente, de politiofeno previamente obtenidas mediante polimerización oxidativa o polimerización enzimática; o the application of true solutions, colloidal dispersions or stable dispersions of finely divided particles, either aqueous or solvent based, of polythiophene previously obtained by oxidative polymerization or enzymatic polymerization; or

(ii) (ii)

la aplicación de disoluciones, bien acuosas bien base disolvente, de monómeros tiofeno y posterior polimerización in situ de los mismos. the application of solutions, either aqueous or solvent based, of thiophene monomers and subsequent in situ polymerization thereof.

En particular, con respecto al método (D1), se aplica sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una disolución verdadera, una dispersión coloidal o una dispersión estable de partículas finamente divididas, bien acuosa bien base disolvente, de un politiofeno previamente obtenida mediante polimerización oxidativa o polimerización enzimática. Dicha aplicación se efectúa mediante diferentes técnicas conocidas tal como pintado, inmersión, recubrimiento por rotación (“spin-coating”) o serigrafía (“screen-printing”), por ejemplo. Tras la aplicación de dicha disolución o dispersión de politiofeno se procede a la evaporación directa del disolvente. En otra variante, se aplica sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una disolución de monómeros tiofeno de un modo análogo al previamente descrito y, después, se procede a la polimerización in situ de dichos monómerosyala posterior evaporación del disolvente. In particular, with respect to method (D1), a true solution, a colloidal dispersion or a stable dispersion of finely divided particles, either aqueous or solvent based, of a polythiophene previously obtained by polymerization is applied to the lower end of the working electrode oxidative or enzymatic polymerization. Said application is carried out by means of different known techniques such as painting, immersion, coating by rotation ("spin-coating") or screen printing ("screen-printing"), for example. After the application of said polythiophene solution or dispersion, the solvent is evaporated directly. In another variant, a solution of thiophene monomers is applied to the lower end of the working electrode in a manner analogous to that previously described, and then, in situ polymerization of said monomers is carried out and subsequent evaporation of the solvent.

A continuación, y de modo análogo, se aplica manualmente sobre la capa de politiofeno así obtenida una disolución de prepolímero de un gel polimérico no conductor. Tras la aplicación de dicha disolución se procede a la reticulación del prepolímero mediante cualquier técnica conocida tal como la exposición a luz halógena, por ejemplo, y después a la evaporación directa del disolvente. Then, and analogously, a prepolymer solution of a non-conductive polymer gel is applied manually on the polythiophene layer thus obtained. After application of said solution, the prepolymer is crosslinked by any known technique such as exposure to halogen light, for example, and then to direct evaporation of the solvent.

Por otro lado, con respecto al método (D2), se aplica sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una disolución verdadera, una dispersión coloidal o una dispersión estable de partículas finamente divididas, bien acuosa bien base disolvente, de politiofeno mezclada con una disolución del gel polimérico no conductor. Tras la aplicación de dicha mezcla se procede a la evaporación directa del disolvente. On the other hand, with respect to method (D2), a true solution, a colloidal dispersion or a stable dispersion of finely divided particles, either aqueous or solvent based, of polythiophene mixed with a solution is applied on the lower end of the working electrode of the non-conductive polymer gel. After the application of said mixture, the solvent is evaporated directly.

Como alternativa, se aplica sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una disolución del gel polimérico no conductor que comprende los monómeros de tiofeno. Dicha aplicación se efectúa manualmente. Tras la aplicación de dicha disolución se procede a la polimerización de los monómeros tiofeno en el seno del gel polimérico no conductor mediante polimerización in-situ (polimerización oxidativa o polimerización enzimática) y, posteriormente, a la reticulación del prepolímero mediante cualquier técnica conocida tal como la exposición a luz halógena, por ejemplo. Finalmente, se procede a la evaporación directa del disolvente. Alternatively, a solution of the non-conductive polymeric gel comprising the thiophene monomers is applied to the lower end of the working electrode. This application is done manually. After application of said solution, the thiophene monomers are polymerized within the non-conductive polymer gel by in-situ polymerization (oxidative polymerization or enzymatic polymerization) and, subsequently, the cross-linking of the prepolymer by any known technique such as exposure to halogen light, for example. Finally, the solvent is evaporated directly.

En cualquier caso, en el procedimiento de la invención el politiofeno se sintetiza químicamente, método que es mucho más sencillo y menos costoso que la síntesis electroquímica del mismo. In any case, in the process of the invention polythiophene is chemically synthesized, a method that is much simpler and less expensive than electrochemical synthesis thereof.

Estos métodos de polimerización oxidativa, polimerización enzimática o polimerización in situ del monómero correspondiente pueden ser los descritos en las referencias ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS 14, 615-622, 2004 y BIOMACROMOLECULES 8(2), 315-317, 2007. Entre los disolventes preferibles están los alcoholes (metanol, etanol o isopropanol, por ejemplo), así como mezclas de agua con estos alcoholes u otros disolventes orgánicos miscibles con el agua tal como la acetona, por ejemplo. Para la polimerización oxidativa, se pueden emplear como oxidantes preferidos el persulfato amónico, el tricloruro de hierro o el tosilato férrico. Para la polimerización enzimática, se pueden emplear como enzimas preferidas la peroxidasa del rábano o peroxidasas de otros orígenes. Adicionalmente, pueden emplearse ligantes poliméricos del tipo poli(vinil alcohol), poli(vinil acetato), etc. y promotores de adhesión, del tipo silanos, resinas tackificantes, etc. para facilitar la formación de filmes altamente adherentes sobre la capa correspondiente. These methods of oxidative polymerization, enzymatic polymerization or in situ polymerization of the corresponding monomer may be those described in references ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS 14, 615-622, 2004 and BIOMACROMOLECULES 8 (2), 315-317, 2007. Among the preferred solvents are alcohols (methanol, ethanol or isopropanol, for example), as well as mixtures of water with these alcohols or other organic solvents miscible with water such as acetone, for example. For oxidative polymerization, ammonium persulfate, iron trichloride or ferric tosylate can be used as preferred oxidants. For enzymatic polymerization, horseradish peroxidase or peroxidases from other sources can be used as preferred enzymes. Additionally, polymeric binders of the type polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, etc. can be used. and adhesion promoters, of the silane type, tacki fi cating resins, etc. to facilitate the formation of highly adherent fi les on the corresponding layer.

De un modo análogo, el resto de capas que comprende el sensor electroquímico de la invención se pueden obtener por aplicación de la dispersión o disolución correspondiente sobre la capa anterior mediante diferentes técnicas conocidas tal como pintado, inmersión, recubrimiento por rotación (“spin-coating”) o serigrafía (“screen-printing”), por ejemplo, seguida de la evaporación directa del disolvente. Similarly, the rest of the layers comprising the electrochemical sensor of the invention can be obtained by application of the corresponding dispersion or solution on the previous layer by means of different known techniques such as painting, immersion, spin coating. ”) Or screen printing (“ screen-printing ”), for example, followed by direct evaporation of the solvent.

En una realización particular del procedimiento de la invención, este comprende obtener una capa intermedia que comprende un material metálico sobre el sustrato previamente a la obtención de la primera capa. In a particular embodiment of the process of the invention, this comprises obtaining an intermediate layer comprising a metallic material on the substrate prior to obtaining the first layer.

En otra realización particular del procedimiento de la invención, este comprende obtener una capa intermedia que comprende un mediador electroquímico sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo previamente a la obtención de la capa (d2) de gel polimérico conductor, tal y como se ha indicado previamente. In another particular embodiment of the process of the invention, this comprises obtaining an intermediate layer comprising an electrochemical mediator on the lower end of the working electrode prior to obtaining the conductive polymer gel layer (d2), as indicated previously.

Estas capas intermedias opcionales se pueden obtener también por aplicación de la dispersión o disolución correspondiente sobre la capa anterior mediante las diferentes técnicas mencionadas, seguida de la evaporación directa del disolvente. These optional intermediate layers can also be obtained by application of the corresponding dispersion or solution on the previous layer by the different techniques mentioned, followed by direct evaporation of the solvent.

El sensor electroquímico de la invención puede emplearse para la detección de analitos de distinta naturaleza tal como, por ejemplo, pesticidas (organofosfatos y carbamatos, por ejemplo), patógenos, metales pesados, neurotransmisores, metabolitos, etc. The electrochemical sensor of the invention can be used for the detection of analytes of different nature such as, for example, pesticides (organophosphates and carbamates, for example), pathogens, heavy metals, neurotransmitters, metabolites, etc.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma. The following examples illustrate the invention and should not be considered as limiting its scope.

Ejemplo 1 Example 1

Preparación de un sensor electroquímico para la detección del pesticida clorpirifós oxon que comprende una primera capa de grafito y una cuarta capa que comprende, a su vez, una capa de PEDOT sobre la que se deposita una capa de PVA (capa (d1)) Preparation of an electrochemical sensor for the detection of the pesticide chlorpyrifos oxon comprising a first layer of graphite and a fourth layer comprising, in turn, a layer of PEDOT on which a layer of PVA is deposited (layer (d1))

Se preparó un sensor electroquímico de tres electrodos según la invención para la detección de clorpirifós oxon, un pesticida organofosfato, basado en la inhibición de la producción de tiocolina, según el siguiente procedimiento. 1) Se imprimieron 3 pistas de una tinta conductora de grafito comercial (Electrodag PF-410) mediante serigrafía “screen printing” sobre un soporte plástico de policarbonato PC. 2) Se imprimió mediante serigrafia “screen printing” una capa de una tinta de Ag/AgCl comercial (Electromag. 6037 SS) únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia. 3) Se imprimió mediante serigrafia “screen printing” una capa protectora de pintura vinílica comercial (Electrodag 452 SS) sobre parte de los 3 electrodos, dejando expuesta únicamente la parte inferior del electrodo de trabajo, del electrodo de referencia y del contraelectrodo. 4a) Se imprimió mediante serigrafia “screen printing” sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una capa de una dispersión acuosa de polietilendioxitiofeno (PEDOT) al 1% en peso de politiofeno (preparada previamente a partir de una solución acuosa de monómero etilendioxitiofeno EDOT comercial (99%, Sigma-Aldrich Chemicals), 0,1 M y poli-estirensulfonato PSS comercial (Sigma-Aldrich Chemicals), 0,1 M como dopante-estabilizante a temperatura ambiente, que se agitó vigorosamente, se le añadió el oxidante persulfato amónico (0,1 M) y se dejó polimerizar). 4b) Se depositó manualmente sobre la capa de PEDOT una mezcla de disolución acuosa de polivinilalcohol fotoentrecruzable (PVA) comercial (Aldrich) al 6% en peso y una disolución de enzima acetilcolinesterasa comercial (de anguila eléctrica tipo V-S de Sigma) en tampón fosfato. La actividad de la disolución enzimática era de entre 0,07 y 0,18 UA/min según la relación PVA/enzima de la mezcla (30/70, 50/50 o 70/30). En cualquiera de los casos, se inmovilizó en el electrodo de trabajo 1 mU enzimática (cantidad necesaria para catalizar la conversión de 1 μmol de sustrato por minuto). La enzima quedó atrapada en el electrodo de trabajo tras la reticulación del prepolímero mediante exposición a luz halógena o Neón, de λ>400 nm, durante 24-72 horas, dependiendo de la cantidad de PVA en la mezcla PVA/enzima. A three electrode electrochemical sensor according to the invention was prepared for the detection of chlorpyrifos oxon, an organophosphate pesticide, based on the inhibition of thiocholine production, according to the following procedure. 1) 3 tracks of a commercial graphite conductive ink (Electrodag PF-410) were printed using screen printing on a PC polycarbonate plastic support. 2) A layer of a commercial Ag / AgCl ink (Electromag. 6037 SS) was printed by screen printing only on the lower end of the reference electrode. 3) A protective film of commercial vinyl paint (Electrodag 452 SS) was printed by screen printing on part of the 3 electrodes, exposing only the lower part of the working electrode, the reference electrode and the counter electrode. 4a) A layer of a 1% by weight aqueous polyethylenedioxythiophene (PEDOT) aqueous dispersion of polythiophene (pre-prepared from an aqueous solution of commercial ethylenedioxythiophene EDOT monomer) was printed by screen printing on the lower end of the working electrode (99%, Sigma-Aldrich Chemicals), 0.1 M and commercial PSS polystyrene sulfonate (Sigma-Aldrich Chemicals), 0.1 M as a dopant-stabilizer at room temperature, which was vigorously stirred, the persulfate oxidant was added ammonium (0.1 M) and allowed to polymerize). 4b) A mixture of 6% by weight commercial photo-crosslinkable polyvinyl alcohol (PVA) aqueous solution (Aldrich) and a commercial acetylcholinesterase enzyme solution (Sigma V-S type electric eel) in phosphate buffer was manually deposited on the PEDOT layer. The activity of the enzymatic solution was between 0.07 and 0.18 AU / min according to the PVA / enzyme ratio of the mixture (30/70, 50/50 or 70/30). In either case, 1 mU enzyme was immobilized on the working electrode (amount needed to catalyze the conversion of 1 μmol of substrate per minute). The enzyme was trapped in the working electrode after cross-linking of the prepolymer by exposure to halogen or Neon light, of λ> 400 nm, for 24-72 hours, depending on the amount of PVA in the PVA / enzyme mixture.

El sensor así obtenido presentaba la estructura en capas definida en la Figura 1 (vista superior) y en la Figura 2 (vista lateral), con las siguientes áreas de los electrodos: The sensor thus obtained presented the layered structure defined in Figure 1 (top view) and in Figure 2 (side view), with the following electrode areas:

�?rea del electrodo de trabajo: 58,09 mm2 Working electrode area: 58.09 mm2

�?rea del electrodo de referencia: 3,74 mm2 �? Reference electrode area: 3.74 mm2

�?rea del contraelectrodo: 7,9 mm2 Back electrode area: 7.9 mm2

y las siguientes relaciones entre dichas áreas: and the following relationships between these areas:

�?rea del electrodo de referencia/�?rea electrodo de trabajo = 0,064 mm2 �? Reference electrode area / �? Working electrode area = 0.064 mm2

�?rea contraelectrodo/�?rea electrodo de trabajo = 0,136 mm2 �? Counter electrode area / �? Working electrode area = 0.136 mm2

Tras obtener el sensor, se procedió a determinar la concentración de clorpirifós oxon en una disolución acuosa. Para ello, se depositó cloruro de acetiltiocolina (una gota de 30 μl, 50 mM) sobre la superficie de análisis del sensor, con lo que se produjo tiocolina enzimáticamente. La oxidación de esta tiocolina se determinó en el sensor a un potencial de 100 mV, con el compuesto politiofeno como mediador. La concentración de cloruro de acetil tiocolina necesaria para la obtención de una señal de intensidad de corriente máxima en el sensor se define como “concentración de saturación”. Tomando las condiciones de saturación como referencia, en presencia del pesticida clorpirifós oxon, la señal de intensidad de corriente obtenida es menor por la desactivación enzimática que produce el pesticida en el sensor. Esta disminución de la señal en presencia de diferentes concentraciones de pesticida posibilita la calibración del sensor, y posteriormente, su utilización en la cuantificación del pesticida en la disolución a ensayar. After obtaining the sensor, the concentration of chlorpyrifos oxon in an aqueous solution was determined. For this, acetylthiocholine chloride (a drop of 30 μl, 50 mM) was deposited on the sensor analysis surface, thereby producing thiocholine enzymatically. The oxidation of this thiocholine was determined in the sensor at a potential of 100 mV, with the polythiophene compound as mediator. The concentration of acetyl thiocholine chloride necessary to obtain a signal of maximum current intensity in the sensor is defined as "saturation concentration". Taking the saturation conditions as a reference, in the presence of the pesticide chlorpyrifos oxon, the current intensity signal obtained is lower due to the enzymatic deactivation produced by the pesticide in the sensor. This decrease in the signal in the presence of different concentrations of pesticide makes it possible to calibrate the sensor, and subsequently, its use in the quantification of the pesticide in the solution to be tested.

Así, se determinó el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla1yenla Figura 4. Thus, the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase was determined in the presence of different concentrations of oxon chlorpyrifos. The results obtained are shown in Table 1 in Figure 4.

TABLA 1 TABLE 1

Porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon Percentage of inhibition of the enzyme acetylcholinesterase in the presence of different concentrations of chlorpyrifos oxon

Como puede verse, los límites de detección son muy bajos, ya que es posible detectar 2.10−10 M de pesticida con un 7% de inhibición. As can be seen, the detection limits are very low, since it is possible to detect 2.10-10 M pesticide with a 7% inhibition.

Ejemplo 2 Example 2

Preparación de un sensor electroquímico para la detección del pesticida clorpirifós oxon que comprende una primera capa de grafito y una cuarta capa de PEDOT y PVA (capa (d2)) Preparation of an electrochemical sensor for the detection of the pesticide chlorpyrifos oxon comprising a first layer of graphite and a fourth layer of PEDOT and PVA (layer (d2))

Se preparó un sensor electroquímico de tres electrodos según la invención para la detección de clorpirifós oxon, un pesticida organofosfato, basado en la inhibición de la producción de tiocolina, según el siguiente procedimiento. Las primeras 3 capas se depositaron de manera idéntica a la descripción realizada en el ejemplo 1. A continuación, se procedió tal como sigue. 4) Se depositó manualmente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una disolución acuosa de polivinilalcohol fotoentrecruzable comercial (Aldrich) al 6% en peso, conteniendo la enzima acetilcolinesterasa comercial (de anguila eléctrica tipo V-S de Sigma) de actividad definida en su interior (entre 0,07 y 0,18 UA/min según fuera la relación PVA/enzima de la mezcla (30/70, 50/50 o 70/30), y una solución de monómero etilendioxitiofeno EDOT comercial (99%, Sigma-Aldrich Chemicals) 0,1 M. El monómero se hizo polimerizar mediante polimerización enzimática empleando la enzima Peroxidasa de rábano (HRP tipo VI de Sigma)/H2O2 (0,3 mg/ml) y, finalmente, el prepolímero de PVA se retículo mediante exposición a luz halógena o Neón, de λ>400 nm, durante 24-72 horas, dependiendo de la cantidad de PVA en la mezcla PVA/enzima, quedando la enzima finalmente atrapada dentro de un gel polimérico conductor. A three electrode electrochemical sensor according to the invention was prepared for the detection of chlorpyrifos oxon, an organophosphate pesticide, based on the inhibition of thiocholine production, according to the following procedure. The first 3 layers were deposited identically to the description made in Example 1. Next, the procedure was as follows. 4) An aqueous solution of 6% by weight commercial polyvinyl alcohol (Aldrich) polyvinyl alcohol (Aldrich) alcohol containing the commercial acetylcholinesterase enzyme (of Sigma type VS electric eel) of activity defined within it was manually deposited on the lower end of the working electrode ( between 0.07 and 0.18 AU / min depending on the PVA / enzyme ratio of the mixture (30/70, 50/50 or 70/30), and a solution of commercial EDOT ethylenedioxythiophene monomer (99%, Sigma-Aldrich Chemicals) 0.1 M. The monomer was polymerized by enzymatic polymerization using the enzyme Radish Peroxidase (Sigma HRP type VI) / H2O2 (0.3 mg / ml) and, finally, the PVA prepolymer was crosslinked by exposure in halogen or Neon light, of λ> 400 nm, for 24-72 hours, depending on the amount of PVA in the PVA / enzyme mixture, the enzyme being finally trapped inside a conductive polymer gel.

El sensor así obtenido presentaba la estructura en capas definida en la Figura 1 (vista superior) y en la Figura 3 (vista lateral), con las áreas y relaciones de áreas del Ejemplo 1. The sensor thus obtained presented the layered structure defined in Figure 1 (top view) and in Figure 3 (side view), with the areas and area relationships of Example 1.

Tras obtener el sensor de la invención, se procedió a determinar la concentración de clorpirifós oxon en una disolución acuosa. Para ello, se depositó cloruro de acetiltiocolina (una gota de 30 μl, 50 mM) sobre la superficie de análisis del sensor, con lo que se produjo tiocolina enzimáticamente. La oxidación de esta tiocolina se determinó en el sensor a un potencial de 100 mV, con el compuesto politiofeno como mediador. La concentración de cloruro de acetil tiocolina necesaria para la obtención de una señal de intensidad de corriente máxima en el sensor se define como “concentración de saturación”. Tomando las condiciones de saturación como referencia, en presencia del pesticida clorpirifós oxon, la señal de intensidad de corriente obtenida es menor por la desactivación enzimática que produce el pesticida en el sensor. Esta disminución de la señal en presencia de diferentes concentraciones de pesticida posibilita la calibración del sensor, y posteriormente, su utilización en la cuantificación del pesticida en la disolución a ensayar. After obtaining the sensor of the invention, the concentration of chlorpyrifos oxon in an aqueous solution was determined. For this, acetylthiocholine chloride (a drop of 30 μl, 50 mM) was deposited on the sensor analysis surface, thereby producing thiocholine enzymatically. The oxidation of this thiocholine was determined in the sensor at a potential of 100 mV, with the polythiophene compound as mediator. The concentration of acetyl thiocholine chloride necessary to obtain a signal of maximum current intensity in the sensor is defined as "saturation concentration". Taking the saturation conditions as a reference, in the presence of the pesticide chlorpyrifos oxon, the current intensity signal obtained is lower due to the enzymatic deactivation produced by the pesticide in the sensor. This decrease in the signal in the presence of different concentrations of pesticide makes it possible to calibrate the sensor, and subsequently, its use in the quantification of the pesticide in the solution to be tested.

Así, se determinó el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla2yenlaFigura 5. Thus, the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase was determined in the presence of different concentrations of oxon chlorpyrifos. The results obtained are shown in Table 2 in Figure 5.

TABLA 2 TABLE 2

Porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon Percentage of inhibition of the enzyme acetylcholinesterase in the presence of different concentrations of chlorpyrifos oxon

Como puede verse, los límites de detección son muy bajos, ya que es posible detectar 3.10−10 M de pesticida con un 10% de inhibición. As can be seen, the detection limits are very low, since it is possible to detect 3.10-10 M pesticide with a 10% inhibition.

Ejemplo 3 Example 3

Preparación de un sensor electroquímico para la detección del pesticida clorpirifós oxon que comprende una primera capa de grafito y una capa intermedia de cobalto ftalocianina sobre la que se deposita la cuarta capa de PEDOT y PVA (capa (d2)) Preparation of an electrochemical sensor for the detection of the pesticide chlorpyrifos oxon comprising a first layer of graphite and an intermediate layer of cobalt phthalocyanine on which the fourth layer of PEDOT and PVA is deposited (layer (d2))

Se preparó un sensor electroquímico de tres electrodos según la invención para la detección de clorpirifós oxon, un pesticida organofosfato, basado en la inhibición de la producción de tiocolina, según el siguiente procedimiento. Las primeras 3 capas se depositaron de manera idéntica a la descripción realizada en el ejemplo 1. A continuación, se procedió tal como sigue. 3’)-Se depositó mediante serigrafia “screen printing” sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una capa de una dispersión (3,8 mg/ml) de cobalto ftalocianina (CoPh) obtenida mediante la disolución de CoPh comercial (Sigma) en una solución acuosa de hidroxietilcelulosa (HEC) al 4%. 4) Se depositó manualmente sobre la capa anterior una disolución acuosa de polivinilalcohol fotoentrecruzable comercial (Aldrich) al 6% en peso, conteniendo la enzima acetilcolinesterasa comercial (de anguila eléctrica tipo V-S de Sigma) de actividad definida en su interior (entre 0,07 y 0,18 UA/min según fuera la relación PVA/enzima de la mezcla (30/70, 50/50 o 70/30), y una solución de monómero etilendioxitiofeno EDOT comercial (99%, Sigma-Aldrich Chemicals) 0,1 M. El monómero se hizo polimerizar mediante polimerización enzimática empleando la enzima Peroxidasa de rábano (HRP tipo VI de Sigma)/H2O2 (0,3 mg/ml) y, finalmente, el prepolímero de PVA se retículo mediante exposición a luz halógena o Neón, de λ>400 nm, durante 24-72 horas, dependiendo de la cantidad de PVA en la mezcla PVA/enzima, quedando la enzima finalmente atrapada dentro de un gel polimérico conductor. A three electrode electrochemical sensor according to the invention was prepared for the detection of chlorpyrifos oxon, an organophosphate pesticide, based on the inhibition of thiocholine production, according to the following procedure. The first 3 layers were deposited identically to the description made in Example 1. Next, the procedure was as follows. 3 ') - A layer of a dispersion (3.8 mg / ml) of phthalocyanine cobalt (CoPh) obtained by dissolving commercial CoPh (Sigma) was deposited by screen printing on the lower end of the working electrode a 4% aqueous solution of hydroxyethyl cellulose (HEC). 4) An aqueous solution of 6% by weight commercial photo-crosslinkable polyvinyl alcohol alcohol (Aldrich) was manually deposited on the previous layer, containing the commercial acetylcholinesterase enzyme (Sigma type VS electric eel) of activity defined therein (between 0.07 and 0.18 AU / min depending on the PVA / enzyme ratio of the mixture (30/70, 50/50 or 70/30), and a solution of commercial EDOT ethylenedioxythiophene monomer (99%, Sigma-Aldrich Chemicals) 0, 1 M. The monomer was polymerized by enzymatic polymerization using the enzyme Radish Peroxidase (Sigma HRP type VI) / H2O2 (0.3 mg / ml) and, finally, the PVA prepolymer was crosslinked by exposure to halogen light or Neon, of λ> 400 nm, for 24-72 hours, depending on the amount of PVA in the PVA / enzyme mixture, the enzyme being finally trapped inside a conductive polymer gel.

El sensor así obtenido presentaba la estructura en capas definida en la Figura 1 (vista superior) y en la Figura 3 (vista lateral), con las áreas y relaciones de áreas del Ejemplo 1. The sensor thus obtained presented the layered structure defined in Figure 1 (top view) and in Figure 3 (side view), with the areas and area relationships of Example 1.

Tras obtener el sensor de la invención, se procedió a determinar la concentración de clorpirifós oxon en una disolución acuosa. Para ello, se depositó cloruro de acetiltiocolina (una gota de 30 μl, 50 mM) sobre la superficie de análisis del sensor, con lo que se produjo tiocolina enzimáticamente. La oxidación de esta tiocolina se determinó en el sensor a un potencial de 100 mV, con el compuesto politiofeno como mediador. La concentración de cloruro de acetil tiocolina necesaria para la obtención de una señal de intensidad de corriente máxima en el sensor se define como “concentración de saturación”. Tomando las condiciones de saturación como referencia, en presencia del pesticida clorpirifós oxon, la señal de intensidad de corriente obtenida es menor por la desactivación enzimática que produce el pesticida en el sensor. Esta disminución de la señal en presencia de diferentes concentraciones de pesticida posibilita la calibración del sensor, y posteriormente, su utilización en la cuantificación del pesticida en la disolución a ensayar. After obtaining the sensor of the invention, the concentration of chlorpyrifos oxon in an aqueous solution was determined. For this, acetylthiocholine chloride (a drop of 30 μl, 50 mM) was deposited on the sensor analysis surface, thereby producing thiocholine enzymatically. The oxidation of this thiocholine was determined in the sensor at a potential of 100 mV, with the polythiophene compound as mediator. The concentration of acetyl thiocholine chloride necessary to obtain a signal of maximum current intensity in the sensor is defined as "saturation concentration". Taking the saturation conditions as a reference, in the presence of the pesticide chlorpyrifos oxon, the current intensity signal obtained is lower due to the enzymatic deactivation produced by the pesticide in the sensor. This decrease in the signal in the presence of different concentrations of pesticide makes it possible to calibrate the sensor, and subsequently, its use in the quantification of the pesticide in the solution to be tested.

Así, se determinó el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla3yenlaFigura 6. Thus, the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase was determined in the presence of different concentrations of oxon chlorpyrifos. The results obtained are shown in Table 3 and Figure 6.

TABLA 3 TABLE 3

Porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon Percentage of inhibition of the enzyme acetylcholinesterase in the presence of different concentrations of chlorpyrifos oxon

Como puede verse, los límites de detección son muy bajos, ya que es posible detectar 2.10−10 M de pesticida con un 9% de inhibición. As can be seen, the detection limits are very low, since it is possible to detect 2.10-10 M pesticide with a 9% inhibition.

Ejemplo 4 Example 4

Preparación de un sensor electroquímico para la detección del pesticida clorpirifós oxon que comprende una capa intermedia de plata sobre la que se deposita una primera capa de grafito y una cuarta capa que comprende, a su vez, una capa de PEDOT sobre la que se deposita una capa de PVA (capa (d1)) Preparation of an electrochemical sensor for the detection of the pesticide chlorpyrifos oxon comprising an intermediate layer of silver on which a first layer of graphite is deposited and a fourth layer comprising, in turn, a layer of PEDOT on which a PVA layer (layer (d1))

Se preparó un sensor electroquímico de tres electrodos según la invención para la detección de clorpirifós oxon, un pesticida organofosfato, basado en la inhibición de la producción de tiocolina, según el siguiente procedimiento. 1’) Se imprimieron tres pistas de una de tinta conductora de plata comercial (Acheson) mediante serigrafia “screen printing” sobre un soporte plástico de policarbonato PC. 1) Se imprimieron 3 pistas de una tinta conductora de grafito comercial (Electrodag PF-410) mediante serigrafia “screen printing” sobre la capa de plata anterior. Las capas 2 y 3 se depositaron de manera idéntica a cómo se efectuó en el ejemplo 1. 4a) Se imprimió mediante serigrafia “screen printing” sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo una capa de una dispersión acuosa de polietilendioxitiofeno (PEDOT) al 1% en peso de politiofeno preparada previamente. Para ello, se disolvieron cantidades equimolares de monómero etilendioxitiofeno EDOT (0,1 M) y dopante-estabilizante poliestirensulfonato PSS (0,1 M) en agua a temperatura ambiente y se ajustó el pH a 2 mediante adición de HC1; a continuación, se añadieron 0,3 mg/ml de peroxidasa de rábano comercial (HRP tipo VI de Sigma) y una cantidad equimolar de H2O2 (0,055 M) y se dejó polimerizar durante 16 horas a 4ºC obteniendo una dispersión de aproximadamente un 1% de PEDOT en agua. 4b) Se depositó manualmente sobre la capa de PEDOT una mezcla de disolución acuosa de polivinilalcohol fotoentrecruzable (PVA) comercial (Aldrich) al 6% en peso y una disolución de enzima acetilcolinesterasa comercial (de anguila eléctrica tipo V-S de Sigma) en tampón fosfato. La actividad de la disolución enzimática era de entre 0,07 y 0,18 UA/min según la relación PVA/enzima de la mezcla (30/70, 50/50 o 70/30). En cualquiera de los casos, se inmovilizó en el electrodo de trabajo 1 mU enzimática (cantidad necesaria para catalizar la conversión de 1 μmol de sustrato por minuto). La enzima quedó atrapada en el electrodo de trabajo tras la reticulación del prepolímero mediante exposición a luz halógena o Neón, de λ>400 nm, durante 24-72 horas,dependiendo de la cantidad de PVA en la mezcla PVA/enzima. A three electrode electrochemical sensor according to the invention was prepared for the detection of chlorpyrifos oxon, an organophosphate pesticide, based on the inhibition of thiocholine production, according to the following procedure. 1 ’) Three tracks of one of commercial silver conductive ink (Acheson) were printed using screen printing on a PC polycarbonate plastic support. 1) 3 tracks of a commercial graphite conductive ink (Electrodag PF-410) were printed by screen printing on the previous silver layer. Layers 2 and 3 were deposited identically to how it was done in Example 1. 4a) A layer of an aqueous dispersion of polyethylenedioxythiophene (PEDOT) to 1 was printed by screen printing on the lower end of the working electrode. % by weight of previously prepared polythiophene. To do this, equimolar amounts of EDOT (0.1 M) ethylenedioxythiophene monomer and PSS polystyrene sulfonate dopant (0.1 M) were dissolved in water at room temperature and the pH was adjusted to 2 by adding HC1; then, 0.3 mg / ml of commercial horseradish peroxidase (Sigma HRP type VI) and an equimolar amount of H2O2 (0.055 M) were added and allowed to polymerize for 16 hours at 4 ° C obtaining a dispersion of approximately 1% of PEDOT in water. 4b) A mixture of 6% by weight commercial photo-crosslinkable polyvinyl alcohol (PVA) aqueous solution (Aldrich) and a commercial acetylcholinesterase enzyme solution (Sigma V-S type electric eel) in phosphate buffer was manually deposited on the PEDOT layer. The activity of the enzymatic solution was between 0.07 and 0.18 AU / min according to the PVA / enzyme ratio of the mixture (30/70, 50/50 or 70/30). In either case, 1 mU enzyme was immobilized on the working electrode (amount needed to catalyze the conversion of 1 μmol of substrate per minute). The enzyme was trapped in the working electrode after cross-linking of the prepolymer by exposure to halogen or Neon light, of λ> 400 nm, for 24-72 hours, depending on the amount of PVA in the PVA / enzyme mixture.

El sensor así obtenido presentaba la estructura en capas definida en la Figura 1 (vista superior) y en la Figura 2 (vista lateral), con las áreas y relaciones de áreas del Ejemplo 1. The sensor thus obtained had the layered structure defined in Figure 1 (top view) and in Figure 2 (side view), with the areas and area relationships of Example 1.

Tras obtener el sensor de la invención, se procedió a determinar la concentración de clorpirifós oxon en una disolución acuosa. Para ello, se depositó cloruro de acetiltiocolina (una gota de 30 μl, 50 mM) sobre la superficie de análisis del sensor, con lo que se produjo tiocolina enzimáticamente. La oxidación de esta tiocolina se determinó en el sensor a un potencial de 100 mV, con el compuesto politiofeno como mediador. La concentración de cloruro de acetil tiocolina necesaria para la obtención de una señal de intensidad de corriente máxima en el sensor se define como “concentración de saturación”. Tomando las condiciones de saturación como referencia, en presencia del pesticida clorpirifós oxon, la señal de intensidad de corriente obtenida es menor por la desactivación enzimática que produce el pesticida en el sensor. Esta disminución de la señal en presencia de diferentes concentraciones de pesticida posibilita la calibración del sensor, y posteriormente, su utilización en la cuantificación del pesticida en la disolución a ensayar. After obtaining the sensor of the invention, the concentration of chlorpyrifos oxon in an aqueous solution was determined. For this, acetylthiocholine chloride (a drop of 30 μl, 50 mM) was deposited on the sensor analysis surface, thereby producing thiocholine enzymatically. The oxidation of this thiocholine was determined in the sensor at a potential of 100 mV, with the polythiophene compound as mediator. The concentration of acetyl thiocholine chloride necessary to obtain a signal of maximum current intensity in the sensor is defined as "saturation concentration". Taking the saturation conditions as a reference, in the presence of the pesticide chlorpyrifos oxon, the current intensity signal obtained is lower due to the enzymatic deactivation produced by the pesticide in the sensor. This decrease in the signal in the presence of different concentrations of pesticide makes it possible to calibrate the sensor, and subsequently, its use in the quantification of the pesticide in the solution to be tested.

Así, se determinó el porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla4yenlaFigura 7. Thus, the percentage inhibition of the enzyme acetylcholinesterase was determined in the presence of different concentrations of oxon chlorpyrifos. The results obtained are shown in Table 4 and Figure 7.

TABLA 4 TABLE 4

Porcentaje de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa en presencia de distintas concentraciones de clorpirifós oxon Percentage of inhibition of the enzyme acetylcholinesterase in the presence of different concentrations of chlorpyrifos oxon

Como puede verse, los límites de detección son muy bajos, ya que es posible detectar 2.10−10 M de pesticida con un 8% de inhibición. As can be seen, the detection limits are very low, since it is possible to detect 2.10-10 M pesticide with 8% inhibition.

Claims (17)

REIVINDICACIONES 1. Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos caracterizado porque comprende: 1. Electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media characterized in that it comprises:

(a) (to)

una primera capa (1) que comprende un material carbonoso depositada sobre un sustrato, constituyendo dicha capa el sistema de electrodos del sensor electroquímico que está compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; a first layer (1) comprising a carbonaceous material deposited on a substrate, said layer constituting the electrochemical sensor electrode system which is composed of at least one reference electrode, a working electrode and a counter electrode;

(b) (b)

una segunda capa (2) que comprende un material metálico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia; a second layer (2) comprising a metallic material deposited only on the lower end of the reference electrode;

(c) (C)

una tercera capa (3) que comprende un material aislante depositada sobre una parte del sistema de electrodos, siendo dicha parte la que queda entre la superficie de análisis (3a) y los contactos eléctricos (3b) del equipo de medida, de modo que quede expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos; a third layer (3) comprising an insulating material deposited on a part of the electrode system, said part being the one between the analysis surface (3a) and the electrical contacts (3b) of the measuring equipment, so that it remains exposed only the lower part of the electrodes of the electrode system;

(d) (d)

una cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo seleccionada entre (d1) y (d2), donde: a fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel deposited only on the lower end of the working electrode selected between (d1) and (d2), where:

(d1) comprende una capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha capa de politiofeno; y (d1) comprises a layer comprising a polythiophene deposited on the lower end of the working electrode and a layer comprising a non-conductive polymer gel deposited on said polythiophene layer; Y (d2) es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno. (d2) is a conductive polymer gel layer comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene.

2. 2.

Sensor según la reivindicación 1, caracterizado porque la cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo es la capa (d2) de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno. Sensor according to claim 1, characterized in that the fourth layer (4) comprising polythiophene and polymer gel deposited only on the lower end of the working electrode is the conductive polymer gel layer (d2) comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene .

3. 3.

Sensor según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una capa adicional que comprende un mediador electroquímico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y sobre la que se deposita la capa (d2) de gel polimérico conductor. Sensor according to claim 2, characterized in that it comprises an additional layer comprising an electrochemical mediator deposited only on the lower end of the working electrode and on which the conductive polymer gel layer (d2) is deposited.

4. Four.

Sensor según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una capa intermedia que comprende un material metálico depositada sobre el sustrato y sobre la que se deposita la primera capa. Sensor according to claim 1, characterized in that it comprises an intermediate layer comprising a metallic material deposited on the substrate and on which the first layer is deposited.

5. 5.

Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a4, caracterizado porque el politiofeno contiene unidades estructurales repetitivas de fórmula (I), Sensor according to any one of claims 1-4, characterized in that the polythiophene contains repetitive structural units of formula (I),

en la que R1 yR2 son independientemente un grupo alquilo C1-C12 o forman un grupo 1, n-alquileno C1-C12, siendo n = 1-12, opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, vinileno, bencilo, fenilo, halógeno, wherein R1 and R2 are independently a C1-C12 alkyl group or form a 1, n-C1-C12 alkylene group, where n = 1-12, optionally substituted by a C1-C12 alkyl group, C2-C12 alkene, vinyl, benzyl, phenyl, halogen, o por un grupo funcional éster, amino, amido o éter opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1-C12. or by an ester, amino, amido or ether functional group optionally substituted by a C1-C12 alkyl group.

6. 6.

Sensor según la reivindicación 5, caracterizado porque en el politiofeno los grupos R1 yR2 forman un grupo alquileno seleccionado entre metileno, 1,2-etileno y 1,3-propileno. Sensor according to claim 5, characterized in that in the polythiophene the groups R1 and R2 form an alkylene group selected from methylene, 1,2-ethylene and 1,3-propylene.

7. 7.

Sensor según la reivindicación 6, caracterizado porque en el politiofeno los grupos R1 yR2 forman un grupo 1,2-etileno. Sensor according to claim 6, characterized in that in the polythiophene the groups R1 and R2 form a 1,2-ethylene group.

8. Sensor según la reivindicación 5, caracterizado porque el politiofeno comprende un dopante aniónico. 8. Sensor according to claim 5, characterized in that the polythiophene comprises an anionic dopant.

9. 9.

Sensor según la reivindicación 8, caracterizado porque el dopante aniónico es un anión inorgánico seleccionado entre un anión sulfato, cloruro y bromuro; un anión orgánico con grupos sulfonato o fosfato seleccionado entre un ácido p-toluen-sulfónico y un ácido p-toluen-fosfónico; o un polianión orgánico seleccionado entre ácidos carboxílicos poliméricos, preferiblemente poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico) o poli(ácido maleico); ácidos sulfónicos poliméricos, preferiblemente ácido poli (estiren sulfónico) o ácido poli (vinil sulfónico); o copolímeros de ácidos vinilcarboxílicos y ácidos vinilsulfónicos con otros monómeros polimerizables, preferiblemente estireno y monómeros acrílicos o metacrílicos. Sensor according to claim 8, characterized in that the anionic dopant is an inorganic anion selected from a sulfate, chloride and bromide anion; an organic anion with sulfonate or phosphate groups selected from a p-toluene sulfonic acid and a p-toluene phosphonic acid; or an organic polyanion selected from polymeric carboxylic acids, preferably poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid) or poly (maleic acid); polymeric sulfonic acids, preferably poly (styrene sulfonic acid) or poly (vinyl sulfonic acid); or copolymers of vinylcarboxylic acids and vinyl sulfonic acids with other polymerizable monomers, preferably styrene and acrylic or methacrylic monomers.

10. 10.

Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a9, caracterizado porque el material carbonoso de la primera capa se selecciona entre grafito, negro de humo y nanotubos de carbono. Sensor according to any one of claims 1-9, characterized in that the carbonaceous material of the first layer is selected from graph, carbon black and carbon nanotubes.

11. Sensor según la reivindicación 10, caracterizado porque el material carbonoso es grafito. 11. Sensor according to claim 10, characterized in that the carbonaceous material is graphical.

12. 12.

Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a11, caracterizado porque la cuarta capa comprende además un compuesto biológico. Sensor according to any one of claims 11 to 11, characterized in that the fourth layer further comprises a biological compound.

13. 13.

Sensor según la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto biológico se selecciona entre enzimas, coenzimas, anticuerpos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, glucoproteínas, lipoproteínas, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, monosacáridos, oligosacáridos y bacterias. Sensor according to claim 12, characterized in that the biological compound is selected from enzymes, coenzymes, antibodies, oligopeptides, polypeptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, monosaccharides, oligosaccharides and bacteria.

14. 14.

Procedimiento para la preparación de un sensor electroquímico según las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende: Method for preparing an electrochemical sensor according to claims 1-13, characterized in that it comprises:

(A) (TO)

obtener sobre el sustrato la primera capa que comprende un material carbonoso y que constituye el sistema de electrodos compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; obtaining on the substrate the first layer comprising a carbonaceous material and constituting the electrode system composed of at least one reference electrode, a working electrode and a counter electrode;

(B) (B)

obtener la segunda capa que comprende un material metálico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia; obtaining the second layer comprising a metallic material only on the lower end of the reference electrode;

(C) (C)

obtener la tercera capa que comprende material aislante sobre la parte del sistema de electrodos que queda entre la superficie de análisis y los contactos eléctricos del equipo de medida de modo que deje expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos; y obtaining the third layer comprising insulating material on the part of the electrode system that remains between the analysis surface and the electrical contacts of the measuring equipment so as to expose only the lower part of the electrodes of the electrode system; Y

(D) (D)

obtener la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo. obtain the fourth layer comprising polythiophene and polymer gel only on the lower end of the working electrode.

15. fifteen.

Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico se obtiene mediante un método seleccionado entre (D1) y (D2), donde: Method according to claim 15, characterized in that the fourth layer comprising polythiophene and polymer gel is obtained by a method selected from (D1) and (D2), wherein:

(D1) comprende obtener la capa que comprende un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y obtener después la capa que comprende un gel polimérico no conductor sobre la capa que comprende un politiofeno; y (D1) comprises obtaining the layer comprising a polythiophene on the lower end of the working electrode and then obtaining the layer comprising a non-conductive polymeric gel on the layer comprising a polythiophene; Y (D2) comprende obtener la capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo. (D2) comprises obtaining the conductive polymer gel layer comprising a non-conductive polymer gel and a polythiophene on the lower end of the working electrode. 16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, caracterizado porque la obtención de la cuarta capa comprende: 16. Method according to any one of claims 14-15, characterized in that obtaining the fourth layer comprises:

(i) (i)

la aplicación de disoluciones verdaderas, dispersiones coloidales o dispersiones estables de partículas finamente divididas, bien acuosas bien base disolvente, de politiofeno previamente obtenidas mediante polimerización oxidativa o polimerización enzimática; o the application of true solutions, colloidal dispersions or stable dispersions of finely divided particles, either aqueous or solvent based, of polythiophene previously obtained by oxidative polymerization or enzymatic polymerization; or

(ii) (ii)

la aplicación de disoluciones, bien acuosas bien base disolvente, de monómeros tiofeno y posterior polimerización in situ de los mismos. the application of solutions, either aqueous or solvent based, of thiophene monomers and subsequent in situ polymerization thereof.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND N.º solicitud: 200930539 Application no .: 200930539 ESPAÑA SPAIN Fecha de presentación de la solicitud: 30.07.2009 Date of submission of the application: 30.07.2009 Fecha de prioridad: Priority Date: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE 51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional 51 Int. Cl.: See Additional Sheet DOCUMENTOS RELEVANTES RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category

Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected

A TO

ISTAMBOULIE, G., et al., The use of artificial neural networks for the selective detection of two organophosphate insecticides: chlorpyrifos and chlorfenvinfos, Talanta, 2009, Vol. 79, págs. 507-511. Resumen; apartados: 2.1, 2.3 y 2.4. 1-16 ISTAMBOULIE, G., et al., The use of artificial neural networks for the selective detection of two organophosphate insecticides: chlorpyrifos and chlorfenvinfos, Talanta, 2009, Vol. 79, p. 507-511. Summary; Sections: 2.1, 2.3 and 2.4. 1-16

A TO

VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbaryl, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal. Chem., 2008, Vol. 392, págs. 699-707. Resumen; apartado: "Experimental"; fig. 1. 1-16 VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbaryl, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal Chem., 2008, Vol. 392, p. 699-707. Summary; section: "Experimental"; fig. one. 1-16

A TO

ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, págs. 506-512. Resumen; apartados: 2.2 y 2.6. 1-16 ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, p. 506-512. Summary; Sections: 2.2 and 2.6. 1-16

A TO

GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, págs. 345-359. Resumen; apartados: 2 y 4. 1-16 GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, p. 345-359. Summary; Sections: 2 and 4. 1-16

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KROS, A., et al., Poly(pyrrole) versus poly(3,4-ethylenedioxythiophene): implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, págs. 289-295. Resumen. 1-16 KROS, A., et al., Poly (pyrrole) versus poly (3,4-ethylenedioxythiophene): implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, p. 289-295. Summary. 1-16

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WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 26.01.2006, resumen; ejemplo 4. 1-16 WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 26.01.2006, summary; example 4. 1-16

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 19.04.2011 Date of realization of the report 19.04.2011

Examinador M. García Poza Página 1/5 Examiner M. García Poza Page 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE Nº de solicitud: 200930539 Application number: 200930539 CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD CLASSIFICATION OBJECT OF THE APPLICATION C12Q1/00 (2006.01) G01N27/30 (2006.01) G01N33/487 (2006.01) G01N33/543 (2006.01)  C12Q1 / 00 (2006.01) G01N27 / 30 (2006.01) G01N33 / 487 (2006.01) G01N33 / 543 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols) C12Q, G01N C12Q, G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, search terms used) INVENES, EPODOC, WPI, CAPLUS, XPESP INVENES, EPODOC, WPI, CAPLUS, XPESP Informe del Estado de la Técnica Página 2/5 State of the Art Report Page 2/5 OPINIÓN ESCRITA  WRITTEN OPINION Nº de solicitud: 200930539 Application number: 200930539 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 19.04.2011 Date of Completion of Written Opinion: 04/19/2011 Declaración Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-16 SI NO Claims Claims 1-16 IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-16 SI NO Claims Claims 1-16 IF NOT

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986). Base de la Opinión.-  Opinion Base.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. This opinion has been made on the basis of the patent application as published. Informe del Estado de la Técnica Página 3/5 State of the Art Report Page 3/5 OPINIÓN ESCRITA  WRITTEN OPINION Nº de solicitud: 200930539 Application number: 200930539 1. Documentos considerados.-1. Documents considered.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01

ISTAMBOULIE, G., et al., The use of artificial neural networks for the selective detection of two organophosphate insecticides: chlorpyrifos and chlorfenvinfos, Talanta, 2009, Vol. 79, págs. 507-511. ISTAMBOULIE, G., et al., The use of artificial neural networks for the selective detection of two organophosphate insecticides: chlorpyrifos and chlorfenvinfos, Talanta, 2009, Vol. 79, p. 507-511.

D02 D02

VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbaryl, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal. Chem., 2008, Vol. 392, págs. 699-707. VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbaryl, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal Chem., 2008, Vol. 392, p. 699-707.

D03 D03

ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, págs. 506-512. ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, p. 506-512.

D04 D04

GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, págs. 345-359. GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, p. 345-359.

D05 D05

KROS, A., et al., Poly(pyrrole) versus poly(3,4ethylenedioxythiophene): implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, págs. 289-295. KROS, A., et al., Poly (pyrrole) versus poly (3,4ethylenedioxythiophene): implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, p. 289-295.

D06 D06

WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 26.01.2006 WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 01/26/2006

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración 2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement El objeto de la invención es un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos. The object of the invention is an electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media. El documento D01 divulga biosensores de acetilcolinesterasa desarrollados para resolver mezclas de dos pesticidas. Estos sensores tienen un sistema de tres electrodos: el electrodo de trabajo de carbono modificado con cobalto ftalocianina (CoPh), el contraelectrodo de grafito y el electrodo de referencia de Ag/AgCl. Sobre el electrodo de trabajo se encuentran las enzimas inmovilizadas por un fotopolímero basado en poli(vinil alcohol). Document D01 discloses acetylcholinesterase biosensors developed to solve mixtures of two pesticides. These sensors have a three electrode system: the carbon working electrode modified with cobalt phthalocyanine (CoPh), the graphite counter electrode and the Ag / AgCl reference electrode. Enzymes immobilized by a photopolymer based on poly (vinyl alcohol) are located on the working electrode. El documento D02 divulga biosensores de acetilcolinesterasa desarrollados para cuantificación de diferentes pesticidas. Estos sensores tienen un sistema de tres electrodos que se forman con las siguientes capas: una capa conductora de plata, una capa de carbono, una capa de Ag/AgCl sobre el electrodo de referencia, una capa de Co-Ph sobre el electrodo de trabajo y finalmente una capa aislante. Las enzimas se colocan sobre el electrodo de trabajo inmovilizadas por una matriz polimérica. Document D02 discloses acetylcholinesterase biosensors developed for quantification of different pesticides. These sensors have a three electrode system that is formed with the following layers: a conductive layer of silver, a layer of carbon, a layer of Ag / AgCl on the reference electrode, a layer of Co-Ph on the working electrode and finally an insulating layer. Enzymes are placed on the working electrode immobilized by a polymer matrix. El documento D03 divulga un biosensor de acetilcolinesterasa desarrollado para detección de pesticidas. El sensor tiene un sistema de tres electrodos como en los documentos anteriores. En el electrodo de trabajo se incluye pasta de carbono con tetracianoquinodimetano (TCNQ) como mediador. Document D03 discloses an acetylcholinesterase biosensor developed for pesticide detection. The sensor has a three electrode system as in the previous documents. Carbon paste with tetracyanoquinodimethane (TCNQ) is included in the working electrode as a mediator. El documento D04 divulga la aplicación de polímeros conductores como biosensores, como por ejemplo el tiofeno. El interés de estos polímeros se encuentra en que pueden atrapar enzimas sobre electrodos. Document D04 discloses the application of conductive polymers as biosensors, such as thiophene. The interest of these polymers is that they can trap enzymes on electrodes. El documento D05 divulga biosensores de poli(3,4-etilenedioxitiofeno)(PEDOT) y poli(pirrol) como el componente activo. Estos biosensores están basados en membranas y se utilizan para la medición de glucosa. Este documento divulga que el PEDOT es un politiofeno con gran estabilidad electroquímica y que no es necesario utilizar un mediador. Document D05 discloses biosensors of poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) and poly (pyrrole) as the active component. These biosensors are membrane based and are used for glucose measurement. This document discloses that PEDOT is a polythiophene with great electrochemical stability and that it is not necessary to use a mediator. El documento D06 divulga un electrodo de enzimas constituido por una membrana conductora porosa en la que se deposita el polímero conductor en los poros de la misma y sobre el que se fijan las enzimas. Uno de los polímeros es el PEDOT. Document D06 discloses an enzyme electrode consisting of a porous conductive membrane in which the conductive polymer is deposited in the pores thereof and on which the enzymes are fixed. One of the polymers is the PEDOT. Ninguno de los documentos citados divulga un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos caracterizado porque comprende: una primera capa de material carbonoso, que constituye el sistema de electrodos compuesto por 3 electrodos; una segunda capa metálica depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo; una tercera capa aislante y una cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo. None of the documents cited discloses an electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media characterized in that it comprises: a first layer of carbonaceous material, which constitutes the electrode system composed of 3 electrodes; a second metallic layer deposited on the lower end of the working electrode; a third insulating layer and a fourth layer comprising polythiophene and polymer gel deposited on the lower end of the working electrode. Informe del Estado de la Técnica Página 4/5 State of the Art Report Page 4/5 OPINIÓN ESCRITA  WRITTEN OPINION Nº de solicitud: 200930539 Application number: 200930539 El sensor de la invención, recogido en la reivindicación 1, se diferencia de los divulgados en los documentos D01 a D03, en dos aspectos, principalmente. En primer lugar, en el sensor de la invención, la capa que define el sistema de electrodos es una capa de carbono. En segundo lugar, el componente activo del electrodo de trabajo en los documentos D01 a D03 es CoPh o TCNQ, siendo la única función del polímero la de fijar las enzimas al electrodo. Sin embargo, en el sensor de la invención la capa polimérica está formada por un polímero conductor que actúa como componente activo y como fijador de enzimas. No sería obvio para el experto en la materia, llegar al sensor de la invención a partir del estado de la técnica mencionado. The sensor of the invention, set forth in claim 1, differs from those disclosed in documents D01 to D03, in two aspects, mainly. First, in the sensor of the invention, the layer that defines the electrode system is a carbon layer. Secondly, the active component of the working electrode in documents D01 to D03 is CoPh or TCNQ, the sole function of the polymer being to fix the enzymes to the electrode. However, in the sensor of the invention the polymeric layer is formed by a conductive polymer that acts as an active component and as an enzyme fixative. It would not be obvious for the person skilled in the art to arrive at the sensor of the invention from the prior art mentioned. Por lo tanto, el objeto de la invención, según se recoge en las reivindicaciones 1 a 16 es nuevo y tiene actividad inventiva (Arts. 6.1 y 8.1 LP). Therefore, the object of the invention, as set out in claims 1 to 16 is new and has inventive activity (Arts. 6.1 and 8.1 LP). Informe del Estado de la Técnica Página 5/5 State of the Art Report Page 5/5