ES2349045T3 - COMPOSITIONS AND CEPAS OF THE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra la enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, dicha composición comprendiendo una cantidad eficaz de un virus del PRRS atenuado seleccionado del grupo que consiste en el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6231, el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6282 y combinaciones de los mismos; y un vehículo o disolvente farmacéuticamente aceptable.An immunogenic composition for use in the induction of a protective immune response against the disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, said composition comprising an effective amount of an attenuated PRRS virus selected from the group consisting of the attenuated PRRS virus of ATCC PTA-6231, the attenuated PRRS virus of ATCC PTA-6282 and combinations thereof; and a pharmaceutically acceptable carrier or solvent.

Description

Campo de la Invención Field of the Invention

La presente invención se refiere a dos cepas atenuadas del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y las composiciones inmunógenas que comprenden una o más cepas del virus atenuado del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Antecedentes de la Invención The present invention relates to two attenuated strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and immunogenic compositions comprising one or more strains of the attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) virus. Background of the Invention

El PRRS se reconoció por primera vez en los Estados Unidos en 1987. Se extendió rápidamente a través de todas las áreas principales de producción porcina de Norte América. Después apareció en Europa y hoy el PRRSV tiene una distribución casi mundial. Muchos productores porcinos, oficiales del gobierno y veterinarios creen que el PRRS es actualmente una de las amenazas económicas más serias afrontadas por las industrias porcinas en todo el mundo. The PRRS was first recognized in the United States in 1987. It spread rapidly throughout all major swine production areas in North America. Then it appeared in Europe and today the PRRSV has an almost worldwide distribution. Many pig producers, government officials and veterinarians believe that PRRS is currently one of the most serious economic threats faced by pig industries worldwide.

Como su nombre implica, el PRRS se caracteriza clínicamente por su capacidad para provocar fallo reproductivo en hembras preñadas, especialmente cuando inicialmente se infecta tarde en la gestación y enfermedad del tracto respiratorio en cerdos de todas las edades, pero más común y severo en cerdos jóvenes. La infección del PRRSV se piensa que también potencia los efectos de otros patógenos porcinos. En la base de estudios serológicos retrospectivos, también se ha hecho evidente que muchas infecciones con el PRRSV de porcinos son subclínicas o producen signos clínicos menos obvios. Por lo tanto, el PRRSV a menudo logra el acceso a una piara y se extiende extensivamente antes de que su presencia se detecte por primera vez. As the name implies, PRRS is clinically characterized by its ability to cause reproductive failure in pregnant females, especially when it is initially infected late in pregnancy and respiratory tract disease in pigs of all ages, but more common and severe in young pigs. . PRRSV infection is thought to also potentiate the effects of other porcine pathogens. On the basis of retrospective serological studies, it has also become clear that many infections with porcine PRRSV are subclinical or produce less obvious clinical signs. Therefore, PRRSV often gains access to a herd and extends extensively before its presence is first detected.

El virus puede persistir en un hospedador infectado durante al menos varios meses. Dichos "vehículos" perpetúan la infección y hacen el control de la enfermedad sumamente difícil. Como una consecuencia, los medios más eficaces para reducir el impacto económico del PRRSV son vacunar (inmunizar) cerdos potencialmente susceptibles antes de que se expongan al virus de campo virulento. The virus can persist in an infected host for at least several months. Such "vehicles" perpetuate the infection and make disease control extremely difficult. As a consequence, the most effective means to reduce the economic impact of PRRSV is to vaccinate (immunize) potentially susceptible pigs before they are exposed to the virulent field virus.

Las vacunas atenuadas, (fabricadas por Boehingher Ingelheim) preparadas por cepas únicas del PRRSV, están disponibles en el mercado. Una está autorizada para usarse en cerdos entre 3 y 18 semanas de edad para la prevención de enfermedades del tracto respiratorio (Gorcyca et al., 1995). Una está autorizada para la pre-reproducción. Attenuated vaccines, (manufactured by Boehingher Ingelheim) prepared by single strains of PRRSV, are commercially available. One is authorized for use in pigs between 3 and 18 weeks of age for the prevention of respiratory tract diseases (Gorcyca et al., 1995). One is authorized for pre-reproduction.

Se ha descrito otra vacuna atenuada para la prevención del fallo reproductivo (Hesse et al., 1996). Se prepara a partir de una cepa única del PRRSV y sólo se ha ensayado contra una única cepa del PRRSV. La cepa de desafío se describe como heteróloga en la base de la respuesta anamnésica de hembras de primera cría vacunadas siguiendo el desafío; no obstante, no se ha presentado otra evidencia para establecer que las dos cepas, es decir, la usada para la vacuna y la usada para el desafío de inmunidad, son genéticamente o antigénicamente distintas. El documento WO 00/65032 describe un método de atenuación, así como una cepa del PRRSV atenuada derivada de la cepa particularmente virulenta JA-142 (Ejemplo 1, p. 7, I. 5 -p. 10, I. 27). Another attenuated vaccine for the prevention of reproductive failure has been described (Hesse et al., 1996). It is prepared from a single strain of PRRSV and has only been tested against a single strain of PRRSV. The challenge strain is described as heterologous on the basis of the anamnestic response of first-born females vaccinated following the challenge; however, no other evidence has been presented to establish that the two strains, that is, the one used for the vaccine and the one used for the immunity challenge, are genetically or antigenically distinct. WO 00/65032 describes an attenuation method, as well as an attenuated PRRSV strain derived from the particularly virulent strain JA-142 (Example 1, p. 7, I. 5-p. 10, I. 27).

Existen dos serotipos principales conocidos del PRRSV (Done et al., 1996). Uno (prototipo Lelystad) es representativo de al menos la mayoría de las cepas que se han aislado en Europa del Este. El otro (prototipo de ATCC 2332) es representativo de al menos la mayoría de las cepas aisladas en América del Norte y Asia. Existen también variantes antigénicas en los prototipos (Meng et al., 1995) y las diferencias de base de secuencia entre cepas aisladas en América del Norte han permitido su diferenciación (Wesley et al., 1996). SUMARIO DE LA INVENCIÓN There are two main known serotypes of PRRSV (Done et al., 1996). One (Lelystad prototype) is representative of at least most of the strains that have been isolated in Eastern Europe. The other (ATCC 2332 prototype) is representative of at least the majority of strains isolated in North America and Asia. There are also antigenic variants in the prototypes (Meng et al., 1995) and the base sequence differences between isolated strains in North America have allowed their differentiation (Wesley et al., 1996). SUMMARY OF THE INVENTION

Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición inmunógena que protege un cerdo contra la enfermedad clínica provocada por el PRRSV. Las composiciones inmunógenas derivaron de dos cepas del PRRSV que se aislaron de cerdos afectados con el PRRSV en los Estados Unidos. An object of the present invention is to provide an immunogenic composition that protects a pig against the clinical disease caused by PRRSV. Immunogenic compositions were derived from two strains of PRRSV that were isolated from pigs affected with PRRSV in the United States.

Otro objeto de la invención es proporcionar dos cepas atenuadas del PRRSV que serían útiles en una vacuna polivalente contra el PRRS. De esa manera, la invención proporciona: Another object of the invention is to provide two attenuated strains of PRRSV that would be useful in a polyvalent vaccine against PRRS. In that way, the invention provides:

1.one.

Una composición inmunógena para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra una enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, dicha composición comprende una cantidad eficaz de un virus del PRRS atenuado  An immunogenic composition for use in the induction of a protective immune response against a disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, said composition comprises an effective amount of an attenuated PRRS virus

seleccionado de un grupo que consiste en el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6281, el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6282 y combinaciones de los mismos; y un vehículo o un disolvente farmacéuticamente aceptable. selected from a group consisting of the ATCC attenuated PRRS virus PTA-6281, the ATCC attenuated PRRS virus PTA-6282 and combinations thereof; and a pharmaceutically acceptable carrier or solvent.

2.2.

La composición inmunógena como se menciona anteriormente, en la que dicho virus es el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6281.  The immunogenic composition as mentioned above, wherein said virus is the ATRS attenuated PRRS virus PTA-6281.

3.3.

La composición inmunógena de lo que se menciona anteriormente, en la que dicho virus es el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6282.  The immunogenic composition of what is mentioned above, wherein said virus is the ATRS attenuated PRRS virus PTA-6282.

4.Four.

Una composición inmunógena polivalente para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra una enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, dicha composición comprende una cantidad eficaz de dos o más virus atenuados, que comprenden al virus del PRRS de ATCC PTA-6281 y al virus del PRRS de ATCC PTA-6282.  A polyvalent immunogenic composition for use in inducing a protective immune response against a disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, said composition comprises an effective amount of two or more attenuated viruses, which comprise the ATCC PTA PRRS virus. -6281 and the ATCC PRRS virus PTA-6282.

5.5.

La composición inmunógena de lo que se menciona anteriormente, comprende adicionalmente un adyuvante.  The immunogenic composition of what is mentioned above further comprises an adjuvant.

6.6.

El inmunógeno polivalente como se menciona anteriormente, comprende adicionalmente un adyuvante.  The polyvalent immunogen as mentioned above, additionally comprises an adjuvant.

7.7.

Un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino atenuado PP5 como se representa por el depósito de ATCC Nº PTA-6282.  An attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus PP5 as represented by ATCC depot No. PTA-6282.

8.8.

Un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino atenuado LC13 como se representa por el depósito de ATCC Nº PTA-6281.  An attenuated swine reproductive and respiratory syndrome virus LC13 as represented by ATCC depot No. PTA-6281.

9.9.

El uso de una composición inmunógena de acuerdo con cualquiera anteriormente mencionada o una composición inmunógena polivalente de acuerdo con 6. en la fabricación de un medicamento para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra una enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino.  The use of an immunogenic composition according to any of the aforementioned or a polyvalent immunogenic composition according to 6. in the manufacture of a medicament for use in the induction of a protective immune response against a disease caused by the reproductive and respiratory syndrome virus porcine.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO BIOLOGICAL MATERIAL DEPOSIT

Las cepas atenuadas PP5 y LC13 se depositaron el 4 de noviembre del 2004 bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection en Manassas, Virginia y se han asignado los Nº de Acceso de ATCC PTA-6282 y de ATCC PTA-6281, respectivamente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN The attenuated strains PP5 and LC13 were deposited on November 4, 2004 under the terms of the Budapest Treaty at the American Type Culture Collection in Manassas, Virginia and ATCC Access Numbers PTA-6282 and ATCC PTA-6281 have been assigned respectively. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

En el presente documento "composición inmunógena" se define en su amplio sentido para referirse a cualquier tipo de agente biológico en una forma administrable capaz de estimular una respuesta inmune en un animal. Una composición inmunógena puede componerse por el agente viral o el virus mismo o un componente inmunógeno (antigénico) del virus. In this document "immunogenic composition" is defined in its broad sense to refer to any type of biological agent in an administrable form capable of stimulating an immune response in an animal. An immunogenic composition may be composed of the viral agent or the virus itself or an immunogenic (antigenic) component of the virus.

La composición inmunógena de la invención se preparó de cualquiera o más de las dos cepas atenuadas del PRRSV: PP5 y LC13. Cada cepa se ensayó individualmente por seguridad y por la capacidad de inducir una respuesta inmune y se contempla que una vacuna polivalente comprendida por las dos cepas sería al menos igual de segura y eficaz que cada composición monovalente y puede proporcionar incluso una inmunidad más amplia para cepas de campo virulentas del PRRSV. The immunogenic composition of the invention was prepared from any one or more of the two attenuated strains of PRRSV: PP5 and LC13. Each strain was individually tested for safety and for the ability to induce an immune response and it is contemplated that a polyvalent vaccine comprised of the two strains would be at least as safe and effective as each monovalent composition and may provide even a broader immunity to strains. PRRSV virulent field.

Se seleccionaron dos cepas del PRRSV (cepas PP5 y LC13) para el desarrollo como composiciones inmunógenas. Cepa del PRRSV PP5 Two strains of PRRSV (strains PP5 and LC13) were selected for development as immunogenic compositions. PRRSV strain PP5

Un aislado virulento del virus del PRRS se obtuvo de muestras tisulares de un cerdo enfermo. Se inoculó un homogeneizado tisular del cerdo enfermo en macrófagos alveolares primarios y se detectó la presencia del virus por efectos citopáticos en cultivos inoculados pero no controlados. Posteriormente se demostró el virus aislado por reactividad con anticuerpos monoclonales específicos para el virus del PRRS por inmunofluorescencia indirecta. Las placas de 96 pocillos de células Marc145 confluentes se fijaron con acetona al 80% durante 10 minutos 2 días después de la infección con el virus. Después se incubaron las monocapas con anticuerpos monoclonales SDOW17 o VO17. Después del lavado, se detectó la reactividad del anticuerpo monoclonal con cada virus por incubación con IgG antiratón conjugada con isotiocianato de fluoresceína seguido por un lavado y el examen para fluorescencia por microscopía. Se observó una fluorescencia positiva con ambos anticuerpos monoclonales para el virus PP5. El virus PP5 se atenuó por pases sucesivos en cultivo tisular. El virus se pasó inicialmente por inoculación de cultivos primarios de macrófagos alveolares porcinos (SAM) (para el primer pase) y después por pases sucesivos en células Marc145 para un total de 81 pases. Durante este proceso, los clones del virus se aislaron por purificación en placa y se caracterizaron para propiedades fenotípicas. La composición inmunógena del clon PP5 se seleccionó por crecimiento defectuoso en macrófagos alveolares porcinos y la falta de la inducción de la enfermedad en cochinillos y cerdas preñadas. El PP5 se expandió en células Marc145 y se congeló como A virulent isolate of the PRRS virus was obtained from tissue samples of a diseased pig. A tissue homogenate was inoculated from the diseased pig in primary alveolar macrophages and the presence of the virus was detected by cytopathic effects in inoculated but uncontrolled cultures. Subsequently, the isolated virus was demonstrated by reactivity with monoclonal antibodies specific for the PRRS virus by indirect immunofluorescence. The 96-well plates of confluent Marc145 cells were fixed with 80% acetone for 10 minutes 2 days after infection with the virus. The monolayers were then incubated with monoclonal antibodies SDOW17 or VO17. After washing, the reactivity of the monoclonal antibody with each virus was detected by incubation with anti-mouse IgG conjugated to fluorescein isothiocyanate followed by washing and examination for fluorescence by microscopy. A positive fluorescence was observed with both monoclonal antibodies for the PP5 virus. The PP5 virus was attenuated by successive passes in tissue culture. The virus was initially passed through inoculation of primary porcine alveolar macrophage (SAM) cultures (for the first pass) and then through successive passes in Marc145 cells for a total of 81 passes. During this process, virus clones were isolated by plaque purification and characterized for phenotypic properties. The immunogenic composition of clone PP5 was selected due to defective growth in porcine alveolar macrophages and lack of disease induction in piglets and pregnant sows. PP5 expanded in Marc145 cells and froze as

un virus de cepa madre. a mother strain virus.

El PP5 se puede diferenciar de otras cepas del PRRSV atenuadas aisladas por la región ORF5 de su secuencia. Cepa del PRRSV LC13 PP5 can be differentiated from other attenuated PRRSV strains isolated by the ORF5 region of its sequence. PRRSV strain LC13

Un aislado virulento del virus del PRRS se obtuvo de muestras tisulares de un cerdo enfermo. Se inoculó un homogeneizado tisular del cerdo enfermo en macrófagos alveolares primarios y se detectó la presencia del virus por efectos citopáticos en cultivos inoculados pero no controlados. Posteriormente el virus aislado se demostró ser reactivo con anticuerpos monoclonales específicos para el virus del PRRS por inmunofluorescencia indirecta. Las placas de 96 pocillos de células Marc145 confluentes se fijaron con acetona al 80% durante 10 minutos 2 días después de la infección con el virus. Después se incubaron las monocapas con anticuerpos monoclonales SDOW17 o VO17. Después del lavado, se detectó la reactividad del anticuerpo monoclonal con cada virus por incubación con IgG antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína seguido por un lavado y el examen para fluorescencia por microscopía. Se observó una fluorescencia positiva con ambos anticuerpos monoclonales para el virus LC13. El virus LC13 se atenuó por pases sucesivos en cultivo tisular. El virus se aisló inicialmente en cultivos primarios de macrófagos alveolares porcinos y después se hicieron pases sucesivamente en células Marc145 para un total de 67 pases. Durante este proceso, los clones del virus se aislaron por purificación en placa y se caracterizaron para propiedades fenotípicas. La composición inmunógena del clon (LC13) se seleccionó por crecimiento defectuoso en macrófagos alveolares porcinos y la falta de la inducción de la enfermedad en cochinillos y cerdas preñadas. El LC13 se expandió en células Marc145 y se congeló como un virus de cepa madre. A virulent isolate of the PRRS virus was obtained from tissue samples of a diseased pig. A tissue homogenate was inoculated from the diseased pig in primary alveolar macrophages and the presence of the virus was detected by cytopathic effects in inoculated but uncontrolled cultures. Subsequently, the isolated virus was shown to be reactive with monoclonal antibodies specific for the PRRS virus by indirect immunofluorescence. The 96-well plates of confluent Marc145 cells were fixed with 80% acetone for 10 minutes 2 days after infection with the virus. The monolayers were then incubated with monoclonal antibodies SDOW17 or VO17. After washing, the reactivity of the monoclonal antibody with each virus was detected by incubation with anti-mouse IgG conjugated to fluorescein isothiocyanate followed by washing and examination for fluorescence by microscopy. A positive fluorescence was observed with both monoclonal antibodies to the LC13 virus. The LC13 virus was attenuated by successive passes in tissue culture. The virus was initially isolated in primary cultures of porcine alveolar macrophages and then passes successively in Marc145 cells for a total of 67 passes. During this process, virus clones were isolated by plaque purification and characterized for phenotypic properties. The immunogenic composition of the clone (LC13) was selected for defective growth in porcine alveolar macrophages and lack of disease induction in piglets and pregnant sows. The LC13 was expanded in Marc145 cells and froze as a mother strain virus.

El LC13 se puede diferenciar de otras cepas del PRRSV atenuadas aisladas por la región ORF5 de su secuencia. LC13 can be differentiated from other attenuated PRRSV strains isolated by the ORF5 region of its sequence.

El virus o los virus de la composición se prepararon para la administración por formulación en una dosificación de inmunización eficaz con un vehículo o disolvente farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina fisiológica o un medio de cultivo tisular. La expresión "cantidad eficaz" se define como siendo esa cantidad que inducirá la inmunidad en un cerdo contra el desafío por una cepa virulenta del PRRSV. La determinación de las cantidades de dosificación actuales estaría completamente dentro de la experiencia de una persona en la técnica. Basándose en los ejemplos proporcionados posteriormente, se contempla que una realización es una dosificación única de aproximadamente 104,5 TCID50/ml. The virus or viruses of the composition were prepared for administration by formulation in an effective immunization dosage with a pharmaceutically acceptable carrier or solvent, such as a physiological saline solution or tissue culture medium. The term "effective amount" is defined as being that amount that will induce immunity in a pig against the challenge by a virulent strain of PRRSV. The determination of the current dosage amounts would be completely within a person's experience in the art. Based on the examples provided below, it is contemplated that one embodiment is a single dosage of approximately 104.5 TCID50 / ml.

Las composiciones se pueden administrar por vía oral, por vía oro-nasal The compositions can be administered orally, by oro-nasal route

o por inyección. Se pueden incluir en la formulación de la composición adyuvantes apropiados como se conocen en la técnica. Como se menciona previamente, las composiciones inmunógenas del sujeto o las vacunas se pueden usar de manera individual o se pueden combinar juntas en cualquier combinación en la formulación de una composición polivalente. or by injection. Appropriate adjuvants may be included in the composition formulation as are known in the art. As previously mentioned, the subject's immunogenic compositions or vaccines can be used individually or can be combined together in any combination in the formulation of a polyvalent composition.

Los siguientes ejemplos se usan para ilustrar el logro exitoso de los objetivos de la invención. Ejemplos The following examples are used to illustrate the successful achievement of the objectives of the invention. Examples

Se preparó una composición inmunógena usando MARC145 como el sustrato (no obstante se pueden usar líneas celulares alternas que apoyen el crecimiento del virus del PRRS tales como células MA104). Las células MARC145 se crecieron a confluencia en recipientes de cultivo tisulares adecuados (es decir, botellas de rodillo de 850 cm2) usando un medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) conteniendo suero fetal bovino del 5 al 10%, Lglutamina 2 mM y antibióticos (tales como gentamicina 30 μg/ml). Se pueden también usar los medios de cultivo tisular alternos que pueden apoyar el crecimiento de las células MARC145 tales como medios esenciales modificados de Dulbecco [DEMEM], Medio 199 u otros. Se inocularon las monocapas confluentes de células MARC145 con PP5 y LC13 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:10 (se puede usar MOI en el intervalo de An immunogenic composition was prepared using MARC145 as the substrate (however alternate cell lines that support the growth of PRRS virus such as MA104 cells can be used). MARC145 cells were grown at confluence in suitable tissue culture vessels (i.e., 850 cm2 roller bottles) using a minimum essential Eagle medium (EMEM) containing 5 to 10% bovine fetal serum, 2 mM Lglutamine and antibiotics ( such as gentamicin 30 μg / ml). Alternate tissue culture media that can support the growth of MARC145 cells such as modified essential means of Dulbecco [DEMEM], Medium 199 or others can also be used. The confluent monolayers of MARC145 cells were inoculated with PP5 and LC13 at a multiplicity of infection (MOI) of 1:10 (MOI can be used in the range of

1:5 a 1:100). Seguido de la incubación durante cinco días a 37ºC, los fluidos sobrenadantes del cultivo se recogieron por decantación. 1: 5 to 1: 100). Following the incubation for five days at 37 ° C, the culture supernatants were collected by decantation.

Los fluidos de virus se titularon mediante la realización de diluciones seriadas en EMEM suplementado como precede y la inoculación de 0,2 ml por pocillo en al menos cuatro pocillos replicados de células MARC145 o MA104 confluentes en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Los cultivos se incubaron durante cinco días a 37ºC, 3-5% de CO2 en una cámara humidificada y se observaron para los efectos citopáticos. Los títulos (criterios de valoración al 50%) se calcularon de acuerdo con los métodos de Spearman y Karber. Virus fluids were titrated by performing serial dilutions in EMEM supplemented as above and inoculation of 0.2 ml per well into at least four replicated wells of confluent MARC145 or MA104 cells in a 96-well tissue culture plate. The cultures were incubated for five days at 37 ° C, 3-5% CO2 in a humidified chamber and observed for cytopathic effects. Titles (50% valuation criteria) were calculated according to the methods of Spearman and Karber.

Para la preparación de una composición inmunógena inactivada o una formulación de vacuna inactivada, los fluidos de virus se incubaron con un agente de inactivación química tales como formaldehído, glutaraldehído, etilenimina binaria o beta-propiolactona. Después los fluidos de virus se almacenaron a 4ºC hasta que se formuló en la composición inmunógena. La composición inmunógena se preparó mediante la mezcla de fluidos de virus (conteniendo de 105 a 109 TCID50 del virus; basándose en títulos de preinactivación) con un disolvente fisiológicamente aceptable (tales como EMEM, Hank's Balance Salt Solution®, solución salina tamponada con fosfato) y un adyuvante inmunoestimulante (tales como aceite mineral, aceite vegetal, hidróxido de aluminio, saponina, detergentes no iónicos, escualeno u otros compuestos conocidos en la técnica, usados solos o en combinación). Una dosis de composición inmunógena fue típicamente entre 1 y 5 ml. For the preparation of an inactivated immunogenic composition or an inactivated vaccine formulation, virus fluids were incubated with a chemical inactivating agent such as formaldehyde, glutaraldehyde, binary ethyleneimine or beta-propiolactone. The virus fluids were then stored at 4 ° C until it was formulated in the immunogenic composition. The immunogenic composition was prepared by mixing virus fluids (containing 105 to 109 TCID50 of the virus; based on pre-activation titers) with a physiologically acceptable solvent (such as EMEM, Hank's Balance Salt Solution®, phosphate buffered saline) and an immunostimulant adjuvant (such as mineral oil, vegetable oil, aluminum hydroxide, saponin, non-ionic detergents, squalene or other compounds known in the art, used alone or in combination). A dose of immunogenic composition was typically between 1 and 5 ml.

Para una composición inmunógena viva o una formulación de vacuna viva, los fluidos de virus (virus atenuados) se almacenan congelados a -50ºC o más frío hasta el uso. Los fluidos de virus (contienen típicamente 106,0 TCID50/dosis pero en el intervalo de 103,0 y 107,0 TCID50/dosis) se diluyen con un disolvente fisiológicamente adecuado (tales como EMEM, Hank's Balanced Salt Solution®, solución salina tamponada con fosfato) y una mezcla fisiológicamente adecuada de compuestos diseñados para estabilizar el virus. Los compuestos conocidos en la técnica que pueden usarse solos o en combinación para estabilizar los virus incluyen sacarosa, lactosa, N-Z amina, glutatión, neopeptona, gelatina, dextrano y triptona. La vacuna se almacena congelada (-50ºC o más frío) o liofilizada con almacenamiento a 4ºC hasta el uso. La composición inmunógena o la vacuna tiene típicamente un tamaño de dosis de 2 ml (intervalo de 1 a 5 ml). For a live immunogenic composition or a live vaccine formulation, virus fluids (attenuated viruses) are stored frozen at -50 ° C or colder until use. Virus fluids (typically contain 106.0 TCID50 / dose but in the range of 103.0 and 107.0 TCID50 / dose) are diluted with a physiologically suitable solvent (such as EMEM, Hank's Balanced Salt Solution®, buffered saline solution with phosphate) and a physiologically suitable mixture of compounds designed to stabilize the virus. Compounds known in the art that can be used alone or in combination to stabilize the viruses include sucrose, lactose, N-Z amine, glutathione, neopeptone, gelatin, dextran and tryptone. The vaccine is stored frozen (-50 ° C or colder) or lyophilized with storage at 4 ° C until use. The immunogenic composition or the vaccine typically has a dose size of 2 ml (range 1 to 5 ml).

Para la profilaxis contra la enfermedad inducida por PRRS, los porcinos se vacunan con compuestos inmunógenos inactivados o vivos por administración intradérmica, intramuscular, subcutánea, intranasal u oral de una dosis de la vacuna. Puede administrarse una vacunación de refuerzo de dos a cuatro semanas después de la inmunización inicial. Para la prevención de la enfermedad asociada al PRRS, el régimen de vacunación se inicia típicamente hasta 6 semanas antes de la reproducción y puede suministrarse como tarde una semana después de la reproducción. Para la prevención de la enfermedad respiratoria en cochinillos, la vacunación puede suministrarse como pronto a las 3 semanas de edad. For prophylaxis against PRRS-induced disease, pigs are vaccinated with inactivated or live immunogenic compounds by intradermal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or oral administration of a dose of the vaccine. A booster vaccination may be administered two to four weeks after the initial immunization. For the prevention of PRRS-associated disease, the vaccination regimen is typically started up to 6 weeks before reproduction and can be given at the latest one week after reproduction. For the prevention of respiratory disease in piglets, vaccination can be given as soon as 3 weeks of age.

Los Ejemplos de la Atenuación de Cepas y su Capacidad para Inducir la Respuesta Inmune Experimento de PP5 Examples of Strain Attenuation and Its Capacity to Induce the Immune Response Experiment of PP5

Las cerdas seronegativas del PRRS se inocularon a los 85 días de PRRS seronegative sows were inoculated 85 days after

5 gestación por vía intranasal (3 ml/fosa nasal) con las cepas de vacunas de cepas madre PP5 (104,5 TCID50/ml). Todas las cerdas parieron a su hora prevista. 5 intranasal gestation (3 ml / nostril) with the vaccine strains of PP5 mother strains (104.5 TCID50 / ml). All sows gave birth at their scheduled time.

La Tabla 1 proporciona los resultados para el experimento de cepas del virus del PRRS PP5. El primer grupo PP5-WT es el virus de tipo silvestre o el Table 1 provides the results for the PRRS PP5 virus strain experiment. The first PP5-WT group is the wild-type virus or the

10 control de virulencia/enfermedad. El grupo PP5-MSV es el virus de cepa madre de la cepa atenuada PP5. PP5-BP representa el quinto último pase (pase de cerdo) desde PP5-MSV para ver si tiene lugar la reversión cualquiera a virus de tipo silvestre. 10 virulence / disease control. The PP5-MSV group is the mother strain virus of the attenuated strain PP5. PP5-BP represents the fifth last pass (pig pass) from PP5-MSV to see if any reversal to wild-type virus occurs.

Los resultados del experimento de PP5 se resumen en la Tabla 2. El The results of the PP5 experiment are summarized in Table 2. The

15 PP5-WT provoca una mortalidad en el parto del 69% comparado con PP5-MSV y PP5-BP habiendo provocado sólo del 16% de la mortalidad en el parto al 19% de la mortalidad en el parto, respectivamente. 15 PP5-WT causes a birth mortality of 69% compared to PP5-MSV and PP5-BP having caused only 16% of the birth mortality to 19% of the birth mortality, respectively.

Tabla 1: PP5 Table 1: PP5

Grupo Nº de Cerdas Anticuerpo Elisa % de Mortalidad en el Nacimiento PP5-WT 40 NT 100% PP5-WT 165 0,9 85% PP5-WT 313 1,3 67% PP5-WT 1138 1,2 25% PP5-WT 1156 1,2 45% Group No. of Sows Antibody Elisa% Birth Mortality PP5-WT 40 NT 100% PP5-WT 165 0.9 85% PP5-WT 313 1.3 67% PP5-WT 1138 1.2 25% PP5-WT 1156 1.2 45%

Totales de PP5-WT 69% Totals of PP5-WT 69%

PP5-MSV 1344 0,511 20% PP5-MSV 1347 0,002 0% PP5-MSV 1348 1,005 40% PP5-MSV 1350 1,151 15% PP5-MSV 1353 0,899 0% PP5-MSV 1355 1,188 13% Totales de PP5-MSV 16% PP5-MSV 1344 0.511 20% PP5-MSV 1347 0.002 0% PP5-MSV 1348 1,005 40% PP5-MSV 1350 1,151 15% PP5-MSV 1353 0.899 0% PP5-MSV 1355 1,188 13% Totals of PP5-MSV 16%

PP5-BP PP5-BP

1345 0,932 38% 1345 0.932 38%

PP5-BP PP5-BP

1346 0,56 13% 1346 0.56 13%

PP5-BP PP5-BP

1349 0,515 33% 1349 0.515 33%

PP5-BP PP5-BP

1351 0,569 0% 1351 0.569 0%

PP5-BP PP5-BP

1352 1,174 27% 1352 1,174 27%

PP5-BP PP5-BP

1354 0,624 0% 1354 0.624 0%

Totales de Totals of

PP5-BP PP5-BP

19% 19%

Tabla 2: Resumen de PP5 Table 2: PP5 Summary

% Mortalidad en el Nacimiento % Mortality at Birth

Virus de Tipo Silvestre 69% PP5-WT Virus de Cepa Madre 16% PP5-MSV Virus de Último Pase 19% PP5-BP Wild-type Virus 69% PP5-WT Mother Strain Virus 16% PP5-MSV Last Pass Virus 19% PP5-BP

Experimento de LC13 LC13 experiment

5 Las cerdas seronegativas de PRRS se inocularon a los 85 días de gestación por vía intranasal (3 ml/fosa nasal) con la cepa de vacunas de cepa madre LC13 (104,5 TCID50/ml). Todas las cerdas parieron a su hora prevista. 5 PRRS seronegative sows were inoculated at 85 days of gestation intranasally (3 ml / nostril) with the vaccine strain LC13 (104.5 TCID50 / ml). All sows gave birth at their scheduled time.

La Tabla 3 proporciona los resultados para el experimento de cepas del virus del PRRS LC13. El primer grupo LC13-WT es el virus de tipo silvestre o el Table 3 provides the results for the PRRS LC13 virus strain experiment. The first group LC13-WT is the wild-type virus or the

10 control de virulencia/enfermedad. El grupo LC13-MSV es el virus de cepa madre de la cepa atenuada LC13. LC13-BP representa el quinto último pase (pase de cerdo) desde LC13-MSV para ver si tiene lugar la reversión cualquiera a virus de tipo silvestre. Los resultados del experimento de LC13 se resumen en la Tabla 4. El 10 virulence / disease control. The LC13-MSV group is the mother strain virus of the attenuated strain LC13. LC13-BP represents the fifth last pass (pig pass) from LC13-MSV to see if any reversal to wild-type virus occurs. The results of the LC13 experiment are summarized in Table 4. The

15 LC13-WT provoca una mortalidad en el parto del 86% de los cochinillos, mientras que LC13-MSV y LC13-BP sólo provocan del 12% de la mortalidad en el parto al 15% de la mortalidad en el parto, respectivamente. Tabla 3: LC13 Grupo Nº de Cerdas Anticuerpo Elisa % de Mortalidad en el Nacimiento LC13-WT 187 1,3 75% LC13-WT 309 NT 100% LC13-WT 518 0,8 100% 15 LC13-WT causes a mortality in delivery of 86% of piglets, while LC13-MSV and LC13-BP only cause 12% of the mortality in childbirth to 15% of the mortality in childbirth, respectively. Table 3: LC13 Group No. of Bristles Elisa Antibody% Mortality at Birth LC13-WT 187 1.3 75% LC13-WT 309 NT 100% LC13-WT 518 0.8 100%

LC13-WT 858 1,2 88% LC13-WT 1041 1,2 56% Totales de LC13-WT 86% LC13-WT 858 1.2 88% LC13-WT 1041 1.2 56% Totals of LC13-WT 86%

LC13-MSV 843 1,0 0% LC13-MSV 845 0,7 8% LC13-MSV 846 0,0 0% LC13-MSV 848 1,1 25% LC13-MSV 850 1,0 11% Totales de LC13-MSV 12% LC13-MSV 843 1.0 0% LC13-MSV 845 0.7 8% LC13-MSV 846 0.0 0% LC13-MSV 848 1.1 25% LC13-MSV 850 1.0 11% Totals of LC13-MSV 12%

LC13-BP 844 <0,1 0% LC13-BP 847 <0,1 31% LC13-BP 849 <0,1 10% LC13-BP 851 <0,1 11% LC13-BP 853 <0,1 0% LC13-BP 844 <0.1 0% LC13-BP 847 <0.1 31% LC13-BP 849 <0.1 10% LC13-BP 851 <0.1 11% LC13-BP 853 <0.1 0%

Totales de LC13-BP 13% Totals of LC13-BP 13%

Tabla 4: Resumen de LC13 % Mortalidad en el Nacimiento Table 4: Summary of LC13% Mortality at Birth

Virus de Tipo Silvestre 86% LC13-WT Virus de Cepa Madre 12% LC13-MSV Virus de Último Pase 13% LC13-BP Wild-type Virus 86% LC13-WT Mother Strain Virus 12% LC13-MSV Last Pass Virus 13% LC13-BP

Los datos de anticuerpos del ensayo (Elisa) inmunosorbente de unión a Antibody binding antibody immunosorbent assay (Elisa) data

5 enzimas hallados en las Tablas 1 y 3 representan los resultados de un ensayo de anticuerpos Elisa en las cerdas. ELISA es el ensayo más comúnmente utilizado para la detección de anticuerpos contra el PRRS. El HerdChek PRRS ELISA fabricado por IDEXX Laboratories Inc. es para la detección de anticuerpos anti-PRRS de proteínas de la nucleocápside (N) del suero o el 5 enzymes found in Tables 1 and 3 represent the results of an Elisa antibody test in the sows. ELISA is the most commonly used assay for the detection of antibodies against PRRS. The HerdChek PRRS ELISA manufactured by IDEXX Laboratories Inc. is for the detection of anti-PRRS antibodies from nucleocapsid (N) proteins of serum or

10 plasma porcino. Los resultados del ensayo se determinaron basándose en los valores de la Muestra/Positivo (S/P): positivo = tasa de S/P > 0,4, negativo = tasa de S/P < 0,4. Como los resultados muestran en la Tabla 1 y 3, ambos LC13-MSV y PP5-MSV aumentan los anticuerpos para el PRRS. Estos datos generados proporcionan evidencias de una composición inmunógena. 10 pig plasma. The test results were determined based on the Sample / Positive (S / P) values: positive = S / P rate> 0.4, negative = S / P rate <0.4. As the results show in Table 1 and 3, both LC13-MSV and PP5-MSV raise antibodies to PRRS. These generated data provide evidence of an immunogenic composition.

Los datos presentados en esta solicitud demuestran claramente que las The data presented in this application clearly demonstrates that

cepas de virus atenuadas del PRRS PP5 y LC13 son ambas seguras e inducen attenuated virus strains of PRRS PP5 and LC13 are both safe and induce

una respuesta inmune. an immune response

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. one.

Una composición inmunógena para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra la enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, dicha composición comprendiendo una cantidad eficaz de un virus del PRRS atenuado seleccionado del grupo que consiste en el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6231, el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6282 y combinaciones de los mismos; y un vehículo o disolvente farmacéuticamente aceptable. An immunogenic composition for use in the induction of a protective immune response against the disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, said composition comprising an effective amount of an attenuated PRRS virus selected from the group consisting of the attenuated PRRS virus of ATCC PTA-6231, the attenuated PRRS virus of ATCC PTA-6282 and combinations thereof; and a pharmaceutically acceptable carrier or solvent.

2. 2.

La composición inmunógena de la reivindicación 1, en la que dicho virus es el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6281. The immunogenic composition of claim 1, wherein said virus is the ATCC attenuated PRRS virus PTA-6281.

3. 3.

La composición inmunógena de la reivindicación 1, en la que dicho virus es el virus del PRRS atenuado de ATCC PTA-6282. The immunogenic composition of claim 1, wherein said virus is the ATCC attenuated PRRS virus PTA-6282.

4. Four.

Una composición inmunógena polivalente para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra la enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, dicha composición comprende una cantidad eficaz de dos o más virus atenuados, que comprende el virus del PRRS de ATCC PTA-6281 y el virus del PRRS de ATCC PTA-6282. A polyvalent immunogenic composition for use in inducing a protective immune response against the disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, said composition comprises an effective amount of two or more attenuated viruses, which comprises the ATCC PTA PRRS virus. -6281 and the ATCC PRRS virus PTA-6282.

5. 5.

La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprende adicionalmente un adyuvante. The immunogenic composition of any of claims 1-4, further comprises an adjuvant.

6. 6.

La composición inmunógena polivalente de la reivindicación 5, comprende adicionalmente un adyuvante. The polyvalent immunogenic composition of claim 5 further comprises an adjuvant.

7. 7.

Un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino atenuado PP5 como se representa por el depósito de ATCC Nº PTA-6282. An attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus PP5 as represented by ATCC depot No. PTA-6282.

8. 8.

Un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino atenuado LC13 como se representa por el depósito de ATCC Nº PTA-6281. An attenuated swine reproductive and respiratory syndrome virus LC13 as represented by ATCC depot No. PTA-6281.

9. 9.

El uso de una composición inmunógena de acuerdo con cualquiera de The use of an immunogenic composition according to any of

las reivindicaciones 1-4 o de una composición inmunógena polivalente de acuerdo con la reivindicación 6 en la fabricación de un medicamento para usarse en la inducción de una respuesta inmune protectora contra una enfermedad provocada por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. claims 1-4 or of a polyvalent immunogenic composition according to claim 6 in the manufacture of a medicament for use in the induction of a protective immune response against a disease caused by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus.