ES2354868T3

ES2354868T3 - Predicción de la curación de heridas mediante el análisis del nitrato urinario.

Info

Publication number: ES2354868T3
Application number: ES02713532T
Authority: ES
Inventors: Joseph V. Boykin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2011-03-18
Anticipated expiration: 2022-02-05
Also published as: DE60238032D1; AU2002245379B2; EP1360508B1; WO2002063308A3; US6436366B2; JP2004532389A; US20010047035A1; WO2002063308A2; EP1360508A2; MXPA03007018A; ATE485523T1; CA2436465A1

Abstract

Método para determinar si un sujeto no diabético con ulceración por estasis venosa, o con una enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan, es un sujeto al que sí se le curan las heridas o un sujeto al que no se le curan las heridas, comprendiendo dicho método el paso de: comparar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del sujeto con un valor umbral que discrimina entre sujetos a los que sí se les curan las heridas y sujetos a los que no se les curan las heridas, en donde si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico es superior al valor umbral el sujeto es un sujeto al que sí se le curan las heridas, y si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico está aproximadamente a la altura del o es inferior al valor umbral, el sujeto es un sujeto al que no se le curan las heridas.

Description

ÁMBITO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere al terreno de la curación de las heridas. En particular se refiere a los análisis para la determinación del nivel de óxido nítrico en pacientes no diabéticos a los que sí se les curan las heridas y a los que no se les curan las heridas. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Se estima que la diabetes afecta a 15 millones de personas en los Estados Unidos. Dentro de la población diabética hay individuos con ulceración de las extremidades inferiores (LEU) que es crónica y no se cura y va asociada a una importante morbosidad y a importantes costes de tratamiento. La LEU crónica que no se cura precede a aproximadamente el 85% de las amputaciones de las extremidades inferiores (LEA) que 10 más de 50.000 diabéticos padecen anualmente (GE Reiber, EJ Boyko, DG Smith, en Diabetes in America, NIH Publication Nº 95-1468, Bethesda, Md” ed. 2.1995, pp. 409-428). Esto representa más de la mitad de todos los individuos que sufren LEA en este país. Mientras que tan sólo las de un 6% de las hospitalizaciones de diabéticos están asociadas a la LEU, el reembolso gubernamental total para las complicaciones de las extremidades inferiores en los diabéticos en 1992 fue de más de 1.500 millones de $, sin incluir los costes de 15 la amputación de miembros y de la rehabilitación. Los factores de riesgo clínico patofisiológico para la LEA incluyen a la neuropatía diabética, la isquemia de las extremidades inferiores y las úlceras de pie diabético crónicas que no se curan.

[0003] El problema subyacente que se da en el caso de los diabéticos con LEU es el de la deteriorada curación de las heridas, que no es bien comprendida. Mientras que en su mayoría los diabéticos presentan 20 una curación “normal” de las heridas, los que presentan LEU crónica a menudo manifiestan una reducida inflamación de las heridas, recurrentes infecciones de las heridas, reducida perfusión vascular cutánea, deficiente deposición de colágeno en las heridas y deficiente maduración de las cicatrices. La deficiencia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) va asociada a la úlcera diabética crónica y contribuye a la curación deteriorada (HD Beer, MT Longaker, S Werner, J Invest Dermatol 109.132 (1997)). Las pruebas 25 clínicas que se han hecho usando Regranex® han presentado eficacia en el mejoramiento de la curación de las úlceras de pie crónicas en solamente la mitad o menos de los pacientes evaluados (DL Steed, J Vasc Surg, 21, 71 (1995)).

[0004] La reciente investigación llevada a cabo sobre el papel del óxido nítrico (NO) en la inflamación de las heridas, la reparación tisular y la homeostasis microvascular nos ha permitido considerar al NO como 30 regulador primario de la curación de las heridas (D Bruch-Gerharz, T Ruzicka, V Kolb-Bachofen. J Invest Dermatol. 110, 1 (1998); MR Schaffer et al., Surgery 121, 413 (1997)). Se ha observado en todos los diabéticos una deficiencia sistémica de NO de origen endotelial (A Veves et al., Diabetes, 47, 457 (1998); M. Huszka et al., Thrombosis Res, 86 (2), 173 (1997); SB Williams, JA Cusco, MA Roddy, MT Hohnston, MA Creager, J. Am. Col. Cardiol., 27 (3), 567 (1996)), sugiriendo que el NO desempeña un papel fundamental en 35 la patogénesis de la LEU crónica que no se cura.

[0005] La solicitud de patente internacional WO 00/57190 da a conocer la técnica de determinar si un sujeto diabético es un diabético al que sí se le curan las heridas o un diabético al que no se le curan las heridas mediante la medición del nivel de producto relacionado con el NO.

[0006] Abd-El-Aleem et al., (J. Pathol., 191, 434-442. 2000) publican un incremento de la expresión de NO en 40 las úlceras venosas crónicas en comparación con la piel normal.

[0007] Stallmeyer et al., (J. Invest. Dermatol., 113, 1090-1098, 1999) publican un incremento de NO en una herida durante la reparación de la herida.

[0008] En consecuencia, hay necesidad de correlacionar la producción de NO con la capacidad de curación de las heridas. Tal correlación permitiría el desarrollo de métodos para predecir la capacidad de curación de las 45 heridas sobre la base de la producción de NO, y proporcionaría un útil indicador clínico que podría servir de base para elegir la terapia apropiada.

BREVE EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

[0009] Es un objeto de la invención el de aportar un método para determinar si un sujeto no diabético con ulceración por estasis venosa o con otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de heridas 50 cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas en las que no se cura la herida, es un sujeto al que sí se le curan las heridas o un sujeto al que no se le curan las heridas. El método comprende los pasos de: (a) tomar una muestra del sujeto; (b) determinar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en la muestra; y (c) comparar el nivel del producto relacionado con el óxido 55 nítrico en la muestra con un valor umbral que discrimina entre sujetos a los que sí se les curan las heridas y sujetos a los que no se les curan las heridas. Si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico es

superior al valor umbral, entonces el sujeto es un sujeto al que sí se le curan las heridas. Si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico está aproximadamente a la altura del valor umbral o es inferior al mismo, entonces el sujeto es un sujeto al que no se le curan las heridas.

[0010] Es también un objeto de la invención el de aportar el uso de una dosis terapéuticamente eficaz de un reactivo que está destinado a incrementar la producción de óxido nítrico en la fabricación de un medicamento 5 para tratar a un sujeto no diabético identificado como un sujeto al que no se le curan las heridas por el método de la presente invención.

[0011] Es un objeto adicional de la presente invención el de aportar un método para supervisar la eficacia del tratamiento de las heridas en un paciente no diabético al que no se le curan las heridas y que presenta ulceración por estasis venosa u otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas 10 cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan, en donde se le ha administrado al paciente un agente terapéutico destinado a incrementar el nivel de óxido nítrico en el paciente, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) determinar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del paciente como 15 medida de la eficacia del tratamiento; y

(b) comparar el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico con un umbral que distingue entre sujetos a los que sí se les curan las heridas y sujetos a los que no se les curan las heridas, en donde si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico es superior al valor umbral la eficacia del tratamiento es suficiente para promover la curación de las heridas, y si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico está 20 aproximadamente a la altura del valor umbral o es inferior al mismo la eficacia del tratamiento es insuficiente para promover la curación de las heridas.

[0012] Estos y otros objetos de la invención son alcanzados por una o varias de las realizaciones que se describen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 25

[0013] La Figura 1 presenta una representación esquemática del papel del óxido nítrico (NO) en la regulación de la reparación de las heridas. La “señalización celular” mediada por el NO en las heridas parece acrecentar la mediación inflamatoria de la reparación, la disponibilidad de oxígeno en la herida y la remodelación y maduración de la matriz de la herida.

[0014] La Figura 2 es una representación gráfica de los niveles de nitrato de la orina en ayunas (micromoles 30 por litro) para controles (C), diabéticos curados (HD) y diabéticos no curados (UHD) en los días 1 y 2 del estudio. Los resultados están indicados como la media ± S.E. (S.E. = error característico), con los valores P en comparación con C (Pc) y con HD (PHD) para cada día.

[0015] La Figura 3 es una representación gráfica de los niveles de nitrato en plasma en ayunas (micromoles por litro) para controles (C), diabéticos curados (HD) y diabéticos no curados (UHD) en los días 1 y 2 del 35 estudio. Los resultados están indicados como la media ± S.E., con los valores P en comparación con C para cada día excepto ‡, que compara a los HD y los UHD para el Día 2 solamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0016] Los métodos y usos de la invención están destinados a detectar, tratar y supervisar a los pacientes no diabéticos con una deficiente capacidad de curación de las heridas sobre la base de la medición de los 40 productos de descomposición de NO en muestras tomadas del paciente bajo condiciones controladas. La invención presume que los pacientes representan un espectro continuo de capacidad de síntesis de NO y que los pacientes que están en el extremo inferior de ese espectro tienen la función de curación de las heridas deteriorada. El NO es normalmente metabolizado siendo convertido en los productos estables nitrato y nitrito, que pueden determinarse mediante análisis en la orina, en el plasma, en el tejido, en el fluido de una herida o 45 en otras muestras de pacientes. El nivel de nitrato o nitrito en una muestra puede servir de indicador del nivel de síntesis de NO en un paciente. Los descubrimientos del inventor indican que por debajo de un nivel umbral de NO en el paciente no diabético no se logra una reparación normal de las heridas, lo cual redunda en una herida o ulceración que crónicamente no se cura.

[0017] El NO es un pequeño radical libre gaseoso hidrofóbico que es un importante mediador fisiológico para 50 funciones autónomas tales como la vasodilatación, la neurotransmisión y el peristaltismo intestinal. El NO proporciona señalización celular por activación de su molécula diana, la guanilato ciclasa, que eleva las concentraciones intracelulares de guanosina monofosfato cíclica (cGMP) (JS Beckman, en Nitric Oxide, J. Lancaster, Jr., Ed. (Academic Press, N.Y.), cap. 1). La señalización celular es llevada a cabo sin la mediación de canales o receptores de membrana celular y es dependiente de la concentración de NO en el entorno 55 celular.

[0018] El NO tiene una vida media de aproximadamente cinco segundos en los tejidos biológicos. Dicho NO es generado por tres isoformas de óxido nítrico sintasa (NOS), que metabolizan L-arginina y oxígeno molecular convirtiéndolos en citrulina y NO. Dos de las tres isoformas son sistemas enzimáticos constitutivos (cNOS) que son descritos en células neuronales (nNOS) y en células endoteliales (eNOS) (D Bruch-Gerharz, T Ruzicka, V Kolb-Bachofen. J Invest Dermatol. 110, 1 (1998)). Con estas isoformas, los incrementados 5 niveles de calcio intracelular activan las enzimas vía calmodulina. Los sistemas cNOS calcio-dependientes producen bajas concentraciones (picomolares) de NO. El tercer sistema es la isoforma inducible (iNOS), que es calcio-independiente. La expresión de iNOS es inducida por estímulos histoespecíficos tales como citoquinas inflamatorias o lipopolisacárido (LPS) bacteriano. La isoforma inducible libera NO en concentraciones mucho más altas (nanomolares) en comparación con los cNOS y tiene potentes efectos 10 citotóxicos.

[0019] Las enzimas cNOS están implicadas en la regulación y el mantenimiento de la homeostasis cutánea (S Moncada, A Higgs, N Eng J Med 329, 2002 (1993)). Las enzimas iNOS parecen estar principalmente asociadas a las respuestas inflamatorias e inmunes que están también implicadas en ciertas enfermedades de la piel. En los queratinocitos cutáneos humanos, los fibroblastos y las células endoteliales poseen las 15 isoformas tanto cNOS como iNOS. El macrófago y el queratinocito de una herida poseen la isoforma iNOS. En los estudios de curación de heridas se ha comprobado que la síntesis de NO tiene lugar por espacio de prolongados periodos de tiempo (de 10-14 días) tras haberse producido la herida, y los macrófagos parecen ser la principal fuente celular (MR Schaffer, U Tantry, RA vanWesep, A Barbul, J Surg Res, 71, 25 (1997)). Como mediador de la reparación tisular, se ha demostrado que el NO promueve la angiogénesis (A 20 Papapetropoulos, G Garcia-Cardena, JAA Madri, WC Sissa. J Clin Invest, 100(12), 3131 (1997)) y la migración celular (E Noiri et al., Am. J. Physiol. 279:C794 (1996)), incrementa la deposición de colágeno y la reticulación de colágeno en las heridas (MR Schaffer, U Tantry, SS Gross, HL Wasserburg, A Barbul. J Surg Res, 63, 237 (1996)), regula la homeostasis microvascular (vasodilatación) (D Bruch-Gerharz, T Ruzicka, V Kolb-Bachofen. J Invest. Dermatol. 110, 1 (1998)), inhibe la agregación plaquetaria (JS Beckman, en Nitric Oxide, J. Lancaster, 25 Jr., redactor jefe (Academic Press, N.Y.), cap. 1), inhibe la formación de adherencias de leucocitos al endotelio (AM Lefer, DJ Lefer, Cardiovascular Res. 32, 743 (1996)), modula la proliferación y la apoptosis endotelial (YH Shen, XL Wang, DE Wilcken, FEBS Lett, 433(1-2), 125 (1998)), incrementa la viabilidad de los colgajos cutáneos aleatorios (SC Um et al., Plast Reconstr Surg. 101 785 (1998); GF Pierce et al., Proc Natl Acad Sci USA. 86, 2229 (1989)), y acrecienta la inmunomodulación celular y la citotoxicidad bacteriana (JS Beckman, 30 en Nitric Oxide, J. Lancaster, Jr., redactor jefe (Academic Press, N.Y.), cap. 1).

[0020] En los diabéticos puede verse muy comprometida la reparación normal de las heridas. En general, durante el proceso de curación de las heridas, el NO proporciona un acrecentamiento de la disponibilidad de oxígeno tisular, de la mediación inflamatoria de los mecanismos de reparación y del desarrollo y de la remodelación de la matriz de la herida (Figura 1). La principal vía metabólica para el NO es la que conduce al 35 nitrato y al nitrito, que son metabolitos estables dentro del tejido, del plasma y de la orina (S Moncada, A Higgs, N Eng J Med 329, 2002 (1993)). Estudios de seguimiento en humanos han demostrado que quizá el 50% del nitrato/nitrito corporal total proviene del sustrato para la síntesis de NO que es la L-arginina (PM Rhodes, AM Leone, PL Francis, AD Struthers, S Moncada, Biomed Biophys Res. Commun. 209, 590 (1995); L. Castillo et al., Proc Natl Acad Sci USA 90.193 (1993). A pesar de que el nitrato y el nitrito no son medidas del 40 NO biológicamente activo, muestras de plasma y de orina obtenidas de sujetos tras un adecuado periodo de ayuno, y opcionalmente tras administración de una dieta controlada (baja en nitrato/baja en arginina), permiten el uso del nitrato y del nitrito como índice de la actividad de NO (C Baylis, P Vallance, Curr Opin Nephorol Hypertens 7, 59 (1998)).

[0021] La determinación de NO endógeno puede también ser aplicada a pacientes no diabéticos que 45 padezcan de otras enfermedades o condiciones caracterizadas por heridas que crónicamente no se curan en algunos pacientes. Una condición de este tipo es la ulceración crónica por estasis venosa (VSU). El trastorno fundamental en los pacientes con insuficiencia venosa crónica (CVI) y VSU secundaria es la hipertensión venosa sostenida derivada de incompetencia valvular, la obstrucción del flujo de salida y/o la disfunción de los músculos de las pantorrillas (E Criado, en Vascular Surgery, ed. RB Rutherford, 4ª ed. W.B. Saunders, 50 Philadelphia, pp. 1771-85 (1995)). Sin embargo, el desarrollo de la úlcera venosa en el paciente con CVI está relacionado con el atrapamiento de células blancas, en el cual el leucocito activado secuestrado deviene una fuente de enzimas proteolíticas y especies reactivas de oxígeno que son liberadas dentro de la microcirculación de la extremidad afectada. Esto ocasiona daño endotelial, deposición de fibrina en el atascamiento vascular e isquemia y necrosis tisular localizada (PD Coleridge-Smith et al., Br Med J 296:1726-55 7 (1988); PJ Pappas et al., J Surg Res 59:553-9 (1995)). Se ha demostrado que la CVI va asociada a una incrementada activación y agregación de las plaquetas y los leucocitos, (es decir, de los monocitos) en toda la circulación (BD Peyton et al., J Vasc Surg 27:1109-16 (1998)). Sin embargo, la presencia de factores liberados por plaquetas y leucocitos activados no es predictiva de pacientes que desarrollen ulceraciones venosas (CC Powell et al., J Vasc Surg 30:844-53 (1999)). 60

[0022] El paciente con úlceras diabéticas y el paciente con VSU comparten una patofisiología similar a nivel microcirculatorio en la cual el nivel disponible de NO deviene un factor decisivo para la curación de las heridas. En estas dos condiciones y en otras enfermedades o condiciones caracterizadas por heridas que

crónicamente no se curan en algunos pacientes, la microcirculación cutánea está abundantemente poblada con leucocitos activados que se agregan con plaquetas activadas o con la superficie endotelial, liberando especies reactivas de oxígeno y enzimas proteolíticas que son capaces de ocasionar lesión celular y peroxidación de los lípidos. Los efectos lesivos que resultan de la activación de los leucocitos y de las plaquetas pueden ser mejorados por los mecanismos compensatorios mediados por NO que son responsables 5 de la promoción de la integridad endotelial y de la hemostasis microvascular (Peyton et al., supra; Powell et al., supra; S Schröder et al., Am J Pathol 139:81-100 (1991); Z Pecsvarady Z et al., Diabetes Care 17:57-63 (1994); M Huszka et al., Thrombosis Res 86:173-80 (1997)). Sin embargo, puesto que el NO es destruido por las especies reactivas de oxígeno, el alto nivel de activación de los leucocitos y de las plaquetas que existe en los tejidos de las heridas tiende a derrotar a los mecanismos compensatorios mediados por NO, creando de 10 hecho un proceso de curación limitado por el NO. Los pacientes a los que sí se les curan las heridas son capaces de compensar el NO destruido por las plaquetas y los leucocitos activados, mientras que los pacientes a los que no se les curan las heridas no son capaces de compensar adecuadamente tal destrucción.

[0023] En los estudios clínicos en diabéticos que se describen en los Ejemplos 1 y 2 que se dan a continuación, este estado de activación celular e incrementada producción de especies reactivas de oxígeno 15 fue documentado como un nivel significantemente incrementado de nitrato en suero en ayunas en los pacientes diabéticos a los que sí se les curan las heridas, que no fue observado en los pacientes diabéticos a los que no se les curan las heridas. A la luz de estas observaciones, es evidente que el diabético al que sí se le curan las heridas es capaz de iniciar una eficaz e incrementada producción endotelial compensatoria de NO. Esto promueve el metabolismo atóxico de las especies reactivas de oxígeno incrementadas (RM Clancy et al., 20 J Clin Invest 90:1116-21 (1992); D Wink et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:9813-17 (1993)) y mantiene la integridad constitutiva de los mecanismos de reparación de heridas mediados por NO sobre los que se ha tratado anteriormente.

[0024] Los pacientes con úlceras diabéticas y con VSU presentan claras similitudes en la patología celular inflamatoria que es responsable de una deteriorada curación de las heridas. Así, la curación de heridas 25 deteriorada en ambos tipos de paciente está relacionada con una falla de similares mecanismos compensatorios de reparación que suponen una producción de NO endógena. Los pacientes a los que sí se les curan las heridas y a los que no se les curan las heridas y que padecen de úlceras diabéticas, VSU o cualquier otra condición caracterizada por una deficiente curación de las heridas cutáneas relacionada en algunos pacientes con un alto nivel de activación por células inflamatorias pueden ser identificados mediante 30 el análisis de los productos relacionados con el NO que aquí se describen. Por ejemplo, otras dos condiciones caracterizadas por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes son las llagas por presión (también llamadas úlceras por presión, úlceras por decúbito o llagas de cama) y las heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan. Una herida quirúrgica cutánea que no se cura es cualquier herida identificada como tal por un cirujano. Como alternativa, una herida quirúrgica cutánea que no se cura es 35 una herida hecha por incisión a través de la piel y que en sus bordes carece de adherencia y formación de tejido cicatrizal a los aproximadamente 7 o más días de la cirugía. Los pacientes con microcirculación deteriorada, como p. ej. los pacientes con daño endotelial que redunda en una reducida producción constitutiva de NO, están predispuestos a desarrollar llagas por presión durante periodos de enfermedad recurrente. MR Bliss, J Tissue Viability 8, 4-13 (1998). Las heridas quirúrgicas que no se curan pueden tener 40 una similar causa subyacente, y concretamente un daño endotelial que conduzca a una reducida síntesis constitutiva de NO, o bien pueden estar relacionadas con otros tipos de daño tisular, tal como el ocasionado por la terapia de radiación. La terapia de radiación ha sido vinculada a la disfunción endotelial y a la síntesis deteriorada de NO, redundando en estenosis vascular y deficiente curación de las heridas quirúrgicas. T Sugihara et al., Circulation 100, 635-41 (1999). 45

[0025] La invención aporta un método para determinar si un sujeto no diabético con ulceración por estasis venosa o con otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas en las que no se curan las heridas, es un sujeto al que sí se le curan las heridas o un sujeto al que no se le curan las heridas. La 50 expresión “sujeto al que sí se le curan las heridas” se refiere a un sujeto no diabético cuya capacidad de curación de heridas es aproximadamente la misma como la de un sujeto sano normal. La expresión “sujeto al que no se le curan las heridas” se refiere a un sujeto no diabético cuya capacidad de curación de las heridas está reducida en comparación con la de un sujeto sano normal, y que en consecuencia está en situación de riesgo de padecer de LEU, de VSU o de otras heridas o ulceraciones crónicas. 55

[0026] Un método para determinar si un sujeto no diabético es un sujeto al que sí se le curan las heridas o un sujeto al que no se le curan las heridas comprende los pasos de tomar una muestra de un sujeto, determinar el nivel de nitrato o nitrito en la muestra, y comparar el nivel de nitrato o nitrito en la muestra con un valor umbral que discrimina entre los sujetos a los que sí se les curan las heridas y los sujetos a los que no se les curan las heridas. Además del nitrito y del nitrato, pueden cuantificarse en la sangre, en la orina, en el tejido o 60 en otras muestras de un paciente otras especies moleculares relacionadas con la síntesis o la descomposición del NO (otros “productos relacionados con el NO”). Por ejemplo, pueden determinarse como reflejo de la síntesis sistémica de NO en un paciente los niveles en plasma de L-citrulina, que es un producto de la

reacción que produce NO, o de cGMP, que es producida como resultado de la activación por el NO de la guanilato ciclasa. (FL Kiechle y T Malinski, Ann. Clin. Lab. Sci. 26, 501 (1996)). Análogamente, la L-dimetilarginina, que es otro producto de la NOS, puede ser detectada por HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) en el suero humano y usada como índice altamente específico de la actividad sistémica de NOS. (J Meyer et al., Anal. Biochem. 247, 11 (1997)). El NO puede también descomponerse 5 reaccionando con el anión de superóxido en el plasma humano para producir peroxinitrito, que a su vez puede producir una variedad de radicales tales como el radical ascorbilo y el radical albúmina-cinilo, que pueden ser detectados usando espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR). (J Vasquez-Vivar et al., Biochem. J. 314, 869 (1996)). Otro producto del peroxinitrito es la 3-nitrotirosina, que puede ser detectada en el plasma humano o en otros fluidos humanos mediante cromatografía de gases en tándem con 10 espectrometría de masas (E Schwedhelm et al., Anal. Biochem. 276, 195 (1999)), HPLC de fase inversa (H Ohshima et al., Nitric Oxide 3, 132 (1999)), o un método de ELISA (ELISA = inmunoanálisis ligado a enzimas) usando anticuerpos anti-nitrotirosina (JC ter Steege et al., Free Radic. Biol. Med. 25, 953 (1998)). A diferencia de lo que sucede en el caso del nitrato o del nitrito, los de la mayoría de estos productos no se ven sujetos a interferencia por parte de la ingesta dietaria. Además, la detección in situ del propio NO es posible con ayuda 15 de biosensores que cuantifican los niveles de NO y las variaciones de los niveles de NO que se dan en respuesta a estímulos. Por ejemplo, el dominio heme de la guanilato ciclasa soluble, que es un receptor natural para el NO, puede ser etiquetado con un colorante informador fluorescente, y los cambios de la intensidad de fluorescencia pueden ser determinados mediante una fibra óptica y calibrados para revelar los niveles de NO en cualquier sitio deseado en el cuerpo, como por ejemplo en el sitio de una herida o cerca del 20 mismo (SL Barker et al., Anal. Chem. 71, 2071 (1999)). Dada la rápida descomposición del NO en los fluidos biológicos, la detección directa del NO debería llevarse a cabo in situ y no algún tiempo después de la toma de una muestra.

[0027] La muestra puede ser cualquier muestra de fluido o tejido obtenida del sujeto no diabético en cantidad suficiente para permitir la determinación del nivel de nitrato, nitrito u otro producto relacionado con el NO. Por 25 ejemplo, la muestra puede ser una muestra de orina, sangre (incluyendo el plasma), fluido de una herida o tejido. La muestra se obtiene preferiblemente del sujeto no diabético tras un periodo de ayuno, a fin de permitir que el nivel de nitrato, nitrito u otros productos relacionados con el NO alcance un nivel de línea base estable. El periodo de ayuno reduce la interferencia de las fuentes metabólicas y dietarias de nitrato o nitrito que no están relacionadas con la descomposición de NO. Durante el periodo de ayuno, el consumo de todo alimento 30 sólido y líquido por parte del sujeto no diabético es reducido en al menos un 50%, un 60%, un 70%, un 80%, un 90% o un 100% con respecto a su consumo medio. Preferiblemente, el consumo de todo alimento sólido y líquido por parte del sujeto no diabético es reducido en al menos un 90%. Más preferiblemente, el consumo de todo alimento sólido y líquido por parte del sujeto no diabético es reducido en un 100%. Con la máxima preferencia, el sujeto no diabético no consume alimento sólido o líquido alguno durante el periodo de ayuno. El 35 consumo de agua por parte del sujeto no diabético generalmente no es restringido durante el periodo de ayuno; si bien en algunas realizaciones el sujeto no diabético tampoco consume agua durante el periodo de ayuno. El periodo de ayuno deberá ser de una duración suficiente para permitir que se alcance una línea base estable en cualquier parámetro que deba ser medido. Una línea base estable es la condición en la cual el parámetro medido, como p. ej. el nitrato urinario, es generalmente reproducible y no está sujeto a grandes 40 fluctuaciones entre las mediciones repetidas o a una indebida interferencia por parte de fuentes dietarias, metabólicas o de otra índole que no estén relacionadas con el metabolismo del NO. Preferiblemente el periodo de ayuno es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 20 o 24 horas. Más preferiblemente el periodo de ayuno es de 4 a 12 horas, o de 6 a 10 horas, o de 8 a 10 horas, o de 10 a 12 horas.

[0028] Se entiende que todo requisito en cuanto al ayuno dependerá de qué producto relacionado con el NO 45 se cuantifique, porque algunos de tales productos apenas se ven afectados por la dieta; mientras que otros pueden requerir tan sólo un breve ayuno. Por ejemplo, la L-dimetilarginina en plasma (J Meyer et al., Anal. Biochem. 247, 11 (1997)) no se ve afectada por la dieta, mientras que los porcentajes de nitrato/creatinina urinario(a) no se ven afectados por la dieta si se lleva a cabo un ayuno durante la noche antes de tomar la muestra (PS Grabowski et al., Arthritis Rheum. 39, 634 (1996)). 50

[0029] En algunas realizaciones, el periodo de ayuno va inmediatamente precedido por un periodo durante el cual se le administra al sujeto no diabético una dieta que es lo suficientemente baja en fuentes de nitrato o nitrito dietario como para alcanzar un valor de línea base estable de cualquier metabolito del NO que se determine en la muestra. Por ejemplo, la dieta puede ser una de la cual se hayan eliminado todas las verduras y los comestibles conservados con nitrato o nitrito. La dieta puede también tener un nivel de L-arginina 55 reducido en comparación con el de la dieta normal del sujeto. Por ejemplo, una dieta aporta un nivel de nitrato de menos de 900 mg/kg de peso corporal/día, y un nivel de nitrito de menos de 9 mg/kg de peso corporal/día.

[0030] El nivel de nitrato o nitrito en la muestra puede ser cuantificado por cualquier método conocido en la técnica que proporcione una adecuada sensibilidad y reproducibilidad. Por ejemplo, la reacción de Griess es un análisis espectrofotométrico para nitrato que puede proporcionar una sensible determinación de nitrato y 60 nitrito en muestras de fluidos biológicos (M Marzinzig et al., Nitric Oxide 1, 177 (1997)). Si la reacción de Griess u otro análisis de nitrito se lleva a cabo tanto con como sin reducción de nitrato a nitrito, entonces los valores para el nitrato pueden ser obtenidos como la diferencia entre los valores para el nitrito obtenidos para

la muestra reducida y para la muestra no reducida. El análisis de Griess puede hacerse más sensible si se obtiene un producto fluorescente, p. ej. haciendo que reaccione nitrito con 2,3-diaminonaftaleno (TP Misko et al., Anal. Biochem. 214, 11 (1993)). Están también disponibles análisis altamente sensibles que primeramente reducen el nitrito y el nitrato (RS Braman y SA Hendrix, Anal. Chem. 61, 2715 (1989)) o todo compuesto relacionado con el NO (M Sonoda et al., Anal. Biochem. 247, 417 (1997) a NO para detección con reactivos de 5 quimioluminiscencia específicos. Ha sido también descrita una variedad de protocolos para detectar y cuantificar los niveles de nitrito y nitrato en los fluidos biológicos por cromatografía iónica (p. ej., SA Everett et al., J. Chromatogr. 706, 437 (1995); JM Monaghan et al., J. Chromatogr. 770, 143 (1997)), cromatografía de líquidos de alta resolución (p. ej., M Kelm et al., Cardiovasc. Res. 41, 765 (1999)) y electroforesis capilar (MA Friedberg et al., J. Chromatogr. 781,491 (1997)). 10

[0031] El “nivel” de nitrato, nitrito u otro producto relacionado con el NO habitualmente se refiere a la concentración (en moles por litro, micromoles por litro u otras unidades adecuadas) de nitrato o nitrito en la muestra o en la porción de fluido de la muestra. Sin embargo, pueden también usarse otras unidades de medida para expresar el nivel de nitrato o nitrito. Por ejemplo, puede usarse una cantidad absoluta (en microgramos, miligramos, nanomoles, moles u otras unidades adecuadas), particularmente si la cantidad está 15 referida a una cantidad constante (p. ej. en gramos, kilogramos, mililitros, litros u otras unidades adecuadas) de las muestras en consideración. Pueden usarse los de una serie de kits (kit = conjunto de materiales y utensilios) de los que están disponibles comercialmente. Se describe en el Ejemplo 2 un kit de este tipo.

[0032] Antes de proceder a la determinación del nitrato o nitrito la muestra puede ser procesada según requiera el método de cuantificación, o bien a fin de mejorar los resultados, o bien para mayor comodidad del 20 investigador. Por ejemplo, el procesamiento puede suponer centrifugar, filtrar u homogeneizar la muestra. Si la muestra es sangre entera, la sangre puede ser centrifugada para eliminar las células, y el análisis del nitrato o nitrito puede llevarse a cabo sobre la fracción de plasma o suero. Si la muestra es tejido, el tejido puede ser dispersado u homogeneizado por cualquier método conocido en la técnica antes de la determinación del nitrato o nitrito. Puede ser preferible eliminar las células y los otros residuos por centrifugación o por otro 25 método y determinar el nivel de nitrato o nitrito usando solamente la parte de fluido de la muestra, o la fracción de fluido extracelular de la muestra. La muestra puede también ser conservada para una determinación posterior, por ejemplo mediante una congelación de las muestras de orina o plasma. Cuando ello sea apropiado, pueden introducirse aditivos en la muestra para preservar o mejorar sus características para su uso en el análisis del nitrato o nitrito. 30

[0033] El valor umbral de nitrato, nitrito u otro producto relacionado con el NO puede ser determinado comparando a sujetos diabéticos con una capacidad de curación de las heridas normal y deficiente usando el método de detección anteriormente descrito. Por ejemplo, comparando los niveles de nitrato urinario de un grupo de diabéticos a los que no se les curan las heridas con los de un grupo de diabéticos a los que sí se les curan las heridas o de sujetos normales, preferiblemente a continuación de la administración de una dieta baja 35 en nitrato y tras un periodo de ayuno, los niveles de nitrato de los dos grupos pueden ser comparados como en el Ejemplo 2. El valor umbral puede ser seleccionado a partir de los datos obtenidos. Por ejemplo, el umbral puede ser elegido como un valor ligeramente más alto que la media del nivel de nitrato urinario del grupo de sujetos a los que no se les curan las heridas; debiendo elegirse el valor umbral de forma tal que los niveles de nitrato urinario de los de al menos un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% de los diabéticos a los 40 que no se les curan las heridas y que se someten a ensayo queden al nivel del umbral o por debajo del mismo. Para pacientes no diabéticos humanos, el valor umbral para el nitrato en la orina está entre las concentraciones 15 y 50 micromolar. Preferiblemente, el valor umbral para el nitrato en la orina humana está entre las concentraciones 20 y 45 micromolar, o bien entre las concentraciones 25 y 40 micromolar. Más preferiblemente, el valor umbral para el nitrato en la orina humana es el de una concentración 20, 25, 28, 30, 45 32, 35, 37 o 40 micromolar. Para pacientes no diabéticos humanos, el valor umbral para el nitrato en plasma está entre las concentraciones 2 y 20 micromolar. Preferiblemente, el valor umbral para el nitrato en el plasma humano está entre las concentraciones 3 y 17 micromolar, o entre las concentraciones 4 y 16 micromolar. Mas preferiblemente, el valor umbral para el nitrato en el plasma humano es el de una concentración 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 micromolar. Al seleccionar un valor umbral de nitrato, nitrito u otro producto relacionado 50 con el NO para su uso con un determinado tipo de muestra, como por ejemplo orina o plasma humana(o), hay que tener en cuenta que el uso de distintos análisis o métodos de normalización podría desplazar las gamas de valores numéricos con respecto a los que aquí se dan.

[0034] Se describe aquí un método para tratar a un sujeto no diabético con ulceración por estasis venosa o con una enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente 55 deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan. A fin de poner en práctica esta realización, un sujeto no diabético es primeramente identificado como sujeto al que sí se le curan las heridas o como sujeto al que no se le curan las heridas por el método descrito anteriormente, o bien por otro método. Puesto que los sujetos a los que no se les curan las heridas, identificados como tales mediante la 60 invención, padecen de una reducida actividad de NO, dichos sujetos pueden ser tratados mediante cualquier terapia que esté destinada a incrementar la producción de NO. Aunque sin carácter limitativo, tales terapias incluyen la administración de L-arginina incrementando su presencia en la dieta, la administración oral de un

suplemento dietario que comprenda L-arginina en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, o bien la inyección parenteral o intravenosa de una preparación farmacéuticamente aceptable que comprenda L-arginina. La dosificación puede ser seleccionada a partir de cualquier protocolo conocido en la técnica que esté destinado a incrementar la producción de NO en el paciente. Una terapia adicional que incrementa la producción de NO es la terapia con oxígeno hiperbárico. Opcionalmente, la administración de cualquier terapia 5 destinada a incrementar la producción de NO en un sujeto puede combinarse con el método que se describe a continuación para supervisar la eficacia de la terapia para incrementar los niveles de NO en el sujeto. Si el sujeto no diabético resulta ser un sujeto al que sí se le curan las heridas, el tratamiento preferido no supone el uso de un agente terapéutico destinado a incrementar la producción de NO en el sujeto. En el caso de un sujeto al que sí se le curan las heridas, puede emplearse un tipo distinto de terapia. Por ejemplo, la 10 administración de PDGF (PDGF = factor de crecimiento derivado de plaquetas) (Regranex® u otra preparación con PDGF) puede ser eficaz para promover la curación de las heridas en un sujeto al que sí se le curan las heridas.

[0035] La invención puede también ser usada para evitar terapias que puedan ser desventajosas para ciertos pacientes no diabéticos. Mediante el uso de la invención puede minimizarse toda influencia terapéutica 15 negativa en la síntesis de óxido nítrico o su eficacia para promover la curación de las heridas. Por ejemplo, a veces se les administran a pacientes diabéticos con LEU fármacos glucocorticoides por su efecto antiinflamatorio. Sin embargo, se sabe de los glucocorticoides que inhiben selectivamente la expresión de iNOS (MW Radomski, RM Palmer, S Moncada, Proc Natl Acad Sic USA 87, 10043 (1990)) y han demostrado reducir la cantidad de nitrito/nitrato en el fluido de las heridas (AE Ulland, JD Shearer, MD Caldwell, J Surg 20 Res 70, 84 (1997). Para pacientes no diabéticos identificados como pacientes a los que no se les curan las heridas y cuya capacidad de síntesis de NO se prevé que esté reducida, es indeseable el uso de esteroides, que moderarían adicionalmente los niveles de NO en el paciente. Así, según una realización de la invención, un paciente no diabético identificado como un paciente al que no se le curan las heridas no es tratado con glucocorticoides u otros fármacos de los que se sospeche que reducen los niveles de NO en el paciente. 25

[0036] En una realización distinta, la invención puede ser usada como método para supervisar la eficacia del tratamiento de un paciente no diabético al que no se le curan las heridas, tal como un paciente con ulceración por estasis venosa o un paciente con otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas 30 en las que no se produce la curación de las heridas. En esta realización, un paciente no diabético es sometido a un tratamiento que supone la administración de un agente terapéutico destinado a incrementar el nivel de óxido nítrico en el paciente que padece de una condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas en las que no se produce la curación de las heridas. Los ejemplos de tales agentes terapéuticos incluyen a la L-arginina y a los tratamientos con oxígeno 35 hiperbárico que se han descrito anteriormente. A continuación de la administración del agente terapéutico, el paciente es supervisado para determinar la eficacia del tratamiento por el método de detectar el nitrato o nitrito en una muestra del paciente, como se ha descrito anteriormente. Si el nivel de nitrato, nitrito u otro producto relacionado con el NO en la muestra está a la altura del o es inferior al valor umbral para determinar si el paciente es un paciente al que sí se le curan las heridas o un paciente al que no se le curan las heridas, 40 entonces la eficacia del agente terapéutico es insuficiente para promover la curación de las heridas. En ese caso, el tratamiento puede ser posteriormente ajustado, por ejemplo incrementando la dosis o la potencia del agente terapéutico o bien incrementando el periodo de exposición al agente terapéutico. En una correspondiente realización, el método de supervisar al paciente es repetido, y se incrementa de nuevo la dosis o la potencia del agente terapéutico, o el periodo de exposición al agente terapéutico. Preferiblemente, 45 en esta realización en el método de supervisión e incremento de la dosis del agente terapéutico dicha dosis es incrementada hasta que el nivel de nitrato o nitrito en una muestra del paciente sea superior al valor umbral. Puede ser deseable mantener entonces la terapia con la dosis más eficaz durante tanto tiempo como sea necesario hasta que las heridas del paciente se hayan curado.

[0037] Lo expuesto anteriormente describe en general la presente invención. Puede lograrse una comprensión 50 más completa de la misma haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se dan aquí a efectos tan sólo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1

Toma de Muestras de Pacientes Diabéticos a los que Sí se les Curan las Heridas y a los que No se les Curan las Heridas 55

[0038] Para explorar la hipótesis de que los diabéticos a los que no se les curan las heridas tienen una actividad de NO deteriorada, el siguiente estudio del nitrato y nitrito como metabolitos del NO en plasma y urinario fue realizado a continuación de un estudio de la curación de las heridas en la úlcera diabética usando Regranex®. Los resultados indican que la población diabética crónica con LEU que no se cura está caracterizada por una excreción de nitrato urinario significantemente reducida. 60

[0039] Para el estudio clínico fueron elegidos diez (10) pacientes diabéticos sanos que tenían un historial de

una o varias úlceras de pie diabético. Todos los pacientes habían recibido anteriormente tratamiento tópico para las úlceras con gel Regranex® bajo estrecha observación clínica. La mitad de este grupo (n = 5) experimentó una curación completa (diabéticos curados/HD) de la úlcera a la semana 20 de observación. La otra mitad (n = 5) de este grupo no había experimentado una curación completa (diabéticos no curados/UHD) de la úlcera a la semana 20 de observación. Una vez concluido el tratamiento con Regranex®, los 10 sujetos 5 diabéticos (HD y UHD) y 10 controles no diabéticos sanos (C) fueron enrolados para el análisis del nitrato/nitrito en la orina y en el plasma. Antes de este análisis todos los sujetos fueron sometidos a selección mediante el historial médico, examen físico, hematología de línea base y química del suero y de la orina a fin de eliminar a los sujetos con enfermedad maligna activa, enfermedad vascular reumática o del colágeno, insuficiencia renal crónica, enfermedad intestinal inflamatoria, abuso de alcohol/drogas, celulitis u osteomielitis 10 y aquéllos que requiriesen cirugía de revascularización. Por razones relativas al cumplimiento de la prescripción facultativa, fueron descalificados los sujetos para los que se determinó que presentaban un deficiente control diabético. Adicionalmente fue descalificado todo aquél que recibiese terapia de radiación, corticosteroides sistémicos y agentes inmunosupresores o quimioterapéuticos. Se obtuvo de todos los participantes en el estudio el consentimiento informado. 15

[0040] Los sujetos de todos los grupos fueron llevados al ambiente hospitalario tras haber ayunado por espacio de un periodo de tiempo de 10 horas. Muestras de orina y plasma en ayunas fueron obtenidas de cada sujeto al tener lugar la admisión (Día 1) para así contar con una indicación de los niveles de nitrato y nitrito de línea base del sujeto. Adicionalmente se obtuvo de todos los sujetos al tener lugar su admisión hospitalaria información rutinaria de laboratorio que constaba del cuadro químico, un CBC (CBC = hemograma 20 completo) y un urinálisis. Los sujetos fueron confinados en las instalaciones hospitalarias por espacio de 24 horas, durante cuyo periodo de tiempo se controlaron el nivel de actividad, la ingesta dietaria y otros factores ambientales. Todos los sujetos quedaron limitados a permanecer en reposo en cama con derecho a usar el cuarto de baño y consumieron la misma dieta durante las 24 h de hospitalización (2.581 Kcal.; 124,2 g de proteína; 5.779 mg de arginina; véase la Tabla 1). Se exigió a todos los sujetos que se abstuviesen de fumar y 25 de consumir alcohol. Las verduras, que habitualmente tienen un elevado contenido de nitrato de los fertilizantes, y los comestibles conservados con nitrato y nitrito fueron eliminados de la dieta del estudio, que se indica en la siguiente Tabla 1. Las concomitantes medicaciones de línea base fueron administradas y la supervisión de la glucosa en sangre fue llevada a cabo por los sujetos diabéticos según su habitual rutina domiciliaria. Durante el periodo de confinamiento de 24 horas fueron registradas y evaluadas por el equipo de 30 investigación la medicación y la ingesta dietaria, así como la salida urinaria. A las 9 de la tarde del día de confinamiento se exigió a todos los sujetos que iniciasen otro periodo de ayuno de 10 horas. Antes de abandonar las instalaciones hospitalarias, los sujetos proporcionaron de nuevo muestras de plasma y orina en ayunas (Día 2). Los signos vitales fueron supervisados diariamente durante el confinamiento y todos los sujetos fueron evaluados para determinar los eventos adversos antes de ser liberados. Todas las muestras de 35 plasma y orina obtenidas fueron inmediatamente congeladas a -20ºC en preparación para los análisis de laboratorio.

TABLA 1

Menú de la Dieta en la Investigación: Calorías Proteína (g) Arginina (mg)

DESAYUNO

huevo, 1: 77 6,3 377

cereal, 3/4 frío: 80 3,0 240

pan tostado, 1 rebanada, blanco: 61 2,2 n/a

margarina, 1 cucharadita de té: 45 0 1

gelatina, 1 cucharada sopera: 50 0 n/a

zumo de naranja, 4 oz.: 55 0 112

leche, 2%, 8 oz.: 121 8,1 294

ALMUERZO

hamburguesa, 3,5 oz.: 274 26,6 1615

bollo: 122 4,4 n/a

1/2 tomate cortado en rodajas: 15 0,5 8

mayonesa, 1 cucharada sopera: 100 0 10

chips de cereales, 1 oz.: 153 1,9 92

copa de macedonia de frutas: 80 0 n/a

leche, 2%, 8 oz.: 121 8,1 294

CENA

pechuga de pollo al horno, 3,5 oz.: 222 29,0 1811

arroz, blanco, 1/2 l.: 133 4,9 342

manzanas, enlatadas, 1/2 l.: 68 0 6

panecillo de cena: 85 2,4 n/a

margarina, 1 cucharadita de té: 45 0 1

cantalupo en cubos, 1/2 l.: 28 1,4 n/a

pudín de dieta, 1/2 l.: 250 6,2 n/a

leche, 2%, 8 oz.: 121 8,1 294

oz. = onza (fluida)

n/a = dato no disponible

l. = lata

EJEMPLO 2 5

Determinación de las Concentraciones de Nitrato y Nitrito en Orina y en Plasma en Pacientes Diabéticos a los que Sí se les Curan las Heridas y a los que No se les Curan las Heridas

[0041] Muestras de orina y sangre fueron obtenidas de los sujetos diabéticos a los que sí se les curan las heridas y a los que no se les curan las heridas como se ha descrito en el Ejemplo 1.

[0042] Las muestras de orina y plasma fueron analizadas fluorométricamente para determinar los niveles de 10 nitrito y nitrato usando un kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) según las instrucciones del

fabricante. El método que se usó es el descrito por Gilliam et al. (Anal. Biochem. 212, 359 (1993)). Se recogió sangre en un tubo de vidrio y se la centrifugó, y el plasma fue recogido y congelado hasta proceder a su análisis. Las muestras fueron descongeladas, sometidas a agitación vorticial y filtradas con un filtro de exclusión por tamaño de 10 kDa (Millipore, Bedford, MA). Para la determinación del nitrato se añadió nitrato reductasa y NADP (NADP = nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato) y ello se dejó en incubación a 5 temperatura ambiente por espacio de dos horas. A continuación de la incubación fue añadido 2,3-diaminonaftaleno seguido por NaOH y se determinó la fluorescencia con un fluorímetro usando excitación a 365 nm y emisión a 405 nm. La concentración de nitrito fue determinada usando el mismo método con la excepción de que se omitieron los pasos de reducción del nitrato. La orina fue procesada de una manera similar, exceptuando que se omitió la filtración. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado. La 10 concentración en las muestras de los pacientes (micromoles por litro) fue determinada mediante comparación con soluciones patrón de nitrato y nitrito. Fue llevado a cabo ANOVA (ANOVA = análisis de la varianza) de una vía con post-prueba de Tukey-Kramer (Ludbrook, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 18, 379 (1991)) usando el software GraphPad InStat, versión 4.10 para Windows 98. Se consideraron significantes los valores P < 0,05.

[0043] En el Día 1 los niveles de nitrato de la orina en ayunas (micromoles/l ± S.E.) para los grupos C y HD 15 (55,88 ± 4,49 y 54,14 ± 3,32, respectivamente) no fueron significantemente distintos (Figura 2). Sin embargo, los niveles de nitrato de la orina en ayunas del grupo UHD (30,35 ± 3,61) fueron significantemente más bajos que los de los grupos C (p < 0,001) o HD (p < 0,01). Los niveles de nitrato de la orina en ayunas del Día 2 para los grupos C y HD fueron más bajos (42,60 ± 1,92 y 45,57 ± 5,10, respectivamente), pero de nuevo no significantemente distintos. Análogamente, los niveles de nitrato de la orina en ayunas del grupo UHD (22,74 ± 20 3,13) fueron más bajos que los valores del Día 1 y fueron de nuevo significantemente más bajos que los del grupo C (p < 0,05) o los del grupo HD (p < 0,05) [Tabla 2]. Los niveles de nitrato en plasma en ayunas del Día 1 (micromoles/l ± S.E.) para el grupo C (4,80 ± 0,85) y el grupo UHD (4,05 ± 0,37) no fueron significantemente distintos (Figura 3). El grupo HD (11,71 ± 2,08), sin embargo, tenía unos niveles más altos que los del grupo UHD, pero sólo significantemente más altos que los del grupo C (p < 0,05). Los niveles de nitrato en plasma en 25 ayunas del Día 2 fueron ligeramente más bajos para los grupos C (2,92 ± 0,37) y UHD (3,16 ± 0,61), pero igual como antes estos niveles no fueron significantemente distintos. Sin embargo, los niveles del grupo HD (11,94 ± 4,46) eran ahora significantemente más altos que los del grupo C (p < 0,01) o los del grupo UHD (p < 0,05). Los niveles de nitrato en la orina y en el plasma eran aproximadamente 100 veces mayores que los de nitrito y eran ocasionalmente indetectables por esta metodología. Por estas razones no se indican los niveles de nitrito 30 en plasma.

TABLA 2: Valores de Nitrato en Orina y en Plasma en Ayunas

: DÍA 1 DÍA 2

: C N=10 HD N=5 UHD N=5 C N=10 HD N=5 UHD N=5

Nitrato de la Orina en Ayunas* (μm/l): 55,88 ±4,49 54,14 ±3,32 30,35 ±3,61 42,60 ±1,92 45,57 ±5,10 22,74 ±3,13

P†, ‡: †NS †0,001 ‡NS ‡0,5

Nitrato del Plasma en Ayunas* (μm/l): 4,80 ±0,85 11,71 ±2,08 4,05 ±0,37 2,92 ±0,37 11,94 ±4,46 3,16 ±0,61

P †, ‡, §: †0,05 †NS ‡0,01 ‡NS §0,05

LEYENDA *Media ± error característico P valor P † En Comparación con los Controles, Día 1 ‡ En Comparación con los Controles, Día 2: § En Comparación con HD, Día 2 C Grupo de Control HD Diabéticos Curados UHD Diabéticos No Curados

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

:  WO 0057190 A [0005]

Literatura no de patentes que se cita en la descripción

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para determinar si un sujeto no diabético con ulceración por estasis venosa, o con una enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se 5 curan, es un sujeto al que sí se le curan las heridas o un sujeto al que no se le curan las heridas, comprendiendo dicho método el paso de:

comparar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del sujeto con un valor umbral que discrimina entre sujetos a los que sí se les curan las heridas y sujetos a los que no se les curan las heridas, en donde si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico es superior 10 al valor umbral el sujeto es un sujeto al que sí se le curan las heridas, y si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico está aproximadamente a la altura del o es inferior al valor umbral, el sujeto es un sujeto al que no se le curan las heridas.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente el paso de:

determinar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en la muestra. 15
3. El método de la reivindicación 2, en donde la muestra fue obtenida de un sujeto a continuación de un periodo de ayuno de al menos 6 horas.
4. El método de la reivindicación 3, en donde el periodo de ayuno es de 6 a 10 horas.
5. El método de la reivindicación 3, en donde la muestra fue obtenida de un sujeto al que por espacio de al menos 6 horas inmediatamente antes del periodo de ayuno le fue administrada una dieta con 20 una ingesta de nitrato de menos de 900 mg/kg de peso corporal/día y una ingesta de nitrito de menos de 9 mg/kg de peso corporal/día.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la dieta fue administrada por espacio de un periodo de tiempo de 6 a 24 horas de duración.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es orina, sangre o tejido. 25
8. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto es un humano.
9. El método de la reivindicación 1, en donde el producto relacionado con el óxido nítrico es nitrato, un derivado de nitrato, nitrito o un derivado de nitrito.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es orina y el producto relacionado con el óxido nítrico es nitrato. 30
11. El método de la reivindicación 1, en donde el producto relacionado con el óxido nítrico es óxido nítrico, L-citrulina, cGMP, peroxinitrito, 3-nitrotirosina o L-dimetilarginina.
12. Uso de una dosis terapéuticamente eficaz de un reactivo que está destinado a incrementar la producción de óxido nítrico para la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto no diabético identificado como un sujeto al que no se le curan las heridas por el método según 35 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. El uso de la reivindicación 2, en donde el reactivo es L-arginina u oxígeno hiperbárico.
14. Método para supervisar la eficacia del tratamiento de las heridas de un paciente no diabético al que no se le curan las heridas y que presenta ulceración por estasis venosa u otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en 40 algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan, en donde se le ha administrado al paciente un agente terapéutico destinado a incrementar el nivel del óxido nítrico en el paciente, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) determinar el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del paciente 45 como medida de la eficacia del tratamiento; y

(b) comparar el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico con un umbral que distingue entre sujetos a los que sí se les curan las heridas y sujetos a los que no se les curan las heridas, en donde si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico es superior al valor umbral la eficacia del tratamiento es suficiente para promover la curación de las heridas, y si el nivel del producto 50 relacionado con el óxido nítrico está aproximadamente a la altura del o es inferior al valor umbral la eficacia del tratamiento es insuficiente para promocionar la curación de las heridas.
15. El método de la reivindicación 14, en donde el producto relacionado con el óxido nítrico es nitrato, un derivado de nitrato, nitrito o un derivado de nitrito.
16. El método de la reivindicación 14, en donde el producto relacionado con el óxido nítrico es óxido nítrico, L-citrulina, cGMP, peroxinitrito, 3-nitrotirosina o L-dimetilarginina.
17. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra fue obtenida del sujeto a continuación de un 5 periodo de ayuno de al menos 6 horas.
18. El método de la reivindicación 14, en donde el paciente fue identificado como un paciente al que no se le curan las heridas comparando el nivel de un producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del paciente con un valor umbral que discrimina entre pacientes a los que sí se les curan las heridas y pacientes a los que no se les curan las heridas, en donde si el nivel del producto 10 relacionado con el óxido nítrico es superior al valor umbral el paciente es un paciente al que sí se le curan las heridas, y si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico está aproximadamente a la altura del o es inferior al valor umbral el paciente es un paciente al que no se le curan las heridas.
19. Uso de un agente terapéutico destinado a incrementar el nivel de óxido nítrico en un paciente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las heridas de un paciente no diabético al que 15 no se le curan las heridas y que presenta ulceración por estasis venosa u otra enfermedad o condición caracterizada por una curación de las heridas cutáneas crónicamente deteriorada en algunos pacientes, y como tal enfermedad o condición seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de llagas por presión y heridas quirúrgicas cutáneas que no se curan, en donde la eficacia del tratamiento es supervisada por el método según la reivindicación 15 y el tratamiento es 20 ajustado según el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico en la muestra, en donde:

(1) si el nivel está a la altura del o es inferior al valor umbral la cantidad del agente terapéutico administrado es incrementada, y si el nivel es superior al umbral la cantidad del agente terapéutico no es incrementada; o bien

(2) si el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico a continuación de la administración del 25 agente terapéutico está a la altura de o es inferior a un nivel umbral, el paso de administrar un agente terapéutico destinado a incrementar el nivel de óxido nítrico en el paciente y los pasos (a) a (b) de la reivindicación 22 son repetidos hasta que el nivel del producto relacionado con el óxido nítrico en una muestra del paciente es superior al nivel umbral.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 o el uso de la reivindicación 19, en donde el 30 agente terapéutico es L-arginina u oxígeno hiperbárico.