ES2350828T3 - Nuevas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y sus usos. - Google Patents
Nuevas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y sus usos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2350828T3 ES2350828T3 ES03762257T ES03762257T ES2350828T3 ES 2350828 T3 ES2350828 T3 ES 2350828T3 ES 03762257 T ES03762257 T ES 03762257T ES 03762257 T ES03762257 T ES 03762257T ES 2350828 T3 ES2350828 T3 ES 2350828T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- dega
- oligonucleotide
- expression
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 62
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 claims description 2
- 101000776165 Homo sapiens Amphoterin-induced protein 2 Proteins 0.000 description 120
- 102100032040 Amphoterin-induced protein 2 Human genes 0.000 description 117
- KWYCPUNAAYFHAK-UHFFFAOYSA-N N-(2,6-Dimethylphenyl)-4-[[(diethylamino)acetyl]amino]benzamide Chemical compound C1=CC(NC(=O)CN(CC)CC)=CC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C KWYCPUNAAYFHAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 115
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 49
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 32
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 29
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 101100000858 Caenorhabditis elegans act-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100020870 La-related protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 108050008265 La-related protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical compound OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N abcn Chemical compound C1CCCCC1(C#N)N=NC1(C#N)CCCCC1 KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000005403 Casein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010031425 Casein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101100112225 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cpa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000005068 bladder tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 102000008395 cell adhesion mediator activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
Description
La presente invención se refiere a polinucleótidos y polipéptidos que se expresan en forma diferencial en una célula enferma y los procedimientos de diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con estos.
El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, sólo superada por la enfermedad cardíaca. En 2002, la American Cancer Society estimó que se diagnosticarán 1.284.900 nuevos casos y se espera que 550.000 de los 1,6 millones que viven con cáncer mueran. El cáncer es causado por la alteración genética o mal funcionamiento de los genes en la célula que origina la proliferación descontrolada de las células anormales para formar una masa o neoplasia tumoral. Uno de los principales contribuyentes a la proliferación descontrolada de las células es la sobreexpresión de los protooncogenes y/o subexpresión de los genes supresores del tumor. Ambos genes cumplen un papel crítico en la patogénesis del cáncer y el desbalance de la expresión del polinucleótido de estas dos familias de polinucleótidos perpetúa la inmortalización del cáncer. Las clases de oncogenes y genes y polipéptidos supresores del tumor incluyen los factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento transformante α (TNF-α) y sus correspondientes receptores, polipéptidos de señalización intracelular (tirosina quinasas), factores de transcripción de polinucleótidos, polipéptidos de control del ciclo celular, y polipéptidos de interacción célula-célula o célula-matriz.
El crecimiento celular descontrolado lleva a la formación de una masa celular tumoral localizada, cuya viabilidad se mantiene por la formación de neovasculatura tal como capilares sanguíneos que son esenciales para transportar los nutrientes a las células. La angiogénesis es en consecuencia un elemento clave en la supervivencia, crecimiento y metástasis de los tumores. Los polipéptidos conocidos por cumplir un papel vital en la angiogénesis son los factores de crecimiento y sus correspondientes receptores, que incluyen EGF y TGF-α, así como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
La masa tumoral localizada, con su proliferación celular rápida y continua, finalmente produce la invasión de los tejidos adyacentes ya que las células tumorales se escapan de la masa tumoral original y migran a los ganglios linfáticos regionales y estructuras vitales distales en el cuerpo por medio de los sistemas sanguíneos o linfáticos. La invasión de las células tumorales requiere la adhesión de las células a la matriz extracelular, seguida por su ruptura y finalmente la migración de la célula tumoral. Se ha mostrado la diseminación de ciertos cánceres en los sitios preferidos por la presencia de ciertos polipéptidos en la superficie celular que son capaces de concentrar marcadores de superficie celular seleccionados en las células diana.
En consecuencia, la inhibición de la proliferación celular descontrolada, angiogénesis, y difusión celular son algunos de las dianas clave en el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar la progresión y recurrencia tumoral. Si bien se ha realizado mucho avance en el campo del cáncer y terapia del cáncer, muchas de las terapias en desarrollo actuales han sido poco satisfactorias, y existe la necesidad de una terapia adyuvante alternativa para muchos de estos tipos de tumores específicos. La presente solicitud involucra el descubrimiento de un nuevo polinucleótido que codifica un polipéptido o polipéptido que se expresa en forma diferencial en ciertas células tumorales y puede ser útil en el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención del cáncer.
La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido está constituido de 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
Se proporcionan polinucleótidos de S30-21616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA o mS30-21616/DEGA respectivamente), en particular SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, o un fragmento de estos. Se describen los polipéptidos de S3021616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA y mS3021616/DEGA), en particular SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, o un fragmentos de estos. Además, se proporcionan procedimientos y composiciones para el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades usando tales polinucleótidos.
La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos de S3021616/DEGA (ADNc = 3769 pb; ORF = 1569 pb, que codifica un polipéptido de 522 aminoácidos) con las siguientes características: secuencia del péptido señal (negrita); dominio de transmembrana (negrita subrayada); sitios de glicosilación positivos (aminoácidos rodeados) y serinas y treoninas fosforiladas putativas (aminoácidos recuadrados)
Las Figuras 2 A y B muestran el análisis de transferencia de punto de los niveles de expresión de ADNc de S30-21616/ DEGA en muestras de tejido tumoral y normal de los pacientes individuales usando Matrices de Perfil del Cáncer BD Biosciences I (A) y II (B).
La Figura 3 muestra el análisis de transferencia Northern de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares de adenocarcinoma gástrico, AGS (calle A), NCI-N87 (calle B), RF-1 (calle C), KatoIII (calle D), KKVR (calle E), NCI-SNU-16 (calle F), y NCI-SNU-1 (calle G). El panel inferior muestra el nivel de ARNm de β-actina en las líneas celulares respectivas.
La Figura 4 muestra el análisis de transferencia de punto de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares generales no de adenocarcinoma gástrico.
La Figura 5A muestra la representación esquemática de la proteína de S3021616/DEGA. Los dominios presentes en la proteína de S30-21616/DEGA se muestran con sus límites de aminoácidos siguientes: SP=Péptido señal; LRR=Repetición rica en leucina; LRR-NT=LRR Dominio rico en cisteína flanquante N-terminal; LRR-CT=LRR Dominio rico en cisteína flanqueante C-terminal; IgG=dominio de inmunoglobulina; TM=dominio de transmembrana; y S/T-Rico=Dominio rico en serina/treonina-rico. Los rombos negros representan sitios de glicosilación N-ligados putativos. La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos del polinucleótido de S30-21616/DEGA con la LRR en negrita, el dominio tipo inmunoglobulina subrayado, el dominio de transmembrana recuadrado, y los sitios de fosforilación de caseína quinasa y de fosforilación de polipéptido quinasa C indicados por [] y (), respectivamente.
La Figura 6 ilustra la localización subcelular de la proteína de fusión S30-21616/DEGAEGFP (Proteína Fluorescente Verde Potenciada) que se expresó en forma estable en células 293 y se evalúa usando microscopia de fluorescencia (aumento 200X).
La Figura 7 muestra la expresión de S30-21616/DEGA por análisis de transferencia Northern en células progenitoras AGS o tipo salvajes (calle 1), AGS transfectadas con el vector vacío, AGS/clon del vector vacío #15 (calle 2), AGS transfectadas con S30-21616/DEGA antisentido, clon AGS/DEGA antisentido #6 (calle 3) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (calle 4). El panel inferior muestra la expresión endógena de ARNm de β-actina en los tipos celulares respectivos (control interno).
La Figura 8 (panel izquierdo) muestra los histogramas de citometría de flujo de los perfiles de contenidos de ADN/ ciclo celular del clon del vector vacío AGS #15 (panel izquierdo superior), clon antisentido AGS/DEGA #6 (panel izquierdo medio) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (panel izquierdo inferior). La Figura 8 (panel derecho) muestra la microscopía óptica que compara el tamaño celular del clon antisentido AGS #6 (panel derecho medio) y clon #11 (panel derecho inferior) al AGS/clon del vector vacío #15 (panel derecho superior).
La Figura 9 ilustra las curvas de crecimiento tumorigénico de los clones de AGS transfectados en forma estable con constructo de DEGA antisentido o vector vacío determinado por la cantidad de ratones portadores del tumor versus la cantidad total de ratones inyectados, de la siguiente manera: AGS WT (12/12); AGS/clon del vector vacío #15 (19/19); clon antisentido AGS/DEGA #6 (6/12); y clon antisentido AGS/DEGA #11 (6/19).
La presente invención se refiere a secuencias de polinucleótidos de una línea celular de carcinoma pulmonar, A549 ADNc (BD Biosciences/Clonentech, Palo Alto, CA), que tiene un marco de lectura abierto de 1569 nucleótidos. Esta secuencia de nucleótidos humana se denomina como hS30-21616 o hS30-21616/DEGA debido a su Perfil de Expresión Diferencial en Adenocarcinoma Gástrico. También se ha aislado la contraparte de ratón de esta secuencia de polinucleótidos, mS30-2161/DEGA, que se expresa en forma diferencial en una biblioteca de ADNc sustractiva de células madre hematopoyéticas y en una línea celular de cáncer renal de ratón. Por consiguiente la presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que el oligonucleótido constituye de 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o el complemento de esta.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser ADN, ARN, duplex ADN/ARN, polipéptido-ácido nucleico (PNA), o sus derivados. La secuencia de polinucleótidos incluye fragmentos o segmentos que son suficientemente largos para usar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o varias técnicas de hibridación bien conocidas en la técnica para la identificación, clonación y amplificación del total o parte de las moléculas de ARNm o ADN.
Por ejemplo, la hibridación en condiciones de rigurosidad alta significa las siguientes condiciones de hibridación y lavado del ácido nucleico: hibridación a 42°C en presencia de 50% de formamida; un primer lavado a 65°C con 2 X SSC que contiene 1% de SDS; seguido por un segundo lavado a 65°C con 0,1 X SSC. Además, los polinucleótidos de la presente invención incluyen los complementos de cualquiera de los nucleótidos o péptidos mencionados anteriormente, por ejemplo, ADNc y ARNm.
Como se usa en la presente, "aislado" o "purificado" significa que una molécula, por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido, está separado del material celular u otros componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, el polinucleótido o polipéptido está sustancialmente puro cuando está al menos 60% (en peso) libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas naturales con las que está asociado naturalmente. Preferentemente, la pureza de la preparación es al menos 75%, más preferentemente al menos 90%, y de máxima preferencia al menos 99% (en peso) libre. Un polinucleótido o polipéptido sustancialmente puro se puede obtener, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido, o síntesis química. La pureza se puede medir por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC. Se debe apreciar que el término aislado o purificado no se refiere a una preparación tipo genoteca que contiene una miríada de otros fragmentos de secuencia. Un polinucleótido o polipéptido sintetizado químicamente o un polinucleótido o polipéptido recombinante producido en un tipo celular diferente del tipo celular en que está naturalmente, por definición, está sustancialmente libre de los componentes que naturalmente lo acompañan. Por consiguiente, los polinucleótidos o polipéptidos sustancialmente puros incluyen los que tienen secuencias derivadas de organismos eucarióticos pero producidos en E. coli u otros procariotas.
En una realización de la presente invención, se proporcionan los constructos recombinantes. Estos constructos comprenden un polinucleótido de S30-21616/DEGA, en particular, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:3, o un fragmento de este, y un vector adecuado, que incluye, pero sin limitación, un vector de plásmido o viral, fagémido, cósmido, vector fago o derivado útil para los fines de expresión, replicación, generación de sonda y secuenciación. Tales constructos se pueden usar para modular la función de S30-21616/DEGA.
La función de S30-21616/DEGA puede ser regulada por aumento o disminución por la modulación del control de transcripción o traducción del ácido nucleico en la célula, lo que produce la inhibición de la expresión del polinucleótido de S30-21616/DEGA o alteración de la cantidad de polipéptido de S30-21616/DEGA. Por la regulación por aumento, se entiende que la actividad asociada con S30-21616/DEGA está aumentada, mientras que la regulación por disminución significa reducción o inhibición de la actividad. El control de la expresión del polinucleótido de S30-21616/DEGA puede ser en el nivel de ADN o ARN. En el nivel del ADN, las funciones que se pueden inhibir incluyen la replicación o transcripción. Las funciones del ARN interferidas incluyen la translocación del ARN en el sitio de la traducción del polipéptido, la traducción del polipéptido del ARN, empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y actividad catalítica que puede estar involucrada en o facilitada por el ARN.
Un agente o constructo que puede inhibir la expresión del polinucleótido S3021616/DEGA es un oligonucleótido antisentido, que puede estar en la forma de ADN o ARN, o un híbrido de este. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ADNc, ADN genómico o ARN o ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificadora o no codificadora. Por antisentido, se denomina a la hibridación específica del oligómero con su ácido nucleico diana, lo que produce interferencia en la función normal del ácido nucleico. Todas las funciones del ADN se pueden interferir por antisentido, lo que incluye replicación y transcripción. Además, todas las funciones del ARN se pueden interferir por antisentido, lo que incluye la translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, la traducción de la proteína a partir del ARNm, empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede estar involucrada o facilitada por ARN. El efecto global de tal oligonucleótido antisentido es la inhibición de la expresión de S3021616/DEGA en una célula, que puede producir reducción de la transcripción de ADN,
Preferentemente, el oligonucleótido antisentido tiene una porción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, o el complemento de esta. También preferentemente, el oligonucleótido antisentido es complementario con una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica el total o una porción de un polipéptido S3021616/DEGA de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido comprende secuencias específicas del gen cortas del ácido nucleico S3021616/DEGA de 20-30 nucleótidos de longitud y más preferentemente entre 12-25 nucleótidos de longitud.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se pueden administrar en una célula por cualquier procedimiento adecuado, que incluye endocitosis mediada por receptor, microinyección y por medio de complejos de proteína y ADN o encapsulado liposómico catiónico. Otro procedimiento para mejorar la administración es por la unión de ligandos del receptor o anticuerpos específicos de la célula a las secuencias de oligonucleótidos antisentido para asistir en la dirección y conducción de estos a las células y/o regiones del tejido diana particulares.
Uno de los mayores problemas al usar el oligonucleótido antisentido como molécula terapéutica es la degradación enzimática rápida de los oligonucleótidos en sangre y en las células. Una solución es invertir en forma terminal la polaridad del oligonucleótido. Este concepto se basa en la suposición de que la degradación intracelular se debe principalmente a una exonucleasa y. en consecuencia, las modificaciones en los extremos de los oligonucleótidos podrían estabilizar la secuencia.
Otra solución propuesta es por medio de la modificación de las uniones fosfodiéster entre las bases nucleotídicas para formar, por ejemplo, enlaces fosforotioato al sustituir uno o más oxígenos no ligados en el esqueleto de fosfato con átomos azufre para formar, por ejemplo, monotiofosfato y ditiofosfatos. Se ha mostrado que estos oligonucleótidos modificados tienen vida media aumentada. Además de la modificación del azufre, otros tipos de modificaciones en el esqueleto de azúcar-fosfato del oligonucleótido antisentido incluyen, pero sin limitación, un grupo 3’amino sustituido con un grupo 3’hidroxilo en el anillo de 2’desoxirribosa del ADN (modificación con fosforamidato), 2’O-metil oligorribonucleósido fosfodiésteres, metilfosfonatos (adición de un grupo metilo al oxígeno no ligado en el esqueleto fosfodiéster), y fosfotriéster.
Una segunda generación de oligonucleótidos antisentido incluye oligonucleótidos de esqueleto mixto que pueden contener la modificación de monotiofosfato en ambos extremos 3’ y 5’ del oligonucleótido. Otros ejemplos de modificaciones incluyen por ejemplo, 3’-desoxi-3’-(2N,N-difeniliminidazolidino)-timidina-5’-N,N,-diisopropil-O-metilfosforamidita, 3’-desoxi-3’-(2-N,Ndifeniliminidazolidino)-timidina-5’-O-metilfosfita. Los ejemplos de modificadores potenciales incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, hidraxina, succinato, etilendiamina y muchos otros. En forma alternativa, la posición 3’ del enlace fofosdiéster no modificada se puede sustituir con un carbono en la unión P-O para formar una unión 3’metileno o 3'-hidroximetileno.
Uno de los efectos secundarios de usar oligonucleótidos antisentido trata del reconocimiento por el sistema inmune de que el oligonucleótido antisentido es una molécula extraña, en particular, los oligonucleótidos que contienen la secuencia de dos bases, CpG (Citosina-fosfato-Guanina) no metilada, que se hallan comúnmente en el ADN bacteriano y no en el ADN de mamífero. Una solución potencial es metilar tal oligonucleótido. Otros procedimientos para minimizar los efectos secundarios del tratamiento con oligonucleótidos involucran la administración lenta de los oligonucleótidos en dosis bajas por inyección intravenosa continua (en vez de administrar dosis altas durante un período corto de tiempo) y el desarrollo de vehículos de administración tópica que permiten la administración suficiente del oligonucleótido a través de la epidermis.
También es posible inhibir la expresión de S30-21616/DEGA por la inactivación de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de S30-21616/DEGA y en consecuencia disminuir o inhibir la expresión del polipéptido. Tal inactivación puede ocurrir por la supresión de la secuencia de nucleótidos en la célula o por la introducción una supresión o mutación en la secuencia de nucleótidos, de este modo se inactiva la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos también se puede inactivar por la inserción en el polinucleótido de otro fragmento de ADN de modo que no se produzca la expresión del S30-21616/DEGA. Los procedimientos para introducir mutaciones, tales como supresiones e inserciones, en genes en células eucarióticas son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Patente U.S. Nº 5.464.764. Los oligonucleótidos y los vectores de expresión útiles para la mutación de los genes en las células se pueden obtener de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y las pautas provistas en la presente memoria; por ejemplo, se pueden usar procedimientos útiles para obtener y expresar oligonucleótidos antisentido y vectores de expresión útiles para mutar genes en las células.
En otra realización de la presente invención, la función o expresión de S3021616/DEGA se puede regular por aumento o inducir en una célula. Los ejemplos de regulación por aumento incluyen pero sin limitación la administración a la célula de ácidos nucleicos desnudos (vectores de ADN desnudos tales como oligonucleótidos o plásmidos), o polipéptidos, que incluyen polipéptidos producidos en forma recombinante. Polipéptidos producidos en forma recombinante significa que las secuencias de ADN que codifican S3021616/DEGA se colocan en un vector de expresión adecuado, que se describe en detalle a continuación.
Se halló que el S30-21616/DEGA está regulado por aumento en ciertos tipos de células tumorales, tales como cánceres de estómago y tiroides, pero generalmente está regulado por disminución en cáncer de mama, pulmón y ovario. La expresión es generalmente baja en muestras de tejido normal o no neoplásico y en consecuencia puede ser útil como un marcador molecular para el diagnóstico de varios cánceres. En consecuencia es un objeto de esta invención que la expresión o la carencia de expresión de este polinucleótido se puede usar para determinar la predisposición de un animal, preferentemente un individuo humano, a un cáncer específico tal como, pero sin limitación, por ejemplo, cáncer de estómago. Se contempla específicamente un kit, útil en el diagnóstico o pronóstico de cáncer, que tiene una sonda de ADN o ADN antisentido o ARN derivada de las secuencias del polinucleótido de S3021616/DEGA y sus variantes, en una mezcla de reactivos conocidos en la técnica.
En otra realización de esta invención, el polinucleótido de S30-21616/DEGA y/o polipéptido de S30-21616/DEGA se pueden regular por aumento y/o por disminución. Por ejemplo, la regulación por aumento o disminución de S30-21616/DEGA en la superficie de la célula o secretada en el suero del paciente con cáncer se puede usar en forma diagnóstica para confirmar o descartar un cáncer sospechado. Como biomarcador sérico o de superficie celular, el nivel de expresión del polipéptido en el momento del diagnóstico también puede proporcionar un pronóstico más preciso que por la estadificación sola. Se ideó un kit de inmunoensayo que tiene, por ejemplo, un anticuerpo dirigido al polipéptido o un péptido derivado de la unión del ligando al polipéptido para la presente invención. Las lecturas de los ensayos son a partir de inmunoensayos estándares bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales ensayos incluyen, pero sin limitación, ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo radioinmunomarcado (RIA), inmunotransferencias y separación celular activada por fluoresceína (FACS).
La invención también desvela un procedimiento para purificar y producir las variantes extracelulares o intracelulares de longitud completa del polipéptido. Por ejemplo, una realización de la invención proporciona constructos recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 que tiene la secuencia de polinucleótidos o un fragmento de esta, y un vector de expresión adecuado operativamente unido a un promotor y una secuencia líder para la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica. Los huéspedes procarióticos adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli DH1 ol; Pseudomonas, Bacillus, tal como Bacillus subtilis y Streptomyces. Las células eucarióticas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, insectos, y células animales tales como células CHO, células COS y células humanas y células vegetales en cultivo de tejidos. Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula transfectada con un constructo de expresión que tiene un polinucleótido de S30-21616/DEGA, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, operativamente unido a secuencias de control de expresión. Preferentemente, tal célula transfectada expresa un polipéptido de S30-21616/DEGA, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO 4.
Se puede tratar cualquier enfermedad neoplásica adecuada, es decir, cáncer, usando los presentes procedimientos de la invención, que incluye, por ejemplo, cánceres de estómago, tiroides, mama, ovario, riñón o pulmón.
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de cáncer metastático. Los tratamientos incluyen ablación del polinucleótido, reemplazo del polinucleótido, expresión del polinucleótido y supresión del polinucleótido antisentido. En una realización preferida de la invención, el procedimiento de tratamiento de un cáncer metastásico, involucra la administración de una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de un polinucleótido de S30-21616/DEGA, o fragmento de este, con secuencias adicionales tales como promotores para la expresión del mensaje de sentido y antisentido, secuencias recombinantes para la localización del gen, marcadores seleccionables para la transfección y selección o replicación u orígenes para el pasaje en células procarióticas, eucarióticas, bacterianas, de insecto o levadura. Los ácido nucleicos usados pueden ser ADN, ARN o PNA monocatenarios o bicatenarios. Las variantes de los ácidos nucleicos pueden incluir alteraciones tales como supresión, sustitución, adición o alteraciones no conservadoras naturales o manipuladas genéticamente.
Se considera que los polinucleótidos y fragmentos de la invención, que incluyen el antagonista, cuando se usan en el cuerpo humano para el fin de diagnóstico o tratamiento, se administrarán en la forma de una composición que tiene adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Tales portadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los modos de administración incluyen, pero sin limitación, las vías subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica o mucosa.
Los polinucleótidos y polipéptidos de S30-21616/DEGA humano de esta invención se expresan en forma diferencial en células madre hematopoyéticas (ver Ejemplo 2) y pueden ser útiles en la regulación de la hematopoyesis. En consecuencia, los polinucleótidos y polipéptidos de S30-21616/DEGAs de esta invención, o los agentes dirigidos contra tales polinucleótidos y polipéptidos, pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con células madre, y en particular una enfermedad hematopoyética tal como deficiencias de las células mieloides y linfoides, por ejemplo, leucemia o para mantener el crecimiento y la proliferación de células madre progenitoras eritroides. El agonista y el antagonista del polipéptido de esta invención también se prevén en el tratamiento de enfermedades asociadas con células madre.
Los polinucleótidos de S30-21616/DEGA de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con otras citoquinas en una composición farmacéuticamente aceptable para el tratamiento de, pero sin limitación, varias anemias o para el uso en conjunto con la irradiación o quimioterapia para estimular la producción de precursores o células eritroides; para mantener el crecimiento y la proliferación de células mieloides tales como monocitos, macrófagos y megacariocitos; y para mantener el crecimiento y la proliferación de células madre hematopoyéticas. En otra realización de la invención, las moléculas inhibidoras se pueden usar para alterar las células madre hematopoyéticas que interactúan con células estromáticas de sostén.
Por consiguiente, la presente invención se puede usar in vivo e in vitro para procedimientos investigativos, diagnósticos, profilácticos o de tratamiento, que son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención, pero no deben interpretarse como limitación del alcance de la invención de ningún modo. Otras realizaciones y usos de la invención serán obvias para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención desvelada en la presente memoria. Las descripciones detalladas de los procedimientos convencionales, tal como los empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de los genes que codifican polipéptidos en tales vectores y plásmidos, la introducción de plásmidos en las células huésped y la expresión y determinación de sus productos de genes y polinucleótidos, se pueden obtener en numerosas publicaciones, que incluyen Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Cultivos celulares
Las líneas celulares usadas se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y los medios usados para su propagación se adquirieron en Gibco, Grand Island, NY. Las líneas celulares y sus respectivos medios de crecimiento (se muestran entre paréntesis) fueron los siguientes: AGS, una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano, (F-12); 293, una línea celular epitelial de riñón humano transformada con el adenovirus 5 ADN, (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)) ; KKVR (DMEM de Iscove); RF-1, una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano, (L-15 de Leibovitz); NCI-SNU-1, NCI-SNU-16, NCI-N87, una línea celular de carcinoma gástrico hepático humano y KatoIII, un carcinoma gástrico humano, (RPMI). Todos los medios se suplementaron con 2 mM de L-Glutamina (Gibco, Grand Island, NY) y 10% de suero fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT).
KatoIII y KKVR, sin embargo, se cultivaron en 20% de FBS y los medios de cultivo NCIN87 y KKVR se suplementaron adicionalmente con 1,5 g/L de bicarbonato de sodio.
Ejemplo 1
El presente ejemplo demuestra la identificación de nuevos genes de cáncer expresados en forma diferencial. En breves palabras, se utilizó una genoteca de ADNc sustractiva de células madre hematopoyéticas murinas. Phillips et al. (2000) Science 288: 1635-1640. Aproximadamente 7.500 EST de esta genoteca se colocaron en micromatrices de ADN y se hibridaron con ADNc preparado de una variedad de líneas celulares de cáncer murino y el tejido normal correspondiente.
Uno de los EST murinos, S30-21616/DEGA, se identificó como que se expresó en forma diferencial 7,6 veces en la línea celular renal murina, RAG versus tejido renal normal, Este EST se secuenció y sus 522 bp se usaron para la búsqueda blast en las bases de datos de secuencias no redundante NCBI. Hasta este momento, S30-21616/DEGA no mostró homología con ninguna secuencia murina conocida. Sin embargo, mostró aproximadamente 85% de semejanza con el clon 12BAC del cromosoma humano y con una porción del clon de ADNc parcial del cáncer de endometrio humano (IMAGE: 3625286). La secuencia de ADN IMAGE:3625286 se usó para generar el ORF de 5’RACE, y los productos de PCR de 3’UTR para dar un ADNc final (hS30-21616/DEGA) de 3769 pb (Figura 1). La transcripción del ADNc produjo transcriptos de varios tamaños de 2,2 y 3,5 KB, lo que implica un empalme alternativo.
Ejemplo 2
El presente ejemplo demuestra la expresión de hS30-21616/DEGA en células normales y cancerosas. En breves palabras, se realizaron análisis de transferencia Northern usando Northern (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA) para múltiples tejidos para evaluar la expresión de hS30-21616/DEGA en células normales y cancerosas. Los tejidos normales analizados incluyen cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón, leucocitos de sangre periférica, glándula adrenal, vejiga, médula ósea, ganglios linfáticos, próstata, columna vertebral, estómago, tiroides, tráquea, útero y lengua. En la mayor parte de estos tejidos, la expresión de hS30-21616/DEGA fue muy baja.
Con respecto a la expresión de la línea celular de cáncer, evaluamos la expresión de hS30-21616/DEGA por análisis de transferencia Northern en células HL-60 (Leucemia Promielocítica), Hela (Carcinoma Cervical), K562 (Leucemia Mieloide Crónica), Molt-(Leucemia Linfoblástica Aguda), Raji y Daudi (Linfoma de Burkitt), SW480 (Adenocarcinoma Colorrectal), G3 (Melanoma), A549 (Carcinoma de Pulmón), AGS (Adenocarcinoma Gástrico Humano), NCISNU-1, NCI-SNU 16 y NCI-N87 (Carcinoma Gástrico Hepático Humano).
El S30-21616/DEGA humano se expresó como transcriptos de múltiple tamaño de 2-3,5
KB en A549 (datos no mostrados) así como en células de AGS y NCI-SNU-16 (ver, Figura 3). También se observan transcriptos de este tamaño en ADNc de GenBank® expresado en testículos, estómago, pulmón y útero. Debido a su perfil de expresión diferencial en adenocarcinoma gástrico, el ADNc de S30-21616 de aquí en adelante se denomina S3021616/DEGA.
Ejemplo 3
El presente ejemplo demuestra el análisis de Micromatriz del Perfil del Cáncer (CPA) de la expresión de S30-21616/DEGA en muestras de pacientes usando transferencia de punto de ADNc. En breves palabras, una variedad de tejidos tumorales y normales (CPA) I y II (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) se investigaron con una sonda del fragmento de ADNc que abarca el ORF de los nucleótidos 1540-2045 (numeración basada en la Figura 1) según las recomendaciones del fabricante. La sonda se marcó usando un [α-32P]-dCTP (PerkinElmer Life Sciences, Inc, Boston, MA) y se aisló usando el kit Prime-It® II (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). CPA I y II son matrices de nylon que contienen ADNc normalizado de 241 y 160 tejidos tumorales y normales correspondientes obtenidos de pacientes cancerosos individuales, respectivamente. Los tejidos representados por CPA I incluyen: mamas, útero, colon, estómago, ovario, pulmón, riñón, recto, tiroides, cuello uterino, intestino delgado, páncreas y próstata. Además de estos tejidos, CPA II aparece en tejido de vejiga, testículos y piel. Estas matrices también contienen controles positivos y negativos así como ADNc aislado de nueve líneas celulares de cáncer: HeLa, Daudi, K-562, HL-60, G-361, A549, Molt-4, SW480 y Raji.
Los resultados de este perfil de matriz de las Figuras 2A (CPA 1) y 2B (CPA II) nuevamente mostraron que DEGA se expresó en algunas muestras de pulmón, colon y recto normales pero la expresión fue generalmente menor que en los tejidos reproductores femeninos. Casi todos los pacientes mostraron fuerte expresión de DEGA en tejidos de mamas normales. En contraste, la expresión de DEGA en las muestras tumorales se expresó en forma diferencial en 56% de los cánceres de tiroides (9/16; 5/6 en CPA I, y 4/10 en CPA II) y 45% de los de estómago (17/38; 14/28 en CPA I y 3/10 en CPA II). De las líneas celulares de cáncer examinadas en CPA I (Figura 2A) y CPA II (Figura 2B), A549 expresó altos niveles de ADNc de DEGA y K562 esto es aproximadamente 10 veces menos ADNc de DEGA que las células A549. Hubo expresión mínima en las células Molt-4, G361 y HeLa.
La Tabla 1 además proporciona una síntesis de la expresión diferencial regulada de DEGA de varios tejidos usando las matrices. Los niveles de expresión se normalizaron contra el ADNc de 241 tejidos tumorales y normales correspondientes de pacientes individuales.
TABLA 1
- Tipo de cáncer
- Número de muestras Regulado por aumento Regulado por disminución Sin diferencia
- Estómago
- 28 45% 34% 21%
- Tiroides
- 6 83% 0% 17%
- Mamas
- 50 6% 70% 24%
- Ovario
- 14 0% 43% 57%
- Pulmón
- 21 19% 57% 24%
- Útero
- 42 19% 26% 55%
- Colon
- 34 26% 26% 48%
- Cuello uterino
- 1 0% 0% 100%
- Riñón
- 20 10% 10% 80%
- Recto
- 18 11% 11% 78%
- Próstata
- 4 0% 50% 50%
- Páncreas
- 1 0% 0% 100%
- Intestino delgado
- 2 0% 0% 100%
En veintiocho cánceres de estómago y seis de tiroides perfilados, hS30-21616/DEGA estaba regulado por aumento en 45% y 83% de los tumores respectivamente versus las muestras normales. Sin embargo, en cincuenta cánceres de mamas, catorce de ovarios, y
5 veintiún de pulmón tipificados, hS30-21616/DEGA estaba regulado por disminución en 70%, 43% y 57% de los tumores respectivamente versus las muestras normales. Los resultados mostraron que hS30-21616/DEGA se expresa en forma diferencial en diferentes tipos de tumores y puede cumplir un papel en la modulación del crecimiento tumoral.
Ejemplo 4
10 El presente ejemplo demuestra el análisis de Northern Blot de la expresión de DEGA en células de adenocarcinoma gástrico. La observación de que 45% de las muestras de pacientes con cáncer de estómago mostraron expresión diferencial de DEGA en sus tumores pero expresión insignificante en el tejido de estómago normal adyacente sugiere que el DEGA puede cumplir un papel crítico en el desarrollo o progresión de al menos una subfracción del
15 adenocarcinoma gástrico. El análisis de transferencia Northern se llevó a cabo para determinar si DEGA se expresó en las líneas celulares de adenocarcinoma, AGS, NCI-SNU-1, NCI-SNU16, NCI-N87, KATOIII, KKVR y RF-1. La autorradiografía de la Figura 3 muestra esa expresión en células AGS (calle A) y NCI-SNU-16 (calle F), con AGS que tienen una expresión ocho veces superior respecto de
Ejemplo 5
El presente ejemplo demuestra el análisis de Matriz del Perfil del Cáncer (CPA) de la expresión de S30-21616/DEGA en otras líneas celulares de cáncer no adenocarcinoma gástrico. Usando transferencias de punto de ADNc, también se usaron la sonda de S3021616/DEGA y las condiciones usadas para CPA I y II para hibridar la Matriz de Perfil de Línea de Cáncer BD Bioscience, que contiene ADNc de líneas celulares que representan cáncer de pulmón (A549, NCI-H-460, NCI-H1299), colon (HCT-116, HCT-15, HT-29), mamas (MDAMB4355, MDA-MB231, MCF7), ovario (SK-OV-3), cuello uterino (HeLa), próstata (DU-145, PC3), piel (SK-MEL-28, SK-MEL-5, SK-NSH, IMR-32, U-87MG), cerebro (IMR-32, U-87MG), riñón (786-O, ACHN), hígado (Hep-G2), colon (Colo589), osteosarcoma (U2-OS) y epidermis (A431).
Los resultados mostraron que la expresión más alta se observó en las células pulmonares NCI-H1299 y A549 (Figura 4, panel izquierdo), células de riñón ACHN y células de osteosarcoma U2-OS (Figura 4, panel derecho). Se observó menor expresión pero significativa en la línea renal, 786-O (Figura 4, panel derecho), células mamarias MDA-MB-231 y línea celular de cáncer de ovario, SKOV-3 (Figura 4, panel izquierdo).
Ejemplo 6
El presente ejemplo demuestra la clonación del ADNc de S30-21616/DEGA. En breves palabras, se amplificó ADNc de S30-21616/DEGA humano como un producto RT-PCR derivado de Marathon-Ready™ A549, preparaciones de ADNc de línea celular de carcinoma de pulmón y bazo (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA). Los cebadores de PCR usados para amplificar el polinucleótido de interés son el cebador de PCR delantero No. 1 con la secuencia 5’ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG 3’ (SEQ ID NO14) y el cebador de PCR inverso No. 2,5’ TTA AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT G 3’ (SEQ ID NO: 15) (Bio-Synthesis Incorporated, Lewisville, TX; los codones de comienzo y detención están subrayados). Se realizó la reacción de PCR usando protocolos de RT-PCR estándares bien conocidos en la técnica, con la excepción de la polimerasa usada, que es Titanium Taq polimerasa (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA), se utilizó específicamente la condición de RT-PCR descripta en el manual de ADNc de Marathon-Ready™: 94°C, 30 segundos; 68°C, 2 minutos.
El producto de PCR del ORF de S30-21616/DEGA (1569 pb) se clonó en pCR2.1 (InVitrogen Corporation, TOPO TA® Cloning Kit, Carlsbad, CA) y se verificó la secuencia (Molecular Genetics Instrumentation Facility, University of Georgia, Athens, GA; GENEWIZ Inc, North Brunswick, NJ). Para obtener la secuencia de ADN corriente arriba del codón de comienzo de S30-21616/DEGA; se realizó 5’RACE usando ADNc A549 Marathon-Ready como se explicó antes con pocas modificaciones. Asp1, un cebador delantero (incluido con ADNc Marathon-Ready™) y un cebador inverso específico del gen de S30-21616/DEGA (5’AAC TCA GGT CCA GTC TCT TAA TCA G 3’; SEQ ID NO : 16) generaron un producto de PCR después de 35 rondas de amplificación (94°C, 30 seg; 57°C, 30 seg; 68°C, 2 min) que se subclonó en pCR2.1 y se verificó la secuencia. La secuencia que representa la 3’UTR de S30-21616/DEGA se obtuvo inicialmente por computación del clon BAC del cromosoma 12 humano, GS1-99H8 (GenBank® N° de acceso AC004010). Posteriormente se diseño una serie de cebadores de PCR para determinar la secuencia de 3’UTR más larga presente en la preparación de ADNc de A549. El siguiente conjunto de cebadores se usó para identificar el segmento de 3’UTR más largo: cebador delantero 5’ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG 3’ (SEQ ID NO: 17); codón de comienzo subrayado y cebador inverso 5’CAA AAT GAA AAG ACA GGC AAA CAA ATG 3’ (SEQ ID NO: 18), que se inicia en los X nucleótidos 3’del ORF de S30-2161 6/DEGA.
La Figura 5A muestra esquemáticamente los rasgos estructurales del producto génico de S30-21616/DEGA. La proteína posee una secuencia señal y un dominio de transmembrana lo que sugiere que se puede localizar en la superficie celular. Su porción extracelular putativa contiene un dominio de Ig y 5 repeticiones ricas en leucina (LRR) flanqueadas por residuos de cisteína presentes en los dominios de LRR-N-terminal (LRR-NT) y LRR-C-terminal (LRR-CT). En consecuencia, S30-21616/DEGA parece pertenecer a la superfamilia LRR. La porción citosólica putativa de S30-21616/DEGA contiene 102 aminoácidos y carece de la presencia de algunos dominios de proteína conocidos. Aproximadamente 1/5 o 20 de los residuos citosólicos son una serina o una treonina, lo que sugiere que S30-21616/DEGA puede actuar como una molécula de señalización en la célula. Tomado en conjunto, el análisis de la secuencia de proteínas sugiere que el producto génico de S30-21616/DEGA puede actuar como una molécula de adhesión celular de señalización. La correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína se ilustra en la Figura 5B.
Ejemplo 7
El presente ejemplo demuestra la expresión estable de un constructo de fusión de S3021616/DEGA-EGFP en células 293 y localización subcelular de la proteína. En breves palabras, una proteína de fusión se manipuló genéticamente por la cual una proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) se fusionó a su extremo C terminal. El ORF de S3021616/DEGA se amplificó por PCR y se clonó en sitios XhoI/AgeI de pEGFP-N1 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se realizó la reacción de PCR como se describió en la sección de clonación del ADNc de S30-21616/DEGA con la excepción de que se usó el cebador delantero (5’ATC CTC GAG GCG ACC ATA ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT 3’; SEQ ID NO: 19), que contenía la secuencia nativa Kozak y un sitio Xho I (subrayado) 5’ al codón de comienzo mostrado en negrita. El cebador inverso usado (5’GAT CAC CGG TGC AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT GTC 31; SEQ ID NO: 20) contenía un sitio Age I (subrayado) 3’ del codón de detención que se muestra en negrita.
El constructo S30-21616/DEGA-EGFP se transfectó en forma estable en células 293 usando el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) descripto por el fabricante. Se usó una relación de FuGENE6 : ADN de 2: 1. Las células transfectadas se dejaron 2 días a 37 °C, después de tal tiempo se sembraron en dilución limitante y se sometieron a selección con 800 µg/ml de geneticina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Los clones individuales se aislaron por tripsinización usando anillos de clonación y se dejaron expandir.
Para determinar la localización subcelular de la proteína de fusión de S30-21616/DEGAEGFP, se evaluaron los clones usando un microscopio fluorescente Zeiss Axioskop (200x de aumento). La micrografía fluorescente que se muestra en la Figura 7 confirmó la localización en la superficie celular de la proteína S30-21616/DEGA.
Ejemplo 8
El presente ejemplo demuestra la expresión estable de los constructos antisentido S3021616/DEGA en las células AGS. El perfil de expresión de S30-21616/DEGA sugiere que puede cumplir un papel funcional en el desarrollo o la progresión de un subconjunto de adenocarcinoma gástrico humano. Para tratar el papel funcional de S30-21616/DEGA, la línea celular AGS humana que ha mostrado que expresa niveles significativos de ARNm de S3021616/DEGA se transfectó para expresar en forma estable el constructo de S30-21616/DEGA antisentido o un vector vacío. Las líneas celulares establecidas se usaron en estudios de comparación de clones en ensayos de ciclo celular, proliferación y tumorigenicidad.
Para generar clones antisentido S30-21616/DEGA, se clonaron un fragmento de nucleótidos que abarca el ORF entero de 30-21616/DEGA así como un que comprendía los 608 nucleótidos más cercanos a 5’ de su ORF (generados de un digesto parcial de EcoRI de pCR2.1-S30-21616/DEGA) en pIRES PURO2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) en orientación inversa y se transfectaron en forma estable en células AGS. En forma concurrente, pIRES PURO2 también se transfectó en forma estable en estas células para actuar como un control del vector vacío. La transfección y el aislamiento del clon se realizaron exactamente como se describió para la fusión de S30-21616/DEGA-EGFP con la excepción de que las células se seleccionaron con 400 µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).
Ejemplo 9
El presente ejemplo demuestra la expresión comparativa de los clones AGS/DEGA antisentido y del vector vacío por análisis de transferencia Northern. Para determinar el efecto de la expresión de S30-21616/DEGA en la línea celular de adenocarcinoma gástrico, se llevaron a cabo procedimientos de transferencia Northern de AGS transfectado en forma estable con S30-21616/DEGA antisentido y el vector vacío. Se aisló ARN total usando el sistema Micro-to-Midi Total RNA (InVitrogen Corporation, Carlsbad, CA) exactamente como recomienda el fabricante y 5 µg se resolvieron en 1,2% de gel de formaldehído desnaturalizante y se transfirieron a membranas de Nytran® SuPerCharge (Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH). Las transferencias se hibridaron con sonda C-terminal de S3021616/DEGA marcada aleatoriamente con 32P usada como sonda de las transferencias de ADNc CPA I y II. Se realizaron hibridaciones durante una hora a 68°C usando solución de ExpressHyb™ (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Posteriormente se realizaron tres lavados a temperatura ambiente de 10 minutos (2 X SSC, 0,05% de SDS) y dos lavados de 20 minutos a 50°C (0,1 X SSC, 0,1% de SDS). Las membranas se lavaron en 2 X SSC y se expusieron toda una noche a -70°C a una película Kodak BioMax MR. (Eastman Kodak Company, Rochester, NY).
El análisis de transferencia Northern de los clones antisentido AGS/DEGA mostró la regulación por disminución significativa y estable de la expresión de S30-21616/DE. La Figura 8 muestra una reducción del nivel de expresión de ARNm para el clon antisentido AGS/DEGA #6 (calle 3) y el clon #11 (calle 4) en comparación con las células progenitoras AGS no transfectadas o de tipo salvaje (WT) (calle 1) y el clon del vector vacío AGS #15 (calle 2). El panel inferior muestra la expresión de ARNm de β-actina en las células analizadas como controles.
Ejemplo 10
El presente ejemplo demuestra los perfiles de contenido de ADN/ ciclo celular de los clones antisentido AGS/DEGA y los clones del vector vacío por análisis de citometría de flujo. Para medir el contenido de ADN y en consecuencia del perfil del ciclo celular, se utilizó la citometría de flujo.
El vector vacío de AGS y los clones antisentido S30-21616/DEGA se cultivaron asincrónicamente en medio de cultivo que contiene suero, se tripsinizaron, se lavaron una vez en PBS y se tiñeron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con solución de yoduro de propidio provista en el kit ADN QC Particles (Catálogo # 349523; Becton Dickinson). Las células se analizaron posteriormente en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSVantage™ M usando los parámetros descriptos en el kit ADN QC particle. Se evaluó el tamaño celular por microscopía óptica.
El análisis de citometría de flujo de las células teñidas con yoduro de propidio mostró que las células AGS/vector vacío demostraron un perfil del contenido de ADN/fase de ciclo celular típico para células proliferantes, con una mayoría de células en G0/G1, seguido en cantidad por células en fase G2/M y S (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma superior). En contraste los clones antisentido S30-21616/DEGA #6 (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma medio) y #11 (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma inferior) exhibieron una alteración drástica del perfil del ciclo celular. Casi todas las células exhibieron un desplazamiento hacia la fase G2/M del ciclo celular. El clon #11 mostró un desplazamiento ligeramente superior hacia la fase G2/M que el clon #6. El desplazamiento a G2/M también se correlacionó con el incremento en el tamaño celular observado para el clon antisentido AGS/DEGA #6 y #11 (ver, Figura 9, panel derecho dos inferior) en contraste con el tamaño celular observado en las células del AGS/vector vacío (ver, Figura 9, panel derecho superior).
Ejemplo 11
El presente ejemplo demuestra los estudios de tumorigenicidad in-vivo de las células que expresan DEGA. Dadas las diferencias del perfil del ciclo celular observadas entre AGS/vector vacío y los clones antisentido AGS/DEGA, también se espera una diferencia de la proliferación celular in vivo. Debido a que las células AGS son tumorigénicas en ratones desnudos, se estudió el efecto de S30-216161DEGA antisentido en la supresión de la expresión de S30-21616/DEGA y en consecuencia la influencia negativa sobre el potencial tumorigénico de las células AGS de la siguiente manera. Los clones de AGS se suspendieron en medio de cultivo, se colocaron en hielo y se mezclaron por completo con MATRIGEL™ (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA) en una relación de 1: 1 (v/v). MATRIGEL™ deriva del sarcoma de ratón Engelbroth-Holm-Swarm, que se halló que es una fuente rica en proteínas de ECM: laminina, colágeno IV, nidogeno/enactina y proteoglicano (12). Cuando se mezcla con las líneas celulares, MATRIGEL™ aumenta la tumorigénesis (27). En cada ratón atímico (nu/nu)(Charles River Laboratories, Wilmington, MA), se inyectaron diez millones de células por vía subcutánea y se midieron los volúmenes del tumor (mm3) en forma semanal usando calibres durante 11 semanas.
La Figura 10 ilustra los resultados del estudio de crecimiento del tumor en ratones. Después de 75 días, 12/12 ratones inyectados con células AGS y 19/19 ratones inyectados con AGS/vector vacío clon #15 desarrollaron un tumor con un volumen medio de aproximadamente 800 mm3. En marcado contraste, solo 6/12 ratones inyectados con clon antisentido AGS/DEGA #6 y 6/19 ratones inyectados con clon antisentido AGS/DEGA #11 desarrollaron tumores con un volumen de tumor medio de aproximadamente 20 mm3. SEQ IDNO: 1 Secuencia de ADNc hS30-21616/DEGA: El marco de lectura abierto se muestra en mayúsculas. Letras en negrita = codones de
comienzo y detención. Para más información de la secuencia, ver la Figura 1 del manuscrito.
SEQ IDNO: 2
Secuencia de aminoácidos de hS30-21616/DEGA:
SEQ IDNO: 3
Secuencia de polinucleótidos de S30-21616 de ratón, mS30-21616/DEGA.
SEQ IDNO: 4
Secuencia de aminoácidos del polipéptido de S30-21616 de ratón, mS30-21616/DEGA.
SEQ IDNO: 5 Secuencia de aminoácidos del polipéptido de S30-21616/DEGA humano que carece del dominio de transmembrana (TM), -TM hS30-21616/DEGA.
LYLSGNFLTQFPMDLYVGRFKL
SEQ ID NO: 7 Repetición Rica en Leucina 1
10 VCPTACICATDIVSCTNKNLSKVPGNLFRLIKR
SEQ ID NO: 8 Repetición Rica en Leucina 2
SFAKLNTLILRHNNI
SEQ ID NO: 9 Repetición Rica en Leucina 3
TSISTGSFSTTPNLKCLDLSSNKLKTVKNAVFQELKVLEVLLLYN
15 SEQ ID NO: 10 Repetición Rica en Leucina 4
LKVLEVLLLYNNHISYLDPSAFGG
SEQ ID NO: 11 Repetición Rica en Leucina 5
LSQLQKLYLSGNFLTQFPMDLYVG
SEQ ID NO: 12 Repetición Rica en Leucina 6
20 LAELMFLDVSYNRIPSMPMHHINLV
5’-ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG -3’
5 SEQ ID NO: 15 Cebador de PCR 2
5’-TTA AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT-3’
SEQ ID NO:16 Cebador inverso específico del gen S30-21616/DEGA
5’-AAC TCA GGT CCA GTC TCT TAA TCA G-3’
SEQ ID NO:17 Cebador delantero
10 5’-ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG-3’
SEQ ID NO:18 Cebador inverso
5’-CAA AAT GAA AAG ACA GGC AAA CAA ATG-3’
SEQ ID NO:19 Cebador delantero para el constructo de fusión S30-21616/DEGA-EGFP
5’ATC CTC GAG GCG ACC ATA ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT 3’
15 SEQ ID NO:20 Cebador inverso para el constructo de fusión S30-21616/DEGA-EGFP
5’ GAT CAC CGG TGC AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT GTC 3’
Claims (14)
- Reivindicaciones
- 1.
- Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
-
- 2.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido está en forma de ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
-
- 3.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora o una cadena no codificadora.
-
- 4.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de cualquier reivindicación precedente, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
-
- 5.
- Un procedimiento in vitro de inhibición de la expresión del polipéptido de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 que comprende introducir el oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una célula, en el que el oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se administra en una célula por un procedimiento seleccionado del grupo constituido por: endocitosis mediada por receptor; microinyección; por medio de complejos ADN-proteína; y encapsulación liposómica catiónica.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que un ligando del receptor o anticuerpos específicos de la célula asisten en la conducción del oligonucleótido a la célula.
-
- 8.
- Uso de un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, para la fabricación de un medicamento para tratar adenocarcinoma gástrico.
-
- 9.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido está en forma de un ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
-
- 10.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora, una cadena no codificadora o una combinación de estas.
-
- 11.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, un complemento de esta, un fragmento de esta o un ORF de esta.
-
- 12.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el oligonucleótido comprende 20-30 o 12-25 nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
- 13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
- 14. Un oligonucleótido antisentido aislado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para tratar el adenocarcinoma gástrico.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39267502P | 2002-06-28 | 2002-06-28 | |
US392675P | 2002-06-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2350828T3 true ES2350828T3 (es) | 2011-01-27 |
Family
ID=30000915
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03762257T Expired - Lifetime ES2350828T3 (es) | 2002-06-28 | 2003-06-30 | Nuevas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y sus usos. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070128595A1 (es) |
EP (2) | EP1572952B1 (es) |
JP (1) | JP4416650B2 (es) |
AT (1) | ATE483030T1 (es) |
AU (1) | AU2003261102A1 (es) |
CA (1) | CA2491083A1 (es) |
DE (1) | DE60334400D1 (es) |
ES (1) | ES2350828T3 (es) |
WO (1) | WO2004003165A2 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003285385A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-09 | Licentia Ltd | The transmembrane protein amigo and uses thereof |
WO2007122820A1 (ja) | 2006-04-18 | 2007-11-01 | Perseus Proteomics Inc. | 膵臓癌の診断薬及び治療薬 |
US20110097261A1 (en) * | 2006-07-20 | 2011-04-28 | Janatpour Mary J | Amigo-2-inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer |
JP2010280568A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-16 | Perseus Proteomics Inc | 肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、及びメラノーマの診断薬および治療剤 |
JP2011001267A (ja) * | 2007-10-17 | 2011-01-06 | Univ Of Tokyo | 大腸癌治療薬 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
WO2001053455A2 (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-26 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
ATE348108T1 (de) * | 1999-03-08 | 2007-01-15 | Genentech Inc | Methode zum nachweis von tumoren |
WO2001057190A2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-09 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
JP2003135075A (ja) * | 2001-11-05 | 2003-05-13 | Research Association For Biotechnology | 新規な全長cDNA |
AU2003285385A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-09 | Licentia Ltd | The transmembrane protein amigo and uses thereof |
-
2003
- 2003-06-30 AU AU2003261102A patent/AU2003261102A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-30 CA CA002491083A patent/CA2491083A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-30 EP EP03762257A patent/EP1572952B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-30 WO PCT/US2003/020601 patent/WO2004003165A2/en active Application Filing
- 2003-06-30 DE DE60334400T patent/DE60334400D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-30 US US10/519,726 patent/US20070128595A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-30 EP EP10150784A patent/EP2275573A1/en not_active Withdrawn
- 2003-06-30 JP JP2004518131A patent/JP4416650B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-30 AT AT03762257T patent/ATE483030T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-06-30 ES ES03762257T patent/ES2350828T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1572952A2 (en) | 2005-09-14 |
WO2004003165A3 (en) | 2006-07-20 |
EP1572952A4 (en) | 2007-08-29 |
EP1572952B1 (en) | 2010-09-29 |
AU2003261102A8 (en) | 2004-01-19 |
DE60334400D1 (de) | 2010-11-11 |
EP2275573A1 (en) | 2011-01-19 |
CA2491083A1 (en) | 2004-01-08 |
ATE483030T1 (de) | 2010-10-15 |
JP4416650B2 (ja) | 2010-02-17 |
WO2004003165A2 (en) | 2004-01-08 |
WO2004003165A9 (en) | 2004-04-01 |
JP2006508641A (ja) | 2006-03-16 |
US20070128595A1 (en) | 2007-06-07 |
AU2003261102A1 (en) | 2004-01-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2381014T3 (es) | Proteína quimérica inhibidora de la angiogénesis y el uso | |
JP2020519298A (ja) | バイシストロン性キメラ抗原受容体及びそれらの使用 | |
TWI480048B (zh) | 活化素-ActRIIa拮抗劑及其治療或預防乳癌之用途 | |
JP2009515520A (ja) | 肝細胞成長因子イントロン融合蛋白 | |
WO2014046481A1 (ko) | 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 | |
JP2006515318A (ja) | 特異的に発現する癌関連遺伝子、それによってコードされるポリペプチドおよびその使用方法 | |
KR20010074494A (ko) | 피부세포에서 분리한 폴리뉴클레오티드와 이의 이용방법 | |
CN111511911A (zh) | 表达特异性地识别人间皮素的细胞表面分子、il-7和ccl19的免疫活性细胞 | |
TW202120552A (zh) | 嵌合抗原受體及其應用 | |
US9314497B2 (en) | E2F as a target of hormone refractory prostate cancer | |
KR20020013543A (ko) | 피부세포에서 분리한 조성물 및 이의 이용방법 | |
ES2350828T3 (es) | Nuevas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y sus usos. | |
ES2344179T3 (es) | Genes expresados diferencialmente en cancer pancreatico y displasia. | |
US20040259196A1 (en) | T cell receptor variants expressed in mesenchymal cells and uses thereof | |
JP2007209328A (ja) | ガレクチン−9利用遺伝子治療剤 | |
JP4462560B2 (ja) | アポトーシス誘導剤及びアポトーシス誘導方法 | |
JP2008534007A (ja) | ヒトのプロトオンコジーンtrgおよび該プロトオンコジーンにコード化されるタンパク質 | |
WO2012122943A1 (zh) | 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物 | |
US7867731B2 (en) | HX2004-6 polypeptide expressed in cancerous cells | |
JP2008271784A (ja) | 新規薬剤デリバリー系 | |
EP2750691B1 (en) | Srpx for treatment of cancer | |
US20110086042A1 (en) | Centrosomal Proteins, Nucleic Acids and Method of Use Thereof | |
US20190352367A1 (en) | Cancer treatment using cx26 blocking peptides | |
ES2252032T3 (es) | Modulacion de angiogenesis usando angiotensina-7 antiangiogenica y polinucleotidos codificantes para dicha sustancia para el tratamiento de tumores. | |
JP2000325087A (ja) | Tsa2306遺伝子 |