ES2354039T3 - Derivados de n-aril-{4-[7-(alcoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida como inhibidores de pdgfr. - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula:**Fórmula** en la que n es 2 ó 3; R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, naftiloxi, indoliloxi e isoquinoliniloxi, R3 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: -OH, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH2, -N(-CH3)2, -NM(-CH2-fenilo), -NH(-Fenilo), -CN **Fórmula** y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que tienen actividad inhibidora sobre la fosforilación de quinasas, que inhibe la actividad de dichas quinasas. La invención también se refiere a un procedimiento de inhibición de quinasas 5 y tratamiento de estados de enfermedad en un mamífero inhibiendo la fosforilación de quinasas.

Técnica antecedente

Se sabe que el PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) actúa como factor agravante para enfermedades de proliferación celular tales como arterioesclerosis, reobstrucción vascular después de angioplastia coronaria percutánea y operación de bypass, cáncer, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis, psoriasis y reumatismo 10 articular [Cell, 46, 155-169 (1986); Science, 253, 1129-1132 (1991); Nippon Rinsho (Japanese J. of Clinical Medicine), 50, 3038-3045 (1992); Nephrol Dial Transplant, 10, 787-795 (1995); Kidney International, 43 (Suppl. 39), 86-89 (1993); Journal of Rheumatology, 21, 1507-1511 (1994); Scandinavian Journal of Immunology, 27, 285-294 (1988), etc.].

Como para los derivados de quinazolina que son útiles como fármacos, la N,N-dimetil-4-(6,7-dimetoxi-4-15 quinazolinil)-1-piperazin carboxamida se describe como un broncodilatador en la Patente Sudafricana Nº 67 06512 (1968). Los derivados de Dimetoxiquinazolina se describen como inhibidores de la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 208911/93 y en el documento WO 96/09294. Los derivados de quinolina que tienen actividad agonista del receptor de benzodiazepina se describen en los documentos Pharmacology Biochemistry and Behavior, 53, 87-97 (1996) y 20 European Journal of Medicinal Chemistry, 31, 417-425 (1996), y los derivados de quinolina que son útiles como agentes anti-parásitos se describen en el documento Indian Journal of Chemistry, 26B, 550-555 (1987).

Los inhibidores de la fosforilación del receptor de PDGF conocidos hasta el momento incluyen compuestos de bis monoarilo y arilo bicíclico y compuestos de heteroarilo (documento WO 92/20642), los derivados de quinoxalina [Cancer Research, 54, 6106 (1994)], derivados de pirimidina (Solicitud de Patente Japonesa no 25 Examinada Publicada Nº 87834/94) y derivados de dimetoxiquinolina [Abstracts of the 16th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan (Kanazawa) (1996), 2, págs. 275,29 (C2) 15-2]. La Patente Europea Nº 0882717 desvela inhibidores de PDGFR.

Divulgación de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno y 30 sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que tienen actividad inhibidora sobre la fosforilación de quinasas, que inhibe la actividad de las quinasas. Particularmente, una importante inhibición de quinasa de acuerdo con la invención es la de tirosina quinasas receptoras incluyendo el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), Flt3, CSF-1R, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGRF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y otros. Otra clase de inhibición 35 de quinasa de acuerdo con la invención es la actividad inhibidora de tirosina quinasas no receptoras incluyendo src y abl, y similares. Una tercera clase de inhibición de acuerdo con la invención es la actividad inhibidora respecto a serina/treonina quinasas, incluyendo quinasas tales como MAPK, MEK y quinasas dependientes de ciclina (CDK) que median la proliferación celular, AKT y CDK tales que median en la supervivencia celular y NIK que regulan respuestas inflamatorias. La inhibición de dichas quinasas puede usarse para tratar enfermedades que implican la 40 supervivencia, proliferación y migración celular, incluyendo enfermedad cardiovascular, tal como arterioesclerosis y reobstrucción vascular, cáncer, glomeruloesclerosis, enfermedades fibróticas e inflamación, así como el tratamiento general de enfermedades de proliferación celular.

En una realización preferida, la presente invención proporciona compuestos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que inhiben o impiden la inhibición de la fosforilación de al menos un receptor de PDGF 45 por al menos una tirosina quinasa. Dicha inhibición por quinasa del receptor de PDGF puede obstaculizar el crecimiento celular anormal y la migración celular y, por lo tanto, dichos compuestos son útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades de proliferación celular tales como arterioesclerosis, reobstrucción vascular, cáncer y glomeruloesclerosis.

Únicamente con fines informativos, la fórmula I es como se indica a continuación: 50

en la que

R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

-CN, -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, -O-naftilo, -O-indolilo y -O-isoquinolinilo; 5

cada uno de R2 y R4 es independientemente un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

hidrógeno, -O(-CH2)-CH3, -O-CH2-CH=CH2, -O-CH2-C4CH y -O(-CH2)n-R3; con la condición de que uno de los grupos R2 y R4 sea hidrógeno y el grupo R2 o R4 restante sea distinto de hidrógeno;

n es 1, 2 ó 3;

R3 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: 10

-OH, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH2, -N(-CH3)2, -NH(-CH2-fenilo), -NH(-Fenilo), -CN

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos particularmente preferidos de acuerdo con la fórmula anterior son compuestos tales en los que R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en GN, -O-metilo, -O-etilo, -O-propilo, -O-isopropilo, -O-butilo, -O-t-butilo, -O-isoamilo, 1-naftiloxi, 2-naftiloxi, 4-indoliloxi, 5-indoliloxi, 5-isoquinoliloxi, e isómeros y homólogos posicionales de los mismos, y todos los isómeros, sales, hidratos, solvatos y derivados de profármacos 5 farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la fórmula (I) incluyen sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables, sales metálicas, sales de amonio, sales de adición de aminas orgánicas, sales de adición de aminoácidos, etc. Son ejemplos de las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) sales de adición de ácidos inorgánicos, tales como clorhidrato, sulfato y 10 fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos, tales como acetato, maleato, fumarato, tartrato, citrato y metanosulfonato. Son ejemplos de las sales metálicas farmacéuticamente aceptables sales de metales alcalinos, tales como sal sódica y sal potásica, sales de metales alcalinotérreos, tales como sal de magnesio y sal cálcica, sal de aluminio y sal de cinc. Son ejemplos de las sales de amonio farmacéuticamente aceptables sal de amonio y sal de tetrametilamonio. Los ejemplos de las sales de adición de aminas orgánicas incluyen sales de amina 15 heterocíclica, tales como sales de morfolina y piperidina. Son ejemplos de las sales de adición de aminoácidos farmacéuticamente aceptables sales con lisina, glicina y fenilalanina.

Únicamente con fines informativos, la fórmula I(a) y la fórmula I(b) son como se indican a continuación:

en las que 20

R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

-CN, -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, -O-naftilo, -O-indolilo y -O-isoquinolinilo;

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Únicamente con fines informativos, la fórmula (Ic) y la fórmula (Id) son como se indican a continuación: 25

en las que

R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

-CN, -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, -O-naftilo, -O-indolilo y -O-isoquinolinilo; 5

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Únicamente con fines informativos, la fórmula I(e) y la fórmula I(f) son como se indican a continuación:

en las que

R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: 10

-CN, -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, -O-naftilo, -O-indolilo y -O-isoquinolinilo;

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

La invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula:

en la que n es 2 ó 3;

R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en -O-alquilo C1-8 que es de cadena lineal o ramificada, -O-fenilo, naftiloxi, indoliloxi e isoquinoliniloxi,

R3 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: 5

-OH, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH2, -N(-CH3)2, -NH(-CH2-fenilo), -NH(-Fenilo), -CN

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Preferentemente, en la que R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: -O-metilo, -O-etilo, -O-propilo, -O-isopropilo, -O-butilo, -O-t-butilo, -O-isoamilo, 1-naftiloxi, 2-naftiloxi, 4-indoliloxi, 5-indoliloxi, 5-10 isoquinoliloxi; y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

Además, preferentemente, en la que el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-morfolin-4-iletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-pirrolidiniletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

5

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-piperidiletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida

{4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}N-[4-(metiletoxi)fenil]carboxamida

{4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-N-[4-(metiletoxi)fenil]carboxamida

N-(4-indol-5-iloxifenil){4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida 5

N-(4-(5-isoquinoliloxi)fenil){4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-piperidilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida

{4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-N-[4-(metiletoxi)fenil]carboxamida

N-(4-indol-5-iloxifenil){4-[7-(2-metoxipropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

N-(4-(5-isoquinoliloxi)fenil){4-[7-(2-metoxipropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

5

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-morfolin-4-ilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-pirrolidinilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

{4-[7-(3-metoxipropoxi]quinazolin-4-il}piperazinil)-N-[4-metiletoxi)fenil]carboxamida

y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de acuerdo con lo anterior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. 5

De acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto anterior o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de proliferación celular seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, reobstrucción vascular, reestenosis, cáncer y glomerulosclerosis. sales, hidratos y solvatos

Los compuestos pueden fabricarse usando métodos y procedimientos como se describen en general en el 10 documento WO 98/14431 publicado el 12 de septiembre de 1998. Pueden fabricarse u obtenerse materiales de partida como se describe también en ese mismo documento.

Pueden utilizarse grupos salientes, tales como halógeno, alcoxi inferior, alquiltio inferior, alquilsulfoniloxi inferior, arilsulfoniloxi, etc, cuando sea necesario excepto para el punto de reacción seguido de desprotección. Son grupos protectores amino adecuados, por ejemplo, los descritos en T. W. Greene, Protective Groups in Organic 15 Synthesis, John Wiley y Sons Inc. (1981), etc., tales como etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, acetilo y bencilo. Los grupos protectores pueden introducirse y eliminarse de acuerdo con procedimientos convencionales usados en la química orgánica sintética [por ejemplo, T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley y Sons Inc. (1981)].

En dichos procedimientos, si los grupos definidos cambian en las condiciones del procedimiento de trabajo 20 o no son apropiadas para realizar el procedimiento, el compuesto deseado puede obtenerse usando los procedimientos de introducción y eliminación de los grupos protectores que se usan de forma convencional en la química orgánica sintética [por ejemplo, T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley y Sons Inc. (1981)], etc. La conversión de los grupos funcionales que se encuentran en los sustituyentes puede realizarse mediante procedimientos conocidos [por ejemplo, R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations (1989)] 25 además de los procedimientos que se han descrito anteriormente, y pueden utilizarse algunos de los compuestos activos de fórmula I en forma de intermedios para sintetizar adicionalmente nuevos derivados de acuerdo con la fórmula I.

Los intermedios y los compuestos deseados en los procedimientos que se han descrito anteriormente pueden aislarse y purificarse mediante procedimientos de purificación usados de forma convencional en la química 30 orgánica sintética, por ejemplo, neutralización, filtración, extracción, lavado, secado, concentración, recristalización y diversos tipos de cromatografía. Los intermedios pueden someterse a la reacción posterior sin purificación.

Pueden existir tautómeros para algunos compuestos de fórmula I, y la presente invención incluye todos los isómeros posibles incluyendo tautómeros y mezclas de los mismos. Cuando los propios carbonos quirales se prestan a dos enantiómeros diferentes, se contemplan ambos enantiómeros así como procedimientos para separar 35 los dos enantiómeros.

En el caso de que se desee una sal de un compuesto de fórmula I y el compuesto se produzca en forma de la sal deseada, puede someterse tal cual a purificación. En el caso de que se produzca un compuesto de fórmula I en el estado libre y se desee su sal, el compuesto de fórmula I se disuelve o se suspende en un disolvente orgánico adecuado seguido de la adición de un ácido o una base para formar una sal. 40

Los siguientes Esquemas de reacción no limitantes I, II y III ilustran realizaciones preferidas de la invención con respecto a la fabricación de compuestos de acuerdo con la invención.

Esquema I

El Esquema I describe la síntesis de un intermedio clave 7-(2-metoxietoxi)-4-piperazinilquinazolina que se 5 utilizará en la síntesis de diversas dianas como se describe en el Esquema II. El ácido 2-amino-4-fluorobenzoico se esterifica seguido de ciclación con formamida a temperatura elevada para proporcionar 7-fluoro-4-quinazolinona. El grupo 7-fluoro se desplaza con varios alcóxidos generados por tratamiento con NaH en DMF a 100ºC. El intermedio de 7-alcoxi-4-quinazolinona se convierte en 7-alcoxi-4-cloroquinazolina con cloruro de tionilo. El intermedio clave I se obtuvo por tratamiento de 7-alcoxisustituido-4-Cl-quinazolina con piperazina en un disolvente apropiado, tal como 10 isopropanol, acetonitrilo o THF a temperatura ambiente o a la temperatura de reflujo durante 1-6 h en presencia de una base de trietilamina o piridina.

Este Esquema II ilustrado proporciona la síntesis de diversas ureas sustituidas a partir del intermedio obtenido en el Esquema I, o mediante otros procedimientos. La reacción del intermedio I con diversos isocianatos proporcionó los compuestos de urea finales. En los casos en los que los isocianatos no están disponibles en el 15 mercado, el intermedio de piperazina se trata con fosgeno para dar un intermedio de cloruro de carbamoílo seguido de reacción con diversas anilinas sustituidas. El intermedio de piperazina también puede tratarse con cloroformiato de p-nitrofenilo para proporcionar el intermedio de carbamato de nitrofenilo que puede tratarse con diversas anilinas para proporcionar las ureas deseadas.

Si el compuesto de urea tiene un grupo terminal NH2 (o uno o más de los átomos de hidrógeno en este 20 grupo amino está reemplazado por un sustituyente desplazable), entonces este compuesto puede utilizarse como un compuesto intermedio con el que producir un compuesto de urea terminado con un grupo -NH-fenil-R1. Como alternativa, si se desea un grupo R1 diferente en el grupo fenilo, un sustituyente de fenilo del grupo saliente en la posición para reemplazable puede desplazarse después del acoplamiento para proporcionar el sustituyente R1 particular como se ha descrito anteriormente para la fórmula I. 25

Esquema II

El Esquema III describe la síntesis de 6-(2-metoxietoxi)-4-piperazinilquinazolina como un intermedio clave que se utilizará en la síntesis de diversas dianas de isómeros posicionales.

5

Esquema III

Dichos procedimientos para la producción de los compuestos reivindicados son solamente una ilustración de un aspecto preferido de la invención. Otros procedimientos y adaptaciones serán evidentes para un experto en la materia en vista de estos esquemas de reacción y las estructuras de los compuestos de acuerdo con la invención. 5 Se considera que dichos procedimientos están dentro del alcance de la presente invención.

Además, los compuestos de fórmula I y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden existir en forma de aductos con agua (hidratos) o diversos disolventes, que también están dentro del alcance de la presente invención.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar mejor la presente invención. 10

Ejemplo 1

El intermedio 4-piperazinil-7-(2-piperidiletoxi)quinazolina se preparó usando los procedimientos que se ha descrito en general en el Esquema 1 como se indica a continuación:

Etapa A: A la solución en etanol (15 ml) de ácido 2-amino-4-fluorobenzoico (840 mg, 5,41 mmol) se le 15 añadió cloruro de tionilo (1,18 ml, 16,23 mmol) y la suspensión resultante se calentó a reflujo durante una noche. El disolvente se evaporó, al residuo se le añadió EtOAc, se lavó con una solución al 10% de NaOH, se secó, se filtró y se evaporó, proporcionando el éster etílico deseado en forma de un sólido (981 mg, 82%). EM (EN) 184 (M+H).

Etapa B: A la solución en formamida (6 ml) de 2-amino-4-fluorobenzoato de etilo (811 mg, 4,43 mmol) se le 20

añadió formiato amónico (0,450 g, 7,14 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 140ºC durante una noche. Después de la refrigeración, se añadieron agua y acetato de etilo. Las fases se separaron y la fase de EtOAc se secó, se filtró y se evaporó, dando la quinazolinona deseada (1 g, cuantitativo). EM (EN) 165 (M+H)

Etapa C: A la solución en DMF (3 ml) de 1-piperidinaetanol (0,689 mg, 5,18 mmol) a 0ºC se le añadió 5 hidruro sódico (0,518 g, 12,95 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 min. A esta solución fría se le añadió una solución en DMF (3 ml) de intermedio de quinazolinona (0,284 g, 1,73 mmol, de la Etapa B) y la mezcla se calentó a 75ºC durante una noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por RP-HPLC, proporcionando el producto deseado en forma un sólido cremoso (0,459 g, al 97%)

Etapa D: Una mezcla de 7-(2-piperidiletoxi)-4-quinazolinona (0,459 g, 1,68 mmol) de la Etapa C) y POCl3 (5 10 ml) se calentó a 75ºC durante una noche. Después de la refrigeración, se retiró el exceso de FOCl3 por evaporación y el residuo se destiló azeotrópicamente con tolueno, proporcionando el intermedio, 4-cloro-7-(2-piperidiletoxi)quinazolina (600 mg, al 95%).

Etapa E: A la solución en isopropanol (10 ml) de 4-cloroquinazolina (0,615 g, 2,11 mmol, de la Etapa D) se le añadió piperazina (0,727 g, 8,44 mmol) y la reacción se calentó durante 4 h a 100ºC. El disolvente se 15 evaporó y el residuo se purificó por RP-HPLC, proporcionando 4-piperazinil-7-(2-piperidiletoxi)quinazolina en forma de un sólido de color blanco (0,630 g, al 87%).

Preparación de N-(4-cianofenil){4-[7-(2-piperidiletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida

A una solución en DMF (2 ml) de 4-piperazinil-7-(2-piperidiletoxi)quinazolina (de la Etapa E, 0,287 g, 0,84 20 mmol) se le añadió una solución en DMF (2 ml) de isocianato de 4-cianofenilo (0,181 g, 1,26 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por RP-HPLC, proporcionando el producto deseado N-{4-cianofenil){4-[7-(2-piperidiletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida en forma de un sólido de color blanco (200 mg, al 50%). EM (EN) 487 (M+H).

Ejemplo 2 25

Se preparó N-(4-cianofenil){4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida usando los procedimientos que se han descrito anteriormente en el Ejemplo 1 con la excepción de que se usó 2-metoxietanol en lugar de 1-piperidinaetanol en forma de un anión de alcóxido, proporcionando el compuesto del título.

Las actividades farmacológicas de los compuestos de la presente invención se obtienen siguiendo los 30 siguientes procedimientos de ejemplos de ensayo, por ejemplo.

Tipo 1 de Ensayo de Test Biológico

Efecto inhibidor de compuestos sobre la Autofosforilación del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, -PDGF

(1) Ensayo de fosforilación de HR5

La línea celular HR5 es una línea celular de células CHO manipuladas para sobreexpresar -PDGFR humano, línea celular que está disponible de la ATCC. El nivel de expresión de -PDGFR en células HR5 es de 5 aproximadamente 5 x104 receptores por célula. Para el ensayo de fosforilación de acuerdo con la invención, se cultivaron células HR5 hasta confluencia en placas de microvaloración de 96 pocillos en condiciones de cultivo tisular convencionales, seguido por privación de suero durante 16 horas. Las células quiescentes se incubaron a 37ºC sin o con concentraciones en aumento del compuesto de ensayo (0,01-30 uM) durante 30 minutos seguido de la adición de PDGF BB 8 nM durante 10 minutos. Las células se lisaron en Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 750 mM, 10 Triton X-100 al 0,5%, pirofosfato sódico 10 mM, NaF 50 mM, 10 ug/ml de aprotinina, 10 ug/ml de leupeptina, fluoruro de fenilmetillsulfonilo 1 mM, vanadato sódico 1 mM, y el lisado se limpió mediante centrifugado a 15.000 x g durante 5 minutos. Los lisados aclarados se transfirieron a una segunda placa de microvaloración en la que los pocillos se recubrieron previamente con 500 ng/pocillo de mAb 1B5B11 anti--PDGFR, y a continuación se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de unión (gelatina al 0,3%, Hepes 25 15 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween-20 al 0,01%), 250 ng/ml de anticuerpo antifosfotirosina policlonal de conejo (Transduction Laboratory) se añadieron y las placas se incubaron a 37ºC durante 60 minutos. Posteriormente, cada pocillo se lavó tres veces con tampón de unión y se incubó con 1 ug/ml de anticuerpo anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 60 minutos. Los pocillos se lavaron antes de añadir ABTS (Sigma), y la tasa de formación de sustrato se monitorizó a 650 nm. Los resultados del ensayo se 20 presentan como CI50 (expresados como la concentración de un compuesto de acuerdo con la invención que inhibe la fosforilación del receptor de PDGF en un 50%) en comparación con células de control que no están expuestas a un compuesto de acuerdo con la invención.

Los ejemplos de dichos resultados de test de CI50 en el ensayo de HR5 para compuestos de acuerdo con la invención se muestran a continuación en la Tabla 1. 25

(2) Ensayo de fosforilación de MG63

La línea celular MG63 es una línea celular tumoral de osteosarcoma humano disponible de la ATCC. Este ensayo es para medir la fosforilación de -PDGFR endógeno en células MG63. Las condiciones del ensayo son las mismas que las descritas para la célula HR5, excepto que la estimulación de PDGF-BB se proporciona en presencia o ausencia de plasma humano al 45%. Los resultados del ensayo de HR5 se presentan como una CI50 (expresados 30 como la concentración de un compuesto de acuerdo con la invención que inhibe la fosforilación del receptor de PDGF en un 50%) en comparación con células de control que no están expuestas a un compuesto de acuerdo con la invención.

Los ejemplos dichos resultados de test de CI50 en el ensayo de MG63 para compuestos de acuerdo con la invención se muestran a continuación en la Tabla 1. 35

Los resultados del ensayo para los Compuestos de los Ejemplos 1 y 2 se muestran en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Compuesto del Ejemplo

MG63 con plasma humano CI50 (M) HR5 CI50 (M)

Ejemplo 1

0,103 0,150

Ejemplo 2

3,56 2,27

Tipo 2 de Ensayo de Test Biológico 40

Inhibición del crecimiento contra células de músculo liso

Se aíslan células vasculares de músculo liso de una aorta de cerdo mediante explante y se usan para el test. Las células se colocan en los pocillos de una placa de 96 pocillos (8.000 células/pocillo) y se cultivan en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) que contenía suero fetal bovino al 10% (FBS; Hyclone) durante 4 días. A continuación, las células se cultivan adicionalmente en DMEM que contenía FBS al 45 0,1% durante 3 días, y se sincronizan en la fase estacionaria del crecimiento celular.

A cada pocillo se le añade DMEM que contiene FBS al 0,1% y una muestra de ensayo a una concentración

variada, y el crecimiento celular se provoca mediante PDGF-BB (SIGMA, concentración final: 20 ng/ml). Después de cultivar durante 3 días, el crecimiento celular se mide usando un kit de ensayo del crecimiento celular (Boehringer Mannheim) de acuerdo con el procedimiento XTT [J. Immunol. Methods, 142, 257-265 (1991)], y el valor de crecimiento celular se calcula mediante la siguiente ecuación.

Valor de crecimiento celular = 100 x {1-(M-PO)/(P100-PO)} donde P100 = absorbancia mediante reactivo 5 XTT cuando se estimula con PDGF-BB; PO = absorbancia mediante reactivo XTT cuando no se estimula con PDGF-BB, y M = absorbancia mediante reactivo XTT después de la adición de una muestra cuando se estimula con PDGF-BB.

El resultado del test se expresa como la concentración de un compuesto de ensayo que inhibe el crecimiento celular en un 50% (CI50) 10

Tipo 3 de Ensayo de Test Biológico

Efecto inhibidor sobre la hipertrofia de la íntima vascular

Ratas SD macho (peso: 375-445 g, Charles River, criterio de referencia) se anestesian con pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.), y a continuación el cuello de cada animal se corta mediante la incisión mediana, seguida de una incisión retrógrada de un catéter con globo (2F, Edwards Laboratories) en la carótida externa izquierda. 15 Después de haber repetido el tratamiento anterior siete veces, el catéter se saca, la carótida externa izquierda se liga, y la herida se sutura. Un compuesto de ensayo se suspende en una solución al 0,5% de Tween 80 en una solución acuosa de cloruro sódico a una concentración de 20 mg/ml en el caso de administración intraperitoneal y en una solución al 0,5% de metilcelulosa 400 a una concentración de 6 mg/ml en el caso de administración oral. La suspensión se administra una vez al día en el caso de administración intraperitoneal y una o dos veces al día en el 20 caso de administración oral durante un periodo de 15 días comenzando el día antes de la lesión por globo. El 14º día después de la lesión por globo, el animal es sacrificado y su carótida izquierda es extirpada. Los tejidos se fijan con formalina, se envuelven en parafina y se cortan, seguido por tinción de Elastica Wangeeson. El área de la sección transversal de los tejidos vasculares (íntima y media) se mide con un analizador de imágenes (Luzex F, NIRECO) y la proporción de área de íntima/media (I/M) se contempla como el grado de hipertrofia de la íntima vascular. 25

A partir de los resultados obtenidos, es evidente cuando la hipertrofia de la íntima vascular es inhibida significativamente por la administración de los compuestos de la presente invención.

Tipo 4 de Ensayo de Test Biológico

Evaluación mediante el uso de un modelo de artritis por adyuvante en rata

Células muertas de la bacteria Mycobacterium (Difco Laboratories Inc.) se rompen en un mortero de ágata y 30 se suspenden en parafina líquida a la concentración final de 6,6 mg/ml, seguida de la esterilización con vapor a alta presión. A continuación, 100 ml de la suspensión se inyectan por vía subcutánea en la almohadilla plantar de la pata trasera derecha de cada animal de los grupos de hembras de 8 semanas de edad (Charles River, Japón) (6 animales/grupo) para inducir artritis por adyuvante. Un compuesto de ensayo se suspende en una solución al 0,5% de metilcelulosa a la concentración final de 3 mg/ml, y desde justo antes de la inducción de artritis, la suspensión se 35 administra por vía oral en una cantidad de 100 ml/100 g del peso corporal una vez al día, 5 días por semana. A un grupo de control se le administra una solución al 0,5% de metilcelulosa. A un grupo normal no se le proporciona tratamiento con adyuvante o administración del compuesto de ensayo. La administración del compuesto de ensayo continúa hasta el 18º día después del tratamiento con adyuvante. El 17º día, se cuenta el número de leucocitos en la sangre periférica, y el 18º día, toda la sangre se recoge, seguida de disección. 40

El cambio de peso corporal con el paso del tiempo, el cambio de edema en la pata trasera con el paso del tiempo, el peso del bazo y del timo, el número de leucocitos en la sangre periférica, el contenido de hidroxiprolina de la orina, el contenido de glucosaminoglicano de la orina, la concentración de SH en el suero, la concentración de monóxido de nitrógeno en el suero y la concentración de mucoproteína en el suero se miden y se evalúan. El volumen de cada una de las dos patas traseras se mide usando un dispositivo de medición de edema de la pata 45 trasera de rata (TK-101, Unicom). El número de leucocitos en la sangre periférica se cuenta usando un contador de células sanguíneas multicanal automático (Sysmex K-2000, Toa Iyo Denshi Co., Ltd.). El contenido de hidroxiprolina de orina se mide de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento Ikeda, et al., Annual Report of Tokyo Metropolitan Research Laboratories P. H., 36, 277 (1985), y el contenido de glucosaminoglicano se mide de acuerdo con el procedimiento descrito en los documentos Moriyama, et al., Hinyo Kiyo, 40, 565 (1994) y Klompmakers, et al., 50 Analytical Biochemistry, 153, 80 (1986). La concentración de SH en el suero se mide de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento Miesel, et al., Inflammation, 17, 595 (1993), y la concentración de monóxido de nitrógeno se mide de acuerdo con el procedimiento del documento Tracey, et al., Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics, 272, 1011 (1995). La concentración de mucoproteína se mide usando el kit Aspro GP (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). El porcentaje de inhibición para cada indicación se calcula de acuerdo con la 55 siguiente ecuación.

% de inhibición = {(Grupo de control - grupo al que se le administró el compuesto)/(grupo de control - grupo normal)} x 100.

A partir de los resultados obtenidos a partir de dichos ensayos, es evidente cuando el compuesto de acuerdo con la invención inhibe la aparición de artritis por adyuvante.

Tipo 5 de Ensayo de Test Biológico 5

Actividad de un modelo de glomerulonefritis proliferativa mesangial

El anticuerpo monoclonal anti-Thy-1.1 de rata OX-7 (Sedaren) se administra a ratas Wister-Kyoto macho (Charles River Japón, 160 g, 6 animales/grupo) en una cantidad de 1,0 mg/kg mediante administración intravenosa a través de la vena caudal. Un compuesto de ensayo se suspende en una solución al 0,5% de metilcelulosa y la suspensión resultante se administra a cada una de las ratas dos veces al día durante un periodo de 7 días 10 comenzando el día antes de la administración de OX-7. El 7º día después de la administración de OX-7, cuando el crecimiento de células mesangiales y la hipertrofia de la matriz extracelular se vuelven prominentes, el riñón izquierdo de cada rata es extirpado, fijado con formalina tamponada al 20% durante 6 horas y se envuelve en parafina, seguido por corte en rodajas. Los pedazos obtenidos se someten a tinción de tejido inmune usando anticuerpo PC10 (DAKO) contra un antígeno intranuclear de células proliferativas. Después de la tinción comparativa 15 con solución de tinción Methyl Green usando diaminobenzidina como desarrollador de color, los pedazos de parafina se cierran sobre sí mismos. La mitad de los glomérulos en un pedazo de riñón se observan y se calcula el número de las células en un glomérulo que son positivas al antígeno intranuclear de células proliferativas. El test para la significación de la diferencia se realiza mediante el test de Wilcoxon.

A partir de dichos resultados, es evidente cuando los compuestos de acuerdo con la presente invención 20 muestran actividad aliviadora sobre la glomerulonefritis proliferativa mesangial.

Los compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden administrarse como tales, pero habitualmente se prefiere administrarlos en forma de composiciones farmacéuticas, que se usan para animales y seres humanos.

Se prefiere emplear la vía de administración que es la más eficaz para el tratamiento. Por ejemplo, la 25 administración se realiza por vía oral o por vía no oral mediante administración intrarrectal, intraoral, subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Los ejemplos de las formas de administración son cápsulas, comprimidos, gránulos, polvos, jarabes, emulsiones, supositorios e inyecciones.

Las composiciones líquidas tales como emulsiones y jarabes que son apropiadas para administración oral 30 pueden prepararse usando agua, azúcares tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles tales como polietilenglicol y propilenglicol, aceites tales como aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja, conservantes tales como benzoatos, aromas tales como aroma de fresa y de menta, etc.

Pueden prepararse cápsulas, comprimidos, polvos y gránulos usando excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol, agentes disgregantes tales como almidón y alginato sódico, lubricantes tales como 35 estearato de magnesio y talco, aglutinantes tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina, tensioactivos tales como ésteres de ácidos grasos, plastificantes tales como glicerina, etc.

Las composiciones adecuadas parta administración no oral comprenden preferiblemente una preparación acuosa esterilizada que contiene un compuesto activo que es isotónico respecto a la sangre del receptor. Por ejemplo, se preparan inyecciones usando un vehículo que comprende una solución salina, una solución de glucosa, 40 o una mezcla de una solución salina y una solución de glucosa.

Las composiciones para aplicación tópica se preparan disolviendo o suspendiendo un compuesto activo en uno o más tipos de disolventes tales como aceite mineral, vaselina y alcohol polihídrico, u otras bases usadas para fármacos tópicos.

Las composiciones para administración intestinal se preparan usando vehículos ordinarios tales como grasa 45 de cacao, grasa hidrogenada y ácido carboxílico de grasa hidrogenada, y se proporcionan como supositorios.

Las composiciones para administración no oral pueden formularse adicionalmente para contener uno o más tipos de aditivos seleccionados entre glicoles, aceites, aromas, conservantes (incluyendo antioxidantes), excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, aglutinantes, tensioactivos y plastificantes que se usan para la preparación de composiciones para administración oral. 50

La dosis eficaz y el programa de administración para cada uno de los compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos variarán dependiendo de la vía de administración, la edad y el peso corporal del paciente, y el tipo o grado de las enfermedades a tratar. Sin embargo, generalmente es apropiado

administrar un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una dosis de 0,01-1000 mg/adulto/día, preferiblemente 5-500 mg/adulto/día, en de una a varias partes.

Todos los compuestos de la presente invención pueden aplicarse inmediatamente al tratamiento de enfermedades dependientes de quinasa de mamíferos como inhibidores de quinasa, específicamente, las relacionadas con tirosina quinasa. Se prefieren específicamente los compuestos que tienen CI50 dentro del intervalo 5 de 10 nM-10 M. Se prefieren aún más los compuestos que tiene una CI50 dentro del intervalo de 10 uM a 1 M. Los compuestos que más se prefieren son los que tienen un valor de CI50 que es menor que 1 M.

Pueden seleccionarse los compuestos específicos de la presente invención que tienen una actividad para inhibir específicamente uno de los tres tipos de proteína quinasa (por ejemplo, quinasa que fosforila tirosina, quinasa que fosforila tirosina y treonina, y quinasa que fosforila treonina). Las enfermedades dependientes de tirosina 10 quinasa incluyen la disfunción hiperproliferativa que es causada o mantenida por actividad anormal de tirosina quinasa. Los ejemplos de las mismas incluyen psoriasis, fibrosis pulmonar, glomerulonefritis, cáncer, aterosclerosis y anti-angiopoyesis (por ejemplo, crecimiento tumoral y retinopatía diabética). El conocimiento actual de la relación entre otras clases de quinasa y enfermedades específicas es insuficiente. Sin embargo, los compuestos que tienen actividad inhibidora de PTK específica tienen un efecto de tratamiento útil. Otras clases de quinasa también se han 15 reconocido de la misma manera. Quercetina, genisteína y estaurosporina, que son todas inhibidores de PTK, inhiben muchos tipos de proteína quinasa además de la tirosina quinasa. Sin embargo, como resultado de su falta de especificidad, su citotoxicidad es alta. Por lo tanto, un inhibidor de PTK (o un inhibidor de otras clases de quinasa) que sea apto para provocar efectos secundarios indeseables debido a la falta de selectividad, puede identificarse mediante el uso de un test ordinario para medir la citotoxicidad. 20

La presente invención proporciona compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que inhiben la fosforilación del receptor de PDGF para obstaculizar el crecimiento celular anormal y la migración celular y, por lo tanto, sean útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades de proliferación celular tales como arterioesclerosis, reobstrucción vascular, cáncer y glomeruloesclerosis. 25

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto que tiene la fórmula:

   en la que n es 2 ó 3;

   R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en: -O-alquilo C1-8 que es una cadena lineal o 5 ramificada, -O-fenilo, naftiloxi, indoliloxi e isoquinoliniloxi,

   R3 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

   -OH, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH2, -N(-CH3)2, -NM(-CH2-fenilo), -NH(-Fenilo), -CN

   y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables. 10
2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R1 es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste

   en: -O-metilo, -O-etilo, -O-propilo, -O-isopropilo, -O-butilo, -O-t-butilo, -O-isoamilo, 1-naftiloxi, 2-naftiloxi, 4-indoliloxi, 5-indoliloxi, 5-isoquinoliloxi;

   y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.
3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo que consiste en:

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-morfolin-4-iletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida 5

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-pirrolidiniletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(2-piperidiletoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida

   {4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}N-[4-(metiletoxi)fenil]carboxamida

   {4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-N-(4-fenoxifenil)carboxamida

   5

   N-(4-indol-5-iloxifenil){4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   N-(4-(5-isoquinoliloxi)fenil){4-[7-(2-metoxietoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-piperidilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-carboxamida

   5

   {4-[7-(2-metoxipropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}-N-(4-fenoxifenil)carboxamida

   N-(4-indol-5-iloxifenil){4-[7-(2-metoxipropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   N-(4-(5-isoquinoliloxi)fenil){4-[7-(2-metoxipropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   5

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-morfolin-4-ilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   N-[4-(metiletoxi)fenil]{4-[7-(3-pirrolidinilpropoxi)quinazolin-4-il]piperazinil}carboxamida

   {4-[7-(3-metoxipropoxi]quinazolin-4-il}piperazinil)-N-[4-metiletoxi)fenil]carboxamida

   5

   y todas sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.
4. 4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. 5. El uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal, hidrato o solvato 5 farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de proliferación celular seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, reobstrucción vascular, reestenosis, cáncer y glomerulosclerosis.
6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad de proliferación celular 10 seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, reobstrucción vascular, reestenosis, cáncer y glomerulosclerosis.