ES2353222T3

ES2353222T3 - Anticuerpos anti-cd154 (ligando cd40) aglicosilados y usos de los mismos.

Info

Publication number: ES2353222T3
Application number: ES04776502T
Authority: ES
Inventors: Ellen A. Garber; Linda C. Burkly; Frederick R. Taylor; Christopher D. Benjamin
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2004-06-14
Publication date: 2011-02-28
Anticipated expiration: 2024-06-14
Also published as: CN1835976B; CN1835976A

Abstract

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, caracterizado por una modificacion en el sitio ligado a N conservado de los dominios CH2 de la parte Fc de dicho anticuerpo.

Description

Campo técnico de la invención [0001] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados de anticuerpos de estos, que bloquean la interacción de moléculas de CD154 y CD40. Los métodos para producir los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados y derivados de anticuerpos se describen en la presente. Los anticuerpos y derivados de anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y prevención de enfermedades que involucran respuestas inmunes no deseables, y que están mediadas por interacciones CD154–CD40.

Antecedentes de la invención [0002] La generación de inmunidad humoral y mediada por células está orquestada por la interacción de células T auxiliares activadas con células presentadoras de antígeno ("APC") y células T efectoras. La activación de las células T auxiliares no es solo dependiente de la interacción del receptor de las células T específicas del antígeno ("TCR") con su ligando péptido cognado-MHC, sino que también requiere la unión coordinada y la activación por numerosas moléculas de adhesión celular y coestimuladoras [Salazar-Fontana, 2001]. [0003] Una molécula coestimuladora crítica es CD154 (también conocida como ligando de CD40, CD40L, gp39, T-BAM, Molécula Activadora de las Células T, TRAP), una proteína de transmembrana de Tipo II que se expresa de manera restringida temporalmente y dependiente de la activación sobre la superficie de las células T CD4+. CD154 también se expresa, después de la activación, en un subconjunto de células T CD8+, basófilos, mastocitos, eosinófilos, células citolíticas naturales, células B, macrófagos, células dendríticas y plaquetas. [0004] El contrarreceptor de CD154, CD40, es una proteína de membrana Tipo I que se expresa en forma constitutiva y general en la superficie de muchos tipos celulares, que incluyen los APC [Foy, 1996]. [0005] La señalización a través de CD40 por CD154 inicia una cascada de eventos que producen la activación de las células portadoras de CD40 y la activación óptima de las células T CD4+. Más específicamente, la interacción cognada entre CD154 y CD4 promueve la diferenciación de las células B en células secretoras del anticuerpo y células B de memoria [Burkly, 2001]. En forma adicional, la interacción de CD154CD40 promueve la inmunidad mediada por células a través de la activación de macrófagos y células dendríticas y la generación de células citolíticas naturales y linfocitos T citotóxicos [Burkly, 2001].

[0006] El papel crítico de CD154 en la regulación de la función de la respuesta inmune humoral y mediada por células ha provocado gran interés en el uso de inhibidores de esta vía para la inmunomodulación terapéutica [patente de Estados Unidos 5.474.771]. Como tal, se ha demostrado que los anticuerpos anti-CD154 son beneficiosos en una amplia variedad de modelos de respuesta inmune con otras proteínas terapéuticas o terapia génica, alergenos, autoinmunidad y trasplante [patente de Estados Unidos 5.474.771; Burkly, 2001]. [0007] Se ha demostrado que la interacción CD40-CD154 es importante en varias enfermedades autoinmunes inducidas experimentalmente, tales como artritis inducida por colágeno, encefalomielitis alérgica experimental ("EAE"), ooforitis, colitis, y nefritis lúpica inducida por fármacos. En forma específica, se ha demostrado que la inducción de enfermedades en todos estos modelos se puede bloquear con antagonistas de CD154 en el momento de la administración del antígeno [Burkly, 2001]. [0008] El bloqueo de la enfermedad usando antagonistas anti-CD154 también se ha observado en los modelos animales de enfermedad autoinmune espontánea, que incluyen diabetes dependiente de insulina y nefritis lúpica, así como en la enfermedad del injerto versus huésped, trasplante, fibrosis pulmonar, y modelos de enfermedad de aterosclerosis [Burkly, 2001]. [0009] Si bien se ha probado que los anticuerpos anti-CD154 glicosilados son útiles para la prevención y el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con la respuesta inmune, en algunos sujetos, las terapias que los usan algunas veces están complicadas por la actividad tromboembolítica [Biogen Press Release, 2001; IDEC Press Release, 2001]. Si bien el mecanismo de este efecto secundario es desconocido, podría involucrar el coligamiento por el anticuerpo anti-CD154, o sus agregados, de FcγRIIa y CD154 sobre las plaquetas, que llevan a una activación de plaquetas inapropiada. La unión de otros receptores Fcγ y el complemento también podría potenciar este efecto. En consecuencia, las formas de los anticuerpos anti-CD154 que no se unen a los receptores efectores pueden ser más seguras y/o más efectivas para el uso terapéutico. [0010] El mecanismo por el cual los anticuerpos anti-CD154 inhiben la función inmune puede ser más complejo que la unión simple a CD154 para bloquear las interacciones con CD40 y, en efecto, puede incluir contribuciones por vías efectoras. Por ejemplo, la unión anticuerpo-antígeno puede inducir la supresión de las células T activadas a través del dominio de Fc de unión a receptores Fcγ o componentes del complemento. Alternativamente, la unión del anticuerpo al CD154 puede aumentar por la formación de un armazón de la superficie celular del anticuerpo sobre las células portadoras del receptor Fcγ. Además, el acceso del anticuerpo a su sitio de acción se puede promover por las interacciones de la unión del receptor Fcγ. [0011] En los anticuerpos glicosilados, que incluyen anticuerpos anti-CD154, los glicanos unidos al sitio N-ligado conservado en los dominios CH2 del dímero Fc se incluyen entre los dominios CH2, con los residuos azúcar que hacen contacto con residuos de aminoácidos específicos en el dominio CH2 opuesto [Jeffries, 1998]. Estudios in vitro con varios anticuerpos glicosilados han demostrado que la eliminación de los glicanos CH2 altera la estructura de Fc de modo que la unión del anticuerpo a los receptores Fc y la proteína del complemento C1Q se reduce mucho [Nose, 1983; Leatherbarrow, 1985; Tao, 1989; Lund, 1990; Dorai, 1991; Hand, 1992; Leader, 1991; Pound, 1993; Boyd, 1995]. Los estudios in vivo han confirmado la reducción de la función efectora de los anticuerpos aglicosilados. Por ejemplo, un anticuerpo aglicosilado anti-CD8 es incapaz de reducir las células portadoras de CD8 en ratones [Isaacs, 1992] y un anticuerpo aglicosilado anti-CD3 no induce el síndrome de liberación de citoquinas en ratones o seres humanos [Boyd, 1995; Friend, 1999]. [0012] Si bien la eliminación de los glicanos del dominio CH2 parece tener un efecto significativo sobre la función efectora, otras propiedades funcionales y físicas del anticuerpo permanecen inalteradas. En forma específica, se ha demostrado que la eliminación de los glicanos tuvo poco a ningún efecto sobre la vida media sérica y la unión al antígeno [Nose, 1983; Tao, 1989; Dorai, 1991; Hand, 1992; Hobbs, 1992].

Compendio de la invención [0013] De acuerdo con la presente invención, la función efectora de Fc involucrada en el mecanismo de acción de los anticuerpos anti-CD154 se dilucida mediante el uso de un anticuerpo anti-CD154 en el que la función efectora de Fc se ha reducido por una modificación del sitio ligado a N conservado de los dominios CH2 del dímero Fc, lo que produce los anticuerpos "aglicosilados" anti-CD154. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen la mutación del sitio ligado a N conservado en los dominios CH2 del dímero de Fc, la eliminación de los glicanos del sitio ligado a N de los dominios CH2 y el impedimento de la glicosilación. Para averiguar si el mecanismo de inhibición con el anticuerpo anti-CD154 depende de sus interacciones efectoras de Fc, el anticuerpo anti-CD154 y su contraparte aglicosilada se compararon con respecto a su capacidad de inhibir varias enfermedades por medio del bloqueo de la interacción CD154-CD40. Los resultados informados en la presente demuestran que las formas aglicosiladas de un anticuerpo CD154 son igualmente protectoras que las formas glicosiladas del anticuerpo anti-CD154. [0014] Debido a que los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención se caracterizan por la función efectora disminuida, estos anticuerpos son particularmente convenientes para usar en sujetos donde existe el potencial de actividad tromboembolítica no deseable. Adicionalmente, la reducción de la función efectora de Fc de los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados puede reducir o eliminar otros efectos secundarios potenciales de las terapias con anticuerpo anti-CD154, tales como la supresión de células T activadas y otras poblaciones de células inducidas para expresar CD154 o la activación dependiente del Fc de los monocitos/macrófagos. [0015] En forma específica, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CD154 aglicosilados que reconocen CD154. Más particularmente, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, humanizado – a saber "hu5c8 aglicosilado", y un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado murino – a saber "muMR1aglicosilado". [0016] En una realización de la presente invención, el anticuerpo hu5c8 aglicosilado se produce a partir de la línea celular de hu5c8 aglicosilado NS0, que se depositó en el American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia el 14 de enero de 2003 (Acceso Núm. PTA-4931), y el anticuerpo MR1 aglicosilado se produce a partir de la línea celular de MR1 murino alglicosilado que fue depositada en el ATCC el 14 de enero de 2003 (Acceso Núm. PTA-4934). [0017] En una realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados son capaces de inhibir la interacción entre CD154 y CD40. [0018] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados pueden asociarse con CD154 de manera que bloquean, en forma directa o indirecta, la activación de las células portadoras de CD40. [0019] También se describe en la presente un método de inhibir una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o un derivado de anticuerpo de este, en el que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra en una cantidad efectiva para inhibir la activación de las células inmunes en el sujeto. [0020] También se describe en la presente un método de tratar o prevenir, en un sujeto, una afección o enfermedad dependiente de la respuesta inmune, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o uno de sus derivados del anticuerpo, el anticuerpo o derivado del anticuerpo que se administra en una cantidad efectiva para inhibir la activación de las células inmunes en el sujeto y de este modo tratar o prevenir la afección o enfermedad dependiente de la respuesta inmune.

Breve descripción de los dibujos [0021] La FIG. 1 ilustra que el anticuerpo monoclonal ("mAb") hu5c8 aglicosilado y mAb hu5c8 glicosilado se unen al CD154 humano con la misma afinidad relativa. La unión del mAb hu5c8 biotinilado al CD154 de la superficie celular compitió con titulaciones del mAb hu5c8 glicosilado o mAb hu5c8 aglicosilado no marcado. La intensidad de fluorescencia media del anticuerpo biotinilado detectado con estreptavidina-PE se graficó versus la concentración del anticuerpo no marcado. Los ajustes de la curva de cuatro parámetros se ilustran, colectivamente. [0022] La FIG. 2 ilustra que mAb hu5c8 aglicosilado tiene mejores capacidades de unión a FcR. Se evaluó la capacidad de un anticuerpo anti-CD154, a saber mAb hu5c8 aglicosilado, para formar un puente entre las células huCD154 y FcγRI+ (a) o entre las células huCD154+ CHO y las células FcγRIII+ (b). Las células FcγR+ marcadas con fluorescencia se añadieron a placas de microtitulación que contienen mAb hu5c8 glicosilado o mAb hu5c8 aglicosilado que están preunidos a CD154. Las células FcγR+ unidas se detectaron por la medición de las unidades fluorescentes relativas ("UFR") en cada pocillo usando los espectros de excitación/emisión, 485/530 nm. [0023] La FIG. 3 ilustra que mAb hu5c8 glicosilado y mAb hu5c8 aglicosilado tienen la misma vida media sérica en los monos cynomolgus. Las concentraciones del mAb hu5c8 glicosilado y mAb hu5c8 aglicosilado se midieron en el suero de monos cynomolgus después de la administración de una dosis intravenosa de 20 mg/kg única. Las concentraciones séricas medias para cada tratamiento se representan ± desvío estándar ("DE"). [0024] La FIG. 4 ilustra que mAb hu5c8 glicosilado y mAb hu5c8 aglicosilado inhiben una respuesta inmune primaria al toxoide tetánico ("TT"). Los resultados se grafican para monos cynomolgus en los grupos tratados con mAb y control con solución salina en el estudio de mAb hu5c8 glicosilado (símbolos cerrados) y en el mAb hu5c8 aglicosilado (símbolos abiertos). [0025] La FIG. 5 ilustra que el mAb hu5c8 aglicosilado inhibe una respuesta inmune consecuencia del TT. Se representan las respuestas de anticuerpo totales primarias (barras cerradas) y secundarias (barras abiertas) (EAUC) al TT para monos cynomolgus individuales. Los animales del Grupo 1A recibieron solución salina antes de los estímulos de TT primarios y secundarios. Los animales del grupo 1B recibieron solución salina antes del estímulo de TT primario y mAb hu5c8 aglicosilado antes del estímulo de TT secundario.

[0026] La FIG. 6 ilustra la farmacocinética del anticuerpo MR1 quimérico murino glicosilado ("muMR1") y muMR1 aglicosilado en ratones BALB/c. Se grafican los resultados para el anticuerpo muMR1 glicosilado (símbolo rombo) y anticuerpo muMR1 aglicosilado (símbolo cuadrado). [0027] La FIG. 7 (A & B) ilustra que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado disminuye la respuesta del autoanticuerpo a ADN de cadena simple (A) y cadena doble (B) en ratones SNF1. Se representan los resultados para el anticuerpo muMR1 (símbolo rombo) y el anticuerpo muMR1 aglicosilado (símbolo cuadrado). El anticuerpo mulgG2a control se muestra como un símbolo triángulo. [0028] La FIG. 8 ilustra que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado disminuye el desarrollo de la nefritis glomerular en ratones SNF1. Las puntuaciones histológicas del compuesto se ilustran para ratones tratados con mulgG2a (controles), muMR1 y muMR1 aglicosilado. [0023] La FIG. 9 ilustra que anticuerpos anti-CD154 aglicosilados retrasan el comienzo de la nefritis glomerular en los ratones SNF1. Se muestran los resultados para el anticuerpo muMR1 (símbolo rombo) y anticuerpo muMR1 aglicosilado (símbolo cuadrado). El anticuerpo mulgG2a control se muestra como un símbolo triángulo. [0030] La FIG. 10 ilustra que los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados retrasan el inicio del aumento de los niveles de nitrógeno ureico sanguíneo ("BUN") en los ratones SNF1. Se muestran los resultados para el anticuerpo muMR1 (símbolo rombo) y anticuerpo muMR1 aglicosilado (símbolo cuadrado). El anticuerpo mulgG2a control se muestra como un símbolo triángulo. [0031] La FIG. 11 ilustra que los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados impiden un aumento de la creatinina sérica en los ratones SNF1. Se muestran los resultados para el anticuerpo muMR1 (símbolo rombo) y anticuerpo muMR1 aglicosilado (símbolo cuadrado). El anticuerpo mulgG2a control se muestra como un símbolo triángulo. [0032] La FIG. 12 ilustra que los ratones tratados con el anticuerpo muMR1 no desarrollaron síntomas de encefalomielitis autoinmune experimental ("EAE"), en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo control de isotipo P1.17. Se ilustran los resultados para el anticuerpo muMR1 (círculos abiertos) y el anticuerpo control P1.17 (círculos cerrados). [0033] La FIG. 13 ilustra que en ratones tratados con el anticuerpo muMR1 aglicosilado, el anticuerpo muMR1 aglicosilado fue tan efectivo en la inhibición de los signos clínicos de la EAE como el anticuerpo muMR1. Los resultados se ilustran indicando puntuación de discapacidad (media + error estándar de la media -"SEM") y % del peso inicial (media + SEM) relacionado con los días después de la inducción de la enfermedad. P1.17 es una Ig control. [0034] La FIG. 14 representa los niveles de glucosa sanguínea en ayunas ("FBG") en monos rhesus después del trasplante de islote alogeneico. El rechazo agudo se definió como FBG >100 mg/dl. Se ilustran animales tratados con MAb hu5c8 aglicosilado (líneas discontinuas) y mAb hu5c8 glicosilado (líneas llenas).

Descripción detallada de la invención [0035] A fin de que la presente invención sea comprendida completamente, se expone la siguiente descripción detallada. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. Los ejemplos de métodos y materiales se describen a continuación, aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descriptos en la presente también se pueden usar en la práctica de la presente invención y serán evidentes para los expertos en la técnica. [0036] En toda esta solicitud, varias publicaciones y referencias son mencionadas entre paréntesis. Las descripciones de estas publicaciones y referencias, en su totalidad, se incorporan en la presente por referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece la presente invención. La cita bibliográfica para estas referencias se puede hallar en el texto o listado por número después de la sección de Detalles Experimentales. En caso de conflicto, regirá la presente memoria descriptiva. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. [0037] Los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de la tecnología de ADN recombinante conocidos por los expertos en la técnica incluyen Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 y Supplements to 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). [0038] Los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de inmunología conocidos por los expertos en la técnica incluyen: Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); y Roitt et al., Immunology, 3d Ed., Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993). Los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de fisiología y farmacología médica conocidos por los expertos en la técnica incluyen: Fauci et al., Eds., Harrison’s Principles Of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. (1998). [0039] La presente descripción contempla el uso de anticuerpos antiglicosilados o derivados de anticuerpos de estos, para inhibir las respuestas inmunes y tratar las enfermedades y afecciones inducidas por las respuestas inmunes –por ejemplo: enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplante, inflamación, enfermedad del injerto versus huésped, fibrosis, y aterosclerosis. [0040] En forma más específica, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados usados para el tratamiento, en particular para el tratamiento humano, incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales y anticuerpos multiméricos. ANTICUERPOS [0041] Un anticuerpo es una glicoproteína de PM aproximado de 150 kD, que es producido por la rama humoral del sistema inmune de los vertebrados en respuesta a la presencia de moléculas extrañas en el organismo. Un anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de reconocer y unirse a su antígeno específico in vitro o in vivo, y puede iniciar cualquiera de las acciones posteriores asociadas con la unión al anticuerpo, que incluyen por ejemplo, citotoxicidad directa, citotoxicidad dependiente del complemento ("CDC"), citotoxicidad dependiente del anticuerpo ("ADCC"), y producción del anticuerpo. [0042] Después de unirse al antígeno, los anticuerpos activan uno o más de los sistemas efectores del sistema inmune que contribuyen a la neutralización, destrucción y eliminación del microorganismo infectante u otra entidad que contiene el antígeno, por ejemplo, célula cancerosa. [0043] Si bien los anticuerpos naturales derivan de una especie única, los anticuerpos manipulados genéticamente y los fragmentos de anticuerpo pueden derivar de más de una especie de animal, -por ejemplo, anticuerpos quiméricos. Hasta la fecha, se han generado anticuerpos quiméricos de ratón (murino) /humano y murino/primate no humano, aunque otras combinaciones de especies son posibles. [0044] En una realización, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención son anticuerpos quiméricos. Normalmente, los anticuerpos quiméricos incluyen las regiones variables de cadena pesada y/o liviana, que incluyen residuos de la región determinante de complementariedad ("CDR") y estructura, de una especie, (normalmente ratón) fusionadas con las regiones constantes de otra especie (normalmente humano). Estos anticuerpos quiméricos ratón/humano contienen aproximadamente 75% de secuencias de aminoácidos humanas y 25% de ratón, respectivamente. Las secuencias humanas representan las regiones contantes del anticuerpo, mientras que las secuencias de ratón representan las regiones variables (y de este modo contienen los sitios de unión al antígeno) del anticuerpo. [0045] El fundamento de usar tales quimeras es retener la especificidad del antígeno del anticuerpo de ratón pero reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de ratón (un anticuerpo de ratón puede causar una respuesta inmune contra este en especies diferentes que el ratón) y en consecuencia poder emplear la quimera en terapias humanas. [0046] En otra realización específica, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos que comprenden regiones estructurales de un anticuerpo y regiones CDR de otro anticuerpo. [0047] En una realización más específica, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos que comprenden regiones CDR de diferentes anticuerpos humanos. [0048] En otra realización específica, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos que comprende las regiones CDR de al menos dos anticuerpos humanos diferentes. [0049] Los métodos de obtener todos los anticuerpos quiméricos descriptos anteriormente son bien conocidos por los expertos en la técnica [patente de Estados Unidos 5.807.715; Morrison, 1984; Sharon, 1984; Takeda, 1985]. [0050] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados también incluyen anticuerpos primatizados, humanizados y totalmente humanos. Los anticuerpos primatizados y humanizados normalmente incluyen CDR de cadena pesada y/o liviana de un anticuerpo murino injertadas en una región estructural V del anticuerpo de primate no humano o humano, usualmente que además comprende una región constante humana [Riechmann, 1988; Co, 1991; patentes de Estados Unidos 6.054.297; 5.821.337; 5.770.196; 5.766.886; 5.821.123; 5.869.619; 6.180.377; 6.013.256; 5.693.761; y 6.180.370].

1. Anticuerpos humanizados [0051] Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo producido por tecnología de ADN recombinante, en el que algunos o todos los aminoácidos de una cadena liviana o pesada de inmunoglobulina humana que no son necesarios para la unión del antígeno (por ejemplo, las regiones constantes y las regiones estructurales de los dominios variables) se usan para sustituir con los correspondientes aminoácidos de la cadena liviana o pesada del anticuerpo no humano cognado. A modo de ejemplo, una versión humanizada de un anticuerpo murino para un antígeno dado tiene en sus cadenas pesada y liviana (1) regiones constantes de un anticuerpo humano; (2) regiones estructurales de los dominios variables de un anticuerpo humano; y (3) CDR del anticuerpo murino. Cuando es necesario, uno o más residuos de las regiones estructurales humanas se pueden cambiar por residuos en las correspondientes posiciones del anticuerpo murino de modo de preservar la afinidad de unión del anticuerpo humanizado al antígeno. Este cambio algunas veces se llama "retromutación". Generalmente es menos probable que los anticuerpos humanizados induzcan una respuesta inmune en los seres humanos en comparación con los anticuerpos humanos quiméricos porque los primeros contienen considerablemente menos componentes no humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanizados son bien conocidos por los expertos en la técnica de los anticuerpos [Patente Europea 239400; Jones, 1986; Riechmann, 1988; Verhoeyen, 1988; Queen, 1989; Orlandi, 1989; patente de Estados Unidos 6.180.370]. [0052] En una realización de la presente invención, se generan anticuerpos humanizados por el trasplante de CDR murinas (u otras no humanas) en un anticuerpo humano. En forma más específica, esto se obtiene de la siguiente manera: (1) los ADNc que codifican los dominios variables de cadena pesada y liviana se aíslan de un hibridoma; (2) las secuencias de ADN de los dominios variables, que incluyen las CDR, se determinan por secuenciación; (3) los ADN que codifican las CDR se transfieren a las correspondientes regiones de una secuencia codificadora del dominio variable de cadena pesada o liviana del anticuerpo humano por mutagénesis dirigida al sitio; y (4) se añaden los segmentos del gen de la región constante humana de un isotipo deseado (por ejemplo, 1 para CH y k para CL). Finalmente, los genes de la cadena pesada y liviana humanizada se coexpresan en células huésped de mamífero (por ejemplo, células CHO o NS0) para producir anticuerpo humanizado soluble. [0053] Algunas veces, la transferencia directa de las CDR a la estructura humana lleva a la pérdida de la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo resultante. Esto es debido a que en algunos anticuerpos cognados, ciertos aminoácidos de las regiones estructurales interactúan con las CDR y en consecuencia influyen en la afinidad de unión al antígeno total del anticuerpo. En tales casos, puede ser crítico introducir "retromutaciones" en las regiones estructurales del anticuerpo aceptor a fin de retener la actividad de unión al antígeno del anticuerpo cognado. Los métodos generales de obtener retromutaciones son bien conocidos por los expertos en la técnica [Queen, 1989; Co, 1991; solicitud de patente PCT WO 90/07861; Tempest, 1991].

2. Anticuerpos humanos [0054] En una realización de la presente invención, los anticuerpos y derivados de anticuerpos son anticuerpos anti-CD154 aglicosilados completamente humanos. [0055] En una realización más particular de la presente invención, los anticuerpos completamente humanos se preparan usando esplenocitos humanos activados in vitro, [Boerner, 1991] o bibliotecas de anticuerpo desplegado en fago [patente de Estados Unidos 6.300.064]. [0056] En una realización más particular de la presente invención, los anticuerpos completamente humanos se preparan por clonación del repertorio [Persson, 1991; Huang y Stollar, 1991]. Además, la patente de Estados Unidos 5.798.230 describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanos de células B humanas, en la que las células B productoras del anticuerpo humano se inmortalizan por la infección con un virus de Epstein-Barr o un derivado de este, que expresa el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr 2 ("EBNA2"), una proteína requerida para la inmortalización. La función de EBNA2 posteriormente se desactiva, lo que produce un aumento de la producción del anticuerpo. [0057] Otros métodos para producir anticuerpos completamente humanos involucran el uso de animales no humanos que tienen locus de IG endógena inactivados y son transgénicos para los genes de la cadena pesada y cadena liviana del anticuerpo humano reordenado. Tales animales transgénicos pueden ser inmunizados con células T activadas o proteína D1.1 [patente de Estados Unidos 5.474.771; patente de Estados Unidos 6.331.433; patente de Estados Unidos 6.455.044] y se pueden generar hibridomas a partir de las células B derivadas de ellos. Los detalles de estos métodos se describen en la técnica. Véase, por ejemplo las diversas publicaciones/patentes de GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) respecto de ratones transgénicos que contienen minilocus de Ig humana, que incluyen la patente de Estados Unidos 5.789.650; las diversas publicaciones/patentes de Abgenix (Fremont, CA) con respecto a ratones XENOMOUSE®, que incluyen las patentes de Estados Unidos 6.075.181, 6.150.584 y 6.162.963; Green, 1997; Mendez, 1997; y las diversas publicaciones/patentes de Kirin (Japón) respecto de ratones "transómicos", que incluyen la Patente Europea 843961 y Tomizuka, 1997.

GENERACIÓN DE ANTICUERPOS DESGLICOSILADOS [0058] En la actualidad existen dos maneras de reducir la función efectora de un mAb a la vez que se retienen los otros atributos valiosos de la parte Fc de este. Una manera de modificar un anticuerpo es mutar aminoácidos en la superficie del mAb que están involucrados en las interacciones de unión al efector [Patente Europea 239400; Jefferies, 1998]. Si bien es probable que alguna combinación de las mutaciones producirá la reducción adecuada de la función efectora, los anticuerpos mutantes de superficie que se han probado hasta ahora parecen retener actividad residual. Otro problema con este abordaje es que los cambios de aminoácidos en la superficie del mAb pueden provocar inmunogenicidad. [0059] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados de anticuerpos con función efectora disminuida, que se caracterizan por una modificación en el sitio ligado a N conservado en los dominios CH2 de la parte Fc de dicho anticuerpo. [0060] En una realización de la presente invención, la modificación comprende una mutación en el sitio de glicosilación de la cadena pesada para impedir la glicosilación en el sitio. En consecuencia, en una realización preferida de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados de anticuerpos se preparan por la mutación del sitio de glicosilación de la cadena pesada, -es decir, la mutación de N298Q (N297 usando la numeración EU de Kabat) y expresan en una célula huésped apropiada. Por ejemplo, esta mutación se puede obtener siguiendo el protocolo recomendado de los fabricantes para el kit de mutagénesis de sitio único de Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA). El anticuerpo mutado se puede expresar en forma estable en una célula huésped (por ejemplo, célula NS0 o CHO) y posteriormente se purifica. Como ejemplo, la purificación se puede llevar a cabo usando cromatografía de proteína A y filtración con gel. Será evidente para los expertos en la técnica que también se pueden usar métodos adicionales de expresión y purificación. [0061] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo tienen función efectora disminuida, en el que la modificación en el sitio ligado a N conservado de los dominios CH2 de la parte Fc de dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo comprende la eliminación de los glicanos del dominio CH2, -es decir, desglicosilación. Estos anticuerpos anti-CD154 aglicosilados se puede generar por métodos convencionales y posteriormente se desglicosilan enzimáticamente. Los métodos para la desglicosilación enzimática de los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica [Williams, 1973; Winkelhake & Nicolson, 1976]. [0062] En otra realización de la presente invención, la desglicosilación se puede obtener usando el inhibidor de la glicosilación tunicamicina [Nose & Wigzell, 1983]. Es decir, la modificación es el impedimento de la glicosilación en el sitio ligado a N conservado en los dominios CH2 de la parte Fc de dicho anticuerpo. [0063] En otras realizaciones de la presente invención, los polipéptidos de CD154 recombinantes (o células o membranas celulares que contienen dichos polipéptidos) se pueden usar como un antígeno para generar un anticuerpo anti-CD154 o derivados del anticuerpo, que posteriormente se puede desglicosilar. El antígeno se puede mezclar con un adyuvante o ligar a un hapteno para aumentar la producción del anticuerpo. [0064] Ya sea que las modificaciones de los anticuerpos aglicosilados o derivados del anticuerpo de la presente invención se producen por la mutación dirigida al sitio o por métodos de desglicosilación enzimática descriptos anteriormente, las bases de la generación de anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica [Harlow, 1998; Coligan, 2001; Zola, 2000]. [0065] Después de la inmunización, los anticuerpos o derivados del anticuerpo de la presente invención se pueden producir usando cualquier técnica convencional. Véase, por ejemplo, Howard, 2000; Harlow, 1998; Davis, 1995; Delves, 1997; Kenney, 1997. [0066] En algunas realizaciones de la presente invención, las células huésped pueden ser, por ejemplo, (1) células bacterianas, tales como, E. coli, Caulobacter crescentus, Streptomyces especie, y Salmonella typhimurium; (2) células de levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica; (3) líneas celulares de insectos, tales como las de Spodoptera frugiperda por ejemplo, líneas celulares Sf9 y Sf21, y células expresSF™ (Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA) -células de Drosófila S2 y Trichoplusia en High Five® Cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); o (4) células de mamíferos. Las células de mamífero típicas incluyen las células COS1 y COS7, células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma NS0, células NIH 3T3, células 293, células HEPG2, células HeLa, células L, HeLa, MDCK, HEK293, WI38, líneas celulares ES murinas (por ejemplo, de cepas 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ), K562, células Jurkat, y BW5147. Otras líneas celulares de mamífero son bien conocidas y disponibles fácilmente en el American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA, USA) y el National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Genetic Cell Repository at the Coriell Cell Repositories (Camden, NJ, USA). Estos tipos celulares son sólo representativos y no significan una lista exhaustiva. [0067] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se preparan por traducción libre celular. [0068] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se producen en biorreactores que contienen células que expresan el anticuerpo, a fin de facilitar la producción en gran escala. [0069] En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se producen en mamíferos transgénicos (por ejemplo, cabras, vacas u ovejas) que expresan el anticuerpo en leche, a fin de facilitar la producción en gran escala de los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados [patente de Estados Unidos 5.827.690; Pollock, 1999]. [0070] Como se indicó antes, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo de la presente invención se pueden producir en células procarióticas y eucarióticas. La invención en consecuencia también proporciona células que expresan los anticuerpos de la presente invención, que incluyen células de hibridoma, células B, células plasmáticas, así como células huésped modificadas en forma recombinante para expresar los anticuerpos de la presente invención. [0071] Entre otras consideraciones, algunas de las cuales se describieron antes, una cepa de célula huésped se puede elegir por su capacidad para procesar la proteína de CD154 expresada de modo deseado. Además de la aglicosilación, tales modificaciones pos-traducción del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, fosforilación, lipidación y acilación, y es un aspecto de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo con una

o más de estas modificaciones pos-traducción. MODIFICACIONES DEL ANTICUERPO [0072] Cuando se administran, a menudo los anticuerpos se eliminan rápidamente de la circulación y en consecuencia pueden inducir una actividad farmacológica relativamente breve. En consecuencia, frecuentes inyecciones de dosis relativamente grandes de anticuerpos pueden ser necesarias para sostener la eficacia terapéutica del tratamiento con el anticuerpo. [0073] En una realización de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se pueden modificar (es decir, unir a otros restos) para aumentar la integridad y longevidad del anticuerpo in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo de la presente invención se pueden modificar para incluir un resto que puede aumentar la estabilización, de este modo se prolonga la vida media sérica del anticuerpo. [0074] En algunas realizaciones de la presente invención los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados se modifican por la unión covalente de polímeros hidrosolubles, tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina

– todos los cuales se sabe que exhiben vidas medias sustancialmente más largas en sangre después de la inyección intravenosa que las correspondientes proteínas no modificadas [Abuchowski, 1981; Anderson, 1992; Newmark, 1982; Katre, 1987]. [0075] Las modificaciones del anticuerpo también pueden aumentar la solubilidad de la proteína en solución acuosa, eliminar la agregación, potenciar la estabilidad física y química de la proteína, y reducir mucho la inmunogenicidad y antigenicidad de la proteína. Como resultado, la actividad biológica in vivo deseada se puede obtener por la administración de tales aductos de proteína poliméricos menos frecuentemente o en dosis menores que con la proteína no modificada. [0076] En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados se modifican por la marcación con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, enzima, colorante o biotina. [0077] En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se modifican al conjugarse con un agente terapéutico, por ejemplo, un radioisótopo o radionucleido (por ejemplo, 111In o 90Y), resto de toxina (por ejemplo, toxoide tetánico o ricina), toxoide o agente quimioterapéutico [patente de Estados Unidos 6,307,026]. [0078] En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados del anticuerpo se modifican al conjugarse con un agente de visualización de imagen. Los agentes de visualización de imagen pueden incluir por ejemplo un grupo de marcaje (por ejemplo, biotina, restos fluorescentes, restos radiactivos, marca de histidina u otras marcas de péptido) para el aislamiento o detección sencillos. DERIVADOS DE ANTICUERPO [0079] La presente invención también se refiere a derivados del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado. Todos los métodos y reactivos descriptos antes con respecto a los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados se pueden usar para producir derivados del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado de la presente invención. [0080] En algunas realizaciones de la presente invención, los derivados del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado incluyen complejos del anticuerpo heteromérico y fusiones del anticuerpo, tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos hemidiméricos, anticuerpos multivalentes (es decir, anticuerpos tetravalentes) y anticuerpos de cadena simple. Un anticuerpo hemidimérico está constituido de una parte Fc y una parte Fab. Un anticuerpo de cadena simple está constituido de regiones variables ligadas por espaciadores de proteína en una cadena de proteína simple. [0081] En algunas realizaciones de la presente invención, los derivados de los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados de la presente invención también pueden incluir proteínas que contienen una o más cadenas livianas y/o cadenas pesadas de inmunoglobulina, tales como monómeros y homo-o hetero-multímeros (por ejemplo, dímeros o trímeros) de estas cadenas, donde estas cadenas están opcionalmente unidas a azufre o entrecruzadas de otro modo. Estos derivados de anticuerpo pueden ser capaces de unirse a uno o más antígenos. [0082] De acuerdo con una realización alternativa, la presente invención incluye fragmentos de unión al antígeno aglicosilados de anticuerpos completos, tales como fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y F(v). En una realización adicional, la presente invención incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos completos, tales como fragmentos de anticuerpo Fab, Fab’, F(ab’)2 y F (v). LÍNEAS CELULARES [0083] La presente invención también proporciona líneas celulares que producen los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados descriptos en la presente. Una de tales líneas celulares, que produce el anticuerpo hu5c8 aglicosilado, se depositó el 14 de enero de 2003 en el ATCC, 10801n University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, U.S.A., bajos las condiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patente y se le asignó el Acceso ATCC Núm. PTA-4931. Una segunda línea celular, que produce el anticuerpo mu5c8 aglicosilado quimérico, murino, se depositó el 14 de enero de 2003 en el ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, U.S.A., bajos las condiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patente y se le asignó el Acceso ATCC Núm. PTA-4934. MÉTODOS TERAPÉUTICOS [0084] En una realización de la presente invención, un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, o un derivado de anticuerpo de este, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo, es capaz de inhibir una respuesta inmune en un sujeto. El anticuerpo, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad inhibidora efectiva. [0085] Una "cantidad inhibidora efectiva" de un anticuerpo, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica es cualquier cantidad que es efectiva para inhibir la interacción CD154-CD40 en el sujeto al que se administra. Los métodos de determinar una "cantidad inhibidora" son bien conocidos por los expertos en la técnica y dependen de factores que incluyen, pero sin limitación el tipo de sujeto involucrado, el tamaño del sujeto y el agente terapéutico administrado. [0086] En una realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de unirse a la molécula de proteína de CD154. [0087] En una realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de unirse a la proteína de CD154 a la que se une en forma específica el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene el Acceso ATCC Núm. PTA-4931. [0088] En una realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de unirse al epítopo de CD154 al que se une específicamente el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene el Acceso ATCC Núm. PTA-4931, y en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo se caracteriza por una mutación de N298Q (N297 usando la numeración EU de Kabat). [0089] En una realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo no se une a un receptor efector. En una realización más específica de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de unirse a la proteína de CD154 a la que se une específicamente el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene el Acceso ATCC Núm. PTA-4931, y en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo o composición farmacéutica no se une a un receptor efector. [0090] En una realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo no causa trombosis. En una realización más específica de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de unirse a la proteína de CD154 a la que se une específicamente el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene el Acceso ATCC Núm. PTA-4931, y en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo o composición farmacéutica no causa trombosis. [0091] En otra realización específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la respuesta inmune por inhibición de la interacción CD154-CD40. [0092] En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la inflamación. Para los fines de la presente invención, las respuestas inflamatorias se caracterizan por enrojecimiento, edema, calor y dolor, como consecuencias de la dilatación capilar con edema y migración de leucocitos fagocíticos. Algunos ejemplos de respuestas inflamatorias incluyen: artritis, dermatitis por contacto, síndrome de hiper-IgE, enfermedad intestinal inflamatoria, asma alérgico, y enfermedad inflamatoria idiopática [Gallin, 1989]. Algunos ejemplos de artritis incluyen: artritis reumatoide, artritis inflamatoria no reumatoide, artritis asociada con enfermedad de Lyme y osteoartritis inflamatoria. Algunos ejemplos de enfermedad inflamatoria idiopática incluyen: psoriasis y lupus sistémico. [0093] En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir el rechazo por el sujeto de un órgano trasplantado. [0094] En una realización más específica de la presente invención, el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir el rechazo por el sujeto de un trasplante de corazón, riñón, hígado, piel, células del islote pancreático o médula ósea. [0095] En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la enfermedad del injerto versus huésped en un sujeto. [0096] En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir las respuestas alérgicas en un sujeto -por ejemplo, fiebre de heno o una alergia a la penicilina u otros fármacos. [0097] En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la respuesta autoinmune en un sujeto que sufre de enfermedad autoinmune. Los ejemplos de enfermedad autoinmunes incluyen, pero sin limitación: artritis reumatoide, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, diabetes mellitus, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, psoriasis, y enfermedades autoinmunes inducidas por fármacos, -por ejemplo, lupus inducido por fármacos. [0098] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir una respuesta autoinmune en un sujeto que sufre de una respuesta autoinmune que deriva de una enfermedad infecciosa. [0099] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir una respuesta autoinmune en un sujeto que sufre de una respuesta autoinmune que deriva de síndrome de Reiter, espondiloartritis, enfermedad de Lyme, infecciones con VIH, sífilis o tuberculosis. [0100] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir fibrosis en un sujeto. [0101] Algunos ejemplos de fibrosis incluyen: fibrosis pulmonar o enfermedad fibrótica. Algunos ejemplos de fibrosis pulmonar incluyen: fibrosis pulmonar consecuencia del síndrome de distrés respiratorio del adulto, fibrosis pulmonar inducida por fármaco, fibrosis pulmonar idiopática, o neumonitis por hipersensibilidad. Algunos ejemplos de enfermedades fibróticas incluyen: hepatitis C; hepatitis B; cirrosis; cirrosis del hígado consecuencia de un ataque tóxica; cirrosis del hígado consecuencia de fármacos; cirrosis hepática consecuencia de una infección viral; y cirrosis del hígado consecuencia de una enfermedad autoinmune. [0102] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir una enfermedad gastrointestinal. Algunos ejemplos de enfermedad gastrointestinal incluyen: dismotilidad esofágica, enfermedad intestinal inflamatoria y escleroderma. [0103] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir una enfermedad vascular. Algunos ejemplos de enfermedad vascular incluyen: aterosclerosis o lesión de reperfusión. [0104] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la proliferación de células tumorales de células T en un sujeto que sufre de un cáncer de células T, -por ejemplo, una leucemia

o linfoma de células T. Tal anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo o composición farmacéutica se puede administrar al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la proliferación de las células tumorales de células T en este sujeto. [0105] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de inhibir la infección viral de las células T de un sujeto por el virus de HTLV I. Tal anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica se puede administrar al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la infección viral. [0106] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de detectar por imágenes las células tumorales o células neoplásicas en un sujeto que expresa una proteína que es reconocida específicamente por el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA-4931. Un método para detectar por imagen células tumorales o células neoplásicas en un sujeto comprende las etapas de: administrar al sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo, o la composición farmacéutica en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o derivado de anticuerpo y una proteína en la superficie de las células tumorales o células neoplásicas; y detectar por imagen cualquier complejo de anticuerpo/ proteína o derivado de anticuerpo/complejo formado, de este modo se detectan por imagen cualquiera de las células tumorales o células neoplásicas en el sujeto. [0107] En una realización de la presente invención, el anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es capaz de detectar la presencia de células tumorales o células neoplásicas en un sujeto que expresa una proteína que es reconocida específicamente por el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA-4931. Uno de estos métodos para detectar la presencia de células tumorales o células neoplásicas en un sujeto comprende las etapas de: administrar al sujeto una cantidad efectiva de anticuerpo aglicosilado, derivado de anticuerpo, o la composición farmacéutica en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o derivado de anticuerpo y una proteína; eliminar cualquier agente de visualización de imagen no unido del sujeto; y detectar la presencia de cualquier complejo de anticuerpo/proteína o derivado de anticuerpo/complejo formado, la presencia de tal complejo indica la presencia de células tumorales o células neoplásicas en el sujeto. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS [0108] La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo, que se describe en la presente. [0109] En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados de anticuerpo. [0110] En otra realización de la presente invención, las composiciones farmacéuticas además pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante, un vehículo de administración, un buffer o un estabilizante. [0111] En una realización más particular de la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato, solución salina fisiológica, agua, formulaciones de citrato/sacarosa/Tween y emulsiones -por ejemplo, emulsiones aceite/agua. [0112] En un caso, la composición farmacéutica se puede administrar en un dispositivo de microencapsulación para reducir o prevenir la respuesta inmune del huésped contra la proteína. El anticuerpo o derivado de anticuerpo también se puede administrar microencapsulado en una membrana, tal como un liposoma. [0113] En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión, humectantes y de suspensión adecuados. [0114] En un caso, la composición farmacéutica se puede administrar por vía oral, tópica o intravenosa. [0115] En una realización más específica de la presente invención, para la administración oral, la composición farmacéutica se formula en una cápsula, comprimido, suspensión o solución acuosa adecuada. Las formulaciones sólidas de las composiciones para la administración oral pueden contener portadores o excipientes adecuados, tales como almidón de maíz, gelatina, lactosa, acacia, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, carbonato de calcio, cloruro de sodio

: o ácido algínico. Los desintegrantes que se pueden usar incluyen, sin limitación, celulosa microcristalina, almidón de maíz, glicolato de almidón sódico y ácido algínico. Los aglutinantes del comprimido que se pueden usar incluyen acacia, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, polivinilpirrolidina (Povidone™), hydroxipropil metilcelulosa, sacarosa, almidón, y etilcelulosa. Los lubricantes que se pueden usar incluyen estearatos de magnesio, ácido esteárico, fluido de silicona, talco, ceras, aceites y sílice coloidal. [0116] En una realización más específica de la presente invención, para las aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en un ungüento adecuado. Algunos ejemplos de formulaciones de una composición para uso tópico incluyen: gotas, tinturas, lociones, cremas, soluciones, y ungüentos que contienen el ingrediente activo y diversos soportes y vehículos. [0117] En una realización de la presente invención, una formulación de ungüento semisólida tópica normalmente comprende una concentración del ingrediente activo desde aproximadamente 1 a 20%, -por ejemplo, 5 a 10%, en un portador, tal como una base de crema farmacéutica. [0118] En una realización de la presente invención, también se pueden preparar fácilmente composiciones farmacéuticas para inhalación y composiciones transdérmicas. [0119] En una realización de la presente invención, las formulaciones líquidas de una composición farmacéutica para la administración oral preparadas en agua u otros vehículos acuosos pueden contener diversos agentes de suspensión tales como metilcelulosa, alginatos, tragacanto, pectina, kelgina, carragenina, acacia, polivinilpirrolidona, y alcohol polivinílico. Las formulaciones líquidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir

soluciones, emulsiones, jarabes y elixires que contienen, junto con los compuestos activos, agentes humectantes, edulcorantes, y agentes colorantes y saborizantes. Varias formulaciones líquidas y en polvo de las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por métodos convencionales para inhalación en los pulmones del mamífero tratado. [0120] En una realización de la presente invención, las formulaciones líquidas de una composición farmacéutica para inyección comprenden diversos portadores tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol, polioles -es decir, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, y similares. En algunas realizaciones, la composición incluye un portador de citrato/sacarosa/tween. Para inyecciones intravenosas, versiones solubles en agua de las composiciones se pueden administrar por el método de goteo, por el cual se infunde una formulación farmacéutica que contiene el agente antifúngico y un excipiente fisiológicamente aceptable. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa 5%, solución salina 0,9%, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Una forma insoluble adecuada de la composición se puede preparar y administrar como una suspensión en una base acuosa

: o una base oleosa farmacéuticamente aceptable, tal como un éster de un ácido graso de cadena larga -por ejemplo, oleato de etilo. [0121] En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende de aproximadamente 0,1 a 90% en peso (tales como 1 a 20% o 1 a 10%) de un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo de este, en un portador farmacéuticamente aceptable. [0122] En una realización de la presente invención, el porcentaje óptimo del anticuerpo

: o derivado de anticuerpo en cada composición farmacéutica varía de acuerdo con la formulación misma y el efecto terapéutico deseado en las patologías específicas y los regímenes terapéuticos correlacionados. La formulación farmacéutica está bien establecida en la técnica [Gennaro, 2000; Ansel, 1999; Kibbe, 2000]. Los métodos convencionales, conocidos por los expertos en la técnica de la medicina, se pueden usar para administrar la composición farmacéutica al sujeto. [0123] En algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica además comprende un compuesto inmunosupresor o inmunomodulador. Por ejemplo, tal compuesto inmunosupresor o inmunomodulador puede ser uno de los siguientes: un agente que interrumpe la señalización coestimuladora de las células T por medio de CD28; un agente que interrumpe la señalización de calcineurina, un corticoide, un

agente antiproliferativo, y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de las células inmunes, que incluyen pero sin limitación a CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 y RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ, y VLA-4. [0124] En algunas realizaciones de la presente invención, el compuesto inmunosupresor o inmunomodulador es tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo, mizorrubina, desoxiespergualina, brequinar sódico, leflunomida, rapamicina

: o azaspirano. [0125] En otras realizaciones de la presente invención, anticuerpos, derivados de anticuerpos o composiciones farmacéuticas que los comprenden se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador solo o como parte de un kit con rótulos e instrucciones para la administración. ADMINISTRACIÓN Y VÍAS DE APLICACIÓN [0126] Los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados o derivados de anticuerpos de este, y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto de cualquier manera que sea médicamente aceptable. Para los fines de la presente invención, "administración" significa alguno de los métodos estándares de administrar un anticuerpo, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica conocidos por los expertos en la técnica, y no deben limitarse a los ejemplos provistos en la presente. [0127] En algunos casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto por inyección en forma intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intramedular, intraventricular, intraepidural, intraarterial, intravascular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intraespinal, intratumoral, intracraneal, enteral, intrapulmonar, transmucosa, intrauterina, sublingual, o local en los sitios de inflamación o de crecimiento tumoral por medio de métodos estándares. [0128] En algunos casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto por vías que incluyen oral, nasal, oftálmica, rectal, o tópica. [0129] En un caso más específico, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto por vía oral en forma de cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. [0130] En un caso más específico, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a

un sujeto en forma tópica por la aplicación de una crema, ungüento o similares. [0131] En otros casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar por inhalación mediante el uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador de dosis medida. [0132] En otros casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto por la administración por liberación sostenida, por tales medio como inyecciones de depósito de implantes erosionables directamente aplicados durante la cirugía o por la implantación de una bomba de infusión o un implante de liberación sostenida biocompatible en el sujeto. [0133] En un caso más específico, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto por vías de administración de un depósito inyectable, tales como por el uso de materiales y métodos biodegradables o inyectables de 1, 3 o 6 meses de depósito . [0134] En un caso más específico, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto por la aplicación en la piel del sujeto de un parche transdérmico que contiene el anticuerpo, el derivado de anticuerpo o la composición farmacéutica, y deja el parche en contacto con la piel del sujeto, generalmente durante 1 a 5 horas por parche. [0135] En otros casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto en cualquier dosis por peso corporal y cualquier frecuencia de dosificación que sea médicamente aceptable. La dosis aceptable incluye un intervalo de entre aproximadamente 0,01 y 200 mg/kg de peso corporal del sujeto. [0136] En otros casos, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto repetidamente en intervalos que varían de uno cada día a uno cada mes. [0137] En un caso, los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en dosis múltiples por día, si se desea, para obtener la dosis diaria deseada total. La efectividad del método de tratamiento se puede evaluar por el control del sujeto por signos o síntomas conocidos de un trastorno. [0138] En todos los casos, la dosis y la tasa de dosis de los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, derivados de anticuerpos de estos y composiciones farmacéuticas de la presente invención efectivas para producir los efectos deseados dependerán de una variedad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad a tratar, el tamaño del sujeto, el objetivo del tratamiento, la composición farmacéutica específica usada y el criterio del médico tratante. [0139] Los anticuerpos anti-CD154 aglicosilados, los derivados de anticuerpos de estos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar como una dosis única para determinadas indicaciones, tales como prevenir la respuesta inmune a un antígeno al que está expuesto un sujeto durante un tiempo breve, tal como un antígeno exógeno administrado en un solo día de tratamiento. Los ejemplos de tal terapia pueden incluir la coadministración del anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invención junto con un agente terapéutico, por ejemplo un agente farmacéutico antigénico, un alergeno o un producto sanguíneo o un vector de terapia génica. En indicaciones donde el antígeno está presente crónicamente, tal como en el control de la reacción inmune en el tejido trasplantado o para administrar crónicamente agente farmacéuticos antigénicos, los anticuerpos, los derivados del anticuerpo o las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en intervalos durante el tiempo indicado médicamente, que varía de días o semanas a la vida del sujeto. [0140] En un caso, el sujeto que se puede tratar por los métodos descriptos anteriores es un animal. Preferiblemente, el animal es un mamífero. Los ejemplos de mamíferos que se pueden tratar incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos, roedores (que incluyen ratas, ratones, hámsters y cobayos) vaca, caballo, oveja, cabra, cerdo, perro y gato. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano. [0141] La presente invención se puede comprender mejor sobre la base de los siguientes Ejemplos. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos descriptos son sólo ilustrativos de la invención que se describe más completamente en las Realizaciones de la Invención que siguen de aquí en adelante.

Detalles experimentales EJEMPLOS [0142] Los siguientes ejemplos ilustran los productos de la presente invención y sus usos. Las modificaciones y adaptaciones adecuadas de las condiciones y los parámetros descriptos encontrados normalmente en la técnica de biología molecular que son evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu y el ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1: Generación y evaluación del anticuerpo hu5c8 aglicosilado

Expresión y caracterización del mAb hu5c8 aglicosilado

[0143] A fin de reducir la función efectora del mAb hu5c8, se creó una forma aglicosilada por el cambio del sitio de Asn ligado a N canónico del dominio CH2 de la cadena pesada por un residuo de Gln. [0144] Un ensayo de unión competitiva demostró que la capacidad del mAb hu5c8 aglicosilado para unirse a CD154 de la superficie celular no se alteró, en comparación con el mAb hu5c8 glicosilado (FIG. 1). [0145] La reducción de la función efectora se midió in vitro usando un formato de ensayo de formación de puente. La unión relativa del mAb hu5c8 aglicosilado a FcγRl disminuyó veinticinco veces, en comparación con el mAb hu5c8 glicosilado (FIG. 2A). No se pudo demostrar unión residual del mAb hu5c8 aglicosilado a FcγRIII en concentraciones de hasta 5 mg/ml, mientras que el mAb hu5c8 glicosilado normal dio una EC50 de 50 ng/ml en el mismo formato de ensayo (FIG. 2B).

Farmacocinética del mAb hu5c8 aglicosilado en monos cynomolgus

[0146] Los perfiles de concentración sérica-tiempo después de una sola dosis de 20 mg/kg de mAb hu5c8 y mAb hu5c8 aglicosilado de dos estudios independientes se sometieron a análisis de farmacocinética usando un modelo de dos compartimientos con una constante de la velocidad de eliminación de primer orden (WinNolin Professional Software v3.1, Pharsight Corp., Cary, NC). La FIG. 3 contiene los perfiles farmacocinéticos y la Tabla 1 contiene los parámetros farmacocinéticos promedio para mAb hu5c8 y mAb hu5c8 aglicosilado. La depuración y el volumen de distribución para mAb hu5c8 fue ligeramente superior que para mAb hu5c8 aglicosilado.

Tabla 1

Parámetros farmacocinéticos después de una dosis intravenosa única de 20 mg/kg de hu5c8 o Hu5c8 aglicosilado a monos CynomolgusA

Anticuerpo CmáxB CIC VssD t1/2E (μg/ml) (mlh/kg) (ml/kg) (d)

hu5c8 515(±16) 4,61(±0,70) 71 (±10) 11,5(±2,5) agli. hu5c8 869(±360) 3,10(±1,10) 47(±11) 11,8(±3,0)

ADatos informados como media aritmética ± desvío estándar, n = 3 para el grupo de tratamiento hu5c8, n = 4 para el grupo de tratamiento hu5c8 aglicosilado. Bconcentración sérica máxima, depuración sistémica, Dvolumen de distribución en estado estacionario, E vida media de fase terminal en suero.

MÉTODOS -Ejemplo 1 [0147] 1. Generación de anticuerpos. La selección, clonación y humanización del mAb hu5c8 se ha descripto previamente. Véase Lederman, 1992 y Karpusas, 2001,

5 respectivamente. El hibridoma de mAb hu5c8 está disponible en ATCC (HB10916). Se realizó la mutación del sitio de glicosilación de la cadena pesada N298Q (N297 usando numeración EU) en el mAb hu5c8 glicosilado por mutagénesis de eliminación de sitio único usando un kit de Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El hu5c8 aglicosilado resultante

10 se expresó en forma estable en las células de mieloma NSO y se purificó por cromatografía de Proteína A y filtración en gel. La línea celular productora del anticuerpo hu5c8 aglicosilado está disponible en ATCC (PTA-4931). SDS-PAGE y la cromatografía de filtración en gel analítica demostraron que la proteína formó el tetrámero unido por disulfuro esperado.

15 [0148] 2. Ensayo de unión de CD154. Se realizó un ensayo de unión competitiva basado en FACS en células huCD154+ D1.1 (obsequio del Dr. Leonard Chess, Columbia University, también disponible en ATCC (CRL-10915)). La unión de 0,1 mg/ml de mAb hu5c8 biotinilado a CD154 de la superficie celular compitió con titulaciones de mAb hu5c8 y mAb hu5c8 aglicosilado. El mAb hu5c8 biotinilado

20 unido a células se detectó con estreptavidina-ficoeritrina (PE) (BD-PharMingen San Diego, CA, USA). Las afinidades de unión relativas se infirieron a partir de los valores de IC50 de los ajustes de curva de cuatro parámetros. [0149] 3. Ensayos de formación de puentes CD154-FcγR. Las afinidades de unión de FcγR se midieron usando ensayos basados en la capacidad del anticuerpo para formar

25 un "puente" entre el antígeno y una célula portadora de FcγR (véase más adelante). El ensayo de formación de puente FcγRl (CD64) se realizó por el revestimiento de placas de ELISA de 96 pocillos Maxisorb (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) durante una noche a 4°C con 1 mg/ml de CD154 humano soluble recombinante (Biogen, Karpusas, 1995) en PBS y posteriormente se bloqueó con 1% de BSA en PBS. Las titulaciones

30 de mAb hu5c8 (glicosilado o aglicosilado) posteriormente se unieron a CD154 durante 30 minutos a 37°C, las placas se lavaron, y se midió la unión de las células marcadas con fluorescencia U937 (CD64+). Las células U937 se cultivaron en medio RPMI con 10% de FBS, 10 mM de HEPES, L-glutamina, y penicilina/estreptomicina, división 1:2, y se activó durante un día antes del ensayo con 1000 unidades/ml de IFNγ para aumentar la expresión de FcγRI. [0150] Los ensayos de formación de puente de FcγRIII (CD16) se realizaron usando una monocapa de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan CD154 (Biogen) cultivadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Corning Life Sciences Acton, MA, USA), con la medición de la unión dependiente de mAb de células Jurkat marcadas con fluorescencia transfectadas con CD16 (obsequio de Dana Farber Institute, Boston, MA, USA). Las células CHO-CD154+, se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 1x105 células/ml y se cultivaron hasta la confluencia en un medio α-MEM con 10% de FBS dializado, 100 nM de metotrexato, Lglutamina, y penicilina/ estreptomicina (todos reactivos de Gibco-BRL Rockville, MD, USA). Las células Jurkat CD16 +, que crecen en RPMI con 10% de FBS, 400 mg/ml de geneticina, 10 mM de HEPES, piruvato de sodio, L-glutamina, y penicilina/estreptomicina (todos reactivos de Gibco-BRL), se dividieron 1:2 un día antes de realizar el ensayo. [0151] En los ensayos para receptores de FcγRI y FcγRIII, las células portadoras del receptor de Fc se marcaron con acetoximetil éster de 2’,7’-bis-(2-carboxietil)-5-(y-6)carboxifluoresceína (BCECF-AM) (Molecular Probes Eugene, OR, USA) durante 20 minutos a 37°C. Después de lavar para eliminar el exceso de BCECF-AM, 1x105 de las células marcadas se incubaron en el ensayo durante 30 minutos a 37°C. Las células FcγR+ no unidas se eliminaron por lavado varias veces y las placas se leyeron en un lector de microplaca fluorescente Cytofluor 2350 (Millipore Corporation Bedford, MA, USA) con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.

Ejemplo 2: El anticuerpo hu5c8 aglicosilado inhibe las respuestas humorales primarias y secundarias

Inhibición de una respuesta humoral primaria al antígeno del toxoide tetánico (TT) en monos cynomolgus

[0152] Se evaluó la capacidad de una dosis única de 20 mg/kg de cada uno de mAb hu5c8 aglicosilado y mAb hu5c8 glicosilado, preparado de acuerdo con el Ejemplo 1, para inhibir una respuesta de anticuerpo primaria al TT en estudios separados. La administración de mAb hu5c8 aglicosilado o mAb hu5c8 glicosilado produjo reducciones de 70% y 77%, respectivamente, de la respuesta inmune primaria total (EAUC), en comparación con grupos tratados con solución salina. La FIG. 4 muestra los títulos de anticuerpo TT hasta el día 42 en forma gráfica, lo que demuestra que mAb hu5c8 aglicosilado inhibe una respuesta humoral primaria en un grado comparable al mAb hu5c8 glicosilado, a pesar de sus capacidades de unión a FcγR disminuidas. [0153] La inmunogenicidad de los mAb humanizados es otra medida de su eficacia en este modelo de primate no humano. Tres de cuatro animales tratados con una dosis única de 20 mg/kg de mAb hu5c8 aglicosilado desarrollaron un título bajo de anticuerpos hu5c8 alrededor del día 82, inmediatamente después de que el fármaco se eliminó del suero, en forma compatible con la inhibición de la respuesta humoral mientras que el mAb aglicosilado estaba presente (datos no mostrados). [0154] Como una medida adicional de la inhibición de la respuesta primaria, las biopsias de ganglios linfáticos inguinales mostraron que la presencia de centros germinales ("GC") en los animales tratados con mAb hu5c8 aglicosilado disminuyó mucho, en comparación con los controles. En los animales tratados, los GC fueron raros y pequeños, ocupando menos del 20% de la corteza. Los animales control presentaron múltiples GC con folículos secundarios moderada a marcadamente reactivos. El grado moderado a grave de hipoplasia de ganglios linfáticos observado fue compatible con el observado previamente con mAb hu5c8 glicosilado (datos no mostrados). [0155] No se observaron cambios groseros en los parámetros hematológicos después de la administración de una dosis única de 20 mg/kg de mAb hu5c8 glicosilado o aglicosilado en monos cynomolgus y no hubo cambio significativo en la cantidad total de linfocitos. Por otra parte, la relación de células T CD4/CD8 permaneció constante, lo que indica que no se produjo la reducción extendida de las células T CD4+ (datos no mostrados).

[0156] Inhibición de una respuesta humoral consecuencia del antígeno del toxoide tetánico (TT) en monos cynomolgus

[0157] Se evaluó la capacidad de una dosis única de 20 mg/kg de mAb hu5c8 aglicosilado para inhibir una respuesta inmune consecuencia del dar un segundo estímulo de TT a los ocho animales control con solución salina que tenían una repuesta primaria normal en la fase descripta previamente del estudio de mAb hu5c8 aglicosilado. Antes del segundo estímulo con TT, cuatro de estos animales recibieron 20 mg/kg de mAb hu5c8 aglicosilado (Grupo 1B) y cuatro recibieron solución salina (Grupo 1A). [0158] Las respuestas inmunes secundarias se caracterizan por comienzo más rápido y

son de mayor magnitud que las respuestas inmunes primarias. Se calculó la magnitud de la respuesta secundaria respecto de la respuesta primaria para los animales individuales (EAUC secundaria/ EAUC primaria) (Tabla 2). La FIG. 5 muestra las respuestas inmunes individuales primaria y secundaria total. Cabe advertir que hubo 5 considerable variabilidad en el grado de respuesta inmune entre los animales individuales. En promedio, un estímulo con TT secundario en los controles con solución salina (Grupo 1A) produjo una respuesta de anticuerpo total que fue 6,5 veces más alta que su respuesta primaria a este antígeno, mientras que los animales que recibieron mAb hu5c8 aglicosilado (Group 1B) produjeron una respuesta de anticuerpo

10 secundaria total que fue, en promedio, solo 2,0 veces superior que su respuesta primaria. En consecuencia, la administración del mAb hu5c8 aglicosilado produjo una reducción del 70% en la magnitud de la respuesta de anticuerpo secundaria, en comparación con controles con solución salina. Tabla 2

Respuestas primaria y secundaria totales (EAUC) al toxoide tetánico en monos cynomolgus

Grupo de tratamiento: Grupo 1A (salina -salina)A Grupo 1B (salina -hu5c8 aglicosilado)B

Animal #: 1A-1 1A-2 1A-3 1A4 1B-1 1B-2 1B-3 1B-4

EAUC primaria (x 105): 2,1 1,1 2,0 0,3 3,9 0,9 1,6 2,6

EAUC secundaria (x 105): 8,7 5,2 9,6 6,0 8,3 1,5 3,3 5,5

Magnitud: 4,2 4,8 4,8 18,8 2,1 1,6 2,1 2,2

Magnitud promedio del grupo: 6,5 2,0

A Los animales del grupo 1A recibieron solución salina antes del estímulo con TT primario y secundario. Los animles del grupo 1B recibieron solución salina antes del estímulo con TT primario y hu5c8 aglicosilado antes del estímulo con TT secundario. B La magnitud de la respuesta secundaria está representada por la relación de EAUC secundaria/ EAUC primaria.

MÉTODOS – Ejemplo 2 [0159] 1. Respuesta inmune humoral a TT. Se llevaron a cabo dos estudios independientes en monos cynomolgus, usando los mismos monos que en el Ejemplo 1. Se recolectaron muestras de sangre de cada estudio y la sangre entera para la inmunotipificación se mantuvo a temperatura ambiente y se realizó el análisis en el día en que se extrajo. [0160] Este estudio de mAb hu5c8 aglicosilado incluyó dos grupos de tratamiento. El Grupo 1, que consiste en cuatro machos y cuatro hembras, recibió solución salina en el día 1 y sirvieron como controles no tratados. El Grupo 2, que consiste en dos machos y dos hembras, recibió una dosis única de 20 mg/kg de mAb hu5c8 aglicosilado por vía intravenosa en el día 1 (descripto antes). Cuatro horas después del tratamiento, todos los animales recibieron una dosis intramuscular (IM) de 5 Lf (dosis floculantes de cal) del TT adsorbido. Se recolectó sangre pre-y pos-tratamiento en el día 1 y en días seleccionados hasta 190 días pos-dosificación. Se tomaron muestras de biopsias de ganglios linfáticos en el día 15. [0161] El estudio de mAb hu5c8 glicosilado estaba compuesto de cinco grupos de tratamiento, cada uno con tres hembras. En el Día 1, el Grupo 1 recibió solución salina (controles no tratados) y los Grupos 2 a 5 recibieron una dosis única de 0,2, 1,5 o 20 mg/kg de mAb hu5c8 glicosilado respectivamente, disponible en el ATCC (CRL10915). Cuatro horas después del tratamiento, todos los animales recibieron una inyección IM única de 5 Lf de TT adsorbido. Se recolectó sangre de todos los grupos pre-y pos-tratamiento en el día 1 y en días seleccionados hasta 42 días pos-dosificación. Para permitir la comparabilidad de estos dos estudios independientes, las muestras de suero seleccionadas se analizaron en forma paralela con el ELISA anti-TTA. [0162] En el día 230 después del estímulo primario con TT en el estudio del aglicosilado descripto antes, el Grupo 1 control se dividió en dos grupos. El Grupo 1A sirvió como controles no tratados, mientras que el Grupo 1B se trató con mAb hu5c8 aglicosilado para evaluar su capacidad de inhibir una respuesta inmune secundaria. Los animales se trataron de la siguiente manera: el Grupo 1B recibió una dosis única de 20 mg/kg de mAb hu5c8 aglicosilado por vía intravenosa en el día 1. El Grupo 1A recibió un volumen de dosis intravenosa equivalente de solución salina tamponada con fosfato en el día 1. Cuatro horas después del tratamiento, todos los animales recibieron una dosis IM de 5 Lf de TT adsorbido. Se recolectó sangre pre-y pos-tratamiento en el día 1 y en días seleccionados hasta 85 días pos-dosificación. [0163] 2. Evaluación de respuestas inmunes. Las respuestas inmunes se evaluaron usando análisis no compartimental. Los parámetros inmunes calculados incluyeron el valor del título máximo (Emáx), el tiempo para alcanzar este valor máximo (tmáx), y la respuesta de anticuerpo total al antígeno administrado desde el momento de la administración del antígeno hasta el último punto de tiempo del muestreo (EAUC(0final)). El análisis farmacocinético se realizó usando un modelo de dos compartimientos con una constante de velocidad de eliminación de primer orden (WinNolin Professional Software v3.1, Pharsight Corp., Cary, NC, USA). Los parámetros farmacocinéticos determinados incluyeron la concentración sérica máxima (Cmáx), la velocidad de depuración sistémica (C1), el volumen de distribución en el estado estacionario (Vss) y la vida media de la fase terminal (t1/2) del anticuerpo. Se realizaron análisis estadísticos, que incluyen media, desvío estándar y media geométrica usando el programa de ordenador Microsoft Excel versión 5.0 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA). [0164] 3. Inmunofenotipificación de monos cynomolgus. Se realizó la inmunofenotipificación de linfocitos usando un protocolo de tinción de sangre entera de dos colores seguido por el análisis FACS. En breves palabras, 100 µl de sangre entera tratada con EDTA se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con una de las siguientes combinaciones de mAb marcados: clon CD20-FITC 2H7 (BD-Pharmingen San Diego CA, USA) y CD2-PE clon RPA-2.10 (BD-Pharmingen), CD3FITC clon SP-34 (BD-Pharmingen) y CD4-PE clon OKT4 (Ortho Diagnostic Systems Raritan, NJ, USA), o CD3-FITC y CD8-PE clon DK-25 (Dako Corporation Carpinteria, CA, USA). Los eritrocitos se lisaron con 2 ml de solución de lisis 1X FACS (Becton-Dickinson Franklin Lakes, NJ, USA). Los linfocitos se fijaron con 1% de paraformaldehído y se analizaron con un FACScan equipado con programa de ordenador Cellquest (Becton-Dickinson). Se determinó el número de linfocitos totales por la suma de todas las células positivas CD2 y CD20. Las células B se identificaron como células positivas CD20. Los subconjuntos de células T se identificaron como positivos dobles para CD3 y CD4 o CD3 y CD8. Los linfocitos totales, células B, células T CD4+, y células T CD8+ se representaron como el porcentaje de células positivas dentro de la ventana de análisis de linfocitos. Se calculó la relación de CD4/CD8 para cada conjunto de datos. [0165] 4. ELISA para la farmacocinética de mAb hu5c8. Las placas de ELISA (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) se revistieron con 5 μg/ml de CD154 humano recombinante soluble (Biogen, véase también Karpusas 1995) en PBS toda una noche a 4°C y se bloquearon con 2% de suero de asno. (Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove, PA, USA -Catálogo #017-000-121). Se capturaron diluciones seriadas de suero y una curva estándar de mAb hu5c8 a partir de 8-500 ng/ml durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. El mAb hu5c8 unido se detectó usando IgG anti-humana de asno y peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove, PA, USA) seguido por el desarrollo con un kit de sustrato 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina ("TMB") (Pierce Biotechnology Rockland, IL, USA). Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placa Spectromax (Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA). Se usó un Softmax Pro Software (Molecular Devices) para actualizar el suero diluido a la parte lineal de un ajuste de curva de cuatro parámetros de los estándares. [0166] 5. ELISA para determinar las respuestas del anticuerpo anti-hu5c8. Las placas de ELISA (Corning-Costar) se revistieron con 1 µg/ml de mAb hu5c8 aglicosilado (descripto antes) en buffer de bicarbonato pH 9,6 toda una noche a 4°C y se bloquearon con 1% de BSA. Diluciones seriadas de suero de mono cynomolgus se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El mAb anti-hu5c8 unido se detectó usando 100 ng/ml de mAb hu5c8 biotinilado seguido por estreptavidina-HRP (Pierce Biotechnology) y el desarrollo con un kit de sustrato de TMB (Pierce Biotechnology). Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placa Spectromax (Molecular Devices). El título de anticuerpo se definió como la recíproca de la dilución más alta que produjo >0,100 unidades de D.O respecto de los valores de presangrado. [0167] 6. ELISA para la respuesta anti-TT. Las placas de ELISA (Corning-Costar) se revistieron con 5 µg/ml de TT (Massachusetts Public Health Biologic Laboratories Boston, MA, USA) en buffer de bicarbonato pH 9,6 toda una noche a 4°C. Se añadió suero de cynomolgus en diluciones seriadas a la placa bloqueada durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos anti-TT se detectaron usando un IgG-HRP antimono de conejo (Cappel-Organon Teknika Durham, NC, USA) seguido por el desarrollo con un kit de sustrato TMB (Pierce Biotechnology). Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placa Spectromax (Molecular Devices). Se usó el programa de ordenador Softmax Pro (Molecular Devices) para crear un ajuste de curva de cuatro parámetros para cada muestra de suero de la dilución seriada. El título de anticuerpo se definió como la recíproca de la dilución más alta que produjo 0,100 unidades de D.O respecto de los valores de presangrado. [0168] 7. Hematología. Se recolectaron muestras de sangre anticoaguladas con EDTA potásico y se analizaron mensualmente para determinar los siguientes parámetros hematológicos: recuento de leucocitos total, recuento de eritrocitos, concentración de hemoglobina, valor de hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media, recuento de plaquetas y evaluación del frotis de sangre (que incluye recuentos diferenciales). [0169] 8. Biopsia de ganglios linfáticos. Se recolectó un ganglio linfático inguinal de todos los animales en el día 15 del mAb hu5c8 aglicosilado, estudio de la respuesta de TT primaria. Se cortó el tejido del ganglio linfático, se incluyó en parafina, se seccionó y montó en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos se analizaron visualmente para determinar la presencia de los centros germinales y se evaluó cuantitativamente sobre la base de la frecuencia y el tamaño de centros germinales.

Ejemplo 3: El anticuerpo muMR1 aglicosilado inhibe la nefritis lúpica [0170] El lupus eritematoso sistémico ("SLE") es una enfermedad autoinmune que surge espontáneamente, con una predominancia en mujeres, que está caracterizado por la producción de una variedad de autoanticuerpos anti-nucleares patogénicos. En la nefritis lúpica, el daño renal está mediado por mecanismos inmunes celulares y humorales, que incluyen la formación de complejos inmunes que se depositan en los glómerulos renales y activan la cascada del complemento, lo que resulta en glomerulonefritis. Se ha establecido previamente que la producción de autoanticuerpos anti-nucleares en el SLE humano y de ratón está conducido por interacciones cognadas entre poblaciones seleccionas de células Th y células B autoinmunes. [Kalled et al., 1998]. [0171] Los estudios previos han demostrado que para ratones (SWR x NZB) F1 (SNF1) con nefritis lúpica establecida, el tratamiento a largo plazo con el mAb antiCD154, MR1 de hámster (haMR1), comenzando a los 5,5 meses de edad prolongó la supervivencia y disminuyó la incidencia de nefritis grave. [0172] En este ejemplo, se describe la eficacia de dos mAb MR1 quiméricos murinos en este modelo. El MR1 quimérico murino ("muMRl") consiste en los dominios variables de cadena pesada y liviana de hámster originales fusionados a los dominios constantes de cadena pesada y liviana de IgG2a murino. Una versión aglicosilada del muMRl se creó por l mutación del sitio de glicosilación ligado a N en el dominio CH2 del Fc de IgG2a. Usando estos dos anticuerpos, se evaluó el papel de la glicosilación de Fc sobre la potencia de los mAb anti-CD154 en la nefritis lúpica. [0173] Los resultados de este ejemplo demuestran que ambos mAb quiméricos, muMR1 y muMR1 aglicosilado, retuvieron la capacidad de inhibir las respuestas del autoanticuerpo. En forma específica, de modo similar al tipo salvaje, el MR1 de hámster progenitor, ambos anticuerpos murinizados retuvieron la capacidad de disminuir la inflamación renal, fibrosis, esclerosis y vasculitis en los ratones tratados con ellos, en comparación con los ratones tratados con un mAb control de IgG2a murino.

Farmacocinética de muMR1 y muMR1 aglicosilado

[0174] Un análisis de la farmacocinética de los anticuerpos muMR1 y muMR1 aglicosilado reveló que ambos anticuerpos exhibieron el mismo perfil cinético en suero de ratones BALB/c (FIG. 6). En forma específica, se estima que la vida media de estas moléculas quiméricas en ratones normales es ~9 días, similar al MR1 de hámster (datos no mostrados).

Analistas de respuestas de autoanticuerpo

[0175] El tratamiento con muMR1 o muMR1aglicosilado disminuyó en gran medida la respuesta de autoanticuerpo a ADNds y ADNss en comparación con los animales de control (FIG. 7 A y B).

Análisis histológico

[0176] Un análisis de la histología del riñón demostró que tres de los cinco animales control de isotipo tenían nefropatía en etapa final grave caracterizada por los numerosos rasgos descriptos en el esquema de puntuación. Los animales de los grupos tratados tenían claramente enfermedad menos grave con pocas excepciones. Las diferencias entre los animales tratados con las formas de tipo salvaje (n=11) y aglicosiladas (n=12) de muMR1 fueron mínimas aunque las puntuaciones de enfermedad compuesta para las formas de tipo salvaje fueron ligeramente menores. La FIG. 8 muestra las puntuaciones de histología compuestas del grupo para los riñones. De los animales tratados con muMR1 aglicosilado, la mayor parte tenía cambios tempranos moderados en los glomérulos con poco o ningún cambio túbulo-intersticial significativo. Todos los animales tratados con muMR1 (n=11) presentaron cambios tempranos moderados y ningún cambio túbulo-intersticial significativo. A partir de estos resultados, es evidente que tanto el muMR1 como el muMR1 aglicosilado son efectivos para la prevención de los cambios histológicos característicos de la nefritis lúpica. [0177] El grado de expansión linfoide en las áreas de las células B y T se evaluó por histología para cada bazo de los animales tratados. La identificación de los folículos secundarios fue difícil debido a los artefactos asociados con la preparación de la sección congelada. No fue evidente la correlación entre el grado de la expansión del área linfoide esplénica y las puntuaciones de la enfermedad renal. Sin embargo, el grado de expansión de la vaina linfocítica periarteriolar (PALS) pareció ser claramente mayor en el control de isotipo y los animales tratados con muMR1 aglicosilado, en comparación con los animales tratados con muMR1 (datos no mostrados).

Analistas de la función renal

[0178] Para evaluar la función renal, se midieron los niveles de proteinuria (PU), así como las mediciones de creatinina sérica y nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) de cada animal. Ambos mAb de muMR1 quiméricos retrasaron el inicio de nefritis grave en los animales SNF1, medido por el contenido de proteína en la orina. Cuando se compararon con los animales control, los ratones tratados con anti-CD154 tenían valores de PU menores en los puntos de tiempo entre 6 y 9 meses (FIG. 9). Sin embargo, a -10 meses, todos los grupos tenían valores de PU indicadores de falla renal (FIG. 9). Estos resultados sugieren que el tratamiento anti-CD154 retrasa el comienzo de la proteinuria. [0179] La FIG. 11 muestra los niveles de creatinina en el suero de ratones SNF1, y la FIG. 10 muestra los niveles de BUN en el suero de ratones SNF1. Los animales del grupo control tenían creatinina sérica y niveles de BUN elevados en el intervalo de 7,25 -10,5 meses. Por contraste, los ratones tratados con el muMR1 glicosilado permanecieron estables a lo largo de todo el estudio, sin ascenso o descenso sustancial de creatinina sérica o BUN. Los animales tratados con MuMR1 aglicosilado mantuvieron niveles normales de creatinina sérica hasta -9 meses de edad, cuando se observó un ligero aumento. De modo similar, los niveles de BUN en este grupo se elevaron a los 11 meses de edad.

Evaluación de supervivencia

[0180] El tratamiento con mAb anti-CD154 prolongó la supervivencia de los ratones SNF1. A los 11 meses de edad, más de 90% de los ratones tratados estaba vivos en comparación con el 56% de los controles. A los 14 meses, todos los ratones control murieron, mientras que 86% y 75% de los ratones con muMR1 y muMR1 aglicosilado aun estaban vivos, respectivamente. (datos no mostrados). [0181] En conjunto, estos experimentos demuestran que el tratamiento a largo plazo de los ratones SNF1 nefríticos con muMR1 o muMR1 aglicosilado prolongó la supervivencia, disminuyó la producción del autoanticuerpo y retrasó el desarrollo de la patología renal. Los resultados ligeramente diferentes obtenidos con muMR1 glicosilado y aglicosilado indican un papel menor de la glicosilación de Fc sobre la eficacia de los mAb anti-CD154 en el lupus. En consecuencia, el mAb anti-CD154 aglicosilado representa un tratamiento efectivo para la nefritis lúpica.

MÉTODOS -Ejemplo 3

[0182] 1. Ratones. Los ratones BALB/c, SWR y NZB se adquirieron en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los híbridos (SWR x NZB)F1 (SNF1) se criaron en el bioterio de Biogen en condiciones de barrera convencionales. Se usaron ratones SNF1 hembra para todos los estudios de lupus. Los ratones BALB/c se usaron para los estudios farmacocinéticos ("PK"). [0183] 2. Anticuerpos. El hibridoma MR1 (ATCC #CRL-2580), que produce mAb CD154 anti-ratón de hámster armenio, se adquirió en el American Type Culture Collection (Rockville, MD). [0184] 3. Protocolo de tratamiento. Todas las inyecciones se administraron por vía intraperitoneal. El estudio de lupus consistía en un grupo control de ratones SNF1 que recibió PI.17 muIgG2a y grupos SNF1 tratados que recibieron uno de los mAb antiCD154 quiméricos. Se administró una dosis única de 500 μg de mAb una vez por semana durante las primeras seis semanas, seguido por una sola inyección de 500 μg una vez por mes hasta la muerte del animal o terminación del estudio. Los estudios comenzaron cuando los animales tenían -5,5 meses de edad y se recolectaron muestras de suero una vez por mes. Para el estudio PK, los ratones BALB/c recibieron una dosis única de 100 μg de muMR1 o muMR1 aglicosilado y se recolectaron muestra de sangre después de 4 horas y en los días 1, 2, 4, 7, 9, 11 y 14. [0185] 4. Ensayos de ELISA. Para la detección de los mAb MR1 en suero, las placas NUNC Maxisorp se revistieron con 15 µg/ml de CD154 murino recombinante soluble toda una noche a 4°C. Al día siguiente las placas se bloquearon, se añadieron los sueros diluidos, seguido por IgG2a anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Southern Biotech) y el desarrollo con el sustrato de TMB. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 N y las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placa Spectramax (Molecular Devices, CA). Se realizaron ELISA de ADN anti-cadena simple (ADNss) y anti-cadena doble ("ADNds”) usando placas NUNC MaxiSorp. Las placas se revistieron toda una noche a 4°C con 10 μg/ml de BSA metilada (Calbiochem Corp, La Jolla, CA) y posteriormente con 5 μg/ml de ADN de timo de carnero grado I (SIGMA, St. Louis, MO) durante dos horas a 25°C. El ADN de timo de carnero se disgregó por sonicación y posteriormente se digirió con nucleasa SI antes de usar. Para el ensayo anti-ASDNss, el ADN se hirvió durante 10 min y se enfrió en hielo antes de usar. Después del bloqueo, se añadieron diluciones seriadas de muestras de suero y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los autoanticuerpos se detectaron con IgG anti-ratón de cabra-Fosfatasa Alcalina (SIGMA, ST. LOUIS, MO) y se desarrollaron con fosfato de p-nitrofenilo (SIGMA, ST. LOUIS, MO) en buffer de dietanolamina 1 M. Las placas se leyeron a 405 nm, y se obtuvieron curvas estándares usando cantidades conocidas de mAb 205 o mAb 5c6 anti-ADN, que son específicos para ADNss y ADNds. Los títulos de anti-DNA se definieron como la dilución recíproca a 0,1 unidades de DO respecto del fondo. [0186] 5. Histología. Las criosecciones y los tejidos incluidos en parafina, fijados en formalina de riñón y bazo se tiñeron con hematoxilina-eosina ("H&E") para determinar infiltración inflamatoria. Los riñones también se tiñeron con Masson Trichrome para la fibrosis y tinción de ácido peryódico de Schiff ("PAS") para el engrosamiento de la membrana basal. Las secciones de tejido teñido fueron clasificadas por un patólogo veterinario. La puntuación total de la calificación histopatológica de la nefritis lúpica se basó en los cambios glomerulares, intersticiales y tubulares. Los grados 0 a 4+ se basan en el porcentaje de compromiso de la estructura examinada (es decir, glomérulos, vasos, etc.) y son los siguientes: 0, sin lesiones significativas; 1+, 1% 30% de arquitectura afectada; 2+, 30% -60% de arquitectura afectada; 3+, >60% arquitectura afectada en algún grado; 4+, >60% de arquitectura severamente afectada. [0187] 6. Análisis de orina y suero. La orina de cada ratón se controló semanalmente con Albustix (Bayer Corp., Tarrytown, NY) para medir proteinuria ("PU"). El nivel de proteinuria se calificó de la siguiente manera: 0,5+, 15 a 30 mg/dl; 1+, 30 mg/dl; 2+, 100 mg/dl; 3+, 300 mg/dl; 4+, >2000 mg/dl. Se midieron la creatinina y el nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) en suero en un analizador de química COBAS (Roche) en forma intermitente durante el estudio para proporcionar medidas de la función renal además de la PU.

Ejemplo 4: El anticuerpo muMR1 aglicosilado inhibe la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) [0188] Se ha demostrado que el bloqueo del ligando CD40 en el momento de la inmunización suprime el desarrollo de la EAE [Samoilova, 1997]. En este ejemplo, los anticuerpos muMR1 y muMR1 aglicosilado se analizaron en cuanto a su capacidad para inhibir la EAE. Este ejemplo también evaluó si la inhibición de la EAE por el mAb anti-CD154 estaba asociada con un mecanismo de supresión activo y en qué medida fue mediada por un mecanismo que es dependiente de las interacciones dependientes del Fc del anticuerpo. [0189] Los resultados de este ejemplo demuestran que el mAb muMR1 aglicosilado es un inhibidor de la EAE tan efectivo como el mAb MR1 de hámster glicosilado de tipo salvaje para bloquear el desarrollo de la enfermedad clínica. En forma más específica, todos los mAb MR1 inhibieron completamente el desarrollo de la enfermedad, evaluado por la puntuación clínica máxima promedio y la gravedad promedio de la enfermedad, con la excepción de un ratón del grupo tratado con MR1 de hámster. Estos resultados sugieren que el mecanismo de protección subyacente contra la EAE por los mAb anti-CD154 no parece involucrar la inducción de T reguladoras. Ellos también muestran que las funciones efectoras dependientes de Fc del mAb no cumplen un papel importante con respecto a la eficacia clínica pero parecen contribuir al mecanismo de inhibición subyacente en el establecimiento autoinmune de la EAE.

Inhibición de la EAE clínica con muMR1 glicosilado

[0190] La Figura 12 demuestra que los ratones tratados con muMR1 no desarrollaron síntomas de enfermedad después de la inmunización de péptidos primaria, en comparación con los ratones tratados con el control de isotipo P1.17. Los animales tratados con muMR1 tampoco desarrollaron síntomas clínicos durante el período de seguimiento de 80 días (datos no mostrados). Cuando los ratones se reinmunizaron con PLP139-151 emulsionado en adyuvante de Freund completo, hubo un aumento de gravedad de los síntomas clínicos en los animales tratados con P1.17. Los ratones que habían sido tratados en los días 0, 2 y 4 con muMR1 desarrollaron EAE después del re-estímulo, con una gravedad que equivalió a la primera fase de la EAE en los animales tratados con P1.17. Estos resultados demuestran que el tratamiento con mAb anti-CD154 no produjo supresión activa. También se estudió si la transferencia de 20 x 106 células del bazo, recolectadas de los ratones 1 o 3 semanas después de la inducción de la EAE y el tratamiento con muMR1, podría volver a los ratones receptores, sin tratamiento anterior, resistentes a la posterior inducción de EAE activa. Este no fue el caso (datos no mostrados).

Inhibición de EAE clínica con muMR1 aglicosilado

[0191] La Figura 13 y la Tabla 3 demuestran que los mAb muMR1 y muMR1 aglicosilados fueron efectivos en la inhibición de los signos clínicos de la EAE durante todo el período de seguimiento, cuando se administraron como 3 dosis de 200 μg, en comparación con el control Ig P1.17. En este aspecto, los anticuerpos muMR1 y muMR1 aglicosilado fueron igualmente efectivos que el MR1 de hámster (datos no mostrados). La administración de dosis menores de estos anticuerpos no reveló mayores diferencias entre los anticuerpos, con respecto a su capacidad de inhibir la EAE.

Inhibición de los infiltrados inflamatorios del SNC [0192] Para evaluar si los anticuerpos difirieron en la inhibición de los infiltrados inflamatorios dentro del sistema nervioso central ("SNC"), grupos separados de 4 a 5 ratones, tratados con cantidades diferentes de anticuerpos (muMR1 y muMR1 aglicosilado, o 3 dosis de 200 μg e IgG control P1.17), se sacrificaron en el día 16, en el pico de actividad de la enfermedad en los ratones tratados con el anticuerpo control del isotipo.

5 Tabla 3: No se requiere glicosilación para el efecto inhibidor del anti-CD154

Anticuerpo: Dosis (μg) N Incidencia Puntuación máxima promedio ±SD1 Puntuación acumulativa promedio ±SD1

P1,17: 3 x 200 14 13 2,4±0,8 32,1 ±32,5

muMR1: 3 x 200 13 0 0 ± 0§ 0 ± 0#

muMR1: 3 x 75 6 0 0 ± 0§ 0,8 ± 1,2# #

muMR1: 3 x 25 6 3 1,4 ± 1,6§§ 39,3 ± 53,1

MR1 aglicosilado: 3 x 200 14 0 0 ± 0§ 0 ± 0#

MR1 aglicosilado: 3 x 75 6 1 0,6 ± 1. 4§ 19,7 ± 47,9

MR1 aglicosilado: 3 x 25 6 2 0,8 ± 1,3§ 9 ± 17,4*

1. El desarrollo de la enfermedad se presenta en la Figura 1. Para cada ratón individual la puntuación de discapacidad máxima y la puntuación acumulativa durante el período de monitoreo completo se evaluó en forma separada antes de calcular la media del grupo. § p < 0,0005, en comparación con ratones tratados con P1.17 ; §§ p<0,05, en comparación con ratones tratados con P1.17 # p = 0,002, en comparación con ratones tratados con P1.17 ; # # p<0,02, en comparación con ratones tratados con P1.17 * p=0,05, en comparación con 25 μg de muMR1

[0193] Como se muestra en la Tabla 4, los anticuerpos no mostraron diferencia con respecto a su capacidad para suprimir el desarrollo de los infiltrados inflamatorios dentro del SNC durante la fase temprana del desarrollo de la enfermedad. Debido a que

10 fue dudoso si el ratón puede desarrollar actividad subclínica en ausencia de los signos de la EAE, se analizaron los tejidos del SNC de 6 a 14 ratones por grupo en el punto final de este estudio (día 58). [0194] En contraste con los ratones tratados con 200 μg de muMR1, tanto los animales tratados con P1.17 como los ratones tratados con 200 μg de agliMR1 mostraron evidencia de infiltrados inflamatorios moderados (Tabla 5) que se localizaron predominantemente en el cerebelo. Sin embargo, el tratamiento con cantidades menores de anticuerpos reveló que el agliMR1 fue similar aunque algo más protector

5 que su forma glicosilada. Estos resultados demuestran que ambos anticuerpos inhiben igualmente el desarrollo de la EAE clínica.

MÉTODOS -Ejemplo 4 [0195] 1. Inducción de EAE. Ratones SJL hembra (10-12 semanas, Harlan) se inmunizaron por vía subcutánea con 50 µg de PLP139-151 emulsionado en adyuvante

10 de Freund completo (Difco, Detroit, MI). Tres días más tarde, los ratones se inyectaron con 109 microorganismos de B. pertussis inactivados por calor (RIVM, Bilthoven, Países Bajos) por vía intravenosa. El desarrollo de la EAE se controló por la evaluación diaria del peso corporal y una puntuación de discapacidad. Esta puntuación varía de 0: sin síntomas, 0,5: pérdida parcial de tono de la cola, 1: pérdida completa del

15 tono de la cola, 2: debilidad de los miembros, 2,5:

Tabla 4: Efecto de anti-CD154 sobre la infiltración del SNC (día 16)

Anticuerpo: Dosis (µg) Número de animales con infiltrados

Ninguno: Esporádico Moderado Severo

P1.17: 3 x 200 0 3 1 1

muMR1: 3 x 200 3 1 0 0

muMR1: 3 x 75 3 2 0 0

muMR1: 3 x 25 1 1 3 0

MR1 aglicosilado: 3 x 200 5 0 0 0

MR1 aglicosilado: 3 x 75 4 1 0 0

MR1 aglicosilado: 3 x 25 2 1 2 0

Tabla 5: Efecto de anti-CD154 sobre la infiltración del SNC (día 58)

Anticuerpo: Dosis (µg) Número de animales con infiltrados

Ninguno: Esporádico Moderado Severo

Isotipo P1.17: 200 3 8 3 0

muMR: 200 12 1 0 0

muMR: 75 3 3 0 0

muMR: 25 0 5 1 0

MR1 aglicosilado: 200 8 5 1 0

MR1 aglicosilado: 75 4 2 0 0

MR1 aglicosilado: 25 4 2 0 0

paresia parcial, 3: parálisis completa de miembros traseros, 3,5: parálisis completa del diafragma y miembros traseros, incontinencia, 4: moribundo, a 5: muerte debido a EAE.

5 [0196] 2. Generación de anticuerpos. Los dominios variables de las cadenas pesada y liviana del mAb MR1 CD154 anti-ratón de hámster se clonaron por RT-PCR del ARN total del hibridoma. Los vectores de expresión para el mAb quimérico de hámster/ ratón se construyeron por manipulación genética de los ADNc de IgG2a murino o

10 región de constante de la cadena kappa murina (derivados de los clones de ADNc de longitud completa de las cadenas pesadas y livianas del mAb CD154 anti-humano -es decir, hu5c8 glicosilado) en los dominios variables de la cadena pesada y liviana, respectivamente, usando técnicas de ADN recombinante estándares. Se demostró que el mAb MR1 quimérico expresado en forma transitoria, designado muMR1, recapitula

15 las propiedades de unión a CD154 del mAb de hámster por citometría de flujo e inmunoprecipitación. [0197] El MR1 aglicosilado quimérico, denominado agliMR1, se construyó por mutagénesis dirigida al sitio de la cadena pesada para cambiar el residuo de asparagina en el sitio de glicosilación ligado a N de Fc (N297 en la nomenclatura RU de Kabat)

20 por un residuo de glutamina. Se construyeron vectores de expresión estable que contienen los casetes de transcripción en tándem dirigidos por promotor CMV-IE para las cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina y un gen de glutamina sintetasa como un marcador seleccionable para IgG2a muMR1 y aglimuMR1, mAb kappa. Los vectores de expresión se transfectaron en células NS0 y los clones estables se aislaron por selección en medio libre de glutamina. [0198] MuMR1 y agliMR1 se purificaron por afinidad de los sobrenadantes celulares del biorreactor en Proteína A Sefarosa seguido por cromatografía de exclusión por tamaño en Sephacril 300 para eliminar agregados. Las resinas de cromatografía se adquirieron en Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Se demostró que los mAb son >95% puros por SDS-PAGE y el análisis de endotoxina garantizó la seguridad de estos reactivos para usar in vivo. Se halló que MuMR1 y agliMR1 tienen la misma afinidad relativa para muCD154 de superficie celular en ensayos in vitro y la misma vida media farmacocinética in vivo en ratones BALB/c (datos no mostrados). El mAb control de isotipo IgG2a murino, P1.17 (ATCC# TIB-10), fue purificado por Proteína A a partir del líquido ascítico en Protos Immunoresearch (Burlingame, CA) bajo contrato de Biogen. [0199] 3. Administración de anticuerpos anti-CD154. En los días 0, 2 y 4, cada ratón recibió 200 μl de PBS i.p., que también contenía los siguientes: Grupo 1 = PBS (control); Grupo 2 = 200 μg de muMR1; Grupo 3 -200 μg de Ig de hámster (control Ig); Grupo 4 = 200 μg de MR1 murinizado; Grupo 5 = 200 μg de control de IgG2a P1.17; Grupo 6 = 200 μg de muMR1 aglicosilado. [0200] En algunos experimentos, los ratones se reinmunizaron en el día 80 con 50 μg de PLP139-151 emulsionado con el adyuvante de Freund completo. [0201] 4. Evaluación de la enfermedad. Los ratones se pesaron diariamente y se controlaron por actividad clínica durante un período de 56 días, de acuerdo con el siguiente sistema de puntuación: 0 = sin síntomas; 0,5 = pérdida de tono de cola 1 = pérdida completa de tono de cola; 2 = debilidad del miembro; 2,5 = paresia parcial; 3 = parálisis completa del miembro trasero; 3,5 = parálisis completa de diafragma y miembros traseros, incontinencia; 4 = moribundo; y 5 = muerte debido a EAE. [0202] 5. Histología. El tejido cerebral y la médula espinal de cada ratón individual se fijaron en 10% de formalina y se incluyeron en parafina. De cada ratón individual, se analizaron tres a seis secciones de la médula espinal (4 μm) y seis secciones cerebrales (que comprenden cerebelo, cerebro, tronco encefálico y espacio subaracnoideo) separados por 100 μm con respecto a la extensión de los infiltrados inflamatorios después de la tinción con hematoxilina. [0203] Cada sección individual se clasificó de acuerdo con la siguiente escala: 0 = sin infiltrados; 1 = esporádico, infiltración perivascular leve (menos de dos lesiones inflamatorias por sección); 2 = = infiltración perivascular multifocal; 4 = infiltración

perivascular severa multifocal acompañada por la propagación en el parénquima. Sobre la base del promedio de todas las secciones, los ratones se categorizaron como sin infiltración, con infiltración esporádica, moderada o severa. [0204] 6. Análisis estadístico. Los resultados se analizaron por ANOVA de una vía, seguido por análisis retrospectivo usando la prueba LSD. Los valores P < 0,05 se consideraron significativos.

Ejemplo 5: El anticuerpo hu5c8 aglicosilado inhibe el trasplante de células del islote [0205] Los estudios previos han demostrado que monos rhesus, tratados con un régimen de inducción/mantenimiento de dosis de 20 mg/kg de hu5c8 glicosilado mantuvieron la función del aloinjerto renal y ninguno experimentó un episodio de rechazo durante el período de dosificación de seis meses, mientras que los monos no tratados que recibieron aloinjertos renales rápidamente rechazaron sus trasplantes dentro de los ocho días [Kirk, 1999]. En un estudio relacionado del grupo de investigación de Kirk, se demostró que el hu5c8 aglicosilado no fue efectivo para el tratamiento del rechazo de trasplante. [0206] En llamativo contraste con los hallazgos de Kirk, los resultados de la presente invención demuestran que una forma aglicosilada del mAb hu5c8 en efecto puede ser efectiva para el tratamiento del rechazo de trasplante en otros contextos.

Trasplante por aloinjerto de células de islote en monos Rhesus

[0207] Previamente se ha demostrado que el hu5c8 glicosilado permite el implante del islote y mantiene la supervivencia del aloinjerto [Kenyon, 1999]. [0208] Cuatro monos rhesus tratados con un régimen de inducción/mantenimiento de dosis de 20 mg/kg lograron independencia de la insulina durante >213, >255, >269, y >341 días postrasplante. Los resultados de este estudio mostraron que los monos control no tratados que recibieron aloinjertos de islote exhibieron rechazo agudo en el día 8, que se evidenció por hiperglucemia persistente y falta de producción de péptido c (un producto de la producción de insulina endógena) en el día 11-14 (datos no mostrados). [0209] En contraste con los animales control no tratados, la FIG. 14 muestra el tratamiento exitoso de uno de los dos monos rhesus tratados con un régimen de inducción/mantenimiento de dosis de hu5c8 aglicosilado (descripto antes). Si bien ambos monos experimentaron hiperglucemia y rechazo inicial en el día 7, cuando los monos se trataron con insulina y continuó el tratamiento con hu5c8 aglicosilado, uno de los dos monos exhibió función parcial del aloinjerto medida por la presencia de péptido c en el día 28 (rombo abierto), y se mantuvo hasta el día 45. [0210] Estos resultados sugieren que los mAb anti-CD154 aglicosilados son útiles en los regímenes de tratamiento en un contexto de trasplante. Sin embargo, debido a que la respuesta inmune durante el trasplante es una respuesta fuerte, es decir, involucra las respuestas inmunes humoral, celular e inflamatoria, es posible que los anticuerpos antiCD154 aglicosilados puedan ser más efectivos cuando se administran en combinación con un compuesto inmunosupresor o inmunomodulador. Por ejemplo, un agente que interrumpe la señalización coestimuladora de las células T por medio de CD28; un agente que interrumpe la señalización de calcineurina, un corticoide, un agente antiproliferativo, u otro anticuerpo que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de las células inmunes, que incluye pero sin limitación CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 y RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ y VLA-4.

MÉTODOS -Ejemplo 5 [0211] 1. Trasplante de aloinjerto de células de islote. Estos estudios se realizaron como se describió previamente [Kenyon, 1999]. En breves palabras, se eligieron pares de donantes-receptores alorreactivos de monos rhesus sobre la base de la reactividad del cultivo de linfocitos mixtos positivo. Los receptores se sometieron a una pancreatectomía y trasplante de islote alogénico intraportal el día 0. [0212] 2. Tratamiento con anticuerpo. Se realizó la dosificación usando una inducción que consiste en 20 mg/kg en los Días -1, 0, 3, 10 y 18 y el mantenimiento consistió en una dosis de 20 mg/kg por mes a partir del día 28. [0213] 3. Evaluación de la función del injerto. La función del injerto del islote se controló en forma diaria mediante los niveles de glucemia de ayunas y posprandial. La falla del islote (ausencia de función primaria o rechazo agudo) se definió como una ausencia de la producción de péptido c en ayunas y estimulado (un producto de insulina endógeno). La ausencia de función primaria se definió como la falla del tejido trasplantado para funcionar en el período de postrasplante inmediato y se caracterizó por hiperglucemia persistente y control glucémico inestable. Los episodios de rechazo agudo se definieron como glucosa en ayunas >100 mg/dl y una glucemia posprandial >150-175 mg/dl. La función del injerto global se evaluó por el control de la cantidad de insulina exógena requerida para mantener los niveles de glucemia normales.

Ejemplo 6: Uso del anticuerpo hu5c8 aglicosilado (anti-CD154) para prevenir la alorreactividad de las células T mediada por anti-CD154 [0214] Los anticuerpos monoclonales que se dirigen a CD154 de las células T han demostrado prevenir parcialmente la alorreactividad in vitro así como in vivo. Sin embargo, no es evidente si la actividad supresora del mAb anti-CD154 depende del bloqueo de las interacciones de CD40-CD154 estimuladoras o, en forma alternativa, de la administración directa de las señales inhibidoras a través de CD154. [0215] Para evaluar los efectos de las interacciones de CD40-CD154 estimuladoras en oposición a la estimulación de CD154 (es decir, administración directa de las señales inhibidoras a través de CD154) sobre la alorreactividad de las células T humanas in vitro, las PBMC no fraccionadas, o células T CD4+ purificadas, se cocultivaron con células estimuladoras mal pareadas con HLA, alogeneicas (células positivas CD40) en presencia de un mAb anti-CD154 humanizado (hu5c8, Biogen Inc., MA, USA), soluble o inmovilizado en los pocillos de cultivo. La mayor parte de los experimentos de bloqueo se realizó con una variante manipulada genéticamente del anti-CD154 soluble (hu5c8 aglicosilado) que tiene reducida función efectora de Fc y en consecuencia puede tener una capacidad reducida para entrecruzar CD154. El hu5c8 aglicosilado usado en este ejemplo es el mismo que el mAb hu5c8 aglicosilado descripto a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Ejemplo 1, ¶ 15 y ¶ 83, supra. Los anticuerpos anti-CD154 solubles pero no revestidos inhibieron la proliferación de las células T alogénicas en cultivos de linfocitos mixtos primarios ("MLC') (inhibición de 40±23% versus 3±18%, n=4). De modo similar, la proliferación de los linfocitos T específicos de aloantígeno en MLC secundario (n=5 experimentos) se suprimió por la activación del bloqueo con CD154 (con anticuerpos solubles), mientras que aumentó por la estimulación con CD154 (anticuerpos revestidos). Además, la estimulación con los anticuerpos anti-CD154 revestidos aumentó fuertemente la generación de efectores CTL específicos del aloantígeno, mientras que los CTL no fueron afectados por el bloqueo de CD154. [0216] Para analizar si la actividad estimuladora de anti-CD154 requería las interacciones coestimuladoras B7-CD28, se realizó el MLC en presencia de CTLA4Ig, una molécula que impide la unión de las moléculas B7 a CD28. La activación en presencia de CTLA4-Ig suprimió la proliferación de linfocitos T específicos del aloantígeno en MLC primarios y secundarios, respectivamente, por 75±14% (n=3) y 64±28% (n=6) e inhibió la generación de CTL en 48±23% (n=2). La señalización de los anticuerpos anti-CD154 revestidos aumentó significativamente la proliferación independiente de CD28 residual de las células T específicas del aloantígeno tanto MLC primarios (en 58±0,6%, n=2) y secundario (en 61±49%, n=6), aunque no anuló completamente la inhibición inducida por CTLA4-Ig. Sin embargo, el efecto inhibidor de CTLA4-Ig sobre la generación de CTL fue anulada por la estimulación con CD154 (por medio de anticuerpos anti-CD154 revestidos). La expresión de CD25, HLA-DR y CD95 sobre células T alorreactivas aumentó fuertemente por la estimulación de CD154 (n=2), en comparación con los cultivos control con o sin CTLA4-Ig. [0217] Nuestros datos muestran que los anticuerpos anti-CD154 pueden aumentar, más que bloquear, la alorreactividad de las células T, cuando están inmovilizadas en la placa de cultivo. El bloqueo de CD154 por amAb hu5c8 glicosilado soluble no pudo aumentar la activación de las células T in vitro y por lo tanto puede ser ventajoso in vivo y, sobre la base de estos hallazgos, pueden ser efectivo, en los modelos experimentales de trasplante, para reducir las respuestas de las células T a los aloantígenos in vivo, sea solo o en combinación con las moléculas que bloquean otras vías coestimuladoras.

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, caracterizado por una modificación en el sitio ligado a N conservado de los dominios CH2 de la parte Fc de dicho anticuerpo.
2.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 1, en que la modificación comprende una mutación en el sitio de glicosilación de la cadena pesada, en el que la mutación impide la glicosilación en el sitio.
3.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 2, en el que la modificación comprende una mutación de N298Q (N297 usando la numeración EU de Kabat).
4.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 1, en el que la modificación comprende la eliminación de los glicanos del dominio CH2.
5.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 1, en el que la modificación comprende impedir la glicosilación en el dominio CH2.
6.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado no se une a un receptor del efector.
7.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado no causa trombosis.
8.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo primatizado, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo completamente humano.
9.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo multimérico, un anticuerpo heterodimérico, un anticuerpo hemidimérico, un anticuerpo tetravalente, y un anticuerpo biespecífico.
10.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo es hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA-4931.
11.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo está marcado con un marcador detectable.
12.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 11, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, colorante o biotina.
13.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se conjuga a un agente terapéutico.
14.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 13, en el que dicho agente terapéutico es un radioisótopo, radionucleido, toxina, toxoide o agente quimioterapéutico.
15.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se conjuga a un agente de visualización de imagen.
16.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 15, en el que el agente de visualización de imagen es un grupo de marcaje.
17.

Anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según la reivindicación 15, en el que el agente de visualización de imagen es una biotina, un grupo fluorescente, un grupo radiactivo, una etiqueta de histidina, o una etiqueta de péptido.
18.

Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
19.

Composición farmacéutica según la reivindicación 18, que además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
20.

Composición farmacéutica según la reivindicación 18, que además comprende un compuesto inmunosupresor o inmunomodulador.
21.

Línea celular que produce el anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
22.

Línea celular según la reivindicación 21, en la que la línea celular produce el hu5c8 aglicosilado (Acceso ATCC Núm. PTA-4931).
23.

Uso de un anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o un derivado de anticuerpo antiCD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo, para la

fabricación de un medicamento para inhibir una respuesta inmune, una respuesta inflamatoria, rechazo de trasplante, enfermedad del injerto versus huésped, una respuesta alérgica, una respuesta autoinmune, fibrosis, infección viral de las células T por el virus de HTLV I, enfermedad gastrointestinal, enfermedad vascular, o proliferación de células tumorales de células T, en un sujeto.
24.

Uso según la reivindicación 23, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica inhibe la unión de CD154 a CD40.
25.

Uso según la reivindicación 23, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica es capaz de unirse específicamente a una proteína que es reconocida específicamente por hu5c8 aglicosilado, que es producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA4931.
26.

Uso según la reivindicación 23, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo o composición farmacéutica se une específicamente al epítopo al cual el hu5c8 aglicosilado (Acceso ATCC Núm. PTA-4931) se une específicamente.
27.

Uso según la reivindicación 23, en el que la respuesta inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en: artritis, dermatitis por contacto, síndrome de hiper-IgE, enfermedad intestinal inflamatoria, asma alérgico y enfermedad inflamatoria idiopática.
28.

Uso según la reivindicación 27, en el que la artritis se selecciona del grupo que consiste en: artritis reumatoide, artritis inflamatoria no reumatoide, artritis asociada con enfermedad de Lyme y osteoartritis inflamatoria.
29.

Uso según la reivindicación 27, en el que la enfermedad inflamatoria idiopática se selecciona del grupo que consiste en: psoriasis y lupus sistémico.
30.

Uso según la reivindicación 23, en el que el rechazo de trasplante implica trasplante de corazón, riñón, hígado, piel, células del islote pancreático o médula ósea.
31.

Uso según la reivindicación 23, en el que la respuesta alérgica se selecciona del grupo que consiste en: fiebre del heno o una alergia a la penicilina u otros fármacos.
32.

Uso según la reivindicación 23, en el que la respuesta autoinmune deriva de una enfermedad infecciosa.
33.

Uso según la reivindicación 23, en el que la respuesta autoinmune deriva del síndrome de Reiter, espondiloartritis, enfermedad de Lyme, infecciones por VIH, sífilis o tuberculosis.
34.

Uso según la reivindicación 23, en el que la respuesta autoinmune se selecciona del grupo que consiste en: artritis reumatoide, miastenia grave, lupus eritematoso

sistémico, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, diabetes mellitus, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades autoinmunes inducidas por fármacos, y lupus inducido por fármaco.
35.

Uso según la reivindicación 23, en el que la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en: fibrosis pulmonar y enfermedad fibrótica.
36.

Uso según la reivindicación 35, en el que la fibrosis pulmonar se selecciona del grupo que consiste en: fibrosis pulmonar consecuencia del síndrome de distrés respiratorio del adulto, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad.
37.

Uso según la reivindicación 35, en el que la enfermedad fibrótica se selecciona del grupo que consiste en: Hepatitis C; Hepatitis B; cirrosis; cirrosis hepática consecuencia de un ataque tóxico; cirrosis hepática consecuencia de fármacos, cirrosis hepática consecuencia de una infección viral y cirrosis hepática consecuencia de una enfermedad autoinmune.
38.

Uso según la reivindicación 23, en el que la enfermedad gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en: dismotilidad esofágica, enfermedad intestinal inflamatoria y escleroderma.
39.

Uso según la reivindicación 23, en el que la enfermedad vascular se selecciona del grupo que consiste en: aterosclerosis o lesión de reperfusión.
40.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado o derivado del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado se seleccionan del grupo que consiste en: un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo primatizado, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo completamente humano.
41.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado o derivado del anticuerpo anti-CD154 aglicosilado se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo multimérico, un anticuerpo heterodimérico, un anticuerpo hemidimérico, un anticuerpo tetravalente, y un anticuerpo biespecífico.
42.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto por inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intramedular, intraventricular, intraepidural, intraarterial, intravascular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intraespinal, intratumoral,

intracraneal; por una vía de administración entérica, intrapulmonar, transmucosa, intrauterina, o sublingual; o en forma local en los sitios de inflamación o crecimiento tumoral.
43.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto por una vía seleccionada del grupo que consiste en: vías oral, nasal, oftálmica, rectal y tópica.
44.

Uso según la reivindicación 43, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto por vía oral en la forma de cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas.
45.

Uso según la reivindicación 43, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto en forma tópica por la aplicación de una crema, ungüento o similares.
46.

Uso según la reivindicación 43, en el que el anticuerpo anti-CD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto por inhalación mediante el uso de un nebulizador, un inhalador del polvo seco o un inhalador de dosis medida.
47.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto por administración por liberación sostenida.
48.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto junto con un agente terapéutico.
49.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto en múltiples dosis por día.
50.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición

farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto de forma repetida en intervalos que varían desde cada día a cada dos meses.
51.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra a dicho sujeto en intervalos durante el tiempo que sea indicado médicamente, que varía de días o semanas a toda la la vida del sujeto.
52.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, en el que el anticuerpo antiCD154 aglicosilado, derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado o composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo es administrado al sujeto con un compuesto inmunomodulador o inmunosupresor.
53.

Uso según la reivindicación 52, en el que el compuesto inmunomodulador o inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

un agente que interrumpe la señalización coestimuladora de las células T por medio del CD28;

(b)

un agente que interrumpe la señalización de calcineurina,

(c)

un corticosteroide,

(d)

un agente antiproliferativo; y

(e)

un anticuerpo que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de las células inmunes, que incluyen pero sin limitación CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 y RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTP, y VLA-4.
54.

Uso según la reivindicación 52, en el que el compuesto inmunosupresor o inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en: tacrolimus, sirolimus, micofenolato de mofetilo, mizorribina, desoxiespergualina, brequinar sódico, leflunomida, rapamicina y azaspirano.
55.

Uso del anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricación de una composición para usar en un método para examinar por imagen células tumorales o células neoplásicas en un sujeto que expresa una proteína que es reconocida específicamente por el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA-4931, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o el derivado de anticuerpo y una proteína en la superficie de las células tumorales o células neoplásicas; y

(b)

visualizar por imagen cualquier complejo de anticuerpo/proteína o derivado de anticuerpo/complejo formado, visualizando de este modo cualquiera de las células tumorales o células neoplásicas en el sujeto.
56. Uso del anticuerpo o derivado de anticuerpo anti-CD154 aglicosilado según

5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricación de una composición para usar en un método para detectar la presencia de células tumorales o células neoplásicas en un sujeto que expresa una proteína que es reconocida específicamente por el hu5c8 aglicosilado producido por la línea celular que tiene Acceso ATCC Núm. PTA-4931, comprendiendo dicho método las etapas de:

10 (a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o el derivado de anticuerpo y la proteína;

(b)

eliminar cualquier agente de imagen no unido del sujeto; y

(c)

detectar la presencia de cualquier complejo anticuerpo/ proteína o derivado de

15 anticuerpo/complejo formado, indicando la presencia de tal complejo la presencia de las células tumorales o células neoplásicas en el sujeto.