ES2355739T3 - Composiciones y métodos para la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rt-pcr). - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para amplificar una molécula de ácido nucleico, dicho procedimiento que comprende (a) mezclar un molde de ARN con una composición que comprende una transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas y una o más moléculas que contienen acetato para proporcionar el ion acetato a una concentración de aproximadamente 60 mM, para formar una mezcla; y (b) incubar dicha mezcla en condiciones suficientes para amplificar una molécula de ADN complementaria al total o una porción de dicho molde de ARN.
Description
Composiciones y métodos para la reacción en
cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa
(RT-PCR).
La presente invención está en los campos de la
biología molecular y celular.
La invención se refiere particularmente a
composiciones y procedimientos útiles para la amplificación de las
moléculas de ácido nucleico por la reacción en cadena de
polimerasa-transcriptasa inversa
(RT-PCR). Específicamente, la invención proporciona
composiciones y procedimientos para la amplificación de las
moléculas de ácido nucleico en un procedimiento
RT-PCR simplificado de una o dos etapas mediante el
uso de combinaciones de enzimas transcriptasa inversa y ADN
polimerasa termoestable en conjunto con moléculas que contienen
acetato (o combinaciones de moléculas que contienen azufre y
moléculas que contienen acetato) y opcionalmente albúmina sérica
bovina. La invención de este modo facilita la amplificación rápida
y eficiente de las moléculas de ácido nucleico y la detección y
cuantificación de las moléculas de ARN. La invención también es útil
en la producción y amplificación rápida de los ADNc (cadena simple
y cadena doble) que se pueden usar para una variedad de propósitos
industriales, médicos y forenses.
El término "transcriptasa inversa" describe
una clase de polimerasas caracterizada como ADN polimerasas
dependiente de ARN. Todas las transcriptasas inversas conocidas
requieren un cebador para sintetizar un transcripto de ADN desde un
molde de ARN. Históricamente, la transcriptasa inversa se ha usado
principalmente para transcribir ARNm en ADNc que posteriormente se
puede clonar en un vector para la manipulación adicional.
La transcriptasa inversa del virus de la
mioblastosis aviar (AMV) fue la primera ADN polimerasa dependiente
de ARN ampliamente usada (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1
(1977)). La enzima tiene actividad de ADN polimerasa dirigida al
ARN 5'-3', actividad de ADN polimerasa dirigida a
ADN 5'-3' y actividad de ARNasa H. ARNasa H es una
ribonucleasa procesiva 5' y 3' específica para la cadena de ARN para
los híbridos ARN-ADN (Perbal, A Practical Guide to
Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Los errores
de transcripción no se pueden corregir con la transcriptasa inversa
porque las transcriptasas inversas virales conocidas carecen de
actividad de exonucleasa 3'-5' necesaria para la
corrección (Saunders y Saunders, Microbial Genetics Applied to
Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). Un estudio detallado de
la actividad de la transcriptasa inversa de AMV y su actividad de
ARNasa H asociada ha sido presentada por Berger et al.,
Biochemistry 22:2365-2372 (1983).
Otra transcriptasa inversa que se usa
intensamente en la biología molecular es la transcriptasa inversa
originada del virus de leucemia murina Moloney
(M-MLV). Ver, por ejemplo, Gerard, G.R., ADN
5:271-279 (1986) y Kotewicz, M.L., et al.,
Gene 35:249-258 (1985). También se ha descripto la
transcriptasa inversa de M-MLV que carece
sustancialmente de actividad de ARNasa H. Ver, por ejemplo, Patente
U.S. Núm. 5,244,797.
Las transcriptasas inversas se han usado
extensamente en la transcripción inversa del ARN antes de la
amplificación por PCR. Este procedimiento, a menudo denominado como
ARN-PCR o RT-PCR, es ampliamente
usado para la detección y cuantificación del ARN.
Para tratar de resolver los problemas técnicos a
menudo asociados con la RT-PCR, se han desarrollado
numerosos protocolos que toman en cuenta las tres etapas básicas
del procedimiento: (a) la desnaturalización del ARN y la
hibridación del cebador inverso, (b) la síntesis de ADNc; y (c)
amplificación por PCR. En el llamado procedimiento
RT-PCR "no acoplado" (por ejemplo,
RT-PCR de dos etapas), la transcripción inversa se
realiza como una etapa independiente mediante el uso de la
condición de buffer óptima para la actividad de transcriptasa
inversa. Después de la síntesis de ADNc, la reacción se diluye para
disminuir el MgCl_{2} y las concentraciones de trifosfato de
desoxirribonucleósido (dNTP) para las condiciones óptimas para la
actividad de ADN polimerasa Taq, y se lleva a cabo una PCR de
acuerdo con condiciones estándares (ver Patentes U.S. Núm. 4.683.195
y 4.683,202). Por contraste, los procedimientos
RT-PCR "acoplados" usan un buffer común o
comprometido para las actividades de transcriptasa inversa y ADN
polimerasa Taq. En una versión, el apareamiento del cebador inverso
es una etapa separada precedente a la adición de enzimas, que
posteriormente se añade al recipiente de reacción único. En otra
versión, la actividad de transcriptasa inversa es un componente de
la ADN polimerasa Taq termoestable. El apareamiento y la síntesis
del ADNc se realizan en presencia de Mn^{++}, posteriormente se
realiza la PCR en presencia de Mg^{++} después de la eliminación
del Mn^{++} por un agente quelante. Finalmente, el procedimiento
"continuo" (por ejemplo, RT-PCR de una etapa)
integra las tres etapas de RT-PCR en una reacción
continua única que evita la apertura del tubo de reacción para la
adición del componente o enzima. Se ha descripto la
RT-PCR continua como un sistema de enzima único
mediante el uso de la actividad de transcriptasa inversa de ADN
polimerasa Taq termoestable y polimerasa Tth y como un sistema de
dos enzimas mediante el uso de ADN polimerasa
AMV-RT y Taq en el que se omitió la etapa de
desnaturalización del ARN inicial de 65ºC.
Los intentos para hacer más eficiente el proceso
de RT-PCR no han sido fáciles y varios informes han
documentado una interferencia entre la transcriptasa inversa y ADN
polimerasa Taq termoestable cuando se usan en combinación en una
RT-PCR de tubo único por baja sensibilidad o falta
de resultados. Por ejemplo, ha habido al menos un informe de una
inhibición general de la ADN polimerasa Taq cuando se mezcla con las
transcriptasas inversas en mezclas de RT-PCR de una
etapa/un tubo (Sellner, L.N., et al., Nucl. Acids Res.
20(7):1487-1490 (1992)). Este mismo informe
indicó que la inhibición no se limitó a un tipo de RT: tanto
AMV-RT como M-MLV-RT
inhibieron la ADN polimerasa Taq y limitaron la sensibilidad de la
RT-PCR. En las condiciones de reacción usadas en los
estudios de Sellner et al. (67 mM de
Tris-HCl, pH 8,8, 17 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 mM de
\beta-mercaptoetanol, 6 \muM de EDTA, 0,2 mg/ml
de gelatina), se halló que el grado de inhibición de Taq polimerasa
aumenta con la concentración creciente de RT, hasta una relación de
aproximadamente 3 unidades de RT:2 unidades de ADN polimerasa Taq
más allá de que Taq polimerasa se volvió completamente inactiva.
Otros informes describen intentos de desarrollar
condiciones para las reacciones de RT-PCR de una
etapa. Por ejemplo, se ha informado el uso de
AMV-RT para la RT-PCR de una etapa
en buffer que comprende 10 mM de Tris-HCl, (pH
8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, y 0,01% de gelatina
(Aatsinki, J.T., et al., BioTechniques
16(2):282-288 (1994)), mientras que otro
informe demostró la RT-PCR de una etapa mediante el
uso de una composición que comprende ADN polimerasa
AMV-RT y Taq en un buffer que consiste en 10 mM de
Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KCl, 0,01% de gelatina y
1,5 mM de MgCl_{2} (Mallet, F., et al., BioTechniques
18(4):678-687 (1995)). En las condiciones de
reacción usadas en este último informe, la sustitución de
M-MLV-RT (formas de ARNasa H+ o
ARNasa H+) para AMV-RT mostró la misma actividad
que en la reacción RT-PCR continua.
La presente invención se refiere generalmente a
las composiciones y procedimientos útiles para la
RT-PCR una etapa/un tubo, mediante el uso de
M-MLV-RT, o sus derivados ARNasa
deficiente en H ("ARNasa H+"), en combinación con una o más
ADN polimerasas, en presencia de moléculas que contienen acetato (o
combinaciones de moléculas que contienen azufre y moléculas que
contienen acetato) para aliviar la inhibición de PCR observada a
menudo cuando se usan composiciones que comprenden dos o más
enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa, en la que la
molécula que contiene acetato proporciona el ion acetato en una
concentración de aproximadamente
60 mM.
60 mM.
En particular, la invención se refiere a los
procedimientos para amplificar una molécula de ácido nucleico que
comprende (a) mezclar un molde de ARN con una composición que
comprende una transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de
Moloney (M-MLV), que preferentemente está
sustancialmente reducida en cuando a la actividad de ARNasa H y que
con máxima preferencia es SuperScript I o SuperScript II, en
combinación con una o más ADN polimerasas y una o más moléculas que
contienen acetato, en que la concentración de iones acetato es
aproximadamente 60 mM para formar una mezcla; y (b) incubar la
mezcla en condiciones suficientes para amplificar una molécula de
ADN complementario con el total o una porción del molde de ARN.
En realizaciones preferidas de tales
procedimientos, las ADN polimerasas usadas son ADN polimerasas
termoestables, y con máxima preferencia Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth,
VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl, o una mutante, variante o derivado de
estas; en este aspecto de la invención la más preferida es la ADN
polimerasa Taq.
En otros aspectos preferidos de la invención,
las ADN polimerasas puede comprender una primera ADN polimerasa que
tiene actividad de 3' exonucleasa, con máxima preferencia una ADN
polimerasa seleccionada del grupo que consiste en Pfu, Pwo,
DEEPVENT, VENT, Tne, Tma, Kod, y sus mutantes, variantes y
derivados, y una segunda ADN polimerasa que tiene actividad de 3'
exonucleasa sustancialmente reducida, con máxima preferencia una
ADN polimerasa seleccionada del grupo que consiste en Taq, Tfl, Tth,
y sus mutantes, variantes y derivados. En aspectos adicionales
preferidos de la invención, la relación de unidades de la
transcriptasa inversa a las ADN polimerasas es de aproximadamente
0,2:2 a aproximadamente 500:2, y en aspectos particularmente
preferidos la relación es de aproximadamente 0,5:2 a
aproximadamente 250:2 o mayor que aproximadamente 3:2.
La concentración de una o más moléculas que
contienen acetato es de aproximadamente 60 mM. La invención también
se refiere a procedimientos tales en el que la fuente de las
moléculas que contienen acetato es un buffer o una sal que contiene
acetato que puede ser acetato de amonio, acetato de magnesio,
TRIS-acetato, o acetato de manganeso, así como
otros buffer y sales que contienen acetato que serán familiares para
los expertos en la técnica.
La invención se refiere a tales procedimientos
en los que la mezcla además comprende una o más nucleótidos,
preferentemente trifosfatos de desoxirribonucleósido (con máxima
preferencia dATP, dUTP, dTTP, dGTP o dCTP), trifosfatos de
desoxirribonucleósido (con máxima preferencia ddATP, ddUTP, ddGTP,
ddTTP o ddCTP) o sus derivados. Tales nucleótidos opcionalmente se
pueden marcar en forma detectable (por ejemplo, con una marca
detectable radiactiva o no radiactiva).
La invención también se refiere a tales
procedimientos en los que la mezcla además comprende uno o más
cebadores de oligonucleótidos, que preferentemente son cebadores
oligo(dT), cebadores aleatorios, cebadores arbitrarios o
cebadores específicos del blanco, y que es más preferentemente un
cebador específico del gen.
\newpage
La invención también se refiere a tales
procedimientos en los que la etapa de incubación comprende (a)
incubar la mezcla a una temperatura (con máxima preferencia una
temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 60ºC) y
durante un tiempo suficiente para obtener una molécula de ADN
complementaria con el total o una porción del molde de ARN; y (b)
incubar la molécula de ADN complementaria con el molde de ARN a una
temperatura y durante un tiempo suficiente para amplificar la
molécula de ADN, preferentemente por medio de termociclado, más
preferentemente termociclado que comprende alternar calentamiento y
enfriamiento de la mezcla suficiente para amplificar dicha molécula
de ADN, y con máxima preferencia termociclado que comprende alternar
desde un primer intervalo de temperatura de aproximadamente 90ºC a
aproximadamente 100ºC, a un segundo intervalo de temperatura de
aproximadamente 40ºC a aproximadamente 75ºC, preferentemente de
aproximadamente 65ºC a aproximadamente 75ºC. En aspectos de la
invención particularmente preferidos, el termociclado se realiza más
de 10 veces, más preferentemente más de 20 veces.
La invención también se refiere a procedimientos
en los que la amplificación no está sustancialmente inhibida.
La invención también se refiere a procedimientos
para amplificar una molécula de ácido nucleico que comprende (a)
mezclar un molde de ARN con una composición que comprende una
transcriptasa inversa del virus de leucemia murina Moloney
(M-MLV), que preferentemente está sustancialmente
reducida en cuanto a la actividad de ARNasa H, en combinación con
una o más ADN polimerasas (con máxima preferencia seleccionada del
grupo que consiste en Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, VENT, DEEPVENT, Pwo,
Tfl, y sus mutante, variantes o derivados), una o más moléculas que
contienen acetato para proporcionar el ion acetato en una
concentración de aproximadamente 60 mM y una o más moléculas que
contienen potasio, para formar una mezcla; y (b) incubar la mezcla
en condicione suficientes para amplificar una molécula de ADN
complementario con el total o una porción del molde de
ARN.
ARN.
La invención también se refiere a composiciones
que comprenden una transcriptasa inversa del virus de leucemia
murina Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas y
una o más moléculas que contienen acetato (en el que la
concentración de acetato es aproximadamente 60 mM), o combinaciones
de una o más moléculas que contienen azufre y una o más moléculas
que contienen acetato en las concentraciones anteriores.
Otras realizaciones preferidas de la presente
invención serán evidentes para los expertos a la luz de los
siguientes dibujos y la descripción de la invención, y de las
reivindicaciones.
La Figura 1 es una fotografía de un gel teñido
con bromuro de etidio (EtdBr) que demuestra la inhibición de
RT-PCR por la transcriptasa inversa. Las calles 1,
10, 11 y 20 contienen fragmentos de ADN de tamaño de 100 pb.
La Figura 2A es una fotografía de un gel teñido
con EtdBr que demuestra el papel protector de la albúmina sérica
bovina (BSA) en RT-PCR de ARNm de
\beta-actina de 100 pg de molde de ARNm total de
HeLa. La calle 1 contiene un fragmento del tamaño de ADN, y la
flecha indica la secuencia blanco de \beta-actina
de 1026 pb.
La Figura 2B es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra el papel protector de la BSA en
RT-PCR de ARNm de CAT de 10^{5} copias de molde
de ARNm de CAT. La calle 1 contiene un fragmento del tamaño de ADN,
y la flecha indica la secuencia blanco de CAT de 653 pb.
La Figura 3 es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra el desempeño de varias RT en buffer que
contienen ion sulfato o BSA. Calle 1: fragmento del tamaño de ADN de
100 pb; Calles 2-5: 5 unidades/reacción de
AMV-RT; Calles 6-9: 5
unidades/reacción de M-MLV-RT;
Calles 10-13: 5 unidades/reacción de
M-MLV-RT (ARNasa H^{+}). La
flecha indica la secuencia blanco de CAT de 500 pb.
La Figura 4 es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra el efecto de la temperatura de reacción de la
transcripción inversa sobre la formación de producto de
RT-PCR. Las muestras duplicadas de 100 ng (calles
1-6) o 10 ng (calles 7-12) del ARN
total de HeLa se transcribió en forma inversa en las temperaturas
indicadas, y se amplificaron una secuencia blanco de la subunidad
\varepsilon de ADN polimerasa III de 606 pb (calles
1-6) o una secuencia blanco de 253 pb de
\beta-actina (calles 7-12) por
PCR. M: marcadores de tamaño de ADN.
La Figura 5 es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra el mejor rendimiento de los productos de
RT-PCR obtenidos por la realización de la reacción
de RT a temperaturas superiores. Las muestras duplicadas de 10 ng
de ARN total de tabaco (calles 1-6) o de 100 ng de
ARN total del HeLa (calles 7-12) se transcribieron
en forma inversa a 45ºC (calles 1, 2, 7 y 8), 50ºC (calles 3, 4, 9 y
10) o 55ºC (calles 5, 6, 11 y 12), y una secuencia blanco de GADPH
500 pb (punta de flecha; calles 1-6) o una secuencia
blanco de una subunidad \varepsilon de ADN polimerasa III de 1475
pb (flecha; calles 7-12) se amplificaron por PCR. M:
marcadores de tamaño de ADN; L: fragmento de tamaño de ácido
nucleico de 100 pb.
La Figura 6 es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra la sensibilidad y eficiencia de la invención en
RT-PCR de productos grandes (2-3
kb). Un fragmento de esclerosis tuberosa II de 2,78 kb se amplificó
a partir de varias cantidades de ARN total del HeLa que se
transcribió en forma inversa mediante el uso de las composiciones
de la invención sin (calles 1-6) o con (calles
7-12) la adición de 1 \mul de mezcla de enzima
ELONGASA o mediante el uso de un kit de RT del proveedor A (calles
13-18). Las calles 1, 2, 7, 8, 13 y 14:1 ng de ARN
de HeLa; Calles 3, 4, 9, 10, 15 y 16: 10 ng de ARN de HeLa; Calles
5, 6, 11, 12, 17 y 18: 100 ng de ARN de HeLa; M: marcadores de
tamaño de ADN.
La Figura 7 es una fotografía de gel teñido con
EtdBr que demuestra la sensibilidad y eficiencia de la invención en
RT-PCR de productos largos (> 3 kb). 100 ng de
ARN total del HeLa se transcribió en forma inversa mediante el uso
de las composiciones de la invención con la adición de 1 \mul de
mezcla de enzima ELONGASA, y los fragmentos del gen de coli de
poliposis adenomatosa que era de 7,3 kb (calles 1, 2), 7,7 kb
(calles 3, 4) o 8,9 kb (calles 5, 6) de tamaño se amplificaron por
PCR. M: marcadores de tamaño de ADN (digesto de HindII de \lambda
ADN).
La presente invención se refiere a las
composiciones y procedimientos para usar en la producción de la
reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa
inversa (RT-PCR) y análisis de los ácidos nucleicos.
En particular, la invención proporciona composiciones que
comprenden una o más moléculas que contienen acetato, para
proporcionar ion acetato en una concentración de aproximadamente 60
mM, transcriptasa inversa M-MLV, una o más ADN
polimerasas, una o más cebadores, uno o más nucleótidos y un buffer
adecuado. Estas composiciones se pueden usar en los procedimientos
de la invención para producir, analizar, cuantificar y manipular de
otro modo las moléculas de ácido nucleico mediante el uso de un
procedimiento de RT-PCR de una o dos etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
El buffer en las composiciones de la invención
proporciona condiciones de pH y iones apropiadas para las enzimas
que tienen actividad de transcriptasa inversa y enzimas de ADN
polimerasa. Los nucleótidos usados en las composiciones (por
ejemplo, trifosfatos de desoxirribonucleósido (dNTP)), y las
moléculas de ácido nucleico del cebador proporcionan los sustratos
para la síntesis o amplificación de las moléculas de ácido nucleico
de acuerdo con la invención. Las composiciones de la invención
también pueden incluir los reactivos de
inhibición-reducción para asistir en la superación
de la inhibición en las reacciones de RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El buffer y las condiciones iónicas de las
presentes composiciones se han optimizado para reducir la inhibición
mediada por RT de la RT-PC. Las composiciones
preferidas de la invención comprenden una o más moléculas de
acetato para proporcionar ion acetato en una concentración de
aproximadamente 60 mM o una combinación de una o más moléculas que
contienen azufre y una o más moléculas que contienen acetato.
Las moléculas que contienen acetato se deben
formular en las composiciones para proporcionar una concentración
de ion acetato en la solución de aproximadamente 60 mM.
Las moléculas que contienen acetato se formulan
preferentemente en las presentes composiciones en la forma de una o
más sales o buffers. Los ejemplos de sales que contienen acetato
adecuadas de acuerdo con la invención incluyen, pero sin
limitación, acetato de amonio, acetato de magnesio, acetato de
manganeso, acetato de potasio, acetato de sodio y similares. Los
ejemplos de buffer que contienen acetato adecuados de acuerdo con la
invención incluyen, pero sin limitación,
TRIS-acetato
(tris[{hidroximetil)]aminometano]acetato), ADA (ácido
N-[2-acetamido]-2-iminodiacético),
y acetato de imidazol (ácido
2-hidroxi-3-[4-imidazolil]-propiónico).
De acuerdo con la invención, se pueden formular
una o más moléculas que contienen potasio en las presentes
composiciones para sustituir, y de este modo reducir el
requerimiento de concentración para el azufre. En este aspecto de
la invención, la adición de moléculas que contienen azufre y
moléculas que contienen potasio disminuye el requerimiento de
concentración para el azufre en aproximadamente
13-75%, preferentemente en aproximadamente
25-50%. Por ejemplo, cuando las moléculas que
contienen potasio se formulan en las presentes composiciones, la
concentración de moléculas que contienen azufre se puede reducir de
aproximadamente 18 mM a aproximadamente 2-14 mM, o
preferentemente a aproximadamente 4-9 mM. Se
entenderá, obviamente, que los uno o más iones de potasio también
se pueden usar en las composiciones de la invención descriptas antes
que contienen una o más moléculas de acetato en vez de, o además
de, la una o más moléculas que contienen azufre.
Las moléculas que contienen potasio se deben
formula en las composiciones a una concentración preferida de al
menos 2 mM, preferentemente al menos 5 mM, aún más preferentemente
al menos 10 mM, y con máxima preferencia al menos 20 mM. Los
intervalos de concentración particularmente preferidos de moléculas
que contienen potasio en las presentes composiciones incluyen
aproximadamente 2 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 2 mM
a aproximadamente 200 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100
mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 75 mM, aproximadamente 2
mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente
40 mM, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 30 mM,
aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM y aproximadamente 2 mM
a aproximadamente 10 mM.
Las moléculas que contienen potasio
preferentemente se formulan en las presentes composiciones en la
forma de una o más sales o buffer. Los ejemplos de sales de potasio
adecuadas de acuerdo con la invención incluyen, pero sin
limitación, sulfato de potasio, sulfito de potasio, cloruro de
potasio, nitrato de potasio y similares. Los más preferidos son
cloruro de potasio, sulfato de potasio y acetato de potasio. Los
buffers de potasio preferidos de acuerdo con la invención incluyen,
pero sin limitación, fosfato de potasio (monobásico), fosfato de
potasio (dibásico) y similares. Otras sales y buffer de potasio, y
otras moléculas que contienen potasio, adecuadas para el uso en las
presentes composiciones serán evidentes para los expertos en la
técnica.
Las moléculas y buffers que contienen azufre,
acetato o potasio que son adecuadas para usar en las presentes
composiciones están disponibles en el comercio a partir de una
amplia variedad de fuentes, por ejemplo, de Sigma (St. Louis,
Missouri).
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Las composiciones de la presente invención
también comprenden enzimas que tienen actividad de transcriptasa
inversa. De acuerdo con la presente invención, las enzimas que
tienen actividad de transcriptasa inversa son transcriptasas
inversas del virus de leucemia murina de Moloney
(M-MLV). Las enzimas preferidas para usar en la
invención incluyen las que están sustancialmente reducidas en cuanto
a la actividad de ARNasa H. Por una enzima "sustancialmente
reducida en cuanto a la actividad de ARNasa H" se entiende que la
enzima tiene menos que aproximadamente 20%, más preferentemente
menos que aproximadamente 15%, 10% o 5%, y con máxima preferencia
menos que aproximadamente 2%, de la actividad de ARNasa H de una
enzima tipo salvaje o ARNasa H^{+} tal como transcriptasa inversa
M-MLV tipo salvaje. La actividad de ARNasa H se
puede determinar por una variedad de ensayos, tales como los
descriptos, por ejemplo, en la Patente U.S. Núm. 5.244.797, en
Kotewicz, M.L., et al., Nucl. Acids Res: 16:265 (1988) y en
Gerard, G.F., et al., FOCUS 14(5):91 (1992), cuyas
descripciones se incorporan por completo en la presente por
referencia.
Las enzimas particularmente preferidas para usar
en la invención incluyen, pero sin limitación, transcriptasa
inversa M-MLV (ARNasa H- o sustancialmente reducida
en la actividad de ARNasa H), y transcriptasa inversa RSV (ARNasa
H- o sustancialmente reducida en la actividad de ARNasa H). Las
enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa están
disponibles en el comercio (por ejemplo, SUPERSCRIP^{TM},
SUPERSCRIPT II^{TM} y M-MLV, disponible en Life
Technologies, Inc.; Rockville, Maryland).
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Las composiciones de la invención también
comprenden una o más ADN polimerasas, que son preferentemente ADN
polimerasas termoestables. Estas ADN polimerasas se pueden aislar de
fuentes naturales o recombinantes, por técnicas que son bien
conocidas en la técnica (Ver WO 92/06200, Patentes U.S. Núm.
5.455.170 y 5.466.591, WO 96/10640 y Solicitud de Patente U.S. Núm.
08/370.190, presentada el 9 de enero de 1995, cuyas descripciones
se incorporan en la presente por referencia), a partir de una
variedad de bacterias termófilas que están disponibles en el
comercio (por ejemplo, de American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland) o se pueden obtener por técnicas de ADN
recombinante (ver, por ejemplo, WO 96/10640 y Solicitud de Patente
U.S. Núm. 08/370,190, presentada el 9 de enero de 1995). Son
adecuadas para usar como fuentes de polimerasas termoestables o los
genes de estas para la expresión en sistemas recombinantes las
bacterias termófilas Thermus thermophilus, Thermococcus
litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woosii y otras
especies del género Pyrococcus, Bacillus sterothermophilus,
Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum, Thermus flavus,
Thermus ruber, Thermus brockianus, Thermotoga neapolitana,
Thermotoga maritima y otras especies del género
Thermotoga, y Methanobacterium thermoautotrophicum, y
sus mutantes, variantes o derivados. Se entiende, sin embargo, que
las ADN polimerasas termoestables de otros organismos también se
pueden usar en la presente invención sin apartarse del alcance o
las realizaciones preferidas de estas. Como alternativa al
aislamiento, las ADN polimerasas termoestables están disponibles en
el comercio en, por ejemplo, Life Technologies, Inc. (Rockville,
Maryland), New England BioLabs (Beverly, Massachusetts), Finnzymes
Oy (Espoo, Finlandia), Stratagene (La Jolla, California),
Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Indiana) y Perkin
Elmer Cetus (Norwalk, Connecticut).
Las ADN polimerasas termoestables
particularmente preferidas para usar en las composiciones y los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, ADN polimerasas Taq, Tne, Tma, Tli/VENT^{TM},
DEEPVENT^{TM}, Pfu, Pwo, Tfi o Tth, o sus mutantes o derivados.
La ADN polimerasa Taq está disponible en el comercio, por ejemplo
de Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland), o se puede aislar
de su fuente natural, la bacteria termófila Thermus
aquaticus, que se describió previamente (Patentes U.S. Núm.
4.889.818 y 4.965.188). La ADN polimerasa se puede aislar de su
fuente natural, la bacteria termófila Thermologa neapolitana
(Ver WO 96/10640 y Solicitud de Patente U.S. Núm. 08/370,190,
presentada el 9 de enero de 1995), y ADN polimerasa Tma de su
fuente natural, la bacteria termófila Thermotoga maritima
(Ver Patente U.S. Núm. 5.374.553, cuya descripción se incorpora en
la presente por referencia). Los procedimientos para producir
mutantes y derivados de las ADN polimerasas termófilas,
particularmente las Tne y Tma polimerasas, se describen en la
Solicitud de Patente U.S. en trámite Núm. 08/689.807 de Deb. K
Chatterjee, y en la solicitud de Patente U.S. en trámite Núm.
08/689,818 de Deb K Chatterjee y A. John Hughes, ambas presentadas
el 6 de septiembre de 1996, que se incorporan por referencia en la
presente en su totalidad. Tfi, Tli/VENT^{TM} y DEEPVENT^{TM}
están disponibles en el comercio (por ejemplo, en New England
BioLabs; Beverly, Massachusetts), o se pueden producir como se
describe (Bej, A.K., y Mahbubani, M.H., en: PCR Technology: Current
Innovations, Griffin, H.G., y Griffin, A.M., eds., CRC Press, pp.
219-237 (1994) para Tli/VENT^{TM}; Flaman, J.-M.,
et al., Nucl. Acids Res.
22(15):3259-3260 (1994) para
DEEPVENT^{TM}). Las ADN polimerasas termoestables se añaden
preferentemente a las presentes composiciones en una concentración
final en solución de aproximadamente 0,1-200
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-50
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-40
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-36
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-34
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-32
unidades por mililitro, aproximadamente 0,1-30
unidades por mililitro, o aproximadamente 0,1-20
unidades por mililitro, y con máxima preferencia a una
concentración de aproximadamente 20 unidades por
mililitro.
mililitro.
En composiciones preferidas de la invención, la
concentración de ADN polimerasas se determina como una relación de
la concentración de las enzimas que tienen actividad de
transcriptasa inversa. En consecuencia, en composiciones
particularmente preferidas la relación de unidades de las enzimas
transcriptasa inversa a las enzimas ADN polimerasa enzimas varía de
aproximadamente 0,2:2 a aproximadamente 500:2, preferentemente de
aproximadamente 0,5:2 a aproximadamente 250:2 y con máxima
preferencia una relación mayor que 3:2. Obviamente, otras relaciones
adecuadas de unidades de actividades de enzimas transcriptasa
inversa a ADN polimerasas adecuadas para usar en la invención serán
evidentes para los expertos en la técnica.
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De acuerdo con los procedimientos de la
invención, uno o más agentes de inhibición-reducción
adicionales se pueden añadir opcionalmente a las presentes
composiciones para ayudar a superar la inhibición de las reacciones
de RT-PCR por las RT tales como RT
M-MLV. Los agentes de
inhibición-reducción preferidos para usar en las
presentes composiciones incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas
tales como (pero sin limitación) albúmina sérica humana, albúmina
sérica bovina, ovalbúmina, Albumax, caseína, gelatina, colágeno,
globulina, lisozima, transferrina, mioglobina, hemoglobina,
\alpha-lactoalbúmina, fumarasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH), amiloglucosidasa, anhidrasa carbónica,
\beta-lactoglobulina, aprotinina, inhibidor de
tripsina de soja, tripsinógeno, fosforilasa b, miosina, actina,
\beta-galactosidasa, catalasa, digestos de soja
trípticos, triptosa, lectinas y similares, o sus fragmentos o
derivados. Son particularmente preferidos para usar en las
composiciones y los procedimientos de la invención albúmina sérica
bovina, albúmina sérica humana, Albumax y caseína. Los péptidos,
polipéptidos o proteína preferentemente se añaden a las
composiciones para obtener una concentración final en la solución
de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 \mug/ml,
preferentemente aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100
\mug/ml, más preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente
50 \mug/ml y con máxima preferencia aproximadamente 2 a
aproximadamente 20 \mug/ml.
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Las composiciones de la invención además
comprenden uno o más nucleótidos (por ejemplo, trifosfatos de
desoxinucleótidos (dNTP)). Los componentes nucleotídicos de las
presentes composiciones sirven como los "bloques de
construcción" para los ácidos nucleicos recién sintetizados, que
se incorporan en la presente por la acción de las transcriptasa
inversas o ADN polimerasas. Los ejemplos de nucleótidos adecuados
para usar en las presentes composiciones incluyen, pero sin
limitación, dUTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dITP,
7-deaza-dGTP,
\alpha-tio-dATP,
\alpha-tio-dTTP,
\alpha-tio-dGTP,
\alpha-tio-dCTP o sus derivados,
los cuales están disponibles en el comercio provenientes de fuentes
que incluyen Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland), New
England BioLabs (Beverly, Massachusetts) y Sigma Chemical Company
(Saint Louis, Missouri). Los dNTP pueden ser no marcados, o pueden
estar marcados de forma detectable por acoplamiento a ellos por
procedimientos conocidos en la técnica con radioisótopos (por
ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P o ^{35}S), vitaminas (por
ejemplo, biotina), restos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína,
rodamina, Rojo Texas, o ficoeritrina), marcas quimioluminiscentes,
dioxigenina y similares. Los dNTP marcados también se pueden
obtener comercialmente, por ejemplo en Life Technologies, Inc.
(Rockville, Maryland) o Sigma Chemical Company (Saint Louis,
Missouri). En las presentes composiciones, los dNTP se añaden para
dar una concentración de trabajo de cada dNTP de aproximadamente
10-1000 micromolar, aproximadamente
10-500 micromolar, aproximadamente
10-250 micromolar, o aproximadamente
10-100 micromolar, y con máxima preferencia una
concentración de aproximadamente 100 micromolar.
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Además de los nucleótidos, las presentes
composiciones comprenden uno o más cebadores que facilitan la
síntesis de una primera molécula de ADN complementaria con el total
o una porción de un molde de ARN (por ejemplo, una molécula de ADNc
de cadena simple). Tales cebadores también se pueden usar para
sintetizar una molécula de ADN complementario con el total o una
porción de la primera molécula de ADN, de este modo se forma una
molécula de ADNc de cadena doble. Adicionalmente, estos cebadores se
pueden usar para amplificar moléculas de ácido nucleico de acuerdo
con la invención. Tales cebadores incluyen, pero sin limitación, los
cebadores específicos del blanco (que son preferentemente cebadores
específico del gen), cebadores oligo(dT), cebadores
aleatorios o cebadores arbitrarios. Los cebadores adicionales que se
pueden usar para la amplificación de las moléculas de ADN de
acuerdo con los procedimientos de la invención serán evidentes para
los expertos en la técnica.
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En la reacción de RT-PCR, las
mezclas de reacción se incuban a una temperatura suficiente para
sintetizar una molécula de ADN complementaria con el total o una
porción del molde de ARN. Tales condiciones normalmente varían de
aproximadamente 20ºC a 75ºC, más preferentemente de aproximadamente
35ºC a 60ºC y con máxima preferencia de aproximadamente 45ºC a
aproximadamente 55ºC. Después de la reacción de transcripción
inversa, la reacción se incuba a una temperatura suficiente para
amplificar la molécula de ADN sintetizada. Preferentemente la
amplificación se obtiene por medio de una o más reacciones en cadena
de polimerasa (PCR). Las condiciones preferidas para la
amplificación comprenden el termociclado, que puede comprender
alternar calentamiento y enfriamiento de la mezcla suficiente para
amplificar la molécula de ADN y que con máxima preferencia comprende
alternar de un primer intervalo de temperatura de aproximadamente
90ºC a aproximadamente 100ºC, a un segundo intervalo de temperatura
de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 75ºC, más preferentemente
de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 75ºC o de aproximadamente
55ºC a aproximadamente 75ºC, y con máxima preferencia de
aproximadamente 65ºC a aproximadamente 75ºC. De acuerdo con la
invención, el termociclado se puede realizar cualquier número
veces, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 80
veces, más preferentemente mayor que aproximadamente 10 veces y con
máxima preferencia mayor que aproximadamente 20 veces.
Las composiciones y los procedimientos de la
presente invención también se pueden usar para la producción,
análisis y cuantificación de moléculas de ácido nucleico más grandes
(por ejemplo, por "PCR larga" o "RT-PCR
larga"), preferentemente las moléculas de ácido nucleico que son
más grandes de aproximadamente 4-8 kilobases de
tamaño, más preferentemente más grandes que aproximadamente
5-7 kilobases de tamaño, y con máxima preferencia
moléculas de ácido nucleico que son más grandes que aproximadamente
7 kilobases de tamaño. En este aspecto de la invención, las
combinaciones de ADN polimerasas, preferentemente mezclas de una o
más ADN polimerasas que carecen de actividad exonucleasa
3'-5' (es decir, una "3' exo^{-}" polimerasa)
con una o más ADN polimerasas que tienen actividad exonucleasa
3'-5' (es decir, una "3' exo^{+}"
polimerasa), se pueden añadir a las composiciones de la invención
(ver Patente U.S. Núm. 5.436.149; ver también Solicitud de Patente
U.S. en trámite Núm. 08/801,720, de Ayoub Rashtchian y Joseph
Solus, presentada el 14 de febrero de 1997, y la Solicitud de
Patente U.S. en trámite de Ayoub Rashtchian y Joseph Solus titulada
"Stable Compositions for Nucleic Acid Amplification and
Sequencing," presentada el 27 de marzo de 1998, cuyas
descripciones se incorporan en la presente en su totalidad. Las 3'
exo^{-} y 3' exo^{+} polimerasas para usar en este aspecto de la
invención son las 3' exo^{-} y 3' exo^{+} polimerasas
termoestables. Particularmente preferidas son las 3' exo^{-}
polimerasas que incluyen, pero sin limitación, Taq,
Tne(exo^{-}), Tma(exo^{-}),
VENT(exo^{-})^{TM},
DEEPVENT(exo^{-})^{TM}, Pfu (exo^{-}) y
Pwo(exo^{-}) polimerasas, o sus mutantes, variantes o
derivados, que se añaden preferentemente a las composiciones de la
invención a una concentración en la solución de aproximadamente
0,1-200 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-50 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-40 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-36 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-34 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-32 unidades por mililitro, aproximadamente
0,1-30 unidades por mililitro, o aproximadamente
0,1-20 unidades por mililitro, y con máxima
preferencia at a concentración de aproximadamente 20 unidades por
mililitro. Las 3' exo^{+} polimerasas particularmente preferidas
incluyen, pero sin limitación, VENT^{TM}, Pfu, Pwo, Tne, Kod y
Tma, y con máxima preferencia DEEPVENT^{TM}, ADN polimerasas, que
se deben añadir a las mezclas en cantidad suficiente para dar un
concentración de trabajo final de aproximadamente
0,0002-200 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-100 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-20 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-2,0 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-1,6 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-0,8 unidades por mililitro, aproximadamente
0,002-0,4 unidades por mililitro, o aproximadamente
0,002-0,2 unidades por mililitro, con máxima
preferencia a concentraciones de aproximadamente 0,40 unidades por
mililitro. Estas ADN polimerasas termoestables están disponibles en
el comercio, por ejemplo en Life Technologies, Inc. (Rockville,
Maryland), New England BioLabs (Beverly, Massachusetts), Finnzymes
Oy (Espoo, Finlandia), Stratagene (La Jolla, California),
Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Indiana) y
Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, Connecticut). Las
mezclas de las composiciones de la invención y las 3' exo^{-} y 3'
exo^{+} polimerasas se pueden usar en los procedimientos de la
invención para producir mejor sensibilidad de detección y producción
de productos RT-PCR grandes.
Habiendo descripto la presente invención en
detalle, la misma se entenderá más claramente con referencia a los
siguientes ejemplos, que se incluyen con la presente para fines de
solo de ilustración y no se consideran limitantes de la
invención.
Para examinar la inhibición de la amplificación
por RT-PCR con RT, se usó el ARN de CAT como un
molde. Las reacciones de RT-PCR se realizaron en un
volumen final de 50 \mul en buffer PCR (20 mM de
Tris-HCl, 50 mM de KCl) o buffer ELONGASA (60 mM de
Tris-SO_{4} (pH 9,1), 18 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4}; concentración de azufre total de
aproximadamente 23 mM) que contiene 20 unidades de
M-MLV(H-) RT, 1 mM de ditiotreitol (DTT),
0,2 mM de cada uno de los cebadores sentido y antisentido, 0,2 mM de
dNTP, 1,25 mM de MgCl_{2}, 2 unidades de Taq y varias cantidades
de ARNm de CAT (0, 10, 10^{2}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o
10^{7} copias por reacción). Las condiciones de
RT-PCR fueron un ciclo de 45ºC durante 30 minutos y
94ºC durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 94ºC durante 15
segundos/60ºC 30 segundos y posteriormente 72ºC durante 5
minutos.
Después del análisis de los productos de
amplificación por electroforesis en gel de agarosa 1,5% (Figura 1),
se observó amplificación significativa de la secuencia blanco de 500
pb en las reacciones realizadas en el buffer ELONGASA mediante el
uso de 10^{6} o 10^{7} copias del molde de ARNm de CAT (Figura
1, calles 8 y 9). En contraste, no se observó producto de PCR
significativo para las reacciones realizadas en buffer de PCR
estándar en todas las concentraciones del molde (Figura 1, calles
18, 19). Estos resultados indican que la presencia de RT en las
mezclas de reacción de PCR inhibe la reacción de amplificación, pero
que esta inhibición se reduce al menos parcialmente mediante el uso
del buffer ELONGASA.
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Ejemplo comparativo
2
Para determinar si el ion sulfato en el buffer
ELONGASA podría ser un componente clave para la reducción de la
inhibición de RT observada en el Ejemplo 1, se estudiaron en detalle
varios parámetros de reacción tales como pH, condiciones iónicas y
composición del buffer. Las reacciones de RT-PCR se
llevaron a cabo en un volumen final de 50 \mul que contiene 1 mM
de DTT, 0,2 mM de dNTP, 1,5 mM de MgSO_{4}, 0,2 mM de cada uno de
los cebadores sentido y antisentido de
\beta-actina humana, 1 pg de molde de ARN del HeLa
total, 2 unidades de ADN polimerasa Taq y 10 unidades de RT
M-MLV(H-) en soluciones salinas reguladas que
comprenden varias condiciones iónicas y buffer. Las condiciones de
RT-PCR fueron 30 minutos a 45ºC y 2 minutos a 94ºC,
seguido por 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos/55ºC durante 30
segundos/68ºC durante 90 segundos, y una extensión final durante 5
minutos a 72ºC. La capacidad de detectar un producto de
RT-PCR de 1,026 pb amplificado de 1 pg de ARN de
HeLa total se usó como una evaluación del éxito de la amplificación
en las condiciones de reacción específicas.
Después del análisis de los productos de
RT-PCR de \beta-actina de 1,026 pb
en electroforesis en gel de agarosa 1%, se obtuvieron los
resultados mostrados en las Tablas 1-7.
Tabla 1: Las composiciones que comprenden
Tris-HCl (pH 8,5-9,3) demostraron
una sensibilidad de aproximadamente 1 pg de ARN total del HeLa
cuando estaba presente 18 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}. Sin
embargo, este aumento de sensibilidad se obtuvo en un intervalo de
pH más amplio (pH 7,8-9,3) cuando se usó buffer de
Tris-SO_{4} en lugar de
Tris-HCl.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Tabla 2: A fin de detectar el producto de
RT-PCR de 1,026-pb en las
composiciones que comprenden buffer Tris-HCl, la
inclusión de 20 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4} en las
composiciones fue esencial. Sin embargo, si se usó buffer
Tris-SO_{4} (20-80 mM, pH
8,0-9,0) en lugar de Tris-HCl, no se
requirió la inclusión de (NH_{4})_{2}SO_{4}.
Tabla 3: El requerimiento de azufre para la
detección sensible del producto de RT-PCR de 1,026
pb también se demostró por el uso de taurina
(NH_{2}CH_{2}SO_{3}H), que contiene ion azufre. La taurina
redujo la inhibición de RT-PCR mediada por RT casi
tanto como lo hizo el sulfato de amonio.
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Tabla 4: El aumento de la sensibilidad de la
detección del sistema buffer Tris-SO_{4} mostrado
en la Tabla 2 (60 mM, pH 8,5-9,0) se podría mejorar
por la adición de 20-40 mM de KCl, lo que indica que
las moléculas que contienen potasio no solo eran sustitutos
adecuados para las moléculas que contienen azufre en las presentes
composiciones, sino que también pueden aumentar la sensibilidad de
la reacción de RT-PCR por sí mismas.
Tabla 5: Se obtuvo similar sensibilidad de
detección y mejora adicional por la adición de KCl en el sistema
buffer de Tris-taurina.
Tabla 6: La adición de NH_{4}Cl en lugar de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en las presentes composiciones no
redujo la inhibición de RT-PCR mediada por RT, lo
que indica que las moléculas que contienen azufre son componentes
clave para la reducción de la inhibición de RT en
RT-PCR.
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Tabla 7: El requerimiento de ion de azufre para
la reducción de la inhibición de PCR mediada por RT fue menos
riguroso en los sistemas buffer de Tris-acetato que
en los sistemas buffer Tris-sulfato. En el sistema
buffer Tris-acetato, los productos de
RT-PCR de 1,026 pb de tamaño se pudieron observar
aun en ausencia de los iones de azufre.
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Para investigar otros componentes de reacción
que podrían reducir la inhibición de RT-PCR mediada
por RT, se añadió BSA a las presentes composiciones. Se formularon
composiciones que comprenden cantidades crecientes de RT
M-MLV(H^{-}) (de 10 unidades a 260
unidades) y varias cantidades de BSA, y estas composiciones se
usaron en las reacciones de RT-PCR. Las reacciones
se realizaron en un volumen final de 50 \mul que contiene 60 mM
de Tris-SO_{4} (pH 9,1), 18 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 mM de dNTP, 1,2 mM de
MgSO_{4}, 0,02 mM de DTT, 0,2 mM de cada uno de los cebadores
sentido y antisentido de ARNm de CAT \beta-actina,
2 unidades de ADN polimerasa Taq y 100 pg de molde de ARN de HeLa
total para la amplificación de \beta-actina, o
10^{5} copias del molde de ARN de HeLa total para la
amplificación de CAT. Las condiciones de RT-PCR
fueron 30 minutos a 45ºC y dos minutos a 94ºC, seguido por 40
ciclos de 94ºC durante 15 segundos/55ºC durante 30 segundos/68ºC
durante 90 segundos, y posteriormente una extensión final de cinco
minutos a 72ºC.
Después del análisis de los productos de
RT-PCR de RT- \beta-actina de
1,026 pb en electroforesis en gel de agarosa 1% (Figura 2A), no se
observó inhibición de RT con 10 unidades de RT, pero cantidades
crecientes de RT (135 unidades-260 unidades)
inhibieron completamente la RT-PCR. Sin embargo, tal
inhibición de RT se redujo por la adición de
200-1000 ng de BSA por reacción (es decir, una
concentración de BSA final de aproximadamente 4-20
pg/ml).
Se obtuvieron resultados similares del análisis
de los productos de RT-PCr de CAT de 653 pb (Figura
2B), donde solo se requirió una cantidad ligeramente superior de
BSA (300-1000 ng por reacción, es decir, una
concentración final de BSA de aproximadamente 6-20
pg/ml) para la reducción de la inhibición de RT. En conjunto, estos
resultados indican que la incorporación de proteínas tales como BSA
en las composiciones de la invención puede ayudar a superar la
inhibición de RT-PCR causada por RT.
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Ejemplo comparativo
4
Para estudiar el rendimiento de varias RT en
RT-PCR, AMV-RT,
M-MLV-RT, y
M-MLV(H-)-RT se usaron en las
presentes composiciones. Las reacciones de RT-PCR
para M-MLV-RT y
M-MLV H-RT (Superscript II) se
realizaron en un volumen final de 50 \mul que contiene 60 mM de
Tris-SO_{4}(pH 9,1), 18 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 mM de dNTP, 250 ng de BSA, 1,0
mM de DTT, 0,2 mM de cada uno de los cebadores sentido y antisentido
de CAT, 2 unidades de ADN polimerasa Taq, 1,5 mM de MgSO_{4}, y
varias cantidades de molde de ARN de CAT (0, 10^{3}, 10^{4} o
10^{5} copias por reacción). Las composiciones que contienen
AMV-RT fueron las mismas excepto que estas carecían
de BSA. En cada reacción, se usaron 5 unidades de cada uno de
AMV-RT, M-MLV-RT o
M-MLV(H-)RT. Las condiciones de ciclado de
RT-PCR fueron 30 minutos a 45ºC y 2 minutos a 94ºC,
seguido por 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos/60ºC durante 30
segundos, y posteriormente una extensión final de cinco minutos a
72ºC.
Como se muestra en la Figura 3, después del
análisis de los productos de RT-PCR de CAT de 500 pb
en electroforesis en gel del agar 1,5%, las reacciones realizadas
con AMV-RT,
M-MLV-RT, y
M-MLV(H-)-RT demostraron un
rendimiento de producto de RT-PCR eficiente y
sensible, sin inhibición de las reacciones de RT-PCR
observadas en ninguna de las condiciones de reacción.
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Habiendo demostrado la simplicidad y
sensibilidad de los presentes procedimientos en amplificación por
RT-PCR de los moldes de hasta 3,5 kb de tamaño, se
examinó la eficacia de la invención para amplificar los ARNm hasta
8,9 kb.
El ARN total del HeLa se aisló con reactivo
TRIzol® (Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) y se
amplificó como antes. Para examinar posibles efectos de la
temperatura, se montaron reacciones idénticas y se incubaron a 45ºC
a 55ºC por duplicado. El ARN total del HeLa usado varió de 1 ng a
100 ng según la abundancia del ARNm. Después de la incubación de RT
durante 30 minutos, las reacciones se incubaron a 94ºC durante dos
minutos, seguido por 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC
durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, seguido por una
extensión final de 68ºC durante cinco minutos.
Para productos de RT-PCR más
grandes, la concentración de magnesio se aumentó a 1,8 mM desde el
estándar de 1,5 mM, y se añadió 1 \mul de mezcla de enzima
ELONGASA (Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) a cada
reacción. La reacción de 50 \mul final consistía en buffer de
ELONGASA IX con 1,8 mM de MgSO_{4} y otras sales, 200 pM de cada
dNTP, 2 pg/ml de BSA, 0,2 pM de cebadores (GiBcO BRL Custom Primers;
Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland), 100 ng de ARN total
del HeLa, 1 \mul de la mezcla de enzima RT/Taq de la invención y
1 \mul de la mezcla de enzima ELONGASA. En los experimentos que
usan el mismo molde de cebadores, se preparó una mezcla maestra de
buffer, mezclas de enzimas, y cebadores o molde para asegurar la
consistencia. Las muestras se incubaron a 50ºC durante 30 minutos y
posteriormente 94ºC durante dos minutos. La amplificación se realizó
con 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 58ºC durante 30 segundos
y 68ºC durante seis a nueve minutos (un minuto/kb). Los productos
de RT-PCR se resolvieron y visualizaron en geles de
agarosa-TAE 0,8 o 1,0% (p/v) que contienen bromuro
de etidio.
Temperatura de la reacción RT. La RT
SUPERSCRIPT II ha mejorado la estabilidad de la temperatura en
comparación con la M-MLV-RT
(Gerard, G., et al., FOCUS 14:91 (1992)). Para examinar el
efecto de la temperatura sobre los productos de PCR, se examinaron
36 conjuntos de cebadores (que representan genes diferentes de ser
humano, rata, planta, y un transcripto in vitro). Como se
muestra en la Figura 4, se observaron rendimiento y especificidad
del producto sustanciales a 45ºC en muchos de los fragmentos
examinados; el aumento de la temperatura de incubación no produjo
aumento de rendimiento o especificidad. Este resultado, sin embargo,
fue dependiente del molde y cebador específicos elegidos (Figura
5): para algunas combinaciones de molde-cebador, el
corrimiento de las bandas causado por la unión inespecífica de
cebadores que fue característica de las reacciones de RT realizadas
a 45ºC desapareció con el aumento de la temperatura (Figura 5;
calles 1-6), mientras que en algunos casos se
observó un aumento significativo del rendimiento del producto cuando
las reacciones de RT se realizaron a temperaturas elevadas (Figura
5; calles 7-12).
Productos de RT-PCR
largos. En los estudios de secuencias codificadoras de longitud
completa o para la amplificación de segmentos largos de ARN, se
analizó el uso de las composiciones de la presente invención
suplementado con la mezcla enzimática ELONGASA. Como se muestra en
la Figura 6, el presente sistema y el kit del proveedor A pudieron
amplificar un producto de 2,8 kb desde 100 ng, pero no de 10 ng, del
ARN total. La adición de mezcla enzimática ELONGASA al presente
sistema no solo aumentó el rendimiento del producto con 100 ng de
ARN total, pero también aumentó la sensibilidad para permitir la
amplificación de moldes largos desde 10 ng de ARN total (Figura 6;
calles 7-12). En contraste, el kit del proveedor A
no pudo amplificar el blanco de 2,8 kb desde 10 ng de ARN total
(Figura 6; calles 13-18) aun cuando este contenía
una mezcla enzimática de polimerasa diseñada para moldes
largos.
También se halló que las composiciones y los
procedimientos de la invención son útiles para amplificar productos
de RT-PCR grandes (>3-5 kb). Como
se muestra en la Figura 7, las composiciones de la presente
invención, cuando se suplementan con la mezcla enzimática ELONGASA,
produjo productos de RT-PCR de hasta 8,9 kb de
tamaño. El fragmento de las bandas observadas después de la
amplificación con estas composiciones es común para
RT-PCR larga, y la variación de los rendimientos
del producto se puede deber parcialmente al uso de diferentes
conjuntos del cebador. Estos resultados demuestran que la adición
de la mezcla enzimática ELONGASA a las presentes composiciones hace
posible amplificar ARNm largos y raros directamente de las
preparaciones de ARN total por los procedimientos de la invención.
Además, la termoestabilidad de RT SUPERSCRIPT II, que facilita las
reacciones de RT a temperaturas de hasta 55ºC, puede aumentar la
especificidad y el rendimiento del producto para algunos moldes y
conjuntos de cebadores.
Claims (44)
1. Un procedimiento para amplificar una molécula
de ácido nucleico, dicho procedimiento que comprende
(a) mezclar un molde de ARN con una composición
que comprende una transcriptasa inversa del virus de leucemia
murina de Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas
y una o más moléculas que contienen acetato para proporcionar el
ion acetato a una concentración de aproximadamente 60 mM, para
formar una mezcla; y
(b) incubar dicha mezcla en condiciones
suficientes para amplificar una molécula de ADN complementaria al
total o una porción de dicho molde de ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la ADN polimerasa es Taq ADN
polimerasa.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que las ADN polimerasas comprende un primer
ADN polimerasa que tiene actividad 3' exonucleasa y una segunda ADN
polimerasa que tiene actividad de exonucleasa 3' sustancialmente
reducida.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la relación de unidades de la
transcriptasa inversa a las ADN polimerasas es de aproximadamente
0,2:2 a aproximadamente 500:2.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la relación es de aproximadamente 0,5:2
a aproximadamente 250:2.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la relación es mayor que 3:2.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la composición además
comprende azufre en forma iónica.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el azufre en forma iónica está en una
concentración de al menos 18 mM.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que el azufre en forma
iónica está en una concentración de al menos 19 mM.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la concentración de azufre
iónico es aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM.
11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la fuente del azufre
iónico es un buffer que contiene azufre.
12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la fuente del azufre
iónico es una sal que contiene azufre.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el buffer que contiene azufre es
TRIS-sulfato
(tris[{hidroximetil}]aminometano]sulfato).
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que la sal que contiene azufre se
selecciona del grupo que consiste en sulfato de amonio, sulfato de
magnesio y sulfato de manganeso.
15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula que
contiene acetato es una sal que contiene acetato.
16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula que
contiene acetato es un buffer que contiene acetato.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que la sal que contiene acetato se
selecciona del grupo que consiste en acetato de amonio, acetato de
magnesio, acetato de manganeso, acetato de sodio y acetato de
potasio.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el buffer que contiene acetato se
selecciona del grupo que consiste en TRIS-acetato
(Tris[(hidroximetil)laminometano]acetato), ADA (ácido
N-[2-acetamido]-2iminodiacético), y
acetato de imidazol (ácido
2-hidroxi-3-[4-imidazolil]-propiónico).
19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla además
comprende uno o más nucleótidos.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que los nucleótidos son trifosfatos de
desoxirribonucleósido o sus derivados, o ditrifosfatos de
desoxirribonucleósido o sus derivados.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que los trifosfatos de
desoxirribonucleósido se seleccionan del grupo que consisten en
dATP, dUTP, dTTP, dGTP, y dCTP.
22. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla además
comprende uno o más cebadores de oligonucleótidos.
23. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador
oligo(dT).
24. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador específico del
blanco.
25. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador específico del
gen.
26. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la transcriptasa
inversa está sustancialmente reducida en cuanto a la actividad de
ARNasa H.
27. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que las ADN polimerasas
son ADN polimerasas termoestables.
28. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27, en el que las ADN polimerasas termoestables se
seleccionan del grupo que consiste en Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, Tfi,
VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl, y sus mutantes, variantes y
derivados.
29. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha ADN polimerasa que tiene actividad
de 3' exonucleasa se selecciona del grupo que consiste en Pfu, Pwo,
DEEPVENT, VENT, Tne, Tma, Kod, y sus mutantes, variantes y
derivados.
30. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicha ADN polimerasa que tiene actividad
de 3' exonucleasa sustancialmente reducida se selecciona del grupo
que consiste en Taq, Tfl, Tth, y sus mutantes, variantes y
derivados.
31. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de
incubación (b) comprende
(a) incubar la mezcla a una temperatura y
durante un tiempo suficiente para obtener una molécula de ADN
complementario con el total o una porción de dicho molde de ARN;
e
(b) incubar la molécula de ADN complementario
con el molde de ARN a una temperatura y durante un tiempo suficiente
para amplificar la molécula de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 31, en el que la primera etapa comprende incubar
dicha mezcla a una temperatura de aproximadamente 35ºC a
aproximadamente 60ºC.
33. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 31, en el que la segunda etapa comprende
termociclado.
34. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que el termociclado comprende alternar el
calentamiento y el enfriamiento de la mezcla suficiente para
amplificar la molécula de ADN.
35. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 34, en el que el termociclado comprende alternar
desde un primer intervalo de temperatura de aproximadamente 90ºC a
aproximadamente 100ºC, a un segundo intervalo de temperatura de
aproximadamente 45ºC a aproximadamente 75ºC.
36. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 35, en el que el segundo intervalo de temperatura es
de aproximadamente 65ºC a aproximadamente 75ºC.
37. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 33 a 36, en el que dicho termociclado se
realiza más de 10 veces.
38. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 33 a 36, en el que el termociclado se más
realiza más de 20 veces.
39. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la transcriptasa
inversa es SuperScript I o SuperScript II.
\newpage
40. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición
además comprende una o más moléculas que contienen potasio.
41. Una composición que comprende una
transcriptasa inversa de virus de leucemia murina de Moloney
(M-MLV), una o más ADN polimerasas, y una o más
moléculas que contienen acetato para proporcionar el ion acetato a
una concentración de aproximadamente 60 mM.
42. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 41, que además comprende una o más moléculas que
contienen azufre que proporcionan azufre en forma iónica.
43. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 42, en el que el azufre iónico está en una
concentración de al menos 18 mM.
44. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 41 a 43 que además comprende una o más
moléculas que contienen potasio.
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