ES2352001T3

ES2352001T3 - Procedimiento de extracción sin disolvente.

Info

Publication number: ES2352001T3
Application number: ES01942672T
Authority: ES
Inventors: Swithin Patrick Adu-Peasah; Brian S. Engelhardt; Craig M. Ruecker; George T. Veeder, Iii
Original assignee: Martek Biosciences Corp
Current assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2011-02-14
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: US6750048B2; US20020001833A1; KR101429236B1; PL356587A1; AU2012200890B2; AU2005202980C1; AU2963601A; EP2302065A1; NO20023449D0; IL206960A0; US20080044875A1; BR0107699B1; JP4537887B2; KR20120070588A; MX297659B; CA2772540A1; US7662598B2; AU2019226124A1; HK1050716A1; KR101429238B1

Abstract

Procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, que comprende: (a) tratar las células de los microorganismos que se desarrollaron en un medio de fermentación para liberar los lípidos intracelulares, en el que el tratamiento comprende el calentamiento de las células, la exposición de las células a condiciones básicas, y la exposición de las células a un compuesto quelante o sus combinaciones; (b) producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada en el que dicha capa pesada comprende una fase acuosa y una capa ligera en el que dicha capa ligera comprende dichos lípidos mediante separación gravitacional del producto de la etapa (a) (c) separar dicha capa pesada de dicha capa ligera (d) tratar dicha fase ligera para romper una emulsión formada entre dichos lípidos y agua; y (e) obtener dichos lípidos a partir de dicha capa ligera, en el que el procedimiento utiliza menos de 5% de un disolvente orgánico no polar, mientras que se evita la extracción del disolvente orgánico para obtener el lípido.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para extraer lípidos de microorganismos sin la utilización de cualquier cantidad significativa de un disolvente orgánico no polar.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un típico procedimiento para la preparación de lípidos de un microorganismo, tal como la producción del ácido graso altamente insaturado omega-3, y en particular, de una mezcla lipídica rica en ácido docosahexaenoico (DHA), implica el desarrollo de microorganismos que pueden producir el lípido deseado en un fermentador, estanque, o biorreactor, aislando la biomasa microbiana, secándola, y extrayendo lípidos intracelulares con un disolvente orgánico no polar, por ejemplo, hexano. Generalmente, los lípidos intracelulares de los microorganismos se extraen después de fragmentar (por ejemplo, lisando) las células secas de los microorganismos. Los lípidos extraídos pueden refinarse posteriormente para producir lípidos de una gran pureza y/o calidad. Los microorganismos se aíslan generalmente diluyendo el caldo fermentativo con agua, en primer lugar, y centrifugando (entonces) la mezcla para aislar los microorganismos. Las células se secan entonces y si los lípidos no se extraen inmediatamente o poco después, las células se empaquetan, por ejemplo, en bolsas (recipientes) precintadas al vacío, para evitar la degradación lipídica.

Desafortunadamente, el proceso de secado expone los microorganismos al calor, el cual puede dañarlos, por ejemplo, degradar la calidad de los lípidos, si (dicho proceso) se lleva a cabo de forma incorrecta. Las bolsas precintadas al vacío pueden desarrollar grietas, lo cual puede degradar posteriormente la calidad de los lípidos, debido a la exposición al aire de los microorganismos. Además, si los microorganismos que se han secado no se tratan con un antioxidante, los lípidos pueden degradarse posteriormente debido a la exposición al aire y o/a la luz. Por ejemplo, los carotenoides, xantófilas y ácidos grasos de cadena larga, como DHA, pueden degradarse, debido a la oxidación por el aire y/o la luz. Además, en algunos casos, los operarios que están expuestos a los microorganismos que se han sometido a secado, pueden desarrollar una reacción alérgica que crea un riesgo de seguridad y/o sanitario a los operarios.

Además, en una producción a escala industrial, la gran cantidad de disolventes orgánicos no polares volátiles e inflamables que se utilizan en la extracción lipídica, pueden crear condiciones operativas peligrosas. La utilización de disolventes orgánicos no polares en el procedimiento de extracción, puede requerir la utilización de un sistema de recuperación del aceite a prueba de explosión, que se añade, por lo tanto, al coste de la recuperación lipídica. Además, la utilización de un disolvente orgánico no polar para la extracción de los lípidos a partir de microorganismos, genera una corriente de residuos de disolventes orgánicos no polares que necesita un procedimiento apropiado de disposición, que aumenta posteriormente el coste productivo total de la extracción lipídica.

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Por tanto, es necesario un procedimiento de extracción lipídica a partir de microorganismos que no requiera la utilización de un disolvente orgánico no polar. También es necesario un procedimiento para la extracción lipídica a partir de los microorganismos que no requiera la cara etapa de secado de los microorganismos previa a la extracción.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención es tal como se describe en las reivindicaciones. Se da a conocer un procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, que comprende:

(a): la lisis de células de microorganismos para producir una mezcla celular lisada.

(b): el tratamiento de la mezcla celular lisada para producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada y una capa ligera rica en lípidos;

(c): la separación de la capa pesada de la capa ligera rica en lípidos; y

(d): obtener los lípidos y/o las fracciones lipídicas a partir de la capa ligera.

Se da a continuación a conocer un procedimiento para obtener lípidos para microorganismos, que comprende:

(a): desarrollar microorganismos en un medio de cultivo;

(b): tratar dicho medio de cultivo y las células microbianas para liberar los lípidos intercelulares;

(c): someter el medio de cultivo que contiene los lípidos intercelulares liberados a separación gravitacional, para formar una fase ligera que contiene lípidos y una fase pesada;

(d): separar dicha fase ligera de dicha fase pesada;

(e): tratar dicha fase ligera para romper una emulsión que se ha formado entre dichos lípidos y el agua; y

(f): recuperar un lípido en bruto.

Se da a continuación a conocer un procedimiento para proporcionar la recuperación de lípidos a partir de microorganismos, que comprende las etapas que consisten en:

(a): desarrollar dichos microorganismos en un medio de cultivo;

(b): tratar las células de los microorganismos de dicho medio de cultivo sin secar dichas células, para liberar los lípidos intercelulares;

(c): someter el medio de cultivo que contiene los lípidos intercelulares liberados a separación gravitacional, para formar una fase ligera que contiene lípidos y una

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fase pesada;

(d): separar dicha fase ligera de dicha fase pesada;

(f): recuperar un lípido en bruto.

Preferentemente, los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación en un fermentador. Alternativamente, los microorganismos pueden cultivarse fotosintéticamente, en un fotobiorreactor o estanque. Preferentemente, los microorganismos son microorganismos ricos en lípidos, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por algas, bacterias, hongos y protistas, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por algas doradas, algas verdes, dinoflagelados, levaduras, hongos del género Mortierella,y Stramenopiles. Preferentemente, los microorganismos comprenden microorganismos del género Mortierella, género Crypthecodinium, y orden Thraustochytriales, y más preferentemente, son seleccionados microorganismos a partir del género Thraustochytrium, Schizochytrium o sus mezclas, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por microorganismos que tienen las características identificadoras de ATCC nº 20888, ATCC nº 20889, ATCC nº 20890, ATCC nº 20891 y ATCC nº 20892, cepas de Mortierella schmuckerii, cepas de Crypthecodinium cohnii, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas.

El tratamiento de las células incluye un tratamiento para liberar los lípidos, tal como la lisis, la ruptura o la permeabilización. Tal como se utiliza en la presente Memoria, los términos lisis, lisar, lisado, etc., se utilizarán genéricamente para referirse a un tratamiento para liberar los lípidos intercelulares, que incluye la ruptura o la permeabilización de las células. Preferentemente, el tratamiento se selecciona a partir del grupo formado por el calentamiento de las células, su exposición a condiciones básicas, exponiéndolas a un compuesto quelante o a sus combinaciones. Más preferentemente, el lisado o ruptura de las células comprende su calentamiento hasta por lo menos 50ºC, mientras se las expone a condiciones básicas, a un compuesto quelante o a sus mezclas.

Preferentemente, la separación gravitacional comprende el paso del caldo fermentativo que contiene los lípidos intercelulares liberados a través de una centrífuga, tal como las centrífugas de tipo decantador, separador o (formadas) por discos apilados.

La mezcla celular que se ha lisado y separado, comprende una capa pesada que incluye una solución acuosa que contiene los materiales sólidos que provienen de las células lisadas, y una capa ligera que contiene lípidos. Las capas ligera y pesada pueden separarse mediante centrifugación. Los lípidos pueden encontrarse en un estado emulsificado. La capa ligera puede lavarse posteriormente con una solución de lavado acuosa hasta que los lípidos se convierten sustancialmente en no emulsificados. Preferentemente, el tratamiento para la ruptura de la emulsión comprende la mezcla de la emulsión con agua, alcohol, acetona o sus mezclas, y el sometimiento de la mezcla a la separación gravitacional. Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo sin utilizar disolventes orgánicos no polares tales como hexano.

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Cuando el procedimiento de extracción lipídica de la presente invención incluye la utilización de microorganismos procedentes de un proceso de fermentación, el procedimiento de extración puede incluir asimismo la solubilización de, por lo menos, parte de los compuestos proteínicos en un caldo fermentativo, añadiendo una base que se selecciona a partir del grupo formado por hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos y sus mezclas.

El procedimiento de la presente invención puede incluir también el calentamiento de los microorganismos a una temperatura de por lo menos de alrededor de 50ºC. Preferentemente, un compuesto químico, tal como una base, se añade al medio de cultivo para ayudar en la lisis de las células.

Como una alternativa al calentamiento, las células pueden lisarse con la ayuda de un compuesto quelante como EDTA. Además de "intervenir" en la lisis o en la ruptura celular, los quelantes ayudan para evitar la oxidación de los lípidos durante el tratamiento mediante la quelación (unión con) los iones metálicos que producen radicales libres en el caldo fermentativo, iones tales como el hierro o el cobre. Las formas preferidas de quelantes son las que se consideran de grado alimentario o GRAS (que se reconocen generalmente como seguros). Compuestos quelantes efectivos incluyen EDTA, ácido cítrico o citrato, ácido láctico, fosfato trisódico, polifosfato, hexametafosfato, EGTA, DTPA, ácido fítico, o CDTA y otras formas salinas de estos compuestos. En una forma de realización, se añade EDTA sódico a las células para degradar las paredes celulares, mediante la quelación de los cationes divalentes que ayudan al mantenimiento conjunto de las paredes celulares. El procedimiento puede realizarse a temperaturas más altas con menos EDTA, o a temperaturas más bajas con una alta concentración de EDTA. Por ejemplo, encontramos que las células ricas en DHA de Schizochytrium sp, pueden permeabilizarse y/o ser sometidas a ruptura mediante la adición de EDTA a los cultivos al final del proceso de fermentación. Para ayudar en la ruptura de las células a 30ºC, se requiere una concentración de 10.000 ppm, siendo efectiva a 50ºC una concentración de 5.000 ppm, y a temperaturas superiores a 70ºC, las concentraciones efectivas son inferiores a 1.000 ppm. Los quelantes pueden añadirse al caldo fermentativo para hacer más fácil que las células se rompan mediante procedimientos físicos tales como la homogenización. Además de un quelante, puede añadirse también agua para aumentar la presión osmótica interna con el fin de lisar las células.

Preferentemente, los microorganismos son capaces de desarrollarse con un nivel de salinidad inferior a 12 g/l aproximadamente de cloruro sódico, más preferentemente menor que 5 g/l aproximadamente, y muy preferentemente inferior a 3 g/l aproximadamente de cloruro sódico. Preferentemente, los microorganismos pueden desarrollarse en un nivel de salinidad inferior a 7 g/l aproximadamente de sodio e inferior a 250 mg/l aproximadamente de cloruro. Preferentemente, el cloruro se encuentra en una cantidad de entre 70 a 150 mg/l aproximadamente.

Preferentemente, los microorganismos comprenden por lo menos aproximadamente 20% en peso de lípidos, más preferentemente, por lo menos aproximadamente 30% en peso, y muy preferentemente, por lo menos aproximadamente 40%. Alternativamente por lo menos aproximadamente 20%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 20% de los lípidos consiste en colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles,

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ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, y ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinoleico y ácido gammalinoleico o sus mezclas, preferentemente por lo menos aproximadamente 30%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 40%.

En un aspecto particular de la presente invención, los microorganismos pueden producir, por lo menos, aproximadamente 0,1 g por litro, por hora, de una mezcla de lípidos, que incluyen preferentemente colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, y ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinoleico y ácido gammalinoleico o sus mezclas, (en cantidades), preferentemente por lo menos, aproximadamente 0,2 g/l/h, y más preferentemente, todavía por lo menos aproximadamente 0,3 g/l/h, y muy preferentemente por lo menos aproximadamente 0,4 g/l/h.

En otro aspecto de la presente invención, el microorganismo es seleccionado de entre el grupo constituido por algas, bacterias, hongos y protistas. Preferentemente, los microorganismos son del orden Thraustochytriales. Más preferentemente, son seleccionados microorganismos a partir del género Thraustochytrium, Schizochytrium y sus mezclas. Y muy preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por microorganismos que tienen las características identificadoras de la ATCC nº 20888, ATCC nº 20889, ATCC nº 20890, ATCC nº 20891 y ATCC nº 20892, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas. Preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por microorganismos que tienen las características identificadoras de ATCC nº 20888 y ATCC nº 20889, y mas preferentemente, ATCC nº 20888, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 representa un diagrama de flujo de una forma de realización de un procedimiento de extracción sin disolvente de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para extraer, recuperar, aislar u obtener lípidos a partir de microorganismos. El procedimiento de la presente invención puede aplicarse a la extracción de diversos lípidos a partir de varios microorganismos, por ejemplo, lípidos que contengan colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico,

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ácido estearidónico, ácido dihomogammalinoleico y ácido gammalinoleico o sus mezclas, más preferentemente, ácidos grasos omega-3 altamente insaturados, tales como el ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), y/o el ácido docosapentaenoico (DPA) (es decir, la forma omega-3 del DPA), en particular, lípidos conteniendo una cantidad relativamente grande de DHA, a partir de microorganismos que produzcan los mismos; y la extracción de lípidos que contengan ácidos grasos altamente insaturados omega-6, tales como el ácido araquidónico y el ácido docosapentaenoico (DPA) (es decir, la forma omega-6 de DPA), a partir de microorganismos que produzcan los mismos. Los microorganismos ejemplificativos de la producción de una cantidad relativamente grande de ácidos grasos altamente insaturados omega-3 se dan a conocer en las patentes en cotitularidad US nº

5.340.594 y nº 5.340.742, ambas publicadas por Barclay, y los microorganismos ejemplificativos de la producción de una cantidad relativamente grande de ácido araquidónico, se dan a conocer en la patente en cotitularidad US nº 5.583.019, publicada por Barclay.

En aras de la brevedad, sin embargo, esta descripción detallada de la invención se presenta con finalidades ilustrativas y de conveniencia en el caso de la extracción de lípidos que comprenden ácidos altamente insaturados omega-3, a partir de los microorganismos que los producen, en particular de la extracción de lípidos a partir de microorganismos que producen una cantidad relativamente grande de DHA. Sin embargo, debe apreciarse que la invención en su totalidad no se proporciona de manera limitada, y que un experto en la materia apreciará que el concepto de la presente invención será aplicable a otros microorganismos que produzcan diversas composiciones lipídicas de acuerdo con las técnicas que se consideran en la presente Memoria. Estos microorganismos incluyen microorganismos tales como hongos, protistas, algas y bacterias, que producen diversos lípidos, como fosfolípidos; ácidos grasos libres; ésteres de ácidos grasos, que incluyen triglicéridos de ácidos grasos; esteroles; pigmentos (por ejemplo, carotenoides y oxicarotenoides) y otros lípidos, y compuestos asociados a lípidos, tales como fitosteroles, ergotionina, ácido lipoico y antioxidantes que incluyen beta-caroteno, tocotrienoles, y tocoferol. Los lípidos preferidos y los compuestos asociados a lípidos incluyen pero no se limitan a colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinoleico y ácido gammalinoleico o sus mezclas. En aras de la brevedad, sino se considera de otra forma, el término "lípido" se refiere a compuestos lipídicos y/o asociados a lípidos. Otros lípidos de los microorganismos que pueden ser apropiados para su utilización en la presente invención, serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia.

Los procedimientos típicos para la preparación de lípidos microbianos (especialmente un aceite que contiene un ácido graso altamente insaturado omega-3, tal como DHA), implican el desarrollo de microorganismos que producen DHA en un fermentador, aislando los microorganismos, secando la biomasa microbiana y extrayendo los lípidos intracelulares con un disolvente orgánico no polar, por ejemplo, hexano. El lípido extraído se refina, en general, posteriormente, para dar lugar a un lípido muy puro o/de alta calidad. El aislamiento de los microorganismos implica diluir el caldo fermentativo con agua, y centrifugar la mezcla para aislar a los microorganismos. Cuando los lípidos no se extraen inmediatamente o no se

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hace pronto después de aislar a los microorganismos, los microorganismos se secan típicamente, por ejemplo, en un secador de tambor, y se precintan en una envoltura por ejemplo, en bolsas precintadas al vacío, para evitar la degradación de los lípidos. Desafortunadamente, el proceso de secado expone los microorganismos al calor, lo cual puede perjudicarlos, por ejemplo, degradar la calidad de los lípidos. Además, si los microorganismos que se secaron no se tratan con un antioxidante, la exposición de los microorganismos al aire o/la luz, degradará posteriormente los lípidos.

La recuperación del aceite en bruto a partir, directamente, del caldo de fermentación, evita estos problemas. Evitar la etapa de extracción con el disolvente orgánico o polar, reduce los costes de fabricación y elimina, asimismo, la exposición del operario a los microorganismos secos, lo que puede causar una respuesta alérgica en algunos individuos.

La presente invención proporciona un procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, utilizando un procedimiento de extracción sustancialmente libre de disolventes orgánicos no polares, es decir, un procedimiento de extracción "sin disolvente". El término "procedimiento de extracción sin disolvente" se refiere a un procedimiento de extracción en el que, cuando se utiliza un disolvente polar o acuoso, el disolvente acuoso o polar incluye menos del 5% de un disolvente orgánico no polar, preferentemente, menos del 4% aproximadamente, más preferentemente, menos del 2% aproximadamente, y muy preferentemente, menos del 1%. Sin embargo, los disolventes pueden utilizarse en etapas en dirección corriente abajo, tal como en un proceso de refinado. El procedimiento de la presente invención puede incluir la obtención o el aislamiento de microorganismos, preferentemente, a partir de un proceso de fermentación. Al contrario que en los procedimientos habituales, los procedimientos de la técnica anterior tales como la extracción de aceites de la soja, en los que ésta puede secarse, el procedimiento de la presente invención no necesita de una etapa de secado anterior al proceso de extracción. De esta forma, los procedimientos de la presente invención pueden aplicarse a la extracción de lípidos a partir de una biomasa microbiana que contenga por lo menos aproximadamente 10% en peso de agua atrapada, preferentemente, de por lo menos, aproximadamente 20%, más preferentemente, de por lo menos, aproximadamente 30%, y muy preferentemente, por lo menos, de alrededor del 50%. Cuando los microorganismos se obtienen a partir de un procedimiento de fermentación, el procedimiento de la presente invención puede incluir la adición de una base al caldo fermentativo para disolver cualquier compuesto proteico que pueda encontrarse en el caldo. "Bases" son sustancias que muestran reacciones alcalinas (básicas) en soluciones acuosas, es decir, añaden protones e iones hidróxido disociados. La base puede ser lo suficientemente fuerte para hidrolizar o solubilizar por lo menos, una parte de los compuestos proteicos que puedan encontrarse en el caldo. Las bases que son útiles para solubilizar proteínas, son bien conocidas por los expertos en la materia química. Los ejemplos de bases que son útiles en los procedimientos de la presente invención, incluyen pero no se limitan a hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio, y carbonato magnésico. Pueden utilizarse también otros compuestos muy básicos como sales básicas de fosfato (fosfato trisódico).

El procedimiento de la presente invención puede incluir también la ruptura o lisis de las células de los microorganismos para liberar los lípidos que se encuentran en el interior de las células. Las células pueden lisarse utilizando cualquiera de los procedimientos conocidos incluyendo los químicos, térmicos, mecánicos, que incluyen pero no se limitan al prensado, molido, (utilización de) ultrasonidos, homogenización, y explosión de vapor; y sus

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combinaciones. En un lisado térmico de las células, el caldo fermentativo que contiene los microorganismos se calienta hasta que las células, es decir, las paredes celulares de los microorganismos, se degradan o se rompen. Típicamente, el caldo de fermentación se calienta a una temperatura de por lo menos alrededor de 50ºC, preferentemente hasta, por lo menos, 75°C aproximadamente, más preferentemente hasta, por lo menos, 100ºC, y muy preferentemente hasta, por lo menos, 130ºC aproximadamente. Un aspecto importante del procedimiento es mantener una temperatura inferior que la temperatura a la cual los lípidos que se extraen puedan degradarse. El lisado térmico de las paredes celulares de los microorganismos es particularmente útil para aquéllos cuyas paredes celulares están compuestas de proteínas. Durante este proceso, el espacio superior del fermentador puede rellenarse con nitrógeno u otro gas inerte para evitar la oxidación de los lípidos por el oxígeno.

El calentamiento del caldo (de cultivo) desnaturaliza también proteínas y ayuda a la solubilización de los materiales orgánicos, incluyendo las proteínas. La etapa de calentamiento del caldo de fermentación, puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los procedimientos conocidos, que incluyen la utilización de un intercambiador calórico en línea, y preferentemente el rociado del vapor de agua en el caldo de fermentación, manteniendo éste a una temperatura deseada durante menos de aproximadamente 90 minutos, preferentemente menos de aproximadamente 60 minutos, y más preferentemente de aproximadamente 30 minutos.

El procedimiento de extracción sin disolvente de la presente invención puede también incluir, por lo menos, la separación parcial de los lípidos del caldo de cultivo de fermentación que se ha utilizado. Típicamente, esto se consigue haciendo pasar el caldo de cultivo a través de una centrífuga decantadora, separadora o (formada) por discos dispuestos verticalmente, y recuperando los lípidos como una fase de emulsión. La centrifugación de la mezcla da lugar a una mezcla de dos fases, que comprende una capa pesada y una capa ligera. Típicamente, la capa pesada es una fase acuosa, que contiene la mayoría de los desechos celulares. La capa ligera que contiene lípidos emulsificados se diluye entonces con agua, se separa otra vez en una mezcla de dos fases y se aísla otra vez la capa ligera. Estos procesos de dilución acuosa, separación y aislamiento (por ejemplo, procedimientos de lavado), pueden alcanzarse continuamente alimentando con agua y eliminando la capa pesada durante el proceso, o pueden llevarse a cabo en etapas discretas. El proceso de lavado se repite generalmente hasta que se obtiene una capa lipídica sustancialmente no emulsificada, aunque pueden permanecer cantidades más pequeñas de emulsión. Se cree que la interfase aceite-agua de la emulsión se estabiliza mediante residuos celulares residuales, que se elimina mediante el proceso de lavado. Durante éste, las cantidades sucesivas de agua añadida se reducen para aumentar el contenido lipídico. Aunque la reducción de la cantidad de agua que se proporcionó demasiado rápidamente puede dar lugar a la pérdida de lípidos a la fase acuosa, la reducción de la cantidad de agua que se añadió demasiado lentamente, da lugar a una pérdida de lípidos a la fase acuosa, la reducción de la cantidad de agua añadida demasiado lentamente da lugar a un proceso de lavado ineficiente. Se puede determinar fácilmente una tasa apropiada de reducción del agua proveída observando o analizando la capa acuosa separada. Generalmente, la capa lipídica, es decir, la capa ligera, está coloreada; por tanto, en muchos casos, se puede determinar una tasa apropiada de la reducción del agua que se provee, observando u analizando simplemente el color de la capa acuosa que se separa de la capa lipídica.

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Alternativa y preferentemente, la emulsión puede romperse, y el aceite que se recupera utilizando el procedimiento de desengrasado (o desaceitado) que se da a conocer en el documento WO 96/05278. En este procedimiento, un compuesto hidrosoluble, alcohol y/o acetona, se añade a la emulsión aceite/agua para romper la emulsión, separándose mediante centrifugación la mezcla resultante. El lípido aislado puede refinarse posteriormente utilizando un procedimiento similar al que se ha utilizado para refinar los aceites vegetales estándar. Brevemente, el proceso de refinado lipídico implica generalmente la hidratación de fosfolípidos añadiendo ácido fosfórico al lípido, seguido por la adición de hidróxido sódico para neutralizar los ácidos grasos libres. Estos compuestos se eliminan mediante centrifugación. Esto es seguido entonces por una etapa de lavado con agua para eliminar cualquier cantidad remanente de fosfolípidos hidratados ("gomas"), y de ácidos grasos neutralizados ("reserva jabonosa") en el lípido. El lípido resultante se blanqueó utilizando "Trysil"TM y una arcilla estándar blanqueadora. Se añadió también el ácido cítrico para eliminar los iones metálicos divalentes mediante quelación. El TrysilTM y la arcilla blanqueadora se eliminaron entonces mediante filtración, para producir un lípido refinado. El lípido blanqueado puede filtrarse en frío para eliminar los compuestos con una alta temperatura de fusión que pudieran encontrarse en el lípido; sin embargo, esta etapa raramente es necesaria.

Los lípidos resultantes pueden refinarse posteriormente eliminando cualesquiera componentes de bajo peso molecular que pudieran estar presentes. Típicamente, estos componentes son eliminados mediante pulverizado con vapor a altas temperaturas, bajo alto vacío. Este proceso destruye también cualquier enlace peróxido que pueda encontrarse presente, y reduce o elimina los olores, ayudando a mejorar la estabilidad del aceite. Puede añadirse entonces un antioxidante al lípido desodorizado resultante para mejorar la estabilidad del producto.

Durante el procedimiento de refinado, el lípido aislado puede ser frigelizado para eliminar los compuestos con una alta temperatura de fusión, tal como los ácidos grasos saturados. El proceso de frigelización implica generalmente la disolución del lípido aislado en un disolvente orgánico por ejemplo, hexano, enfriando la solución orgánica resultante, y filtrando la solución para eliminar los componentes con una alta temperatura de fusión de la fase lipídica o de estearina. El proceso de frigelización da lugar generalmente un lípido claro, especialmente cuando el lípido aislado es turbio u opaco. Como se apreciará, la utilización de un disolvente tal como hexano es aceptable en procedimientos tales como el descrito anteriormente "de refinado". Alternativamente, el lípido aislado puede enfriarse bruscamente y las impurezas solidificadas pueden filtrarse, sin utilizar un disolvente.

El procedimiento de refinado, de blanqueamiento, de desodorización, que se ha mencionado anteriormente se utilizará para mezclas lipídicas ricas en triglicéridos. Alternativamente, o además de este procedimiento, otros lípidos, por ejemplo, pigmentos o carotenoides, pueden separarse y purificarse, por ejemplo, mediante distribución en varios disolventes, procedimientos cromatográficos, etc.

Aunque el procedimiento de la presente invención puede incluir el aislamiento de microorganismos a partir de un proceso de fermentación, una de las ventajas de la presente invención es que permite que la fermentación de microorganismos y el aislamiento de lípidos puedan ser llevados a cabo en un recipiente único. Por ejemplo, después de la fermentación, se puede añadir base al recipiente de fermentación y calentar la mezcla para lisar las

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células. Después de separar la fase en una capa pesada y en una capa ligera, la capa ligera puede transferirse a otro recipiente para realizar un tratamiento posterior, o puede eliminarse la capa pesada del recipiente de fermentación, por ejemplo, realizando un drenaje a través del suelo del recipiente de fermentación, pudiéndose procesar posteriormente dentro del mismo recipiente de fermentación, la capa ligera restante (que permanece).

Si la concentración de lípidos en las células del cultivo microbiano es alta (por ejemplo, superior a aproximadamente 20%), pero la concentración celular es baja (por ejemplo, inferior a aproximadamente 40 g/l) tal como en las células que se han desarrollado en sistemas de fermentación continua, o en cultivos que presentan dificultades (por ejemplo, fragilidad) para que las células se desarrollen, o en cultivos que tienen lugar en sistemas de cultivo basados fotosintéticamente, las células, antes de utilizar los procedimientos de la invención, pueden concentrarse, si es necesario, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o fijación.

Otros objetivos, ventajas, y nuevas características de la presente invención resultarán evidentes a los expertos en la materia, a partir de sus ejemplos siguientes no limitativos.

EJEMPLOS

Se caracterizó la capacidad de reproducir el procedimiento obteniendo tres muestras de aceite completamente refinado, utilizando aceite en bruto procedente del nuevo procedimiento de extracción sin disolvente ver anteriormente. Una muestra extraída con hexano fue también completamente refinada para servir como control. Las etapas de fermentación, extracción, y aislamiento se llevaron a cabo a gran escala, mientras que los estudios de refinado se realizaron a pequeña escala.

Las muestras de aceite completamente refinado se analizaron para demostrar la reproducibilidad del procedimiento.

Fermentación

Un microorganismo rico en aceite (Schizochytrium sp.) se desarrolló en un fermentador de 1.200 galones, para producir un caldo fermentativo para los procedimientos siguientes de extracción. Se utilizó una única carga para generar el caldo (de cultivo) inicial para los tres procedimientos de extracción sin disolvente. Se dejó que se llevara a cabo el proceso fermentativo durante 94 horas, mientras se controlaban los niveles de glucosa a 13 g/l, después de lo cual finalizó el suministro de jarabe de maíz. Los niveles residuales de glucosa descendieron a < 5 g/l cuatro horas después. Esto dio lugar a una duración total (del proceso fermentativo) de 98 horas. El volumen final del caldo (de cultivo) fue de 958 galones. El rendimiento final fue de 146 g/l de peso celular seco. Tanto los controles con respecto a la contaminación llevados a cabo durante el proceso, como el análisis de una muestra final del caldo (de cultivo), no mostraron ningún signo de contaminación.

Muestra de control extraída con hexano

Una pequeña alícuota del caldo de cultivo procedente de la carga de fermentación se secó (en un secador de tambor) y se extrajo con hexano, para actuar como una muestra de

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control. La biomasa intermedia se recuperó utilizando un secador de tambor doble. El análisis de este lípido se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Análisis de la biomasa de Schizochytrium sp. secada en un secador de tambor.

Parámetro: Valor

Contenido en DHA (base FAME): 35,7%

Contenido en aceite: 62,7%

Valor peróxido (meq/kg): 2,6

Contaje total de la placa (cfu/g): <50

Contenido en DHA *: 20,3%

Contenido FAME: 56,9%

* base de peso seco celular

Procedimiento de extracción sin disolvente

10 Se obtuvo aceite en bruto tratando tres alícuotas de 400 galones del caldo de fermentación (aproximadamente). Cada alícuota de 400 galones del fermentador se procesó separadamente, iniciándose con las etapas de tratamiento caústico/térmico. Cada alícuota se trató con 20 gramos de KOH al 45% por litro y se calentó a 130ºC durante 30 minutos

15 aproximadamente, haciendo pasar vapor a través del caldo de fermentación. El aceite en crudo se recuperó a partir del caldo que se había tratado, utilizando una centrífuga a escala comercial Westfalia HFA-100, de discos dispuestos verticalmente. Se informa de los resultados de resumen para varios parámetros del procedimiento en la Tabla 2 y los resultados finales del análisis del aceite en bruto se muestran en la Tabla 3.

20 Tabla 2. Datos del procedimiento a partir del procedimiento de extracción sin disolvente

SFE-1: SFE-2 SFE-3

Ambos tratamientos

Volumen del caldo procesado: 288 gal 288 gal 258 gal

pH tratado final: 7,5 8,0 8,7

Volumen final después del tratamiento térmico: 388 gal 398 gal 308 gal

Aumento del volumen a partir del condensado: 34,7% 38,2% 19,4%

Emulsión de 1er paso

Volumen total (gal): 180 133 149

Concentración de aceite extraído (peso/peso): 12,0% 24,5% 16,1%

Densidad aparente (g/ml): 0,986 0,991 0,999

Aislamiento del aceite

Aceite total en bruto recuperado (1b): 182 165 174

Número asignado al lote de aceite DHA: SF1A SF2A SF3A

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Tabla 3. Análisis de lotes de aceite DHA procedentes del procedimiento de extracción sin disolvente

Parámetro: SF1A SF2A SF3A

Contenido de DHA (% FAME): 39,0% 38,6% 39,2%

Valor peróxidos (meq/kg): 4,6 1,8 2,0

Valor ácido (mg KOH/g): N/D N/D N/D

Contenido en humedad: N/D N/D N/D

5 Refinado

Una muestra de cada alícuota de aceite en bruto fue frigelizada, refinada,

blanqueada y desodorizada a pequeña escala, pues era una muestra de aceite en bruto

procedente del control extraído con hexano. En la Tabla 4 se muestran datos misceláneos

10 de estos experimentos a pequeña escala, que incluyen las eficiencias de recuperación para las diversas etapas de tratamiento. Aunque es difícil obtener demasiada información con respecto a las eficiencias de recuperación para los procedimientos de "gradación según una escala", pues las pérdidas tienden a ser desproporcionadamente grandes, los valores que se listan en la tabla 4 muestran que los valores para las muestras extraídas sin disolvente

15 tienden a asociar los valores medidos para el control extraído con hexano, con la excepción que representa la etapa de frigelización. Aunque la eficiencia de recuperación durante la etapa de frigelización para el control hexano fue inferior a las (eficiencias de recuperación) observadas para las otras tres muestras, esta diferencia no es significativa desde un punto de vista estadístico. Las altas pérdidas durante la etapa de frigelización provocaron que la

20 eficiencia de recuperación total para la muestra hexano de control, fuera también inferior. No se esperaba que el menor rendimiento tuviera un impacto significativo sobre la calidad total del aceite. En conjunto, las diferencias en el tratamiento de las diversas muestras de aceite fueron mínimas.

25 Tabla 4. Datos diversos de tratamiento de las etapas de refinamiento del aceite.

HEX-1: SF1A SF2A SF3A

Condiciones de tratamiento

Concentraciones diversas: 45,0% 52,9% 52,8% 45,0%

Velocidad de rociado del vapor: 3,4% 3,4% 2,5% 2,2%

Eficiencias de recuperación

Frigelización: 80,6% 92,3% 87,7% 85,5%

Refinado: 89,4% 84,8% 91,8% 95,0%

Lavado con agua: 90,6% 94,5% 95,8% 81,2%

Blanqueamiento: 86,1% 89,2% 87,3% 84,1%

Desodorización: 97,4% 96,1% 97,2% 97,5%

Empaquetamiento: 88,2% 89,7% 89,3% 95,8%

Total: 48,2% 56,9% 58,5% 51,8%

Las muestras de aceite completamente refinado procedentes de los tres tratamientos de extracción sin disolvente, y el control extraído mediante hexano, se analizaron y los resultados se muestran en la Tabla 5. También se muestran las correspondientes especificaciones de liberación para cada parámetro.

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Una muestra del aceite en bruto inicial procedente del tratamiento de extracción sin disolvente, se analizó con respecto al contenido en hierro. El contenido en hierro de la muestra fue de 0,08 ppm. La concentración de los otros metales traza se encontró para todos los metales inferior con respecto a sus límites respectivos de detección.

Tabla 5. Resultados QC para el aceite RBD DHA procedente del procedimiento de extracción sin disolvente comparados con el aceite extraído con hexano.

Hexano: Procedimiento extracción sin disolvente

Tratamiento ID #: HEX-1 SFA1 SFA2 SFA3

Valor peróxidos (meq/kg): 0,28 0,69 0,35 0,34

Valor ácido (mg KOH/g): 0,17 0,11 0,57 0,24

Humedad & Volátiles: 0,00% 0,06%** 0,00% 0,00%

Metales traza (ppm)

Plomo: <0,20 <0,20 <0,20 <0,20

Arsénico: <0,20 <0,20 <0,20 <0,20

Hierro: 0,22 0,21 0,56*** 0,02

Cobre: <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Mercurio: <0,20 <0,20 <0,20 <0,20

DHA (%FAME): 36,9 37,3 37,0 37,7

DHA (mg/g aceite): 342 345 343 351

Hexano (ppm): <3 <3 <3 <3

* El valor se redujo hasta 0,22 mg KOH/g después de repetir las etapas de blanqueamiento y refinamiento. ** Muestra analizada por el Grupo Analítico de Ciencias de la Fermentación de San Diego. *** Se redujo el valor hasta < 0,02 ppm después de repetir las etapas de blanqueamiento y refinamiento.

10 La Tabla 6 representa una comparación más directa de los resultados analíticos promedio para las tres muestras procedentes del procedimiento de extracción sin disolvente, con respecto a los obtenidos para el control hexano.

15 Tabla 6. Comparación de los valores promedio

Hexano: Extracción sin disolvente

Parámetro: Control Promedio Desviación estándar CV % Dif.

Valor peróxidos (meq/kg): 0,28 0,46 0,20 43,3% 64,3%

Valor ácido (mg KOH/g): 0,17 0,19* 0,06 33,3% 11,2%

Humedad & Volátiles: 0,00% 0,02% 0,03% 173% ND

Metales traza (ppm)

Plomo: <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0%

Arsénico: <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0%

Hierro: 0,22 0,26 0,27 104% 18,2%

Cobre: <0,05 <0,05 N/A N/A 0,0%

Mercurio: <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0%

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(continuación)

Hexano: Extracción sin disolvente

Parámetro: Control Promedio Desviación estándar CV % Dif.

Contenido en DHA (%FAME): 36,9% 37,3% 0,4% 0,9% 1,1%

Contenido en DHA (mg/g): 342 346 4 1,2% 1,2%

Hexano (ppm): <3 <3 N/A N/A 0,0%

* Calculado utilizando el valor ácido para la muestra que se volvió a trabajar.

Los resultados de este experimento demuestran claramente que el procedimiento de

5 extracción sin disolvente es reproducible y que los lípidos que proceden de la extracción sin disolvente son relativamente indistinguibles de los obtenidos a partir del procedimiento de extracción con hexano en términos de realización del procedimiento y de la calidad del producto. El producto final del procedimiento de extracción sin disolvente es sustancialmente equivalente a los lípidos que proceden de un procedimiento de extracción habitual que se

10 basa en el hexano, tal como se ha determinado por las similitudes entre los perfiles de los ácidos grasos y de los esteroles del producto que procede de estos dos procedimientos.

Claims

1. Procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, que comprende:

(a): tratar las células de los microorganismos que se desarrollaron en un medio de fermentación para liberar los lípidos intracelulares, en el que el tratamiento comprende el calentamiento de las células, la exposición de las células a condiciones básicas, y la exposición de las células a un compuesto quelante o sus combinaciones;

(b): producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada en el que dicha capa pesada comprende una fase acuosa y una capa ligera en el que dicha capa ligera comprende dichos lípidos mediante separación gravitacional del producto de la etapa (a)

(c): separar dicha capa pesada de dicha capa ligera

(d): tratar dicha fase ligera para romper una emulsión formada entre dichos lípidos y agua; y

(e): obtener dichos lípidos a partir de dicha capa ligera,

en el que el procedimiento utiliza menos de 5% de un disolvente orgánico no polar, mientras que se evita la extracción del disolvente orgánico para obtener el lípido.

2.: Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende el calentamiento de las células.

3.: Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la solubilización de por lo menos parte de cualquier proteína presente en el medio de fermentación.

4.: Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha etapa de solubilización de proteínas comprende el calentamiento del medio que contiene los lípidos intracelulares liberados.

5.: Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento de las células, comprende el lisado de las células para producir una mezcla de células lisadas.

6.: Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la producción de una mezcla separada en fases en (b) comprende la centrifugación de dicha mezcla de células lisadas.

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7.: Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende la adición de una base a dicho medio de fermentación.

8.: Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha base disuelve un compuesto proteínico en el medio de fermentación, y en el que dicha base es seleccionada de entre el grupo constituido por hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos y sus mezclas.

9.: Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende el calentamiento de dichos microorganismos a una temperatura de por lo menos 50ºC.

10.: Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende el calentamiento de las células hasta por lo menos 50ºC durante la exposición de las células a un compuesto básico, un compuesto quelante o sus mezclas.

11.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el procedimiento se lleva a cabo sin secar dichas células.

12.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha etapa (c) comprende además:

i) añadir una solución de lavado acuosa a dicha capa ligera;

ii) separar dicha solución de lavado acuosa de dicha capa ligera; y

iii) repetir dichas etapas (i) e (ii) hasta que el lípido se convierta en sustancialmente no emulsificado.

13.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha capa ligera comprende un lípido emulsificado.

14.: Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho lípido emulsificado comprende una suspensión de dicho lípido en una fase acuosa.

15.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha solución acuosa comprende materiales celulares sólidos.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha separación gravitacional

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comprende el paso del medio de fermentación que contiene los lípidos intracelulares liberados a través de una centrífuga decantadora, separadora o de discos apilados.

17.: Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha separación gravitacional comprende la centrifugación.

18.: Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de rotura de la emulsión comprende la mezcla de la emulsión con agua, alcohol y/o acetona, y someter la mezcla a la separación gravitacional.

19.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que el procedimiento se lleva a cabo en ausencia de un disolvente orgánico no polar.

20.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que los lípidos obtenidos se someten a refinamiento, o tratamiento adicional para obtener un lípido refinado.

21.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que los lípidos obtenidos son blanqueados y desodorizados.

22.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos se obtienen a partir de un proceso de fermentación.

23.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos pueden desarrollarse con un nivel de salinidad inferior a aproximadamente 12 g/l de cloruro sódico.

24.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son microorganismos ricos en lípidos.

25.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden por lo menos aproximadamente 20% en peso de lípidos.

26.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por algas, hongos, bacterias y protistas.

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27.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden microorganismos de entre el grupo constituido por algas doradas, algas verdes, dinoflagelados, levadura, hongos del género Mortierella y Stramenopiles.

28.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden microorganismos del orden Thraustochytriales.

29.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el género Thraustochytrium, Schizochytrium y sus mezclas.

30.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por microorganismos que presentan las características identificadoras de la ATCC nº 20888, ATCC nº 20889, ATCC nº 20890, ATCC nº 20891 y ATCC nº 20892, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas.

31.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos pueden producir por lo menos aproximadamente 0,1 gramos por litro por hora de colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, y ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinolénico y ácido gammalinolénico o sus mezclas.

32.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que por lo menos aproximadamente 20% de dicho lípido es colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinolénico y ácido gammalinolénico o sus mezclas.