ES2348355T3 - COMBINATORY LIBRARIES OF MONOMERIC DOMAINS. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un multímero que se una a una molécula diana, comprendiendo los métodos, (a) proporcionar una biblioteca de polipéptidos, comprendiendo los polipéptidos diferentes dominios monoméricos, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos, comprende al menos dos enlaces disulfuro, y es un dominio de clase A del receptor de LDL; (b) escrutar la biblioteca de polipéptidos en busca de la afinidad para una molécula diana; (c) identificar al menos un primer polipéptido que comprende un primer dominio monomérico que se une específicamente a una molécula diana; (d) conectar el primer dominio monomérico a una pluralidad de diferentes dominios monoméricos para formar una biblioteca de diferentes multímeros, comprendiendo los multímeros el primer dominio monomérico y uno de una pluralidad de diferentes dominios monoméricos; (e) escrutar la biblioteca de multímeros en busca de la capacidad para unirse a la molécula diana; y (f) identificar un multímero que se une específicamente a la molécula diana, donde el multímero comprende el primer dominio monomérico y un segundo dominio monomérico.A method for identifying a multimer that binds to a target molecule, the methods comprising, (a) providing a library of polypeptides, the polypeptides comprising different monomeric domains, where each monomeric domain has 30-100 amino acids, comprises at least two disulfide bonds , and is a class A domain of the LDL receptor; (b) scan the polypeptide library for affinity for a target molecule; (c) identify at least one first polypeptide comprising a first monomer domain that specifically binds to a target molecule; (d) connecting the first monomer domain to a plurality of different monomer domains to form a library of different multimers, the multimers comprising the first monomer domain and one of a plurality of different monomer domains; (e) scrutinize the multimer library for the ability to bind to the target molecule; and (f) identify a multimer that specifically binds to the target molecule, where the multimer comprises the first monomer domain and a second monomer domain.

Description

Bibliotecas combinatorias de dominios monoméricos.Combinatorial Domain Libraries monomeric

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

Los análisis de las secuencias de proteínas y de las estructuras tridimensionales han revelado que muchas proteínas están compuestas por un número discreto de dominios monoméricos. La mayoría de las proteínas con dominios monoméricos discretos es extracelular o constituye las porciones extracelulares de las proteínas unidas a la membrana.Analyzes of protein sequences and of three-dimensional structures have revealed that many proteins They are composed of a discrete number of monomer domains. The Most proteins with discrete monomer domains are extracellular or constitutes the extracellular portions of the membrane bound proteins.

Una importante característica de un dominio monomérico discreto es su capacidad para plegarse independientemente o con alguna ayuda limitada. La ayuda limitada puede incluir la ayuda de una o varias chaperoninas (p. ej., una proteína asociada con un receptor (RAP)). La presencia de uno o varios iones metálicos también ofrece ayuda limitada. La capacidad para plegarse independientemente evita el plegamiento erróneo del dominio cuando es insertado en el entorno de una nueva proteína. Esta característica ha permitido que los dominios monoméricos discretos sean evolutivamente móviles. Como resultado, los dominios discretos se han dispersado durante la evolución y ahora existen por otra parte en proteínas no relacionadas. Algunos dominios, incluyendo los dominios de tipo III de fibronectina y el dominio de tipo inmunoglobina, existen en numerosas proteínas, mientras otros dominios solamente se encuentran en un número limitado de proteínas.An important feature of a domain Monomer discrete is its ability to fold independently  or with some limited help. Limited help may include help of one or more chaperonins (e.g., an associated protein with a receiver (RAP)). The presence of one or more metal ions It also offers limited help. The ability to fold independently prevents misfolding of the domain when It is inserted into the environment of a new protein. This feature has allowed discrete monomer domains Be evolutionarily mobile. As a result, discrete domains they have dispersed during evolution and now exist for another part in unrelated proteins. Some domains, including type III fibronectin domains and type domain immunoglobin, exist in numerous proteins, while others domains are only found in a limited number of proteins

Las proteínas que contienen estos dominios están involucradas en una variedad de procedimientos, tales como transportadores celulares, movimiento de colesterol, transducción de la señal y funciones de señalización que están implicadas en el desarrollo y la neurotransmisión. Véase Herz, Lipoprotein receptors: beacons to neurons?, (2001) Trends in Neurosciences 24(4):193-195; Goldstein y Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science 292: 1310-1312. La función de un dominio monomérico discreto a menudo es específica pero también contribuye a la actividad global de la proteína o polipéptido. Por ejemplo, el dominio de clase A del receptor de LDL (también referido como módulo de clase A, una repetición de tipo complemento o un dominio A) está implicado en la unión al ligando mientras el dominio ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) que se encuentra en las proteínas de coagulación dependientes de vitamina K está implicado en la unión de alta afinidad a las membranas de fosfolípidos. Otros dominios monoméricos discretos incluyen, p. ej., el dominio de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el activador de plasminógeno de tipo tisular que media la unión a células del hígado y regula de ese modo el aclaramiento de esta enzima fibrinolítica de la circulación y la cola citoplásmica del receptor de LDL que está implicada en la endocitosis mediada por receptores.The proteins that contain these domains are involved in a variety of procedures, such as cellular transporters, cholesterol movement, transduction of the signal and signaling functions that are involved in the development and neurotransmission. See Herz, Lipoprotein receptors: beacons to neurons ?, (2001) Trends in Neurosciences 24 (4): 193-195; Goldstein and Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science 292: 1310-1312. The function of a discrete monomer domain is often specific. but it also contributes to the overall activity of the protein or polypeptide. For example, the class A domain of the LDL receiver (also referred to as a class A module, a type repetition complement or domain A) is involved in ligand binding while the gamma-carboxyglutamic acid domain (Gla) found in coagulation dependent proteins Vitamin K is involved in binding high affinity to phospholipid membranes. Other discrete monomer domains include, p. eg, the growth factor type domain epidermal (EGF) in the tissue-type plasminogen activator which mediates liver cell binding and thereby regulates the clearance of this fibrinolytic enzyme from the circulation and the cytoplasmic tail of the LDL receptor that is involved in the endocytosis mediated by receptors.

Las proteínas individuales pueden poseer uno o más dominios monoméricos discretos. Estas proteínas a menudo se denominan proteínas mosaico. Por ejemplo, los miembros de la familia del receptor de LDL contienen cuatro dominios estructurales principales: las repeticiones del dominio A ricas en cisteína, las repeticiones de tipo precursor del factor de crecimiento epidérmico, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. La familia del receptor de LDL incluye miembros que: 1) son receptores de la superficie celular; 2) reconocen ligandos extracelulares; y 3) los internalizan para su degradación por lisosomas. Véase Hussain et al., The Mammalian Low-Density Lipoprotein Receptor Family, (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:141-72. Por ejemplo, algunos miembros incluyen receptores de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL-R), receptor 2 de apolipoproteína E, proteína relacionada con LDLR (LRP) y megalina. Los miembros de la familia tienen las siguientes características: 1) expresión en la superficie celular; 2) unión al ligando extracelular que consiste en repeticiones del dominio A; 3) requerimiento de calcio para la unión al ligando; 4) reconocimiento de la proteína asociada al receptor y la apolipoproteína (apo) E; 5) dominio de homología con el precursor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) que contiene repeticiones YWTD; 6) región que abarca la membrana sencilla; y 7) endocitosis mediada por el receptor de diferentes ligandos. Véase Hussain, supra. Con todo, los miembros se unen a diversos ligandos estructuralmente distintos.Individual proteins may possess one or more discrete monomer domains. These proteins are often called mosaic proteins. For example, members of the LDL receptor family contain four major structural domains: cysteine-rich A domain repeats, epidermal growth factor precursor type repeats, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain. The LDL receptor family includes members that: 1) are cell surface receptors; 2) recognize extracellular ligands; and 3) internalize them for degradation by lysosomes. See Hussain et al ., The Mammalian Low-Density Lipoprotein Receptor Family, (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 141-72. For example, some members include very low density lipoprotein receptors (VLDL-R), apolipoprotein E receptor 2, LDLR-related protein (LRP) and megalin. Family members have the following characteristics: 1) cell surface expression; 2) binding to the extracellular ligand consisting of repetitions of the A domain; 3) calcium requirement for ligand binding; 4) recognition of the receptor-associated protein and apolipoprotein (apo) E; 5) homology domain with the precursor of epidermal growth factor (EGF) containing YWTD repeats; 6) region that encompasses the single membrane; and 7) receptor-mediated endocytosis of different ligands. See Hussain, supra. However, the members join various structurally distinct ligands.

Resulta ventajoso desarrollar métodos para generar y optimizar las propiedades deseadas de estos dominios monoméricos discretos. Sin embargo, los dominios monoméricos discretos, si bien están estructuralmente conservados, no están conservados a nivel de nucleótidos o aminoácidos, excepto para ciertos aminoácidos, p. ej., los residuos de cisteína del dominio A. De este modo, los métodos de recombinación de nucleótidos existentes se quedan cortos para generar y optimizar las propiedades deseadas de estos dominios monoméricos discretos.It is advantageous to develop methods for generate and optimize the desired properties of these domains discrete monomeric However, monomeric domains discrete, while structurally preserved, they are not conserved at the level of nucleotides or amino acids, except for certain amino acids, e.g. eg, cysteine residues in the domain A. Thus, nucleotide recombination methods existing ones fall short to generate and optimize desired properties of these discrete monomer domains.

La presente invención está dirigida a estos y otros problemas.The present invention is directed to these and other problems.

Breve resumen de la invenciónBrief Summary of the Invention

La presente invención proporciona un método para identificar un multímero que se une a una molécula diana, comprendiendo el método,The present invention provides a method for identify a multimer that binds to a target molecule, understanding the method,

(a)(to)

proporcionar una biblioteca de polipéptidos, comprendiendo los polipéptidos diferentes dominios monoméricos, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos, comprende al menos dos enlaces disulfuro, y está en un dominio de clase A del receptor de LDL;provide a library of polypeptides, polypeptides comprising different domains monomeric, where each monomeric domain has 30-100 amino acids, comprises at least two bonds disulfide, and is in a class A domain of the receptor of LDL;

(b)(b)

escrutar la biblioteca de polipéptidos en busca de afinidad hacia una molécula diana;scrutinize the polypeptide library in search of affinity towards a target molecule;

(c)(C)

identificar al menos un primer polipéptido que comprende un primer dominio monomérico que se une específicamente a una molécula diana;identify at least a first polypeptide comprising a first monomeric domain that binds specifically to a target molecule;

(d)(d)

conectar el primer dominio monomérico a una pluralidad de dominios monoméricos diferentes para formar una biblioteca de multímeros diferentes, comprendiendo los multímeros el primer dominio monomérico y uno de la pluralidad de dominios monoméricos diferentes;connect the first monomer domain to a plurality of different monomer domains to form a library of different multimers, comprising multimers the first monomeric domain and one of the plurality of domains different monomers;

(e)(and)

escrutar la biblioteca de multímeros en busca de la capacidad para unirse a la molécula diana; yscan the multimer library in search of the ability to bind to the target molecule; Y

(f)(F)

identificar un multímero que se une específicamente a la molécula diana, donde el multímero comprende el primer dominio monomérico y un segundo dominio monomérico.identify a multimer that binds specifically to the target molecule, where the multimer comprises the first monomer domain and a second monomer domain.

En algunas realizaciones, al menos tres dominios monoméricos se unen a la misma molécula diana.In some embodiments, at least three domains monomers bind to the same target molecule.

Adicionalmente se describen en la presente memoria métodos que comprenden una etapa adicional de mutación de al menos un dominio monomérico, proporcionando de ese modo una genoteca que comprende dominios monoméricos mutados. La etapa de mutación puede comprender recombinar una pluralidad de fragmentos polinucleotídicos de al menos un polinucleótido que codifica un dominio monomérico. La etapa de mutación puede comprender una evolución dirigida. La etapa de mutación puede comprender una mutagénesis dirigida al sitio.Additionally described herein memory methods comprising an additional stage of mutation of at least one monomer domain, thereby providing a library comprising mutated monomeric domains. The stage of mutation may comprise recombining a plurality of fragments polynucleotides of at least one polynucleotide encoding a monomer domain. The mutation stage may comprise a directed evolution. The mutation stage may comprise a site-directed mutagenesis.

Adicionalmente se describen en la presente memoria métodos que comprenden: escrutar la biblioteca de dominios monoméricos en busca de afinidad hacia una segunda molécula diana; identificar un dominio monomérico que se une a una segunda molécula diana; conectar al menos un dominio monomérico con afinidad hacia la primera molécula diana con al menos un dominio monomérico con afinidad hacia una segunda molécula diana, formando de ese modo una biblioteca de multímeros; escrutar la biblioteca de multímeros en busca de la capacidad de unirse a la primera y segunda moléculas diana; e identificar un multímero que se une a la primera y segunda moléculas diana, identificando de ese modo un multímero que se une específicamente a una primera y una segunda moléculas diana.Additionally described herein Memory methods that comprise: scrutinizing the domain library monomeric in search of affinity towards a second target molecule; identify a monomeric domain that binds to a second molecule Diana; connect at least one monomer domain with affinity towards first target molecule with at least one monomer domain with affinity towards a second target molecule, thereby forming a multimer library; scrutinize the multimer library in looking for the ability to join the first and second molecules Diana; and identify a multimer that joins the first and second target molecules, thereby identifying a multimer that binds specifically to a first and second target molecules.

Ciertos métodos descritos en la presente memoria comprenden adicionalmente: proporcionar una segunda biblioteca de dominios monoméricos; escrutar la segunda biblioteca de dominios monoméricos en busca de afinidad hacia al menos una segunda molécula diana; identificar un segundo dominio monomérico que se une a la segunda molécula diana; conectar los dominios monoméricos identificados que se unen a la primera molécula diana o la segunda molécula diana, formando de ese modo una biblioteca de multímeros; escrutar la biblioteca de multímeros en busca de la capacidad de unirse a la primera y segunda moléculas diana; e identificar un multímero que se une a la primera y segunda moléculas diana.Certain methods described herein additionally comprise: providing a second library of monomeric domains; scrutinize the second domain library monomeric in search of affinity towards at least a second target molecule; identify a second monomer domain that binds to the second target molecule; connect monomer domains identified that bind to the first target molecule or the second target molecule, thereby forming a multimer library; scrutinize the multimer library for the ability to bind to the first and second target molecules; and identify a multimer that binds to the first and second target molecules.

La molécula diana se puede seleccionar del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, una enzima, una proteína de la superficie celular, un inhibidor de enzima, una molécula informadora, y un receptor. El antígeno viral puede ser un polipéptido requerido para la replicación viral. La primera y al menos segunda moléculas diana pueden ser diferentes componentes del mismo sistema de replicación viral. El multímero seleccionado se puede unir a al menos dos serotipos del mismo virus.The target molecule can be selected from the group which consists of a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen, an enzyme, a cell surface protein, an enzyme inhibitor, a reporter molecule, and a receptor. He viral antigen may be a polypeptide required for the viral replication The first and at least second target molecules they can be different components of the same replication system viral. The selected multimer can be attached to at least two serotypes of the same virus.

En algunas realizaciones, la biblioteca de multímeros es expresada como una presentación en fagos, presentación en ribosomas o presentación sobre la superficie celular.In some embodiments, the library of Multimers is expressed as a phage display, presentation  in ribosomes or presentation on the cell surface.

En algunas realizaciones, los dominios monoméricos están conectados por un conector polipeptídico. Como se describe en la presente memoria, el conector polipeptídico puede ser un conector asociado naturalmente con el dominio monomérico. En algunas realizaciones, el conector polipeptídico es una variante de un conector asociado naturalmente con un dominio monomérico. La etapa de conexión puede comprender conectar los dominios monoméricos con una variedad de conectores de diferentes longitudes y composiciones.In some embodiments, the domains Monomers are connected by a polypeptide connector. How I know described herein, the polypeptide connector can be a connector naturally associated with the monomer domain. In some embodiments, the polypeptide connector is a variant of a connector naturally associated with a monomer domain. The connection stage can comprise connecting domains monomeric with a variety of connectors of different lengths and compositions.

La presente invención también proporciona polipéptidos que comprenden los multímeros seleccionados descritos antes.The present invention also provides polypeptides comprising the selected multimers described before.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican los multímeros seleccionados como se ha descrito antes.The present invention also provides polynucleotides encoding the selected multimers as He has described before.

La presente invención también proporciona bibliotecas de multímeros formadas como se ha descrito antes.The present invention also provides Multimer libraries formed as described above.

La presente invención también proporciona métodos para identificar un multímero que se une a al menos una molécula diana, que comprende las etapas de: proporcionar una biblioteca de multímeros, donde cada multímero comprende al menos dos dominios monoméricos y donde cada dominio monomérico comprende al menos dos enlaces disulfuro, tiene 30 - 100 aminoácidos, es un dominio de clase A del receptor de LDL y los dominios monoméricos están separados por un conector heterólogo; y escrutar la biblioteca de multímeros en busca de multímeros que se unen a la molécula diana. En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente identificar los multímeros que se unen a la molécula diana que tienen avidez por la molécula diana que es mayor que la avidez de un único dominio monomérico por la molécula diana. En algunas realizaciones, uno o más de los multímeros comprenden un dominio monomérico que se une específicamente a una segunda molécula diana.The present invention also provides methods to identify a multimer that binds to at least one target molecule, which comprises the steps of: providing a multimer library, where each multimer comprises at least two monomeric domains and where each monomeric domain comprises at least two disulfide bonds, it has 30 - 100 amino acids, it is a Class A domain of the LDL receiver and monomeric domains they are separated by a heterologous connector; and scrutinize the library of multimers in search of multimers that bind to the molecule Diana. In some embodiments, the methods comprise additionally identify the multimers that bind to the molecule target that have avidity for the target molecule that is greater than the Avidity of a single monomer domain by the target molecule. In some embodiments, one or more of the multimers comprise a monomeric domain that specifically binds to a second molecule Diana.

La presente invención también proporciona bibliotecas de multímeros. En algunas realizaciones, cada multímero comprende al menos dos dominios monoméricos conectados por un conector; cada dominio monomérico muestra una especificidad de unión para una molécula diana; y cada dominio monomérico es un dominio monomérico que no existe naturalmente.The present invention also provides Multimer libraries. In some embodiments, each multimer it comprises at least two monomeric domains connected by a connector; Each monomer domain shows a specificity of binding for a target molecule; and each monomer domain is a monomeric domain that does not exist naturally.

La presente invención también proporciona polipéptidos que comprenden al menos dos dominios monoméricos separados por una secuencia conectora heteróloga. En algunas realizaciones, cada dominio monomérico se une específicamente a una molécula diana; y cada dominio es un dominio monomérico de una proteína que no existe naturalmente.The present invention also provides polypeptides comprising at least two monomeric domains separated by a heterologous connecting sequence. In some embodiments, each monomer domain specifically binds to a target molecule; and each domain is a monomeric domain of a protein that does not exist naturally.

Adicionalmente se describen en la presente memoria polipéptidos que comprenden un primer dominio monomérico que se une a una primera molécula diana y un segundo dominio monomérico que se une a una segunda molécula diana. Los polipéptidos pueden comprender dos dominios monoméricos, teniendo cada dominio monomérico una especificidad de unión que es específica para un sitio diferente de la misma molécula diana. Los polipéptidos pueden comprender adicionalmente un dominio monomérico que tiene una especificidad de unión para una segunda molécula diana.Additionally described herein memory polypeptides comprising a first monomer domain that binds to a first target molecule and a second domain monomer that binds to a second target molecule. The polypeptides can comprise two monomeric domains, having each monomer domain a binding specificity that is specific for a different site of the same target molecule. The polypeptides may additionally comprise a monomeric domain which has a binding specificity for a second molecule Diana.

Como se describe adicionalmente en la presente memoria, los dominios monoméricos de una biblioteca, multímero o polipéptido pueden ser idénticos al menos en 70%.As described further herein memory, the monomeric domains of a library, multimer or Polypeptide can be identical at least 70%.

Definiciones Definitions

A menos que se indique de otro modo, las siguientes definiciones sustituyen a las de la técnica.Unless stated otherwise, the The following definitions replace those of the technique.

El término "dominio monomérico" o "monómero" se utiliza indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a una región discreta encontrada en una proteína o polipéptido. Un dominio monomérico forma una estructura tridimensional nativa en solución en ausencia de secuencias de aminoácidos nativas colindantes. Los dominios monoméricos de la invención se unirán específicamente a una molécula diana. Por ejemplo, un polipéptido que forma una estructura tridimensional que se une a una molécula diana es un dominio monomérico. Según se utiliza en la presente memoria, el término "dominio monomérico" no incluye la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo.The term "monomer domain" or "monomer" is used interchangeably herein to refer to a discrete region found in a protein or polypeptide. A monomeric domain forms a structure native three-dimensional solution in the absence of sequences of adjoining native amino acids. The monomeric domains of the invention will specifically bind to a target molecule. By example, a polypeptide that forms a three-dimensional structure that binds to a target molecule is a monomeric domain. Is according used herein, the term "monomer domain" does not include the complementarity determining region (CDR) of an antibody

El término "variante de dominio monomérico" hace referencia a un dominio que resulta de la manipulación humana de una secuencia de un dominio monomérico. Los ejemplos de los cambios manipulados por el hombre incluyen, p. ej., la mutagénesis al azar, la mutagénesis específica del sitio, el barajado, la evolución dirigida, etc. El término "variante de dominio monomérico" no abarca una región determinante de la complementariedad (CDR) mutagenizada de un anticuerpo.The term "monomer domain variant" refers to a domain that results from human manipulation of a sequence of a monomer domain. The examples of Manipulated changes include, e.g. eg, mutagenesis random, site-specific mutagenesis, shuffling, directed evolution, etc. The term "domain variant monomeric "does not cover a determining region of the mutagenized complementarity (CDR) of an antibody.

El término "multímero" se utiliza en la presente memoria para indicar un polipéptido que comprende al menos dos dominios monoméricos y/o inmunodominios (p. ej., al menos dos dominios monoméricos, al menos dos inmuno-dominios, o al menos un dominio monomérico y al menos un inmuno-dominio). Los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios separados en un multímero pueden ser reunidos por medio de un conector. Un multímero también es conocido como una proteína mosaico combinatoria o una proteína mosaico recombinante.The term "multimer" is used in the herein to indicate a polypeptide comprising at least two monomeric and / or immunodomain domains (e.g., at least two monomeric domains, at least two immuno-domains, or at least one monomer domain and at least one immuno-domain). Monomeric domains and / or separate immuno-domains in a multimer can be gathered through a connector. A multimer is also known as a combinatorial mosaic protein or a protein recombinant mosaic.

El término "ligando", también referido en la presente memoria como "molécula diana", abarca una amplia variedad de sustancias y moléculas, que oscilan entre moléculas simples y dianas complejas. Las moléculas diana pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos o cualquier otra molécula capaz de reconocer un dominio polipeptídico. Por ejemplo, una molécula diana puede incluir un compuesto químico (esto es, un compuesto no biológico tal como, p. ej., una molécula orgánica, una molécula inorgánica, o una molécula que tiene átomos tanto orgánicos como inorgánicos, pero excluyendo polinucleótidos y proteínas), una mezcla de compuestos químicos, una matriz de compuestos localizados espacialmente, una macromolécula biológica, una biblioteca de presentación de péptidos en bacteriófagos, una biblioteca de presentación de péptidos en polisomas, un extracto elaborado a partir de materiales biológicos tales como células o tejidos bacterianos, vegetales, fúngicos, o animales (p. ej., mamíferos), una proteína, una toxina, una hormona peptídica, una célula, un virus, o similar. Otras moléculas diana incluyen, p. ej., una célula completa, un tejido completo, una mezcla de proteínas relacionadas o no relacionadas, una mezcla de virus o cepas bacterianas o similares. Las moléculas diana también pueden ser definidas mediante la inclusión en análisis de escrutinio descritos en la presente memoria o intensificando o inhibiendo una interacción de proteínas específicas (esto es, un agente que inhibe selectivamente una interacción de unión entre dos polipéptidos predeterminados).The term "ligand", also referred to in The present report as "target molecule" encompasses a broad variety of substances and molecules, which oscillate between molecules Simple and complex targets. The target molecules can be proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates or any other molecule capable of recognizing a polypeptide domain. For example, a target molecule can include a chemical compound (that is, a non-biological compound such as, e.g. eg, an organic molecule, a inorganic molecule, or a molecule that has both atoms organic as inorganic, but excluding polynucleotides and proteins), a mixture of chemical compounds, a matrix of spatially located compounds, a biological macromolecule, a peptide presentation library in bacteriophages, a peptide presentation library in polysomes, an extract made from biological materials such as cells or bacterial, plant, fungal, or animal tissues (e.g., mammals), a protein, a toxin, a peptide hormone, a cell, a virus, or the like. Other target molecules include, e.g. eg, a whole cell, a whole tissue, a mixture of related or unrelated proteins, a mixture of viruses or Bacterial or similar strains. Target molecules can also be defined by inclusion in scrutiny analysis described herein or by intensifying or inhibiting a interaction of specific proteins (that is, an agent that inhibits selectively a binding interaction between two polypeptides default).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "inmuno-dominios" hace referencia a dominios de unión a proteínas que contienen al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Los inmuno-dominios pueden ser dominios inmunológicos de origen natural (esto es, aislados de la naturaleza) o pueden ser dominios inmunológicos de origen no natural que han sido alterados mediante manipulación humana (p. ej., mediante métodos de mutagénesis, tales como, por ejemplo, mutagénesis al azar, mutagénesis específica del sitio, y similares, así como mediante métodos de evolución dirigida, tales como, por ejemplo, PCR propensa a error recursiva, recombinación recursiva, y similares). Los diferentes tipos de inmuno-dominios que son adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen un mini-anticuerpo ("minibody"), un anticuerpo de un sólo dominio, un fragmento variable de cadena sencilla (ScFv), y un fragmento Fab.As used herein, the term "immuno-domains" refers to protein binding domains that contain at least one region Complementarity determinant (CDR) of an antibody. The immuno-domains can be immunological domains of natural origin (that is, isolated from nature) or they can be immunological domains of unnatural origin that have been altered by human manipulation (e.g., by methods of mutagenesis, such as, for example, random mutagenesis, site-specific mutagenesis, and the like, as well as by directed evolution methods, such as, for example, prone PCR  to recursive error, recursive recombination, and the like). The different types of immuno-domains that are suitable for use in the practice of the present invention include a mini-antibody ("minibody"), a single domain antibody, a variable chain fragment simple (ScFv), and a Fab fragment.

El término "mini-anticuerpo" hace referencia en la presente memoria a un polipéptido que codifica solamente 2 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de origen natural o no natural (p. ej., mutagenizadas) que existen en el dominio variable de la cadena pesada o el dominio variable de la cadena ligera, o una de sus combinaciones. Un ejemplo de un mini-anticuerpo es descrito por Pessi et al., A designed metal-binding protein with a novel fold, (1993) Nature 362:367-369. Se ilustra esquemáticamente un multímero de mini-anticuerpos en la Figura 11A. Los círculos representan mini-anticuerpos, y las líneas gruesas representan los radicales conectores que unen los inmunodominios entre sí.The term "mini-antibody" refers herein to a polypeptide that encodes only 2 complementarity determining regions (CDRs) of natural or non-natural origin (eg, mutagenized) that exist in the variable domain of the heavy chain or the variable domain of the light chain, or one of its combinations. An example of a mini-antibody is described by Pessi et al ., A designed metal-binding protein with a novel fold, (1993) Nature 362: 367-369. A multimer of mini-antibodies is schematically illustrated in Figure 11A. The circles represent mini-antibodies, and the thick lines represent the connecting radicals that bind the immunodomains to each other.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo de dominio sencillo" hace referencia al dominio variable de la cadena pesada ("V_{H}") de un anticuerpo, esto es, un dominio variable de la cadena pesada sin un dominio variable de la cadena ligera. Los anticuerpos de dominio sencillo ilustrativos empleados en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada de Camélido (aproximadamente 118 a 136 residuos de aminoácido) como describen Hamers-Casterman, C. et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains (1993) Nature 363:446-448, y Dumoulin, et al., Single-domain antibody fragments with high conformational stability (2002) Protein Science 11:500-515. En la Figura 11B se representa un multímero de anticuerpos de dominio sencillo. Las elipses representan los anticuerpos de dominio sencillo, y las líneas gruesas representan los radicales conectores que unen los anticuerpos de dominio sencillo entre sí.As used herein, the term "single domain antibody" refers to the heavy chain variable domain ("VH") of an antibody, that is, a heavy chain variable domain without a domain. variable light chain. Illustrative single domain antibodies employed in the practice of the present invention include, for example, the variable domain of the Camelid heavy chain (approximately 118 to 136 amino acid residues) as described by Hamers-Casterman, C. et al ., Naturally occurring antibodies devoid of light chains (1993) Nature 363: 446-448, and Dumoulin, et al ., Single-domain antibody fragments with high conformational stability (2002) Protein Science 11: 500-515. A single domain antibody multimer is depicted in Figure 11B. Ellipses represent single domain antibodies, and thick lines represent connecting radicals that bind single domain antibodies to each other.

Los términos "fragmento variable de cadena sencilla" o "ScFv" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que están unidos por un conector peptídico que tiene al menos 12 residuos de aminoácido. Los fragmentos variables de cadena sencilla contemplados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen aquellos descritos por Bird, et al., Single-chain antigen-binding proteins (1988) Science 242(4877):423-426 y Huston et al., Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli (1988) Proc Natl Acad Sci U S A 85(16):5879-83. En la Figura 11C se ilustra un multímero de fragmentos variables de cadena sencilla. Las líneas discontinuas representan el conector peptídico que une los dominios variables de la cadena pesada y ligera entre sí. Las líneas gruesas representan los radicales conectores que unen los dominios variables de la cadena pesada entre sí.The terms "single chain variable fragment" or "ScFv" are used interchangeably herein to refer to variable domains of heavy and light chains of antibodies that are linked by a peptide linker having at least 12 amino acid residues. Variable single chain fragments contemplated for use in the practice of the present invention include those described by Bird, et al ., Single-chain antigen-binding proteins (1988) Science 242 (4877): 423-426 and Huston et al. ., Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (16): 5879-83. A multimer of single chain variable fragments is illustrated in Figure 11C. The dashed lines represent the peptide linker that links the variable domains of the heavy and light chain to each other. The thick lines represent the connecting radicals that link the variable domains of the heavy chain to each other.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento Fab" hace referencia a un inmuno-dominio que tiene dos cadenas de proteína, una de las cuales es una cadena ligera que consiste en dos dominios de la cadena ligera (dominio variable V_{L} y dominio constante C_{L}) y una cadena pesada que consiste en dos dominios pesados (esto es, un dominio variable V_{H} y uno constante C_{H}). Los fragmentos Fab empleados en la práctica de la presente invención incluyen aquellos que tienen un enlace disulfuro intercatenario en el extremo C de cada componente pesado y ligero, así como aquellos que no tienen semejante enlace disulfuro C-terminal. Cada fragmento tiene aproximadamente 47 kD. Los fragmentos Fab son descritos por Pluckthun y Skerra, Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia coli (1989) Methods Enzymol 178:497-515. En la Figura 11D se representa un multímero de fragmentos Fab. Las elipses de color blanco representan el componente de la cadena pesada del fragmento Fab, las elipses rellenas representan el componente de la cadena ligera del Fab.As used herein, the term "Fab fragment" refers to an immuno-domain that has two protein chains, one of which is a light chain consisting of two domains of the light chain (variable domain V_ { L} and constant domain C_ {L}) and a heavy chain consisting of two heavy domains (that is, a variable domain V_ {H} and a constant domain C_ {H}). Fab fragments employed in the practice of the present invention include those that have an intercatenary disulfide bond at the C-terminus of each heavy and light component, as well as those that do not have such a C-terminal disulfide bond. Each fragment has approximately 47 kD. Fab fragments are described by Pluckthun and Skerra, Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia coli (1989) Methods Enzymol 178: 497-515. A multimer of Fab fragments is depicted in Figure 11D. The white ellipses represent the heavy chain component of the Fab fragment, the filled ellipses represent the light chain component of the Fab.

El término "conector" se utiliza en la presente memoria para indicar un radical o grupo de radicales que unen o conectan dos o más dominios monoméricos separados discretos. El conector permite que los dominios monoméricos separados discretos permanezcan separados cuando se unen en un multímero. El radical conector es típicamente un radical sustancialmente lineal. Los conectores adecuados incluyen polipéptidos, ácidos polinucleicos, ácidos peptidonucleicos y similares. Los conectores adecuados también incluyen radicales alquileno opcionalmente sustituidos que tienen uno o más átomos de oxígeno incorporados al esqueleto carbonado. Típicamente, el peso molecular del conector es menor de aproximadamente 2000 daltons. Más típicamente, el peso molecular del conector es menor de aproximadamente 1500 daltons y normalmente es menor de aproximadamente 1000 daltons. El conector puede ser suficientemente pequeño para permitir que los dominios monoméricos separados discretos cooperen, p. ej., cuando cada uno de los dominios monoméricos separados discretos de un multímero se unen a la misma molécula diana mediante sitios de unión separados. Los conectores ilustrativos incluyen un polinucleótido que codifica un polipéptido, o un polipéptido de aminoácidos u otros radicales de origen natural. El conector puede ser una porción de una secuencia nativa, una de sus variantes, o una secuencia sintética. Los conectores pueden comprender, p. ej., aminoácidos de origen natural, de origen no natural, o una combinación de ambos.The term "connector" is used in the present memory to indicate a radical or group of radicals that join or connect two or more discrete separate monomer domains. The connector allows separate monomer domains Discrete remain separate when joined in a multimer. He Connector radical is typically a substantially linear radical. Suitable connectors include polypeptides, acids polynucleic, peptidonucleic acids and the like. The connectors Suitable also include alkylene radicals optionally substituted which have one or more oxygen atoms incorporated into the carbon skeleton Typically, the molecular weight of the connector is less than about 2000 daltons. More typically, the weight Molecular connector is less than approximately 1500 daltons and It is usually less than about 1000 daltons. The connector can be small enough to allow domains Separate discrete monomers cooperate, p. eg when each of the discrete separate monomer domains of a multimer are bind to the same target molecule through separate binding sites. Illustrative connectors include a polynucleotide that encodes a polypeptide, or a polypeptide of amino acids or other radicals of natural origin The connector can be a portion of a sequence native, one of its variants, or a synthetic sequence. The connectors can comprise, e.g. eg, amino acids of origin natural, of unnatural origin, or a combination of both.

El término "separado" se utiliza en la presente memoria para indicar una propiedad de un radical que es independiente y permanece independiente incluso cuando forma complejos con otros radicales, incluyendo por ejemplo, otros dominios monoméricos. Un dominio monomérico es un dominio separado en una proteína debido a que tiene una propiedad independiente que puede ser reconocida y separada de la proteína. Por ejemplo, la capacidad de unión al ligando del dominio A en el LDLR es una propiedad independiente. Otros ejemplos de separado incluyen los dominios monoméricos separados en un multímero que siguen siendo dominios independientes separados incluso cuando forman complejos o se unen entre sí en el multímero por medio de un conector. Otro ejemplo de la propiedad de separado son los sitios de unión separados en un multímero para un ligando.The term "separated" is used in the present memory to indicate a property of a radical that is independent and remains independent even when it forms complexes with other radicals, including, for example, others monomeric domains A monomer domain is a separate domain in a protein because it has an independent property that It can be recognized and separated from protein. For example, the ligand binding ability of domain A in the LDLR is a independent property. Other separate examples include the monomeric domains separated into a multimer that remain separate independent domains even when they form complexes or they are joined together in the multimer by means of a connector. Other example of the property of separate are the binding sites separated in a multimer for a ligand.

Según se utiliza en la presente memoria, "la evolución dirigida" hace referencia a un procedimiento por medio del cual se generan variantes polinucleotídicas, se expresan, y se escrutan en busca de una actividad (p. ej., un polipéptido con actividad de unión) en un procedimiento recursivo. Se seleccionan uno o más candidatos en el escrutinio y el procedimiento se repite después utilizando polinucleótidos que codifican los candidatos seleccionados para generar nuevas variantes. La evolución dirigida implica al menos dos rondas de generación de la variación y puede incluir 3, 4, 5, 10, 20 o más rondas de generación de la variación y la selección. La variación puede ser generada mediante cualquier método conocido por los experto en la técnica, incluyendo, p. ej., PCR propensa al error, barajado de genes, mutagénesis química y similares.As used herein, "the directed evolution "refers to a procedure by from which polynucleotide variants are generated, expressed, and scrutinize for an activity (e.g., a polypeptide with binding activity) in a recursive procedure. Are selected one or more candidates in the scrutiny and the procedure is repeated then using polynucleotides that encode the candidates selected to generate new variants. Directed evolution it involves at least two rounds of variation generation and can include 3, 4, 5, 10, 20 or more rounds of variation generation and the selection. The variation can be generated by any method known to those skilled in the art, including, e.g. eg Error prone PCR, gene shuffling, chemical mutagenesis and Similar.

El término "barajado" se utiliza en la presente memoria para indicar la recombinación entre secuencias no idénticas. En algunas realizaciones, el barajado puede incluir el cruzamiento por medio de recombinación homóloga o por medio de recombinación no homóloga, por ejemplo por medio de los sistemas cre/lox y/o flp/frt. El barajado se puede llevar a cabo empleando una variedad de formatos diferentes, incluyendo por ejemplo, formatos de barajado in vitro e in vivo, formatos de barajado in silico, formatos de barajado que utilizan moldes bicatenarios o monocatenarios, formatos de barajado basados en cebadores, formatos de barajado basados en la fragmentación de ácido nucleico, y formatos de barajado mediados por oligonucleótidos, todos los cuales se basan en eventos de recombinación entre secuencias no idénticas y se describen con más detalle o se refieren en la presente memoria más abajo, así como otros formatos basados en la recombinación similares.The term "shuffled" is used herein to indicate recombination between non-identical sequences. In some embodiments, shuffling may include cross-linking by homologous recombination or by non-homologous recombination, for example by means of the cre / lox and / or flp / frt systems. Shuffling can be carried out using a variety of different formats, including, for example, in vitro and in vivo shuffling formats, in silico shuffling formats, shuffling formats that use double-stranded or single-stranded molds, primer-based shuffle formats, shuffle formats based on nucleic acid fragmentation, and oligonucleotide mediated shuffle formats, all of which are based on recombination events between non-identical sequences and are described in more detail or referred to herein below, as well as other similar recombination based formats.

El término "al azar" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una secuencia de polinucleótidos o una secuencia de aminoácidos compuesta por dos o más aminoácidos y construida mediante un procedimiento estocástico o al azar. La secuencia de polinucleótidos o la secuencia de aminoácidos al azar pueden incluir motivos en marco o armazón, que pueden comprender secuencias invariables.The term "random" as used in the This report refers to a polynucleotide sequence or an amino acid sequence composed of two or more amino acids and Built by a stochastic or random procedure. The polynucleotide sequence or random amino acid sequence may include frame or frame motifs, which may include invariable sequences

El término "pseudo-al azar" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un grupo de secuencias, de polinucleótidos o polipéptidos, que tienen una variabilidad limitada, de manera que el grado de variabilidad de los residuos en algunas posiciones está limitado, pero se permite cualquier posición pseudo-al azar, al menos cierto grado de variación de residuos.The term "pseudo-random" as used herein refers to a group of sequences, of polynucleotides or polypeptides, which have a limited variability, so that the degree of variability of Waste in some positions is limited, but allowed any pseudo-random position, at least true degree of variation of waste.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan en la presente memoria indistintamente para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos de dos o más aminoácidos.The terms "polypeptide", "peptide", and "protein" are used interchangeably herein. to refer to an amino acid sequence of two or more amino acids.

La "sustitución de aminoácidos conservativa" hace referencia a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxiladas alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina."Amino acid substitution Conservative "refers to the interchangeability of waste They have similar side chains. For example, a group of amino acids that have aliphatic side chains is glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; a group of amino acids that have aliphatic hydroxylated side chains is serine and threonine; a group of amino acids that have side chains that contain amide is asparagine and glutamine; a group of amino acids which have aromatic side chains is phenylalanine, tyrosine, and tryptophan; a group of amino acids that have side chains alkaline is lysine, arginine, and histidine; and an amino acid group that have sulfur-containing side chains is cysteine and methionine Preferred conservative substitution groups of amino acids are: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, and asparagine-glutamine.

La frase "secuencia de ácido nucleico" hace referencia a un polímero de cadena sencilla o doble de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' al 3'. Esto incluye ADN cromosómico, plásmidos auto-replicantes y ADN o ARN que desempeñan un papel estructural primario.The phrase "nucleic acid sequence" makes reference to a single or double base chain polymer deoxyribonucleotides or ribonucleotides read from the 5 'to 3' end. This includes chromosomal DNA, plasmids self-replicating and DNA or RNA that play a primary structural role.

El término "que codifica" hace referencia a una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de iniciación o terminación. Una secuencia de aminoácidos puede estar codificada por uno cualquiera de los seis marcos de lectura diferentes proporcionados por una secuencia de polinucleótidos.The term "coding" refers to a polynucleotide sequence that encodes one or more amino acids.  The term does not require an initiation or termination codon. A amino acid sequence can be encoded by any one of the six different reading frames provided by a polynucleotide sequence.

El término "promotor" hace referencia a regiones o secuencias localizadas aguas arriba y/o aguas abajo del inicio de la transcripción que están implicadas en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción.The term "promoter" refers to regions or sequences located upstream and / or downstream of the initiation of transcription that are involved in recognition and the binding of RNA polymerase and other proteins to initiate the transcription.

Un "vector" hace referencia a un polinucleótido, que cuando es independiente del cromosoma anfitrión, es susceptible de replicación en un organismo anfitrión. Los ejemplos de los vectores incluyen los plásmidos. Los vectores tienen típicamente un origen de replicación. Los vectores pueden comprender, p. ej., terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico concreto.A "vector" refers to a polynucleotide, which when independent of the host chromosome, It is susceptible to replication in a host organism. The Examples of vectors include plasmids. Vectors They typically have an origin of replication. Vectors can understand, p. eg transcription terminators and the translation, transcription initiation sequences and the translation, and promoters useful for the regulation of expression of the specific nucleic acid.

El término "recombinante" cuando se utiliza haciendo referencia, p. ej., a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula deriva de una célula modificada de este modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son expresados anómalamente de otro modo, expresados a la baja o no expresados en absoluto.The term "recombinant" when used by reference, e.g. ex. , to a cell, or nucleic acid, protein, or vector, indicates that the cell, nucleic acid, protein or vector, has been modified by the introduction of a heterologous nucleic acid or protein or the alteration of a native nucleic acid or protein, or that the cell derives from a cell modified in this way. Thus, for example, recombinant cells express genes that are not in the native (non-recombinant) form of the cell or express native genes that are otherwise expressed abnormally, expressed downward or not expressed at all.

La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un polipéptido, cuando hace referencia a un monómero o multímero, hace referencia a una reacción de unión que puede ser determinante de la presencia del polipéptido en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. De este modo, en condiciones convencionales o en análisis utilizados en los análisis de unión de anticuerpos, el monómero o multímero especificados se unen a una molécula diana concreta por encima del fondo (p. ej., 2X, 5X, 10X o más por encima del fondo) y no se une de una manera significativa a otras moléculas presentes en la muestra.The phrase "specifically joins (or selectively) "to a polypeptide, when referring to a monomer or multimer, refers to a binding reaction that it can be determinant of the presence of the polypeptide in a heterogeneous population of proteins and other biological compounds. From this way, under conventional conditions or in analyzes used in antibody binding analyzes, the monomer or multimer specified bind to a specific target molecule above the bottom (e.g., 2X, 5X, 10X or more above the bottom) and does not join in a significant way to other molecules present in the sample.

Los términos "identidad" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. "Esencialmente idéntico" hace referencia a dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (esto es, una identidad de 60%, opcionalmente una identidad de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% a lo largo de una región especificada, o, cuando no se especifica, a lo largo de una secuencia completa), cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación, o una región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad o identidad sustancial existe a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud.The terms "identity" or percentage of "identity", in the context of two or more nucleic acid or polypeptide sequences, refer to two or more sequences or sub-sequences that are the same. "Essentially identical" refers to two or more nucleic acid or polypeptide sequences that have a specified percentage of amino acid or nucleotide residues that are the same (ie , an identity of 60%, optionally an identity of 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% along a specified region, or, when not specified, along a complete sequence), when compared and aligned for maximum correspondence to along a comparison window, or a designated region measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual inspection. Optionally, the substantial identity or identity exists along a region that is at least about 50 nucleotides in length, or more preferably along a region that is 100 to 500 or 1000 or more nucleotides in length.

El término "conector heterólogo", cuando se utiliza en referencia a un multímero, indica que el multímero comprende un conector y un monómero que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (p. ej., forman una proteína de fusión).The term "heterologous linker", when used in reference to a multimer, indicates that the multimer comprises a linker and a monomer that are not in the same relationship with each other in nature ( eg , form a fusion protein ).

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

La Figura 1 ilustra esquemáticamente el tipo, número y orden de dominios monoméricos encontrados en los miembros de la familia de receptores de LDL. Estos dominios monoméricos incluyen dominios Molinillo \beta, dominios de tipo EGF y dominios de clase A del receptor de LDL. Los miembros mostrados incluyen el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), el receptor 2 de ApoE (ApoER2), el receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR), la proteína 2 relacionada con LDLR (LRP2) y la proteína 1 relacionada con el LDLR (LRP1).Figure 1 schematically illustrates the type, number and order of monomer domains found in members of the LDL receptor family. These monomer domains include grinder β domains, domains of type EGF and Class A domains of the LDL receptor. The members shown include the low density lipoprotein receptor (LDLR), the ApoE receptor 2 (ApoER2), the very lipoprotein receptor low density (VLDLR), LDLR-related protein 2 (LRP2) and LDLR-related protein 1 (LRP1).

La Figura 2 ilustra esquemáticamente el alineamiento de la secuencia de aminoácidos parcial de una variedad de dominios de clase A del receptor de LDL que incluyen dos secuencias de LPR1 humanas, dos secuencias de LRP2 humanas, dos secuencias de LDLR humanas, dos secuencias de LDVR humanas, una secuencia de LRP3 humana, una secuencia de MAT humana, una secuencia de CO6 humana, una secuencia de SORL humana, para demostrar las cisteínas conservadas.Figure 2 schematically illustrates the alignment of the partial amino acid sequence of a variety of LDL receptor class A domains that include two human LPR1 sequences, two human LRP2 sequences, two human LDLR sequences, two human LDVR sequences, one sequence of human LRP3, a sequence of human MAT, a sequence of human CO6, a sequence of human SORL, for Demonstrate conserved cysteines.

La Figura 3, panel A ilustra esquemáticamente un ejemplo de un dominio A. El panel A ilustra esquemáticamente aminoácidos conservados en un dominio A de aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. Los residuos de cisteína conservados están indicados por C, y los aminoácidos cargados negativamente están indicados por un círculo con un signo menos ("-"). Los círculos con una "H" indican residuos hidrófobos. El panel B ilustra esquemáticamente dos dominios A plegados conectados por un conector. El panel B también indica dos sitios de unión a calcio, los círculos oscuros con Ca^{+2}, y tres enlaces disulfuro en cada dominio A plegado para un total de 6 enlaces disulfuro.Figure 3, panel A schematically illustrates a example of a domain A. Panel A schematically illustrates amino acids conserved in an A domain of approximately 40 amino acids in length Cysteine residues conserved are indicated by C, and negatively charged amino acids are indicated by a circle with a minus sign ("-"). The Circles with an "H" indicate hydrophobic residues. Panel B schematically illustrates two folded domains connected by a connector Panel B also indicates two calcium binding sites, the dark circles with Ca + 2, and three disulfide bonds in each A folded domain for a total of 6 disulfide bonds.

La Figura 4 indica algunos de los ligandos reconocidos por la familia de receptores de LDL, que incluyen inhibidores, proteasas, complejos de proteasa, complejos portadores de vitaminas, proteínas implicadas en el metabolismo de lipoproteínas, ligandos no humanos, antibióticos, virus, y otros.Figure 4 indicates some of the ligands recognized by the family of LDL receptors, which include inhibitors, proteases, protease complexes, carrier complexes of vitamins, proteins involved in the metabolism of lipoproteins, non-human ligands, antibiotics, viruses, and others.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente un esquema general para identificar dominios monoméricos que se unen a un ligando, aislar los dominios monoméricos seleccionados, crear multímeros de los dominós monoméricos seleccionados uniendo los dominios monoméricos seleccionados en diversas combinaciones y escrutar los multímeros para identificar los multímeros que comprenden más de un monómero que se une a un ligando.Figure 5 schematically illustrates a scheme general to identify monomer domains that bind to a ligand, isolate selected monomer domains, create multimers of the monomeric dominoes selected by joining the monomeric domains selected in various combinations and scan the multimers to identify the multimers that They comprise more than one monomer that binds to a ligand.

La Figura 6 es una representación esquemática de otra estrategia de selección (selección guiada). Se identifica un dominio monomérico con propiedades de unión apropiadas a partir de una biblioteca de dominios monoméricos. El dominio monomérico identificado es conectado después con un dominio monomérico de otra biblioteca de dominios monoméricos para formar una biblioteca de multímeros. La biblioteca de multímeros es escrutada para identificar un par de dominios monoméricos que se unen simultáneamente a la diana. Este procedimiento se puede repetir después hasta obtener las propiedades de unión óptimas en el multímero.Figure 6 is a schematic representation of another selection strategy (guided selection). It identifies a monomer domain with appropriate binding properties from a library of monomeric domains. The monomer domain identified is then connected to a monomeric domain of another library of monomeric domains to form a library of multimers The multimer library is scrutinized for identify a pair of monomeric domains that bind simultaneously to the target. This procedure can be repeated. then until the optimum bonding properties are obtained in the multimer.

La Figura 7 muestra el procedimiento de multimerización de los dominios monoméricos. Los aciertos con monómeros de unión a la diana son amplificados a partir de un vector. Esta mezcla de dominios monoméricos y/o inmuno-dominios de unión a la diana es escindida después y mezclada con una combinación óptima de conector y oligonucleótidos tapón. Los multímeros que se generan son clonados después en un vector adecuado para la segunda etapa de selección para la identificación de multímeros de unión a la diana.Figure 7 shows the procedure of multimerization of the monomer domains. The successes with target binding monomers are amplified from a vector. This mixture of monomeric domains and / or target binding immuno-domains is cleaved then and mixed with an optimal combination of connector and plug oligonucleotides. The multimers that are generated are cloned then in a suitable vector for the second selection stage for the identification of target binding multimers.

La Figura 8 representa aminoácidos comunes en cada posición del dominio A. Los porcentajes encima de las posiciones de los aminoácidos hacen referencia al porcentaje de dominios A de origen natural con la inter-cisteína espaciadora desplegada. Los residuos de aminoácidos potenciales representados bajo cada posición de aminoácido representan residuos comunes en esa posición. Los seis aminoácidos finales, representados como círculos de color más claro, representan secuencias conectoras. Las dos columnas de residuos de aminoácidos en cursiva en las posiciones 2 y 3 del conector representan residuos de aminoácidos que no existen en esa posición. Cualquier otro aminoácido (p. ej., A, D, E, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, y V) puede ser incluido en estas posiciones.Figure 8 represents common amino acids in each domain position A. The percentages above the amino acid positions refer to the percentage of domains of natural origin with inter-cysteine spacer deployed. Potential amino acid residues represented under each amino acid position represent residues common in that position. The final six amino acids, represented as lighter colored circles, they represent sequences connectors. The two columns of amino acid residues in italics in positions 2 and 3 of the connector represent residues of amino acids that do not exist in that position. Any other amino acid (e.g., A, D, E, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, and V) It can be included in these positions.

La Figura 9 muestra la frecuencia de aparición de residuos de aminoácidos en los dominios A de origen natural para los dominios A con el siguiente espaciamiento entre cisteínas: CX_{6}CX_{4}CX_{6}CX_{5}CX_{8}C.Figure 9 shows the frequency of occurrence of amino acid residues in naturally occurring A domains for domains A with the following cysteine spacing: CX_ {6} CX_ {4} CX_ {6} CX_ {5} CX_ {8} C.

La Figura 10 representa un alineamiento de dominios A. En la parte superior e inferior de la figura, las letras pequeñas (a-q) indican residuos conservados. Los aminoácidos predominantes en estas posiciones y el porcentaje de tiempo que se observaron en los dominios A nativos se ilustran en la parte inferior de la figura.Figure 10 represents an alignment of domains A. At the top and bottom of the figure, the letters  Small (a-q) indicate conserved residues. The predominant amino acids in these positions and the percentage of time that were observed in the native A domains are illustrated in the bottom of the figure.

La Figura 11 representa posibles conformaciones de multímeros comprendidos por inmuno-dominios. La Figura 11A ilustra un multímero de mini-anticuerpos. La Figura 11B ilustra un multímero de anticuerpos de dominio sencillo. La Figura 11C ilustra un multímero de inmuno-dominios de scfv. La Figura 11D ilustra un multímero de fragmentos Fab.Figure 11 represents possible conformations of multimers comprised of immuno-domains. The Figure 11A illustrates a multimer of mini-antibodies Figure 11B illustrates a multimer of single domain antibodies. Figure 11C illustrates a scfv immuno-domain multimer. Figure 11D illustrates a multimer of Fab fragments.

La Figura 12 representa la conexión de dominios mediante conectores parciales.Figure 12 represents the domain connection by partial connectors.

La Figura 13 ilustra formaciones de anillos multiméricos ilustrativas.Figure 13 illustrates ring formations Multimeric illustrative.

La Figura 14 ilustra diferentes conformaciones multiméricas de cadenas pesadas y ligeras de Fv.Figure 14 illustrates different conformations multimeric heavy and light chain Fv.

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Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

La invención proporciona un enfoque mejorado para la selección y optimización de las propiedades de los dominios monoméricos de clase A del receptor de LDL discretos para crear multímeros. En particular, esta descripción describe métodos, composiciones y kits para identificar dominios monoméricos de clase A del receptor de LDL discretos que se unen a un ligando o mezcla de ligandos deseados y crear multímeros (también conocidos como proteínas mosaico combinatorias o proteínas mosaico recombinantes) que comprenden dos o más dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que están unidos a través de un conector. Los multímeros pueden ser escrutados para identificar aquellos que tienen un fenotipo mejorado tal como una avidez o afinidad mejorados o una especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos, en comparación con el dominio monomérico discreto.The invention provides an improved approach. for the selection and optimization of domain properties Class A monomeric discrete LDL receiver to create multimers In particular, this description describes methods, compositions and kits to identify class monomer domains A discrete LDL receptor binding to a ligand or mixture of desired ligands and create multimers (also known as combinatorial mosaic proteins or recombinant mosaic proteins) comprising two or more monomeric domains and / or immuno-domains that are linked through a connector Multimers can be screened to identify those who have an improved phenotype such as avidity or improved affinity or an altered specificity for the ligand or the ligand mixture, compared to the monomer domain discreet.

1. Dominios Monoméricos Discretos1. Discrete Monomeric Domains

Los dominios monoméricos pueden ser cadenas polipeptídicas con aproximadamente 30 a aproximadamente 100 aminoácidos. De un modo similar, un dominio monomérico de la presente invención comprende de 30 a aproximadamente 100 aminoácidos. Los dominios monoméricos y los inmuno-dominios pueden mantener una conformación estable en solución. La conformación estable contiene enlaces disulfuro (p. ej., al menos dos, o tres o más enlaces disulfuro). Los enlaces disulfuro se pueden formar opcionalmente entre dos residuos de cisteína.Monomeric domains can be strings. polypeptide with about 30 to about 100 amino acids. Similarly, a monomeric domain of the The present invention comprises from 30 to about 100 amino acids. Monomeric domains and immuno-domains can maintain a conformation stable in solution. The stable conformation contains links disulfide (eg, at least two, or three or more disulfide bonds). Disulfide bonds can optionally be formed between two cysteine residues

Las publicaciones que describen dominios monoméricos y proteínas mosaico y las referencias citadas allí incluyen las siguientes: Hegyi, H y Bork, P., On the classification and evolution of protein modules, (1997) J. Protein Chem., 16(5):545-551; Baron et al., Protein modules (1991) Trends Biochem. Sci., 16(1):13-7; Ponting et al., Evolution of domain families, (2000), Adv. Protein Chem., 54:185-244; Doolittle, The multiplicity of domains in proteins, (1995) Annu. Rev. Biochem 64:287-314; Doolitte y Bork, Evolutionarily mobile modules in proteins (1993) Scientific American, 269 (4):50-6; y Bork, Shuffled domains in extracellular proteins (1991), FEBS letters 286(1-2):47-54. Los dominios monoméricos de la presente invención también incluyen aquellos dominios encontrados en la base de datos Pfam y la base de datos SMART. Véase Schultz, et al., SMART: una herramienta basada en la red para el estudio de dominios móviles genéticamente, (2000) Nucleic Acid Res. 28(1):231-34.Publications describing monomeric domains and mosaic proteins and references cited there include the following: Hegyi, H and Bork, P., On the classification and evolution of protein modules, (1997) J. Protein Chem., 16 (5): 545-551; Baron et al ., Protein modules (1991) Trends Biochem. Sci., 16 (1): 13-7; Ponting et al ., Evolution of domain families, (2000), Adv. Protein Chem., 54: 185-244; Doolittle, The multiplicity of domains in proteins, (1995) Annu. Rev. Biochem 64: 287-314; Doolitte and Bork, Evolutionarily mobile modules in proteins (1993) Scientific American, 269 (4): 50-6; and Bork, Shuffled domains in extracellular proteins (1991), FEBS letters 286 (1-2): 47-54. The monomeric domains of the present invention also include those domains found in the Pfam database and the SMART database. See Schultz, et al ., SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains, (2000) Nucleic Acid Res. 28 (1): 231-34.

Los dominios monoméricos adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son el dominio de clase A del receptor de LDL. La Figura 1 presenta esquemáticamente diferentes clases de dominios monoméricos encontrados en las moléculas de la familia del receptor de LDL.Monomeric domains suitable for use in the practice of the present invention they are the class A domain of the LDL receptor. Figure 1 presents schematically different classes of monomeric domains found in the molecules of the LDL receptor family.

Otros rasgos de los dominios monoméricos incluyen la capacidad para unir ligandos (p. ej., como en el dominio de clase A del receptor de LDL, la capacidad para unirse a un ión (p. ej., unión a Ca^{2+} mediante el dominio A del receptor de LDL).Other features of monomeric domains include the ability to bind ligands (e.g., as in the domain  Class A LDL receptor, the ability to bind to an ion (e.g., binding to Ca 2+ through domain A of the receptor of LDL).

Las características de un dominio monomérico incluyen la capacidad para plegarse independientemente y la capacidad para formar una estructura estable. De este modo, la estructura del dominio monomérico a menudo está conservada, aunque la secuencia de polinucleótidos que codifica el monómero no necesita estar conservada. Por ejemplo, la estructura del dominio A está conservada entre los miembros de la familia del dominio A, mientras la secuencia de ácidos nucleicos del dominio A no lo está. De este modo, por ejemplo, un dominio monomérico se clasifica como un dominio A por sus residuos de cisteína y su afinidad por el calcio, no necesariamente por su secuencia de ácidos nucleicos. Véase, la Figura 2.The characteristics of a monomer domain include the ability to fold independently and the ability to form a stable structure. Thus, the structure of the monomer domain is often conserved, although the polynucleotide sequence encoding the monomer need not be conserved. For example, the structure of domain A is conserved among members of the family of domain A, while the nucleic acid sequence of domain A is not. Thus, for example, a monomeric domain is classified as an A domain by its cysteine residues and its affinity for calcium, not necessarily by its nucleic acid sequence. See , Figure 2.

Específicamente, los dominios A (denominados a veces "repeticiones de tipo complemento") contienen aproximadamente 30-50 aminoácidos. En algunas realizaciones, los dominios comprenden aproximadamente 35-45 aminoácidos y en algunos casos aproximadamente 40 aminoácidos. En los 30-50 aminoácidos, existen aproximadamente 6 restos cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: C1 y C3, C2 y C5, C4 y C6. El dominio A constituye un radical de unión al ligando. Los residuos de cisteína del dominio son disulfuro conectado para formar un radical funcionalmente independiente, estable, compacto. Véase la Figura 3. Las agrupaciones de estas repeticiones forman un dominio de unión al ligando, y una agrupación diferencial puede conferir especificidad con respecto a la unión al ligando.Specifically, domains A (referred to as sometimes "complement type repetitions") contain approximately 30-50 amino acids. In some embodiments, the domains comprise approximately 35-45 amino acids and in some cases approximately 40 amino acids In the 30-50 amino acids, there are approximately 6 cysteine residues. Of the six cysteines, disulfide bonds are typically found among the following cysteines: C1 and C3, C2 and C5, C4 and C6. Domain A It constitutes a ligand binding radical. Cysteine residues of the domain are disulfide connected to form a radical functionally independent, stable, compact. See Figure 3. The clusters of these repetitions form a binding domain to ligand, and a differential grouping can confer specificity with respect to ligand binding.

Las secuencias ilustrativas del dominio A y las secuencias consenso se representan en las Figuras 2, 3 y 8. La Figura 9 presenta la localización y aparición de residuos en los dominios A con el siguiente espaciamiento entre cisteínas. Además, la Figura 10 representa un número de dominios A y proporciona una lista de aminoácidos conservados. Una secuencia consenso típica útil para identificar dominios A es la siguiente: C-[VILMA]-X_{(5)}-C-[DNH]-X_{(3)}-[DENQHT]-C-X_{(3,4)}-[STADE]-[DEH]-[DE]-X_{(1,5)}-C, donde los residuos entre corchetes indican posibles residuos en una posición. "X_{(#)}" indica el número de residuos. Estos residuos pueden ser cualquier residuo de aminoácido. Los paréntesis que contienen dos números hacen referencia a la gama de aminoácidos que pueden ocupar esa posición (p. ej., "[DE]-X_{(1,5)}-C" significa que los aminoácidos DE están seguidos por 1, 2, 3, 4, ó 5 residuos, seguido por C). Esta secuencia consenso representa solamente la porción del dominio A que comienza en la tercera cisteína. Un segundo consenso es el siguiente: C-X_{(3-15)}-C-X_{(4-15)}-C-X_{(6-7)}-C-[N,D]-X_{(3)}-[D,E,N,Q,H,S,T]-C-X_{(4,6)}-D-E-X_{(2-8)}-C. El segundo consenso pronostica residuos de aminoácidos que abarcan los seis residuos de cisteína. En algunas realizaciones, las variantes del dominio A comprenden secuencias esencialmente idénticas a cualquiera de las secuencias descritas antes.The illustrative sequences of domain A and the Consensus sequences are depicted in Figures 2, 3 and 8. The Figure 9 presents the location and appearance of residues in the domains A with the following cysteine spacing. Further, Figure 10 represents a number of domains A and provides a list of conserved amino acids. A typical consensus sequence Useful to identify domains A is as follows: C- [VILMA] -X (5)} - C- [DNH] -X (3)} - [DENQHT] -C-X (3,4)} - [STADE] - [DEH] - [ DE] -X (1.5) -C,  where the residues in square brackets indicate possible residues in a position. "X (#)}" indicates the number of residues. These residues can be any amino acid residue. The parentheses which contain two numbers refer to the range of amino acids that can occupy that position (e.g., "[DE] -X (1,5)} - C" means that amino acids DE are followed by 1, 2, 3, 4, or 5 residues, followed by C). This consensus sequence represents only the portion of domain A that begins in the third cysteine. A Second consensus is as follows: C-X (3-15) - C-X (4-15) - C-X (6-7) - C- [N, D] -X (3)} - [D , E, N, Q, H, S, T] -C-X (4,6) - DE-X (2-8) -C.  The second consensus predicts amino acid residues that cover the six cysteine residues. In some embodiments, the domain A variants comprise sequences essentially identical to any of the sequences described above.

Hasta la fecha, se han identificado al menos 190 dominios A humanos basándose en secuencias de ADNc. Véase, p. ej., la Figura 10. Las proteínas ilustrativas que contienen dominios A incluyen, p. ej., componentes del complemento (p. ej., C6, C7, C8, C9, y Factor I), serina proteasas (p. ej., enteropeptidasa, matriptasa, y corina), proteínas transmembrana (p. ej., ST7, LRP3, LRP5 y LRP6) y receptores endocíticos (p. ej., receptor relacionado con Sortilina, receptor de LDL, VLDLR, LRP1, LRP2, y ApoER2). Los dominios A y las variantes de dominios A pueden ser fácilmente empleados en la práctica de la presente invención como dominios monoméricos y sus variantes. Se puede encontrar una descripción adicional de dominios A en las siguientes publicaciones y las referencias allí citadas: Howell y Hertz, The LDL receptor gene family: signaling functions during development, (2001) Current Opinion in Neurobiology 11:74-81; Herz (2001), supra; Krieger, The "best" of cholesterols, the "worst" of cholesterols: A tale of two receptors, (1998) PNAS 95: 4077-4080; Goldstein y Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science, 292: 1310-1312; y, Moestrup y Verroust, Megalin- and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vitamins, Lipids, and Hormones in Polarized Epithelia, (2001) Ann. Rev. Nutr. 21:407-28.To date, at least 190 human A domains have been identified based on cDNA sequences. See , p. ex. , Figure 10. Illustrative proteins containing domains A include, e.g. e.g., complement components (e.g., C6, C7, C8, C9, and Factor I), serine proteases (e.g., enteropeptidase, matriptase, and corina), transmembrane proteins (e.g., ST7 , LRP3, LRP5 and LRP6) and endocytic receptors (e.g., Sortilin-related receptor, LDL receptor, VLDLR, LRP1, LRP2, and ApoER2). Domains A and variants of domains A can easily be used in the practice of the present invention as monomer domains and their variants. An additional description of A domains can be found in the following publications and references cited there: Howell and Hertz, The LDL receptor gene family: signaling functions during development, (2001) Current Opinion in Neurobiology 11: 74-81; Herz (2001), supra; Krieger, The "best" of cholesterols, the "worst" of cholesterols: A tale of two receptors, (1998) PNAS 95: 4077-4080; Goldstein and Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science, 292: 1310-1312; and, Moestrup and Verroust, Megalin- and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vitamins, Lipids, and Hormones in Polarized Epithelia, (2001) Ann. Rev. Nutr. 21: 407-28.

Las descripciones de algunos dominios monoméricos adicionales se pueden encontrar en las siguientes publicaciones y en las referencias allí citadas: Yamazaki et al., Elements of Neural Adhesion Molecules and a Yeast Vacuolar Protein Sorting Receptor are Present in a Novel Mammalian Low Density Lipoprotein Receptor Family Member, (1996) Journal of Biological Chemistry 271(40) 24761-24768; Nakayama et al., Identification of High-Molecular-Weight Proteins with Multiple EGF-like Motifs by Motif-Trap Screening, (1998) Genomics 51:27-34; Liu et al, Genomic Organization of New Candidate Tumor Suppressor Gene, LRP1B, (2000) Genomics 69:271-274; Liu et al., The Putative Tumor Suppressor LRP1B, a Novel Member of the Low Density Lipoprotein (LDL) Receptor Family, Exhibits Both Overlapping and Distinct Properties with the LDL Receptor-related Protein, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(31):28889-28896; Ishii et al, cDNA of a New Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein and Mapping of its Gene (LRP3) to Chromosome Bands 19q12-q13.2, (1998) Genomics 51:132-135; Orlando et al, Identification of the second cluster of ligand binding repeats in megalin as a site for receptor-ligand interactions, (1997) PNAS USA 94:2368-2373; Jeon y Shipley, Vesicle-reconstituted Low Density Lipoprotein Receptor, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(39):30458-30464; Simmons et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Fragment, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(41):25531-25536; Fass et al., Molecular Basis of familial hypercholesterolaemia from structure of LDL receptor module, (1997) Nature 388:691-93; Daly et al., Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor, (1995) PNAS USA 92:6334-6338; North y Blacklow, Structural Independence of Ligand-Binding Modules Five and Six of the LDL Receptor, (1999) Biochemistry 38:3926-3935; North and Blacklow, Solution Structure of the Sixth LDL-A module of the LDL Receptor, (2000) Biochemistry 39:25640-2571; North y Blacklow, Evidence that Familial Hypercholesterolemia Mutations of the LDL Receptor Cause Limited Local Misfolding in an LDL-A Module Pair, (2000) Biochemistry 39:13127-13135; Beglova et al., Backbone Dynamics of a Module Pair from the Ligand-Binding Domain of the LDL Receptor, (2001) Biochemistry 40:2808-2815; Bieri et al., Folding, Calcium binding, and Structural Characterization of a Concatemer of the First and Second Ligand-Binding Modules of the Low-Density Lipoprotein Receptor, (1998) Biochemistry 37:10994-11002; Jeon et al., Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain pair, (2001) Nature Structural Biology 8(6):499-504; Kurniawan et al., NMR structure of a concatemer of the first and second ligand-binding modules of the human low-density lipoprotein receptor, (2000) Protein Science 9:1282-1293; Esser et al., Mutational Analysis of the Ligand Binding Domain of the Low Density poprotein Receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(26):13282-13290; Russell et al., Different Combinations of Cysteine-rich Repeats Mediate Binding of Low Density Lipoprotein Receptor to Two Different Proteins, (1989) Journal of Biological Chemistry 264(36):21682-21688; Davis et al., Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region, (1987) Nature 326:760-765; Rong et al., Conversion of a human low-density lipoprotein receptor ligand-binding repeat to a virus receptor: Identification of residues important for ligand specificity, (1998) PNAS USA 95:8467-8472; Agnello et al., Hepatitis C virus and other Flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor; (1999) PNAS 96(22):12766-12771; Esser y Russell, Transport-deficient Mutations in the Low Density lipoprotein receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(26):13276-13281; Davis et al., The Low Density Lipoprotein Receptor, (1987) Journal of Biological Chemistry 262(9):4075-4082; y, Peacock et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Expressed in Xenopus Oocytes, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(16):7838-7845.Descriptions of some additional monomer domains can be found in the following publications and references cited there: Yamazaki et al ., Elements of Neural Adhesion Molecules and a Yeast Vacuolar Protein Sorting Receptor are Present in a Novel Mammalian Low Density Lipoprotein Receptor Family Member , (1996) Journal of Biological Chemistry 271 (40) 24761-24768; Nakayama et al ., Identification of High-Molecular-Weight Proteins with Multiple EGF-like Motifs by Motif-Trap Screening, (1998) Genomics 51: 27-34; Liu et al , Genomic Organization of New Candidate Tumor Suppressor Gene, LRP1B, (2000) Genomics 69: 271-274; Liu et al ., The Putative Tumor Suppressor LRP1B, a Novel Member of the Low Density Lipoprotein (LDL) Receptor Family, Exhibits Both Overlapping and Distinct Properties with the LDL Receptor-related Protein, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (31) : 28889-28896; Ishii et al , cDNA of a New Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein and Mapping of its Gene (LRP3) to Chromosome Bands 19q12-q13.2, (1998) Genomics 51: 132-135; Orlando et al , Identification of the second cluster of ligand binding repeats in megalin as a site for receptor-ligand interactions, (1997) PNAS USA 94: 2368-2373; Jeon and Shipley, Vesicle-reconstituted Low Density Lipoprotein Receptor, (2000) Journal of Biological Chemistry 275 (39): 30458-30464; Simmons et al ., Human Low Density Lipoprotein Receptor Fragment, (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (41): 25531-25536; Fass et al ., Molecular Basis of familial hypercholesterolaemia from structure of LDL receptor module, (1997) Nature 388: 691-93; Daly et al ., Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor, (1995) PNAS USA 92: 6334-6338; North and Blacklow, Structural Independence of Ligand-Binding Modules Five and Six of the LDL Receptor, (1999) Biochemistry 38: 3926-3935; North and Blacklow, Solution Structure of the Sixth LDL-A module of the LDL Receptor, (2000) Biochemistry 39: 25640-2571; North and Blacklow, Evidence that Familial Hypercholesterolemia Mutations of the LDL Receptor Cause Limited Local Misfolding in an LDL-A Module Pair, (2000) Biochemistry 39: 13127-13135; Beglova et al ., Backbone Dynamics of a Module Pair from the Ligand-Binding Domain of the LDL Receptor, (2001) Biochemistry 40: 2808-2815; Bieri et al ., Folding, Calcium binding, and Structural Characterization of a Concatemer of the First and Second Ligand-Binding Modules of the Low-Density Lipoprotein Receptor, (1998) Biochemistry 37: 10994-11002; Jeon et al ., Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain pair, (2001) Nature Structural Biology 8 (6): 499-504; Kurniawan et al ., NMR structure of a concatemer of the first and second ligand-binding modules of the human low-density lipoprotein receptor, (2000) Protein Science 9: 1282-1293; Esser et al ., Mutational Analysis of the Ligand Binding Domain of the Low Density poprotein Receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263 (26): 13282-13290; Russell et al ., Different Combinations of Cysteine-rich Repeats Mediate Binding of Low Density Lipoprotein Receptor to Two Different Proteins, (1989) Journal of Biological Chemistry 264 (36): 21682-21688; Davis et al ., Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region, (1987) Nature 326: 760-765; Rong et al ., Conversion of a human low-density lipoprotein receptor ligand-binding repeat to a virus receptor: Identification of residues important for ligand specificity, (1998) PNAS USA 95: 8467-8472; Agnello et al ., Hepatitis C virus and other Flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor; (1999) PNAS 96 (22): 12766-12771; Esser and Russell, Transport-deficient Mutations in the Low Density lipoprotein receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263 (26): 13276-13281; Davis et al ., The Low Density Lipoprotein Receptor, (1987) Journal of Biological Chemistry 262 (9): 4075-4082; and, Peacock et al ., Human Low Density Lipoprotein Receptor Expressed in Xenopus Oocytes, (1988) Journal of Biological Chemistry 263 (16): 7838-7845.

Otras publicaciones que describen las proteínas VLDLR, ApoER2 y LRP1 y sus dominios monoméricos incluyen las siguientes así como las referencias allí citadas: Savonen et al., The Carboxyl-terminal Domain of Receptor-associated Protein Facilitates Proper Folding and Trafficking of the Very Low Density Lipoprotein Receptor by Interaction with the Three Amino-terminal Ligand-binding Repeats of the Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(36):25877-25882; Hewat et al., The cellular receptor to human rhinovirus 2 binds around the 5-fold axis and not in the canyon: a structural view, (2000) EMBO Journal 19(23):6317-6325; Okun et al., VLDL Receptor Fragments of Different Lengths Bind to Human Rhinovirus HRV2 with Different Stoichiometry, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(2):1057-1062; Rettenberger et al., Ligand Binding Properties of the Very Low Density Lipoprotein Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(13):8973-8980; Mikhailenko et al., Functional Domains of the very low density lipoprotein receptor: molecular analysis of ligand binding and acid-dependent ligand dissociation mechanisms, (1999) Journal of Cell Science 112:3269-3281; Brandes et al., Alternative Splicing in the Ligand Binding Domain of Mouse ApoE Receptor-2 Produces Receptor Variants Binding Reelin but not alpa2-rnacroglobulin, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(25):22160-22169; Kim et al., Exon/Intron Organization, Chromosome Localization, Alternative Splicing, and Transcription Units of the Human Apolipoprotein E Receptor 2 Gene, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(13):8498-8504; Obermoeller-McCormick et al., Dissection of receptor folding and ligand-binding property with functional minireceptors of LDL receptor-related protein, (2001) Journal of Cell Science 114(5):899-908; Horn et al., Molecular Analysis of Ligand Binding of the Second Cluster of Complement-type Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(21):13608-13613; Neels et al., The Second and Fourth Cluster of Class A Cysteine-rich Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein Share Ligand binding Properties, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(44):31305-31311; Obermoeller et al., Differential Functions of the Triplicated Repeats Suggest Two Independent Roles for the Receptor-Associated Protein as a Molecular Chaperone, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(16):10761-10768; Andersen et al., Identification of the Minimal Functional Unit in the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein for Binding the Receptor-associated Protein (RAP), (2000) Journal of Biological Chemistry 275(28):21017-21024; Andersen et al., Specific Binding of alpha-Macroglobulin to Complement-Type Repeat CR4 of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, (2000) Biochemistry 39:10627-10633; Vash et al., Three Complement-Type Repeats of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein Define a.Common Binding Site for RAP, PAI-1, and Lactoferrin, (1998) Blood 92(9):3277-3285; Dolmer et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR3 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(5):3264-3269; Huang et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR8 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(20):14130-14136; y Liu et al., Uptake of HIV-1 Tat protein mediated by low-density lipoprotein receptor-related protein disrupts the neuronal metabolic balance of the receptor ligands, (2000) Nature Medicine 6(12):1380-1387.Other publications describing the VLDLR, ApoER2 and LRP1 proteins and their monomeric domains include the following as well as the references cited there: Savonen et al ., The Carboxyl-terminal Domain of Receptor-associated Protein Facilitates Proper Folding and Trafficking of the Very Low Density Lipoprotein Receptor by Interaction with the Three Amino-terminal Ligand-binding Repeats of the Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (36): 25877-25882; Hewat et al ., The cellular receptor to human rhinovirus 2 binds around the 5-fold axis and not in the canyon: a structural view, (2000) EMBO Journal 19 (23): 6317-6325; Okun et al ., VLDL Receptor Fragments of Different Lengths Bind to Human Rhinovirus HRV2 with Different Stoichiometry, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (2): 1057-1062; Rettenberger et al ., Ligand Binding Properties of the Very Low Density Lipoprotein Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (13): 8973-8980; Mikhailenko et al ., Functional Domains of the very low density lipoprotein receptor: molecular analysis of ligand binding and acid-dependent ligand dissociation mechanisms, (1999) Journal of Cell Science 112: 3269-3281; Brandes et al ., Alternative Splicing in the Ligand Binding Domain of Mouse ApoE Receptor-2 Produces Receptor Variants Binding Reelin but not alpa2-rnacroglobulin, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (25): 22160-22169; Kim et al ., Exon / Intron Organization, Chromosome Localization, Alternative Splicing, and Transcription Units of the Human Apolipoprotein E Receptor 2 Gene, (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (13): 8498-8504; Obermoeller-McCormick et al ., Dissection of receptor folding and ligand-binding property with functional minireceptors of LDL receptor-related protein, (2001) Journal of Cell Science 114 (5): 899-908; Horn et al ., Molecular Analysis of Ligand Binding of the Second Cluster of Complement-type Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (21): 13608-13613; Neels et al ., The Second and Fourth Cluster of Class A Cysteine-rich Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein Share Ligand binding Properties, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (44): 31305-31311; Obermoeller et al ., Differential Functions of the Triplicated Repeats Suggest Two Independent Roles for the Receptor-Associated Protein as a Molecular Chaperone, (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (16): 10761-10768; Andersen et al ., Identification of the Minimal Functional Unit in the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein for Binding the Receptor-associated Protein (RAP), (2000) Journal of Biological Chemistry 275 (28): 21017-21024; Andersen et al ., Specific Binding of alpha-Macroglobulin to Complement-Type Repeat CR4 of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, (2000) Biochemistry 39: 10627-10633; Vash et al ., Three Complement-Type Repeats of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein Defines a. Common Binding Site for RAP, PAI-1, and Lactoferrin, (1998) Blood 92 (9): 3277-3285; Dolmer et al ., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR3 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (2000) Journal of Biological Chemistry 275 (5): 3264-3269; Huang et al ., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR8 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (20): 14130-14136; and Liu et al ., Uptake of HIV-1 Tat protein mediated by low-density lipoprotein receptor-related protein disrupts the neuronal metabolic balance of the receptor ligands, (2000) Nature Medicine 6 (12): 1380-1387.

Otras referencias referentes a dominios monoméricos también incluyen las siguientes publicaciones y referencias allí citadas: FitzGerald et al, Pseudomonas Exotoxin-mediated Selection Yields Cells with Altered Expression of Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1995) Journal of Cell Biology, 129: 1533-41; Willnow y Herz, Genetic deficiency in low density lipoprotein receptor-related protein confers cellular resistance to Pseudomonas exotoxin A, (1994) Journal of Cell Science, 107:719-726; Trommsdorf et al., Interaction of Cytosolic Adaptor Proteins with Neuronal Apolipoprotein E Receptors and the Amyloid Precursor Protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(5): 33556-33560; Stockinger et al., The Low Density Lipoprotein Receptor Gene Family, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(48): 32213-32221; Obermoeller et al., Ca+2 and Receptor-associated Protein are independently required for proper folding and disulfide bond formation of the low density lipoprotein receptor-related protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(35):22374-22381; Sato et al., 39-kDa receptor-associated protein (RAP) facilitates secretion and ligand binding of extracellular region of very-low-density-lipoprotein receptor: implications for a distinct pathway from low-density-lipoprotein receptor, (1999) Biochem. J., 341:377-383; Avromoglu et al, Functional Expression of the Chicken Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein in a mutant Chinese Hamster Ovary Cell Line Restores Toxicity of Pseudomonas Exotoxin A and Degradation of alpha2 Macroglobulin, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(11) 6057-6065; Kingsley y Krieger, Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein: Somatic cell mutants define multiple genes required for expression of surface-receptor activity, (1984) PNAS USA, 81:5454-5458; Li et al, Differential Functions of Members of the Low Density Lipoprotein Receptor Family Suggests by their distinct endocystosis rates, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(21):18000-18006; y, Springer, An Extracellular beta-Propeller Module Predicted in Lipoprotein and Scavenger Receptors, Tyrosine Kinases, Epidermal Growth Factor Precursor, and Extracellular Matrix Components, (1998) J. Mol. Biol. 283:837-862.Other references concerning monomeric domains also include the following publications and references cited therein: FitzGerald et al , Pseudomonas Exotoxin-mediated Selection Yields Cells with Altered Expression of Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1995) Journal of Cell Biology, 129: 1533 -41; Willnow and Herz, Genetic deficiency in low density lipoprotein receptor-related protein confers cellular resistance to Pseudomonas exotoxin A, (1994) Journal of Cell Science, 107: 719-726; Trommsdorf et al ., Interaction of Cytosolic Adapter Proteins with Neuronal Apolipoprotein E Receptors and the Amyloid Precursor Protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (5): 33556-33560; Stockinger et al ., The Low Density Lipoprotein Receptor Gene Family, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (48): 32213-32221; Obermoeller et al ., Ca + 2 and Receptor-associated Protein are independently required for proper folding and disulfide bond formation of the low density lipoprotein receptor-related protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (35): 22374-22381; Sato et al ., 39-kDa receptor-associated protein (RAP) facilitates secretion and ligand binding of extracellular region of very-low-density-lipoprotein receptor: implications for a distinct pathway from low-density-lipoprotein receptor, (1999) Biochem . J., 341: 377-383; Avromoglu et al , Functional Expression of the Chicken Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein in a mutant Chinese Hamster Ovary Cell Line Restores Toxicity of Pseudomonas Exotoxin A and Degradation of alpha2 Macroglobulin, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (11) 6057- 6065; Kingsley and Krieger, Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein: Somatic cell mutants define multiple genes required for expression of surface-receptor activity, (1984) PNAS USA, 81: 5454-5458; Li et al , Differential Functions of Members of the Low Density Lipoprotein Receptor Family Suggests by their distinct endocystosis rates, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (21): 18000-18006; and, Springer, An Extracellular beta-Propeller Module Predicted in Lipoprotein and Scavenger Receptors, Tyrosine Kinases, Epidermal Growth Factor Precursor, and Extracellular Matrix Components, (1998) J. Mol. Biol. 283: 837-862.

Los polinucleótidos (también referidos como ácidos nucleicos) que codifican los dominios monoméricos se emplean típicamente para elaborar dominios monoméricos a través de su expresión. Los ácidos nucleicos que codifican dominios monoméricos pueden ser obtenidos de una variedad de fuentes diferentes. Las genotecas de dominios monoméricos pueden ser preparadas expresando una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes que codifican dominios monoméricos de origen natural, dominios monoméricos alterados (esto es, variantes de dominios monoméricos), o sus combinaciones.The polynucleotides (also referred to as nucleic acids) that encode monomeric domains are used typically to make monomeric domains through its expression. Nucleic acids encoding monomer domains They can be obtained from a variety of different sources. The Monomeric domain libraries can be prepared by expressing a plurality of different nucleic acids encoding domains  monomeric of natural origin, altered monomeric domains (this is, variants of monomeric domains), or combinations thereof.

La invención proporciona métodos de identificación de dominios monoméricos que se unen a un ligando seleccionado o deseado o una mezcla de ligandos. En algunas realizaciones, los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios se identifican o seleccionan con respecto a una propiedad deseada (p. ej., afinidad de unión) y después los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios forman multímeros. Véase, p. ej., la Figura 5. Para esas realizaciones, se puede utilizar cualquier método que de como resultado la selección de dominios con una propiedad deseada (p. ej., una propiedad de unión específica). Por ejemplo, los métodos pueden comprender proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, codificando cada ácido nucleico un dominio monomérico; traducir la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, proporcionando de ese modo una pluralidad de dominios monoméricos diferentes; escrutar la pluralidad de dominios monoméricos diferentes en busca de la unión al ligando o la mezcla de ligandos deseados; e, identificar miembros de la pluralidad de dominios monoméricos diferentes que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados.The invention provides methods of identifying monomeric domains that bind to a selected or desired ligand or a mixture of ligands. In some embodiments, the monomeric and / or immuno-domain domains are identified or selected with respect to a desired property (e.g., binding affinity) and then the monomeric and / or immuno-domain domains form multimers. See , p. eg, Figure 5. For those embodiments, any method that results in the selection of domains with a desired property (eg, a specific binding property) can be used. For example, the methods may comprise providing a plurality of different nucleic acids, each nucleic acid encoding a monomeric domain; translate the plurality of different nucleic acids, thereby providing a plurality of different monomeric domains; scrutinize the plurality of different monomer domains for ligand binding or the mixture of desired ligands; and, identify members of the plurality of different monomeric domains that bind to the ligand or mixture of desired ligands.

Como se ha mencionado antes, los dominios monoméricos pueden ser de origen natural o alterado (variantes no naturales). El término "de origen natural" se utiliza en la presente memoria para indicar que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, los dominios monoméricos naturales pueden incluir dominios monoméricos humanos u opcionalmente, dominios derivados de diferentes especies o fuentes, p. ej., mamíferos, primates, roedores, peces, pájaros, reptiles, plantas, etc. Los dominios monoméricos de origen natural pueden ser obtenidos mediante numerosos métodos, p. ej., mediante amplificación por PCR del ADN genómico o el ADNc.As mentioned before, domains monomeric can be of natural or altered origin (variants not natural). The term "of natural origin" is used in the present memory to indicate that an object can be found in nature. For example, natural monomer domains they can include human monomeric domains or optionally, domains derived from different species or sources, p. eg mammals, primates, rodents, fish, birds, reptiles, plants, etc. Monomeric domains of natural origin can be obtained  by numerous methods, e.g. e.g., by PCR amplification of genomic DNA or cDNA.

Los dominios monoméricos de la presente invención pueden ser dominios de origen natural o variantes de origen no natural. Las genotecas de dominios monoméricos empleadas en la práctica de la presente invención pueden contener dominios monoméricos de origen natural, variantes de dominios monoméricos de origen no natural, o una de sus combinaciones.The monomeric domains of the present invention may be domains of natural origin or variants of unnatural origin. The monomeric domain libraries used in the practice of the present invention they may contain domains monomeric of natural origin, variants of monomeric domains of unnatural origin, or one of its combinations.

Las variantes de dominios monoméricos pueden incluir dominios ancestrales, dominios quiméricos, dominios al azar, dominios mutados, y similares. Por ejemplo, los dominios ancestrales se pueden basar en el análisis filogenético. Los dominios quiméricos son dominios en los cuales una o más regiones son remplazadas por las regiones correspondientes de otros dominios de la misma familia. Los dominios al azar son dominios en los cuales una o más regiones se han aleatorizado. La aleatorización se puede basar en una aleatorización completa, u, opcionalmente, una aleatorización parcial basada en la distribución natural.Variants of monomeric domains can include ancestral domains, chimeric domains, domains at random, mutated domains, and the like. For example, domains Ancestral can be based on phylogenetic analysis. The chimeric domains are domains in which one or more regions are replaced by the corresponding regions of other domains from the same family. Random domains are domains in which one or more regions have been randomized. The randomization is it can be based on a complete randomization, or, optionally, a partial randomization based on natural distribution.

Los dominios monoméricos no naturales o los dominios monoméricos alterados se pueden producir mediante numerosos métodos. Se puede utilizar cualquier método de mutagénesis, tal como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis al azar (p. ej., mutagénesis química) para producir variantes. En algunas realizaciones, se emplea la PCR propensa a errores para crear variantes. Los métodos adicionales incluyen el alineamiento de una pluralidad de dominios monoméricos de origen natural alineando aminoácidos conservados en la pluralidad de dominios monoméricos de origen natural; y, diseñando el dominio monomérico de origen no natural mediante el mantenimiento de los aminoácidos conservados e insertando, suprimiendo o alterando los aminoácidos en torno a los aminoácidos conservados para generar el dominio monomérico de origen no natural. En una realización, los aminoácidos conservados comprenden cisteínas. En otra realización, la etapa de inserción utiliza aminoácidos al azar, u opcionalmente, la etapa de inserción utiliza porciones de los dominios monoméricos de origen natural. Los aminoácidos pueden ser insertados sintéticamente o pueden ser codificados por un ácido nucleico.Unnatural monomeric domains or altered monomeric domains can be produced by numerous  methods Any method of mutagenesis can be used, such such as site-directed mutagenesis and random mutagenesis (e.g. eg, chemical mutagenesis) to produce variants. In some embodiments, error-prone PCR is used to create variants. Additional methods include the alignment of a plurality of monomeric domains of natural origin aligning amino acids conserved in the plurality of monomeric domains of natural origin; and, designing the monomeric domain of origin not natural by maintaining conserved amino acids and inserting, suppressing or altering the amino acids around conserved amino acids to generate the monomeric domain of unnatural origin. In one embodiment, the conserved amino acids They comprise cysteines. In another embodiment, the insertion stage use random amino acids, or optionally, the insertion stage It uses portions of the monomeric domains of natural origin. The amino acids can be synthetically inserted or they can be encoded by a nucleic acid.

Los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de los dominios monoméricos de origen natural y/o los inmuno-dominios también se pueden mezclar y/o recombinar (p. ej., utilizando fragmentos producidos químicamente o enzimáticamente) para generar dominios monoméricos y/o inmuno-dominios modificados, completos. Los fragmentos y el dominio monomérico también pueden ser recombinados manipulando los ácidos nucleicos que codifican los dominios o sus fragmentos. Por ejemplo, se puede utilizar la ligación de un constructo de ácido nucleico que codifica fragmentos del dominio monomérico para generar un dominio monomérico alterado.Nucleic acids encoding fragments of monomeric domains of natural origin and / or immuno-domains can also be mixed and / or recombine (e.g., using chemically produced fragments or enzymatically) to generate monomeric domains and / or modified, complete immuno-domains. The fragments and the monomer domain can also be recombined manipulating the nucleic acids that encode domains or their fragments For example, you can use the ligation of a nucleic acid construct encoding domain fragments monomeric to generate an altered monomeric domain.

Los dominios monoméricos alterados también pueden ser generados proporcionando una colección de oligonucleótidos sintéticos (p. ej., oligonucleótidos solapantes) que codifican una secuencia conservada, al azar, al pseudo-azar, o definida de secuencias peptídicas que después son insertadas mediante ligación en un sitio predeterminado en un polinucleótido que codifica un dominio monomérico. De un modo similar, la diversidad de secuencia de uno o más dominios monoméricos puede ser ampliada mutando el dominios o los dominios monoméricos mediante mutagénesis dirigida al sitio, mutación al azar, mutación al pseudo-azar, mutación kernal definida, mutación basada en codones, y similares. Las moléculas de ácido nucleico resultantes pueden ser propagadas en un anfitrión para la clonación y amplificación. Los ácidos nucleicos pueden ser barajados.The altered monomer domains also can be generated by providing a collection of synthetic oligonucleotides (e.g., overlapping oligonucleotides) that encode a randomly conserved sequence at pseudo-random, or defined peptide sequences which are then inserted by ligation in one place default in a polynucleotide that encodes a domain monomeric Similarly, the sequence diversity of one or more monomer domains can be extended by mutating the domains or monomeric domains by site-directed mutagenesis, random mutation, pseudo-random mutation, mutation defined kernal, codon-based mutation, and the like. The resulting nucleic acid molecules can be propagated in a host for cloning and amplification. Nucleic acids They can be shuffled.

Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para recombinar una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican dominios monoméricos y escrutar la genoteca resultante en busca de dominios monoméricos que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados o similar. Los ácidos nucleicos de dominios monoméricos seleccionados también pueden ser retro-cruzados mediante barajado con secuencias de polinucleótido que codifican secuencias neutras (esto es, que tienen un efecto funcional insustancial sobre la unión), tal como por ejemplo, mediante retro-cruzamiento con una secuencia de tipo salvaje o de origen natural esencialmente idéntica a una secuencia seleccionada para producir dominios monoméricos funcionales de tipo nativo. Generalmente, durante el retro-cruzamiento, se aplica la selección posterior para conservar la propiedad, p. ej., la unión al ligando.Additionally described herein memory a method to recombine a plurality of nucleic acids  that encode monomer domains and scrutinize the library resulting in search of monomeric domains that bind to the ligand or mixture of desired ligands or the like. Nucleic acids from selected monomer domains can also be retro-crossed by shuffling with sequences of polynucleotide encoding neutral sequences (that is, that they have an insubstantial functional effect on the union), such as for example, by retro-crossing with a essentially identical wild or naturally occurring sequence to a sequence selected to produce monomer domains functional native type. Generally, during retro-cross, subsequent selection is applied to preserve property, p. eg, ligand binding.

Como se describe en la presente memoria la biblioteca de monómeros puede ser preparada mediante barajado. En tal caso, los dominios monoméricos se aíslan y se barajan para recombinar combinatoriamente las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios monoméricos (la recombinación se puede producir entre o en los dominios monoméricos, o ambos). La primera etapa implica identificar un dominio monomérico que tenga la propiedad deseada, p. ej., afinidad por un cierto ligando. Si bien durante la recombinación se mantienen los aminoácidos conservados, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios monoméricos se pueden recombinar, o recombinar y unir en multímeros.As described herein the Monomer library can be prepared by shuffling. In such case, the monomeric domains are isolated and shuffled to combinatorially recombine the nucleic acid sequences that encode monomeric domains (recombination can be produce between or in the monomeric domains, or both). The first stage involves identifying a monomeric domain that has the desired property, p. eg, affinity for a certain ligand. While conserved amino acids are maintained during recombination, nucleic acid sequences encoding domains monomers can be recombined, or recombined and bound in multimers

La selección de dominios monoméricos y/o inmuno-dominios a partir de una biblioteca de dominios se puede completar mediante una variedad de procedimientos. Por ejemplo, un método de identificación de dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que tienen una propiedad deseada implica traducir una pluralidad de ácidos nucleicos, donde cada ácido nucleico codifica un dominio monomérico y/o inmuno-dominio, escrutar los polipéptidos codificados por la pluralidad de ácidos nucleicos, e identificar esos dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que, p. ej., se unen a un ligando o una mezcla de ligandos deseados, produciendo de ese modo un dominio monomérico y/o inmuno-dominio seleccionado. Los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios expresados por cada uno de los ácidos nucleicos pueden ser sometidos a ensayo en busca de su capacidad para unirse al ligando mediante métodos conocidos en la técnica (esto es, inmunopurificación, cromatografía de afinidad, análisis FACS).The selection of monomeric domains and / or immuno-domains from a library of domains can be completed using a variety of procedures For example, a method of domain identification monomeric and / or immuno-domains that have a desired property involves translating a plurality of acids nucleic acids, where each nucleic acid encodes a monomeric domain and / or immuno-domain, screen polypeptides encoded by the plurality of nucleic acids, and identify those monomeric domains and / or immuno-domains that, p. e.g., they bind to a ligand or a mixture of desired ligands, thereby producing a monomeric domain and / or selected immuno-domain. Domains monomeric and / or immuno-domains expressed by each one of the nucleic acids can be tested for of its ability to bind the ligand by known methods in the art (that is, immunopurification, chromatography of affinity, FACS analysis).

Como se ha mencionado antes, la selección de los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios se puede basar en la unión a un ligando tal como una proteína diana u otra molécula diana (p. ej., lípido, carbohidrato, ácido nucleico y similares). Otras moléculas pueden ser incluidas opcionalmente en los métodos junto con la diana, p. ej., iones tales como Ca^{+2}. El ligando puede ser un ligando conocido, p. ej., un ligando que se sabe que se une a uno de una pluralidad de dominios monoméricos, o p. ej., el ligando deseado puede ser un ligando de un dominio monomérico desconocido. Véase, p. ej., la Figura 4, que ilustra algunos de los ligandos que se unen al dominio A. Otras selecciones de dominios monoméricos y/o inmuno-dominios se pueden basar, p. ej., en la inhibición o potenciación de una función específica de una proteína diana o una actividad. La actividad de la proteína diana puede incluir, p. ej., endocitosis o internalización, inducción del sistema del segundo mensajero, regulación al alza o regulación a la baja de un gen, unión a una matriz extracelular, liberación de una o varias moléculas, o un cambio en la conformación. En este caso, no se necesita que el ligando sea conocido. La selección también puede incluir el uso de análisis de alto rendimiento.As mentioned above, the selection of monomeric and / or immuno-domain domains can be based on binding to a ligand such as a target protein or other target molecule (e.g., lipid, carbohydrate, nucleic acid and the like. ). Other molecules may optionally be included in the methods together with the target, e.g. eg, ions such as Ca + 2. The ligand can be a known ligand, e.g. eg, a ligand that is known to bind to one of a plurality of monomeric domains, or p. eg, the desired ligand can be a ligand of an unknown monomer domain. See , p. ex. , Figure 4, illustrating some of the ligands that bind to domain A. Other selections of monomeric and / or immuno-domain domains can be based, e.g. eg, in the inhibition or potentiation of a specific function of a target protein or an activity. The activity of the target protein may include, e.g. eg, endocytosis or internalization, induction of the second messenger system, upward regulation or downward regulation of a gene, binding to an extracellular matrix, release of one or more molecules, or a change in conformation. In this case, it is not necessary for the ligand to be known. The selection may also include the use of high performance analysis.

Cuando un dominio monomérico y/o inmuno-dominio se selecciona basándose en su capacidad para unirse a un ligando, el fundamento de selección puede incluir la selección basada en una tasa de disociación lenta, que normalmente es predictiva de una elevada afinidad. La valencia del ligando también se puede variar para controlar la afinidad de unión media de los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios seleccionados. El ligando se puede unir a una superficie o sustrato a densidades variables, por ejemplo incluyendo un compuesto competidor, mediante dilución, o mediante otro método conocido por los expertos en la técnica. Se puede utilizar una elevada densidad (valencia) de ligando predeterminado para enriquecer en dominios monoméricos que tengan una afinidad relativamente baja, mientras una densidad baja (valencia) se puede enriquecer preferentemente en dominios monoméricos de afinidad superior.When a monomer domain and / or immuno-domain is selected based on its ability to join a ligand, the foundation of selection may include selection based on a slow dissociation rate, which is usually predictive of high affinity. Valence of the ligand can also be varied to control the affinity of middle union of monomeric domains and / or selected immuno-domains. The ligand can be join a surface or substrate at varying densities, by example including a competing compound, by dilution, or by another method known to those skilled in the art. Be you can use a high density (valence) of ligand default to enrich in monomer domains that have a relatively low affinity, while a low density (Valencia) can be preferably enriched in domains monomeric higher affinity.

Se pueden utilizar una variedad de vectores de presentación informadores para expresar ácidos nucleicos que codifican los dominios monoméricos, inmuno-dominios y/o multímeros de la presente invención y para someter a ensayo una actividad deseada. Por ejemplo, un sistema de presentación en fagos es un sistema en el cual se expresan dominios monoméricos como proteínas de fusión sobre la superficie de fagos (Pharmacia, Milwaukee Wis.). La presentación en fagos puede implicar la presentación de una secuencia polipeptídica que codifique dominios monoméricos y/o inmuno-dominios sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso, típicamente como una fusión con una proteína de la envoltura del bacteriófago.A variety of vectors of reporting informants to express nucleic acids that encode monomeric domains, immuno-domains and / or multimers of the present invention and for testing a desired activity For example, a phage display system it is a system in which monomeric domains are expressed as fusion proteins on the phage surface (Pharmacia, Milwaukee Wis.). Phage display may involve presentation of a polypeptide sequence encoding domains monomeric and / or immuno-domains on the surface of a filamentous bacteriophage, typically as a fusion with a bacteriophage envelope protein.

Generalmente en estos métodos, cada partícula de fago o célula sirve como un miembro de una genoteca individual que presenta una única especie de polipéptido presentado además de las secuencias de proteínas del fago natural o célula. La pluralidad de ácidos nucleicos se clona en el ADN del fago en un sitio que da como resultado la transcripción de una proteína de fusión, una porción de la cual está codificada por la pluralidad de ácidos nucleicos. El fago que contiene una molécula de ácido nucleico experimenta replicación y transcripción en la célula. La secuencia líder de la proteína de fusión dirige el transporte de la proteína de fusión hacia la punta de la partícula del fago. De este modo, la proteína de fusión que está parcialmente codificada por el ácido nucleico es presentada sobre la partícula del fago para la detección y selección mediante los métodos descritos más arriba y más abajo. Por ejemplo, la genoteca de fagos se puede incubar con un ligando predeterminado (deseado), de manera que las partículas de fago que presentan una secuencia de una proteína de fusión que se une al ligando se puedan separar diferencialmente de aquellas que no presenten secuencias polipeptídicas que se unan al ligando predeterminado. Por ejemplo, la separación se puede proporcionar inmovilizando el ligando predeterminado. Las partículas de fago (esto es, los miembros de la genoteca) que se unen al ligando inmovilizado son recuperadas después y replicadas para amplificar la subpoblación de fagos seleccionados para una ronda subsiguiente de enriquecimiento de afinidad y replicación de fagos. Después de varias rondas de enriquecimiento de afinidad y replicación de fagos, los miembros de la genoteca de fagos que se seleccionan de este modo se aíslan y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos presentada se determina, identificando de ese modo la secuencia o las secuencias de polipéptidos que se unen al ligando predeterminado. Tales métodos se describen adicionalmente en las publicaciones de patentes PCT Núms. 91/17271, 91/18980, y 91/19818 y 93/08278.Generally in these methods, each particle of phage or cell serves as a member of an individual library that it presents a single species of polypeptide presented in addition to the Natural phage or cell protein sequences. The plurality of nucleic acids are cloned into phage DNA at a site that gives as transcription result of a fusion protein, a portion of which is encoded by the plurality of nucleic acids. The phage that contains a nucleic acid molecule experiences replication and transcription in the cell. The leading sequence of the fusion protein directs the transport of fusion protein towards the tip of the phage particle. In this way, the protein of fusion that is partially encoded by the nucleic acid is presented on phage particle for detection and selection by the methods described above and below. For example, the phage library can be incubated with a predetermined ligand (desired), so that phage particles presenting a sequence of a fusion protein that binds to the ligand can be differentially separate from those that do not have sequences polypeptides that bind to the predetermined ligand. For example, separation can be provided by immobilizing the ligand predetermined. Phage particles (that is, members of the library) that bind to the immobilized ligand are recovered then and replicated to amplify phage subpopulation selected for a subsequent round of enrichment of phage affinity and replication. After several rounds of affinity enrichment and phage replication, members of the phage library that are selected in this way are isolated and the nucleotide sequence encoding the polypeptide sequence presented is determined, thereby identifying the sequence or polypeptide sequences that bind to the ligand predetermined. Such methods are further described in the PCT patent publications Nos. 91/17271, 91/18980, and 91/19818 and 93/08278.

Los ejemplos de otros sistemas de presentación incluyen presentaciones en ribosomas, una presentación ligada a nucleótidos (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.281.344; 6.194.550, 6.207.446, 6.214.553, y 6.258.558), presentaciones en superficies celulares y similares. Las presentaciones en superficies celulares incluyen una variedad de células, p. ej., células de E. coli, levadura y/o mamífero. Cuando se utiliza una célula como presentación, los ácidos nucleicos, p. ej., obtenidos mediante amplificación por PCR seguida de digestión, son introducidos en la célula y traducidos. Opcionalmente, los polipéptidos que codifican los dominios monoméricos o los multímeros de la presente invención pueden ser introducidos, p. ej., mediante inyección, en la célula.Examples of other presentation systems include presentations in ribosomes, a presentation linked to nucleotides (see , e.g., U.S. Patents Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, and 6,258,558), presentations on cell surfaces and the like. Presentations on cell surfaces include a variety of cells, e.g. eg, E. coli , yeast and / or mammalian cells. When a cell is used as a presentation, nucleic acids, e.g. eg, obtained by PCR amplification followed by digestion, are introduced into the cell and translated. Optionally, polypeptides encoding the monomeric domains or multimers of the present invention can be introduced, e.g. eg, by injection, in the cell.

La invención también incluye composiciones que son producidas mediante los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye dominios monoméricos seleccionados o identificados a partir de una genoteca y/o genotecas que comprenden dominios monoméricos producidos mediante los métodos de la presente invención.The invention also includes compositions that are produced by the methods of the present invention. By example, the present invention includes monomer domains selected or identified from a library and / or libraries that comprise monomeric domains produced by The methods of the present invention.

La presente invención también proporciona bibliotecas de dominios monoméricos. Las bibliotecas pueden incluir, p. ej., aproximadamente 100, 250, 500 dominios monoméricos, o la biblioteca puede incluir, p. ej., aproximadamente 100, 250, 500 o más polipéptidos que codifican dominios monoméricos. Las bibliotecas pueden incluir dominios monoméricos que contienen el mismo marco de cisteínas, p. ej., dominios A.The present invention also provides libraries of monomeric domains. Libraries can include,  p. eg, approximately 100, 250, 500 monomer domains, or the library may include, e.g. e.g., approximately 100, 250, 500 or more polypeptides encoding monomer domains. The libraries they can include monomeric domains that contain the same framework of cysteines, p. eg, domains A.

Como se describe en la presente memoria, las genotecas se pueden escrutar en busca de una propiedad deseada tal como la unión de un ligando o una mezcla de ligandos deseados. Por ejemplo, los miembros de la biblioteca de dominios monoméricos se pueden presentar y pre-escrutar en busca de la unión a un ligando o mezcla de ligandos conocidos o desconocidos. Las secuencias de los dominios monoméricos se pueden mutagenizar después (p. ej., recombinar, alterar químicamente, etc.) o alterar de otro modo y los nuevos dominios monoméricos se pueden escrutar de nuevo en busca de la unión al ligando o la mezcla de ligandos con una afinidad mejorada. Los dominios monoméricos seleccionados se pueden combinar o unir para formar multímeros, que después se pueden escrutar en busca de una afinidad o avidez mejoradas o una especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos. La especificidad alterada puede significar que la especificidad se amplía, p. ej., unión de múltiples virus relacionados, u opcionalmente la especificidad alterada puede significar que la especificidad se estrecha, p. ej., la unión en una región específica de un ligando. Los expertos en la técnica reconocerán que hay varios métodos disponibles para calcular la avidez. Véanse, p. ej., Mammen et al., Angew Chem Int. Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al., Anal. Biochem. 261:149-158
(1998).As described herein, libraries can be screened for a desired property such as the binding of a ligand or a mixture of desired ligands. For example, members of the monomer domain library can be presented and pre-screened for binding to a ligand or mixture of known or unknown ligands. The sequences of the monomeric domains can then be mutagenized (e.g., recombined, chemically altered, etc.) or otherwise altered and the new monomeric domains can be screened again for binding to the ligand or mixture of ligands with improved affinity. Selected monomer domains can be combined or linked to form multimers, which can then be screened for improved affinity or greediness or an altered specificity for the ligand or ligand mixture. Altered specificity may mean that the specificity is extended, e.g. eg, binding of multiple related viruses, or optionally altered specificity may mean that the specificity narrows, e.g. eg, binding in a specific region of a ligand. Those skilled in the art will recognize that there are several methods available to calculate avidity. See , p. eg, Mammen et al ., Angew Chem Int. Ed. 37: 2754-2794 (1998); Muller et al ., Anal. Biochem 261: 149-158
(1998).

Los expertos en la técnica reconocerán que las etapas de generación de la variación y el escrutinio en busca de una propiedad deseada se pueden repetir (esto es, realizar recursivamente) para optimizar los resultados. Por ejemplo, en una genoteca de presentación en fagos u otro formato similar, se puede realizar un primer escrutinio de una genoteca con una restricción relativamente inferior, seleccionando de ese modo tantas partículas asociadas con una molécula diana como sea posible. Las partículas seleccionadas se pueden aislar después y los polinucleótidos que codifican el monómero o multímero se pueden aislar de las partículas. Después se pueden generar variaciones adicionales partir de estas secuencias y con posterioridad rastrear a una afinidad superior. La Figura 7 ilustra un ciclo genérico de selección y generación de la variación.Those skilled in the art will recognize that stages of generation of variation and scrutiny in search of a desired property can be repeated (that is, perform recursively) to optimize the results. For example, in a phage display library or other similar format, you can perform a first scrutiny of a library with a restriction relatively lower, thereby selecting so many particles associated with a target molecule as possible. The particles selected can then be isolated and the polynucleotides that encode the monomer or multimer can be isolated from particles Then additional variations can be generated from these sequences and then track to a superior affinity Figure 7 illustrates a generic cycle of Selection and generation of variation.

Los polipéptidos de las composiciones están incluidos en la presente invención. Por ejemplo, la presente invención proporciona una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes donde cada ácido nucleico codifica al menos dos dominios monoméricos de clase A del receptor de LDL.The polypeptides of the compositions are included in the present invention. For example, this invention provides a plurality of different nucleic acids where each nucleic acid encodes at least two domains Class A monomeric LDL receptor.

2. Multímeros (también denominados Proteínas Mosaico Recombinante o Proteínas Mosaico Combinatorias)2. Multimers (also called Mosaic Proteins Recombinant or Combinatorial Mosaic Proteins)

Los métodos para generar multímeros son un rasgo de la presente invención. Los multímeros comprenden al menos dos dominios monoméricos de la clase A de los receptores de LDL. Por ejemplo, los multímeros de la invención pueden comprender de 2 a aproximadamente 10 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, de 2 y aproximadamente 8 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, de aproximadamente 3 y aproximadamente 10 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, aproximadamente 7 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, aproximadamente 6 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, aproximadamente 5 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios, o aproximadamente 4 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios. En algunas realizaciones, el multímero comprende al menos 3 dominios monoméricos y/o inmuno-dominios. Típicamente, los dominios monoméricos han sido pre-seleccionados para la unión a la molécula diana de interés.The methods for generating multimers are a feature of the present invention. The multimers comprise at least two monomeric domains of class A of LDL receptors. By For example, the multimers of the invention may comprise from 2 to approximately 10 monomer domains and / or immuno-domains, of 2 and approximately 8 domains monomeric and / or immuno-domains, of approximately 3 and about 10 monomer domains and / or immuno-domains, approximately 7 domains monomeric and / or immuno-domains, approximately 6 monomeric domains and / or immuno-domains, approximately 5 monomer domains and / or immuno-domains, or approximately 4 domains monomeric and / or immuno-domains. In some embodiments, the multimer comprises at least 3 domains monomeric and / or immuno-domains. Typically, the monomeric domains have been pre-selected for binding to the target molecule of interest.

En algunas realizaciones, cada dominio monomérico se une específicamente a una molécula diana. En algunas de estas realizaciones, cada monómero se une a una posición diferente (análoga a un epítopo) de una molécula diana. Múltiples dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que se unen a la misma molécula diana dan como resultado un efecto sobre la avidez que produce una mejora de la avidez del multímero por la molécula diana en comparación con cada monómero individual. En algunas realizaciones, el multímero tiene una avidez de al menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 o 100 veces la avidez de un dominio monomérico solo.In some embodiments, each domain monomer specifically binds to a target molecule. In some of these embodiments, each monomer joins a position different (analogous to an epitope) of a target molecule. Multiple monomeric domains and / or immuno-domains that bind to the same target molecule result in an effect on the avidity that produces an avidity improvement of the multimer by the target molecule compared to each individual monomer. In some embodiments, the multimer has an avidity of at least approximately 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 or 100 times greediness of a single monomer domain.

En otra realización, el multímero comprende dominios monoméricos con especificidades para diferentes moléculas diana. Por ejemplo, los multímeros de tales dominios monoméricos diversos se pueden unir específicamente a componentes de un sistema de replicación viral o diferentes serotipos de un virus. En algunas realizaciones, al menos un dominio monomérico se une a una toxina y al menos un dominio monomérico se une a una molécula de la superficie celular, actuando de ese modo como un mecanismo para dirigir la toxina. En algunas realizaciones, al menos dos dominios monoméricos y/o inmuno-dominios del multímero se unen a moléculas diana diferentes en una célula o tejido diana. De un modo similar, las moléculas terapéuticas pueden ser dirigidas a la célula o tejido uniendo un agente terapéutico a un monómero que también contiene otros dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que tienen especificidad de unión a la célula o tejido.In another embodiment, the multimer comprises monomeric domains with specificities for different molecules Diana. For example, multimers of such monomer domains various can be specifically linked to components of a system of viral replication or different serotypes of a virus. In some embodiments, at least one monomeric domain binds to a toxin and at least one monomeric domain binds to a molecule of the cell surface, thus acting as a mechanism to Direct the toxin. In some embodiments, at least two domains monomeric and / or immuno-domains of the multimer are bind to different target molecules in a cell or target tissue. From similarly, therapeutic molecules can be directed to the cell or tissue attaching a therapeutic agent to a monomer that It also contains other monomeric domains and / or immuno-domains that have specificity to binding to The cell or tissue.

Los multímeros pueden comprender una variedad de combinaciones de dominios monoméricos. Por ejemplo, en un único multímero, los dominios monoméricos seleccionados pueden ser iguales o idénticos, opcionalmente, diferentes o no idénticos. Además, los dominios monoméricos seleccionados pueden comprender varios dominios monoméricos diferentes de la misma familia de dominios monoméricos, o varios dominios monoméricos de diferentes familias de dominios, u opcionalmente, una combinación de ambos.Multimers may comprise a variety of combinations of monomeric domains. For example, in a single multimer, the selected monomer domains can be the same or identical, optionally, different or not identical. In addition, the Selected monomer domains can comprise several domains different monomers of the same family of monomer domains, or several monomeric domains of different domain families, or optionally, a combination of both.

Los multímeros que se generan en la práctica de la presente invención pueden ser cualquiera de los siguientes:The multimers that are generated in the practice of The present invention can be any of the following:

(1)(one)

Un homo-multímero (un multímero del mismo dominio, esto es, A1-A1-A1-A1);A homo-multimer (a multimer of the same domain, this is, A1-A1-A1-A1);

(2)(2)

Un hetero-multímero de diferentes dominios de la misma clase de dominios, p. ej., A1-A2-A3-A4. Por ejemplo, el hetero-multímero incluye multímeros en los que A1, A2, A3 y A4 son diferentes variantes de origen no natural de un dominio de clase A del receptor de LDL concreto, o donde algunos de A1, A2, A3, y A4 son variantes de origen natural de un dominio de clase A del receptor de LDL (véase, p. ej., la Figura 10).A hetero-multimer of different domains of the same class of domains, e.g. eg, A1-A2-A3-A4. For example, the hetero-multimer includes multimers in which A1, A2, A3 and A4 are different variants of unnatural origin of a class A domain of the particular LDL receptor, or where some of A1, A2, A3, and A4 they are naturally occurring variants of a class A domain of the LDL receptor (see , eg, Figure 10).

Las bibliotecas de multímeros empleadas en la práctica de la presente invención pueden contener homo-multímeros, hetero-multímeros de diferentes dominios monoméricos (naturales o no naturales) de los dominios de clase A del receptor de LDL.The multimer libraries used in the practice of the present invention may contain homo-multimers, hetero-multimers from different monomeric domains (natural or non-natural) of the Class A domains of the LDL receptor.

Los dominios no necesitan ser seleccionados antes de que los dominios se unan para formar multímeros. Por otra parte, los dominios pueden ser seleccionados en busca de su capacidad para unirse a una molécula diana antes de unirse en multímeros. De este modo, por ejemplo, un multímero puede comprender dos dominios que se unen a una molécula diana y un tercer dominio que se une a una segunda molécula diana.Domains do not need to be selected before the domains unite to form multimers. For other part, domains can be selected in search of their ability to bind to a target molecule before joining in multimers Thus, for example, a multimer can comprise two domains that bind to a target molecule and a third domain which binds to a second target molecule.

Los dominios monoméricos seleccionados se unen por medio de un conector para formar un multímero. Por ejemplo, se coloca un conector entre cada dominio monomérico separado discreto en un multímero.Selected monomer domains join by means of a connector to form a multimer. For example, it place a connector between each discrete separate monomer domain in a multimer.

La unión de los dominios monoméricos seleccionados por medio de un conector se puede completar utilizando una variedad de mecanismos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensamblaje combinatorio de los polinucleótidos que codifican los dominios monoméricos seleccionados se puede lograr mediante ligación de ADN, u opcionalmente, mediante reacciones de solapamiento de auto-cebado basadas en PCR. El conector puede ser anclado a un monómero antes de que el monómero sea identificado por su capacidad para unirse a un multímero diana o después de que el monómero haya sido seleccionado por su capacidad para unirse a un multímero diana.The union of monomeric domains selected by means of a connector can be completed using  a variety of mechanisms known in the art. For example, him combinatorial assembly of the polynucleotides encoding the Selected monomer domains can be achieved by ligation of DNA, or optionally, by overlapping reactions of self-priming based on PCR. The connector can be anchored to a monomer before the monomer is identified by your ability to join a target multimer or after the monomer has been selected for its ability to join a target multimer.

El conector puede ser de origen natural, sintético o una combinación de ambos. Por ejemplo, el conector sintético puede ser un conector aleatorizado, p. ej., tanto en secuencia como en tamaño. En un aspecto, el conector aleatorizado puede comprender una secuencia completamente aleatorizada, u opcionalmente, el conector aleatorizado se puede basar en secuencias conectoras naturales. El conector puede comprender, p. ej. un radical no peptídico, un polinucleótido, un polipéptido o similar.The connector can be of natural origin, synthetic or a combination of both. For example, the connector synthetic can be a randomized connector, e.g. eg both in sequence as in size. In one aspect, the randomized connector may comprise a completely randomized sequence, or optionally, the randomized connector can be based on natural connecting sequences. The connector may comprise, e.g. ex. a non-peptide radical, a polynucleotide, a polypeptide or Similary.

Un conector puede ser rígido, o alternativamente, flexible, o una combinación de ambos. La flexibilidad del conector puede ser una función de la composición tanto del conector como de los dominios monoméricos con los cuales interacciona el conector. El conector une dos dominios monoméricos seleccionados, y mantiene los dominios monoméricos como dominios monoméricos separados discretos. El conector puede permitir que los dominios monoméricos separados discretos cooperen aunque mantengan sus propiedades separadas tales como múltiples sitios de unión separados para el mismo ligando en un multímero, o p. ej., múltiples sitios de unión separados para diferentes ligandos en un multímero.A connector can be rigid, or alternatively, flexible, or a combination of both. The connector flexibility can be a function of the composition both the connector and the monomer domains with which the connector interacts. The connector joins two monomer domains selected, and keeps the monomer domains as domains discrete separated monomers. The connector can allow the discrete separate monomer domains cooperate even if they maintain its separate properties such as multiple binding sites separated for the same ligand in a multimer, or p. eg multiple separate binding sites for different ligands in a multimer.

La elección de un conector adecuado para un caso específico en el que dos o más dominios monoméricos (esto es cadenas polipeptídicas) van a ser conectados puede depender de una variedad de parámetros incluyendo, p. ej. la naturaleza de los dominios monoméricos, la estructura y naturaleza de la diana a la cual se debe unir el multímero polipeptídico y/o la estabilidad del conector peptídico hacia la proteolisis y la oxidación.Choosing a suitable connector for a case specific in which two or more monomeric domains (this is polypeptide chains) are going to be connected can depend on a variety of parameters including, e.g. ex. the nature of monomeric domains, the structure and nature of the target to the which the polypeptide multimer should be attached and / or the stability of the peptide connector towards proteolysis and oxidation.

La presente invención proporciona métodos para optimizar la elección del conector una vez que se han identificado los dominios monoméricos/variantes deseados. Generalmente, las bibliotecas de multímeros que tienen una composición que es fija con respecto a la composición de dominios monoméricos, pero variable en la composición y longitud del conector, se puede preparar fácilmente y escrutar como se ha descrito antes.The present invention provides methods for optimize the connector choice once they have been identified the desired monomer domains / variants. Generally, the multimer libraries that have a composition that is fixed with respect to the composition of monomeric domains, but variable in the composition and length of the connector, it can be prepared Easily and scrutinize as described before.

Típicamente, el polipéptido conector puede incluir predominantemente residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Gly, Ser, Ala y Thr. Por ejemplo, el conector peptídico puede contener al menos 75% (calculado basándose en el número total de residuos del conector peptídico), por ejemplo al menos 80%, p. ej. al menos 85% o al menos 90% de residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Gly, Ser, Ala y Thr. El conector peptídico también puede consistir en residuos de Gly, Ser, Ala y/o Thr solamente. El polipéptido conector debe tener una longitud, que sea adecuada para conectar dos dominios monoméricos de tal manera que adopten entre sí la conformación relativa correcta de forma que conserven la actividad deseada, por ejemplo como antagonistas de un receptor dado.Typically, the linker polypeptide can predominantly include amino acid residues selected from group consisting of Gly, Ser, Ala and Thr. For example, the connector peptide may contain at least 75% (calculated based on the total number of peptide connector residues), for example at minus 80%, p. ex. at least 85% or at least 90% of waste from amino acid selected from the group consisting of Gly, Ser, Ala and Thr. The peptide connector may also consist of residues of Gly, Ser, Ala and / or Thr only. The polypeptide linker must have a length, which is suitable for connecting two domains monomeric in such a way that they adopt each other the conformation correct relative so that they retain the desired activity, by example as antagonists of a given receptor.

Una longitud adecuada para este propósito es una longitud de al menos uno y típicamente menos de aproximadamente 50 residuos de aminoácido, tal como 2-25 residuos de aminoácido, 5-20 residuos de aminoácido, 5-15 residuos de aminoácido, 8-12 residuos de aminoácido u 11 residuos. De un modo similar, el polipéptido que codifica un conector puede oscilar en tamaño, p. ej., de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 aminoácidos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, aproximadamente 10, aproximadamente 8, o aproximadamente 6 aminoácidos. En los métodos y composiciones que implican ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN, o combinaciones de ambos, el polinucleótido que contiene la secuencia conectora puede tener, p. ej., entre aproximadamente 6 nucleótidos y aproximadamente 45 nucleótidos, entre aproximadamente 9 nucleótidos y aproximadamente 45 nucleótidos, entre aproximadamente 12 nucleótidos y aproximadamente 36 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 24 nucleótidos, o aproximadamente 18 nucleótidos. Del mismo modo, los residuos de aminoácido seleccionados para la inclusión en el polipéptido conector deben mostrar propiedades que no interfieran significativamente en la actividad o función del multímero polipeptídico. De este modo, el conector peptídico no debe mostrar en general, una carga que no concuerde con la actividad o función del multímero polipeptídico, o interfiera en el plegamiento interno, o forme enlaces u otras interacciones con residuos de aminoácido en uno o más de los dominios monoméricos que pudieran impedir gravemente la unión del multímero polipeptídico a la diana en cuestión.A suitable length for this purpose is a length of at least one and typically less than about 50 amino acid residues, such as 2-25 residues of amino acid, 5-20 amino acid residues, 5-15 amino acid residues, 8-12 amino acid residues or 11 residues. In a similar way, the polypeptide encoding a connector may range in size, e.g. eg, from about 2 to about 15 amino acids, of about 3 to about 15, about 4 to about 12, about 10, about 8, or Approximately 6 amino acids In the methods and compositions that involve nucleic acids, such as DNA, RNA, or combinations of both, the polynucleotide that contains the linker sequence can have, p. eg, between approximately 6 nucleotides and approximately 45 nucleotides, between approximately 9 nucleotides and about 45 nucleotides, between about 12 nucleotides and approximately 36 nucleotides, approximately 30 nucleotides, approximately 24 nucleotides, or approximately 18 nucleotides Similarly, amino acid residues Selected for inclusion in the polypeptide linker should show properties that do not significantly interfere with the activity or function of the polypeptide multimer. In this way, the peptide connector should not show in general, a load that does not match the activity or function of the polypeptide multimer, or interfere with the internal folding, or form links or other interactions with amino acid residues in one or more of the monomeric domains that could seriously impede the union of polypeptide multimer to the target in question.

Como se describe en la presente memoria, el conector peptídico se selecciona de una biblioteca en la que los residuos de aminoácido del conector peptídico están aleatorizados para un grupo específico de dominios monoméricos en un multímero polipeptídico concreto. Se podría utilizar un conector flexible para encontrar combinaciones adecuadas de dominios monoméricos, que después se optimiza utilizando esta biblioteca al azar de conectores variables para obtener conectores con una longitud y geometría óptimas. Los conectores óptimos pueden contener el número mínimo de residuos de aminoácido del tipo correcto que participan en la unión a la diana y restringir el movimiento relativo de los dominios monoméricos entre sí en el multímero polipeptídico cuando no está unido a la
diana.As described herein, the peptide linker is selected from a library in which the amino acid residues of the peptide linker are randomized to a specific group of monomer domains in a particular polypeptide multimer. A flexible connector could be used to find suitable combinations of monomer domains, which is then optimized using this random library of variable connectors to obtain connectors with optimal length and geometry. The optimal connectors may contain the minimum number of amino acid residues of the correct type that participate in the binding to the target and restrict the relative movement of the monomeric domains with each other in the polypeptide multimer when not bound to the
Diana.

El uso de conectores peptídicos de origen natural así como artificiales para conectar polipéptidos en polipéptidos de fusión conectados novedosos es bien conocido en la bibliografía (Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139,2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630; US 5,856,456).The use of natural as well as artificial peptide connectors to connect polypeptides in novel connected fusion polypeptides is well known in the literature (Hallewell et al . (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al . (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al . (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al . (1998), Endocrinology 139,2459-2464; Smallshaw et al . (1999), Protein Eng. 12, 623-630; US 5,856,456).

Un ejemplo en el que el uso de conectores peptídicos es amplio es para la producción de anticuerpos de cadena sencilla en los que las regiones variables de una cadena ligera (V_{L}) y una cadena pesada (V_{H}) están unidas por un conector artificial, y existe un gran número de publicaciones sobre este campo concreto. Un conector peptídico ampliamente utilizado es un péptido de 15 unidades que consiste en tres repeticiones de una secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ((Gly_{4}Ser)_{3}). Se han utilizado otros conectores y se han utilizado la tecnología de presentación en fagos así como la tecnología de fagos infectivos selectivos para diversificar y seleccionar secuencias conectoras apropiadas (Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410). Se han utilizado conectores peptídicos para conectar cadenas individuales en proteínas hetero- y homo-diméricas tales como el receptor de las células T, el represor Cro de lambda, el represor Arc del fago P22, IL-12, TSH, FSH, IL-5, y el interferón-\gamma. También se han empleado conectores peptídicos para crear polipéptidos de fusión. Se han utilizado diferentes conectores y en el caso del represor Arc, se ha utilizado la presentación en fagos para optimizar la longitud del conector y la composición para un aumento de la estabilidad de la proteína de cadena sencilla (Robinson y Sauer (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5929-5934).An example in which the use of peptide connectors is broad is for the production of single chain antibodies in which the variable regions of a light chain (V L) and a heavy chain (V H) are linked by an artificial connector, and there are a large number of publications on this particular field. A widely used peptide linker is a 15-unit peptide consisting of three repetitions of a Gly-Gly-Gly-Gly-Ser amino acid sequence ((Gly 4 Ser) 3). Other connectors have been used and phage display technology as well as selective infective phage technology have been used to diversify and select appropriate connecting sequences (Tang et al . (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686 ; Hennecke et al . (1998), Protein Eng. 11, 405-410). Peptide connectors have been used to connect individual chains in hetero- and homo-dimeric proteins such as the T-cell receptor, the Lambda Cro repressor, the phage Arc repressor P22, IL-12, TSH, FSH, IL-5 , and interferon- γ. Peptide connectors have also been used to create fusion polypeptides. Different connectors have been used and in the case of the Arc repressor, phage display has been used to optimize the length of the connector and the composition for an increase in the stability of the single chain protein (Robinson and Sauer (1998), Proc Natl. Acad. Sci. USA 95, 5929-5934).

Otro tipo de conector es una inteína, esto es, un tramo peptídico que es expresado con el polipéptido de cadena sencilla, pero separado post-traduccionalmente mediante empalme de proteínas. El uso de inteínas es revisado por F.S. Gimble en Chemistry and Biology, 1998, Vol 5, Núm. 10 págs. 251-256.Another type of connector is an intein, that is, a peptide stretch that is expressed with the chain polypeptide simple, but post-translationally separated by protein splicing. The use of inteines is reviewed by F.S. Gimble in Chemistry and Biology, 1998, Vol 5, No. 10 pp. 251-256.

Otro modo más de obtener un conector adecuado es mediante la optimización de un conector simple, p. ej. (Gly_{4}Ser)_{n}, por medio de mutagénesis al azar.Another way to get a suitable connector is by optimizing a simple connector, e.g. ex. (Gly 4 Ser) n, by means of random mutagenesis.

Como se ha mencionado antes, generalmente se prefiere que el conector peptídico posea al menos cierta flexibilidad. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el conector peptídico contiene 1-25 residuos de glicina, 5-20 residuos de glicina, 5-15 residuos de glicina o 8-12 residuos de glicina. El péptido conector contendrá típicamente al menos 50% de residuos de glicina, por ejemplo al menos 75% de residuos de glicina. El conector peptídico puede comprender solamente residuos de glicina.As mentioned before, it usually prefers the peptide connector to have at least certain flexibility. Therefore, in some embodiments, the peptide connector contains 1-25 residues of glycine, 5-20 glycine residues, 5-15 glycine residues or 8-12 Wisteria residues The connecting peptide will typically contain the minus 50% glycine residues, for example at least 75% of Wisteria residues The peptide connector may comprise only glycine residues.

El conector peptídico puede, además de residuos de glicina, comprender otros residuos, en particular residuos seleccionados del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, en particular Ser. De este modo, un ejemplo de un conector peptídico específico incluye un conector peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos Gly_{x}-Xaa-Gly_{y}-Xaa-Gly_{z}, donde cada Xaa se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp y Glu, y donde cada uno de x, y y z son números enteros en el intervalo de 1-5. En algunas realizaciones, cada Xaa se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, en particular Ser. Más concretamente, el conector peptídico tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly, donde cada Xaa se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp y Glu. Como se describe en la presente memoria, cada Xaa se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, en particular Ser.The peptide connector can, in addition to waste of glycine, including other waste, in particular waste selected from the group consisting of Ser, Ala and Thr, in particular Ser. Thus, an example of a peptide connector specific includes a peptide connector that has the sequence of amino acids Gly_ {x} -Xaa-Gly_ {y} -Xaa-Gly_ {z},  where each Xaa is independently selected from the group that It consists of Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp and Glu, and where each of x, y and z are integers in the range of 1-5. In some embodiments, each Xaa is independently selected. of the group consisting of Ser, Ala and Thr, in particular Ser. More specifically, the peptide connector has the sequence of amino acids Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly, where each Xaa is independently selected from the group that It consists of Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp and Glu. As described in this memory, each Xaa can be selected regardless of the group consisting of Ser, Ala and Thr, in particular being.

En algunos casos puede ser deseable o necesario proporcionar cierta rigidez al conector peptídico. Esto se puede completar incluyendo residuos de prolina en la secuencia de aminoácidos del conector peptídico. De este modo, el conector peptídico puede comprender al menos un residuo de prolina en la secuencia de aminoácidos del conector peptídico. Por ejemplo, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos, donde al menos 25%, por ejemplo al menos 50%, p. ej. al menos 75%, de los residuos de aminoácido son residuos de prolina. Como se describe en la presente memoria, el conector peptídico comprende solamente residuos de prolina.In some cases it may be desirable or necessary. provide some rigidity to the peptide connector. This can be complete including proline residues in the sequence of amino acids of the peptide linker. In this way, the connector peptide may comprise at least one proline residue in the amino acid sequence of the peptide linker. For example, him peptide connector has an amino acid sequence, where at minus 25%, for example at least 50%, e.g. ex. at least 75% of the amino acid residues are proline residues. As described in herein, the peptide connector comprises only proline residues

Asimismo se describen en la presente memoria conectores peptídicos modificados de tal manera que se introduce un residuo de aminoácido que comprende un grupo de anclaje para un radical no polipeptídico. Los ejemplos de tal residuo de aminoácido pueden ser un residuo de cisteína (al cual se ancla con posterioridad el radical no polipeptídico) o la secuencia de aminoácidos puede incluir un sitio de N-glicosilación in vivo (anclando de ese modo un radical azúcar (in vivo) al conector peptídico).Also described herein are modified peptide connectors such that an amino acid residue comprising an anchor group for a non-polypeptide radical is introduced. Examples of such an amino acid residue may be a cysteine residue (to which the non-polypeptide radical is subsequently anchored) or the amino acid sequence may include an in vivo N-glycosylation site (thereby anchoring a sugar radical ( in live ) to the peptide connector).

El conector peptídico puede comprender al menos un residuo de cisteína, tal como un residuo de cisteína. De este modo, en algunas realizaciones de la invención el conector peptídico comprende residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Gly, Ser, Ala, Thr y Cys. Semejante conector peptídico puede comprender solamente un residuo de cisteína.The peptide connector may comprise at least a cysteine residue, such as a cysteine residue. Of this mode, in some embodiments of the invention the peptide connector comprises amino acid residues selected from the group that It consists of Gly, Ser, Ala, Thr and Cys. Such a peptide connector It may comprise only one cysteine residue.

El conector peptídico descrito en la presente memoria puede comprender residuos de glicina y residuos de cisteína, por ejemplo solamente residuos de glicina y residuos de cisteína. Típicamente, se puede incluir sólo un residuo de cisteína por conector peptídico. De este modo, un ejemplo de un conector peptídico específico que comprende un residuo de cisteína, incluye un conector peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos Gly_{n}-Cys-Gly_{m}, donde n y m son cada uno números enteros de 1-12, p. ej., de 3-9, de 4-8, o de 4-7. Más concretamente, el conector peptídico puede tener la secuencia de aminoácidos GGGGG-C-GGGGG.The peptide connector described herein memory may comprise glycine residues and cysteine residues,  for example only glycine residues and cysteine residues. Typically, only one cysteine residue can be included per peptide connector. Thus, an example of a connector specific peptide comprising a cysteine residue, includes a peptide connector that has the amino acid sequence Gly_ {n} -Cys-Gly_ {m}, where n and m are each whole numbers of 1-12, p. eg of 3-9, 4-8, or 4-7. More specifically, the peptide connector can have the amino acid sequence GGGGG-C-GGGGG.

Este enfoque (esto es la introducción de un residuo de aminoácido que comprende un grupo de anclaje para un radical no polipeptídico) también se puede utilizar para los conectores que contienen prolina más rígida. Por consiguiente, el conector peptídico puede comprender residuos de prolina y cisteína, tal como residuos de prolina y cisteína solamente. Un ejemplo de un conector peptídico que contiene prolina específico que comprende un residuo de cisteína, incluye un conector peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos Pro_{n}-Cys-Pro_{m}, donde n y m son cada uno números enteros de 1-12, preferiblemente de 3-9, por ejemplo de 4-8 o de 4-7. Más concretamente, el conector peptídico puede tener la secuencia de aminoácidos PPPPP-C-PPPPP.This approach (this is the introduction of a amino acid residue comprising an anchor group for a non-polypeptide radical) can also be used for connectors that contain more rigid proline. Therefore, the peptide connector may comprise proline and cysteine residues, such as proline and cysteine residues only. An example of a peptide connector containing specific proline comprising a cysteine residue, includes a peptide linker that has the amino acid sequence Pro_ {n} -Cys-Pro_ {m}, where n and m are each whole numbers of 1-12, preferably 3-9, for example of 4-8 or 4-7. More specifically, the peptide connector can have the amino acid sequence PPPPP-C-PPPPP.

El propósito de introducir un residuo de aminoácido, tal como un residuo de cisteína, que comprende un grupo de anclaje para un radical no polipéptido es anclar con posterioridad un radical no polipeptídico a dicho residuo. Por ejemplo, los radicales no polipeptídicos pueden mejorar la vida media en suero del multímero polipeptídico. De este modo, el residuo de cisteína se puede anclar covalentemente a un radical no polipeptídico. Los ejemplos preferidos de los radicales no polipeptídios incluyen moléculas poliméricas, tales como PEG o mPEG, en particular mPEG así como agentes terapéuticos no polipeptídicos.The purpose of introducing a residue of amino acid, such as a cysteine residue, comprising a group anchor for a non-polypeptide radical is to anchor with subsequently a non-polypeptide radical to said residue. By For example, non-polypeptide radicals can improve life serum average of the polypeptide multimer. In this way, the cysteine residue can be covalently anchored to a non radical polypeptide Preferred examples of radicals do not polypeptides include polymeric molecules, such as PEG or mPEG, in particular mPEG as well as non-therapeutic agents polypeptide

El experto reconocerá que se pueden utilizar otros residuos de aminoácido distintos de cisteína para anclar un no polipéptido al conector peptídico. Un ejemplo concreto de tales otros residuos incluye el acoplamiento del radical no polipeptídico a un residuo de lisina.The expert will recognize that they can be used amino acid residues other than cysteine to anchor a no polypeptide to the peptide linker. A concrete example of such Other residues include coupling of the non-polypeptide radical to a lysine residue.

Otra posibilidad de introducir un grupo de anclaje específico del sitio para un radical no polipeptídico en el conector peptídico es la introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo, tal como un sitio de N-glicosilación in vivo, en el conector peptídico. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de N-glicosilación in vivo en un conector peptídico que comprende residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Gly, Ser, Ala y Thr. Se entenderá que con el fin de asegurar que, en efecto, se ha anclado un radical azúcar a dicho sitio de N-glicosilación in vivo, la secuencia de nucleótidos que codifica el multímero polipeptídico debe ser insertada en un anfitrión de expresión eucariótico, glicosilante.Another possibility of introducing a site-specific anchor group for a non-polypeptide radical in the peptide linker is the introduction of an in vivo N-glycosylation site, such as an in vivo N-glycosylation site, into the peptide linker. For example, an N-glycosylation site can be introduced in vivo into a peptide linker comprising amino acid residues selected from the group consisting of Gly, Ser, Ala and Thr. It will be understood that in order to ensure that, in effect, a sugar radical has been anchored to said N-glycosylation site in vivo , the nucleotide sequence encoding the polypeptide multimer must be inserted into a host of eukaryotic, glycosylating expression.

Un ejemplo específico de un conector peptídico que comprende un sitio de N-glicosilación in vivo es un conector peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos Gly_{n}-Asn-Xaa-Ser/Thr-Gly_{m}, preferiblemente Gly_{n}-Asn-Xaa-Thr-Gly_{m}, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, y donde n y m son cada uno números enteros de 1-8, preferiblemente en el intervalo de 2-5.A specific example of a peptide linker comprising an in vivo N-glycosylation site is a peptide linker having the amino acid sequence Gly_n -Asn-Xaa-Ser / Thr-Gly_ {m}, preferably Gly_ {n} -Asn-Xaa-Thr-Gly_m, where Xaa is any amino acid residue except proline, and where n and m are each whole numbers of 1-8, preferably in the range of 2-5.

A menudo, las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en el multímero polipeptídico serán idénticas. Sin embargo, en ciertos conectores las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en el multímero polipeptídico pueden ser diferentes. Se cree que esto último es particularmente relevante en caso de que el multímero polipeptídico sea un trímero o tetrámero polipeptídico y concretamente en casos en los que un residuo de aminoácido que comprende un grupo de anclaje para un radical no polipeptídico está incluido en el conector peptídico.Often, everyone's amino acid sequences the peptide connectors present in the polypeptide multimer They will be identical. However, in certain connectors the sequences of amino acids from all peptide connectors present in the Multimer polypeptide may be different. It is believed that this last is particularly relevant in case the multimer polypeptide is a trimer or polypeptide tetramer and specifically in cases where an amino acid residue that comprises an anchor group for a non-polypeptide radical is included in the peptide connector.

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Bastante a menudo, será deseable o necesario anclar solamente unos pocos, típicamente solo uno, radicales no polipeptídicos/radical (por ejemplo mPEG, un radical azúcar o un agente terapéutico no polipeptídico) al multímero polipeptídico con el fin de lograr el efecto deseado, tal como una vida media en suero prolongada. Evidentemente, en el caso de un trímero polipeptídico, que contendrá dos conectores peptídicos, solamente se requiere modificar un conector peptídico, p. ej. mediante la introducción de un residuo de cisteína, mientras la modificación del otro conector peptídico típicamente no será necesaria. En este caso todos (ambos) conectores peptídicos del multímero polipeptídico (trímero) son diferentes.Quite often, it will be desirable or necessary anchor only a few, typically only one, radicals not polypeptide / radical (for example mPEG, a sugar radical or a non-polypeptide therapeutic agent) to the polypeptide multimer with in order to achieve the desired effect, such as a serum half-life prolonged Obviously, in the case of a polypeptide trimer, which will contain two peptide connectors, only required modify a peptide connector, e.g. ex. by introducing a cysteine residue, while modifying the other connector Peptide will typically not be necessary. In this case all (both) Peptide connectors of the polypeptide multimer (trimer) are different.

Por consiguiente, como se describe en la presente memoria, las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en el multímero polipeptídico son idénticas excepto por uno, dos o tres conectores peptídicos, por ejemplo excepto por uno o dos conectores peptídicos, en particular excepto por un conector peptídico, que tiene/tienen una secuencia de aminoácidos que comprende un residuo de aminoácido que comprende un grupo de anclaje para un radical no polipeptídico. Los ejemplos preferidos de tales residuos de aminoácido incluyen residuos de cisteína de sitios de N-glicosilación in vivo.Accordingly, as described herein, the amino acid sequences of all the peptide connectors present in the polypeptide multimer are identical except for one, two or three peptide connectors, for example except for one or two peptide connectors, in particular except by a peptide linker, which has / has an amino acid sequence comprising an amino acid residue comprising an anchor group for a non-polypeptide radical. Preferred examples of such amino acid residues include cysteine residues of N-glycosylation sites in vivo .

Un conector puede ser una secuencia conectora nativa o sintética. Un conector nativo ilustrativo incluye, p. ej., la secuencia entre la última cisteína de un primer dominio A de receptor de LDL y la primera cisteína de un segundo dominio A de receptor de LDL y puede ser utilizado como secuencia conectora. El análisis de diferentes conexiones de dominios A revela que los conectores nativos oscilan de al menos 3 aminoácidos a menos de 20 aminoácidos, p. ej., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 aminoácidos de longitud. No obstante, los expertos en la técnica reconocerán que se pueden utilizar secuencias conectoras más largas o más cortas. Una secuencia conectora del dominio A ilustrativa se representa en la Figura 8. El conector es un hexámero con la siguiente secuencia A_{1}A_{2}A_{3}A_{4}A_{5}A_{6}, donde A_{1} se selecciona entre los aminoácidos A, P, T, Q, E y K; A_{2} y A_{3} son cualquier aminoácido excepto C, F, Y, W, o M; A_{4} se selecciona entre los aminoácidos S, G y R; A_{5} se selecciona entre los aminoácidos H, P, y R; y A_{6} es el aminoácido T.A connector can be a connecting sequence native or synthetic An illustrative native connector includes, e.g. eg the sequence between the last cysteine of a first domain A of LDL receptor and the first cysteine of a second A domain of LDL receptor and can be used as a connecting sequence. He analysis of different domains connections A reveals that native connectors range from at least 3 amino acids to less than 20 amino acids, e.g. e.g., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 amino acids in length. However, experts in the technique will recognize that more connecting sequences can be used Long or shorter. A connecting sequence of domain A Illustrative is represented in Figure 8. The connector is a hexamer with the following sequence A_ {1} A_ {2} A_ {3} A_ {4} A_ {5} A_ {6}, where A_ {1} is select among amino acids A, P, T, Q, E and K; A_ {2} and A 3 are any amino acid except C, F, Y, W, or M; A_ {4} is selected from amino acids S, G and R; A_ {5} is selected between amino acids H, P, and R; and A 6 is the amino acid T.

Los métodos para generar multímeros a partir de dominios monoméricos pueden incluir unir los dominios seleccionados con al menos un conector para generar al menos un multímero, p. ej., el multímero puede comprender al menos dos de los dominios monoméricos y el conector. El multímero o los multímeros son escrutados después en busca de una mejora de la avidez y la afinidad o una alteración de la especificidad para el ligando o la mezcla de ligandos deseados en comparación con los dominios monoméricos seleccionados.The methods to generate multimers from monomeric domains may include joining the selected domains with at least one connector to generate at least one multimer, e.g. eg the multimer can comprise at least two of the domains monomeric and the connector. The multimer or the multimers are scrutinized later in search of an avidity improvement and affinity or an alteration of the specificity for the ligand or the mixture of desired ligands compared to domains selected monomers.

En otros métodos descritos en la presente memoria, los dominios multiméricos seleccionados se unen con al menos un conector para generar al menos dos multímeros, donde los dos multímeros comprenden dos o más de los dominios monoméricos seleccionados y el conector. Los dos o más multímeros son escrutados en busca de una mejora en la avidez o afinidad o una alteración de la especificidad para el ligando o la mezcla de ligandos deseados en comparación con los dominios monoméricos seleccionados, Las composiciones de dos o más multímeros producidas mediante el método anterior también se describen en la presente memoria.In other methods described herein memory, the selected multimeric domains join with the least one connector to generate at least two multimers, where two multimers comprise two or more of the monomer domains selected and the connector. The two or more multimers are screened in search of an improvement in greediness or affinity or an alteration of specificity for the ligand or mixture of desired ligands compared to the selected monomer domains, the compositions of two or more multimers produced by the method The above are also described herein.

Típicamente, los multímeros de la presente invención son un único polipéptido discreto. Los multímeros de radicales de conector parcial-domino-conector parcial están asociados con múltiples polipéptidos, correspondiendo cada uno a un radical de conector parcial-dominio-conector parcial.Typically, the multimers of the present Invention are a single discrete polypeptide. The multimers of connector radicals partial-domino-partial connector are associated with multiple polypeptides, corresponding each one to one connector radical partial-domain-connector partial.

En algunos polipéptidos descritos en la presente memoria, el multímero seleccionado comprende más de dos dominios. Tales multímeros pueden ser generados por etapas, p. ej., donde la adición de cada nuevo dominio es sometida a ensayo individualmente y el efecto de los dominios es sometido a ensayo de una manera secuencial. Véase, p. ej., la Figura 6. En otros polipéptidos descritos en la presente memoria, los dominios están conectados para formar multímeros que comprenden más de dos dominios y seleccionados por su unión sin conocimiento previo de cómo se unen multímeros más pequeños, o alternativamente, cómo se une cada dominio.In some polypeptides described herein, the selected multimer comprises more than two domains. Such multimers can be generated in stages, e.g. eg, where the addition of each new domain is tested individually and the effect of the domains is tested sequentially. See, p. ex. , Figure 6. In other polypeptides described herein, the domains are connected to form multimers comprising more than two domains and selected for binding without prior knowledge of how smaller multimers bind, or alternatively, how each binds domain.

Los métodos descritos en la presente memoria también incluyen métodos de desarrollo de multímeros. Los métodos pueden comprender, p. ej., cualquiera de, o todas las siguientes etapas: proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, donde cada ácido nucleico codifica un dominio monomérico; traducir la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, lo que proporciona una pluralidad de dominios monoméricos diferentes; escrutar la pluralidad de dominios monoméricos diferentes en busca de la unión del ligando o mezcla de ligandos deseados; identificar miembros de la pluralidad de dominios monoméricos diferentes que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados, lo que proporciona dominios monoméricos seleccionados; unir los dominios monoméricos seleccionados con al menos un conector para generar al menos un multímero, donde el al menos un multímero comprende al menos dos de los dominios monoméricos seleccionados y al menos un conector; y, escrutar el al menos un multímero en busca de una mejora de la afinidad o avidez o una alteración de la especificidad para el para el ligando o la mezcla de ligandos deseados en comparación con los dominios monoméricos seleccionados.The methods described herein They also include multimer development methods. Methods can understand, e.g. eg, any of, or all of the following steps: provide a plurality of different nucleic acids, where each nucleic acid encodes a monomeric domain; translate the plurality of different nucleic acids, which provides a plurality of different monomer domains; scrutinize the plurality of different monomer domains in search of union of the ligand or mixture of desired ligands; identify members of the plurality of different monomer domains that bind to the ligand or mixture of desired ligands, which provides domains selected monomers; join the monomer domains selected with at least one connector to generate at least one multimer, where the at least one multimer comprises at least two of the selected monomer domains and at least one connector; Y, scrutinize the at least one multimer in search of an improvement of the affinity or greediness or an alteration of specificity for the ligand or mixture of desired ligands compared to those selected monomer domains.

Se puede introducir una variación adicional insertando conectores de diferente longitud y composición entre los dominios. Esto permite la selección de conectores óptimos entre dominios. En algunos métodos descritos en la presente memoria la longitud y composición óptimas de los conectores permitirá una unión óptima de los dominios. En algunos métodos descritos en la presente memoria los dominios con afinidades de unión concretas se conectan por medio de diferentes conectores y se seleccionan los conectores óptimos en un análisis de unión. Por ejemplo, se seleccionan los dominios por las propiedades de unión deseadas y después se constituye una biblioteca que comprende una variedad de conectores. La biblioteca puede ser escrutada después para identificar los conectores óptimos. Alternativamente, se pueden formar bibliotecas de multímeros en las que el efecto del dominio o el conector sobre la unión a la molécula diana no es conocido.An additional variation can be introduced inserting connectors of different length and composition between the domains This allows the selection of optimal connectors between domains In some methods described herein the optimal length and composition of the connectors will allow a union Optimal domains. In some methods described herein memory domains with specific binding affinities connect through different connectors and the connectors are selected optimal in a binding analysis. For example, the domains by the desired binding properties and then it It constitutes a library comprising a variety of connectors. The library can then be scrutinized to identify the optimal connectors Alternatively, libraries can be formed of multimers in which the effect of the domain or connector on binding to the target molecule is not known.

Los métodos descritos en la presente memoria también incluyen generar uno o más multímeros seleccionados proporcionando una pluralidad de dominios monoméricos. La pluralidad de dominios monoméricos se escruta en busca de la unión de un ligando o mezcla de ligandos deseados. Los miembros de la pluralidad de dominios que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados se identifican, proporcionando de ese modo dominios con una afinidad deseada. Los dominios identificados se unen con al menos un conector para generar los multímeros, donde cada multímero comprende al menos dos de los dominios seleccionados y al menos un conector; y, los multímeros se escrutan en busca de una mejora de la afinidad o avidez o una alteración de la especificidad para el ligando o la mezcla de ligandos deseados en comparación con los dominios seleccionados, identificando de ese modo los uno o más multímeros seleccionados.The methods described herein also include generating one or more selected multimers providing a plurality of monomer domains. The plurality of monomeric domains is scrutinized for union of a ligand or mixture of desired ligands. The members of the plurality of domains that bind the ligand or mixture of ligands desired are identified, thereby providing domains with a desired affinity Identified domains join with at least a connector to generate the multimers, where each multimer It comprises at least two of the selected domains and at least one connector; and, multimers are screened for an improvement in affinity or greediness or an alteration of specificity for the ligand or the mixture of desired ligands compared to those selected domains, thereby identifying the one or more selected multimers.

La selección de multímeros se puede completar utilizando una variedad de técnicas que incluyen aquellas mencionadas más arriba para identificar los dominios monoméricos. Otros métodos de selección incluyen, p. ej., una selección basada en una mejora de la afinidad o avidez o una alteración de la especificidad para el ligando en comparación con los dominios monoméricos seleccionados. Por ejemplo, una selección se puede basar en la unión selectiva a tipos específicos de células, o a un grupo de células relacionadas o tipos de proteínas (p. ej., diferentes serotipos de virus). La optimización de la propiedad seleccionada para, p. ej., la avidez de un ligando, se puede lograr después recombinando los dominios, así como también manipulando la secuencia de aminoácidos de los dominios monoméricos individuales o el dominio conector o la secuencia de nucleótidos que codifica tales dominios, como se menciona en la presente invención.The multimer selection can be completed using a variety of techniques that include those mentioned above to identify monomer domains. Other selection methods include, e.g. eg, a selection based in an improvement of affinity or greediness or an alteration of the specificity for the ligand compared to domains selected monomers. For example, a selection can be based in selective binding to specific cell types, or to a group of related cells or types of proteins (e.g., different virus serotypes). Optimization of the selected property to P. eg, the greed of a ligand, can be achieved later recombining the domains, as well as manipulating the sequence of amino acids from the individual monomer domains or the connector domain or the nucleotide sequence encoding such domains, as mentioned in the present invention.

Un método para identificar multímeros se puede completar presentando los multímeros. Como con los dominios monoméricos, los multímeros son opcionalmente expresados o presentados sobre una variedad de sistemas de presentación, p. ej., presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación unida a nucleótidos (véanse, p. ej., las Patentes de los estados Unidos Núms. 6.281.344; 6.194.550, 6.207.446, 6.214.553, y 6.258.558) y/o la presentación en la superficie celular, como se ha descrito antes. Las presentaciones en la superficie celular pueden incluir pero no están limitadas a células de E. coli, levadura o mamífero. Además, las genotecas de presentación de multímeros con múltiples sitios de unión pueden ser inmunopurificadas en busca de avidez o afinidad o especificidad alterada para un ligando o para múltiples ligandos.A method to identify multimers can be completed by presenting the multimers. As with monomeric domains, multimers are optionally expressed or presented on a variety of presentation systems, e.g. eg, phage display, presentation in ribosomes, nucleotide-linked presentation (see , e.g., United States Patents Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, and 6,258. 558) and / or presentation on the cell surface, as described above. Presentations on the cell surface may include but are not limited to E. coli, yeast or mammalian cells. In addition, multimer presentation libraries with multiple binding sites may be immunopurified for avidity or affinity or specificity altered for one ligand or for multiple ligands.

Otras variaciones incluyen el uso de múltiples compuestos de unión, de manera que los dominios monoméricos, multímeros o bibliotecas de estas moléculas pueden ser escrutados simultáneamente en busca de una multiplicidad de ligandos o compuestos que tienen diferente especificidad de unión. Se pueden escrutar concomitantemente múltiples ligandos o compuestos predeterminados en una sola biblioteca, o escrutar secuencialmente frente a numerosos dominios monoméricos o multímeros. En una variación, múltiples ligandos o compuestos, cada uno codificado en una cuenta separada (o subgrupo de cuentas), pueden ser mezclados e incubados con dominios monoméricos, multímeros o bibliotecas de estas moléculas en condiciones de unión adecuadas. La colección de cuentas, que comprenden múltiples ligandos o compuestos, puede ser utilizada después para aislar, mediante selección por afinidad, los dominios monoméricos, los multímeros seleccionados o miembros de la biblioteca. Generalmente, las rondas de escrutinio por afinidad posteriores pueden incluir la misma mezcla de cuentas, subgrupos de las mismas, o cuentas que contienen solamente uno o dos ligandos o compuestos individuales. Este enfoque permite un escrutinio eficaz, y es compatible con la automatización en el laboratorio, el procesamiento por lotes, y los métodos de escrutinio de alto
rendimiento.Other variations include the use of multiple binding compounds, so that the monomeric, multimeric or library domains of these molecules can be screened simultaneously for a multiplicity of ligands or compounds that have different binding specificity. Multiple predetermined ligands or compounds can be concomitantly screened in a single library, or sequentially screened against numerous monomeric or multimeric domains. In a variation, multiple ligands or compounds, each encoded in a separate account (or subgroup of accounts), can be mixed and incubated with monomeric, multimeric or library domains of these molecules under suitable binding conditions. The collection of accounts, comprising multiple ligands or compounds, can then be used to isolate, by affinity selection, the monomeric domains, the selected multimers or library members. Generally, subsequent affinity screening rounds may include the same mixture of accounts, subgroups thereof, or accounts containing only one or two individual ligands or compounds. This approach allows for effective scrutiny, and is compatible with laboratory automation, batch processing, and high scrutiny methods.
performance.

Como se describe en la presente memoria, los multímeros pueden ser escrutados simultáneamente en busca de su capacidad para unirse a múltiples ligandos, donde cada ligando comprende una marca diferente. Por ejemplo, cada ligando puede ser marcado con una marca fluorescente diferente, puesto en contacto simultáneamente con un multímero o biblioteca de multímeros. Los multímeros con la afinidad deseada son identificados después (p. ej., mediante clasificación FACS) basándose en la presencia de marcas conectadas a las marcas deseadas.As described herein, the multimers can be screened simultaneously for their ability to join multiple ligands, where each ligand It comprises a different brand. For example, each ligand can be marked with a different fluorescent brand, contacted simultaneously with a multimer or multimer library. The Multimers with the desired affinity are identified later (e.g. e.g., by FACS classification) based on the presence of marks connected to the desired marks.

Los multímeros seleccionados de los métodos anteriores pueden ser manipulados adicionalmente, p. ej., mediante recombinación o barajado de los multímeros seleccionados (se puede producir recombinación entre o con multímeros o ambos), mutación de los multímeros seleccionados, y similares. Esto da como resultado multímeros alterados que pueden ser escrutados y seleccionados en busca de miembros que tienen una propiedad mejorada en comparación con el multímero seleccionado, produciendo de ese modo multímeros alterados seleccionados.The selected multimers of the methods above can be further manipulated, e.g. eg, by recombination or shuffling of the selected multimers (you can produce recombination between or with multimers or both), mutation of the selected multimers, and the like. This is the result altered multimers that can be screened and selected in looking for members who have improved property compared with the multimer selected, thereby producing multimers altered selected.

Los conectores, multímeros o multímeros seleccionados producidos mediante los métodos anteriores y siguientes se describen en la presente memoria. Se proporcionan las bibliotecas que comprenden multímeros, p. ej., una biblioteca que comprende aproximadamente 100, 250, 500 o más miembros producidos mediante los métodos de la presente invención o seleccionados mediante los métodos de la presente invención. Como se describe en la presente memoria, también están incluidas una o más células que comprenden miembros de las bibliotecas. Las bibliotecas de los polipéptidos recombinantes también se describen en la presente memoria p. ej., una biblioteca que comprende aproximadamente 100, 250, 500 o más polipéptidos recombinantes diferentes.The connectors, multimers or multimers selected produced by the above methods and The following are described herein. The libraries comprising multimers, e.g. eg, a library that It comprises approximately 100, 250, 500 or more members produced by the methods of the present invention or selected by the methods of the present invention. As described in This report also includes one or more cells that They include members of the libraries. The libraries of Recombinant polypeptides are also described herein. memory p. eg, a library comprising approximately 100, 250, 500 or more different recombinant polypeptides.

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Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden unir a una matriz de un material de afinidad, p. ej., los polipéptidos recombinantes. Los ejemplos del material de afinidad incluyen, p. ej., cuentas, una columna, un soporte sólido, y/o similares.The compositions described herein memory can be attached to a matrix of an affinity material, e.g. eg, recombinant polypeptides. The material examples of affinity include, e.g. eg, beads, a column, a solid support, and / or similar.

Los conectores adecuados descritos en la presente memoria incluyen un heterodímero obligado de radicales conectores parciales. El término "heterodímero obligado" hace referencia en la presente memoria a un dímero de dos radicales conectores parciales que difieren entre sí en su composición, y que se asocian entre sí de una manera no covalente, específica para unir entre sí dos dominios. La asociación específica es tal que los dos conectores parciales se asocian esencialmente entre sí en comparación con la asociación con otros conectores parciales. De este modo, en contraste con los multímeros de la presente invención que están expresados como un único polipéptido, los multímeros de dominios que están conectados por medio de heterodímeros se ensamblan a partir de unidades discretas de conector parcial-monómero-conector parcial. El ensamblaje de los heterodímeros se puede lograr, por ejemplo, mediante mezclado. De este modo, si los conectores parciales son segmentos polipeptídicos, cada unidad de conector parcial-monómero-conector parcial puede ser expresada en forma de un péptido discreto antes del ensamblaje del multímero. Se puede añadir un enlace disulfuro para bloquear covalentemente los péptidos juntos siguiendo el emparejamiento no covalente correcto. En la Figura 12 se representa un multímero que contiene tales heterodímeros obligados. Los radicales conectores parciales que son apropiados para formar heterodímeros obligados incluyen, por ejemplo, polinucleótidos, polipéptidos, y similares. Por ejemplo, cuando el conector parcial es un polipéptido, se producen los dominios de unión individualmente junto con su péptido de conexión único (esto es, un conector parcial) y más tarde se combinan para formar multímeros. El orden espacial de los dominios de unión en el multímero está regido por la especificidad de la unión heterodimérica de cada conector parcial. Los conectores parciales pueden contener secuencias de aminoácidos terminales que se unen específicamente a una secuencia de aminoácidos heteróloga definida. Un ejemplo de semejante secuencia de aminoácidos es el activador de la cabeza del neuropéptido de Hydra como describen Bodenmuller et al. El activador de la cabeza del neuropéptido pierde su actividad biológica mediante dimerización, (1986) EMBO J 5(8):1825-1829. Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.491.074 y el documento WO 94/28173. Estos conectores parciales permiten que se produzca el multímero primero como unidades conectoras parciales del monómero o unidades de conector parcial-monómero-conector parcial que después se mezclan entre sí y se permite que se ensamblen en el orden ideal basándose en las especificidades de unión de cada conector parcial.Suitable connectors described herein include a bound heterodimer of partial linker radicals. The term "bound heterodimer" refers herein to a dimer of two partial linker radicals that differ from each other in their composition, and that are associated with each other in a non-covalent manner, specific to join two domains together. The specific association is such that the two partial connectors are essentially associated with each other compared to the association with other partial connectors. Thus, in contrast to the multimers of the present invention that are expressed as a single polypeptide, domain multimers that are connected by means of heterodimers are assembled from discrete units of partial-monomer-partial-connector. The assembly of the heterodimers can be achieved, for example, by mixing. Thus, if the partial connectors are polypeptide segments, each partial-monomer-partial connector unit can be expressed in the form of a discrete peptide prior to the assembly of the multimer. A disulfide bond can be added to covalently block the peptides together following the correct non-covalent pairing. A multimer containing such bound heterodimers is depicted in Figure 12. Partial linker radicals that are suitable for forming bound heterodimers include, for example, polynucleotides, polypeptides, and the like. For example, when the partial linker is a polypeptide, the binding domains are produced individually together with their single linker peptide (that is, a partial linker) and later combined to form multimers. The spatial order of the binding domains in the multimer is governed by the specificity of the heterodimeric binding of each partial linker. Partial connectors may contain terminal amino acid sequences that specifically bind to a defined heterologous amino acid sequence. An example of such an amino acid sequence is the activator of the head of the Hydra neuropeptide as described by Bodenmuller et al . The activator of the neuropeptide head loses its biological activity by dimerization, (1986) EMBO J 5 (8): 1825-1829. See , p. ex. , United States Patent No. 5,491,074 and WO 94/28173. These partial connectors allow the multimer to be produced first as partial monomer connector units or partial-monomer-partial connector connector units that are then mixed together and allowed to assemble in the ideal order based on the binding specificities of each partial connector

Cuando el conector parcial comprende un motivo de unión al ADN, cada dominio monomérico tiene un conector parcial aguas arriba y uno aguas abajo (esto es, Lp-dominio-Lp, donde "Lp" es una representación de un conector parcial) que contiene una proteína de unión al ADN con una especificidad de unión al ADN específicamente única. Estos dominios pueden ser producidos individualmente y después ensamblados en un multímero específico mezclando los dominios con fragmentos de ADN que contienen las secuencias de nucleótidos apropiadas (esto es, los sitios de reconocimiento específico para las proteínas de unión al ADN de los conectores parciales de los dos dominios deseados) con el fin de unir los dominios en el orden deseado. Adicionalmente, se pueden ensamblar los mismos dominios en muchos multímeros diferentes mediante la adición de secuencias de ADN que contienen diferentes combinaciones de sitios de reconocimiento de proteínas de unión al ADN. La aleatorización adicional de las combinaciones de los sitios de reconocimiento de las proteínas de unión al ADN en los fragmentos de ADN puede permitir el ensamblaje de bibliotecas de multímeros. El ADN puede ser sintetizado con análogos de esqueleto para evitar la degradación in vivo.When the partial connector comprises a DNA binding motif, each monomeric domain has a partial connector upstream and one downstream (that is, Lp-domain-Lp, where "Lp" is a representation of a partial connector) that contains a DNA binding protein with a specifically unique DNA binding specificity. These domains can be produced individually and then assembled into a specific multimer by mixing the domains with DNA fragments that contain the appropriate nucleotide sequences (that is, the specific recognition sites for the DNA-binding proteins of the partial connectors of the two desired domains) in order to join the domains in the desired order. Additionally, the same domains can be assembled into many different multimers by adding DNA sequences that contain different combinations of DNA binding protein recognition sites. Additional randomization of combinations of DNA binding protein recognition sites in DNA fragments may allow assembly of multimer libraries. The DNA can be synthesized with skeleton analogs to prevent degradation in vivo .

Una ventaja significativa de la presente invención es que se pueden utilizar ligandos conocidos, o ligandos desconocidos para seleccionar los dominios monoméricos y/o multímeros. No se requiere una información previa referente a la estructura del ligando para aislar los dominios monoméricos de interés o los multímeros de interés. Los dominios monoméricos identificados pueden tener actividad biológica, lo que significa que incluyen al menos una afinidad de unión específica para un ligando seleccionado o deseado, y, en algunos casos, incluirá adicionalmente la capacidad de bloquear la unión de otros compuestos, para estimular o inhibir las rutas metabólicas, para actuar como señal o mensajero, para estimular o inhibir la actividad celular, y similares.A significant advantage of this invention is that known ligands, or ligands can be used unknown to select monomer domains and / or multimers No prior information is required regarding the ligand structure to isolate the monomeric domains of interest or interest multimers. The monomeric domains identified may have biological activity, which means that include at least one specific binding affinity for a ligand selected or desired, and, in some cases, will include additionally the ability to block the union of others compounds, to stimulate or inhibit metabolic pathways, to act as a signal or messenger, to stimulate or inhibit activity cell phone, and the like.

Se puede utilizar un único ligando, u opcionalmente una variedad de ligandos para seleccionar los dominios monoméricos, y/o multímeros. Un dominio monomérico de la presente invención se puede unir a un único ligando o a una variedad de ligandos. Un multímero de la presente invención puede tener múltiples sitios de unión discretos para un único ligando, u opcionalmente, puede tener múltiples sitios de unión para una variedad de ligandos.A single ligand can be used, or optionally a variety of ligands to select domains  monomeric, and / or multimers. A monomeric domain of the present invention can bind to a single ligand or a variety of ligands A multimer of the present invention may have multiple discrete binding sites for a single ligand, or optionally, it can have multiple binding sites for one variety of ligands.

Las aplicaciones potenciales de los multímeros de la presente invención son diversas. Por ejemplo, la invención se puede utilizar en la aplicación para crear antagonistas, donde los dominios monoméricos seleccionados o multímeros bloquean la interacción entre dos proteínas. Opcionalmente, la invención puede generar agonistas. Por ejemplo, los multímeros que se unen a dos proteínas diferentes, p. ej., enzima y sustrato, pueden intensificar la función de la proteína, incluyendo, por ejemplo, la actividad enzimática y/o la conversión del sustrato.The potential applications of multimers of the present invention are diverse. For example, the invention is you can use in the application to create antagonists, where selected monomeric domains or multimers block the Interaction between two proteins. Optionally, the invention can generate agonists. For example, multimers that join two different proteins, e.g. e.g. enzyme and substrate, can intensify  protein function, including, for example, activity Enzymatic and / or substrate conversion.

Otras aplicaciones incluyen el direccionamiento celular. Por ejemplo, los multímeros que consisten en dominios monoméricos y/o inmuno-dominios que reconocen proteínas de la superficie celular específicas se pueden unir selectivamente a ciertos tipos celulares. Las aplicaciones que implican dominios monoméricos y/o inmuno-dominios como agentes antivirales también están incluidas. Por ejemplo, los multímeros que se unen a diferentes epítopos sobre la partícula del virus pueden ser útiles como agentes antivirales debido a la polivalencia. Otras aplicaciones pueden incluir, pero no están limitadas a, purificación de proteínas, detección de proteínas, biosensores, experimentos de captura por afinidad de ligandos y similares. Además, se pueden sintetizar dominios o multímeros en masa mediante métodos convencionales para cualquier uso adecuado, p. ej., como agente terapéutico o de diagnóstico.Other applications include addressing mobile. For example, multimers consisting of domains monomeric and / or immuno-domains that recognize specific cell surface proteins can bind selectively to certain cell types. The applications that involve monomeric domains and / or immuno-domains As antiviral agents are also included. For example, the multimers that bind to different epitopes on the particle of the Viruses may be useful as antiviral agents due to the polyvalence. Other applications may include, but are not limited to, protein purification, protein detection, biosensors, ligand affinity capture experiments and Similar. In addition, domains or multimers can be synthesized in mass by conventional methods for any suitable use, e.g. eg, as a therapeutic or diagnostic agent.

Como se describe en la presente memoria, el multímero comprende dominios monoméricos con especificidades para diferentes proteínas. Las diferentes proteínas pueden estar relacionadas o no relacionadas. Los ejemplos de las proteínas relacionadas incluyen miembros de una familia de proteínas o diferentes serotipos de un virus. Alternativamente, los dominios monoméricos y/o inmuno-dominios de un multímero pueden dirigir diferentes moléculas de una ruta fisiológica (p. ej., diferentes proteínas de la coagulación de la sangre). Como se describe adicionalmente en la presente memoria, los dominio monoméricos y/o inmuno-dominios se unen a proteínas en rutas no relacionadas (p. ej., dos dominios se unen a factores de la sangre, otros dos dominios se unen a proteínas relacionadas con la inflamación y un quinto se une a la albúmina del suero).As described herein, the multimer comprises monomer domains with specificities for Different proteins The different proteins can be related or unrelated. Examples of proteins related include members of a family of proteins or Different serotypes of a virus. Alternatively, the domains monomeric and / or immuno-domains of a multimer they can direct different molecules of a physiological path (e.g. eg, different blood clotting proteins). How I know further described herein, the domain monomeric and / or immuno-domains bind to proteins on unrelated routes (e.g., two domains join factors of blood, two other domains bind to related proteins with inflammation and a fifth binds to serum albumin).

3. Método de Tratamiento Terapéutico y Profiláctico - Incluido Solamente como Referencia3. Therapeutic and Prophylactic Treatment Method - Included for reference only

La presente patente también describe métodos de tratamiento terapéutico y profiláctico de una enfermedad o trastorno mediante la administración in vivo o ex vivo de uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención descritos antes (o composiciones que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y uno o más de tales ácidos nucleicos o polipéptidos) a un sujeto, incluyendo, p. ej., un mamífero, incluyendo un ser humano, primate, ratón, cerdo, vaca, cabra, conejo, rata, cobaya, hámster, caballo, oveja; o un vertebrado no mamífero tal como un ave (p. ej., un pollo o un pato), pez, o invertebrado.The present patent also describes methods of therapeutic and prophylactic treatment of a disease or disorder by in vivo or ex vivo administration of one or more nucleic acids or polypeptides of the invention described above (or compositions comprising a pharmaceutically acceptable excipient and one or more of such nucleic acids or polypeptides) to a subject, including, e.g. ex. , a mammal, including a human being, primate, mouse, pig, cow, goat, rabbit, rat, guinea pig, hamster, horse, sheep; or a non-mammalian vertebrate such as a bird ( eg , a chicken or a duck), fish, or invertebrate.

En métodos ex vivo, se obtienen una o más células o una población de células de interés del sujeto (p. ej., células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células de la sangre, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestinos, bazo, estómago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) o se separan del sujeto y se ponen en contacto con una cantidad de un dominio monomérico y/o multímero seleccionado de la invención que es eficaz en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad, trastorno, u otra afección. Las células puestas en contacto se devuelven o liberan después al sujeto en el sitio del cual se obtuvieron u otro sitio (p. ej., incluyendo aquellos definidos antes) de interés en el sujeto que se vaya a tratar. Si se desea, las células puestas en contacto se pueden injertar en un tejido, órgano, o sitio de un sistema (incluyendo todos los descritos antes) de interés en el sujeto utilizando técnicas de injerto convencionales y bien conocidas o, p. ej., liberar en el sistema sanguíneo o linfático utilizando técnicas de liberación o transfusión convencionales.In ex vivo methods, one or more cells or a population of cells of interest to the subject are obtained ( eg , tumor cells, tumor tissue sample, organ cells, blood cells, skin cells, lung, heart, muscle, brain, mucosa, liver, intestines, spleen, stomach, lymphatic system, cervix, vagina, prostate, mouth, tongue, etc. ) or separate from the subject and come into contact with a quantity of a monomeric domain and / or selected multimer of the invention that is effective in the prophylactic or therapeutic treatment of a disease, disorder, or other condition. The cells placed in contact are then returned or released to the subject at the site from which they were obtained or another site ( eg , including those defined above) of interest in the subject to be treated. If desired, the cells contacted can be grafted into a tissue, organ, or site of a system (including all those described above) of interest in the subject using conventional and well-known grafting techniques or, e.g. ex. , release into the blood or lymphatic system using conventional release or transfusion techniques.

Se describen en la presente memoria métodos in vivo en los cuales se ponen en contacto una o más células o una población de células de interés del sujeto directamente o indirectamente con una cantidad de un dominio monomérico y/o multímero seleccionado de la invención eficaz en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad, trastorno, u otra afección. en formatos de contacto/administración directos, el dominio monomérico y/o multímero seleccionado se administran típicamente o se transfieren directamente a las células a tratar o al sitio del tejido de interés (p. ej., células tumorales, muestras de tejido tumoral, células de órganos, células de la sangre, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosas, hígado, intestinos, bazo, estómago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata; boca, lengua, etc.) mediante cualquiera de una variedad de formatos, incluyendo administración tópica, inyección (p. ej., utilizando una aguja o jeringa), o vacuna o liberación con pistola génica, presionando en el tejido, órgano, o sitio de la piel. El dominio monomérico y/o multímero seleccionados pueden ser liberados, por ejemplo, intramuscularmente, intradérmicamente, subdérmicamente, subcutáneamente, oralmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intravenosamente, o colocados en una cavidad del organismo (incluyendo, p. ej., durante la cirugía), o mediante inhalación o administración vaginal o rectal. In vivo methods are described herein in which one or more cells or a population of cells of interest of the subject are contacted directly or indirectly with an amount of a selected monomer and / or multimer domain of the invention effective in the prophylactic or therapeutic treatment of the disease, disorder, or other condition. in direct contact / administration formats, the selected monomeric and / or multimer domain is typically administered or transferred directly to the cells to be treated or to the site of the tissue of interest ( e.g. , tumor cells, tumor tissue samples, cells of organs, blood cells, skin cells, lung, heart, muscle, brain, mucous membranes, liver, intestines, spleen, stomach, lymphatic system, cervix, vagina, prostate; mouth, tongue, etc. ) through any of a variety of formats, including topical administration, injection ( eg , using a needle or syringe), or vaccine or gene gun release, pressing on the tissue, organ, or site of the skin. The selected monomeric and / or multimer domain can be released, for example, intramuscularly, intradermally, subdermally, subcutaneously, orally, intraperitoneally, intrathecally, intravenously, or placed in a body cavity (including, e.g. , during surgery) , or by inhalation or vaginal or rectal administration.

En los formatos de contacto/administración indirectos in vivo, el dominio monomérico y/o multímero seleccionado se administra típicamente o se transfiere indirectamente a las células a tratar o al tejido de interés, incluyendo los descritos antes (tales como, p. ej., células de la piel, sistemas de órganos, sistema linfático, o sistema de células sanguíneas, etc.), poniendo en contacto o administrando el polipéptido de la invención directamente a una o más células o poblaciones de células cuya tratamiento se puede facilitar. Por ejemplo, células tumorales del organismo del sujeto que se vaya a tratar poniendo en contacto las células del sistema sanguíneo o linfático, piel, o un órgano con una cantidad suficiente del dominio monomérico y/o multímero seleccionado de manera que se produzca el reparto del dominio monomérico y/o multímero seleccionado al sitio de interés (p. ej., tejido, órgano, o células de interés de o sistema sanguíneo o linfático en el organismo) y de como resultado el tratamiento profiláctico o terapéutico efectivo. Semejante contacto, administración, o transferencia se realizan típicamente utilizando una o más rutas o modos de administración descritos.In indirect in vivo contact / administration formats, the selected monomer and / or multimer domain is typically administered or indirectly transferred to the cells to be treated or to the tissue of interest, including those described above (such as, e.g., skin cells, organ systems, lymphatic system, or blood cell system, etc. ), by contacting or administering the polypeptide of the invention directly to one or more cells or cell populations whose treatment can be facilitated. For example, tumor cells of the organism of the subject to be treated by contacting the cells of the blood or lymphatic system, skin, or an organ with a sufficient amount of the selected monomer and / or multimer domain so that the distribution of the monomeric and / or multimeric domain selected to the site of interest ( e.g. , tissue, organ, or cells of interest of or blood or lymphatic system in the organism) and as a result the effective prophylactic or therapeutic treatment. Such contact, administration, or transfer are typically performed using one or more routes or modes of administration described.

Adicionalmente se describen en la presente memoria métodos ex vivo en los cuales se obtienen o se separan una o más células de interés o una población de células de interés del sujeto (p. ej., células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosas, hígado, intestinos, bazo, estómago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) del sujeto y se transforman poniendo en contacto dichas una o más células o población de células con un constructo polinucleotídico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido biológicamente activo de interés (p. ej., un dominio monomérico y/o multímero seleccionado) que es eficaz en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad, trastorno, u otra afección. Las una o más células o poblaciones de células se ponen en contacto con una cantidad suficiente del constructo polinucleotídico y un promotor que controla la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico de manera que se produzca la absorción del constructo polinucleotídico (y el promotor) en las células y de como resultado una expresión suficiente de la secuencia de ácido nucleico diana para producir una cantidad del polipéptido biológicamente activo, codificando un dominio monomérico y/o multímero seleccionados, eficaz para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno, o afección. El constructo polinucleotídico puede incluir una secuencia promotora (p. ej., una secuencia promotora de CMV) que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico de la invención y/o, si se desea, una o más secuencias de nucleótidos adicionales que codifican al menos uno o más de otro polipéptido de la invención, una citoquina, coadyuvante, o molécula co-estimuladora, u otro polipéptido de interés.Additionally, ex vivo methods are described herein in which one or more cells of interest or a population of cells of interest to the subject are obtained or separated ( eg , tumor cells, tumor tissue sample, organ cells , blood cells, skin cells, lung, heart, muscle, brain, mucous membranes, liver, intestines, spleen, stomach, lymphatic system, cervix, vagina, prostate, mouth, tongue, etc. ) of the subject and transform by putting said one or more cells or cell population contacting with a polynucleotide construct comprising a nucleic acid sequence of the invention encoding a biologically active polypeptide of interest ( eg , a selected monomeric and / or multimer domain) that is effective in the prophylactic or therapeutic treatment of the disease, disorder, or other condition. The one or more cells or cell populations are contacted with a sufficient amount of the polynucleotide construct and a promoter that controls the expression of said nucleic acid sequence so that absorption of the polynucleotide construct (and the promoter) occurs in the cells and as a result sufficient expression of the target nucleic acid sequence to produce an amount of the biologically active polypeptide, encoding a selected monomeric and / or multimeric domain, effective to prophylactically or therapeutically treat the disease, disorder, or condition. The polynucleotide construct may include a promoter sequence ( e.g. , a CMV promoter sequence) that controls the expression of the nucleic acid sequence of the invention and / or, if desired, one or more additional nucleotide sequences encoding at least one or more of another polypeptide of the invention, a cytokine, adjuvant, or co-stimulatory molecule, or other polypeptide of interest.

Después de la transfección, las células transformadas se devuelven, liberan, o transfieren al sujeto, al sitio del tejido o sistema del cual fueron obtenidas o a otro sitio (p. ej., células tumorales, muestra de tejido tumoral, células de órganos, células de la sangre, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosas, hígado, intestinos, bazo, estómago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) que se van a tratar en el sujeto. Si se desea, las células pueden ser injertadas sobre un tejido, piel, órgano, o sistema corporal de interés en el sujeto utilizando técnicas de injerto convencionales o bien conocidas o liberadas en el sistema sanguíneo o linfático utilizando técnicas de liberación o transfusión convencionales. Semejante reparto, administración, o transferencia de células transformadas se realiza típicamente utilizando una o más de las rutas o modos de administración descritos antes. La expresión del ácido nucleico diana se produce naturalmente o puede ser inducida (como se describe con mayor detalle más abajo) y se expresa una cantidad del polipéptido codificado suficiente y eficaz para tratar la enfermedad o afección en el sitio o sistema de tejidos.After transfection, the transformed cells are returned, released, or transferred to the subject, to the site of the tissue or system from which they were obtained or to another site ( e.g. , tumor cells, tumor tissue sample, organ cells, cells of the blood, skin cells, lung, heart, muscle, brain, mucous membranes, liver, intestines, spleen, stomach, lymphatic system, cervix, vagina, prostate, mouth, tongue, etc. ) to be treated in the subject. If desired, the cells can be grafted onto a tissue, skin, organ, or body system of interest in the subject using conventional grafting techniques or well known or released into the blood or lymphatic system using conventional release or transfusion techniques. Such distribution, administration, or transfer of transformed cells is typically performed using one or more of the routes or modes of administration described above. Expression of the target nucleic acid occurs naturally or can be induced (as described in more detail below) and an amount of the encoded polypeptide sufficient and effective to treat the disease or condition at the tissue site or system is expressed.

Asimismo se describen en la presente memoria métodos in vivo en los cuales una o más células de interés o una población de células del sujeto (p. ej., incluyendo aquellas células y sistemas de células y sujetos descritos antes) son transformadas en el organismo del sujeto poniendo en contacto las células o población de células con (o administrando o transfiriendo a las células o población de células que utilizan una o más de las rutas o modos de administración descritos antes) un constructo polinucleotídico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido biológicamente activo de interés (p. ej., un dominio monomérico y/o multímero seleccionado) que es eficaz en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad, trastorno, u otra afección.Also described herein are in vivo methods in which one or more cells of interest or a population of subject cells ( eg , including those cells and cell systems and subjects described above) are transformed into the organism of the subject by contacting cells or population of cells with (or administering or transferring to cells or population of cells using one or more of the routes or modes of administration described above) a polynucleotide construct comprising a nucleic acid sequence of the invention encoding a biologically active polypeptide of interest ( e.g. , a selected monomeric and / or multimer domain) that is effective in the prophylactic or therapeutic treatment of the disease, disorder, or other condition.

El constructo polinucleotídico puede ser administrado o transferido directamente a células que padecen una enfermedad o trastorno (p. ej., mediante contacto directo utilizando una o más de las rutas o modos de administración descritos antes). Alternativamente, el constructo polinucleotídico puede ser administrado o transferido indirectamente a células que padecen una enfermedad o trastorno poniendo en contacto primero directamente las células no enfermas o células con otra enfermedad utilizando una o más de las rutas o modos de administración descritos antes con una cantidad suficiente del constructo polinucleotídico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido biológicamente activo, y un promotor que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico, de manera que se produzca la absorción del constructo polinucleotídico (y el promotor) en las células y de como resultado una expresión suficiente de la secuencia de ácido nucleico de la invención para producir una cantidad del polipéptido biológicamente activo eficaz para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad o trastorno, y por medio de lo cual el constructo polinucleotídico o el polipéptido expresado resultante es transferido naturalmente o automáticamente desde el sitio, sistema, tejido u órgano del organismo del sujeto de liberación inicial al organismo del sujeto al sitio, órgano o sistema del organismo del sujeto enfermos (p. ej., a través del sistema sanguíneo o linfático). La expresión del ácido nucleico diana se produce naturalmente o puede ser inducido (como se describe con mayor detalle más abajo) de manera que una cantidad del polipéptido expresado sea suficiente y eficaz para tratar la enfermedad o afección en el sitio o sistema tisular. El constructo polinucleotídico puede incluir una secuencia promotora (p. ej., una secuencia promotora de CMV) que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico y/o, si se desea, una o más secuencias de nucleótidos adicionales que codifican al menos uno o más de los otros polipéptidos de la invención, una citoquina, un coadyuvante, o una molécula co-estimuladora, u otro polipéptido de interés.The polynucleotide construct can be administered or transferred directly to cells suffering from a disease or disorder ( e.g. , by direct contact using one or more of the routes or modes of administration described above). Alternatively, the polynucleotide construct can be administered or indirectly transferred to cells suffering from a disease or disorder by first directly contacting the non-diseased cells or cells with another disease using one or more of the routes or modes of administration described above with a sufficient amount. of the polynucleotide construct comprising the nucleic acid sequence encoding the biologically active polypeptide, and a promoter that controls the expression of the nucleic acid sequence, so that absorption of the polynucleotide construct (and the promoter) occurs in the cells and as a result, sufficient expression of the nucleic acid sequence of the invention to produce an amount of the biologically active polypeptide effective to prophylactically or therapeutically treat the disease or disorder, and whereby the polynucleotide construct or the express polypeptide The resulting do is naturally or automatically transferred from the site, system, tissue or organ of the organism of the subject of initial release to the organism of the subject to the site, organ or system of the organism of the diseased subject ( e.g. ex. , through the blood or lymphatic system). Expression of the target nucleic acid occurs naturally or can be induced (as described in more detail below) so that an amount of the expressed polypeptide is sufficient and effective to treat the disease or condition at the tissue site or system. The polynucleotide construct may include a promoter sequence ( eg , a CMV promoter sequence) that controls the expression of the nucleic acid sequence and / or, if desired, one or more additional nucleotide sequences encoding at least one or more of the other polypeptides of the invention, a cytokine, an adjuvant, or a co-stimulatory molecule, or other polypeptide of interest.

En cada uno de los métodos de tratamiento in vivo y ex vivo descritos antes, se puede administrar o liberar una composición que comprende un excipiente y el polipéptido o ácido nucleico de la invención. Asimismo se describe en la presente memoria, una composición que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o ácido nucleico que puede ser administrada o liberada al sujeto como se ha descrito antes en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno.In each of the in vivo and ex vivo treatment methods described above, a composition comprising an excipient and the polypeptide or nucleic acid of the invention can be administered or released. Also described herein is a composition comprising a pharmaceutically acceptable excipient and a polypeptide or nucleic acid that can be administered or released to the subject as described above in an amount effective to treat the disease or disorder.

Como se describe adicionalmente en la presente memoria, en cada método de tratamiento in vivo y ex vivo descrito antes, la cantidad de polinucleótido administrado a las células o al sujeto puede ser una cantidad tal que se produzca la absorción de dicho polinucleótido en una o más células del sujeto y de como resultado una expresión suficiente de dicha secuencia de ácido nucleico para producir una cantidad de un polipéptido biológicamente activo eficaz para intensificar una respuesta inmunitaria en un sujeto, incluyendo una respuesta inmunitaria inducida por un inmunógeno (p. ej., un antígeno). Para cada uno de tales métodos, la cantidad de polipéptido administrado a las células o al sujeto puede ser una cantidad suficiente para intensificar una respuesta inmunitaria en el sujeto, incluyendo la inducida por un inmunógeno (p. ej., un antígeno).As further described herein, in each in vivo and ex vivo treatment method described above, the amount of polynucleotide administered to the cells or the subject may be an amount such that absorption of said polynucleotide occurs in one or more subject cells and as a result sufficient expression of said nucleic acid sequence to produce an amount of a biologically active polypeptide effective to intensify an immune response in a subject, including an immune response induced by an immunogen ( e.g. , a antigen). For each such method, the amount of polypeptide administered to the cells or to the subject may be an amount sufficient to intensify an immune response in the subject, including that induced by an immunogen ( eg , an antigen).

Adicionalmente se describe en la presente memoria un método de tratamiento in vivo o in vivo en el cual se utiliza un constructo polinucleotídico (o una composición que comprende un constructo polinucleotídico) para liberar un polipéptido fisiológicamente activo en un sujeto. La expresión del constructo polinucleotídico puede ser inducida utilizando un sistema de expresión génica inducible de conexión y desconexión. Los ejemplos de tales sistemas de expresión génica de conexión y desconexión incluyen el Sistema de Expresión Génica Tet-On® y el Sistema de Expresión Génica Tet-Off® (véase, p. ej., Catálogo Clontech 2000, págs. 110-111 para una descripción detallada de cada uno de tales sistemas), respectivamente. Otros sistemas de expresión génica de conexión y desconexión controlables o inducibles son conocidos por los expertos normales en la técnica. Con semejante sistema, la expresión del ácido nucleico del constructo polinucleotídico puede ser regulada de una manera precisa, reversible, y cuantitativa. La expresión génica del ácido nucleico diana puede ser inducida, por ejemplo, una vez que las células transfectadas estables que contienen el constructo polinucleotídico que comprende el ácido nucleico diana son liberadas o transferidas o puestas en contacto con el sitio del tejido, órgano o sistema de interés. Tales sistemas son particularmente ventajosos en los métodos de tratamiento y formatos en los cuales es beneficioso retrasar o controlar precisamente la expresión del ácido nucleico diana (p. ej., para dar tiempo para completar una operación quirúrgica y/o curación después de la cirugía; para dar tiempo para que el constructo polinucleotídico que comprende el ácido nucleico diana alcance el sitio, las células, o el tejido que se vaya a tratar; para dar tiempo para que el injerto que contiene las células transformadas con el constructo se incorporen al tejido u órgano sobre el que, o en el que ha sido empalmado o anclado, etc.).Additionally, an in vivo or in vivo treatment method in which a polynucleotide construct (or a composition comprising a polynucleotide construct) is used herein to release a physiologically active polypeptide in a subject. The expression of the polynucleotide construct can be induced using an inducible connection and disconnection gene expression system. Examples of such connection and disconnection gene expression systems include the Tet-On® Gene Expression System and the Tet-Off® Gene Expression System (see , e.g., Clontech 2000 Catalog, pp. 110-111 for a detailed description of each such system), respectively. Other controllable and inducible connection and disconnection gene expression systems are known to those of ordinary skill in the art. With such a system, the expression of the polynucleotide construct nucleic acid can be regulated in a precise, reversible, and quantitative manner. Gene expression of the target nucleic acid can be induced, for example, once stable transfected cells containing the polynucleotide construct comprising the target nucleic acid are released or transferred or brought into contact with the site of the tissue, organ or system of interest. Such systems are particularly advantageous in the treatment methods and formats in which it is beneficial to delay or precisely control the expression of the target nucleic acid ( eg , to allow time to complete a surgical operation and / or cure after surgery; to allow time for the polynucleotide construct comprising the target nucleic acid to reach the site, cells, or tissue to be treated; to allow time for the graft containing the cells transformed with the construct to be incorporated into the tissue or organ on which, or in which it has been spliced or anchored, etc.).

4. Manipulación Adicional de Dominios Monoméricos y/o Ácidos Nucleicos Multiméricos y Polipéptidos - Descrita en la Presente Memoria Solamente como Referencia4. Additional Manipulation of Monomeric Domains and / or Multimeric Nucleic Acids and Polypeptides - Described in Present Memory For Reference Only

Como se ha mencionado antes, el polipéptido de la presente invención puede ser alterado. Las descripciones de una variedad de procedimientos diversos que generan procedimientos para generar secuencias de ácido nucleico modificadas o alteradas que codifican estos polipéptidos se describen más arriba y más abajo en las siguientes publicaciones y en las referencias allí citadas: Soong, N. et al., Molecular breeding of viruses, (2000) Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al., Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties, (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness et al., DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin, (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang et al, Evolution of a cytokine using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull y Stemmer, Protein evolution by molecular breeding, (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians et al., Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, (1998) Nature 391:288-291; Crameri et al., Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, (1997) Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang et al., Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al., Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines, (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al, Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling, (1996) Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al., Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, (1996) Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al., Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer', (1996) Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer, Sexual PCR and Assembly PCR, (1996) In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nueva York. págs.447-457; Crameri y Stemmer, Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al., Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleótidos, (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, The Evolution of Molecular Computation, (1995) Science 270: 1510; Stemmer. Searching Sequence Space, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, (1994) Nature 370:389-391; y Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.As mentioned before, the polypeptide of the present invention can be altered. Descriptions of a variety of diverse procedures that generate procedures for generating modified or altered nucleic acid sequences encoding these polypeptides are described above and below in the following publications and in the references cited therein: Soong, N. et al ., Molecular breeding of viruses, (2000) Nat Genet 25 (4): 436-439; Stemmer, et al ., Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties, (1999) Tumor Targeting 4: 1-4; Ness et al ., DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin, (1999) Nature Biotechnology 17: 893-896; Chang et al , Evolution of a cytokine using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17: 793-797; Minshull and Stemmer, Protein evolution by molecular breeding, (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3: 284-290; Christians et al ., Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17: 259-264; Crameri et al ., DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, (1998) Nature 391: 288-291; Crameri et al ., Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, (1997) Nature Biotechnology 15: 436-438; Zhang et al ., Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Patten et al ., Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines, (1997) Current Opinion in Biotechnology 8: 724-733; Crameri et al , Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling, (1996) Nature Medicine 2: 100-103; Crameri et al ., Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, (1996) Nature Biotechnology 14: 315-319; Gates et al ., Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer', (1996) Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer, Sexual PCR and Assembly PCR, (1996) In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp. 447-457; Crameri and Stemmer, Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes, (1995) BioTechniques 18: 194-195; Stemmer et al ., Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides, (1995) Gene, 164: 49-53; Stemmer, The Evolution of Molecular Computation, (1995) Science 270: 1510; Stemmer Searching Sequence Space, (1995) Bio / Technology 13: 549-553; Stemmer, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, (1994) Nature 370: 389-391; and Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.

Los métodos mutacionales de generación de diversidad incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, (1997) Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, (1996) Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith, In vitro mutagenesis, (1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, Site-directed mutagenesis, (1986) Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, (1987) in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)); la mutagénesis utilizando moldes que contienen uracilo (Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1987) Methods in Enzymol. 154, 367-382; and Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, (1988) Science 242:240-245); la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos ((1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500; (1987) Methods in Enzymol. 154: 329-350; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, (1983) Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller & Smith, Oligonucleótido-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, (1987) Methods in Enzymol. 154:329-350); la mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, (1988) Nucl. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814); la mutagénesis utilizando ADN dúplex con espacios (Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz Oligonucleótido-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, (1987) Methods in Enzymol. 154:350-367; Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).Mutational methods of generating diversity include, for example, site-directed mutagenesis (Ling et al ., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, (1997) Anal Biochem. 254 (2): 157-178; Dale et al . , Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, (1996) Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith, In vitro mutagenesis, (1985) Ann. Rev. Genet. 19: 423-462; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, (1985) Science 229: 1193-1201; Carter, Site-directed mutagenesis, (1986) Biochem. J. 237: 1-7; and Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, (1987 ) in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, DMJ eds., Springer Verlag, Berlin)); Mutagenesis using uracil containing molds (Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al ., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1987) Methods in Enzymol. 154, 367-382; and Bass et al ., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, (1988) Science 242: 240-245); oligonucleotide-directed mutagenesis ((1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500; (1987) Methods in Enzymol. 154: 329-350; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, (1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500; and Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, (1987) Methods in Enzymol. 154: 329-350); phosphotothioate modified DNA mutagenesis (Taylor et al ., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al ., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al ., YT Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 791-802; and Sayers et al ., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagenesis using duplex DNA with spaces (Kramer et al ., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, (1987) Methods in Enzymol. 154: 350-367; Kramer et al ., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7207; and Fritz et al ., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro , (1988) Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

Los métodos adecuados adicionales incluyen la reparación puntual de los emparejamientos erróneos (Kramer et al., Point Mismatch Repair, (1984) Cell 38:879-887), la mutagénesis utilizando cepas anfitrionas con una reparación deficiente (Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; y Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, (1987) Methods in Enzymol. 154: 382-403), la mutagénesis por deleción (Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5115), la selección mediante restricción y la purificación mediante restricción (Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), la mutagénesis mediante síntesis génica total (Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, (1984) Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), (1988) Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, (1985) Gene 34:315-323; y Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), la reparación por rotura de la dobre hebra (Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181; y Arnold, Protein engineering for unusual environments, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para subsanar problemas con diferentes métodos de mutagénesis.Additional suitable methods include timely repair of mismatches (Kramer et al ., Point Mismatch Repair, (1984) Cell 38: 879-887), mutagenesis using host strains with poor repair (Carter et al ., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, (1987) Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagenesis by deletion (Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction selection and restriction purification (Wells et al ., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagenesis by total gene synthesis (Nambiar et al ., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S pro tein, (1984) Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transduction), (1988) Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al ., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, (1985) Gene 34: 315-323; and Grundström et al ., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), repair by breaking the double strand (Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli : a method for site-specific mutagenesis, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181; and Arnold, Protein engineering for unusual environments, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455). Additional details on many of the above methods can be found in Methods in Enzymology Volume 154, which also describes useful controls for correcting problems with different mutagenesis methods.

Los detalles adicionales referentes a los métodos de generación de diversidad se pueden encontrar en las siguientes patentes de los Estados Unidos, publicaciones PCT y solicitudes, y publicaciones EPO: Patente de los Estados Unidos Núm. 5.605.793 de Stemmer (25 Febrero, 1997), "Methods for In Vitro Recombination"; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.811.238 de Stemmer et al. (22 Septiembre, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.830.721 de Stemmer et al. (3 Noviembre, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.834.252 de Stemmer, et al. (10 Noviembre, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.837.458 de Minshull, et al. (7 Noviembre, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; Documento WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Documento WO 96/33207 de Stemmer yd Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; Documento WO 97/20078 de Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Documento WO 97/35966 mediante Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; Documento WO 99/41402 de Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; Documento WO 99/41383 de Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"; Documento WO 99/41369 de Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"; Documento WO 99/41368 de Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; Documento EP 752008 de Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Documento EP 0932670 de Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; Documento WO 99/23107 de Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; Documento WO 99/21979 de Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"; Documento WO 98/31837 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; Documento WO 98/27230 de Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; Documento WO 98/27230 de Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection", Documento WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries", Documento WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences", Documento WO 98/42832 de Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers", Documento WO 99/29902 de Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", Documento WO 98/41653 de Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library", Documento WO 98/41622 de Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", y Documento WO 98/42727 de Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"; Documento WO 00/18906 de Patten et al., "Shuffling of Codon-Altered Genes"; Documento WO 00/04190 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination"; Documento WO 00/42561 de Crameri et al., "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"; Documento WO 00/42559 de Selifonov y Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations"; Documento WO 00/42560 de Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics"; Documento WO 01/23401 de Welch et al., "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling"; y Documento PCT/US01/06775 "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation" de Affholter.Additional details regarding diversity generation methods can be found in the following United States patents, PCT publications and applications, and EPO publications: United States Patent No. 5,605,793 to Stemmer (February 25, 1997) , "Methods for In Vitro Recombination"; U.S. Patent No. 5,811,238 to Stemmer et al . (September 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; U.S. Patent No. 5,830,721 to Stemmer et al . (November 3, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; U.S. Patent No. 5,834,252 to Stemmer, et al . (November 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; United States Patent No. 5,837,458 to Minshull, et al . (November 7, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 95/22625, Stemmer and Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; WO 96/33207 by Stemmer and Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; WO 97/20078 by Stemmer and Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; WO 97/35966 by Minshull and Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 99/41402 of Punnonen et al . "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; WO 99/41383 of Punnonen et al . "Antigen Library Immunization"; WO 99/41369 of Punnonen et al . "Genetic Vaccine Vector Engineering"; WO 99/41368 of Punnonen et al . "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; EP 752008 by Stemmer and Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; EP 0932670 from Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; WO 99/23107 by Stemmer et al ., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; WO 99/21979 of Apt et al ., "Human Papillomavirus Vectors"; Document WO 98/31837 of del Cardayre et al . "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; WO 98/27230 by Patten and Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; Document WO 98/27230 by Stemmer et al ., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection", Document WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries", Document WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences, "WO 98/42832 of Arnold et al .," Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers, "WO 99/29902 of Arnold et al .," Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences ", Document WO 98/41653 of Vind," An in Vitro Method for Construction of a DNA Library ", Document WO 98/41622 of Borchert et al .," Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling ", and WO 98/42727 of Pati and Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"; WO 00/18906 by Patten et al ., "Shuffling of Codon-Altered Genes"; Document WO 00/04190 of del Cardayre et al . "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination"; WO 00/42561 of Crameri et al ., "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"; WO 00/42559 by Selifonov and Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations"; WO 00/42560 from Selifonov et al ., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics"; WO 01/23401 by Welch et al ., "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling"; and Document PCT / US01 / 06775 "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation" by Affholter.

Otro aspecto descrito en la presente memoria incluye la clonación y expresión de dominios monoméricos, dominios monoméricos seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados que codifican ácidos nucleicos. De este modo, los dominios multiméricos pueden ser sintetizados como una única proteína utilizando sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Además de los muchos textos indicados arriba, los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares útiles en la presente memoria, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes para expresar ácidos nucleicos tales como dominios monoméricos, dominios monoméricos seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2^{a} Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado durante 1999) ("Ausubel")). Los ejemplos de las técnicas suficientes para dirigir a los expertos en la técnica a través de los métodos de amplificación in vitro, útiles en la identificación, el aislamiento y la clonación de dominios monoméricos y multímeros que codifican ácidos nucleicos, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con replicasa Q\exists; y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (p. ej., NASBA), se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullis et al., (1987) Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 Octubre, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Los métodos mejorados de clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados son descritos por Wallace et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.426.039. Los métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos grandes mediante PCR son resumidos por Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 y las referencias allí citadas, en los que se generan amplicones de PCR de hasta 40 kb. Un experto en la técnica apreciará que esencialmente cualquier ARN puede ser convertido en un ADN de doble hebra adecuado para la digestión con enzimas de restricción, la expansión por PCR y la secuenciación utilizando la transcriptasa inversa y una polimerasa. Véase, Ausubel, Sambrook y Berger, todas más arriba.Another aspect described herein includes the cloning and expression of monomer domains, selected monomer domains, selected multimers and / or multimers encoding nucleic acids. In this way, multimeric domains can be synthesized as a single protein using expression systems well known in the art. In addition to the many texts indicated above, the general texts describing molecular biological techniques useful herein, including the use of vectors, promoters and many other relevant topics to express nucleic acids such as monomeric domains, selected monomeric domains, multimers and / or selected multimers, include Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al ., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented during 1999) ("Ausubel")). Examples of sufficient techniques to direct those skilled in the art through in vitro amplification methods, useful in the identification, isolation and cloning of monomeric and multimeric domains encoding nucleic acids, including chain reaction of polymerase (PCR), ligase chain reaction (LCR), amplification with Q \ exists replicase; and other RNA polymerase mediated techniques ( eg , NASBA), are found in Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis et al ., (1987) United States Patent No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al . Eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al . (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173; Guatelli et al . (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al . (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al ., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al . (1990) Gene 89, 117, and Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564 Improved methods of in vitro cloning of amplified nucleic acids are described by Wallace et al ., U.S. Patent No. 5,426. 039. The improved methods of amplification of large nucleic acids by PCR are summarized by Cheng et al . (1994) Nature 369: 684-685 and the references cited therein, in which PCR amplicons of up to 40 kb are generated. in the art it will be appreciated that essentially any RNA can be converted into a double stranded DNA suitable for restriction enzyme digestion, PCR expansion and sequencing use do reverse transcriptase and a polymerase. See , Ausubel, Sambrook and Berger, all above .

Los vectores descritos en la presente memoria pueden ser introducidos en células anfitrionas, y los dominios monoméricos, los dominios monoméricos seleccionados, los multímeros y/o los multímeros seleccionados de la invención pueden ser producidos mediante mecanismos recombinantes. Las células anfitrionas son diseñadas genéticamente (esto es, transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores descritos en la presente memoria que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células anfitrionas diseñadas genéticamente pueden ser cultivadas en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar el gen o los genes del dominio monomérico, el dominio monomérico seleccionado, el multímero y/o el multímero seleccionado de interés. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquellas utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la técnica y en las referencias citadas en la presente memoria, incluyendo, p. ej., Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias allí citadas.The vectors described herein can be introduced into host cells, and domains monomeric, selected monomeric domains, multimers and / or the selected multimers of the invention can be produced by recombinant mechanisms. The cells Hostesses are genetically engineered (that is, transduced, transformed or transfected) with the vectors described in the present memory which can be, for example, a vector of cloning or an expression vector. The vector can be, by example, in the form of a plasmid, a viral particle, a phage, etc. Genetically designed host cells can be grown in conventional nutrient medium modified as appropriate to activate promoters, select transformants, or amplify the gene or the genes of the monomer domain, the domain selected monomer, the multimer and / or the selected multimer of interest. Cultivation conditions, such as temperature, pH and the like are those previously used with the cell hostess selected for the expression, and will be evident to those skilled in the art and in the references cited in the present report, including, e.g. eg Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and references there cited.

Como se describe en la presente memoria, los polipéptidos de la invención también pueden ser producidos en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. En efecto, como se ha indicado antes, la presentación en fagos es una técnica especialmente relevante para producir tales polipéptidos. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, se pueden encontrar detalles referentes al cultivo celular en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.As described herein, the polypeptides of the invention can also be produced in non-animal cells such as plants, yeasts, fungi, bacteria and the like. Indeed, as indicated above, phage display is an especially relevant technique for producing such polypeptides. In addition to Sambrook, Berger and Ausubel, details regarding cell culture can be found in Payne et al . (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

También se describe en la presente memoria la alteración de dominios monoméricos, y/o multímeros para mejorar las propiedades farmacológicas, para reducir la inmunogenicidad, o para facilitar el transporte del multímero y/o el dominio monomérico a una célula o tejido (p. ej., a través de la barrera hemato-encefálica, o a través de la piel). Estos tipos de alteraciones incluyen una variedad de modificaciones (p. ej., la adición de grupos azúcar o glicosilación), la adición de PEG, la adición de dominios de proteína que se unen a cierta proteína (p. ej., HAS u otra proteína del suero), la adición de fragmentos de proteínas o secuencias que señalan el movimiento o transporte en, fuera de y a través de una célula. También se pueden añadir componentes adicionales a un multímero y/o dominio monomérico para manipular las propiedades del multímero y/o dominio monomérico. También se puede añadir una variedad de componentes incluyendo, p. ej., un dominio que se une a un receptor conocido (p. ej., un dominio de una proteína de la región Fc que se une a un receptor de Fc), una o varias toxinas o una porción de una toxina, un prodominio que puede ser opcionalmente escindido para activar el multímero o dominio monomérico, una molécula informadora (p. ej., proteína fuorescente verde), un componente que se une a una molécula informadora (tal como un radionúclido para radioterapia, biotina o avidina) o un combinación de modificaciones.Also described herein is the alteration of monomeric domains, and / or multimers to improve pharmacological properties, to reduce immunogenicity, or to facilitate the transport of the multimer and / or the monomer domain to a cell or tissue (e.g., through the barrier blood-brain, or through the skin). These Types of alterations include a variety of modifications (e.g. e.g., the addition of sugar or glycosylation groups), the addition of PEG, the addition of protein domains that bind to certain protein (e.g., HAS or other whey protein), the addition of protein fragments or sequences that signal movement or transport in, out of and through a cell. Can also be add additional components to a multimer and / or domain monomeric to manipulate the properties of the multimer and / or domain monomeric You can also add a variety of components including, p. eg, a domain that binds to a known receptor (e.g., a domain of a protein from the Fc region that binds to a Fc receptor), one or more toxins or a portion of a toxin, a dominance that can be optionally split to activate the multimer or monomer domain, a reporter molecule (e.g., green fuorescent protein), a component that binds to a reporter molecule (such as a radionuclide for radiotherapy, biotin or avidin) or a combination of modifications.

5 Kits - Descritos en la presente memoria solamente como Referencia5 Kits - Described herein only as Reference

Los kits que comprenden los componentes necesarios en los métodos (típicamente en una forma no mezclada) y los componentes de los kits (materiales de envasado, instrucciones para utilizar los componentes y/o los métodos, uno o más recipientes (tubos de reacción, columnas, etc.)) para contener los componentes se describen en la presente memoria. Los kits pueden contener una biblioteca de multímeros, o un único tipo de multímero. Los kits también pueden incluir reactivos adecuados para promover la unión a la molécula diana, tales como tampones o reactivos que facilitan la detección, incluyendo moléculas marcadas detectablemente. Los patrones para la calibración de la unión del ligando a un dominio monomérico o similar, también pueden estar incluidos en los kits de la invención.The kits that comprise the components necessary in the methods (typically in an unmixed form) and kit components (packaging materials, instructions to use the components and / or methods, one or more containers (reaction tubes, columns, etc.)) to contain the Components are described herein. The kits can contain a multimer library, or a single type of multimer. The kits may also include suitable reagents to promote binding to the target molecule, such as buffers or reagents that facilitate detection, including labeled molecules detectably The standards for the calibration of the union of the linking to a monomeric or similar domain, they can also be included in the kits of the invention.

Asimismo se describen en la presente memoria análisis de unión comercialmente valiosos y kits para poner en práctica los análisis. En algunos de los análisis se emplean uno o más ligandos para detectar la unión de un dominio monomérico, y/o multímero. Tales análisis se basan en cualquier método conocido en la técnica, p. ej., citometría de flujo, microscopía fluorescente, resonancia de plasmón, y similares, para detectar la unión de uno o varios ligandos al dominio monomérico y/o multímero.They are also described herein. commercially valuable union analysis and kits to put in Practice the analysis. In some of the analyzes one or more ligands to detect the binding of a monomeric domain, and / or multimer. Such analyzes are based on any method known in the technique, p. eg, flow cytometry, fluorescent microscopy, plasmon resonance, and the like, to detect the binding of one or several ligands to the monomeric and / or multimer domain.

También se proporcionan los kits basados en el análisis. Los kits incluyen típicamente un recipiente, y uno o más ligandos. Los kits opcionalmente comprenden instrucciones para realizar los análisis, reactivos de detección adicionales, tampones, o instrucciones para el uso de cualquiera de estos componentes, o similares. Alternativamente, los kits pueden incluir células, vectores, (p. ej., vectores de expresión, vectores de secreción que comprenden un polipéptido de la invención), para la expresión de un dominio monomérico y/o un multímero de la invención.The kits based on the analysis. The kits typically include a container, and one or more ligands The kits optionally comprise instructions for perform the analyzes, additional detection reagents, buffers, or instructions for using any of these components, or the like. Alternatively, the kits may include cells, vectors, (eg, expression vectors, secretion comprising a polypeptide of the invention), for the expression of a monomeric domain and / or a multimer of the invention.

6. Sistemas Integrados - Descritos Solamente como Referencia6. Integrated Systems - Described Only as Reference

También se describen en la presente memoria ordenadores, medios legibles con ordenador y sistemas integrados que comprenden una serie de caracteres correspondientes a dominios monoméricos, dominios monoméricos seleccionados, multímeros y/o multímeros seleccionados y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos. Estas secuencias pueden ser manipuladas mediante métodos de barajado in silico, o mediante un soporte lógico de alineamiento de secuencias o procesamiento de texto convencional.Also described herein are computers, computer readable media and integrated systems comprising a series of characters corresponding to monomer domains, selected monomer domains, selected multimers and / or multimers and nucleic acids encoding such polypeptides. These sequences can be manipulated by in silico shuffling methods, or by means of a sequence alignment software or conventional text processing.

Por ejemplo, diferentes tipos de similitud y consideraciones de restricción variable y longitud de la serie de caracteres pueden ser detectados y reconocidos en los sistemas integrados en la presente memoria. Por ejemplo, se han diseñado muchos métodos de determinación de la homología para el análisis comparativo de secuencias de polímeros, para la corrección ortográfica en el procesamiento de textos, y para la recuperación de datos de diferentes bases de datos. Con una interpretación de las interacciones del complemento por pares de la doble hélice entre las 4 nucleobases principales en los polinucleótidos naturales, también se pueden utilizar modelos que simulan la hibridación de series de polinucleótidos homólogos complementarios como fundamento de un alineamiento de secuencias u otras operaciones realizadas típicamente sobre las series de caracteres correspondientes a las secuencias en la presente memoria (p. ej., manipulaciones del procesamiento de textos, construcción de figuras que comprenden series de caracteres de una secuencia o subsecuencia, tablas de rendimiento, etc.). Un ejemplo de un paquete de soporte lógico con GOs para calcular la similitud de secuencias es BLAST, que puede ser adaptado a la presente invención mediante aportación de series de caracteres correspondientes a las secuencias de la presente memoria.For example, different types of similarity and variable constraint considerations and series length of characters can be detected and recognized in the systems integrated in this report. For example, they have been designed many homology determination methods for analysis comparison of polymer sequences, for correction spelling in word processing, and for the recovery of data from different databases. With an interpretation of the complement interactions of the double helix in pairs the 4 main nucleobases in natural polynucleotides, You can also use models that simulate hybridization of series of complementary homologous polynucleotides as the basis of sequence alignment or other operations performed typically on the series of characters corresponding to the sequences herein (e.g., manipulations of the word processing, construction of figures that comprise character series of a sequence or sub-sequence, tables of performance, etc.). An example of a software package with GOs to calculate sequence similarity is BLAST, which can be adapted to the present invention by series contribution of characters corresponding to the sequences of the present memory.

BLAST es descrito por Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El soporte lógico para realizar análisis BLAST es asequible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (asequible en la Red Informática Mundial en ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de elevada puntuación (HSP en sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que emparejan o satisfacen cierta puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia de la base de datos. T es referdio como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP que las contengan. Los éxitos de las palabras se amplían después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. Las puntuaciones cumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de emparejamiento; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos de emparejamientos erróneos; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento cumulativo cae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).BLAST is described by Altschul et al ., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. The software to perform BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (available on the World Computer Network at ncbi.nlm.nih.gov). This algorithm involves first identifying high-score sequence pairs (HSP) by identifying short words of length W in the problem sequence, which match or satisfy a certain threshold score T with positive value when aligned with a word of the same length of a database sequence. T is referred to as the punctuation threshold of the neighboring word (Altschul et al., Supra ). These successes of the initial neighbor word act as seeds to initiate searches to find HSPs that contain them. The successes of the words are then expanded in both directions along each sequence as much as the cumulative alignment score can be increased. Cumulative scores are calculated using, for nucleotide sequences, the parameters M (reward score for a pair of pairing residues; always> 0) and N (penalty score for residues of mismatches; always <0). For amino acid sequences, a scoring matrix is used to calculate the cumulative score. The extent of word hits in each direction stops when: the cumulative alignment score falls by an amount X from its maximum value reached; the cumulative score tends to zero or less, due to the accumulation of one or more negative score residue alignments; or the end of any sequence is reached. The BLAST W, T, and X algorithm parameters determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) uses by default a word length (W) of 11, a hope (E) of 10, a cut of 100, M = 5, N = -4, and a comparison of both strands . For amino acid sequences, the BLASTP program uses by default a word length (W) of 3, a hope (E) of 10, and the BLOSUM62 score matrix (see Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).

Un ejemplo adicional de un algoritmo de alineamiento de secuencias útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos por pares, progresivos. También puede trazar un árbol que muestra las relaciones de agrupación utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear, p. ej., hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se puede alinear después con la siguiente secuencia o agrupación más relacionada de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias pueden ser alineadas mediante una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra mediante una serie de alineamientos por pares, progresivo. El programa también puede ser utilizado para trazar un dendrograma o representación en árbol de relaciones de agrupamientos. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de la secuencia. Por ejemplo, con el fin de determinar los aminoácidos conservados en una familia de dominios monoméricos o para comparar las secuencias de dominios monoméricos en una familia, la secuencia de la invención, o los ácidos nucleicos codificantes, se alinean para proporcionar información sobre la estructura-función.An additional example of an algorithm of Useful sequence alignment is PILEUP. PILEUP creates a alignment of multiple sequences from a group of related sequences using peer alignments, progressive You can also draw a tree that shows the grouping relationships used to create the alignment. PILEUP uses a simplification of the alignment method Progressive by Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol 35: 351-360. The method used is similar to the method described by Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5: 151-153. The program can align, e.g. eg up 300 sequences with a maximum length of 5,000 letters. He multiple alignment procedure begins with alignment in pairs of the two most similar sequences, producing a grouping of two aligned sequences. This grouping can be align later with the next sequence or more grouping related sequence aligned. Two sequence groupings can be aligned by a simple extension of the alignment in pairs of two individual sequences. The final alignment is achieved through a series of pairwise alignments, progressive. He program can also be used to draw a dendrogram or Tree representation of group relationships. The program it is executed designing specific sequences and their coordinates of amino acids or nucleotides for the comparison regions of the sequence. For example, in order to determine amino acids preserved in a family of monomeric domains or to compare the sequences of monomeric domains in a family, the sequence of the invention, or the coding nucleic acids, are aligned to provide information on the structure-function

En un aspecto descrito en la presente memoria se utiliza el sistema computarizado para realizar la recombinación de secuencia "in silico" o el barajado de las series de caracteres correspondientes a los dominios monoméricos. Una variedad de tales métodos se expone en "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" de Selifonov y Stemmer, presentado el 5 de Febrero, 1999 (USSN 60/118854) y "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" de Selifonov y Stemmer, presentada el 12 de Octubre, 1999 (USSN 09/416,375). En resumen, se utilizan operadores genéticos en algoritmos genéticos para cambiar secuencias dadas, p. ej., imitando eventos genéticos tales como la mutación, recombinación, muerte y similares. El análisis multi-dimensional para optimizar las secuencias se puede realizar también en el sistema computarizado, p. ej., como se describe en la solicitud '375.In one aspect described herein, the computerized system is used to perform the " in silico " sequence recombination or shuffling of the series of characters corresponding to the monomer domains. A variety of such methods are set forth in "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" by Selifonov and Stemmer, presented on February 5, 1999 (USSN 60/118854) and "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics "by Selifonov and Stemmer, presented on October 12, 1999 (USSN 09 / 416,375). In summary, genetic operators are used in genetic algorithms to change given sequences, e.g. eg, mimicking genetic events such as mutation, recombination, death and the like. Multi-dimensional analysis to optimize sequences can also be performed in the computerized system, e.g. eg, as described in application '375.

Un sistema digital también puede ordenar a un sintetizador de oligonucleótidos que sintetice oligonucleótidos, p. ej., utilizados para la reconstrucción o recombinación génicas, o para organizar oligonucleótidos de fuentes comerciales (p. ej., imprimiendo los impresos de solicitud apropiados o conectándose a un impreso de solicitud en la Red).A digital system can also order a oligonucleotide synthesizer that synthesizes oligonucleotides, e.g. e.g., used for gene reconstruction or recombination, or to organize oligonucleotides from commercial sources (e.g., printing the appropriate application forms or connecting to a application form on the Network).

El sistema digital también puede incluir elementos de salida para controlar la síntesis de ácido nucleico (p. ej., basándose en una secuencia o un alineamiento de un dominio monomérico recombinante, p. ej., barajado como en la presente memoria), esto es, un sistema integrado de la invención incluye opcionalmente un sintetizador de oligonucleótidos o un controlador de la síntesis de oligonucleótidos. El sistema puede incluir otras operaciones que se producen aguas abajo de un alineamiento u otra operación realizada utilizando una serie de caracteres correspondiente a una secuencia de la presente memoria, p. ej., como se ha indicado antes con referencia a los análisis.The digital system can also include output elements to control the synthesis of nucleic acid ( e.g. , based on a sequence or alignment of a recombinant monomer domain, e.g., shuffled as herein), that is , an integrated system of the invention optionally includes an oligonucleotide synthesizer or an oligonucleotide synthesis controller. The system may include other operations that occur downstream of an alignment or other operation performed using a series of characters corresponding to a sequence herein, e.g. eg, as indicated above with reference to the analyzes.

Ejemplos Examples

El siguiente ejemplo se ofrece para ilustrar, no para limitar la invención reivindicada.The following example is offered to illustrate, not to limit the claimed invention.

Ejemplo 1Example one

Este ejemplo describe la selección de dominios monoméricos y la creación de multímeros.This example describes the selection of domains monomeric and the creation of multimers.

Los materiales de partida para identificar dominios monoméricos y crear multímeros a partir de los dominios monoméricos y los procedimientos seleccionados pueden derivar de cualquiera de una variedad de secuencias humanas y/o no humanas. Por ejemplo, para producir un dominio monomérico seleccionado con una unión específica a un ligando o mezcla de ligandos deseados, se seleccionan uno o más genes de dominios monoméricos a partir de una familia de dominios monoméricos que se unen a cierto ligando. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el uno o más genes de dominios monoméricos pueden ser obtenidas mediante amplificación por PCR de ADN genómico o ADNc, u opcionalmente, pueden ser producidas sintéticamente utilizando oligonucleótidos solapantes.The starting materials to identify monomer domains and create multimers from domains monomeric and the selected procedures may derive from any of a variety of human and / or non-human sequences. For example, to produce a selected monomer domain with a specific binding to a ligand or mixture of desired ligands, is select one or more monomeric domain genes from a family of monomeric domains that bind to a certain ligand. The nucleic acid sequences encoding the one or more genes of monomeric domains can be obtained by amplification by PCR of genomic DNA or cDNA, or optionally, can be produced synthetically using overlapping oligonucleotides.

Muy comúnmente, estas secuencias se clonan después en un formato de presentación sobre la superficie celular (esto es, presentación en la superficie bacteriana, de levadura, o de mamífero (COS); presentación en fagos) para la expresión y el escrutinio. Las secuencias recombinantes son transfectadas (transducidas o transformadas) en la célula anfitriona apropiada en la que son expresadas y presentadas sobre la superficie de la célula. Por ejemplo, las células pueden ser teñidas con un ligando deseado marcado (p. ej., marcado fluorescentemente). Las células teñidas se clasifican mediante citometría de flujo, y los genes que codifican los dominios monoméricos son recuperados (p. ej., mediante aislamiento de plásmidos, PCR o expansión y clonación) de las células positivas. El procedimiento de tinción y clasificación se puede repetir múltiples veces (p. ej., utilizando concentraciones progresivamente decrecientes del ligando deseado hasta que se obtiene el nivel de enriquecimiento deseado). Alternativamente, se puede utilizar cualquier método de escrutinio o detección conocido en la técnica que se pueda emplear para identificar las células que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados.Very commonly, these sequences are cloned then in a presentation format on the cell surface (that is, presentation on the bacterial, yeast surface, or mammalian (COS); phage display) for expression and scrutiny. Recombinant sequences are transfected. (transduced or transformed) in the appropriate host cell in which are expressed and presented on the surface of the cell. For example, cells can be stained with a ligand desired labeling (eg, fluorescently labeled). The cells stained are classified by flow cytometry, and the genes that encode the monomer domains are retrieved (e.g., by plasmid isolation, PCR or expansion and cloning) of Positive cells The staining and classification procedure can be repeated multiple times (e.g., using concentrations  progressively decreasing the desired ligand until it get the desired enrichment level). Alternatively, it you can use any known screening or screening method in the technique that can be used to identify the cells that bind to the ligand or mixture of desired ligands.

Los genes que codifican los dominios monoméricos seleccionados recuperados de las células de unión al ligando o mezcla de ligandos deseados pueden ser opcionalmente recombinados de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria o en las referencias citadas. Las secuencias recombinantes producidas en esta ronda de diversificación son escrutadas después mediante el mismo o diferente método para identificar genes recombinantes con una afinidad mejorada para el ligando deseado o diana. El procedimiento de diversificación y selección se repite opcionalmente hasta que se obtiene una afinidad deseada.The genes that encode monomer domains selected recovered from ligand binding cells or mixture of desired ligands can be optionally recombined from according to any of the methods described herein memory or references cited. Recombinant sequences produced in this round of diversification are scrutinized after by the same or different method to identify genes recombinants with an improved affinity for the desired ligand or Diana. The diversification and selection procedure is repeated optionally until a desired affinity is obtained.

Los ácidos nucleicos del dominio monomérico seleccionado elegidos mediante los métodos pueden ser unidos entre sí por medio de una secuencia conectora para crear multímeros, p. ej., mediante ensamblaje combinatorio de secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios monoméricos seleccionados mediante ligación de ADN, u opcionalmente, reacciones de solapamiento autocebado, basadas en PCR. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los multímeros son clonadas después en un formato de presentación en la superficie celular (esto es, presentación en la superficie de células bacterianas, de levadura, o de mamífero (COS); presentación en fagos) para su expresión y escrutinio. Las secuencias recombinantes son transfectadas (transducidas o transformadas) en la célula anfitriona apropiada donde son expresadas y presentadas sobre la superficie de la célula. Por ejemplo, las células pueden ser teñidas con un ligando o mezcla de ligandos deseados, marcados, p. ej., marcados fluorescentemente. Las células teñidas se clasifican mediante citometría de flujo, y los genes que codifican los multímeros seleccionados se recuperan (p. ej., mediante PCR o expansión y clonación) de las células positivas. Las células positivas incluyen multímeros con una avidez o afinidad mejorada o una especificidad alterada hacia el ligando o mezcla de ligandos deseados en comparación con los dominios monoméricos seleccionados. El procedimiento de tinción y clasificación se puede repetir múltiples veces (p. ej., utilizando concentraciones progresivamente decrecientes del ligando o mezcla de ligandos deseados hasta obtener un nivel de enriquecimiento deseado). Alternativamente, se puede emplear cualquier método de escrutinio o detección conocido en la técnica que se puede utilizar para identificar células que se unen al ligando o mezcla de ligandos deseados.The nucleic acids of the monomeric domain selected chosen by the methods can be joined between yes through a connecting sequence to create multimers, e.g. eg, by combinatorial assembly of acid sequences nucleic encoding the selected monomer domains by DNA ligation, or optionally, reactions of self-priming overlay, based on PCR. Acid sequences nucleic encoding the multimers are then cloned into a presentation format on the cell surface (that is, presentation on the surface of bacterial, yeast cells, or mammalian (COS); phage display) for expression and scrutiny. Recombinant sequences are transfected. (transduced or transformed) in the appropriate host cell where they are expressed and presented on the surface of the cell. For example, cells can be stained with a ligand or mixture of desired, labeled ligands, e.g. eg, fluorescently labeled. Stained cells are classified by flow cytometry, and the genes encoding the selected multimers are recovered (e.g., by PCR or expansion and cloning) of the cells positive. Positive cells include multimers with an avidity or improved affinity or an altered specificity towards the ligand or mixture of desired ligands compared to domains selected monomers. The staining procedure and sorting can be repeated multiple times (e.g., using progressively decreasing concentrations of the ligand or mixture of desired ligands until an enrichment level is obtained wanted). Alternatively, any method of scrutiny or detection known in the art that can be used to identify cells that bind to the ligand or mixture of ligands desired

Los genes que codifican el multímero seleccionado recuperados de las células de unión al ligando o mezcla de ligandos deseados pueden ser opcionalmente recombinados de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria o en las referencias citadas. Las secuencias recombinantes producidas en esta ronda de diversificación son escrutadas después mediante el mismo o diferente método para identificar los genes recombinantes con una avidez o afinidad mejoradas o una especificidad alterada para el ligando deseado o diana. El procedimiento de diversificación y selección se repite opcionalmente hasta que se obtiene una avidez o afinidad deseadas o una especificidad alterada.The genes that encode the multimer selected recovered from ligand binding cells or mixture  of desired ligands can be optionally recombined from according to any of the methods described herein memory or references cited. Recombinant sequences produced in this round of diversification are scrutinized after by the same or different method to identify genes recombinants with an improved avidity or affinity or a altered specificity for the desired ligand or target. He diversification and selection procedure is optionally repeated until a desired avidity or affinity or a specificity altered.

Ejemplo 2Example 2

Este ejemplo describe el desarrollo de una biblioteca de multímeros formada por dominios C2.This example describes the development of a multimer library consisting of C2 domains.

Se crea una genoteca de secuencias de ADN que codifican dominios monoméricos C2 mediante PCR de ensamblaje como describen Stemmer et al., Gene 164, 49-53 (1995). Los oligonucleótidos utilizados en esta reacción de PCR son:A library of DNA sequences encoding C2 monomeric domains is created by assembly PCR as described by Stemmer et al ., Gene 164, 49-53 (1995). The oligonucleotides used in this PCR reaction are:

1one

Los fragmentos de la PCR se digieren con BamHI y XhoI. Los productos de la digestión se separan sobre un gel de agarosa al 1,5% y los fragmentos del dominio C2 se purifican a partir del gel. Los fragmentos de ADN se ligan en los correspondientes sitios de restricción del vector pYD1 de presentación en la superficie de levadura (Invitrogen).The PCR fragments are digested with BamHI and XhoI. The products of digestion are separated on a gel of 1.5% agarose and the C2 domain fragments are purified to from the gel. DNA fragments are linked in the corresponding restriction sites of the pYD1 vector of presentation on the surface of yeast (Invitrogen).

La mezcla de ligación se utiliza para la transformación de la cepa de levadura EBY100. Los transformantes se seleccionan haciendo crecer las células en medio selectivo que contiene glucosa (-Trp) a 30ºC.The ligation mixture is used for Yeast strain transformation EBY100. The transformants are select by growing the cells in selective medium that contains glucose (-Trp) at 30 ° C.

La presentación en la superficie de la biblioteca de dominios C2 es inducida haciendo crecer las células en medio selectivo que contiene galactosa a 20ºC. Las células se enjuagan con PBS y después se incuban con proteína diana marcada fluorescentemente y se enjuagan de nuevo en PBS.The presentation on the surface of the C2 domain library is induced by growing cells in  selective medium containing galactose at 20 ° C. The cells are rinse with PBS and then incubate with labeled target protein fluorescently and rinsed again in PBS.

Después las células se clasifican mediante FACS y las células positivas se hacen crecer de nuevo en medio selectivo que contiene glucosa. Se puede utilizar el cultivo celular para una segunda ronda de clasificación o se puede utilizar para el aislamiento del ADN plasmídico. El ADN plasmídico purificado se utiliza como molde para amplificar por PCR las secuencias de ADN que codifican el dominio C2.The cells are then classified by FACS and the positive cells are grown again in selective medium It contains glucose. The cell culture can be used for a second qualifying round or can be used for the Plasmid DNA isolation. The purified plasmid DNA is used as a template to amplify the DNA sequences by PCR that encode the C2 domain.

Los oligonucleótidos utilizados en esta reacción de PCR son:The oligonucleotides used in this reaction PCR are:

22

Los fragmentos de la PCR son digeridos después con AlwNI, los productos de la digestión son separados sobre un gel de agarosa al 1,5% y los fragmentos del dominio C2 son purificados del gel. Con posterioridad, los fragmentos de la PCR son multimerizados mediante ligación de ADN en presencia de fragmentos de terminación. Los fragmentos de terminación se enumeran más abajo:The PCR fragments are digested after With AlwNI, digestion products are separated on a gel 1.5% agarose and the C2 domain fragments are purified of the gel. Subsequently, the PCR fragments are multimerized by DNA ligation in the presence of fragments of termination Termination fragments are listed more down:

Terminación1:Termination1:

33

Terminación2:Termination2:

44

La mezcla de ligación es digerida después EcoRI y HindIII.The ligation mixture is digested after EcoRI and HindIII.

Los multímeros se separan sobre gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN correspondientes a terminación1-C2-C2-terminación2 se purifican del gel. Los fragmentos terminación1-C2-C2-terminación2 se amplifican mediante PCR utilizando cebadores 5'-aattcaacgctactaccat-3' y 5'-agcttcattacccaaatcaac-3' y con posterioridad se digieren con BamHI y XhoI. Opcionalmente, los polinucleótidos que codifican los multímeros se pueden someter a una ronda adicional de escrutinio de afinidad (p. ej., análisis FACS como se ha descrito antes).The multimers are separated on agarose gel 1% and the DNA fragments corresponding to termination1-C2-C2-termination2  They are purified from the gel. Fragments termination1-C2-C2-termination2 are amplified by PCR using primers 5'-aattcaacgctactaccat-3 'and 5'-agcttcattacccaaatcaac-3 'and with later they are digested with BamHI and XhoI. Optionally, the polynucleotides encoding the multimers can be subjected to a additional round of affinity scrutiny (e.g., FACS analysis as described before).

Con posterioridad, se aíslan y se secuencian los aglutinantes de alta afinidad. El ADN que codifica los aglutinantes de alta afinidad se clona en un vector de expresión y se replican en un anfitrión adecuado. Las proteínas expresadas se purifican y caracterizan.Subsequently, they are isolated and sequenced high affinity binders. The DNA that encodes the binders High affinity is cloned into an expression vector and replicated in A suitable host. The expressed proteins are purified and characterize.

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Ejemplo 3Example 3

Este ejemplo describe el desarrollo de una genoteca de trímeros que comprende dominios A de receptores de LDL.This example describes the development of a trimer library comprising domains A of receptors of LDL

Se crea una genoteca de secuencias de ADN que codifican dominios A monoméricos mediante PCR de ensamblaje como describen Stemmer et al., Gene 164, 49-53 (1995). Los oligonucleótidos utilizados en esta reacción de PCR son:A library of DNA sequences encoding monomeric A domains is created by assembly PCR as described by Stemmer et al ., Gene 164, 49-53 (1995). The oligonucleotides used in this PCR reaction are:

55

donde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G, y N=A/C/G/T.where R = A / G, Y = C / T, M = A / C, K = G / T, S = C / G, W = A / T, B = C / G / T, D = A / G / T, H = A / C / T, V = A / C / G, and N = A / C / G / T.

Los fragmentos de PCR se digieren con XmaI y SfiI. Los productos de digestión se separan sobre gel de agarosa al 3% y los fragmentos del dominio A se purifican a partir del gel. Los fragmentos de ADN se ligan después en los sitios de restricción correspondientes del vector de presentación en fagos fuse5-HA, un derivado de fuse5. La mezcla de ligación es sometida a electroporación en células E. coli electrocompetentes (cepa F p. ej. Top10 o MC1061). Las células E. coli transformadas se desarrollan durante la noche en medio 2xYT que contiene 20 \mug/ml de tetraciclina.The PCR fragments are digested with XmaI and SfiI. The digestion products are separated on 3% agarose gel and the fragments of domain A are purified from the gel. The DNA fragments are then ligated into the corresponding restriction sites of the phage display vector fuse5-HA, a derivative of fuse5. The ligation mixture is subjected to electroporation in electrocompetent E. coli cells (strain F eg, Top10 or MC1061). Transformed E. coli cells are grown overnight in 2xYT medium containing 20 µg / ml tetracycline.

Los viriones se purifican a partir de este cultivo mediante precipitación con PEG. La proteína diana se inmoviliza sobre una superficie sólida (p. ej. placa Petri o placa de microtitulación) directamente mediante incubación en NaHCO_{3} 0,1 M o indirectamente a través de una conexión biotina-estreptavidina. Los viriones purificados se añaden a un número típico de ~1-3 x 10^{11} TU. La placa Petri o la placa de microtitulación se incuba a 4ºC, se lava varias veces con tampón de lavado (TBS/Tween) y los fagos unidos se hacen eluir añadiendo glicina.tampón HCl. El producto eluido se neutraliza añadiendo Tris-HCl 1 M (pH 9,1).Virions are purified from this culture by precipitation with PEG. The target protein is immobilizes on a solid surface (eg Petri dish or plate microtiter) directly by incubation in NaHCO3 0.1 M or indirectly through a connection biotin-streptavidin. The purified virions are they add to a typical number of ~ 1-3 x 10 11 TU. The Petri dish or microtiter plate is incubated at 4 ° C, washed several times with wash buffer (TBS / Tween) and the bound phages are They elute by adding glycine. HCl buffer. The eluted product is neutralize by adding 1M Tris-HCl (pH 9.1).

Los fagos se amplifican y se utilizan con posterioridad como aporte para una segunda ronda de selección de afinidad. El ADNss se extrae del producto eluido final utilizando el kit QIAprep M13 kit. El ADNss se utiliza como molde para amplificar mediante PCR los dominios A que codifican las secuencia de ADN.Phages are amplified and used with later as a contribution for a second round of selection of affinity. The ssDNA is extracted from the final eluted product using the QIAprep kit M13 kit. ADNss is used as a template to amplify by PCR the domains A that encode the DNA sequence.

Los oligonucleótidos utilizados en esta reacción de PCR son:The oligonucleotides used in this reaction PCR are:

5'-aagcctcagcgaccgaa5'-aagcctcagcgaccgaa

5'-agcccaataggaacccat5'-agcccaataggaacccat

Los fragmentos de la PCR se digieren con AlwNI y BglI. Los productos de la digestión se separan sobre gel de agarosa al 3% y los fragmentos del dominio A se purifican del gel. Los fragmentos de la PCR se multimerizan mediante ligación con ADN en presencia de los siguientes fragmentos de terminación:The PCR fragments are digested with AlwNI and BglI. Digestion products are separated on agarose gel at 3% and fragments of domain A are purified from the gel. The PCR fragments are multimerized by ligation with DNA in presence of the following termination fragments:

Terminación1:Termination1:

66

Terminación2:Termination2:

77

La mezcla de ligación se digiere con EcoRI y HindIII.The ligation mixture is digested with EcoRI and HindIII.

Los multímeros se separan sobre gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN correspondientes a terminación1-A-A-A-terminación2 se purifican del gel. Los fragmentos terminación1-A-A-A-terminación2 se amplifican con posterioridad mediante PCR utilizando cebadores 5'-agcttcattacccaaatcaac-3' y 5' aattcaacgctactaccat-3' y con posterioridad se digieren con XmaI y SfiI. Los polinucleótidos seleccionados se clonan después en un sistema de expresión en fagos y se prueba su afinidad por la proteína diana.The multimers are separated on agarose gel 1% and the DNA fragments corresponding to termination1-A-A-A-termination2  They are purified from the gel. Fragments termination1-A-A-A-termination2 are subsequently amplified by PCR using primers 5'-agcttcattacccaaatcaac-3 'and 5' aattcaacgctactaccat-3 'and later it digest with XmaI and SfiI. The selected polynucleotides will be they are then cloned into a phage display system and their affinity for the target protein.

Los aglutinantes de alta afinidad se aíslan y secuencian con posterioridad. El ADN que codifica los aglutinantes de alta afinidad se clona en un vector de expresión y se expresa con posterioridad en un anfitrión adecuado. La proteína expresada se purifica y se caracteriza después.High affinity binders are isolated and sequence later. The DNA that encodes the binders High affinity is cloned into an expression vector and expressed with later in a suitable host. The expressed protein is Purify and characterize later.

Claims (17)

1. Un método para identificar un multímero que se una a una molécula diana, comprendiendo los métodos,1. A method to identify a multimer that binds to a target molecule, understanding the methods,

(a)(to)

proporcionar una biblioteca de polipéptidos, comprendiendo los polipéptidos diferentes dominios monoméricos, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos, comprende al menos dos enlaces disulfuro, y es un dominio de clase A del receptor de LDL;provide a library of polypeptides, polypeptides comprising different domains monomeric, where each monomeric domain has 30-100 amino acids, comprises at least two bonds disulfide, and is a class A domain of the LDL receptor;

(b)(b)

escrutar la biblioteca de polipéptidos en busca de la afinidad para una molécula diana;scrutinize the polypeptide library in search of affinity for a target molecule;

(c)(C)

identificar al menos un primer polipéptido que comprende un primer dominio monomérico que se une específicamente a una molécula diana;identify at least a first polypeptide comprising a first monomeric domain that binds specifically to a target molecule;

(d)(d)

conectar el primer dominio monomérico a una pluralidad de diferentes dominios monoméricos para formar una biblioteca de diferentes multímeros, comprendiendo los multímeros el primer dominio monomérico y uno de una pluralidad de diferentes dominios monoméricos;connect the first monomer domain to a plurality of different monomer domains to form a library of different multimers, the multimers comprising the first monomeric domain and one of a plurality of different monomeric domains;

(e)(and)

escrutar la biblioteca de multímeros en busca de la capacidad para unirse a la molécula diana; yscan the multimer library in search of the ability to bind to the target molecule; Y

(f)(F)

identificar un multímero que se une específicamente a la molécula diana, donde el multímero comprende el primer dominio monomérico y un segundo dominio monomérico.identify a multimer that binds specifically to the target molecule, where the multimer comprises the first monomer domain and a second domain monomeric

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2. El método de la reivindicación 1, donde el multímero seleccionado comprende al menos tres dominios monoméricos.2. The method of claim 1, wherein the selected multimer comprises at least three domains monomeric 3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la biblioteca de multímeros se expresa como una presentación en fagos, una presentación en ribosomas, o una presentación en la superficie celular.3. The method of any of the preceding claims, wherein the multimer library is expressed as a phage presentation, a presentation in ribosomes, or a presentation on the cell surface. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los dominios monoméricos están conectados por un conector polipeptídico heterólogo.4. The method of any of the preceding claims, where the monomeric domains are connected by a heterologous polypeptide connector. 5. Un método para identificar un multímero que se une a al menos una molécula diana, comprendiendo el método:5. A method to identify a multimer that binds to at least one target molecule, the method comprising:

(a)(to)

proporcionar una biblioteca de multímeros, donde cada multímero comprende al menos dos dominios monoméricos, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos y comprende al menos dos enlaces disulfuro, separados por un conector heterólogo donde los dominios monoméricos son dominios de clase A del receptor de LDL; yprovide a library of multimers, where each multimer comprises at least two domains monomeric, where each monomeric domain has 30-100 amino acids and comprises at least two bonds disulfide, separated by a heterologous connector where the domains monomeric are class A domains of the LDL receptor; Y

(b)(b)

escrutar la biblioteca de multímeros en busca de multímeros que se unen a la molécula diana.scan the multimer library in search of multimers that bind to the target molecule.

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6. El método de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente identificar los multímeros que se unen a la molécula diana que tienen una avidez por la molécula diana que es mayor que la avidez de un dominio monomérico sencillo por la molécula diana.6. The method of claim 5, which further comprises identifying the multimers that bind to the target molecule that have an avidity for the target molecule that is greater than the avidity of a simple monomer domain by the target molecule 7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde uno o más de los multímeros comprende un dominio monomérico que se une específicamente a una segunda molécula diana.7. The method of claim 5 or the claim 6, wherein one or more of the multimers comprises a monomeric domain that specifically binds to a second molecule Diana. 8. Una biblioteca de multímeros, donde8. A library of multimers, where

(a)(to)

cada multímero comprende al menos dos dominios monoméricos conectados por un conector heterólogo, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos y comprende al menos dos enlaces disulfuro; yevery multimer comprises at least two monomer domains connected by a heterologous connector, where each monomer domain has 30-100 amino acids and comprises at least two bonds disulfide; Y

(b)(b)

los dominios monoméricos son dominios de clase A del receptor de LDL.the monomeric domains are class A domains of the receiver of LDL

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9. La biblioteca de la reivindicación 8, donde cada dominio monomérico de los multímeros es un dominio monomérico de origen no natural.9. The library of claim 8, wherein each monomer domain of the multimers is a monomer domain of unnatural origin. 10. La biblioteca de la reivindicación 8, donde los dominios monoméricos están conectados por un conector polipeptídico.10. The library of claim 8, wherein the monomer domains are connected by a connector polypeptide 11. El método o la biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la biblioteca contiene al menos 100 miembros.11. The method or library of any of the preceding claims, wherein the library contains the minus 100 members 12. Un polipéptido que comprende al menos dos dominios monoméricos separados por un conector heterólogo, donde cada dominio monomérico tiene 30-100 aminoácidos y comprende al menos dos enlaces disulfuro, donde cada dominio monomérico se une específicamente a una molécula diana y donde los dominios monoméricos son dominios de clase A del receptor de LDL.12. A polypeptide comprising at least two monomer domains separated by a heterologous connector, where each monomer domain has 30-100 amino acids and it comprises at least two disulfide bonds, where each domain monomer specifically binds to a target molecule and where monomeric domains are class A domains of the receiver of LDL 13. El polipéptido de la reivindicación 12, donde cada dominio monomérico es un dominio monomérico de proteína de origen no natural.13. The polypeptide of claim 12, where each monomer domain is a protein monomer domain of unnatural origin. 14. El polipéptido de la reivindicación 12, donde el polipéptido comprende un primer dominio monomérico que se une a una primera molécula diana y un segundo dominio monomérico que se une a una segunda molécula diana.14. The polypeptide of claim 12, where the polypeptide comprises a first monomer domain that is binds to a first target molecule and a second monomer domain that binds to a second target molecule. 15. El polipéptido de la reivindicación 12, donde el polipéptido comprende dos dominios monoméricos, teniendo cada uno especificidad de unión por un sitio diferente en una primera molécula diana.15. The polypeptide of claim 12, where the polypeptide comprises two monomeric domains, having each binding specificity for a different site in a first target molecule. 16. El polipéptido de la reivindicación 12, donde el polipéptido comprende al menos tres dominios monoméricos.16. The polypeptide of claim 12, where the polypeptide comprises at least three domains monomeric 17. El polipéptido de la reivindicación 12, donde los dominios monoméricos están conectados por un segundo conector polipeptídico.17. The polypeptide of claim 12, where monomeric domains are connected for a second polypeptide connector.