ES2352082T3

ES2352082T3 - Polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección.

Info

Publication number: ES2352082T3
Application number: ES07101045T
Authority: ES
Inventors: Benjamin J. Metcalf; Leah Diane Fletcher; Remy Griffais; Banumathi Sankaran; Joel A. Peek; Robert John Zagursky; Susan K. Hoiseth
Original assignee: Merck Serono Biodevelopment SAS
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2011-02-15
Anticipated expiration: 2018-11-20
Also published as: DE69841894D1; US6559294B1; US20090274701A1; PT1032674E; US7101963B2; US20040006218A1; CY1106408T1; US20070053927A1; US7601531B2; ATE480625T1

Abstract

Un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto (ORF) de un genoma de Chlamydia pneumoniae, que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos ORF291 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 291; (b) una secuencia de nucleótidos que exhibe una identidad de al menos 80% con la secuencia de la SEQ ID No. 291; o (c) una secuencia complementaria de la misma.

Description

Polipéptido de la membrana externa de Chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección polipéptido de la membrana externa de Chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección.

El objeto de la invención es la identificación, a partir de la secuencia genómica, de la secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de la membrana externa de Chlamydia pneumoniae, así como vectores que incluyen dicha secuencia y células o animales transformados con estos vectores. La invención también se refiere a métodos para detectar estos ácidos nucleicos o polipéptidos y a kits para diagnosticar una infección por Chlamydia pneumoniae. Finalmente, la invención comprende composiciones composiciones farmacéuticas, en particular vacunas, para la prevención y/o el tratamiento de infecciones por Chlamydia pneumoniae.

El análisis comparativo de la secuencia del gen que codifica el ARN ribosómico 16S se ha usado ampliamente para el estudio filogenético de procariotas. Esta estrategia ha hecho posible clasificar las clamidias entre las eubacterias, entre las cuales representan un grupo bien aislado que, sin embargo, tiene una asociación muy débil con los planctomices. De esta manera, las clamidias presentan algunas características únicas dentro de las eubacterias, en particular su ciclo de desarrollo y la estructura de sus membranas. Tienen un ciclo celular singular de dos fases: el cuerpo elemental, una pequeña forma extracelular, se une al hospedador y se introduce en éste por fagocitosis; en el fagosoma, se convierte en la forma intracelular replicativa, el cuerpo reticulado. Las clamidias son bacterias intracelulares obligadas que se multiplican en células eucariotas a expensas de sus reservas de energía y reservas de nucleótidos; son responsables de una amplia diversidad de enfermedades en mamíferos y aves. Las clamidias son los únicos miembros del orden Chlamydiales, de la familia Chlamydiaceae y del género Chlamydia. Dentro del género Chlamydia, actualmente están descritas cuatro especies: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae y Chlamydia pecorum. Estas bacterias están agrupadas y comparten propiedades biológicas y bioquímicas. Entre ellas, sólo las tres primeras infectan a los seres humanos, siendo Chlamydia pecorum un patógeno de rumiantes.

La especie Chlamydia psittaci infecta a muchos animales, en particular aves, y es transmisible a los seres humanos. Es responsable de neumonía atípica, disfunción hepática y renal, endocarditis y conjuntivitis.

La especie Chlamydia trachomatis es la mejor caracterizada. Además de ser una cepa murina, se divide en dos grupos que se pueden distinguir por la naturaleza de las enfermedades de las que son responsables: tracoma, infecciones genitales y linfogranulomatosis venérea. Hay quince serotipos humanos de Chlamydia trachomatis (A, K) y LGV (L1, L2, L3). Las cepas A a C se encuentran principalmente en infecciones oculares, mientras que las cepas D a K y LGV son responsables esencialmente de infecciones genitales. Debe mencionarse que las cepas LGV son responsables de enfermedades sistémicas. Históricamente, en 1906 Halberstaeder y Von Provaseck descubrieron, en pacientes con tracoma, la presencia de inclusiones en el citoplasma de las células obtenidas a partir de raspados conjuntivales. En 1940, Rake y Jones describieron estas mismas inclusiones en ciertas células obtenidas por punción de los ganglios de un paciente que padecía granulomatosis venérea. La caracterización del microorganismo Chlamydia trachomatis sólo se realizó de forma satisfactoria en 1957, después de una serie de aislamientos en cultivos celulares.

Fue en 1983 cuando Chlamydia pneumoniae se reconoció como un patógeno humano (Grayston JT et al., 1986); desde entonces, se ha puesto una atención especial en esta bacteria y se estima (Gaydos CA et al., 1994) que 10% de las neumonías y 5% de las bronquitis y sinusitis son atribuibles a Chlamydia pneumoniae (Aldous MB et al., 1992). Más recientemente, está suscitando un interés cada vez mayor la asociación de esta bacteria con la patogénesis de enfermedades asmáticas y de problemas cardiovasculares.

Los estudios serológicos han hecho posible observar que la infección por Chlamydia pneumoniae es común en niños con edades comprendidas entre los 5 y los 16 años. Antes de esta edad es raro encontrar anticuerpos; entonces, el aumento en el número de individuos que llevan anticuerpos está correlacionado con la edad hasta los 20 años. Por consiguiente, 50% de los adultos son portadores de anticuerpos, siendo posible que esta prevalencia sea tan elevada como de 75%. Estas cifras son muy sorprendentes, ya que una primera infección induce niveles de anticuerpo cuya persistencia a lo largo del tiempo se limita a 3 o como máximo 5 años, lo que sugiere una frecuente reinfección a lo largo de toda la vida. El índice de seroconversión anual es de aproximadamente 8% entre los 8 y los 12 años y de aproximadamente 6% entre los 12 y los 16 años (Haidl et al., 1994). Antes de los 15 años, la seroprevalencia de la enfermedad es idéntica entre los dos sexos. Después de esta edad, los hombres se infectan con más frecuencia que las mujeres; esto ocurre en todas las regiones del mundo en las que se han realizado estos estudios.

Estas infecciones están muy extendidas geográficamente, como demuestran numerosos estudios realizados en todo el mundo (Kanamoto Y et al., 1991; Tong CY et al., 1993). Los países desarrollados del norte tales como Canadá, Dinamarca y Noruega tienen los menores índices de infección; por el contrario, se encuentran los mayores índices de prevalencia en los países menos desarrollados de regiones tropicales en las que la infección puede producirse antes de los 5 años de edad.

Los seres humanos son el único depósito conocido de Chlamydia pneumoniae y es probable que la infección se produzca por transmisión directa, siendo probablemente las secreciones respiratorias las responsables de esta transmisión de bajo rendimiento (Aldous et al., 1992). Parece ser que la cadena de transmisión también puede ser indirecta (Kleemola M et al., 1988), lo que sugiere que la infección se produce por una transmisión eficaz, pero también que existen portadores asintomáticos, lo cual podría explicar la elevada prevalencia de la enfermedad. Otros estudios (Mordhorst CH et al., 1992) demuestran que la eficacia de la transmisión varía de acuerdo con los individuos e indica casos de infección que afectan a todos o a la mayoría de los miembros de una familia o de un grupo de familias. El período de incubación es de varias semanas, significativamente mayor a este respecto que el de muchos otros agentes patógenos respiratorios. Aunque en condiciones de alta humedad relativa la infectividad de Chlamydia pneumoniae al aire libre se reduce rápidamente, lo que sugiere un modo directo de transmisión en estas condiciones, es probable que la transmisión se realice en algunos casos de manera indirecta, ya que el microorganismo puede sobrevivir durante un período de hasta 30 horas en un medio hostil (Falsey et al., 1993).

Las manifestaciones clínicas debidas a Chlamydia pneumoniae son enfermedades esencialmente respiratorias. La neumonía y la bronquitis son las más frecuentes porque son evidentes clínicamente: como en este caso se promueve el diagnóstico etiológico, se identifica el agente infeccioso. Las enfermedades asintomáticas son probablemente numerosas (Grayston JT et al., 1992; Grayston JT et al., 1986; Thom DH et al., 1990). La enfermedad entonces progresa por bronquitis o neumonía; en el momento del examen no hay fiebre pero algunas veces se notifica por el paciente. El grado de gravedad de la enfermedad es variable y en pacientes hospitalizados es común observar una efusión pleural; también puede observarse una infección generalizada y, en casos severos, un examen anatomicopatológico muestra enfermedades por Chlamydia pneumoniae.

Se han descrito otros síndromes tales como sinusitis (Hashiguchi K et al., 1992), otitis media purulenta (Ogawa H et al., 1992) o faringitis (Huovinen P et al., 1989) así como infecciones con problemas respiratorios similares al asma (Hahn DL et al., 1991). Chlamydia pneumoniae también se ha asociado con sarcoidosis, con eritema nodosum (Sundelof et al., 1993) e incluso se ha descrito un caso de síndrome de Guillain-Barré (Haidl et al., 1992). También se ha evaluado la implicación de Chlamydia pneumoniae en el síndrome de Reiter (Braun J et al., 1994).

La asociación de Chlamydia pneumoniae con enfermedades coronarias y con infarto de miocardio se sospechó por primera vez por la observación del alto nivel de anticuerpos en 71% de los pacientes que tenían una enfermedad cardiaca (Shor A et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et al., 1993; Thomas GN et al., 1997). Los estudios realizados en varios países han demostrado resultados similares en pacientes con lesiones ateromatosas (Shor A et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et al., 1993; Grayston JT et al., 1996; Casas-Ciria J et al., 1996; Thomas GN et al., 1997; Jackson LA et al., 1997) y en pacientes con alteraciones carotídeas. Los estudios anatomicopatológicos y microbiológicos han detectado Chlamydia pneumoniae en los vasos sanguíneos. El microscopio electrónico ha hecho posible visualizar la bacteria (Ladany S et al., 1989) que, efectivamente, se ha demostrado por otras técnicas tales como PCR (Campbell LA et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Kuo CC et al., 1988). También parece ser que la bacteria se encuentra con más frecuencia en lesiones ateromatosas antiguas. Otros estudios realizados en sujetos jóvenes de 15 a 35 años han dado la oportunidad de estudiar las arterias coronarias de personas sin aterosclerosis, sin que esta observación sea posible en sujetos de mayor edad (el inicio de la enfermedad ateromatosa es una edad temprana). En estos sujetos jóvenes, los estudios de PCR no encontraron Chlamydia pneumoniae en sujetos sin enfermedad ateromatosa, pero revelaron la presencia de Chlamydia pneumoniae en dos de los once sujetos que mostraron lesiones tempranas y en seis de los siete sujetos que desarrollaron placas de ateroma. Por lo tanto, estos estudios demuestran que la placa de ateroma está muy correlacionada con la presencia de Chlamydia pneumoniae, pero aún no está definido el papel que juega la bacteria en la patología vascular.

Los datos relacionados con estudios clínicos controlados que analizan el efecto de tratamientos en infecciones por Chlamydia pneumoniae son limitados en número. A diferencia de la penicilina, la ampicilina o las sulfamidas, eritromicina, tetraciclina o doxiciclina muestran un actividad antibiótica in vitro contra Chlamydia pneumoniae. Sin embargo, un tratamiento a altas dosis debe continuarse durante varias semanas para evitar la recurrencia de la infección. Por consiguiente, hoy en día se prefiere el uso de dos nuevos macrólidos, claritromicina y azitromicina, cuya difusión, biodisponibilidad y vida media permiten curas más cortas y mejor toleradas. En ausencia de una prueba definitiva basada en los resultados de estudios clínicos, por lo tanto, sigue siendo deseable un tratamiento eficaz, sin recurrencias y bien tolerado de infecciones por Chlamydia pneumoniae.

Una necesidad incluso más importante percibida hasta ahora tiene que ver con un diagnóstico específico y sensible que pueda realizarse de manera conveniente y rápida, permitiendo una investigación temprana de la infección. Los métodos basados en el cultivo de Chlamydia pneumoniae son lentos y requieren una experiencia considerable debido a la dificultad implicada en la recogida, conservación y almacenamiento de la cepa en condiciones apropiadas. Los métodos basados en la detección de antígenos (EIA, DFA) o en la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) proporcionan ensayos que son más adecuados para la práctica de laboratorio. Por lo tanto, es muy deseable un ensayo fiable, sensible y conveniente que permita la distinción entre serogrupos y, con mayor motivo, entre especies de Chlamydia pneumoniae.

Esto es lo más importante, ya que los síntomas de la infección por Chlamydia pneumoniae aparecen lentamente, ya que aún no se han identificado todas las patologías asociadas con estas infecciones y ya que, como se ha mencionado anteriormente, se sospecha una asociación entre estas infecciones e infecciones crónicas graves, asma o aterosclerosis.

Aún no se dispone de ninguna vacuna contra Chlamydia pneumoniae: esto se debe a la naturaleza lábil de los antígenos específicos para la cepa, lo cual ha impedido hasta ahora su identificación específica.

Aunque el número de estudios y de modelos animales creados es elevado, los antígenos usados no han inducido suficiente inmunidad protectora para conducir al desarrollo de vacunas humanas. En el caso de Chlamydia pneumoniae, probablemente debe entenderse el papel de la defensa inmune en la fisiología y patología de la enfermedad para crear vacunas satisfactorias.

Una información más detallada en relación con la biología de estas cepas, sus interacciones con sus hospedadores, el fenómeno asociado de infectividad y los de escape de las defensas inmunes del hospedador en particular, y finalmente su implicación en el desarrollo de estas patologías asociadas, permitirá comprender mejor estos mecanismos. Por lo tanto, en vista del texto precedente que muestra, en particular, las limitación de los medios para controlar la infección por Chlamydia pneumoniae, en el momento actual es esencial, por una parte, crear herramientas moleculares, en particular a partir de un mejor conocimiento genético de Chlamydia pneumoniae, pero también crear nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos, nuevos métodos de diagnóstico y nuevas estrategias de vacuna que sean específicas, eficaces y que se toleren. Este es precisamente el objeto de la presente invención.

El objeto de la presente invención es la secuencia de nucleótidos de ORF 291 que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 291 del genoma de Chlamydia pneumoniae.

De esta manera, el objeto de la presente invención incluye un polinucleótido aislado que tiene una secuencias de nucleótidos de un ORF1 de un genoma de C. pneumoniae, que comprende:

a): la secuencia de nucleótidos de ORF 291 que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 291, que presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia de ORF 291;

b): una secuencia complementaria de la misma.

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Se entiende que secuencia de nucleótidos, polinucleótido o ácido nucleico significa, de acuerdo con la presente invención, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario o productos de la transcripción de dichos ADNs.

Debe entenderse que la presente invención no se refiere a las secuencias de nucleótidos genómicas de Chlamydia pneumoniae tomadas en su medio natural, es decir en el estado natural. Son secuencias que pueden haberse aislado, purificado o purificado parcialmente por métodos de separación tales como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular por tamaños o cromatografía de afinidad, o como alternativa técnicas de fraccionamiento basadas en la solubilidad en diversos disolventes, o por métodos de ingeniería genética tales como amplificación, clonación o subclonación, siendo posible que las secuencias de la invención se lleven por vectores.

La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1, publicada en la solicitud de patente madre WO 99/27105 o EP 1 032 674, se obtuvo secuenciando el genoma de Chlamydia pneumoniae por el método de secuenciación directa después de la secuenciación automática fluorescente de los insertos de clones y el ensamblaje de estas secuencias de fragmentos de nucleótidos (insertos) por medio de softwares (véanse los ejemplos). A pesar de la alta precisión de la secuencia de la SEQ ID No. 1, es posible que no represente perfectamente, al 100%, la secuencia de nucleótidos del genoma de Chlamydia pneumoniae y que en la secuencia de la SEQ ID No. 1 queden algunos errores o incertidumbres de secuenciación raros. En la presente invención, la presencia de una incertidumbre para un aminoácido se designa con "Xaa" y la de un nucleótido se designa con "N" en la lista de secuencias que se proporciona más adelante. Estos pocos errores o incertidumbres raros pueden detectarse fácilmente y corregirse por personas especialistas en la técnica usando el cromosoma entero y/o sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención y los métodos convencionales de amplificación, clonación y secuenciación, siendo posible que las secuencias obtenidas se comparen fácilmente, en particular por medio de un software informático y usando medios legibles por un ordenador para registrar las secuencias de acuerdo con la invención como se describe, por ejemplo, más adelante. Después de corregir estos posibles errores o incertidumbres raros, la secuencia de nucleótidos corregida obtenida presentaría una identidad de al menos 99,9% con la secuencia de la SEQ ID No. 1. Estas incertidumbres de secuenciación raras no están presentes dentro del ADN contenido en el depósito ATCC Nº 1366-VR, y sea cual sea la incertidumbre de secuencia rara que exista dentro de la SEQ ID No. 1 puede corregirse rutinariamente utilizando el ADN del depósito ATCC.

Se entiende que secuencia de nucleótidos homóloga para los fines de la presente invención significa una secuencia de nucleótidos que tiene un porcentaje de identidad con las bases de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1 de al menos 80%, preferiblemente 90% y 95%, siendo este porcentaje puramente estadístico y siendo posible que las diferencias entre las dos secuencias de nucleótidos se distribuyan aleatoriamente y a lo largo de toda su longitud. Dichas secuencias homólogas que presentan un porcentaje de identidad con las bases de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1 de al menos 80%, preferiblemente 90% y 95%, pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de una bacteria que pertenece a la familia Chlamydia, incluyendo las especies Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y
Chlamydia pecorum mencionadas anteriormente, así como las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie
Chlamydia pneumoniae. En la presente invención, los términos familia y género son mutuamente intercambiables, y los términos variante, serotipo, cepa y subespecie también son mutuamente intercambiables. Estas secuencias homólogas, por lo tanto, pueden corresponder a variaciones asociadas con mutaciones dentro de la misma especie o entre especies y pueden corresponder en particular a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones asociadas con la degeneración del código genético o a una desviación en el código genético que es específica para la familia, para la especie o para la variante y que probablemente estará presente en Chlamydia.

Las homologías entre proteínas y/o secuencias de ácidos nucleicos pueden evaluarse usando cualquiera de la diversidad de algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Estos algoritmos y programas incluyen, pero sin limitación, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-2448; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266-272).

En una realización particularmente preferida, las homologías entre las secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos se evalúan usando la Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), que es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al.,1993, Nature Genetics 3: 266-272; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402). En particular, se usan cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea:

(1): BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos problema con una base de datos de secuencias de proteínas;

(2): BLASTN compara una secuencia de nucleótidos problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos;

(3): BLASTX compara los productos de traducción conceptuales de seis fases de una secuencia de nucleótidos problema (las dos cadenas) con una base de datos de secuencias de proteínas;

(4): TBLASTN compara una secuencia proteica problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas en las seis fases de lectura (las dos cadenas); y

(5): TBLASTX compara las traducciones en seis fases de una secuencia de nucleótidos problema con las traducciones en seis fases de una base de datos de secuencias de nucleótidos.

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Los programas BLAST identifican secuencias homólogas identificando segmentos similares, que se denominan en este documento "pares de segmentos de alta puntuación" entre una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico problema y una secuencia de ensayo que se obtiene preferiblemente a partir de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de alta puntuación preferiblemente se identifican (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación, de las que se conocen muchas en la técnica. Preferiblemente, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992, Science 256: 1443-1445; Henikoff y Henikoff, 1993, Proteins 17: 49-61). Menos preferiblemente, también pueden usarse las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).

Los programas BLAST evalúan el significado estadístico de todos los pares de segmentos de alta puntuación identificados y preferiblemente selecciona los segmentos que satisfacen un umbral de significado especificado por el usuario, tal como un porcentaje de homología especificado por el usuario. Preferiblemente, el significado estadístico de un par de segmentos de alta puntuación se evalúa usando la fórmula de significado estadístico de Karlin (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268).

Se entiende que una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de la invención significa cualquier ADN cuyos nucleótidos son complementarios a los de la secuencia de la invención, y cuya orientación es inversa (secuencia antiparalela).

La secuencia de nucleótidos ORF 291 se define en las Tablas 1 y 2, mostradas más adelante, por su posición en la secuencia de la SEQ ID No. 1. El ORF 291 se ha identificado por análisis de homología así como por análisis de sitios de inicio potenciales de ORF, como se describe en los ejemplos proporcionados más adelante. Debe entenderse que el ORF identificado comprende una secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia de nucleótidos contigua desde el codón de parada del ORF inmediatamente en posición 3' con respecto al codón de parada del ORF precedente y a lo largo del codón 5' al siguiente codón de parada de la SEQ ID No. 1 en fase con la secuencia de nucleótidos del ORF. La Tabla 2, presentada más adelante, indica el principio, el final y el sitio de inicio potencial del ORF 291. En una realización, el ORF comprende la secuencia de nucleótidos contigua que abarca desde el sitio de inicio potencial de ORF cadena abajo (es decir 3') con respecto al codón de parada del ORF (o el codón del ORF inmediatamente adyacente y cadena arriba del codón de parada del ORF). El ORF 291 codifica el polipéptido de la SEQ ID No. 291.

La Tabla 1 también representa los resultados de las búsquedas de homología que compararon las secuencias de los polipéptidos codificados por cada uno de los ORFs con secuencias presentes en bases de datos públicas publicadas.

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A modo de ejemplo y sin limitación, procesos que utilizan condiciones de alta rigurosidad son como sigue: La prehibridación de filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante 8 h hasta durante una noche a 65ºC en tampón compuesto de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65ºC, la temperatura de hibridación preferida, en una mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Alternativamente, la etapa de hibridación se puede realizar a 65ºC en presencia de tampón SSC, correspondiendo 1 x SSC a NaCl 0,15 M y citrato de Na 0,05 M. Subsiguientemente, se pueden realizar lavados del filtro a 37ºC durante 1 h en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%, seguido de un lavado en 0,1X SSC a 50ºC durante 45 min. Alternativamente, los lavados del filtro se pueden efectuar en una solución que contiene 2 x SSC y SDS al 0,1%, ó 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, ó 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 68ºC a intervalos de 15 minutos. Después de las etapas de lavado, las sondas hibridadas son detectables por aurorradiografía. Otras condiciones de alta rigurosidad que se pueden utilizar son bien conocidas en la técnica y según se citan en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, N.Y. págs. 9.47-9.57; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. se incorporan en esta memoria en su totalidad. Preferiblemente, este tipo de secuencias codifican un homólogo de un polipéptido codificado por uno de ORF2 a ORF1297. En una realización, secuencias de este tipo codifican un polipéptido de Chlamydia pneumoniae.

A modo de ejemplo y sin limitación, procesos que utilizan condiciones de rigurosidad intermedia son como sigue: Se prehibridan filtros que contienen ADN y luego se hibridan a una temperatura de 60ºC en presencia de un tampón 5 x SSC y sonda marcada. Subsiguientemente, se realizan lavados de los filtros en una solución que contiene 2x SSC a 50ºC, y las sondas hibridadas son detectables por aurorradiografía. Otras condiciones de rigurosidad intermedia que se pueden utilizar son bien conocidas en la técnica y según se citan en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, N.Y. págs. 9.47-9.57; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. se incorporan en esta memoria en su totalidad. Preferiblemente, este tipo de secuencias codifican un homólogo de un polipéptido codificado por uno de
ORF2 a ORF1297. En una realización, secuencias de este tipo codifican un polipéptido de Chlamydia pneumoniae.

En relación con la homología con la secuencia de nucleótidos de ORF 292 se prefieren las secuencias homólogas que exhiben una identidad de porcentaje con las bases de las secuencias de nucelótidos de ORF 291 de al menos un 80%, de preferencia de 90% y 95%. Secuencias homólogas de este tipo se identifican rutinariamente, por ejemplo a través del algoritmo descrito anteriormente y en los ejemplos que figuran a continuación. Dichas secuencias homólogas corresponden a las secuencias homólogas según se definen anteriormente y pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a las secuencias de ORF de una bacteria perteneciente a la familia Chlamydia, incluida la especie Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y Chlamydia pecorum antes mencionadas, así como las secuencias correspondientes a las secuencias del ORF de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie Chlamydia pneumoniae. Estas secuencias homólogas pueden corresponder, igualmente, a variaciones unidas a mutaciones dentro de la misma especie o entre especies y pueden corresponder, en particular, a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones unidas a la degeneración del código genético o a una predisposición en el código genético que es especifica de la familia, a las especies o a la variante y que es probable que estén presentes en Chlamydia.

La invención comprende un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, una secuencia de ORF, en particular los polipéptidos de Chlamydia pneumoniae, caracterizados porque tienen la secuencia de la SEQ ID No. 291.

En la presente descripción, los términos polipéptido, péptido y proteína son intercambiables.

Deberá entenderse que la invención no se refiere a los polipéptidos en forma natural, es decir, no son tomados en su medio natural, sino que pueden haber sido aislados u obtenidos mediante purificación a partir de fuentes naturales o, alternativamente, obtenidos por recombinación genética, o incluso por síntesis química y que, en este caso, pueden comprender aminoácidos no naturales, tal como se describirá más abajo.

Se entenderá que polipéptido homólogo designa los polipéptidos que presentan, en relación con el polipéptido natural, ciertas modificaciones tales como, en particular, una deleción, adición o sustitución de al menos un aminoácido, un truncamiento, una extensión, una fusión quimérica y/o una mutación, o polipéptidos que presentan modificaciones postraduccionales. Entre los polipéptidos homólogos, se han de citar aquellos cuya secuencia de aminoácidos presenta una homología o identidad de al menos 80%, preferiblemente 90% con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con la descripción. En el caso de una sustitución, uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos se reemplazan por aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente", como se entiende en este documento, designa cualquier aminoácido que puede sustituir a uno de los aminoácidos de la estructura básica, pero sin modificar esencialmente las actividades biológicas de los péptidos correspondientes y como se definirá más adelante.

Se entiende que un fragmento polipeptídico de acuerdo con la invención designa un polipéptido que comprende un mínimo de 5 aminoácidos, preferiblemente 10 aminoácidos o preferiblemente 15 aminoácidos. Debe entenderse que estos fragmentos se refieren sólo a porciones del polipéptido codificadas por ORF291 que no están indicadas actualmente en una base de datos disponible para el público.

Los fragmentos polipeptídicos de acuerdo con la invención pueden corresponder a fragmentos aislados o purificados que están presentes naturalmente en Chlamydia pneumoniae o que se secretan por Chlamydia pneumoniae, o pueden corresponder a fragmentos que pueden obtenerse por escisión de dicho polipéptido con una enzima proteolítica, tal como tripsina, quimotripsina o colagenasa, o con un reactivo químico tal como bromuro de cianógeno (CNBr) o, como alternativa, poniendo dicho polipéptido en un medio muy ácido, por ejemplo a pH 2,5. Estos fragmentos polipeptídicos pueden prepararse igualmente bien por síntesis química, usando hospedadores transformados con un vector de expresión de acuerdo con la invención que contiene un ácido nucleico que permite la expresión de dichos fragmentos, situado bajo el control de elementos apropiados para la regulación y/o expresión.

La estructura de las membranas citoplásmicas y de la pared de las bacterias depende de las proteínas asociadas. La estructura de la membrana citoplásmica hace que sea impermeable al agua, a sustancias hidrosolubles y a moléculas de pequeño tamaño (iones, pequeñas moléculas inorgánicas, péptidos o proteínas). Para entrar o interferir con una célula o una bacteria, un ligando debe establecer una relación especial con una proteína anclada en la membrana citoplásmica (el receptor). Estas proteínas que están ancladas en la membrana juegan un papel importante en el metabolismo, ya que controlan los intercambios en la bacteria. Estos intercambios se aplican a moléculas de interés para la bacteria (moléculas pequeñas tales como azúcares y péptidos pequeños) así como a moléculas indeseables para la bacteria tales como antibióticos o metales pesados.

La estructura de bicapa lipídica de la membrana requiere que las proteínas que están insertadas en la misma tengan dominios hidrófobos de aproximadamente 20 aminoácidos que forman una hélice alfa. A partir de la secuencia primaria de las proteínas, deducida a su vez a partir de la secuencia de nucleótidos, pueden predecirse las regiones predominantemente hidrófobas y potencialmente transmembrana. La presencia de uno o más supuestos dominios transmembrana plantea la posibilidad de que una proteína se asocie con la membrana citoplásmica y pueda jugar un papel metabólico importante en la misma o, como alternativa, de que la proteína expuesta de esta manera pueda presentar epítopos potencialmente protectores.

Si las proteínas insertadas en la membrana presentan varios dominios transmembrana capaces de interaccionar entre sí a través de enlaces electrostáticos, entonces es posible que estas proteínas formen poros que atraviesan la membrana, la cual se vuelve permeable para varias sustancias. Debe tenerse en cuenta que las proteínas que no tienen dominios transmembrana también pueden anclarse por la intermediación de ácidos grasos en la membrana citoplásmica, siendo posible que la ruptura del enlace entre la proteína y su anclaje en algunos casos sea responsable de la liberación del péptido al exterior de la bacteria.

Forman también parte de la invención polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención , así como polipéptidos de fusión que comprenden a polipéptidos de este tipo. En una realización, los polipéptidos y polipéptidos de fusión inmunorreaccionan con suero seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia pneumoniae. Por ejemplo, según se describe más abajo, se encuentran secuencias de polipéptidos que exhiben características particularmente preferibles.

El objeto de la invención es también un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un polipéptido de la envuelta celular, preferiblemente de la envuelta celular externa de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos. De acuerdo con la invención, dicho polipéptido es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291 y uno de sus fragmentos representativos.

Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un polipéptido de la transmembrana de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, que tiene entre 1 y 3 dominios de la transmembrana, y porque es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.

Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, y porque es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.

Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es una lipoproteína de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, y porque es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.

Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un polipéptido de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, que no se encuentran en Chlamydia trachomatis (Blastp P>e^{-10}) y porque es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.

En general, en la presente invención, el grupo funcional al que pertenece el polipéptido, así como su secuencia de nucleótidos correspondiente, puede determinarse por analogía comparativa con secuencias ya conocidas o por medio del uso de técnicas convencionales de bioquímica, de citología combinada con las técnicas de ingeniería genética tales como inmunoafinidad, localización por inmunomarcaje, extracción diferencial, medición de la actividad enzimática, estudio de la actividad que induce o reprime la expresión o el estudio de la expresión en E. coli.

Se entiende claramente que, en la presente descripción, una secuencia de nucleótidos (ORF) mencionada dentro de un grupo funcional dado también puede ser parte de otro grupo teniendo en cuenta, por ejemplo, la interrelación entre los grupos indicados. Por consiguiente, y como ejemplo de esta interrelación, en el proceso de virulencia de Chlamydia pneumoniae también puede estar implicado un polipéptido exportado y/o secretado, así como su secuencia de nucleótidos codificante por medio de la modificación del mecanismo de defensa de la célula hospedadora infectada, o un polipéptido transmembrana o su secuencia de nucleótidos codificante también forma parte de los polipéptidos o secuencias de nucleótidos codificantes de la envuelta celular.

La invención también describe las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, caracterizadas porque están covalentemente o no covalentemente inmovilizadas en un soporte.

De acuerdo con otra realización ventajosa de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la descripción, estas últimas pueden usarse inmovilizadas en un soporte y de esta manera pueden servir para capturar, por medio de hibridación específica, el ácido nucleico diana obtenido a partir de la muestra biológica a ensayar. Si es necesario, el soporte sólido se separa de la muestra y el complejo de hibridación formado entre la denominada sonda de captura y el ácido nucleico diana después se detecta por medio de una segunda sonda, denominada sonda de detección, marcada con un elemento fácilmente detectable.

Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención también pueden usarse en nuevos sistemas analíticos, chips de ADN, que permiten la secuenciación, el estudio de mutaciones y de la expresión de genes, y que actualmente tienen interés dado su pequeño tamaño y su alta capacidad en términos del número de análisis.

El principio de la operación de estos chips se basa en sondas moleculares, la mayoría de las veces oligonucleótidos, que están unidos a una superficie miniaturizada, generalmente del orden de unos pocos centímetros cuadrados. Durante un análisis, una muestra que contiene fragmentos de un ácido nucleico diana a analizar, por ejemplo ADN o ARN marcado, por ejemplo después de la amplificación, se deposita sobre el chip de ADN en el que se ha recubierto el soporte de antemano con sondas. La puesta en contacto de las secuencias diana marcadas con las sondas conduce a la formación, por medio de la hibridación, de un dúplex de acuerdo con la regla del emparejamiento definida por J. D. Watson y F. Crick. Después de una etapa de lavado, el análisis de la superficie del chip permite localizar las hibridaciones eficaces por medio de las señales emitidas por los marcadores que señalizan la diana. A partir de este análisis se obtiene un modelo específico de hibridación que, por medio de un procesamiento informático apropiado, hará posible determinar la información tal como la presencia de fragmentos específicos en la muestra, la determinación de secuencias y la presencia de mutaciones.

El chip consta de una multitud de sondas moleculares, organizadas de forma precisa o en serie en un soporte sólido cuya superficie está miniaturizada. Es en el centro del sistema donde otros elementos (sistema de formación de imágenes, microordenador) permiten la adquisición e interpretación de un modelo específico de hibridación.

Los soportes de hibridación se proporcionan en forma de superficies planas o porosas (perforadas con pocillos) compuestas de diversos materiales. La elección de un soporte se determina por sus propiedades fisicoquímicas, o más precisamente, por la relación entre estas últimas y las condiciones en las que se colocará el soporte durante las síntesis o la unión de las sondas o durante el uso del chip. Por lo tanto es necesario, antes de considerar el uso de un soporte particular (R.S. Matson et al., 1994), considerar características tales como su estabilidad al pH, su resistencia física, su reactividad y su estabilidad química, así como su capacidad de unirse de forma no específica a ácidos nucleicos. Comúnmente se usan materiales tales como vidrio, silicio y polímeros. En una primera etapa denominada "funcionalización", su superficie se hace reactiva hacia los grupos con los que se desea que se una. Después de la funcionalización, se injertan las denominadas moléculas espaciadoras sobre la superficie activada. Usadas como intermedios entre la superficie y la sonda, estas moléculas de tamaño variable hacen que sean poco importantes las propiedades de la superficie de los soportes, que a menudo resultan problemáticas para la síntesis o la unión de las sondas y para la hibridación.

Entre los soportes de hibridación pueden mencionarse vidrio que se usa, por ejemplo, en el método de síntesis in situ de oligonucleótidos por tratamiento fotoquímico desarrollado por la compañía Affymetrix (E. L. Sheldon, 1993), activándose la superficie de vidrio por silano. Genosensor Consortium (P. Mérel, 1994) también usa portaobjetos de vidrio que llevan pocillos separados por una distancia de 3 mm, activándose este soporte con epoxisilano.

Entre estos soportes de hibridación también pueden mencionarse polímeros o silicio. Por ejemplo, el equipo de Andrei Mirzabekov ha desarrollado un chip que consiste en cuadrados de poliacrilamida polimerizados en una superficie de vidrio silanizado (G. Yershov et al., 1996). Varios equipos usan silicio, en particular el laboratorio IFOS de Ecole Centrale of Lyon que usa un sustrato semiconductor de silicio que está p-dopado por medio de la introducción en su estructura cristalina de átomos cuya valencia es diferente de la del silicio. Como soporte también pueden usarse diversos tipos de metales, en particular oro y platino (Genosensor Consortium (K. Beattie et al. 1993)).

Las sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse directamente in situ sobre los soportes de los chips de ADN. Esta síntesis in situ puede realizarse por tratamiento fotoquímico (desarrollado por la compañía Affymax (Ámsterdam, Holanda) y explotarse industrialmente por su filial Affymetrix (Estados Unidos)) o basándose en la tecnología VLSIPS (síntesis de polímeros inmovilizados a escala muy grande) (S.P.A. Fodor et al., 1991) que se basa en un método de síntesis combinatoria dirigida fotoquímicamente y cuyo principio combina la química de fase sólida, el uso de grupos protectores fotolábiles y fotolitografía.

Las sondas de acuerdo con la invención pueden unirse a los chips de ADN de diversas formas tales como tratamiento electroquímico, tratamiento automático o el uso de impresores de sondas (T. Livache et al., 1994; G. Yershov et al., 1996; J. Derisi et al., 1996 y S. Borman, 1996).

La revelación de la hibridación entre las sondas de la invención, depositadas o sintetizadas in situ sobre los soportes de los chips de ADN y la muestra a analizar puede determinarse, por ejemplo, midiendo señales fluorescentes, por recuento radiactivo o por detección electrónica.

El uso de moléculas fluorescentes tales como fluoresceína constituye el método más común para marcar las muestras. Permite la revelación directa o indirecta de la hibridación y permite el uso de diversos fluorocromos.

Affymetrix actualmente proporciona un aparato o un escáner diseñado para leer sus chips Gene Chip^{TM}. Hace que sea posible detectar las hibridaciones explorando la superficie del chip en microscopía confocal (R.J. Lipshutz et al., 1995). Se han ensayado otros métodos para detectar señales fluorescentes: acoplamiento de un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD (G. Yershov et al., 1996), el uso de un sistema de recogida de fibra óptica (E.L. Sheldon, 1993). Un método convencional consiste en realizar un marcaje terminal, con fósforo 32, de las secuencias diana, por medio de un aparato apropiado, el Phosphorimager (comercializado por Molecular Dynamics). La detección electrónica se basa en el principio de que la hibridación de dos moléculas de ácido nucleico va acompañada de fenómenos físicos que pueden cuantificarse en ciertas condiciones (sistema desarrollado por Ecole Centrale of Lyon y denominado GEN-FET (transistor de efecto de campo GEN)). También pueden mencionarse Genosensor Consortium y la compañía Beckman Instruments que están desarrollando un chip electrónico o Permittivity Chips^{TM} (K. Beattie et al., 1993).

De esta manera, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden usarse en chips de ADN para realizar el análisis de mutaciones. Este análisis se basa en la producción de chips capaces de analizar cada base de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención.

Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención también pueden usarse en chips de ADN para realizar el análisis de la expresión de los genes de Chlamydia pneumoniae. Este análisis de la expresión de genes de Chlamydia pneumoniae se basa en el uso de chips en los que están presentes sondas de la invención, elegidas por su especificidad para caracterizar un gen dado (D.J. Lockhart et al., 1996; D.D. Shoemaker et al., 1996). Para los métodos de análisis de expresión génica usando los chips de ADN, puede hacerse referencia, por ejemplo, a los métodos descritos por D.J. Lockhart et al. (1996) y Sosnowsky et al. (1997) para la síntesis de sondas in situ o para el tratamiento y la unión de sondas sintetizadas previamente. Las secuencias diana a analizar están marcadas y en general se fragmentan en secuencias de aproximadamente 50 a 100 nucleótidos antes de hibridarse en el chip. Después de lavarse como se describe, por ejemplo, por D.J. Lockhart et al. (1996) y de la aplicación de diferentes campos eléctricos (Sosnowsky et al., 1997), los compuestos marcados se detectan y cuantifican, realizándose las hibridaciones al menos por duplicado. El análisis comparativo de las intensidades de señal obtenidas con respecto a la misma sonda para diferentes muestras y/o para diferentes sondas con la misma muestra, determina la expresión diferencial del ARN o del ADN derivado de la muestra.

Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, además, pueden usarse en chips de ADN en los que también están presentes otras sondas de nucleótidos específicas para otros microorganismos, y pueden permitir la realización de un ensayo seriado que permite una rápida identificación de la presencia de un microorganismo en una muestra.

Por consiguiente, el objeto de la descripción también son las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, caracterizadas porque están inmovilizadas en un soporte de un chip de ADN.

También forman parte de la invención los chips de ADN, caracterizados porque contienen al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, inmovilizados sobre el soporte de dicho chip.

Dichos chips preferiblemente contendrán varias sondas o secuencias de nucleótidos de la invención de diferente longitud y/o correspondientes a diferentes genes para identificar, con mayor certeza, la especificidad de las secuencias diana o la mutación deseada en la muestra a analizar.

Por consiguiente, los análisis realizados por medio de cebadores y/o sondas de acuerdo con la invención, inmovilizados en soportes tales como chips de ADN, harán posible, por ejemplo, identificar, en muestras, mutaciones asociadas a variaciones tales como variaciones intraespecie. Estas variaciones pueden correlacionarse o asociarse con patologías específicas para la variante identificada y harán posible seleccionar el tratamiento apropiado.

Otro objeto de la presente invención es un vector para la clonación y/o expresión de una secuencia, caracterizado porque contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, los vectores comprenden los elementos necesarios para permitir la expresión y/o la secreción de dichas secuencias de nucleótidos en una célula hospedadora dada, y forman parte de la invención. En este caso, el vector debe comprender un promotor, señales para el inicio y para la terminación de la traducción, así como regiones apropiadas para la regulación de la trascripción. Debe poder mantenerse de manera estable en la célula hospedadora y opcionalmente puede poseer señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos se eligen de acuerdo con la célula hospedadora usada. Para este efecto, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma dentro del hospedador elegido, o vectores de integración en el hospedador elegido.

Para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que conste de señales de control de la trascripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de proteínas puede usarse cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y técnicas de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética).

La expresión de un polipéptido, péptido o derivado, o análogos de los mismos codificados por una secuencia polinucleotídica ORF291 contenida dentro de la SEQ ID No. 1 puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que la proteína o péptido se exprese en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína o péptido puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión incluyen, pero sin limitación, el promotor de CMV, la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), las secuencias reguladores del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; vectores de expresión vegetales que comprenden la región promotora de la nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303: 209-213) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control de la trascripción en animales, que presentan especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); región de control del gen de la insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), región de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495), región de control del gen de la albúmina que se activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1: 268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58; región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), región de control del gen de la beta-globina que se activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); región de control del gen de la cadena 2 ligera de la miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286), y región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Mason et al, 1986, Science 234: 1372-1378).

Los vectores de acuerdo con la invención son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. En una realización específica, se usa un vector que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido ORF291 contenida dentro de la SEQ ID No. 1, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores de expresión comprenden secuencias reguladoras que controlan la expresión génica, incluyendo la expresión génica en una célula hospedadora deseada. Los vectores preferidos para la expresión de los polipéptidos de la invención incluyen los vectores plasmídicos de tipo pET (Promega) o vectores plasmídicos pBAD (Invitrogen). Además, los vectores de acuerdo con la invención son útiles para transformar células hospedadoras para clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de la invención.

La expresión también puede conseguirse usando recombinación homóloga dirigida para activar genes de
Chlamydia pneumoniae presentes en el ADN genómico clonado. Un elemento regulador heterólogo puede insertarse en una línea celular estable o microorganismo clonado, de tal manera que esté unido de forma operativa con un gen endógeno de Chlamydia pneumoniae presente en el genoma clonado, usando técnicas, tales como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051 y Skoultchi, documento WO 91/06667, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria en su totalidad).

Los sistemas de vector de expresión/célula hospedadora que contienen insertos de secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID No. 1 u ORF dentro de la SEQ ID No. 1, que codifican polipéptidos, péptidos o derivados o análogos de los mismos, pueden identificarse por tres estrategias generales: (a) hibridación de ácido nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores" y (c) expresión de secuencias insertadas. En la primera estrategia, la presencia de una secuencia polinucleotídica insertada en un vector de expresión puede detectarse por hibridación de ácidos nucleicos usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a una secuencia polinucleotídica insertada. En la segunda estrategia, el sistema vector recombinante/hospedador puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de genes "marcadores" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) debida a la inserción de una secuencia polinucleotídica en el vector. Por ejemplo, si la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID No. 1 u ORF dentro de la SEQ ID No. 1 se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, pueden identificarse recombinantes que contienen el inserto por ausencia de la función del gen marcador. En la tercera estrategia pueden identificarse vectores de expresión recombinantes ensayando el producto de la secuencia polinucleotídica expresada por el recombinante. Estos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del polipéptido expresado en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, unión con un anticuerpo o promoción de la proliferación celular.

Una vez identificada y aislada una molécula de ADN recombinante particular, pueden usarse varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Los clones identificados pueden introducirse en una célula hospedadora apropiada por métodos convencionales, tales como, por ejemplo, lipofección, electroporación y choque térmico. Una vez establecido el sistema hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, los vectores de expresión recombinantes pueden propagarse y prepararse en grandes cantidades.

La invención también comprende las células hospedadoras transformadas por un vector de acuerdo con la invención. Estas células pueden obtenerse introduciendo en células hospedadoras una secuencia de nucleótidos insertada en un vector como se ha definido anteriormente, y después cultivando dichas células en condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de la secuencia de nucleótidos utilizada para la transfección.

La célula hospedadora puede elegirse entre sistemas eucariotas o procariotas, tales como por ejemplo células bacterianas (Olins y Lee, 1993), pero también células de levadura (Buckholz, 1993), así como células animales, en particular cultivos de células de mamífero (Edwards y Aruffo, 1993), y en particular células de ovario de hámster chino (CHO), pero también células de insecto en las que pueden usarse, por ejemplo, métodos que usan baculovirus (Luckow, 1993).

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. La expresión a partir de ciertos promotores puede estar elevada en presencia de ciertos inductores; de esta manera, puede controlarse la expresión del polipéptido modificado por ingeniería genética. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación) de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, puede usarse expresión en un sistema bacteriano para producir un producto de proteína nuclear no glicosilado. La expresión en levadura producirá un producto glicosilado. La expresión en células de mamífero puede usarse para asegurar la glicosilación "nativa" de una proteína heteróloga. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden afectar a las reacciones de procesamiento en diferentes medidas.

Una célula hospedadora preferida para la expresión de las proteínas de la invención consiste en células procariotas, tales como bacterias Gram^{-}. Otra célula hospedadora preferida de acuerdo con la invención es una bacteria que pertenece a la familia Chlamydia, más preferiblemente que pertenece a la especie Chlamydia pneumoniae o elegida entre un microorganismo asociado con la especie Chlamydia pneumoniae.

En otras realizaciones específicas, los polipéptidos, péptidos o derivados, o análogos de los mismos, pueden expresarse como un producto de proteína de fusión o quimérica (que comprende la proteína, fragmento, análogo o derivado unido a través de un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga (de una proteína diferente)). Este producto quimérico puede obtenerse ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en la fase codificante apropiada, y expresando el producto quimérico por métodos conocidos comúnmente en la técnica. Como alternativa, este producto quimérico puede obtenerse por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, por medio del uso de un sintetizador de
péptidos.

Las secuencias genómicas pueden clonarse y expresarse como productos génicos traduccionales (es decir, péptidos, polipéptidos y proteínas) o productos génicos transcripcionales (es decir, fragmentos antisentido y ribozimas).

Ahora es posible producir polipéptidos recombinantes en una cantidad relativamente grande por ingeniería genética usando las células trasformadas con vectores de expresión de acuerdo con la invención, o utilizando animales transgénicos de acuerdo con la invención.

Los métodos para preparar un polipéptido de la invención en forma recombinante se caracterizan porque usan un vector y/o una célula trasformada con un vector de acuerdo con la invención y/o un animal transgénico que comprende una de dichas células trasformadas de acuerdo con la invención, o están por sí mismos incluidos en la presente invención.

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Entre dichos métodos para preparar un polipéptido en forma recombinante, se prefieren los métodos de preparación que usan un vector y/o una célula transformada con dicho vector y/o un animal transgénico que comprende una de dichas células transformadas, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la envuelta celular de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, más preferiblemente que codifica un polipéptido de la envuelta celular externa de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos.

Los polipéptidos recombinantes obtenidos como se ha indicado anteriormente pueden proporcionarse en forma glicosilada o no glicosilada y pueden tener o no la estructura terciaria natural.

Una variante preferida consiste en la producción de un polipéptido recombinante fusionado a una proteína de "soporte" (proteína quimérica). La ventaja de este sistema es que permite una estabilización y una reducción de la proteolisis del producto recombinante, un aumento de la solubilidad durante la renaturalización in vitro y/o una simplificación de la purificación cuando la molécula de fusión tiene afinidad por un ligando específico.

Más particularmente, la invención se refiere a un método para preparar un polipéptido de la invención que comprende las siguientes etapas:

a): cultivo de las células trasformadas en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención;

b): cuando sea apropiado, recuperación de dicho polipéptido recombinante.

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Cuando el método para preparar un polipéptido de la invención usa un animal transgénico de acuerdo con la invención, el polipéptido recombinante se extrae luego de dicho animal.

El objeto de la invención es también un polipéptido capaz de ser obtenido por un método de la invención según se define antes.

La invención también comprende un método para preparar un polipéptido sintético, caracterizado porque usa una secuencia de aminoácidos de polipéptidos de acuerdo con la invención.

La invención también se refiere a un polipéptido sintético, obtenido por un método de acuerdo con la invención.

También pueden prepararse polipéptidos de acuerdo con la invención por técnicas convencionales en el campo de la síntesis de péptidos en condiciones adecuadas para producir los polipéptidos codificados por el polinucleótido de la invención. Esta síntesis puede realizarse y recuperarse a partir de una solución homogénea o en fase sólida.

Por ejemplo, puede usarse la técnica de síntesis en una solución homogénea descrita por Houbenweyl en 1974.

Este método de síntesis consiste en condensar sucesivamente, por parejas, los aminoácidos sucesivos en el orden requerido, o condensar aminoácidos y fragmentos previamente formados y que ya contienen varios aminoácidos en el orden apropiado o, como alternativa, varios fragmentos preparados de esta manera previamente, entendiéndose que debe tenerse cuidado de proteger con antelación todos los grupos funcionales reactivos que llevan estos aminoácidos o fragmentos, con la excepción de los grupos funcionales amino de uno y los grupos funcionales carboxilo de otro o viceversa, que normalmente participan en la formación de los enlaces peptídicos, en particular después de la activación del grupo funcional carboxilo, de acuerdo con métodos bien conocidos en la síntesis de péptidos.

De acuerdo con otra técnica preferida de la invención, se usa el método descrito por Merrifield.

Para fabricar una cadena peptídica de acuerdo con el método de Merrifield se usa una resina polimérica muy porosa, sobre la cual se une el primer aminoácido C-terminal de la cadena. Este aminoácido se une a una resina a través de su grupo carboxilo y se protege su grupo amino funcional. De esta manera se unen los aminoácidos que constituirán la cadena peptídica, uno después de otro, sobre el grupo amino, cada vez desprotegido de antemano, de la porción de la cadena peptídica ya formada, y que está unida a la resina. Cuando se forma la cadena peptídica entera deseada, los grupos protectores se retiran de los diversos aminoácidos que constituyen la cadena peptídica y el péptido se separa de la resina con ayuda de un ácido.

La invención se refiere, además, a polipéptidos híbridos (de fusión) que tienen al menos un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención, y una secuencia de un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune en seres humanos o animales.

Ventajosamente, el determinante antigénico es tal que puede inducir una respuesta humoral y/o celular. Un determinante antigénico puede identificarse seleccionando bibliotecas de expresión del genoma de Chlamydia pneumoniae con anticuerpos contenidos en el suero de pacientes infectados con una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae. Un determinante antigénico puede comprender un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención, en forma glicosilada, usado para obtener composiciones inmunogénicas capaces de inducir la síntesis de anticuerpos dirigidos contra múltiples epítopos. Dichos polipéptidos o sus fragmentos glicosilados también forman parte de la invención.

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Estas moléculas híbridas pueden constar, en parte, de una molécula de soporte para polipéptidos o para sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención, combinada con una porción que puede ser inmunogénica, en particular un epítopo de la toxina diftérica, la toxina tetánica, un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Patente FR 79 21811), el antígeno VP1 del virus de la poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno viral o bacteriano.

Los métodos para sintetizar las moléculas híbridas incluyen los métodos usados en ingeniería genética para construir secuencias de nucleótidos híbridas que codifican las secuencias polipeptídicas deseadas. Ventajosamente puede hacerse referencia, por ejemplo, a la técnica para producir genes que codifican proteínas de fusión descrita por Minton en 1984.

Dichas secuencias de nucleótidos híbridas que codifican un polipéptido híbrido, así como los polipéptidos híbridos de acuerdo con la invención se caracterizan porque son polipéptidos recombinantes obtenidos por la expresión de dichas secuencias de nucleótidos híbridas forman también parte de la invención.

La invención también comprende los vectores caracterizados porque contienen una de dichas secuencias de nucleótidos híbridas. Las células hospedadoras, transformadas por dichos vectores, los animales transgénicos que comprenden una de dichas células transformadas, así como los métodos de preparar polipéptidos recombinantes utilizando dichos vectores, dichas células transformadas y/o dichos animales transgénicos forman, naturalmente, también parte de la invención.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención, los anticuerpos de acuerdo con la invención descritos más adelante y las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, ventajosamente pueden usarse en métodos in vitro y/o in vivo para la detección y/o la identificación de bacterias que pertenecen a la especie Chlamydia pneumoniae, en una muestra biológica (tejido o fluido biológico) que es probable que los contenga. Estos métodos, dependiendo de la especificidad de los polipéptidos, de los anticuerpos y de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención que se usarán, pueden detectar y/o identificar en particular las variantes bacterianas que pertenecen a la especie Chlamydia pneumoniae así como los microorganismos asociados que pueden detectarse por los polipéptidos, los anticuerpos y las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención que se elegirán. Por ejemplo, puede ser ventajoso elegir un polipéptido, un anticuerpo o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención que sea capaz de detectar cualquier bacteria de la familia Chlamydia eligiendo un polipéptido, un anticuerpo y/o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención que sea específica para la familia o, por el contrario, será ventajoso más particularmente dirigir una variante de la especie Chlamydia pneumoniae, que es responsable, por ejemplo, de la inducción o empeoramiento de patologías específicas para la variante dirigida, eligiendo un polipéptido, un anticuerpo y/o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención que sea específica para dicha variante.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden usarse ventajosamente en un método para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, en una muestra biológica (tejido o fluido biológico) que es probable que los contenga, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto esta muestra biológica con un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención (en condiciones que permitan una reacción inmunológica entre dicho polipéptido y los anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra biológica);

b): detectar los complejos de antígeno-anticuerpo que pueden formarse.

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Preferiblemente, la muestra biológica consta de un fluido, por ejemplo un suero humano o animal, sangre o biopsias.

Puede usarse cualquier procedimiento convencional para realizar dicha detección de los complejos de anticuerpo-antígeno que pueden formarse.

A modo de ejemplo, un método preferido usa procedimientos inmunoenzimáticos basados en la técnica ELISA, procedimientos de inmunofluorescencia o procedimientos radioinmunológicos (RIA) y similares.

Por consiguiente, la invención también se refiere a los polipéptidos de acuerdo con la invención, marcados con la ayuda de un marcador adecuado tal como un marcador de tipo enzimático, fluorescente o radiactivo.

Estos métodos comprenden, por ejemplo, las siguientes etapas:

-: deposición de cantidades definidas de una composición polipeptídica en los pocillos de una placa de microtitulación,

-: introducción, en dichos pocillos, de diluciones crecientes de suero, o de una muestra biológica diferente como se ha definido anteriormente, que tiene que analizarse,

-: incubación de la microplaca,

-: introducción, en los pocillos de la placa de microtitulación, de anticuerpos marcados dirigidos contra inmunoglobulinas humanas o animales, habiéndose marcado estos anticuerpos con la ayuda de una enzima seleccionada entre las que pueden hidrolizar un sustrato, modificando de esta manera la absorción de la radiación de este último, al menos a una longitud de onda definida, por ejemplo a 550 nm,

-: detección, por comparación con un control, de la cantidad de sustrato hidrolizado.

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La invención también se refiere a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

-: un polipéptido de acuerdo con la invención,

-: cuando es apropiado, los reactivos para constituir el medio apropiado para la reacción inmunológica o específica,

-: los reactivos que permiten la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica entre el polipéptido o polipéptidos de la invención y los anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra biológica, siendo posible que estos reactivos también lleven un marcador, o puedan reconocerse a su vez por un reactivo marcado, más particularmente en caso de que el polipéptido de acuerdo con la invención no esté marcado,

-: cuando sea apropiado, una muestra biológica de referencia (control negativo) sin anticuerpos reconocidos por el polipéptido de acuerdo con la invención,

-: cuando sea apropiado, una muestra biológica de referencia (control positivo) que contenga una cantidad predeterminada de anticuerpos reconocidos por un polipéptido de acuerdo con la invención.

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De acuerdo con la invención, los polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión u otros derivados o análogos de los mismos codificados por una secuencia polinucleotídica ORF291 pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unan inmunoespecíficamente a dicho inmunógeno. Estos anticuerpos pueden incluir, pero sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos o humanizados, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En una realización específica, el anticuerpo contra un polipéptido, péptido u otro derivado, o análogo del mismo codificado por una secuencia polinucleotídica ORF 291 es un anticuerpo biespecífico (véase en general, por ejemplo, Fanger y Drakeman, 1995, Drug News and Perspectives 8: 133-137). Este anticuerpo biespecífico se modifica por ingeniería genética para reconocer tanto (1) un epítopo como (2) una de una diversidad de moléculas "desencadenantes" por ejemplo, receptores Fc en células mieloides y CD3 Y CD2 en células T, que se han identificado como moléculas capaces de hacer que una célula T citotóxica destruya una diana particular. Estos anticuerpos biespecíficos pueden prepararse por conjugación química, hibridoma o por técnicas de biología molecular recombinante conocidas para el especialista en la
técnica.

Para la producción de anticuerpos policlonales contra un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo del mismo codificado por una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID No. 1, pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica. Para la producción del anticuerpo, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores por inyección con un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo del mismo, incluyendo pero sin limitación conejos, ratones, ratas, etc. Pueden usarse diversos adyuvantes, dependiendo de la especie hospedadora, para aumentar la respuesta inmunológica, incluyendo pero sin limitación Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPL^{TM} (monofosforil lípido A 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, BCG (bacilo Calmette-Guerin) y
Corinebacterium parvum. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos policlonales por purificación, en una columna de afinidad en la que previamente se ha unido un polipéptido de acuerdo con la invención, de los anticuerpos contenidos en el suero de pacientes infectados con una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, puede usarse la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). En una realización adicional de la invención pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales sin gérmenes utilizando la tecnología descrita en el documento PCT/US90/02545. En otra realización, pueden usarse animales no humanos transgénicos para la producción de anticuerpos humanos utilizando la tecnología descrita en los documentos WO 98/24893 y WO 96/33735. De acuerdo con la invención, pueden usarse anticuerpos humanos y pueden obtenerse usando hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026-2030) o trasformando células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, páginas 77-96). De hecho, de acuerdo con la invención, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) uniendo los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada; anticuerpos de este tipo pueden estar dentro del alcance de esta invención.

De acuerdo con la invención, deben adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de Estados Unidos 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios con especificidad de polipéptido o péptido. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión Fab (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para polipéptidos, derivados o análogos.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula por técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitación: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los enlaces disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y fragmentos Fv.

Además, se han desarrollado técnicas para la producción de anticuerpos quimerizados (véase, por ejemplo, Boss, M. et al., Patente de Estados Unidos 4.816.397; y Cabilly, S. et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria en su totalidad como referencia) y humanizados (véase, por ejemplo, Queen, Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089, que se incorpora en esta memoria en su totalidad como referencia). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consta de una región "flanqueante" interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). La medida de la región flanqueante y las CDR se han definido de forma precisa (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabar, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983). En resumen, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo procedentes de especies no humanas que tienen una o más CDR de las especies no humanas y una región flanqueante de una molécula de inmunoglobulina humana.

Los anticuerpos de la invención también pueden marcarse de la misma manera que se ha descrito anteriormente para las sondas de ácido nucleico, tal como por medio de un marcaje de tipo enzimático, fluorescente o radiactivo.

La invención se refiere, además, a un método para la detección y/o la identificación de una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto la muestra biológica (tejido o fluido biológico) con un anticuerpo mono- o policlonal de acuerdo con la invención (en condiciones que permitan una reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y los polipéptidos de la bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado que puede estar presente en la muestra biológica, es decir, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes);

b): detectar el complejo de antígeno-anticuerpo que puede formarse.

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También cae dentro del alcance de la invención un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

-: un anticuerpo policlonal o monoclonal de acuerdo con la invención, marcado cuando sea apropiado;

-: cuando sea apropiado, un reactivo para constituir el medio apropiado para realizar la reacción inmunológica;

-: un reactivo que permita la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica, siendo posible que este reactivo también lleve un marcador, o pueda reconocerse a su vez por un reactivo marcado, más particularmente en caso de que dicho anticuerpo monoclonal o policlonal no esté marcado;

-: cuando sea apropiado, reactivos para realizar la lisis de las células en la muestra ensayada.

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El principio del chip de ADN que se explicó anteriormente también puede usarse para producir "chips" de proteínas en los que el soporte se ha recubierto con un polipéptido o un anticuerpo de acuerdo con la invención, o series de los mismos, en lugar del ADN. Estos "chips" de proteínas hacen que sea posible, por ejemplo, analizar las interacciones biomoleculares (BIA) inducidas por la captura de afinidad de analitos diana sobre un soporte recubierto, por ejemplo, con proteínas, por resonancia de plasma superficial (SPR). Puede hacerse referencia, por ejemplo, a las técnicas para el acoplamiento de proteínas sobre un soporte sólido que se describen en el documento EP 524 800 o a los métodos que describen el uso de chips de proteínas de tipo biosensor tales como la técnica de tipo BIAcore (Pharmacia) (Arlinghaus et al., 1997; Krone et al., 1997, Chatelier et al., 1995). Estos polipéptidos o anticuerpos de acuerdo con la invención, capaces de unirse específicamente a anticuerpos o polipéptidos derivados de la muestra a analizar, de esta manera pueden usarse en chips de proteínas para la detección y/o la identificación de proteínas en muestras. Dichos chips de proteínas pueden usarse, en particular, para el diagnóstico de infecciones y pueden contener preferiblemente, por chip, varios polipéptidos y/o anticuerpos de la invención de diferente especificidad, y/o polipéptidos y/o anticuerpos capaces de reconocer microorganismos diferentes de Chlamydia pneumoniae.

Por consiguiente, el objeto de la presente descripción son también los polipéptidos y los anticuerpos de acuerdo con la invención, caracterizados porque están inmovilizados sobre un soporte, en particular de un chip de proteína.

Los chips de proteína, caracterizados porque contiene al menos un polipéptido o un anticuerpo de acuerdo con la invención inmovilizado sobre el soporte de dicho chip, forman también parte de la invención.

La presente descripción comprende, además, un chip de proteína de acuerdo con la invención, caracterizado porque contiene, adicionalmente, al menos un polipéptido de un microorganismo diferente de Chlamydia pneumoniae o al menos un anticuerpo dirigido contra un compuesto de un microorganismo diferente de Chlamydia pneumoniae, inmovilizado sobre el soporte de dicho chip.

La descripción también se refiere a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, o para la detección y/o identificación de un microorganismo, caracterizado porque comprende un chip de proteína de acuerdo con la invención.

El objeto de la presente descripción es también un método para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado en una muestra biológica, caracterizado porque usa una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención.

Más particularmente, la invención se refiere a un método para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): cuando sea apropiado, aislamiento del ADN de la muestra biológica a analizar u opcionalmente producción de un ADNc a partir del ARN presente en la muestra biológica;

b): amplificación específica del ADN de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado con la ayuda de al menos un cebador, que se hibrida específicamente con el polinucleótido ORF 291;

c): detección de los productos de amplificación.

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Éstos pueden detectarse, por ejemplo, por la técnica de hibridación molecular usando una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Esta sonda ventajosamente se marcará con un elemento no radiactivo (sonda fría) o radiactivo.

Para los fines de la presente invención, se entenderá que "ADN de la muestra biológica" o "ADN contenido en la muestra biológica" significa el ADN presente en la muestra biológica considerada, u opcionalmente el ADNc obtenido después de la acción de una enzima de tipo transcriptasa inversa sobre el ARN presente en dicha muestra biológica.

Otro objetivo de la presente invención consiste en un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto una sonda nucleotídica de acuerdo con la invención con una muestra biológica, habiéndose hecho accesible previamente el ADN contenido en la muestra biológica a la hibridación, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con pares de bases complementarias del ADN de una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado;

b): detectar el complejo de hibridación formado entre la sonda de nucleótidos y el ADN en la muestra biológica.

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La presente descripción también se refiere a un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto una sonda de nucleótidos inmovilizada sobre un soporte de acuerdo con la invención con una muestra biológica, habiéndose hecho accesible previamente el ADN de la muestra, cuando es apropiado, a la hibridación, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con el ADN de una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado;

b): poner el híbrido formado entre la sonda de nucleótidos inmovilizada sobre un soporte y el ADN contenido en la muestra biológica, cuando sea apropiado después de la eliminación del ADN de la muestra biológica que no se ha hibridado con la sonda, con una sonda nucleotídica marcada de acuerdo con la invención; y

c): detectar el nuevo híbrido formado en la etapa b).

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De acuerdo con una realización ventajosa del método para la detección y/o la identificación definido anteriormente, se caracteriza porque, antes de la etapa a), el ADN en la muestra biológica se extiende y/o se amplifica con cebadores de antemano con la ayuda de al menos de un cebador de acuerdo con la invención.

La invención se refiere, además, a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae, caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

a): un cebador o sonda nucleotídico capaz de hibridarse con un polinucleótido de acuerdo con la invención.

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La descripción también se refiere a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los siguientes componentes:

a): una sonda de nucleótidos, denominada sonda de captura;

b): una sonda oligonucleotídica, denominada sonda de detección;

c): cuando sea apropiado, al menos un cebador de acuerdo con la invención así como los reactivos (por ejemplo, polimerasa y/o desoxinucleótido trifosfatos) necesarios para una reacción de amplificación del ADN.

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a): al menos un cebador;

b): cuando sea apropiado, los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación de ADN;

c): cuando sea apropiado, un componente que hace que sea posible comprobar la secuencia del fragmento amplificado, más particularmente una sonda oligonucleotídica de acuerdo con la invención.

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La descripción se refiere, además, a un kit o estuche para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado, o para la detección y/o la identificación de un microorganismo caracterizado porque comprende un chip de ADN como se ha definido anteriormente.

La invención también se refiere a un método o a un kit o estuche de acuerdo con la invención para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae, que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención y un anticuerpo de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la presente descripción, Preferiblemente, dicho método o dicho kit o estuche anterior de acuerdo con la invención, para la detección y/o la identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae se caracteriza porque dicho cebador y/o dicha sonda o dichos polipéptidos se eligen entre las secuencias de nucleótidos o polipéptidos de acuerdo con la invención que se han identificado como específicas para la especie Chlamydia pneumoniae y porque dichos anticuerpos de acuerdo con la invención se eligen entre los anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de acuerdo con la invención elegidos entre los polipéptidos identificados como específicos para la especie Chlamydia pneumoniae.

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La invención también comprende ensayos de selección que comprenden las etapas de:

a): poner en contacto dicho compuesto con un polipéptido o polinucleótido aislado de acuerdo con la invención; y

b): determinar la capacidad de dicho compuesto para unirse con dicho polipéptido o dicha secuencia de polinucleótidos.

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La presente descripción se dirige a células transformados de acuerdo con la invención que, ventajosamente, pueden servir como modelo y pueden usarse en métodos para estudiar, identificar y/o seleccionar compuestos que puedan ser responsables de patologías inducidas o que empeoran por Chlamydia pneumoniae, o capaces de prevenir y/o tratar estas patologías tales como, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares o respiratorias. En particular, las células hospedadoras transformadas, en particular bacterias de la familia Chlamydia cuya transformación con un vector de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, aumentar o inhibir su infectividad, o modular las patologías inducidas o que empeoran normalmente por la infección, pueden usarse para infectar a animales en los que se controlará el inicio de las patologías. Estos animales no transformados, infectados por ejemplo con bacterias Chlamydia transformadas, pueden servir como modelo de estudio.

Los compuestos que pueden seleccionarse pueden ser compuestos orgánicos tales como polipéptidos o carbohidratos o cualquier otro compuesto orgánico o inorgánico ya conocido, o nuevos compuestos orgánicos producidos usando técnicas de modelado molecular y obtenidos por síntesis química o bioquímica, siendo conocidas dichas técnicas para los especialistas en la técnica.

Dichos compuestos seleccionados pueden usarse para modular el crecimiento y/o la replicación celular de Chlamydia pneumoniae o cualquier otro microorganismo asociado y de esta manera controlar la infección por estos microorganismos. Dichos compuestos también pueden usarse para modular el crecimiento y/o la replicación celular de todas las células eucariotas o procariotas, en particular células tumorales y microorganismos infecciosos, para los que dichos compuestos resultarán activos, haciendo posible los métodos determinar dichas modulaciones que son bien conocidas por los especialistas en la técnica.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende

: un polipéptido de acuerdo con la invención; o

: un anticuerpo de acuerdo con la invención; y

: un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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La presente descripción también se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de acuerdo con la invención y/o uno o más polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención. Estas composiciones además comprenden un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones que comprenden un polipéptido o polipéptido de fusión que presenta reacción inmunológica con suero seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia pneumoniae. En una realización, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, o que comprende un polinucleótido, un vector o una célula hospedadora de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para la prevención o tratamiento de una infección por una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae.

La invención se refiere, además, a una composición inmunogénica o una composición de vacuna caracterizada porque comprende uno o más polipéptidos y/o uno o más polipéptidos híbridos (de fusión) de acuerdo con la invención. Estas composiciones además comprenden un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones inmunogénicas o el polipéptido de fusión incluyen composiciones que comprenden un polipéptido que presenta reacción inmunológica con suero seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia pneumoniae.

Las composiciones de vacuna o inmunogénicas también pueden comprender composiciones de vacuna o inmunogénicas de ADN que comprenden secuencias polinucleotídicas de la invención asociadas operativamente con una secuencia reguladora que controla la expresión génica. Estas composiciones pueden incluir composiciones que dirigen la expresión de un epítopo neutralizador de Chlamydia pneumoniae.

La presente descripción también se refiere al uso de una célula transformada como se ha definido anteriormente, para la preparación de una composición de vacuna.

La invención también se refiere a una composición de vacuna, caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con la invención y/o una célula transforma de acuerdo con la invención.

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La invención también se refiere a las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención para la prevención o el tratamiento de una infección por bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o por un microorganismo asociado.

La presente descripción también se refiere al uso de ADN que codifica polipéptidos de Chlamydia pneumoniae, en particular determinantes antigénicos, a formular como composiciones de vacuna. De acuerdo con este aspecto de la invención, el ADN de interés se introduce por ingeniería genética en un vector de expresión bajo el control de elementos reguladores, que promoverán la expresión del ADN, es decir, elementos promotores o potenciadores. El elemento promotor puede presentar especificidad de célula y permitir la trascripción sustancial del ADN sólo en células predeterminadas. El ADN puede introducirse directamente en el hospedador como ADN desnudo o formulado en composiciones con otros agentes que pueden facilitar la captación del ADN incluyendo vectores virales, por ejemplo, vectores de adenovirus, o agentes que facilitan la inmunización, tales como bupivicaína y otros anestésicos locales, saponinas y poliaminas catiónicas.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido antigénico y el elemento regulador puede insertarse en una línea celular estable o un microorganismo clonado, usando técnicas, tales como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica, y descritas, por ejemplo, en Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051; Skoultchi, WO 91/06667.

Estas líneas celulares y microorganismos pueden formularse para realizar vacunas. La secuencia de ADN que codifica el polipéptido antigénico y el elemento regulador puede suministrarse a un hospedador mamífero e introducirse en el genoma del hospedador por medio de recombinación homóloga.

Se describe que las composiciones inmunogénicas y/o de vacuna de acuerdo con la invención, que están destinadas para la prevención y/o tratamiento de una infección por Chlamydia pneumoniae se elegirán entre las composiciones inmunogénicas y/o de vacuna que comprenden un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos correspondientes a una proteína, o uno de sus fragmentos representativos, de la envuelta celular de Chlamydia pneumoniae. Las composiciones de vacuna que comprenden secuencias de nucleótidos también comprenderán secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos correspondientes a una proteína, o uno de sus fragmentos representativos, de la envuelta celular de Chlamydia pneumoniae.

Los polipéptidos o sus fragmentos representativos que entran en las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención pueden seleccionarse por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica, tales como por ejemplo, basándose en la capacidad de dichos polipéptidos para estimular células T, que tiene como resultado, por ejemplo, su proliferación o la secreción de interleuquinas, y que conduce a la producción de anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos.

En ratones, en los que se administra una dosis ponderada de la composición de vacuna comparable a la dosis usada en seres humanos, la reacción de anticuerpos se ensaya recogiendo suero seguido de un estudio de la formación de un complejo entre los anticuerpos presentes en el suero y el antígeno de la composición de vacuna, de acuerdo con las técnicas habituales.

Se describe que composiciones de vacuna preferiblemente estarán en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, cuando sea apropiado, con uno o más adyuvantes de inmunidad apropiado.

Actualmente se dispone de diversos tipos de vacunas para proteger a los seres humanos contra enfermedades infecciosas: microorganismos vivos atenuados (M. Bovis - BCG para tuberculosis), microorganismos inactivados (virus de la influenza), extractos acelulares (Bordetella pertussis para tos ferina), proteínas recombinantes (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B), polisacáridos (neumococos). Se han realizado experimentos con vacunas preparadas a partir de péptidos sintéticos o a partir de microorganismos modificados genéticamente que expresan antígenos heterólogos. Incluso más recientemente, se propusieron genes que llevaban ADN de plásmido recombinante que codificaban antígenos protectores como estrategia de vacuna alternativa. Este tipo de vacunación se realiza con un plásmido particular derivado de un plásmido de E. Coli que no se replica in vivo y que codifica sólo la proteína de la vacuna. Se inmunizaron animales por medio de una simple inyección del ADN plasmídico desnudo en el músculo. Esta técnica conduce a la expresión de la proteína de la vacuna in situ y a una respuesta inmune de tipo celular (CTL) y de tipo moral (anticuerpo). Esta doble inducción de la respuesta inmune es una de las ventajas principales de la técnica de vacunación con ADN desnudo.

Las composiciones de vacuna pueden evaluarse en modelos animales in vitro e in vivo antes de su administración al hospedador, por ejemplo, al ser humano. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de neutralización in vitro tales como los descritos por Peterson et al. (1988). El ensayo descrito por Peterson et al. (1988) es adecuado para ensayar composiciones de vacuna dirigidas hacia Chlamydia pneumoniae o Chlamydia trachomatis.

En resumen, se diluye antisuero hiper-inmune en PBS que contiene 5% de suero de cobaya como fuente de complemento. Se añaden clamidias (10^{4} IFU; unidades infecciosas) a las diluciones de antisuero. Las mezclas de antígeno-anticuerpo se incuban a 37EC durante 45 minutos y se inoculan por duplicado en monocapas de células Hep-2 o HeLa confluentes contenidas en viales de vidrio (por ejemplo, 15 por 45 mm), que se han lavado dos veces con PBS antes de la inoculación. Las células de la monocapa se infectan por centrifugación a 1000X g durante 1 hora seguido de incubación estacionaria a 37E durante 1 hora. Las monocapas infectadas se incuban durante 48 o 72 horas, se fijan y se tiñen con un anticuerpo específico de Chlamydia, tal como anti-MOMP para C. trachomatis, etc. Las IFU se cuentan en diez campos a 200 aumentos. La titulación de neutralización se asigna basándose en la dilución que proporciona una inhibición de 50% en comparación con las monocapas de control/IFU.

La eficacia de las composiciones de vacuna puede determinarse in vivo exponiendo modelos animales de infección por Chlamydia pneumoniae, por ejemplo, ratones o conejos, a las composiciones de vacuna. Por ejemplo, pueden realizarse estudios de exposición a la composición de vacuna in vivo en el modelo murino de infección por Chlamydia pneumoniae descrito por Moazed et al. (1997). En resumen, se inmunizan ratones C57 BL/6J y/o deficientes en apoE homocigotos, machos, con composiciones de vacuna. Después de la vacunación, los ratones se sedan suavemente por inyección subcutánea de una mezcla de ketamina y xilazina, y se les inocula por vía intranasal un volumen total de 0,03-0,05 ml de organismos suspendidos en medio SPG o con SPG solo. Las inoculaciones de Chlamydia pneumoniae son de aproximadamente 3 x 10^{7} IFU/ratón. Los ratones se inoculan con Chlamydia pneumoniae a las 8, 10 y 12 semanas de edad. Después se recogen tejidos del pulmón, bazo, corazón, etc. 1-20 semanas después de la primera inoculación. La presencia de organismos se puntúa usando PCR, histología e inmunocitoquímica, o por cultivo cuantitativo/IFU después de la homogeneización del tejido.

Como alternativa, pueden realizarse estudios de exposición a la composición de vacuna in vivo en el modelo de conejo de Chlamydia pneumoniae descrito por Laitinen et al. (1997). En resumen, se inmunizan conejos blancos de Nueva Zelanda (de 5 meses de edad) con las composiciones de vacuna. Después de la vacunación, los conejos se sedan con Hypnorm, 0,3 ml/kg de peso corporal, por vía intramuscular, y se les inocula por vía intranasal un total de 0,5 ml de Chlamydia pneumoniae suspendido en medio SPG o con SPG solo. Las inoculaciones de Chlamydia pneumoniae son aproximadamente 3 x 10^{7} IFU/conejo. Los conejos se reinfectan de la misma manera y con la misma dosis 3 semanas después de la inoculación primaria. Posteriormente, los tejidos se recogen 2 semanas después de la infección primaria y 1, 2 y 4 semanas después de la reinfección. La presencia de Chlamydia pneumoniae se evalúa usando PCR, histología e inmunocitoquímica, o por cultivo cuantitativo/IFU después de la homogeneización de tejidos.

Las composiciones de vacuna que comprenden secuencias de nucleótidos o vectores en los que se insertan dichas secuencias se describen, en particular, en la Solicitud Internacional Nº WO 90/11092 y también en la Solicitud Internacional Nº WO 95/11307.

Se describe que las secuencias de nucleótidos que constituyen la composición de vacuna de acuerdo con la invención pueden inyectarse en el hospedador después de haberse acoplado a compuestos que promueven la penetración de este polinucleótido dentro de la célula o su transporte hasta el núcleo celular. Los conjugados resultantes pueden encapsularse en micropartículas poliméricas, como se describe en la Solicitud Internacional Nº WO 94/27238 (Medisorb Technologies Internacional).

Se describe que la secuencia de nucleótidos, preferiblemente un ADN, de la composición de vacuna se compleja con el DEAE-dextrano (Pagano et al., 1967) o con proteínas nucleares (Kaneda et al., 1989), con lípidos (Felgner et al., 1987) o se encapsula en liposomas (Fraley et al., 1980) o, como alternativa, se introduce en forma de un gel facilitando su transfección en las células (Midoux et al., 1993, Pastore et al., 1994). El polinucleótido o el vector también pueden estar en suspensión en una solución tampón o puede combinarse con liposomas.

Ventajosamente, esta vacuna se preparará de acuerdo con la técnica descrita por Tacson et al. o Huygen et al. en 1996 o, como alternativa, de acuerdo con la técnica descrita por Davis et al. en la Solicitud Internacional Nº WO 95/11307.

Esta vacuna también puede prepararse en forma de una composición que contiene un vector de acuerdo con la invención situado bajo el control de elementos reguladores permitiendo su expresión en seres humanos o animales. Es posible, por ejemplo, usar como vector para la expresión in vivo del antígeno polipeptídico de interés, el plásmido pcDNA3 o el plásmido pcDNA1/neo, ambos comercializados por Invitrogen ® & D Systems, Abingdon, Reino Unido). También es posible usar el plásmido VlJns.tPA, descrito por Shiver et al. en 1995. Esta vacuna ventajosamente comprenderá, además del vector recombinante, una solución salina, por ejemplo una solución de cloruro sódico.

También se describe que las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden utilizarse como parte de métodos para inmunización, donde dichos métodos comprenden administrar a un hospedador, por ejemplo, un hospedador humano, una cantidad inmunizadora de las composiciones inmunogénicas de la invención. El método de inmunización es un método de inmunización contra Chlamydia pneumoniae.

Se entiende que un vehículo farmacéuticamente aceptable indica un compuesto o combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica o de vacuna que no produce efectos secundarios y que hace que sea posible, por ejemplo, facilitar la administración del compuesto activo, aumentar su vida y/o su eficacia en el cuerpo, aumentar su solubilidad en solución o, como alternativa, mejorar su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptarán por personas especialistas en la técnica de acuerdo con la naturaleza y modo de administración del compuesto activo elegido.

Por lo que respecta a las formulaciones de vacuna, éstas pueden comprender adyuvantes de inmunidad apropiados que son conocidos por personas especialistas en la técnica tales como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, un representante de la familia de muramil péptidos tales como uno de los derivados peptídicos de N-acetil-muramilo, un lisado bacteriano o, como alternativa, adyuvante incompleto de Freund, Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPL^{TM} (monofosforil lípido A 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).

Estos compuestos se administrarán por vía sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intranasal, intramuscular, intradérmica o subcutánea, o por vía oral. La composición de vacuna que comprende polipéptidos de acuerdo con la invención se administrará varias veces, extendidas a lo largo del tiempo, por vía intradérmica o subcutánea.

Los modos óptimos de administración, dosificaciones y formas galénicas pueden determinarse de acuerdo con criterios que generalmente se tienen en cuenta para establecer un tratamiento adaptado a un paciente, tal como por ejemplo la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia del tratamiento y los efectos secundarios observados.

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Leyendas de las figuras

Figura 1: Línea para la producción de secuencias de Chlamydia pneumoniae.

Figura 2: Análisis de las secuencias y ensamblaje.

Figura 3: Técnicas de acabado.

Figura 3a): Mapa de ensamblaje.

Figura 3b): Determinación y uso de los extremos huérfanos de los contigs.

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Ejemplos Procedimientos experimentales Células

La cepa de Chlamydia pneumoniae (CM1) usada por los inventores se obtiene en la ATCC (American Culture Type Collection) donde tiene el número de referencia ATCC 1360-VR.

Se cultivan células HeLa 229, obtenidas en la American Type Culture Collection, con la referencia ATCC CCL-2.1.

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Cultivo de las células

Las células HeLa ATCC CCL-2.1 se cultivan en matraces de cultivo de células de 75 ml (Corning). El medio de cultivo es medio de cultivo de células modificado por Dulbecco (Gibco BRL Nº 04101965) suplementado con MEM aminoácidos (Gibco BRL - Nº 04301140) L (5 ml por 500 ml de medio) y suero bovino fetal al 5% (Gibco BRL Nº 10270 lote 40G8260K) sin antibióticos o antifúngicos.

La solución madre de cultivo de células se mantiene de la siguiente manera. Los cultivos celulares se examinan con un microscopio invertido. Veinticuatro horas después de la confluencia, cada césped celular se lava con PBS (Gibco BRL Nº 04114190), se aclara y después se pone durante 5 minutos en una estufa en presencia de 3 ml de tripsina (Gibco BRL Nº 25200056). Después se separa el césped celular y posteriormente se resuspende en 120 ml de medio de cultivo, y el conjunto se agita para hacer homogénea la suspensión celular. Después se distribuyen 30 ml de esta suspensión por matraz de cultivo de células. Los matraces se mantienen en una estufa de CO_{2} (al 5%) durante 48 horas a una temperatura de 37ºC. La solución madre de células se mantiene de manera que se disponga diariamente de 16 matraces de células subconfluentes. Son estas células subconfluentes las que se usarán para infectarse con Chlamydia. También se usan matraces de cultivo de células de 25 ml que se preparan de una manera similar, pero los volúmenes usados para mantener las células son los siguientes: 1 ml de tripsina, y 28 ml de medio de cultivo para resuspender las células; se usan 7 ml de medio de cultivo por matraz de 25 ml.

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Infección de las células con Chlamydia

Inicialmente, las clamidias se obtienen congeladas a partir de la ATCC (-70ºC) en suspensión, en un volumen de 1 ml. Esta preparación se descongela lentamente, se recogen 500 \mul y se ponen en contacto con células subconfluentes que se obtienen como se ha indicado anteriormente, en un matraz de cultivo de células de 25 ml que contiene 1 ml de medio, de manera que se cubran las células. El matraz después se centrifuga a 2000 rpm en un rotor "oscilante" para placas de microtitulación, manteniéndose la centrífuga a una temperatura de 35ºC. Después de la centrifugación, los dos matraces se ponen en una estufa a 35ºC durante tres horas. Después se añaden 6 ml de medio de cultivo que contiene cicloheximida (1 \mug/ml) y el matraz se almacena a 35ºC. Después de 72 horas, el nivel de infección se evalúa por inmunofluorescencia directa y por el efecto citopatogénico producido en las células.

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Inmunofluorescencia directa

Partiendo con células infectadas que se obtuvieron como se ha indicado anteriormente, se deposita un frotis celular con una pipeta Pasteur en un portaobjetos de microscopio. El frotis celular se fija con acetona durante 10 minutos. Después de drenar la acetona, el frotis se cubre con 30 \mul de anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra MOMP (proteína principal de la membrana externa) de Chlamydia (Syva, Biomérieux) marcada con isotiocianato de fluoresceína. El conjunto después de incuba en una cámara húmeda a una temperatura de 37ºC. Los portaobjetos después se aclaran con agua, se secan ligeramente y después de depositar una gota de medio de montaje, se monta un cubreobjetos antes de la lectura. La lectura se realiza con la ayuda de un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros requeridos (excitación a 490 nm, emisión a 520 nm).

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Recolección de Chlamydia pneumoniae

Después de comprobar la infección por inmunofluorescencia directa, realizada como se ha indicado anteriormente, los matraces de cultivo se abren en una cabina estéril, y en el matraz se ponen perlas de vidrio estéril con un diámetro del orden de un milímetro. El matraz se cierra y después se agita vigorosamente mientras se mantiene horizontalmente el césped celular en el fondo, de manera que las perlas de vidrio puedan tener una acción mecánica sobre el césped celular. De esta manera, la mayoría de las células se separan o se rompen. El efecto de la agitación se observa con un microscopio óptico para asegurar la liberación apropiada de clamidias.

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Infección a gran escala de los cultivos celulares

El producto de la recolección de clamidias (medio de cultivo y desecho celular) se recoge con una pipeta y se distribuye en tres matraces de cultivo de células que contienen células HeLa ATCC CCL-2.1 subconfluentes, obtenidas como se ha indicado anteriormente. Las células inoculadas de esta manera se ponen bajo agitación suave (oscilante) en una estufa a 35ºC. Después de una hora, los matraces se mantienen horizontalmente en una estufa de manera que el medio de cultivo cubra las células durante 3 horas. Después se añaden 30 ml de medio de cultivo que contiene actidiona (1 \mug/ml) a cada uno de los matraces. Después, los matraces de cultivo se almacenan a 35ºC durante 72 horas. Las células infectadas de esta manera se examinan con un microscopio óptico después de 24 horas, el efecto citopatogénico se evalúa por la aparición de inclusiones citoplásmicas que son visibles con un microscopio óptico invertido. Después de 72 horas, las vacuolas que contienen las clamidias ocupan el citoplasma de la célula y empujan a los núcleos celulares hacia un lado. En esta fase, numerosas células se destruyen espontáneamente y dejan cuerpos elementales libres en el medio de cultivo. Las clamidias se recogen como se ha descrito anteriormente y se congelan a -80ºC o se usan para otra propagación.

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Purificación de las clamidias

El producto de las recolecciones de clamidias se almacenan a -80ºC y se descongela en un baño de agua a temperatura ambiente. Después de la descongelación, cada tubo se agita vigorosamente durante un minuto y se sumerge durante un minuto en un depósito de ultrasonidos (BRANSON 1200); los tubos después se agitan por inversión antes de centrifugarse durante 5 minutos a 2000 rpm. El sobrenadante se retira cuidadosamente y se mantiene a una temperatura fría (hielo). El sobrenadante se agita vigorosamente y después se filtra en filtros de nylon que tienen poros de 5 \mum de diámetro sobre un soporte (Nalgene) que permite establecer un vacío delicado bajo el filtro de nylon. Para cada filtración, se superponen tres filtros de nylon; estos filtros se reemplazan después de cada 40 ml de filtrado. Se mantienen 200 ml de producto de filtración a temperatura ambiente y después de agitarse por inversión, se centrifugan a 10.000 rpm durante 90 minutos, se retira el sobrenadante y el sedimento se recoge en 10 ml de Tris 10 mM, se somete a una agitación vorticial vigorosa y después se centrifuga a 10.000 rpm durante 90 minutos. Se retira el sobrenadante y el sedimento se recoge en un tampón (Tris 20 mM pH 8,0, KCl 5 mM, MgCl_{2} 5 mM) al que se añaden 800 unidades de DNAsa I (Boehringer). El conjunto se mantiene a 37ºC durante una hora. Después se añade 1 ml de EDTA 0,5 M, el conjunto se somete a agitación vorticial y se congela a -20ºC.

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Preparación del ADN

Las clamidias purificadas anteriormente se descongelan y se someten a una digestión con proteinasa K (Boehringer) en un volumen final de 10 ml. Las condiciones de digestión son las siguientes: 0,1 mg/ml de proteinasa K, 0,1 x SDS a 55EC, agitación cada 10 minutos. El producto de digestión después se somete a una doble extracción con fenol-cloroformo, se añaden dos volúmenes de etanol y el ADN se recupera directamente con una pipeta Pasteur que tiene un extremo en forma de un gancho. El ADN se seca en el borde del tubo y después se resuspende en 500 \mul de Tris 2 mM pH 7,5. El ADN se almacena a 4ºC durante al menos 24 horas antes de usarse para la clonación.

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Clonación del ADN

Después de la precipitación, el ADN se cuantifica midiendo la densidad óptica a 260 nm. Se distribuyen 30 \mug de ADN de Chlamydia en 10 tubos de 1,5 ml y se diluyen en 300 \mul de agua. Cada uno de los tubos se somete a 10 aplicaciones de ultrasonidos que duran 0,5 segundos en un sonicador (unisonix XL2020). Después se agrupan los contenidos de los 10 tubos y se concentran por extracciones sucesivas con butanol (Sigma B1888) de la siguiente manera: se añaden dos volúmenes de butanol a la mezcla de ADN diluida. Después de agitar, el conjunto se centrifuga durante cinco minutos a 2500 rpm y se retira el butanol. Esta operación se repite hasta que el volumen de la fase acuosa es menor de 1 ml. El ADN después se precipita en presencia de etanol y de acetato sódico 0,5 M pH 5,4 y después se centrifuga durante 30 minutos a 15.000 rpm a temperatura fría (4ºC). El sedimento se lava con etanol al 75%, se centrifuga durante cinco minutos a 15.000 rpm y se seca a temperatura ambiente. La décima parte de la preparación se analiza en un gel de agarosa al 0,8%. Típicamente, el tamaño de los fragmentos de ADN preparados de esta manera está comprendido entre 200 y 8000 pares de bases.

Para permitir la clonación del ADN obtenido, los extremos se reparan. El ADN se distribuye en una cantidad de 10 \mug/tubo, en el siguiente medio de reacción: volumen final 100 \mul, 1 x tampón (Biolabs 201L), 0,5 \mul de BSA a 0,05 mg/ml, dATP 0,1 mM, 0,1 mM de cada uno de dGTP, dCTP o dTTP y 60.000 UI de ADN polimerasa de T4. La reacción se incuba durante 30 minutos a 16ºC. Después se agrupan los contenidos de los tubos antes de realizar una extracción con fenol-cloroformo y después se precipita la fase acuosa como se ha descrito anteriormente. Después de esta etapa, el ADN preparado de esta manera se fosforila. Para esto, el ADN se distribuye en tubos en una cantidad de 10 \mug por tubo, y después en un volumen final de 50 \mul, la reacción se prepara de la siguiente manera: ATP 1 mM, 1 x tampón quinasa y 10 UI de polinucleótido quinasa de T4 (Biolabs 201L). La preparación se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Los contenidos de los tubos se combinan y se realiza una extracción con fenol-cloroformo y después una precipitación para precipitar el ADN. Este último después se suspende en 1 \mul de agua y posteriormente los fragmentos de ADN se separan de acuerdo con su tamaño en un gel de agarosa al 0,8% (1 x TAE). El ADN se somete a un campo eléctrico de 5 V/cm y después se visualiza en una tabla UV. Los fragmentos cuyo tamaño varía entre 1200 y 2000 pares de bases se seleccionan cortando el gel. El fragmento de gel aislado de esta manera se pone en un tubo y después el ADN se purifica con el kit Qiaex (20021 Qiagen), de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante.

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Preparación del vector

Se diluyen 14 \mug del vector de clonación pGEM-5Zf (Promega P2241) en un volumen final de 150 \mul y se someten a digestión con la enzima de restricción EcoRV 300 UI (Biolabs 195S) de acuerdo con el protocolo y con los reactivos proporcionados por el fabricante. El conjunto se pone a 37ºC durante 150 minutos y después se distribuye en los pocillos de un gel de agarosa al 0,8% sometido a un campo eléctrico de 5 V/cm. El vector linealizado se visualiza en una tabla UV, se aísla cortando el gel y después se purifica por el kit Qiaex (Qiagen 20021) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los productos de purificación se agrupan en un tubo, se mide el volumen y después se añade la mitad del volumen de fenol, y el conjunto se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se añade la mitad del volumen de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1 y se agita vigorosamente durante 1 minuto. El conjunto se centrifuga a 15.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC, la fase acuosa se recupera y se transfiere a un tubo. El ADN se precipita en presencia de acetato sódico 0,3 M, pH 5,4 y 3 volúmenes de etanol y se pone a -20ºC durante 1 hora. Después, el ADN se centrifuga a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC, se retira el sobrenadante mientras se conserva el sedimento y se lava dos veces con etanol al 70%. Después de secar a temperatura ambiente, el ADN se suspende en 25 \mul
de agua.

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Fosforilación del vector

Se diluyen 25 \mul del vector preparado en la etapa anterior en un volumen final de 500 \mul de la siguiente mezcla de reacción:

Después de la reparación, el ADN se somete a una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación, después se recoge el sedimento en 10 \mul de agua y el ADN se cuantifica midiendo la densidad óptica a 260 nm. El ADN cuantificado se une al vector PGEm-5Zf(+) preparado por la enzima de restricción EcoRV y se desfosforila (véase la preparación del vector). La unión se realiza en tres condiciones que varían en la relación entre el número de moléculas de vector y el número de moléculas de inserto. Típicamente, se usa una relación equimolar, una relación de 1:3 y una relación de 3:1 para las uniones que, además, se realizan en las siguientes condiciones: 25 ng de vector PGEm-5Zf(+), ADN cortado y tampón de unión en un volumen final de 20 \mul con ADN ligasa de T4 (Amersham E70042X); el conjunto después se pone en un refrigerador durante una noche y después se realiza una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación de una manera convencional. El sedimento se recoge en 5 \mul de agua.

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Transformación de las bacterias Cultivo de las bacterias

Se usan placas Petri que contienen medio Agar LB que contiene ampicilina (50 \mug/ml), Xgal (280 \mug/ml) [5-bromo-4-cloroindolil-beta-D-galactopiranósido (Sigma B-4252)] e IPTG (140 \mug/ml) [isopropil-beta-D-tiogalactósido (Sigma I-6758)], se cultivan 50 y 100 \mul de bacterias para cada uno de los ligamientos. Las placas Petri se ponen en posición invertida a 37ºC durante 15 a 16 horas en una estufa. El número de clones positivos "recombinantes" se evalúa contando las colonias blancas y las colonias azules que se considera que contienen el vector solo.

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Evaluación de los clones positivos "recombinantes"

Se recogen noventa y cuatro colonias blancas y dos colonias azules con la ayuda de conos estériles y se depositan en el fondo de los pocillos de placas diseñadas para realizar las técnicas de amplificación. A cada pocillo se le añaden 30 \mul de la siguiente mezcla de reacción: MgCl_{2} 1,7 mM, 0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, dos oligonucleótidos sintéticos correspondientes a secuencias flanqueantes del sitio de clonación en cada lado y que orientan la síntesis del ADN de una manera convergente (cebadores RP y PU 0,5 \muM, 1 U de TAQ polimerasa (GibcoBRL 18038-026)).

Las colonias preparadas de esta manera se someten a una temperatura de 94ºC durante 5 minutos y después a 30 ciclos térmicos compuestos de las siguientes etapas: 94ºC durante 40 s, 50ºC durante 30 s, 72ºC durante 180 s. La reacción después se mantiene durante 7 minutos a 72ºC y después se deja a 4ºC.

Los productos de amplificación se depositan en un gel de agarosa (0,8%), se tiñen con bromuro de etidio, se someten a electroforesis y después se analizan en una tabla ultravioleta. La presencia de un fragmento de amplificación con un tamaño mayor de 500 pares de bases indica la presencia de un inserto. Después se preparan los clones bacterianos para estudiar la secuencia de su inserto.

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Secuenciación

Para secuenciar los insertos de los clones obtenidos como se ha indicado anteriormente, éstos se amplificaron por PCR en cultivos de bacterias realizados durante una noche usando los cebadores para los vectores que flanquean los insertos. La secuencia de los extremos de estos insertos (con un promedio de 500 bases en cada lado) se determinó por secuenciación fluorescente automática en un secuenciador ABI 377, equipado con el software de Análisis de Secuenciación de ADN ABI Prism (versión 2.1.2).

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Análisis de las secuencias

Las secuencias obtenidas por secuenciación en una línea de alto rendimiento (Figura 1) se almacenan en una base de datos; esta parte de la producción es independiente de cualquier tratamiento de las secuencias. Las secuencias se extraen de la base de datos, evitando todas las regiones de calidad inadecuada, es decir las regiones para las que se observan incertidumbres en la secuencia en más de 95%. Después de la extracción, las secuencias se introducen en una línea de procesamiento, cuyo diagrama se describe en la Figura 2. En una primera trayectoria de esta línea de procesamiento, las secuencias se ensamblan por el software Gap4 de R. Staden (Bonfield et al., 1995) (OS UNIX/SUN Solaris); los resultados obtenidos por este software se mantienen en forma de dos archivos que se usarán para un procesamiento posterior. El primero de estos archivos proporciona información sobre la secuencia de cada uno de los contigs obtenidos. El segundo archivo representa todos los clones que participan en la composición de todos los contigs así como sus posiciones en los contigs respectivos.

La segunda ruta de procesamiento usa un ensamblador de secuencias (TIGR-Asmg assembler UNIX/SUN Solaris); los resultados de esta segunda ruta de procesamiento se mantienen en forma de un archivo en formato TIGR-Asmg que proporciona información sobre la relación existente entre las secuencias seleccionadas para el ensamblaje. Este ensamblador algunas veces no puede unir contigs cuyos extremos solapan en varios cientos de pares de bases.

Los resultados obtenidos a partir de estos dos ensambladores se comparan con la ayuda del programa BLAST, comparándose cada uno de los contigs derivados de una ruta de ensamblaje con los contigs derivados de la otra ruta.

Para las dos rutas de procesamiento, se fijan los parámetros de ensamblaje estrictos (homología de 95%, 30 nucleótidos de superposición). Estos parámetros evitan la confusión de 3 a 5% de los clones derivados de células eucariotas con secuencias obtenidas a partir de los clones derivados de Chlamydia pneumoniae. Sin embargo, las secuencias eucariotas se conservan durante el transcurso de este proyecto; la estrategia introducida, que se describe más adelante, se diseñará, entre otras cosas, de manera que no se obstaculice por estas secuencias derivadas de clones contaminantes.

Los resultados de estos dos ensambladores se procesan en un software desarrollado para este proyecto. Este software opera en una plataforma Windows NT y recibe, como datos, los resultados derivados del software STADEN y/o los resultados derivados del ensamblador TIGR-Asmg, el software, los resultados, después del procesamiento de los datos, en la determinación de un mapa de ensamblaje que proporciona la relación de proximidad y la orientación de los contigs entre sí (Figura 3a). Usando este mapa de ensamblaje, el software determina todos los cebadores necesarios para terminar el proyecto. Este tratamiento, que se detallará más adelante, tiene la ventaja de distinguir entre las secuencias aisladas procedentes de las contaminaciones por el ADN de células eucariotas y las secuencias de pequeño tamaño integradas claramente en el proyecto por las relaciones que establecen con contigs. Para permitir, sin riesgo de error, la redisposición y la orientación de los contigs entre sí, se realiza una evaluación estadística de la precisión de los nombres (nominación). La "nominación" de la secuencia se realiza a partir de los resultados de la "contigación". Esta evaluación hace que sea posible proporcionar a cada una de las placas de clones, así como a cada una de las subseries de placas, un peso que es inversamente proporcional al índice de error probable que existe en la "nominación" de las secuencias obtenidas a partir de esta placa o partir de una subserie de esta placa. A pesar de que haya un índice bajo de error, pueden producirse errores a lo largo de todas las etapas de producción de los clones y de las secuencias. Estas etapas son numerosas, repetitivas y aunque la mayoría de ellas son automáticas, otras, tales como la deposición en los secuenciadores, son manuales; por lo tanto, es posible que el operario tenga fallos tales como la inversión de dos secuencias. Este tipo de error tiene una repercusión sobre el procesamiento posterior de los datos, dando como resultado relaciones (entre los contigs) que no existen en realidad, y por lo tanto intentos de dirigir la secuenciación entre los contigs que producirán fallo. Es a causa de esto por lo que la evaluación de la nominación de errores tiene una importancia particular, ya que permite el establecimiento de un mapa de ensamblaje probabilístico a partir del cual se hace posible determinar todos los clones que servirán como plantilla para obtener secuencias que separan dos contigs adyacentes. La Tabla 2 de la solicitud de Patente de Estados Unidos parental con el Nº de serie 60/107078 presentada el 4 de Noviembre de 1998 y la Solicitud Francesa 97-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997, cada una de las cuales se incorpora como referencia en esta memoria en su totalidad, proporciona los clones y las secuencias de los cebadores usados inicialmente durante las operaciones iniciales.

Para evitar la etapa que consiste en ordenar y después preparar los clones por medios microbiológicos convencionales, el software define cebadores externos e internos orientados hacia las regiones que aún no se han secuenciado. Los cebadores determinados de esta manera hacen que sea posible preparar, por PCR, una plantilla que cubra la región no secuenciada. Son los denominados cebadores externos (los más distantes de la región a secuenciar) los que se usan para preparar esta plantilla. La plantilla después se purifica y se obtiene una secuencia en cada una de las 2 cadenas durante dos reacciones de secuenciación que usan uno de los 2 cebadores internos. Para facilitar el uso de esta estrategia, los dos cebadores externos y los dos cebadores internos se preparan y después se almacenan en la misma posición de 4 placas de 96 pocillos diferentes. Las dos placas que contienen los cebadores externos se usan para realizar las PCR que servirán para preparar las plantillas. Estas plantillas se purificarán en columnas de purificación que conservan la topografía de las placas. Cada una de las secuencias se obtendrá usando cebadores situados en una y después en la otra de las placas que contienen los cebadores internos. Esta distribución permite una automatización muy considerable del proceso y tiene como resultado un método que es sencillo de usar para terminar las regiones que aún no se han secuenciado. La Tabla 3 de la solicitud de patente de Estados Unidos parental con el Nº de serie 60/107078 presentada el 4 de Noviembre de 1998 y la Solicitud Francesa 97-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997, cada una de las cuales se incorpora como referencia en esta memoria en su totalidad, proporciona los nombres y las secuencias de los cebadores usados para terminar el proyecto de Chlamydia pneumoniae.

Finalmente, varios contigs existen en una configuración en la que uno de sus extremos no está asociado a ningún otro extremo de contig (Figura 3b) por una relación de clones de conexión (un clon de conexión se define como un clon que tiene un extremo de secuencia en un contig y el otro extremo de su secuencia en otro contig; además, este clon debe proceder de una placa o una subserie de placas con una calidad de denominación adecuada). Para el proyecto de Chlamydia pneumoniae, este caso particular se produjo 24 veces. Se definen dos cebadores de PCR adyacentes que orientan la síntesis del ADN hacia el extremo de la secuencia consenso para cada uno de los extremos huérfanos de la secuencia consenso. El cebador que está más próximo al extremo de la secuencia se denomina cebador interno, mientras que el cebador que está más distante del extremo de la secuencia se denomina cebador externo. Los cebadores externos se usan para explorar la relación mutua entre los extremos huérfanos de los diferentes contigs. La presencia de un solo producto de PCR y la posibilidad de amplificar este producto de forma inequívoca usando los cebadores internos provoca la probable relación entre los contigs sobre los cuales están situados los cebadores que permitieron la amplificación. Esta relación se confirmará por secuenciación y permitirá la conexión entre los extremos huérfanos de las secuencias consenso. Esta estrategia hace que sea posible obtener un mapa completo del cromosoma de Chlamydia pneumoniae y después terminar el proyecto.

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Control de calidad

Se anotaron todas las bases no determinadas con certeza en la secuencia cromosómica y se midió la densidad de incertidumbres en el cromosoma entero. Se anotaron las regiones con una alta densidad de incertidumbres y se extrajeron los cebadores de PCR que abarcaban estas regiones y se representan en la Tabla 4 de la Solicitud de Patente de Estados Unidos parental con el Nº de serie 60/107078 presentada el 4 de Noviembre de 1998 y la Solicitud de Patente Francesa 97-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997, cada una de las cuales se incorpora como referencia en esta memoria en su totalidad.

La secuencia de cada uno de los productos de PCR se obtuvo con dos cebadores operativos diferentes de los cebadores de amplificación. Las secuencias se obtuvieron en las dos direcciones para todas las PCR (100% de éxito).

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Bancos de datos

Se usaron reorganizaciones locales de los bancos públicos principales. El banco de proteínas usado comprende la fusión no redundante del banco Genpept (traducción automática de GenBank, NCBI; Benson et al., 1996).

Se usó el software BLAST entero (dominio público, Altschul et al., 1990) para la búsqueda de homologías entre una secuencia y bancos de datos de proteínas o ácidos nucleicos. Los niveles de significado usados dependen de la longitud y complejidad de la región ensayada así como del tamaño del banco de referencia. Se ajustaron y adaptaron a cada análisis.

Los resultados de la búsqueda de homologías entre una secuencia de acuerdo con la invención y los bancos de datos de proteínas y ácidos nucleicos se presentan y se resumen en la Tabla 1 presentada más adelante.

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Tabla 1

Lista de regiones cromosómicas codificantes y homologías entre estas regiones y los bancos de secuencias

Leyenda de la Tabla 1: las fases de lectura abiertas se identifican con el software GenMark versión 2.3A (GenePro), la plantilla usada es Chlamydia pneumoniae de orden 4 en una longitud de 196 nucleótidos con una ventana de 12 nucleótidos y una señal mínima de 0,5. El marco de lectura ORF291 está numerado en orden de aparición en el cromosoma. Las posiciones del principio y del final se proporcionan en la columna 2 (posición). Cuando la posición del principio es mayor que la posición del final, esto significa que la región se codifica por la cadena complementaria a la secuencia que se proporcionó en la secuencia SEQ ID No. 1.

Todos los supuestos productos se sometieron a una investigación de homología en GENPEPT (liberación 102 para ORF Nº 291) con el software BLASTP (Altschul et al., 1990). Se usaron como parámetros los parámetros por defecto con la excepción del valor E esperado fijado a 10^{-5} (para ORF Nº 291). Posteriormente, solo se tuvieron en cuenta las identidades mayores de 30% (columna I%). La descripción de la secuencia más homóloga se proporciona en la columna de Homología; el identificador para la última secuencia se proporciona en la columna ID y la especie de animal a la que pertenece esta secuencia se proporciona en la columna de Especie. La puntuación de homología se evalúa por la suma de las puntuaciones blast para cada región de homología y se presenta en la columna de Puntuación.

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Materiales y métodos para dominios transmembrana

El software DAS se usó como recomiendan los autores (Cserzo et al., 1997).

Este método usa, para predecir los dominios transmembrana, plantillas derivadas de un muestreo de proteínas seleccionadas. Se tuvieron en cuenta todas las regiones para las que se encontró un "Límite" mayor de 1,5 por el programa.

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Otros programas para encontrar ORF

Para este análisis se usaron dos programas para encontrar ORF adicionales para predecir las fases de lectura abierta potenciales de una longitud mínima de 74 aminoácidos; Glimmer (Slazberg, S.L., Delcher, A., Kasif, S., y W. White, 1998. Microbial gene identification using interpolated Markov models. Nucleic Acids Res. 26: 544-548), y un programa interno escrito. El programa interno usó un algoritmo de búsqueda muy sencillo. El análisis requería que el texto de la secuencia de ADN genómico estuviera en la dirección 5' a 3', que el genoma fuera circular y que TAA y TAG y TGA fueran codones de parada (codones stop). Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes:

(1): Se realizó una búsqueda de un ORF que empezaba con un codón GTG. Si no se encontraban codones GTG, se realizaba una búsqueda de un codón ATG. Sin embargo, si se encontraba un codón GTG entonces se realizaba una búsqueda cadena debajo de un codón ATG. Se registraron todas las posiciones de nucleótidos de inicio y parada.

(2): Se realizó una búsqueda de un ORF que empezaba con un codón TTG. Si no se encontraban codones TTG, se realizaba una búsqueda de un codón ATG. Sin embargo, si se encontraba un codón TTG se realizaba una búsqueda cadena debajo de un codón ATG. Se registraron todas las posiciones de nucleótidos de inicio y parada.

(3): El análisis descrito en las etapas 1 y 2 se repitió para la cadena opuesta de la secuencia de ADN.

(4): Se realizó una búsqueda de ORF que determinaba todas las longitudes de ORF usando posiciones de inicio y parada en las mismas fases de lectura.

(5): Todos los ORFs cuya longitud de ADN era menor de 225 nucleótidos se eliminaron de la búsqueda.

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Criterios de búsqueda de proteínas expuestas en la superficie

Las posibles dianas de vacunas de la superficie celular son proteínas de la membrana externa tales como porinas, lipoproteínas, adhesinas y otras proteínas no integrales. En Chlamydia psittaci, los inmunógenos principales son un grupo de supuestas proteínas de la membrana externa (POMP) y no se han encontrado homólogos en Chlamydia pneumoniae y Chlamydia trachomatis por análisis tradicional (Longbottom, D., Russell, M., Dunbar, S.M., Jones, G.E., y A.J. Herring. 1998. Molecular Cloning and Characterization of the Genes Coding for the Highly Immunogenic Cluster of 90-Kilodalton Envelope Proteins from Chlamydia psittaci Subtype That Causes Abortion in Sheep. Infect Immun 66: 1317-1324). En Chlamydia pneumoniae se han identificado varias supuestas proteínas de la membrana externa, de las que todas pueden representar candidatos de vacuna. Se ha encontrado el gen de la proteína principal de la membrana externa (MOMP) (omp1) en diversos aislados de Chlamydia pneumoniae (Jantos, CA., Heck, S., Roggendorf, R., Sen-Gupta, M., y Hegemann, JH. 1997. Antigenic and molecular analyses of different chlamydia pneumoniae strains. J. Clin Microbiology 35(3): 620-623). Se usaron varios criterios, como se indica más adelante, para identificar supuestos ORFs expuestos en la superficie a partir de la secuencia de ADN genómico de Chlamydia pneumoniae (Solicitud de Patente Francesa 91-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997). En esta categoría se indicó cualquier ORF que cumpliera uno o más de los criterios individuales.

Se realizaron búsquedas de homología de proteínas usando la herramienta Blastp 2.0 (Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J. Zhang, Z., Miller, W., y D.J. Lipman. 1997. Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Un producto de ORF estaba expuesto en la superficie marcado si había homología con una proteína expuesta en la superficie conocida, hipotética o supuesta con una puntuación P mejor que e^{-10}.

La mayoría, si no todas las proteínas que se localizan en la membrana de las bacterias, a través de una ruta secretora, contienen un péptido señal. Un programa de software SignalP analiza la secuencia de aminoácidos de un ORF para este péptido señal (Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6). Los primeros 60 aminoácidos N-terminales de cada ORF se analizaron por SignalP usando la base de datos del software Gram-Negative. El resultado genera cuatro valores separados, C máxima, Y máxima, S máxima y S media. La puntuación S, o región señal, es la probabilidad de la posición que pertenece al péptido señal. La puntuación C, o sitio de escisión, es la probabilidad de la posición que está la primera en la proteína madura. La puntuación Y es la media geométrica de la puntuación C y un derivado suavizado de la puntuación S. Cerca de cada puntuación se proporciona una conclusión de Sí o No. Si las cuatro conclusiones son Sí y el aminoácido C-terminal es una fenilalanina (F) o una tirosina (Y), el producto de ORF es de la membrana externa marcada (Struyve, M., Moons, M., y J. Tommassen. 1991. Carboxy-terminal Phenylalanine is Essential for the Correct Assembly of a Bacterial Outer Membrane Protein. J. Mol. Biol. 218: 141-148).

El programa denominado Psort determina la localización de una proteína basada en su secuencia señal, reconocimiento de segmentos transmembrana y análisis de su composición de aminoácidos (Nakai, K., y M. Kanehisa. 1991. Expert system for predicting protein localization sites in gram-negative bacteria. Proteins 11:95-110). Un producto de ORF se considera una proteína de la membrana externa si los datos producidos predicen que la proteína es de la membrana externa con un valor de certidumbre de 0,5 o mejor y cuyo valor es al menos dos veces mayor que el siguiente valor de certidumbre localizado previsto.

Finalmente, se analizaron adicionalmente productos de ORF que no se consideraron de la membrana externa o expuestos en la superficie basándose en los criterios anteriores. Los datos del resultado de blastp para estos ORFs se buscaron usando diversas palabras clave generales y específicas, sugerentes de proteínas expuestas en la superficie celular conocidas. Un ORF estaba expuesto en la superficie marcada si las palabras claves correspondientes tenían un acierto Blastp, tenían una puntuación de P mejor que e^{-10} y no había datos mejores que indicaran otra cosa. A continuación se proporciona una lista de las palabras clave buscadas

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Se incluyeron los ORFs que no cumplían los requisitos mínimos para ser una proteína de la membrana externa basándose en los criterios de búsqueda anteriores pero que eran homólogas a ORF de la membrana externa identificadas en Chlamydia trachomatis. El genoma de Chlamydia trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y 97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997) se analizó usando los criterios de búsqueda anteriores y se identificaron varios ORFs de membrana externa. Estos ORFs de Chlamydia trachomatis después se ensayaron frente al genoma de Chlamydia pneumoniae usando Blastp. En esta sección se incluyó cualquier ORF de Chlamydia pneumoniae con un valor P de Blastp P mejor que e^{-10} contra la membrana externa de Chlamydia trachomatis, si no había ningún dato mejor que indicara otra cosa. En la memoria descriptiva se ha indicado anteriormente una lista de ORFs en el genoma de Chlamydia pneumoniae que codifica supuestas proteínas expuestas en la superficie.

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Identificación de supuestas lipoproteínas en el genoma de Chlamydia pneumoniae

Las lipoproteínas son las proteínas secretoras bacterianas modificadas después de la traducción más abundantes (Pugsley, A.P., 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108). Los rasgos característicos de las lipoproteínas son un diacilglicérido unido a tiol y un grupo monoacilo unido a amina en la cisteína que se convierte en el resto amino-terminal después de la escisión del péptido señal por la Peptidasa Señal II. (Pugsley, A. P., 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57:50-108). La identificación de supuestas lipoproteínas a partir de la secuenciación genómica de Chlamydia pneumoniae se realizó examinando la secuencia de aminoácidos deducida de ORF identificadas con respecto a la presencia de un péptido señal con un sitio de escisión de la Peptidasa Señal II análogo a la secuencia consenso para la modificación de prolipoproteínas y reacciones de procesamiento (Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992. Identification and characterization of lipid-modified proteins in bacteria, p. 261-285. En N.M. Hooper y A.J. Turner (ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York: Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Gram-positive bacteria J. Bacteriol. 177:1123-1128).

Inicialmente se seleccionaron ORF de Chlamydia pneumoniae con respecto a las características más básicas de las lipoproteínas, una cisteína en los primeros 30 aminoácidos de la proteína deducida. Se seleccionaron ORF con codón de iniciación convencional (ATG, GTG o TTG) y que tenían una o más de las siguientes características para análisis directo de sus primeros 30 aminoácidos:

(a): Valor de P Señal significativo (al menos dos de los cuatro valores son Sí)

(b): Valor PSORT que indica el paso a través de la membrana (IM-membrana interna, Peri-periplasma u OM membrana externa)

(c): Identificación de la palabra lipoproteína entre la serie de datos de Blastp de ORF.

(d): Un valor Blastp de <e^{-10} con una supuesta lipoproteína de Chlamydia trachomatis (Solicitudes Francesas 97-15041 presentada el 28 de Noviembre de 1997 y 97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997).

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Los primeros 30 aminoácidos de cada ORF de esta serie se analizaron para determinar las características encontradas comúnmente en péptidos señal de lipoproteínas (Pugsley, A.P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108; Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992. Identification and characterization of lipid- modified proteins in bacteria, p. 261-285. En N. M. Hooper y A. J. Turner (ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York, Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Gram positive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123-1128.) Se requería que los supuestos péptidos señal de lipoproteína tuvieran una cisteína entre el aminoácido 10 y 30 y alcanzaran una puntuación mínima de tres basándose en los siguientes criterios para péptidos señal de lipoproteínas:

(a): Identificación de aminoácidos específicos en posiciones específicas alrededor de la cisteína que forman parte del sitio de escisión consenso de la Peptidasa Señal II (Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992. Identification and characterization of lipid-modified proteins in bacteria, p. 261-285. En N. M. Hooper y A. J. Turner (ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York); Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123-1128). Como la identificación del sitio de escisión es el factor más importante para identificar supuestas lipoproteínas, cada aminoácido colocado correctamente contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.

(b): Una región hidrófoba rica en alanina y leucina antes del sitio de escisión (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108) contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.

(c): Un tramo corto de aminoácidos hidrófilos mayor o igual a 1, normalmente lisina o arginina después de la metionina N-terminal (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108) contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.

En la memoria descriptiva se ha indicado anteriormente una lista de ORF en el genoma de Chlamydia pneumoniae que codifican supuestas lipoproteínas.

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ORFs de Chlamydia pneumoniae relacionados con LPS

El lipopolisacárido (LPS) es un antígeno de superficie clave importante de células del género Chlamydia. Se han identificado anticuerpos monoclonales (Mab) dirigidos contra LPS de Chlamydia pneumoniae que pueden neutralizar la infectividad de Chlamydia pneumoniae tanto in vitro como in vivo (Peterson, E. M., de la Maza, L.M., Brade, L., Brade, H. 1998. Characterization of a Neutralizing Monoclonal Antibody Directed at the Lipopolysaccharide of Chlamydia pneumoniae. Infect. Immun. Aug. 66(8): 3848-3855.) El LPS de Chlamydia está compuesto de lípido A y una porción de oligosacárido nuclear y es fenotípicamente de tipo rugoso (R-LPS) (Lukacova, M., Baumann, M., Brade, L., Mamat, U., Brade, H. 1994. Lipopolysaccharide Smooth-Rough Phase Variation in Bacteria of the Genus Chlamydia. Infect. Immun. Jun. 62(6): 2270-2276.) El componente del lípido A está compuesto de ácidos grasos que sirven para anclar el LPS en la membrana externa. El componente del núcleo contiene azúcares y derivados de azúcar tales como un trisacárido de ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico (KDO) (Reeves, P.R., Hobbs, M., Valvano, M. A., Skurnik, M., Whitfield, C., Coplin, D., Kido, N., Klena, J., Maskell, D., Raetz, C.R.H., Rick, P.D. 1996. Bacterial Polysaccharide Synthesis and Gene Nomenclature páginas 10071-10078, Elsevier Science Ltd.). El producto del gen KDO es una glicosiltransferasa multifuncional y representa un epítopo compartido entre las clamidias. Como revisión de la biosíntesis de LPS véase, por ejemplo, Schnaitman, C.A., Klena, J.D. 1993. Genetics of Lipopolysaccharide Biosynthesis in Enteric Bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682.

Una búsqueda de texto de los resultados de blastp de ORF identificó varios genes que están implicados en la producción de LPS en clamidias con una puntuación P mejor que e^{-10}. En la búsqueda de texto se usaron los siguientes términos clave: KDO, CPS (Biosíntesis de Polisacárido Capsular), cápsula, LPS, rfa, rfb, rfc, rfe, rha, rhl, núcleo, epimerasa, isomerasa, transferasa, pirofosforilasa, fosfatasa, aldolasa, heptosa, mano, glucosa, lpxB, fibronectina, fibrinógeno, fucosiltransferasa, lic, lgt, pgm, tolC, rol, ChoP, fosforilcolina, waaF, PGL-Tb1. En la memoria descriptiva se ha indicado anteriormente una lista de ORFs en el genoma de Chlamydia pneumoniae que codifican supuestos polipéptidos implicados en la biosíntesis de LPS.

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Tipo III y otros productos secretados

La secreción de tipo III permite que las bacterias gram-negativas secreten e inyecten proteínas de patogenicidad en el citosol de células hospedadoras eucariotas (Hueck, C. J., 1998. Type III Protein Secretion Systems in Bacterial Pathogens of Animals and Plants. En Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62: 379-433). Estos factores secretados a menudo se parecen a factores de transducción de señales eucarióticos, permitiendo de esta manera que las bacterias redirijan las funciones de la célula hospedadora (Lee, C.A., 1997. Type III secretion systems: machines to deliver bacterial proteins into eukariotic cells? Trends Microbiol. 5: 148-156). Sin embargo, en un intento de alterar las funciones celulares normales, los factores de patogenicidad de Chlamydia inyectados en el citosol del hospedador, como constituyentes citoplásmicos, se procesarán y presentarán en el contexto del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC de clase I). Como tales, estas proteínas de patogenicidad representan antígenos del MHC de clase I y jugarán un papel importante en la inmunidad celular. En esta serie también se incluyen productos secretados que no son de tipo III que pueden jugar un papel como componentes de vacuna.

Una búsqueda de textos de los resultados de blastp de ORF identificó genes que están implicados en la secreción de proteínas de Chlamydia pneumoniae con una puntuación P mejor que e^{-10}. En la búsqueda de textos se usaron los siguientes términos clave con la intención de identificar productos localizados en la superficie o secretados: Yop, Lcr, Ypk, Exo, Pcr, Pop, Ipa, Vir, Ssp, Spt, Esp, Tir, Hrp, Mxi, hemolisina, toxina, IgA proteasa, citolisina, tox, hap, secretado y Mip.

Los ORFs de Chlamydia pneumoniae que no cumplieron los criterios de búsqueda de palabras clave anteriores, pero tienen homólogos en Chlamydia trachomatis que cumplen los criterios de búsqueda, se incluyen aquí. El genoma de Chlamydia trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y 97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997) se analizó usando los criterios de búsqueda anteriores y se identificaron varios ORFs. Estos ORFs de Chlamydia trachomatis se ensayaron frente al genoma de Chlamydia pneumoniae usando Blastp. Se incluyó cualquier ORF de Chlamydia pneumoniae con un valor P de Blastp < e^{-10} frente a un homólogo de Chlamydia trachomatis, identificado usando los criterios de búsqueda anteriores. En la memoria descriptiva se proporciona una lista de ORFs en el genoma de Chlamydia pneumoniae que codifica supuestas proteínas secretadas.

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Chlamydia pneumoniae: Secuencia de reconocimiento de RGD

Las proteínas que contienen un sitio de unión a Arg-Gly-Asp (RGD), junto con las integrinas que sirven como su receptor, constituyen un sistema de reconocimiento fundamental para la adhesión celular. La secuencia RGD es el sitio de unión celular de un gran número de proteínas de la matriz extracelular adhesivas, proteínas sanguíneas y proteínas de la superficie celular y casi la mitad de las integrinas conocidas reconocen esta secuencia en sus ligandos de proteínas de adhesión. Hay muchas proteínas microbianas que contienen RGD tales como la proteína pentona de adenovirus, el virus coxsackie, el virus de la fiebre aftosa y la pertactina, una proteína de superficie de 69 kDa (kilodaltons) de Bordetella pertussis, que sirven como ligandos a través de los cuales estos microbios se unen a las integrinas en la superficie celular y entran en la célula. A continuación se proporcionan pruebas que confirman la importancia de RGD en la adhesión microbiana:

a): La proteína base de la pentona de adenovirus tiene una actividad de redondeo celular y cuando se expresaba la base pentona en E. coli, producía un redondeo celular y las células se adherían a pocillos de poliestireno recubiertos con la proteína. El análisis de mutantes demostró que estas propiedades requerían una secuencia RGD. Los virus mutantes con sustituciones de aminoácidos en la secuencia RGD mostraron una adherencia mucho menor a células HeLa S3, y también estaban retrasados en la reproducción de los virus (Bai, M., Harfe, B., y Freimuth, P. 1993. Mutations That Alter an RGD Sequence in the Adenovirus Type 2 Penton Base Protein Abolish Its Cell-Rounding Activity and Delay Virus Reproduction in Flat Cells. J. Virol. 67: 5198-5205).

b): Se ha demostrado que la unión y entrada de virus coxsackie A9 a células GMK dependía de un motivo RGD en la proteína de la cápsida VP1. También se ha demostrado que VP1 se une a la integrina \alpha_{\gamma}\beta_{3}, que es un receptor de vitronectina (Roivainen, M, Piirainen, L., Hovi, T., Virtanen, I., Riikonen, T., Heino, J., y Hyypia, T. 1994. Entry of Coxsackievirus A9 into Host Cells: Specific Interactions with a_{\gamma}b_{3} Integrin, the Vitronectin Receptor Virology, 203: 357-65).

c): Durante el transcurso de la tos ferina, la Bordetella pertussis interacciona con macrófagos alveolares y otros leucocitos en el epitelio respiratorio. Las bacterias enteras se adhieren por medio de dos proteínas, la hemaglutinina filamentosa (FHA) y la toxina pertussis. La FHA interacciona con dos clases de moléculas presentes en los macrófagos, glicoconjugados que contienen galactosa y la integrina CR3. La interacción entre CR3 y FHA implica el reconocimiento de la secuencia RGD en las posiciones 1097-1099 en FHA (Relman, D., Tuomanen, E., Falkow, S., Golenbock, D. T., Saukkonen, K., y Wright, S. D. "Recognitition of a Bacterial Adhesin by an Integrin: Macrophage CR3 Binds Filamentous Hemagglutinin of Bordetella Pertussis". Cell, 61: 1375-1382 (1990)).

d): Se ha demostrado que la pertactina, una proteína de la membrana externa de 69 kDa de Bordetella pertussis, promueve la unión de células de ovario de hámster Chino (CHO). Esta unión está mediada por el reconocimiento de la secuencia RGD en la pertactina por integrinas de las células CHO y puede inhibirse por homólogos de péptidos que contienen RGD sintéticos al presente en la pertactina (Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J. G., Charles, I. G., Fairweather, N., Novotny, P., y Brennan, M. J. 1991. Pertactin, an Arg-Gly-Asp containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 345-349).

e): La secuencia RGD está muy conservada en la proteína VP1 del virus de la tos ferina (FMDV). La unión de FMDV a células renales de cría de hámster (BHK), según se ha demostrado, está mediada por la proteína VP1 a través de la secuencia RGD. Los anticuerpos contra la secuencia RGD de VP1 bloqueaban la unión del virus a células BHK (Fox, G., Parry, N. R., Barnett, P. V., McGinn, B., Rowland, D. J., y Brown, F. 1989. The Cell Attachment Site on Foot-and-Mouth Disease Virus Includes the Amino Acid Sequence RGD (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) J. Gen. Virol., 70: 625-637).

Se ha demostrado que la adherencia bacteriana puede basarse en una interacción de una secuencia RGD de adhesina bacteriana con una integrina y que las adhesinas bacterianas pueden tener múltiples sitios de unión característicos de proteínas de la matriz extracelular eucariótica. El reconocimiento de RGD es uno de los mecanismos importantes usados por los microbios para entrar en las células eucariotas.

Se buscó la presencia de la secuencia RGD en la secuencia proteica deducida completa del genoma de Chlamydia pneumoniae. Hubo un total de 54 ORF que tenían una o más secuencias RGD. No todas las proteínas que contienen RGD median la unión celular. Se ha demostrado que los péptidos que contienen RGD que tienen prolina inmediatamente después de la secuencia RGD son inactivos en ensayos de unión de células (Pierschbacher & Ruoslahti. 1987. Influence of stereochemistry of the secuence Arg-Gly-Asp-Xaa on binding specificity in cell adhesion. J. Biol. Chem. 262: 17294-98). Se excluyeron de la lista las ORF que tenían RGD, con prolina como aminoácido siguiente a la secuencia RGD. Además, la secuencia RGD puede no estar disponible en la superficie de la proteína y puede estar presente en un contexto que no es compatible con la unión de la integrina. Como no todas las proteínas que contienen RGD están implicadas en la unión de células, se usaron otros criterios para perfeccionar la lista de proteínas que contienen RGD. En la memoria descriptiva se proporciona una lista de ORF del genoma de Chlamydia pneumoniae que codifican polipéptidos con una o más secuencias de reconocimiento RGD.

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ORFs no pertenecientes a Chlamydia trachomatis

Se compararon ORFs de Chlamydia pneumoniae con los ORFs del genoma de Chlamydia trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y 97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997) usando Blastp. En esta sección se incluye cualquier ORF de Chlamydia pneumoniae con un valor P de Blastp peor que e^{-10} (es decir > e^{-10}) frente a los ORFs de Chlamydia trachomatis. En la memoria descriptiva se ha indicado anteriormente una lista de los ORFs del genoma de Chlamydia pneumoniae que no se encuentran en Chlamydia trachomatis.

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ORFs de superficie de anclaje a la pared celular

Muchas proteínas de la superficie se anclan a la pared celular de bacterias Gram-positivas a través del motivo LPXTG conservado (Schneewind, O., Fowler, A., y Faull, K.F. 1995. Structure of the Cell Wall Anchor of Surface Proteins in Staphylococcus aureus. Science 268: 103-106). Se realizó una búsqueda de los ORFs de Chlamydia pneumoniae usando el motivo LPXTG. En la memoria descriptiva se proporciona una lista de ORFs en el genoma de Chlamydia pneumoniae que codifican polipéptidos anclados a la pared celular.

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Depósitos ATCC

Se depositaron muestras de Chlamydia pneumoniae en la American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, Maryland, el 19 de Noviembre de 1998 y recibieron el número de acceso 1360-VR. Las células pueden cultivarse, recogerse y purificarse, y el ADN puede prepararse como se ha descrito anteriormente. Para permitir la recuperación de fragmentos específicos del cromosoma, se pueden realizar reacciones PCR dirigidas, cuyos productos de amplificación después pueden secuenciarse y/o clonarse en cualquier vector adecuado, de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos para los especialistas en la técnica.

Además, se depositó una muestra de tres grupos de clones que cubrían las regiones cromosómicas de interés en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, el 19 de Noviembre de 1998. Cada conjunto de clones contiene una serie de clones. Cuando se toman conjuntamente, los tres conjuntos de la muestra cubren una porción del cromosoma, con una redundancia ligeramente mayor de dos. El número total de clones en la muestra es 196.

Los clones cubren las tres siguientes regiones de interés:

(i): posición 30.000 a 40.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región A;

(ii): posición 501.500 a 557.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región B; y

(iii): posición 815.000 a 830.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región C.

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La Tabla 4 indica un grupo de oligonucleótidos a usar para amplificar el ORF 291 de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos para los especialistas en la técnica. Estos oligonucleótidos se listan como SEQ ID No. 1956, 1957, 4460 y 4461. Para cada ORF, se indica lo siguiente: un cebador directo colocado 2.000 pb cadena arriba del inicio del ORF; un cebador directo colocado 200 pb cadena arriba del inicio del ORF; un cebador inverso colocado 2.000 pb cadena abajo al final del ORF, que está 2.000 pb cadena arriba del sitio final del ORF en la cadena complementaria; y un cebador inverso 200 pb cadena arriba al final del ORF, que está 200 pb cadena arriba del sitio final del ORF en la cadena complementaria. Los números correspondientes para los cebadores se indican en la Tabla 4, donde Fp es el cebador directo proximal; Fd es el cebador directo distal; Bp es el cebador inverso proximal; y Bd es el cebador inverso distal. Las posiciones de los extremos 5' de cada uno de estos cebadores en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1 se muestran en la Tabla 5.

2

TABLA 2

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TABLA 4

4

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TABLA 5

5

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<110> SERONO GENETICS INSTITUTE SA

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<120> Polipéptido de la membrana externa de Chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y usos del mismo, en particular para el diagnóstico, prevención y tratamiento de una infección

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<151> 1997-11-21

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<160> 6

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<210> ORF 291

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<211> 825

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<212> DNA

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<213> Chlamydia pneumoniae

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<400> ORF291

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<220>

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<223> Comienzo: posición nt323190, final: posición nt322366 (véase Tabla 2) en la secuencia del genoma completo SEQ ID No. 1 descrita en la solicitud de patente madre W099/27105

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6

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<210> SEQ ID No.291

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<211> 275

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<212> PRT

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<213> Chlamydia pneumoniae

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<400> SEQ ID No.291

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7

8

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<210> SEQ ID No.1956

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<211> 20

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<212> DNA

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<400> SEQ ID No.1956

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcagcata agtgctacta

\hfill

20

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<210> SEQ ID No.1957

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<211> 20

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<212> DNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> SEQ ID No.1957

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccttggcg tgtaggaatia

\hfill

20

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<210> SEQ ID No.4460

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<400> SEQ ID No. 4460

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaaagcta tccacagctc

\hfill

20

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<210> SEQ ID No.4461

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<211> 20

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<212> DNA

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<400> SEQ ID No.4461

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccagggattt gtcaaggaac

\hfill

20

Claims

1. Un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto (ORF) de un genoma de Chlamydia pneumoniae, que comprende:

(a): la secuencia de nucleótidos ORF291 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 291;

(b): una secuencia de nucleótidos que exhibe una identidad de al menos 80% con la secuencia de la SEQ ID No. 291; o

(c): una secuencia complementaria de la misma.

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2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que codifica los siguientes polipéptidos o fragmentos de los mismos:

(a): un polipéptido de Chlamydia pneumoniae de la envuelta celular, preferiblemente de la envuelta celular externa;

(b): un polipéptido de la transmembrana de Chlamydia pneumoniae que tiene entre 1 y 3 dominios de la transmembrana;

(c): un polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae;

(d): una lipoproteína de Chlamydia pneumoniae; o

(e): un polipéptido de Chlamydia pneumoniae que no se encuentra en Chlamydia trachomatis.

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3. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, ligado en marco a un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo.

4. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3, operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión de los genes.

6. Una célula hospedadora tratada mediante ingeniería genética, que contiene el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una célula hospedadora tratada mediante ingeniería genética, que contiene el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3, operativamente asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión de los genes en la célula hospedadora.

8. Un método para producir un polipéptido, que comprende:

(a): cultivar la célula hospedadora tratada mediante ingeniería genética de la reivindicación 6 ó 7, en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el polinucleótido; y

(b): recuperar el polipéptido del cultivo.

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9. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3.

10. El polipéptido de la reivindicación 9, que comprende los siguientes polipéptidos o fragmentos de los mismos:

(c): un polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae;

(d): una lipoproteína de Chlamydia pneumoniae; o

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11. Una proteína de fusión, codificada por el polinucleótido de la reivindicación 9 ó 10.

12. El polipéptido de las reivindicaciones 9 a 11, que inmunorreacciona con suero seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia pneumoniae.

13. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al polipéptido de la reivindicación 9 ó 10.

14. Un método para la detección y/o la identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra biológica, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra con un cebador de polinucleótidos que se híbrida específicamente con el polinucleótido ORF291, o una secuencia complementaria del mismo, en presencia de una enzima polimerasa y nucleótidos en condiciones que permiten la extensión del cebador; y

(b): detectar la presencia de productos de extensión del cebador en la muestra, en que la detección de productos de extensión del cebador indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.

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15. Un método para la detección y/o la identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra biológica, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra con una sonda de polinucleótidos que se híbrida específicamente con el polinucleótido ORF291, o una secuencia complementaria del mismo, en condiciones que permiten la hibridación de pares de bases complementarios; y

(b): detectar la presencia de complejos de hibridación en la muestra, en que la detección de complejos de hibridación indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.

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16. Un método para la detección y/o identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra biológica, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 13, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes; y

(b): detectar la presencia de complejos inmunes en la muestra en la que la detección de complejos inmunes indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.

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17. Un método para la detección y/o identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra biológica, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra con un polipéptido de las reivindicaciones 9 y 10, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes; y

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18. Un chip de ADN que contiene una serie de polinucleótidos que comprenden al menos uno de los polinucleótidos de la reivindicación 1 a 3.

19. Un chip de proteína que contiene una serie de polinucleótidos que comprenden al menos uno de los polinucleótidos de la reivindicación 9 ó 10.

20. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición inmunogénica de ADN que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4 ó 5.

22. La composición de ADN de la reivindicación 21, en donde la composición de ADN dirige la expresión de un epítopo neutralizante de Chlamydia pneumoniae.

23. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12, o un anticuerpo de la reivindicación 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

\newpage

24. Composición para el tratamiento o la prevención de una infección por Chlamydia pneumoniae, comprendiendo dicha composición:

a): un polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3;

b): un polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12;

c): un anticuerpo de la reivindicación 13;

d): un vector de las reivindicaciones 4 y 5; o

e): una célula hospedadora de las reivindicaciones 6 y 7.

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25. Una composición de la reivindicación 24, en forma de una vacuna.

26. Un ensayo de selección, que comprende:

(a): poner en contacto un compuesto de ensayo con un polinucleótido aislado de las reivindicaciones 9 y 10; y

(b): detectar si se produce una unión.

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27. Un kit que comprende un recipiente que contiene un polinucleótido aislado de las reivindicaciones 1 a 3, o un cebador o una sonda capaz de hibridarse específicamente con un polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido aislado de las reivindicaciones 9 y 10 o un anticuerpo de la reivindicación 13.