ES2348087T3

ES2348087T3 - USE OF ANTI-CD40 ANTI-BODIES FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY AND AUTOIMMUNE DISEASES AND ORGAN TRANSPLANT REJECTION.

Info

Publication number: ES2348087T3
Application number: ES04810420T
Authority: ES
Inventors: Asha Yabannavar; Isabel Zaror; Mohammad Luqman; Li Long
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2010-11-30
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: SI2149585T1; ES2367892T3; ES2348238T3; ZA200802168B; ES2348237T3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.An anti-CD40 human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell expressing CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, for use in a method for treating a human subject of an inflammatory disease or an autoimmune disease, the method comprising administering to said subject an effective amount of the human anti-CD40 monoclonal antibody, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of: a) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the dep hybridoma cell line ossified at the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543; b) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; c) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-89 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; d) a monoclonal antibody that competes with the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543 in a competitive binding assay; and e) a monoclonal antibody that is an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of any one of the preceding items a) -d), wherein said fragment maintains the ability to specifically bind to said human CD40 antigen.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION

La invención se refiere a procedimientos para tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias usando anticuerpos monoclonales anti-CD40. The invention relates to methods for treating autoimmune and inflammatory diseases using anti-CD40 monoclonal antibodies.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

El CD40 es un antígeno de superficie celular de 55 kDa presente en la superficie de las células B normales y células B neoplásicas humanas, células dendríticas, otras células presentadoras de antígenos (APC), células endoteliales, células monolíticas, células T CD8+ y células epiteliales. El antígeno CD40 se expresa también en células T activadas, plaquetas activadas, células musculares lisas vasculares inflamadas, eosinófilos, membranas sinoviales en artritis reumatoide, fibroblastos dérmicos y otros tipos de células no linfoides. Dependiendo del tipo de célula que expresa CD40, la ligazón puede inducir adhesión intercelular, diferenciación, activación y proliferación. Por ejemplo, la unión de CD40 a su ligando cognado, CD40L (también designado CD154), estimula proliferación de células B y diferenciación en células plasmáticas, producción de anticuerpos, cambio de isotipos y generación de memoria en células B. Durante la diferenciación de células B, CD40 se expresa en células pre-B pero se pierde en la diferenciación en células plasmáticas. CD40 is a 55 kDa cell surface antigen present on the surface of normal B cells and human neoplastic B cells, dendritic cells, other antigen presenting cells (APC), endothelial cells, monolithic cells, CD8 + T cells and epithelial cells . The CD40 antigen is also expressed in activated T cells, activated platelets, inflamed vascular smooth muscle cells, eosinophils, synovial membranes in rheumatoid arthritis, dermal fibroblasts and other types of non-lymphoid cells. Depending on the type of cell that expresses CD40, the ligation can induce intercellular adhesion, differentiation, activation and proliferation. For example, the binding of CD40 to its cognate ligand, CD40L (also referred to as CD154), stimulates B cell proliferation and differentiation in plasma cells, antibody production, isotype change and memory generation in B cells. During cell differentiation B, CD40 is expressed in pre-B cells but is lost in differentiation in plasma cells.

El ligando de CD40 se ha identificado en la superficie de células B activadas (Fenslow y col. (1992) J. Immunol. 149: 655; Lane y col. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2573; Noelle y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 6550), pero no se expresa genralmente en las células T humanas en reposo. DC40L es una glicoproteína transmembrana de tipo I con homología con TNF-α (Armitage y col. (1992) Nature 357: 80 y Spriggs y col. (1992) J. Exp. Med. 176: 1543). El dominio extracelular de CD40L contiene dos residuos de arginina proximales a la región transmembrana, proporcionando un sitio de escisión proteolítica potencial que ocasiona una forma soluble del ligando (sCD40L). La sobreexpresión de CD40L causa enfermedades autoinmunes similares a lupus eritematoso sistémico en modelos de roedor (Higuchi y col. (2002) J.Immunol. 168: 9-12). En contraste, la ausencia de CD40L funcional en células T activadas causa síndrome de hiper-IgM ligado a X (Allen y col. (1993) Science 259: 990; y Korthauer y col. (1993) Nature 361: 539). Adicionalmente, el bloqueo de la interacción CD40/CD40L puede evitar rechazo de transplantes en modelos de primates no humanos. The CD40 ligand has been identified on the surface of activated B cells (Fenslow et al. (1992) J. Immunol. 149: 655; Lane et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2573; Noelle et al. . (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6550), but is not generally expressed in resting human T cells. DC40L is a type I transmembrane glycoprotein with homology to TNF-α (Armitage et al. (1992) Nature 357: 80 and Spriggs et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1543). The extracellular domain of CD40L contains two arginine residues proximal to the transmembrane region, providing a potential proteolytic cleavage site that causes a soluble form of the ligand (sCD40L). Overexpression of CD40L causes autoimmune diseases similar to systemic lupus erythematosus in rodent models (Higuchi et al. (2002) J. Immunol. 168: 9-12). In contrast, the absence of functional CD40L in activated T cells causes X-linked hyper-IgM syndrome (Allen et al. (1993) Science 259: 990; and Korthauer et al. (1993) Nature 361: 539). Additionally, blocking the CD40 / CD40L interaction can prevent transplant rejection in nonhuman primate models.

Véase, por ejemplo, Wee y col. (1992) Transplantation 53: 501-7. See, for example, Wee et al. (1992) Transplantation 53: 501-7.

La expresión de CD40 en APC juega un papel coestimulador importante en la activación de estas células. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40 agonistas han mostrado imitar los efectos de las células T ayudantes en la activación de las células B. Cuando están presentes en células adherentes que expresan FcγRII, estos anticuerpos inducen proliferación de células B (Banchereau y col. (1989) Science 251: 70). Además, los anticuerpos monoclonales anti-CD40 agonistas pueden reemplazar la señal T ayudante para la secreción de IgM, IgG e IgE en presencia de IL-4 (Gascan y col. (1991) J. Immunol. 147: 8). Además, los mAb anti-CD40 agonistas pueden evitar la muerte celular programada (apoptosis) en células B aisladas de nódulos linfáticos. The expression of CD40 in APC plays an important costimulatory role in the activation of these cells. For example, agonist anti-CD40 monoclonal antibodies (mAbs) have been shown to mimic the effects of helper T cells in activating B cells. When present in adherent cells expressing FcγRII, these antibodies induce B cell proliferation (Banchereau et al. (1989) Science 251: 70). In addition, agonist anti-CD40 monoclonal antibodies can replace the T-signal helper for the secretion of IgM, IgG and IgE in the presence of IL-4 (Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147: 8). In addition, agonist anti-CD40 mAbs can prevent programmed cell death (apoptosis) in B cells isolated from lymph nodes.

Éstas y otras observaciones respaldan la teoría actual de que la interacción de CD40 y CD40L juega un papel fundamental en regular tanto respuestas inmunes humorales como respuestas inmunes mediadas por células. Los estudios más recientes han revelado un papel mucho más amplio de interacción CD40/CD40L en diversos procedimientos fisiológicos y patológicos. These and other observations support the current theory that the interaction of CD40 and CD40L plays a fundamental role in regulating both humoral immune responses and cell-mediated immune responses. More recent studies have revealed a much broader role of CD40 / CD40L interaction in various physiological and pathological procedures.

La ruta de transducción de señales de CD40 depende de la regulación coordinada de muchos factores intracelulares. Como otras membranas de la familia de receptores de TNF, CD40 reacciona con proteínas TRAF (protenías asociadas con factores receptores de TNF) tales como TRAF2 y TRAF3, que median una señal intracelular tras lal unión de CD40 con CD40L (bien CD40L en fase sólñida o bien CD40L soluble). Los TRAF translucen una señal dentro del núcleo por medio de quinasas map tales como NIK (quinasa inductora de NK-κB) y quinasas Ikappa B (IKK α/β), activando definitivamente el factor de transcripción NK-κB (Young y col. (1998) Immunol. Today 19: 502-06). La señalización por medio de Ras y la ruta MEK/ERK se ha demostrado en un subgrupo de células B. Rutas adicionales implicadas en señalización celular de CDF40 incluyen ruta PI3k/Akt u ruta P30 MAPK (Craxton y col. (1998) J. Immunol. 5: 439-447). La señalización por medio de CD40 se ha mostrado para prevenir muerte celular a partir de apoptosis (Makus y col. (2002) J. Immunol. 14: 973-982). Las señales apoptóticas son necesarias para inducir muerte celular programada en una manera coordinada. Las señales de muerte celular pueden incluir estímulas intrínsecos del interior de la célula tales como estrés de retículo endoplásmico o estímulos externos tales como unión de receptor de FasL o TNFα. La ruta de señalización es compleja, implicando activación de caspasas tales como caspasas 3 y 9 y de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Durante la cascada, las proteínas de señalización anti-apoptóticas, tales como Mcl-1 y BCLx, y miembros de las prtoteínas de la familia IAP, tales como Inhibidor Ligado a X de Apoptosis (XIAP), se regulan de forma descendente (Budihardjo y col. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 269-90). Por ejemplo, en células dendríticas, la señalización celular de CD40 puede bloquear señales de apoptosis trasducidas por FasL (Bjorck y col. (1997) Int’l Immunol. 9: 365-372). The signal transduction path of CD40 depends on the coordinated regulation of many intracellular factors. Like other membranes in the TNF receptor family, CD40 reacts with TRAF proteins (proteins associated with TNF receptor factors) such as TRAF2 and TRAF3, which mediate an intracellular signal after binding of CD40 with CD40L (either solid-phase CD40L or well soluble CD40L). TRAFs translude a signal into the nucleus by means of map kinases such as NIK (NK-κB inducing kinase) and Ikappa B kinases (IKK α / β), definitely activating the transcription factor NK-κB (Young et al. ( 1998) Immunol. Today 19: 502-06). Signaling via Ras and the MEK / ERK route has been demonstrated in a subset of B cells. Additional routes involved in CDF40 cell signaling include PI3k / Akt pathway or P30 MAPK pathway (Craxton et al. (1998) J. Immunol .5: 439-447). Signaling via CD40 has been shown to prevent cell death from apoptosis (Makus et al. (2002) J. Immunol. 14: 973-982). Apoptotic signals are necessary to induce programmed cell death in a coordinated manner. Cell death signals may include intrinsic stimuli from inside the cell such as endoplasmic reticulum stress or external stimuli such as FasL receptor binding or TNFα. The signaling pathway is complex, involving activation of caspases such as caspases 3 and 9 and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). During the cascade, anti-apoptotic signaling proteins, such as Mcl-1 and BCLx, and members of the IAP family prtoteins, such as X-linked Inhibitor of Apoptosis (XIAP), are regulated downwards (Budihardjo and col. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 269-90). For example, in dendritic cells, CD40 cell signaling can block apoptosis signals transduced by FasL (Bjorck et al. (1997) Int’l Immunol. 9: 365-372).

Por consiguiente, la unión de CD40 por CD40L y la activación subsiguiente de señalización de CD40 son etapas necesarias para respuestas inmunes normales; sin embargo, la desregulación de señalización de CD40 puede conducir a enfermedad. La ruta de señalización de CD40 ha estado mostrando estar implicada en enfermedad autoinmune (Ichikawa y col. (2002) J. Immunol. 169: 2781-7 y Moore y col. (2002) J. Autoimmun. 19: 139-45). Adicionalmente, la interacción CD40/CD40L juega un papel importante en procedimientos inflamatorios. Por ejemplo, tanto CD40 como ligando de CD40 se sobreexpresan en aterosclerosis humana y en lesiones de aterosclerosis experimentales. La estimulación de CD40 induce expresión de enzimas que degradan matriz e induce expresión de factor de tejido en tipos celulares asociados con ateroma, tales como células endoteliales, células musculares lisas y macrófagos. Adicionalmente, la estimulación de CD40 induce producción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, IL-6 e IL-8, y molçéculas de adhesión tales como ICAM-1, Eselectina y VCAM. La inhibición de la interacción de CD40/CD40L evita aterosclerosis en modelos animales. En modelos de transplante, bloquear la interacción CD40/CD40L evita inflamación. Se ha mostrado que la unión CD40/CD40L actúa sinérgicamente con el péptido beta-amiloide de Alzheimer para promover activación microglial, conduciendo así a neurotoxicidad. Accordingly, binding of CD40 by CD40L and subsequent activation of CD40 signaling are necessary steps for normal immune responses; however, deregulation of CD40 signaling can lead to disease. The CD40 signaling pathway has been showing to be involved in autoimmune disease (Ichikawa et al. (2002) J. Immunol. 169: 2781-7 and Moore et al. (2002) J. Autoimmun. 19: 139-45). Additionally, the CD40 / CD40L interaction plays an important role in inflammatory procedures. For example, both CD40 and CD40 ligand are overexpressed in human atherosclerosis and experimental atherosclerosis lesions. CD40 stimulation induces expression of matrix degrading enzymes and induces tissue factor expression in cell types associated with atheroma, such as endothelial cells, smooth muscle cells and macrophages. Additionally, CD40 stimulation induces production of proinflammatory cytokines such as IL-1, IL-6 and IL-8, and adhesion molecules such as ICAM-1, Eselectin and VCAM. The inhibition of the interaction of CD40 / CD40L prevents atherosclerosis in animal models. In transplant models, blocking the CD40 / CD40L interaction prevents inflammation. It has been shown that the CD40 / CD40L binding acts synergistically with the Alzheimer's beta-amyloid peptide to promote microglial activation, thus leading to neurotoxicity.

En los pacientes con artritis reumatoide (RA), la expresión de CD40 está incrementada en condrocitos articulares, por consiguiente, la señalización de CD40 contribuye probablemente a producción de citoquinas dañinas y metaloproteinasas de matriz. Véase, Gotoh y col. (2004) J. Rheumatol.31: 1506-12. Adicionalmente, ello ha mostrado que la amplificación de la respuesta inflamtoria sinovial tiene lugar por activación de quinasas de proteínas activadas por mitógeno (MAP) y del factor del núcleo kappaB (NFκB) por medio de ligación de CD40 en células sinoviales CD14+ de pacientes de RA (Harigai y col. (2004) Arthritis. Rheum., 50: 2167-77). En un modelo experimental de RA, el tratamiento de anticuerpo anti-CD40L evitó inducción de enfermedad, inflamación de la articulaciones, y producción de amnticuerpos anticolágeno (Durie y col. (1993) Science 261: 1328). Finalmente, en ensayos clínicos, se ha mostrado que deplecionar células B positivas CD20+ de pacientes de RA administrando RITUXAN® (indicado generalmente por linfoma de células B) mejora los síntomas (Shaw y col. (2003) Ann. Deum. Dis. 62: ii55-ii59). In patients with rheumatoid arthritis (RA), CD40 expression is increased in articular chondrocytes, therefore, CD40 signaling probably contributes to the production of harmful cytokines and matrix metalloproteinases. See, Gotoh et al. (2004) J. Rheumatol. 31: 1506-12. Additionally, this has shown that the amplification of the synovial inflammatory response takes place by activation of mitogen-activated protein kinases (MAP) and the kappaB nucleus factor (NFκB) by means of ligation of CD40 into CD14 + synovial cells of RA patients. (Harigai et al. (2004) Arthritis. Rheum., 50: 2167-77). In an experimental model of RA, anti-CD40L antibody treatment prevented disease induction, inflammation of the joints, and production of anti-collagen antibodies (Durie et al. (1993) Science 261: 1328). Finally, in clinical trials, it has been shown that depleting CD20 + B positive cells from RA patients by administering RITUXAN® (usually indicated by B cell lymphoma) improves symptoms (Shaw et al. (2003) Ann. Deum. Dis. 62: ii55-ii59).

Se ha mostrado también que bloquear interacciones CD40/CD40L durante la presentación de antígeno a células T induce tolerancia a células T. Por lo tanto, bloquear interacción CD40/CD40L evita activación de células T inicial así como induce tolerancia a largo plazo para re-exposición al antígeno. It has also been shown that blocking CD40 / CD40L interactions during antigen presentation to T cells induces T cell tolerance. Therefore, blocking CD40 / CD40L interaction prevents initial T cell activation as well as induces long term tolerance for re-exposure. to the antigen.

Los documentos WO 01/83755, WO 02/28480 y WO 02/28904 describen anticuerpos capaces de unirse a CD40, procedimientos para producir estos anticuerpos y procedimientos para su uso. WO 01/83755, WO 02/28480 and WO 02/28904 describe antibodies capable of binding to CD40, methods for producing these antibodies and methods for their use.

Ellmark y col. (Immunology 2002, 106, 456-463) dan un informe sobre la modulación de la interacción CD40-ligando de CD40 usando fragmentos de anticuerpos anti-CD40 de cadena simple humanos. Ellmark et al. (Immunology 2002, 106, 456-463) give a report on the modulation of the CD40-CD40 ligand interaction using human single chain anti-CD40 antibody fragments.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o de un enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por: The invention provides a human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to the human CD40 antigen expressed on the surface of cells expressing human CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell. , for use in a method for treating a human subject of an inflammatory disease or an autoimmune disease, the method comprising administering to said subject an effective amount of the human anti-CD40 monoclonal antibody, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group Constituted by:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano. a) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or to the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can Obtained from the hybridoma cell line deposited with the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543; b) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; c) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-89 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; d) a monoclonal antibody that competes with the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the cell line of hybridoma deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543 in a competitive binding assay; and e) a monoclonal antibody that is an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of any one of the preceding items a) -d), wherein said fragment maintains the ability to specifically bind to said human CD40 antigen.

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano para una enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmune, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: The invention also provides the use of an effective amount of a human anti-CD40 monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40 in the preparation of a medicament for treating a human subject for an inflammatory disease or autoimmune disease, said monoclonal antibody being free of significant antagonistic activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal antiCD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por: The invention provides a human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to the human CD40 antigen expressed on the surface of cells expressing human CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell. , for use in a method for treating a human transplant rejection subject, the method comprising administering to said subject an effective amount of the human anti-CD40 monoclonal antibody, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal antiCD40 humano seleccionado del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano. The invention also provides the use of an effective amount of a human anti-CD40 monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40 in the preparation of a medicament for treating a human transplant rejection subject, said monoclonal antibody being free of significant antagonistic activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said human antiCD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of: a) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or to the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the deposited hybridoma cell line in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543; b) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; c) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-89 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; d) a monoclonal antibody that competes with the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the cell line of hybridoma deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543 in a competitive binding assay; and e) a monoclonal antibody that is an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of any one of the preceding items a) -d), wherein said fragment maintains the ability to specifically bind to said human CD40 antigen.

La invención proporciona también un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal antiCD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por: The invention also provides a human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to the human CD40 antigen expressed on the surface of cells expressing human CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, for use in a method for treating a human subject of rheumatoid arthritis, the method comprising administering to said subject an effective amount of the human anti-CD40 monoclonal antibody, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: The invention also provides the use of an effective amount of a human anti-CD40 monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40 in the preparation of a medicament for treating a human subject of rheumatoid arthritis, said monoclonal antibody being free of significant antagonistic activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

Otros aspectos de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas. Other aspects of the invention are presented in the appended claims.

BREVE RESUMEN DE LA REVELACIÓN BRIEF SUMMARY OF THE REVELATION

Se dan a conocer procedimientos para tratar a un ser humano con una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, comprendiendo administrar el sujeto un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que está libre de actividad agonista significativa donde se une a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Se dan a conocer también los procedimientos para inhibir la respuesta de células que expresan antígeno CD40. Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para usar en la presente invención tienen una fuerte afinidad por CD40. Estos anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de unión específica a antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana. Están libres de actividad agonista significativa pero presentan actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en células humanas. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo presentan actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en células presentadoras de antígenos tales como células B. Methods for treating a human being with an autoimmune disease and / or an inflammatory disease are disclosed, the subject comprising administering an anti-CD40 antibody or an antigen-binding fragment thereof that is free of significant agonist activity where it binds. to a CD40 antigen in a human cell that expresses CD40. Methods for inhibiting the response of cells expressing CD40 antigen are also disclosed. Anti-CD40 antagonist antibodies suitable for use in the present invention have a strong affinity for CD40. These monoclonal antibodies and antigen binding fragments thereof are capable of specific binding to human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell. They are free of significant agonist activity but exhibit antagonistic activity when they bind to the CD40 antigen in human cells. In one embodiment, the anti-CD40 antibody or fragment thereof exhibits antagonistic activity when they bind to the CD40 antigen in antigen presenting cells such as B cells.

Los anticuerpos antagonistas son especialmente útiles en evitar, mejorar o tratar enfermedades que comprenden un componente autoinmune y/o inflamatorio. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares. Antagonist antibodies are especially useful in preventing, improving or treating diseases that comprise an autoimmune and / or inflammatory component. These diseases include but are not limited to autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE), discoid lupus, lupus nephritis, sarcoidosis, inflammatory arthritis, including, but not limited to, juvenile arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome. , ankylosing spondylitis and gouty arthritis, rejection of an organ or tissue transplant, hyperacute, acute or chronic rejection and / or graft versus host disease, multiple sclerosis, hyper IgE syndrome, polyarteritis nodosa, primary biliary cirrhosis, inflammatory disease of the intestine, Crohn's disease, celiac disease (gluten-sensitive enteropathy), autoimmune hepatitis, pernicious anemia, autoimmune hemolytic anemia, psoriasis, scleroderma, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune thyroiditis, Graves disease, hasimotoid thyroiditis, complex disease immune, chronic fatigue syndrome and immune dysfunction (CFS DI), polymyositis and dermatomyositis, cryoglobulinemia, thrombolysis, cardiomyopathy, pemphigus vulgaris, interstitial pulmonary fibrosis, sarcoidosis, diabetes mellitus Type I and Type II, delayed type hypersensitivity of type 1, 2, 3 and 4, allergy or allergic disorders , unwanted / unwanted immune responses to therapeutic proteins, asthma, Churg-Strauss syndrome (allergic granulomatosis), atopic dermatitis, allergic and irritating contact dermatitis, urticaria, IgE-mediated allergy, atherosclerosis, vaculitis, idiomatic inflammatory myopathies, hemolytic disease , Alzheimer's disease, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, and the like.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

La Figura 1 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas del mAb CHIR-12.12. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº: 2), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº: 2) de la cadena ligera se muestran en la Figura 1A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº: 4), variable (residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4), y constante (residuos 140-469 de SEC ID Nº: 4) de la cadena pesada se muestran en la Figura 1B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la Figura 1B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº: 4. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 se presenta en SEC ID Nº: 5. La Figura 2 muestra la secuencia codificadora para la cadena ligera (Figura 2A; SEC ID Nº: 1) y la cadena pesada (Figura 2B; SEC ID Nº: 3) para el mAb CHIR-12.12. La Figura 3 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb CHIR-5.9. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº: 6), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº: 6) de la cadena ligera se muestran en la Figura 3A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº: 7), variable (residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7), y constante (residuos 145-474 de SEC ID Nº: 7) de la cadena pesada se muestran en la Figura 3B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura 3B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 158 de SEC ID Nº: 7. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAB CHIR-5.9 se presenta en la SEC ID Nº: 8. La Figura 4 muestra la secuencia codificadora (Figura 4A; SEC ID Nº: 9) para la isoforma corta del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4B; SEC ID Nº: 10), y la secuencia codificadora (Figura 4C; SEC ID Nº: 11) para la isoforma larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4D). La Figura 5 muestra la temperatura de fusión de CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH medidas por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Figure 1 shows the amino acid sequences for the light and heavy chains of the CHIR-12.12 mAb. The leading regions (residues 1-20 of SEQ ID NO: 2), variable (residues 21-132 of SEQ ID NO: 2), and constant (residues 133-239 of SEQ ID NO: 2) of the light chain are shown in Figure 1A. The leading regions (residues 1-19 of SEQ ID NO: 4), variable (residues 20-139 of SEQ ID NO: 4), and constant (residues 140-469 of SEQ ID NO: 4) of the heavy chain are shown in Figure 1B. The alternative constant region for the CHIR-12.12 mAb heavy chain shown in Figure 1B reflects a substitution of an alanine residue for a serine residue at position 153 of SEQ ID NO: 4. The complete sequence for this heavy chain variant of the CHIR-12.12 mAb is presented in SEQ ID NO: 5. Figure 2 shows the coding sequence for the light chain (Figure 2A; SEQ ID NO: 1) and the heavy chain (Figure 2B; SEQ ID NO: 3) for the CHIR-12.12 mAb. Figure 3 shows the amino acid sequences for the light and heavy chains of the CHIR-5.9 mAb. The leading regions (residues 1-20 of SEQ ID NO: 6), variable (residues 21-132 of SEQ ID NO: 6), and constant (residues 133-239 of SEQ ID NO: 6) of the light chain are shown in Figure 3A. The leading regions (residues 1-19 of SEQ ID NO: 7), variable (residues 20-144 of SEQ ID NO: 7), and constant (residues 145-474 of SEQ ID NO: 7) of the heavy chain are shown in Figure 3B. The alternative constant region for the CHIR-5.9 mAb heavy chain shown in Figure 3B reflects a substitution of an alanine residue with a serine residue at position 158 of SEQ ID NO: 7. The complete sequence for this heavy chain variant of mAB CHIR-5.9 is presented in SEQ ID NO: 8. Figure 4 shows the coding sequence (Figure 4A; SEQ ID NO: 9) for the short isoform of human CD40 (amino acid sequence shown in Figure 4B; SEC ID No.: 10), and the coding sequence (Figure 4C; SEQ ID NO: 11) for the long isoform of human CD40 (amino acid sequence shown in Figure 4D). Figure 5 shows the melting temperature of CHIR-12.12 in formulations of different pH measured by differential scanning calorimetry (DSC).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DETAILED DESCRIPTION

La presente revelación se refiere a procedimientos para tratar enfemedades autoinmunes y antinflamatorias, usando anticuerpos que tienen una afinidad fuerte por el antígeno de superficie celular CD40. Estos anticuerpos anti-CD40 y fragmentos de unión a anticuerpo de los mismos están libres de actividad agonista significativa cuando se unen a CD40 en células que expresan CD40. The present disclosure relates to methods for treating autoimmune and anti-inflammatory diseases, using antibodies that have a strong affinity for the CD40 cell surface antigen. These anti-CD40 antibodies and antibody binding fragments thereof are free of significant agonist activity when they bind to CD40 in cells expressing CD40.

Los “anticuerpos” y las “inmunoglobulinas” (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión para un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como a otras moléculas análogas a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles aumentados por los mielomas. "Antibodies" and "immunoglobulins" (Igs) are glycoproteins that have the same structural characteristics. While antibodies exhibit binding specificity for an antigen, immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules that lack antigen specificity. Polypeptides of the latter type are produced, for example, at low levels by the lymphatic system and at levels increased by myelomas.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y abarca los anticuerpos totalmente estructurados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (por ejemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, fragmentos divalentes o diabodies), y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores. The term "antibody" is used in the broadest sense and encompasses fully structured antibodies, antibody fragments that can bind to the antigen (eg, Fab ', F' (ab) 2, Fv, single chain antibodies, divalent fragments or diabodies), and recombinant peptides comprising the above.

El término “anticuerpo monoclonal” según se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se dan en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies comprising the population are identical except for the possible mutations that occur in nature. which may be present in smaller amounts.

Los “anticuerpos nativos” y las “inmunoglobulinas nativas” son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras "Native antibodies" and "native immunoglobulins" are usually heterotetrameric glycoproteins of approximately 150,000 daltons, composed of two light chains

(L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene enlaces disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio de variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. (L) identical and two identical heavy chains (H). Each light chain is linked to a heavy chain by a covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each light and heavy chain also has regularly spaced intra-chain disulfide bonds. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at its other end; the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. It is believed that particular amino acid residues form an interface between the variable domains of the light and heavy chains.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración lámina β, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de la lámina β, y en algunos casos forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991) NIH Publ. Nº: 91-3242, Vol. I, páginas 647-669). The term "variable" refers to the fact that certain parts of the variable domains differ widely in sequence between the antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not distributed evenly across the variable domains of the antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions in both light chain and heavy chain domains. The most highly conserved parts of the variable domains are called frame regions (FR). The variable domains of the native light and heavy chains each comprise four FR regions, which largely adopt a β-sheet configuration, connected by three CDRs, which form loops that connect the structure of the β-sheet, and in some cases are part Of the same. The CDRs in each chain are held together in close proximity by the FR regions and, with the CDRs of the other chain, contribute to the formation of the antibody antigen binding site (see Kabat et al. (1991) NIH Publ. Nº: 91-3242, Vol. I, pages 647-669).

Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la unión del receptor de FC (FcR), la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos, la opsonización, la iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y la desgranulación de los mastocitos. Constant domains do not directly participate in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as FC receptor binding (FcR), antibody involvement in antibody-dependent cellular toxicity, opsonization, initiation of complement-dependent cytotoxicity and mast cell degranulation.

El término “región hipervariable” cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) y/o los residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32(H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Los residuos del “marco” o “FR” son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable. The term "hypervariable region" when used herein refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. The hypervariable region comprises amino acid residues of a "complementarity determining region" or "CDR" (ie residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the variable domain of the light chain and 31-35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. , Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) and / or waste from a “hypervariable loop” (ie, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3 ) in the variable domain of the light chain and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the variable domain of the heavy chain; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol 196: 901-917) The residues of the "frame" or "FR" are the residues of the variable domain other than the residues of the hypervariable region.

Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de unión al anticuerpo o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2 y fragmentos Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos lineales (Zapata y col. (1995) Protein Eng. 8(10): 10571062); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún es capaz de formar un entrecruzamiento con el antígeno. "Antibody fragments" comprise a portion of an intact antibody, preferably the antibody binding region or the variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ’, F (ab’) 2 and Fv fragments; divalent fragments; linear antibodies (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8 (10): 10571062); single chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Papain digestion of the antibodies produces two identical antigen-binding fragments, called "Fab" fragments, each with a single antigen-binding site, and a residual "Fc" fragment, whose name reflects their ability to crystallize easily. Pepsin treatment gives an F (ab ’) 2 fragment that has two combination sites with the antigen and is still capable of forming a cross-link with the antigen.

“Fv” es el fragmento mínimo del anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión del antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación, no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura “dimérica” análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo. "Fv" is the minimum antibody fragment that contains a complete antigen recognition and binding site. In a two-chain Fv species, this region is constituted by a dimer of a heavy chain and a light chain variable domain in close association, not covalent. In a single chain Fv species, a heavy chain and a light chain variable domain can be covalently linked by a flexible peptide linker such that light and heavy chains can be associated in a "dimeric" structure analogous to that of a Fv species of two chains. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Together, the six CDRs confer the antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind to the antigen, although with a lower affinity than the complete binding site.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en el presente documento para el Fab’ en el que el(los) residuo(s) cisteína de los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producían originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab ’fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the CH1 domain of the heavy chain that includes one or more cysteines from the hinge region of the antibody. Fab’-SH is the denomination in this document for Fab ’in which the cysteine residue (s) of the constant domains has a free thiol group. F (ab ') 2 antibody fragments were originally produced as pairs of Fab ’fragments that have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

Las “cadenas ligeras” de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa (κ)y lambda (λ), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. The "light chains" of the antibodies (immunoglobulins) of any vertebrate species can be assigned to one of two clearly different types, called kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.

Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras y las configuraciones tridimensionales de las subunidades de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los isotipos diferentes tienen funciones efectoras diferentes. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be assigned to different classes. There are five main classes of human immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM and several of these can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2. The constant domains of the heavy chains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called alpha, delta, epsilon, gamma and mu, respectively. The three-dimensional structures and configurations of the subunits of the different classes of immunoglobulins are well known. Different isotypes have different effector functions. For example, human IgG1 and IgG3 isotypes mediate antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity.

La palabra “marcador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente a los anticuerpos para generar un anticuerpo “marcado”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. The word "marker" when used herein refers to a detectable compound or composition that conjugates directly or indirectly to antibodies to generate a "labeled" antibody. The label can be detectable by itself (for example, radioisotope markers or fluorescent markers) or, in the case of an enzymatic label, it can catalyze the chemical alteration of a compound or substrate composition that is detectable.

El término “antagonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una diana nativa dada a conocer en el presente documento o su transcripción o traducción. The term "antagonist" is used in the broadest sense and includes any molecule that partially or totally blocks, inhibits or neutralizes a biological activity of a native target disclosed herein or its transcription or translation.

“Vehículos” según se usa en el presente documento incluye los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que son no tóxicos para la célula o el mamífero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones usadas. Frecuentemente el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluido el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y Pluronics. La administración “en combinación con” otro u otros agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (al mismo tiempo) y la administración consecutiva en cualquier orden. "Vehicles" as used herein includes pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers, which are non-toxic to the cell or mammal that is exposed thereto in the doses and concentrations used. Frequently the physiologically acceptable vehicle is an aqueous solution of buffered pH. Examples of physiologically acceptable carriers include buffers such as phosphate, citrate, succinate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid; low molecular weight polypeptides (with less than about 10 residues); proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt forming counterions such as sodium; and / or non-ionic surfactants such as TWEEN, polyethylene glycol (PEG) and Pluronics. Administration "in combination with" other or other therapeutic agents includes simultaneous administration (at the same time) and consecutive administration in any order.

Una “célula huésped”, según se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo A "host cell," as used herein, refers to a microorganism.

o a una célula o línea celular de eucariota cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye a la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una célula única puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la original, por las mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. or to a cultured eukaryotic cell or cell line as a unicellular entity that can be used, or has been used, as a receptor for a recombinant vector or other transfer polynucleotides, and includes the progeny of the original cell that has been transfected. It is understood that the progeny of a single cell may not necessarily be completely identical in morphology or in complement of genomic or total DNA to the original, by natural, accidental or deliberate mutations.

“Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y que realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo la función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citolíticas naturales (NK), monocitos, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo las de preferencia las PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Nótese que además de aislar anticuerpos IgG1 e IgG3, tales anticuerpos que median la ADCC pueden generarse modificando una región variable de un anticuerpo que no media la ADCC o un fragmento de región variable formando una región constante del isotipo IgG1 o IgG3. "Human effector cells" are leukocytes that express one or more FcR and that perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcγRIII and perform the effector function of antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural cytolytic cells (NK), monocytes, macrophages, eosinophils and neutrophils, with PBMC and NK cells being preferred. Antibodies that have ADCC activity are typically of the IgG1 or IgG3 isotype. Note that in addition to isolating IgG1 and IgG3 antibodies, such antibodies that mediate ADCC can be generated by modifying a variable region of an antibody that does not mediate ADCC or a variable region fragment forming a constant region of the IgG1 or IgG3 isotype.

Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR de preferencia es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR de preferencia es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye a los receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluidas las variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). Los FcR se recopilan en Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel y col. (1994) Immunomethods 4: 25-34; y de Haas y col. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros FcRs, incluidos los que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col. (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim y col. (1994) J. Immunol. 24: 249 (1994)). The terms "Fc receptor" or "FcR" are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody. The preferred FcR is a native sequence human FcR. In addition, a preferred FcR is one that binds to an IgG antibody (a gamma receptor) and includes the receptors of the subclasses FcγRI, FcγRII and FcγRIII, including allelic variants and alternative splicing forms of these receptors. FcγRII receptors include FcγRIIA (an "activator receptor") and FcγRIIB (an "inhibitor receptor"), which have similar amino acid sequences that differ primarily in their cytoplasmic domains. The FcγRIIA activator receptor contains a tyrosine-based immunoreceptor activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. The FcγRIIB inhibitor receptor contains a tyrosine-based immunoreceptor inhibition (ITIM) motif in its cytoplasmic domain (see Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). FcRs are compiled in Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al. (1994) Immunomethods 4: 25-34; and from Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Other FcRs, including those that will be identified in the future, are covered by the term “FcR” in this document. The term also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117: 587 and Kim et al. (1994) J. Immunol. 24 : 249 (1994)).

Hay varias maneras de producir anticuerpos humanos. Por ejemplo, pueden inmortalizarse células secretoras por medio de la infección con el virus de Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de clonar y usualmente producen sólo rendimientos relativamente bajos de inmunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100: 540). En el futuro, posiblemente podría lograrse la inmortalización de células B humanas introduciendo una combinación definida de genes transformadores. Una posibilidad tal se destaca por medio de una reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica de telomerasa junto con la oncoproteína grande de SV40 y un alelo oncogénico de H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica de células fibroblásticas y epiteliales humanas normales (Hahn y col. (1999) Nature 400: 464-468). Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. There are several ways to produce human antibodies. For example, secretory cells can be immortalized by infection with the Epstein-Barr virus (EBV). However, EBV infected cells are difficult to clone and usually produce only relatively low immunoglobulin yields (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100: 540). In the future, the immortalization of human B cells could possibly be achieved by introducing a defined combination of transforming genes. Such a possibility is highlighted by a recent demonstration that the expression of the telomerase catalytic subunit together with the large SV40 oncoprotein and an H-ras oncogenic allele resulted in the tumorigenic conversion of normal human fibroblast and epithelial cells ( Hahn et al. (1999) Nature 400: 464-468). It is now possible to produce transgenic animals (eg, mice) that are capable, after immunization, of producing a repertoire of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production (Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol.

13: 65-93; Fishwild y col. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 845-851; Mendez y col. (1997) Nat. Genet. 13: 65-93; Fishwild et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 845-851; Mendez et al. (1997) Nat. Genet.

15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727; recopilado en Little y col. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de unión de cadenas pesadas (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555). La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas humanas de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío con antígenos (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258). Mendez y col. (1997) (Nature Genetics 15: 146156) han generado una línea de ratones transgénicos que, cuando se desafían con un antígeno, generan anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Esto se logró por la integración en la línea germinal de loci megabase de cadenas pesadas y cadenas ligeras humanas en los ratones con deleción en el segmento endógeno JH como se describió anteriormente. Estos ratones (tecnología XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, California)) albergan 1.020 kb del locus de cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes de VH, regiones DH y JH completas, y tres regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb del locus κ humano que contiene 32 genes de Vκ, segmentos Jκ y genes de Cκ. Los anticuerpos producidos en estos ratones se asemejan mucho a los que se observan en seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reorganización genética, la estructura y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan de preferencia sobre anticuerpos endógenos por deleción en el segmento endógeno que evita la reorganización genética en el locus murino. Tales ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés particular. 15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97: 722-727; compiled in Little et al. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). For example, it has been described that homozygous deletion of the heavy chain (JH) binding region of the antibody in chimeric mice and germline mutants results in complete inhibition of endogenous antibody production (Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555). Transfer of the set of human germline immunoglobulin genes in such germline mutant mice results in the production of human antibodies after challenge with antigens (Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255-258). Mendez et al. (1997) (Nature Genetics 15: 146156) have generated a line of transgenic mice that, when challenged with an antigen, generate fully human antibodies of high affinity. This was achieved by the integration in the germline of the megabase heavy chain and human light chain loci in mice with deletion in the endogenous JH segment as described above. These mice (XenoMouse® II technology (Abgenix; Fremont, California)) house 1,020 kb of the human heavy chain locus that contains approximately 66 VH genes, complete DH and JH regions, and three different constant regions, and also houses 800 kb of the Human κ locus containing 32 Vκ genes, Jκ segments and Cκ genes. The antibodies produced in these mice closely resemble those seen in humans in all aspects, including genetic reorganization, structure and repertoire. Human antibodies are preferably expressed on endogenous antibodies by deletion in the endogenous segment that prevents genetic reorganization in the murine locus. Such mice can be immunized with an antigen of particular interest.

Los sueros de tales animales inmunizados pueden examinarse para reactividad de anticuerpo frente al antígeno inicial. Los linfocitos pueden aislarse de ganglios linfáticos o de células del bazo y además pueden seleccionarse para células B seleccionando las células CD138 negativas y CD19 positivas. En un aspecto, tales cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas como se detalló anteriormente. Sera from such immunized animals can be examined for antibody reactivity against the initial antigen. Lymphocytes can be isolated from lymph nodes or spleen cells and can also be selected for B cells by selecting CD138 negative and CD19 positive cells. In one aspect, such B-cell cultures (BCC) can be fused to myeloma cells to generate hybridomas as detailed above.

En otro aspecto, tales cultivos de células B pueden seleccionarse además para reactividad frente al antígeno inicial, de preferencia. Tal selección incluye ELISA con la proteína diana/antígeno, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos que se unen al antígeno de interés, y unión in vitro a células CHO u otras células transfectadas de manera transitoria que expresan el antígeno diana. In another aspect, such B-cell cultures may also be selected for reactivity against the initial antigen, preferably. Such selection includes ELISA with the target protein / antigen, a competition assay with known antibodies that bind the antigen of interest, and in vitro binding to CHO cells or other transiently transfected cells expressing the target antigen.

La presente revelación se refiere a composiciones y procedimientos para tratar sujetos humanos que tienen enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias. Los procedimientos implican el tratamiento con un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, en donde la administración del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno promueve una respuesta terapéutica positiva en el paciente que se somete a este procedimiento de terapia. Los procedimientos y composiciones son especialmente útiles en tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, y similares. Adicionalmente, estos anticuerpos anti-CD40 antagonistas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos anti-CD40 antagonistas son especialmente útiles entratar enfermedades asociadas con inflamación, incluyendo pero no limitadas a hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas (véanse por ejemplo, Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US 2002/0119151 y Koren y col. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares. The present disclosure relates to compositions and procedures for treating human subjects who have autoimmune diseases and / or inflammatory diseases. The methods involve treatment with an anti-CD40 antibody described herein, or one of its antigen binding fragments, wherein administration of the antibody or its antigen binding fragment promotes a positive therapeutic response in the patient who is undergo this therapy procedure. The procedures and compositions are especially useful in treating diseases that include, but are not limited to, autoimmune diseases, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus discoid, lupus nephritis, sarcoidosis, inflammatory arthritis, including, but not limited to, juvenile arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, ankylosing spondylitis and gouty arthritis, rejection of an organ or tissue transplant, hyperacute, acute or chronic rejection and / or graft versus host disease, multiple sclerosis, hyper IgE syndrome, polyarteritis nodosa, primary biliary cirrhosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, celiac disease (gluten sensitivity enteropathy), autoimmune hepatitis, pernicious anemia, autoimmune hemolytic anemia, psoriasis, scleroderma, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune thyroiditis, disease of Graves, hasimotoid thyroiditis, complex disease in mune, chronic fatigue syndrome and immune dysfunction (SFCDI), polymyositis and dermatomyositis, cryoglobulinemia, thrombolysis, cardiomyopathy, pemphigus vulgaris, interstitial pulmonary fibrosis, sarcoidosis, Type I and Type II diabetes mellitus, and the like. Additionally, these anti-CD40 antagonist antibodies and antigen-binding fragments thereof anti-CD40 antagonists are especially useful for diseases associated with inflammation, including but not limited to delayed type hypersensitivity of type 1, 2, 3 and 4, allergy. or allergic disorders, unwanted / unwanted immune responses to therapeutic proteins (see, for example, US Patent Application No. US 2002/0119151 and Koren et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349- 60), asthma, Churg-Strauss syndrome (allergic granulomatosis), atopic dermatitis, allergic and irritant contact dermatitis, urticaria, IgE-mediated allergy, atherosclerosis, vaculitis, idiomatic inflammatory myopathies, hemolytic disease, Alzheimer's disease, inflammatory demyelinating polyneuropathy Chronic, and the like.

Los anticuerpos anti-CD40 adecuados para uso en los procedimientos de la invención se unen específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y están exentos de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Estos anticuerpos anti-CD40 y sus fragmentos de unión al antígeno se denominan en el presente documento “anticuerpos anti-CD40 antagonistas”. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 totalmente humanos que se describen a continuación y los anticuerpos monoclonales tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se describen a continuación también. Anti-CD40 antibodies suitable for use in the methods of the invention specifically bind to the human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell and are free of significant agonist activity, but exhibit antagonistic activity when they bind to the CD40 antigen in a cell. human expressing CD40. These anti-CD40 antibodies and their antigen binding fragments are referred to herein as "anti-CD40 antagonist antibodies." Such antibodies include, but are not limited to, the fully human CHIR-5.9 and CHIR-12.12 monoclonal antibodies described below and the monoclonal antibodies have the binding characteristics of the CHIR-5.9 and CHIR-12.12 monoclonal antibodies described. then too.

Los anticuerpos que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIRAntibodies that have the binding characteristics of CHIR monoclonal antibodies

5.9 y CHIR-12.12 incluyen anticuerpos que interfieren de manera competitiva con la unión a CD40 y/o se unen a los mismos epítopos que CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Un experto podría determinar si un anticuerpo interfiere de manera competitiva con CHIR-5.9 o CHIR-12.12 usando procedimientos convencionales. 5.9 and CHIR-12.12 include antibodies that interfere competitively with binding to CD40 and / or bind to the same epitopes as CHIR-5.9 and CHIR-12.12. An expert could determine whether an antibody interferes competitively with CHIR-5.9 or CHIR-12.12 using conventional procedures.

Cuando estos anticuerpos se unen a CD40 expuesto en la superficie de las células humanas, tales como células B humanas, células T, células dendríticas, células endoteliales, plaquetas activadas, células del músculo liso vasculares inflamadas, eosinófilos, membranas sinoviales, fibroblastos dérmicos y similares, los anticuerpos están exentos de actividad agonista importante; en algunas realizaciones, su unión a CD40 expuesto en la superficie de las células humanas da como resultado la inhibición de la proliferación y la diferenciación de estas células humanas. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales que pueden exhibir actividad antagonista hacia las células humanas normales y malignas que expresan el antígeno de superficie celular CD40. When these antibodies bind to exposed CD40 on the surface of human cells, such as human B cells, T cells, dendritic cells, endothelial cells, activated platelets, inflamed vascular smooth muscle cells, eosinophils, synovial membranes, dermal fibroblasts and the like , the antibodies are exempt from significant agonist activity; In some embodiments, their binding to exposed CD40 on the surface of human cells results in the inhibition of proliferation and differentiation of these human cells. Accordingly, anti-CD40 antagonist antibodies suitable for use in the methods of the invention include monoclonal antibodies that can exhibit antagonistic activity towards normal and malignant human cells that express the CD40 cell surface antigen.

Anticuerpos anti-CD40 antagonistas Anti-CD40 Antagonist Antibodies

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la presente invención. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales anti-CD40 totalmente humanos del isotipo IgG1 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 12.12). Estas líneas celulares se crearon usando esplenocitos de ratones xenotípicos inmunizados que contienen el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena K humana (tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California)). Las células del bazo se fusionaron con las células de mieloma SP2/0 de ratón (Sierra BioSource). Las hibridomas resultantes se subclonaron varias veces para crear las líneas celulares monoclonales estables The monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 represent anti-CD40 antagonist antibodies suitable for use in the methods of the present invention. CHIR-5.9 and CHIR-12.12 antibodies are fully human anti-CD40 monoclonal antibodies of the IgG1 isotype produced from hybridoma cell lines 131.2F8.5.9 (referred to herein as cell line 5.9) and 153.8E2.D10.D6.12.12 (referred to herein as cell line 12.12). These cell lines were created using splenocytes from immunized xenotypic mice containing the human IgG1 heavy chain locus and the human K chain locus (XenoMouse® technology (Abgenix; Fremont, California)). Spleen cells were fused with mouse SP2 / 0 myeloma cells (Sierra BioSource). The resulting hybridomas were subcloned several times to create stable monoclonal cell lines

5.9 y 12.12. Otros anticuerpos de la invención pueden prepararse de manera similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulina humana o por otros procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento. 5.9 and 12.12. Other antibodies of the invention can be prepared similarly using transgenic mice for human immunoglobulin loci or by other methods known in the art and / or described herein.

Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 2 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12), SEC ID Nº: 4 (secuencia completa para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 5 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 presentada en SEC ID Nº: 4, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 153 de SEC ID Nº: 4). Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 1 (secuencia codificadora para la cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 3 (secuencia codificadora para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada del mAb CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 6 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHR-5.9), SEC ID Nº: 7 (secuencia completa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9) y SEC ID Nº: 8 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 presentada en SEC ID Nº: 7, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 158 de SEC ID Nº: 7). Además, los hibridomas que expresan los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se han depositado en la ATCC con una denominación de depósito de patente de PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente. The amino acid sequences for the leader, variable and constant regions for the light chain and heavy chain for the CHIR-12.12 mAb are presented in Figures 1A and 1B, respectively. See also SEQ ID NO: 2 (complete sequence for the CHIR-12.12 mAb light chain), SEQ ID NO: 4 (complete sequence for the CHIR-12.12 mAb heavy chain) and SEQ ID NO: 5 (complete sequence for a heavy chain variant for the CHIR-12.12 mAb presented in SEQ ID NO: 4, where the variant comprises a substitution of the alanine residue with serine at the 153 position of SEQ ID NO: 4). Nucleotide sequences encoding the light chain and heavy chain for the CHIR-12.12 mAb are presented in Figures 2A and 2B, respectively. See also SEQ ID NO: 1 (coding sequence for the light chain for the CHIR-12.12 mAb) and SEQ ID NO: 3 (coding sequence for the heavy chain for the CHIR-12.12 mAb). The amino acid sequences for the leader, variable and constant regions for the light chain and heavy chain of the CHIR-5.9 mAb are presented in Figures 3A and 3B, respectively. See also SEQ ID NO: 6 (complete sequence for the light chain of the CHR-5.9 mAb), SEQ ID NO: 7 (complete sequence for the heavy chain of the CHIR-5.9 mAb) and SEQ ID NO: 8 (complete sequence for a variant of the heavy chain of the CHIR-5.9 mAb presented in SEQ ID NO: 7, where the variant comprises a substitution of the alanine residue for serine at the position of 158 of SEQ ID NO: 7). In addition, the hybridomas expressing the CHIR-5.9 and CHIR-12.12 antibodies have been deposited in the ATCC with a patent deposit designation of PTA-5542 and PTA-5543, respectively.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a CD40 soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular, y desplazan el ligando de CD40 previamente unido, según se determina por ensayos de citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión a CD40 pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 descrito en el documento WO 02/28904. The monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 bind to soluble CD40 in ELISA type assays, prevent binding of the CD40 ligand to the CD40 of the cell surface, and displace the previously bound CD40 ligand, as determined by assays of flow cytometry. The CHIR-5.9 and CHIR-12.12 antibodies compete with each other for binding to CD40 but not with 15B8, the anti-CD40 monoclonal antibody described in WO 02/28904.

Cuando se prueban in vitro los efectos en la proliferación de células B de sujetos humanos normales, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 actúan como anticuerpos anti-CD40 antagonistas. Además, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen fuerte proliferación de linfocitos humanos de sujetos normales. La afinidad de unión de CHIR-5.9 por el CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 es de 5 x 10-10 M, según se determina por medio del ensayo Biacore™. When the effects on B cell proliferation of normal human subjects are tested in vitro, CHIR-5.9 and CHIR-12.12 act as anti-CD40 antagonist antibodies. In addition, CHIR-5.9 and CHIR-12.12 do not induce strong proliferation of human lymphocytes from normal subjects. The binding affinity of CHIR-5.9 for human CD40 is 1.2 x 10-8 M and the binding affinity of CHIR-12.12 is 5 x 10-10 M, as determined by the Biacore ™ assay.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la presente invención exhiben una fuerte afinidad de unión de sitio único por el antígeno CD40 de superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de la invención exhiben una constante de equilibrio de disociación (KD) para CD40 de al menos 10-5 M, al menos 3 X 10-5 M, de preferencia al menos 10-6 M hasta 10-7 M, de más preferencia al menos 10-8 M hasta aproximadamente 10-12 M, medida usando un ensayo convencional tal como Biacore™. El análisis Biacore se conoce en la técnica y se proporcionan detalles en el “BIAapplications handbook”. Los procedimientos descritos en el documento WO 01/27160 pueden usarse para modular la afinidad de unión. Anti-CD40 antagonist antibodies suitable for use in the methods of the present invention exhibit a strong single site binding affinity for the CD40 cell surface antigen. The monoclonal antibodies of the invention exhibit a dissociation equilibrium constant (KD) for CD40 of at least 10-5 M, at least 3 X 10-5 M, preferably at least 10-6 M to 10-7 M, of more preference at least 10-8 M to about 10-12 M, measured using a conventional assay such as Biacore ™. Biacore analysis is known in the art and details are provided in the "BIAapplications handbook". The procedures described in WO 01/27160 can be used to modulate binding affinity.

Se entiende por “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” una glicoproteína transmembranaria que pertenece a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véanse, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº: 5.674.492 y 4.708.871; Stamenkovic y col. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36: 33; Barclay y col. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2ª ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción con cortes y empalmes alternativos de este gen. La primera isoforma (también conocida como la “isoforma larga” o “isoforma 1”) se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEC ID Nº: 12 (informada primero en GenBank con Nº de acceso CAA43045, e identificada como isoforma 1 en GenBank con Nº de acceso NP 001241), codificado por SEC ID Nº: 11 (véase Nº de acceso de GenBank X60592 y NM 001250)), que tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma (también conocida como la “isoforma corta” o “isoforma 2”) se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEC ID Nº: 10 (Nº de acceso de GenBank NP 690593), codificado por SEC ID Nº: 9 (Nº de acceso de GenBank NM 152854)), que también tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. Los polipéptidos precursores de estas dos isoformas de CD40 humano comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos 1-165 de SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 12). El polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en SEC ID Nº: 10) está codificado por una variante de transcripción (SEC ID Nº: 9) que carece de un segmento codificador, que da lugar a un cambio del marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un extremo C terminal más corto y diferente (residuos 166-203 de SEC ID Nº: 10) del que está contenido en la isoforma larga de CD40 (extremo C terminal mostrado en los residuos 166-277 de SEC ID Nº: 12). Para los fines de la presente invención, el término “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” abarca tanto la isoforma corta como la larga de CD40. Los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención se unen a un epítopo de CD40 humano que se encuentra en la misma situación dentro de la isoforma corta o la isoforma larga de este antígeno de superficie celular como se señala a continuación en el presente documento. By "CD40 antigen", "CD40 cell surface antigen", "CD40 receptor" or "CD40" is a transmembrane glycoprotein belonging to the family of tumor necrosis factor (TNF) receptors (see, for example, Patents No. 5,674,492 and 4,708,871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36: 33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2nd ed. ; Academic Press, San Diego)). Two isoforms of human CD40 have been identified, encoded by transcription variants with alternative splices of this gene. The first isoform (also known as the "long isoform" or "isoform 1") is expressed as a 277 amino acid precursor polypeptide (SEQ ID NO: 12 (first reported in GenBank with accession No. CAA43045, and identified as isoform 1 in GenBank with accession number NP 001241), encoded by SEQ ID NO: 11 (see GenBank accession number X60592 and NM 001250)), which has a signal sequence represented by the first 19 residues. The second isoform (also known as the "short isoform" or "isoform 2") is expressed as a 203 amino acid precursor polypeptide (SEQ ID NO: 10 (GenBank Accession No. NP 690593), encoded by SEQ ID NO: 9 (GenBank Accession No. NM 152854)), which also has a signal sequence represented by the first 19 residues. The precursor polypeptides of these two isoforms of human CD40 share in common their first 165 residues (i.e. residues 1-165 of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12). The short isoform precursor polypeptide (shown in SEQ ID NO: 10) is encoded by a transcription variant (SEQ ID NO: 9) that lacks an encoding segment, which results in a change of the translation framework; The resulting CD40 isoform contains a shorter and different C-terminal end (residues 166-203 of SEQ ID NO: 10) than is contained in the long CD40 isoform (C-terminal end shown in residues 166-277 of SEQ ID Nº: 12). For the purposes of the present invention, the term "CD40 antigen", "cell surface CD40 antigen", "CD40 receptor" or "CD40" encompasses both the short and long isoforms of CD40. The anti-CD40 antibodies of the present invention bind to a human CD40 epitope that is in the same situation within the short isoform or the long isoform of this cell surface antigen as noted hereinbelow.

El antígeno CD40 está expuesto en la superficie de una diversidad de tipos celulares, según se describe en otras partes en el presente documento. Por “expuesto en la superficie” y “expresado en la superficie” se entiende que todo o una parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la célula. El antígeno CD40 expuesto o expresado puede estar total o parcialmente glicosilado. The CD40 antigen is exposed on the surface of a variety of cell types, as described elsewhere herein. By "exposed on the surface" and "expressed on the surface" is meant that all or part of the CD40 antigen is exposed to the outside of the cell. The exposed or expressed CD40 antigen may be totally or partially glycosylated.

Por “actividad agonista” se entiende que la sustancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un receptor en una célula e inicia una reacción o actividad que es similar a la misma que se inicia por el ligando natural del receptor. Un agonista de CD40 induce, pero no se limita a, cualquiera o todas las siguientes respuestas: proliferación y diferenciación de células, regulación ascendente de la adhesión intercelular por medio de moléculas tales como ICAM-1, E-selectina, VCAM y similares; secreción de citoquinas proinflamatorias tales como IL1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF y similares, transducción de señales por el receptor de CD40 por rutas tales como TRAF (por ejemplo, TRAF2 y/o TRAF3), MAP quinasas tales como N1K (quinasa inductora de NF-κB), quinasas I-kappa B (IKK α/β), factor de transcripción NF-κB, Ras y la ruta MEK/ERK, la ruta PI3K/Akt, la ruta P38 MAPK, y similares; transducción de una señal antiapoptótica por moléculas tales como XIAP, Mcl-1, BCLx, y similares; generación de células de memoria B y/o de células de memoria T; producción de anticuerpos de células B; cambio de isotipo de células B; regulación ascendente de expresión en la superficie celular de MHC de clase II y de CD80/86 y similares. Por “actividad antagonista” se entiende que la sustancia funciona como un antagonista. Por ejemplo, un antagonista de CD40 evita o reduce la inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del receptor de CD40 a un ligando agonista, en particular CD40L. El antagonista puede reducir la inducción de una o más de las respuestas a la unión de agonistas en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, de preferencia 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, de más preferencia 70 %, 80 %, 85 % y de la mayor preferencia 90 %, 95 %, 99 % ó 100 %. Los procedimientos para medir la especificidad de unión y la actividad de antagonista de anticuerpos anti-CD40 y ligandos de CD40 son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión competitiva estándar, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por las células B, ensayos de proliferación de células B, ensayos de proliferación de células B análogos a Banchereau, ensayos de células T ayudantes para la producción de anticuerpos, ensayos de proliferación de células con coestimulación y ensayos para regulación ascendente de marcadores de activación de células B. By "agonist activity" is meant that the substance functions as an agonist. An agonist combines with a receptor in a cell and initiates a reaction or activity that is similar to that initiated by the receptor's natural ligand. A CD40 agonist induces, but is not limited to, any or all of the following responses: cell proliferation and differentiation, ascending regulation of intercellular adhesion by means of molecules such as ICAM-1, E-selectin, VCAM and the like; secretion of proinflammatory cytokines such as IL1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF and the like, signal transduction by the CD40 receptor by routes such as TRAF (eg, TRAF2 and / or TRAF3), MAP kinases such as N1K (NF-κB inducing kinase), I-kappa B kinase (IKK α / β), transcription factor NF-κB, Ras and the MEK / ERK route, the PI3K / Akt route, the P38 MAPK route, and the like; transduction of an antiapoptotic signal by molecules such as XIAP, Mcl-1, BCLx, and the like; generation of memory cells B and / or memory cells T; B cell antibody production; B cell isotype change; ascending regulation of cell surface expression of MHC class II and CD80 / 86 and the like. By "antagonist activity" is meant that the substance functions as an antagonist. For example, a CD40 antagonist prevents or reduces the induction of any of the responses induced by the binding of the CD40 receptor to an agonist ligand, in particular CD40L. The antagonist may reduce the induction of one or more of the agonist binding responses by 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferably 40%, 45%, 50 %, 55%, 60%, more preferably 70%, 80%, 85% and most preferably 90%, 95%, 99% or 100%. Methods for measuring binding specificity and antagonist activity of anti-CD40 antibodies and CD40 ligands are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, standard competitive binding assays, secretion control assays. of immunoglobulins by B cells, B cell proliferation assays, B-cell proliferation assays analogous to Banchereau, T-cell helper assays for antibody production, costimulation cell proliferation assays and assays for ascending regulation of markers of B cell activation

Por actividad antagonista “significativa” se entiende una actividad agonista de al menos 30 %, 35 %, 40%, 45 %, 50%, 60%,70 %, 75%, 80 %, 85%, 90 %, 95%ó 100 % superior a la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un bioensayo tal como un ensayo de respuesta de células B. De preferencia, la actividad agonista “significativa” es una actividad agonista que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la respuesta de células B de interés es la proliferación de células B, la actividad agonista “significativa” sería la inducción de un nivel de proliferación de células B que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que el nivel de proliferación de células B inducido por una sustancia neutra o un control negativo. En una realización, una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1, que no se une a CD40 sirve como el control negativo. Una sustancia “exenta de actividad agonista significativa” exhibirá una actividad agonista de no más que aproximadamente 25 % mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra By "significant" antagonist activity is meant an agonist activity of at least 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100% higher than the agonist activity induced by a neutral substance or a negative control as measured in a bioassay such as a B-cell response assay. Preferably, the "significant" agonist activity is an agonist activity that is at least 2 times greater or at least 3 times greater than the agonist activity induced by a neutral substance or a negative control as measured in the assay of a B cell response. Therefore, for example, when the B cell response of interest is the B cell proliferation, the “significant” agonist activity would be the induction of a level of B cell proliferation that is at least 2 times greater or at least 3 times greater than the level of B cell proliferation induced by a neutral substance or a negative control In one embodiment, a non-specific immunoglobulin, for example IgG1, that does not bind to CD40 serves as the negative control. A substance "free of significant agonist activity" will exhibit an agonist activity of no more than about 25% greater than the agonist activity induced by a neutral substance

o un control negativo, de preferencia no más que aproximadamente 20 % mayor, 15 % mayor, 10 % mayor, 5 % mayor, 1 % mayor, 0,5 % mayor, o incluso no más que aproximadamente 0,1 % mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un ensayo de una respuesta de células B. Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en los procedimientos de la presente invención están exentos de actividad agonista significativa como se señaló anteriormente cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana. En una realización de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en una respuesta de células B. En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en ensayos de más de una respuesta de células B (por ejemplo, proliferación y diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de anticuerpos). or a negative control, preferably no more than about 20% greater, 15% greater, 10% greater, 5% greater, 1% greater, 0.5% greater, or even no more than approximately 0.1% greater than the agonist activity induced by a neutral substance or a negative control as measured in an assay of a B-cell response. Anti-CD40 antagonist antibodies useful in the methods of the present invention are free of significant agonist activity as noted above when bind to a CD40 antigen in a human cell. In one embodiment of the invention, the anti-CD40 antagonist antibody is free of significant agonist activity in a B cell response. In another embodiment of the invention, the anti-CD40 antagonist antibody is free of significant agonist activity in assays of more than a B cell response (for example, proliferation and differentiation, or proliferation, differentiation and antibody production).

Según se usa en el presente documento “anticuerpo anti-CD40” abarca cualquier anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno CD40 de superficie celular, incluidos anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, y sus fragmentos tales como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo anti-CD40 original. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti-CD40 antagonistas que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos anteriormente. As used herein "anti-CD40 antibody" encompasses any antibody that specifically recognizes the cell surface CD40 antigen, including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, and their fragments such as Fab, F (ab ') 2, Fv, and other fragments that retain the antigen binding function of the original anti-CD40 antibody. Of particular interest to the present invention are anti-CD40 antagonist antibodies that share the binding characteristics of the CHIR-5.9 and CHIR-12.12 monoclonal antibodies described above.

Por consiguiente, además de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12, otros anticuerpos que serían útiles en llevar a la práctica la invención descrita en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: (1) los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 12.12), depositadas en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 y Depósito de Patente Nº PTA-5543, respectivamente; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 4, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 5, ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4, y por ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 5; (3) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 7, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 8, ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº:6 y SEC ID Nº: 7, y por ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 3, y ambas secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº: y SEC ID Nº: 3; (5) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma Therefore, in addition to the monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12, other antibodies that would be useful in carrying out the invention described herein include, but are not limited to, the following: (1) monoclonal antibodies produced by the hybridoma cell lines designated 131.2F8.5.9 (referred to herein as cell line 5.9) and 153.8E2.D10.D6.12.12 (referred to herein as line cell 12.12), deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 and Patent Deposit No. PTA-5543, respectively; (2) a monoclonal antibody comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2, the sequence shown in SEQ ID NO: 4, the sequence shown in SEQ ID NO: 5, both sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, and for both sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5; (3) a monoclonal antibody comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 6, the sequence shown in SEQ ID NO: 7, the sequence shown in SEQ ID NO: 8, both sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and for both sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8; (4) a monoclonal antibody having an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.: 3, and both nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: and SEQ ID NO: 3; (5) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line

5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 10 5.9 or the hybridoma cell line 12.12; (6) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10

: o SEC ID Nº: 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que se une al antígeno or SEQ ID NO: 12; (7) a monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody CHIR-5.9 or CHIR-12.12 in a competitive binding assay; and (8) a monoclonal antibody that is a fragment of the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9 that binds to the antigen

: o los anticuerpos monoclonales anteriores en los puntos anteriores (1)-(7), en los que el fragmento retiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.Aquellos expertos en la técnica reconocen que los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos adecuados para usar en los procedimientos revelados en el presente documento incluyen anticuerpos anti-CD-40 antagonistas y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se producen recombinantemente usando procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos más adelante, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se han producido recombinantemente. or the previous monoclonal antibodies in the above points (1) - (7), in which the fragment retains the ability to specifically bind to the human CD40 antigen. Those skilled in the art recognize that antagonist anti-CD40 antibodies and fragments of Antigen binding of these antibodies suitable for use in the methods disclosed herein include anti-CD-40 antagonist antibodies and antigen binding fragments thereof that are recombinantly produced using methods well known in the art and described below, and include, for example, monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 that have been recombinantly produced.

Producción de anticuerpos anti-CD40 Production of anti-CD40 antibodies

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas para usar en la presente invención pueden producirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. En general, primero se usa una solución que contiene el antígeno CD40 para inmunizar a un animal adecuado, de preferencia un ratón, rata, conejo o cabra. Los conejos o cabras son de preferencia para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero que puede obtenerse y a la disponibilidad de anticuerpos anti conejo y anti cabra marcados. Anti-CD40 antagonist antibodies for use in the present invention can be produced using any of the methods well known to those skilled in the art. In general, a solution containing the CD40 antigen is first used to immunize a suitable animal, preferably a mouse, rat, rabbit or goat. Rabbits or goats are preferably for the preparation of polyclonal sera due to the volume of serum that can be obtained and the availability of labeled anti-rabbit and anti-goat antibodies.

Pueden prepararse sueros policlonales en un animal transgénico, de preferencia un ratón que lleve loci de inmunoglobulina humana. En una realización de preferencia, se usan células Sf9 que expresan CD40 como el inmunógeno. La inmunización también puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la solución que contiene el antígeno en solución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando por vía intravenosa la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 µg/inyección. La inmunización se estimula por lo general 2-6 semanas más tarde con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, de preferencia usando adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, pueden también generarse anticuerpos mediante inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica, que para los fines de esta invención se considera equivalente a la inmunización in vivo. Los antisueros policlonales se obtienen por extracción de sangre del animal inmunizado en un recipiente de vidrio o de plástico, incubando la sangre a 25 ºC durante una hora, seguido por la incubación a 4 ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g x durante 10 minutos). Pueden obtenerse aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre de conejos. Polyclonal sera can be prepared in a transgenic animal, preferably a mouse carrying human immunoglobulin loci. In a preferred embodiment, Sf9 cells expressing CD40 are used as the immunogen. Immunization can also be carried out by mixing or emulsifying the solution containing the antigen in saline solution, preferably in an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, and injecting intravenously the mixture or emulsion parenterally (usually subcutaneously or intramuscular). Typically a dose of 50-200 µg / injection is sufficient. Immunization is usually stimulated 2-6 weeks later with one or more injections of the protein in saline, preferably using incomplete Freund's adjuvant. Alternatively, antibodies can also be generated by in vitro immunization using methods known in the art, which for the purposes of this invention is considered equivalent to immunization in vivo. Polyclonal antisera are obtained by extracting blood from the immunized animal in a glass or plastic container, incubating the blood at 25 ° C for one hour, followed by incubation at 4 ° C for 2-18 hours. The serum is recovered by centrifugation (for example, 1,000 g x for 10 minutes). Approximately 20-50 ml can be obtained by drawing blood from rabbits.

La producción de células Sf9 (Spodoptera frugiperda) se da a conocer en la Patente de EEUU Nº 6.004.552. En resumen, se combinaron secuencias que codifican CD40 humano en un baculovirus usando vectores de transferencia. Los plásmidos se cotransfectaron con ADN de baculovirus de tipo silvestre en células Sf9. Las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante se identificaron y se purificaron como clones. The production of Sf9 cells (Spodoptera frugiperda) is disclosed in US Patent No. 6,004,552. In summary, sequences encoding human CD40 in a baculovirus were combined using transfer vectors. Plasmids were cotransfected with wild-type baculovirus DNA in Sf9 cells. Sf9 cells infected with recombinant baculovirus were identified and purified as clones.

De preferencia el anticuerpo es monoclonal en la naturaleza. Por “anticuerpo monoclonal” se entiende un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan naturalmente que puedan estar presentes en cantidades menores. El término no está limitado con respecto a la especie o la fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico, es decir, el antígeno CD40 de superficie celular en la presente invención. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo ya que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que es necesaria la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan según la presente invención pueden producirse por el procedimiento de hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256: 495, Preferably the antibody is monoclonal in nature. By "monoclonal antibody" is meant an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in smaller amounts. The term is not limited with respect to the species or source of the antibody. The term encompasses complete immunoglobulins, as well as fragments such as Fab, F (ab ') 2, Fv and others that retain the antigen binding function of the antibody. Monoclonal antibodies are very specific, being directed against a single antigenic site, that is, the cell surface CD40 antigen in the present invention. In addition, unlike conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant in the antigen. The "monoclonal" modifier indicates the character of the antibody since it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be construed as producing the antibody by any particular procedure. For example, the monoclonal antibodies used according to the present invention can be produced by the hybridoma method first described by Kohler et al. (1975) Nature 256: 495,

o pueden producirse por los procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” pueden aislarse también de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628; Marks y col. (1991) J Mol. Biol. 222: 581-597; y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548. or they can be produced by recombinant DNA methods (see, for example, US Patent No. 4,816,567). "Monoclonal antibodies" can also be isolated from phage antibody libraries using the techniques described in, for example, Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1991) J Mol. Biol. 222: 581-597; and in U.S. Patent No. 5,514,548.

Por “epítopo” se entiende la parte de la molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos lineales de aminoácidos (es decir, los residuos en el epítopo están organizados consecutivamente uno después de otro en forma lineal), residuos no lineales (a los que se hace referencia en el presente documento como “epítopos no lineales”; estos epítopos no están organizados de forma consecutiva), o residuos de aminoácidos tanto lineales como no lineales. By "epitope" is meant the part of the antigenic molecule for which an antibody is produced and to which the antibody will bind. The epitopes may comprise linear amino acid residues (ie, residues in the epitope are sequentially organized one after the other in a linear fashion), nonlinear residues (referred to herein as "nonlinear epitopes"; these epitopes are not organized consecutively), or amino acid residues both linear and non-linear.

La expresión “epítopo del antígeno CD40” según se usa en el presente documento se refiere a una molécula de estructura tridimensional (bien lineal o bien conformacional) que es capaz de tener inmunorreactividad con los anticuerpos monoclonales anti-CD40 de esta invención, excluyendo el propio antígeno CD40. Los epítopos del antígeno CD40 pueden comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno CD40), o sus combinaciones. Los miméticos de oligopéptidos adecuados se describen, entre otros, en la solicitud de PCT US 91/04282. The term "epitope of the CD40 antigen" as used herein refers to a molecule of three-dimensional structure (either linear or conformational) that is capable of immunoreactivity with the anti-CD40 monoclonal antibodies of this invention, excluding itself CD40 antigen. The epitopes of the CD40 antigen may comprise proteins, protein fragments, peptides, carbohydrates, lipids and other molecules, but for the purposes of the present invention are more commonly proteins, short oligopeptides, oligopeptide mimetics (i.e., organic compounds that mimic the antibody binding properties of the CD40 antigen), or combinations thereof. Suitable oligopeptide mimetics are described, among others, in PCT application US 91/04282.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento de Kohler y col. (1975) Nature 256: 495-496, o una modificación del mismo. Típicamente, se inmuniza un ratón con una solución que contiene el antígeno. La inmunización puede llevarse a cabo mezclando Monoclonal antibodies can be prepared using the method of Kohler et al. (1975) Nature 256: 495-496, or a modification thereof. Typically, a mouse is immunized with a solution containing the antigen. Immunization can be carried out by mixing

o emulsionando la solución que contiene el antígeno en solución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral. Puede usarse cualquier procedimiento de inmunización conocido en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales de la invención. Tras la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y de manera opcional, varios ganglios linfáticos grandes) y se separan las células individuales. Las células del bazo pueden examinarse aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de interés. Las células B que expresan la inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan por aclarado. A continuación se induce la fusión de las células B resultantes, o de todas las células separadas del bazo, con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo. Las células resultantes se plaquean por dilución en serie y se realiza el ensayo de producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados). A continuación se cultivan los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal (mAb) seleccionado in vitro (por ejemplo, en frascos de cultivo tisular o reactores de fibras huecas), o in vivo (como ascitis en ratones). or by emulsifying the solution containing the antigen in saline, preferably in an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, and injecting the mixture or emulsion parenterally. Any immunization procedure known in the art can be used to obtain monoclonal antibodies of the invention. After immunization of the animal, the spleen is removed (and optionally, several large lymph nodes) and the individual cells are separated. Spleen cells can be examined by applying a suspension of cells to a plate or well coated with the antigen of interest. B cells expressing the membrane-bound immunoglobulin specific for the antigen bind to the plate and are not cleared. The fusion of the resulting B cells, or all cells separated from the spleen, is then induced with myeloma cells to form hybridomas, and cultured in a selective medium. The resulting cells are plated by serial dilution and the production assay of antibodies that specifically bind the antigen of interest (and that do not bind unrelated antigens) is performed. Hybridomas secreting the selected monoclonal antibody (mAb) are then cultured in vitro (for example, in tissue culture bottles or hollow fiber reactors), or in vivo (as ascites in mice).

Cuando los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención deben prepararse usando procedimientos de ADN recombinante, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma descritas en el presente documento sirven como una fuente de preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en las células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de recopilación sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 y Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151. Como una alternativa al uso de hibridomas, puede producirse anticuerpo en una línea celular tal como una línea celular CHO, como se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 5.545.403; 5.545.405; y 5.998.144. En resumen, la línea celular se transfecta con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en vectores separados, pueden producirse anticuerpos quiméricos. Otra ventaja es la glicosilación correcta del anticuerpo. When the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention must be prepared using recombinant DNA methods, the DNA encoding the monoclonal antibodies is easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, by the use of oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes that encode the light and heavy chains of murine antibodies). The hybridoma cells described herein serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in expression vectors, which are then transfected into host cells such as E. coli cells, simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells or non-myeloma cells otherwise produce immunoglobulin protein, to obtain the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. Collection articles on recombinant expression in DNA bacteria encoding the antibody include Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 and Phickthun (1992) Immunol. Revs 130: 151. As an alternative to the use of hybridomas, antibody can be produced in a cell line such as a CHO cell line, as disclosed in US Pat. Nos. 5,545,403; 5,545,405; and 5,998,144. In summary, the cell line is transfected with vectors capable of expressing a light chain and a heavy chain, respectively. By transfecting the two proteins into separate vectors, chimeric antibodies can be produced. Another advantage is the correct glycosylation of the antibody.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo CHIRIn some embodiments, the anti-CD40 antagonist antibody, for example the CHIR antibody

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se produce en células CHO usando el sistema de expresión de genes GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), que usa glutamina sintetasa como un marcador. Véase también las Patentes de EEUU Nº 5.122.464; 5.591.639; 5.658.759; 5.770.359; 5.827.739; 5.879.936; 5.891.693; y 5.981.216. 12.12 or CHIR-5.9, or its antigen-binding fragment is produced in CHO cells using the GS gene expression system (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), which uses glutamine synthetase as a marker. See also US Patent No. 5,122,464; 5,591,639; 5,658,759; 5,770,359; 5,827,739; 5,879,936; 5,891,693; and 5,981,216.

Los anticuerpos monoclonales contra CD40 son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las secciones dedicadas a antígenos de células B en McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, Nueva York); Patentes de EEUU Nº 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; documento WO 00/63395; documentos de Publicación Internacional Nº WO 02/28905 y WO 02/28904; Gordon y col. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle y col. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark y col. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon y col. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang y col. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan y col. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau y col. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3: 8; y Banchereau y col. (1991) Science 251: 70. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti-CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIRMonoclonal antibodies against CD40 are known in the art. See, for example, sections dedicated to B cell antigens in McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York); U.S. Patent No. 5,674,492; 5,874,082; 5,677,165; 6,056,959; WO 00/63395; International Publication Documents No. WO 02/28905 and WO 02/28904; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark et al. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang et al. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol Spectrum 3: 8; and Banchereau et al. (1991) Science 251: 70. Of particular interest to the present invention are the anti-CD40 antagonist antibodies disclosed herein that share the binding characteristics of the monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR

12.12 descritos anteriormente. 12.12 described above.

Adicionalmente, la expresión “anticuerpo anti-CD40” según se usa en el presente documento abarca anticuerpos quiméricos anti-CD40; tales anticuerpos anti-CD40 quiméricos para uso en los procedimientos de la invención tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento. Por anticuerpos “quiméricos” se entiende anticuerpos que de más preferencia se obtienen usando técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinante y que comprenden tanto componentes humanos (incluidas especies inmunológicamente “relacionadas”, por ejemplo, chimpancé) como no humanos. Rituxan® es un ejemplo de un anticuerpo quimérico con una región variable murina y una región constante humana. Para propósitos de la presente invención, la región constante del anticuerpo quimérico es de la mayor preferencia sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico de la mayor preferencia se obtiene de una fuente no humana y tiene la especificidad antigénica deseada para el antígeno CD40 de superficie celular. La fuente no humana puede ser cualquier fuente de vertebrado que pueda usarse para generar anticuerpos contra un antígeno CD40 humano de superficie celular o material que comprenda un antígeno CD40 humano de superficie celular. Tales fuentes no humanas incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo, conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.816.567) y primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.; véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.750.105 y 5.756.096). Según se usa en el presente documento, la frase “inmunológicamente activo” cuando se usa en referencia a anticuerpos anti-CD40 quiméricos significa un anticuerpo quimérico que se une a CD40 humano. Additionally, the term "anti-CD40 antibody" as used herein encompasses anti-CD40 chimeric antibodies; Such chimeric anti-CD40 antibodies for use in the methods of the invention have the binding characteristics of the CHIR-5.9 and CHIR-12.12 monoclonal antibodies described herein. By "chimeric" antibodies are meant antibodies that are most preferably obtained using recombinant deoxyribonucleic acid techniques and which comprise both human components (including immunologically "related" species, for example, chimpanzees) and nonhuman. Rituxan® is an example of a chimeric antibody with a murine variable region and a human constant region. For purposes of the present invention, the constant region of the chimeric antibody is most preferably substantially identical to the constant region of a natural human antibody; The variable region of the most preferred chimeric antibody is obtained from a non-human source and has the desired antigen specificity for the CD40 cell surface antigen. The non-human source can be any vertebrate source that can be used to generate antibodies against a human CD40 cell surface antigen or material comprising a human CD40 cell surface antigen. Such non-human sources include, but are not limited to, rodents (e.g., rabbit, rat, mouse, etc .; see, for example, U.S. Patent No. 4,816,567) and non-human primates (e.g., monkey old world, ape, etc .; see, for example, US Patent Nos. 5,750,105 and 5,756,096). As used herein, the phrase "immunologically active" when used in reference to chimeric anti-CD40 antibodies means a chimeric antibody that binds to human CD40.

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados representan anticuerpos anti-CD40 adicionales adecuados para usar en la presente invención. Por “humanizado” se entienden formas de anticuerpos anti-CD40 que contienen una secuencia mínima derivada de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que están reemplazados residuos de una región hipervariable (también conocida como región determinante de complementariedad o CDR) del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión “región determinante de complementariedad” se refiere a las secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Véase, por ejemplo, Chothia y col. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat y col. (1991) U.S. Dept of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242). La expresión “región constante” se refiere a la parte de la molécula de anticuerpo que confiere funciones de efector. En trabajos anteriores dirigidos a la producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en terapia de enfermedades humanas, se sustituyeron regiones constantes de ratón por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados del sujeto se derivaron de inmunoglobulinas humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún facilitaron una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en seres humanos y hubo pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados para uso en los procedimientos de la presente invención tienen características de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento. Humanized anti-CD40 antibodies represent additional anti-CD40 antibodies suitable for use in the present invention. By "humanized" are meant forms of anti-CD40 antibodies that contain a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin sequences. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibody) in which residues of a hypervariable region (also known as complementarity determining region or CDR) of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a non-human species (antibody donor) such as mouse, rat, rabbit or non-human primate that has the desired specificity, affinity and capacity. The term "complementarity determining region" refers to the amino acid sequences that together define the affinity and binding specificity of the natural Fv region of a native immunoglobulin binding site. See, for example, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat et al. (1991) U.S. Dept of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). The term "constant region" refers to the part of the antibody molecule that confers effector functions. In previous studies aimed at the production of non-immunogenic antibodies for use in therapy of human diseases, mouse constant regions were replaced by human constant regions. The constant regions of the subject's humanized antibodies were derived from human immunoglobulins. However, these humanized antibodies still facilitated an unwanted and potentially dangerous immune response in humans and there was loss of affinity. Humanized anti-CD40 antibodies for use in the methods of the present invention have binding characteristics similar to those exhibited by the CHIR-5.9 and CHIR-12.12 monoclonal antibodies described herein.

La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo secuencias de un anticuerpo humano por las correspondientes CDR o secuencias CDR de roedores o roedores mutantes. Véase también las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; Humanization can be essentially performed following the procedure of Winter et al. (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239 : 1534-1536), replacing sequences of a human antibody with the corresponding CDR or CDR sequences of rodents or mutant rodents. See also US Patent No. 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761;

5.693.762 y 5.859.205. En algunos casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos (véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370). Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar más el rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad deseada). En general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas 5,693,762 and 5,859,205. In some cases, residues within the framework regions of one or more variable regions of the human immunoglobulin are replaced by the corresponding non-human residues (see, for example, US Pat. Nos. 5,585,089; 5,693,761; 5,693. 762; and 6,180,370). In addition, humanized antibodies may comprise residues that are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to further refine the antibody performance (for example, to obtain the desired affinity). In general, in humanized antibody it will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all

o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col. (1986) Nature 331: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos del marco están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Véase también la Patente de EEUU Nº 6.180.370, y el documento de Publicación Internacional WO 01/27160, en los que se dan a conocer anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen mejor afinidad para un antígeno predeterminado. or substantially all hypervariable regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin sequence. The humanized antibody will also optionally comprise at least a portion of a constant region (Fc) of immunoglobulin, typically that of a human immunoglobulin. For more details, see Jones et al. (1986) Nature 331: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; and Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. Accordingly, such "humanized" antibodies may include antibodies in which substantially less of an intact human variable domain has been replaced by the corresponding sequence of a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some framework residues are replaced by residues of similar sites in rodent antibodies. See, for example, US Patent Nos. 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205. See also US Patent No. 6,180,370, and International Publication WO 01/27160, in which humanized antibodies and techniques for producing humanized antibodies that have better affinity for a predetermined antigen are disclosed.

También están abarcados por el término anticuerpos anti-CD40 los anticuerpos anti-CD40 xenogénicos o modificados producidos en un huésped mamífero no humano, más particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de inmunoglobulina (Ig) endógena inactivados. En tales animales transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de las subunidades ligera y pesada de las inmunoglobulinas del huésped se convierten en no funcionales y se sustituyen con los loci análogos de inmunoglobulina humana. Estos animales transgénicos producen anticuerpos humanos en ausencia sustancial de subunidades ligera o pesada de inmunoglobulina del huésped. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.877.397 y 5.939.598. Also encompassed by the term anti-CD40 antibodies are xenogeneic or modified anti-CD40 antibodies produced in a non-human mammalian host, more particularly a transgenic mouse, characterized by endogenously inactivated immunoglobulin (Ig) loci. In such transgenic animals, the endogenous genes competent for the expression of the light and heavy subunits of host immunoglobulins become nonfunctional and are replaced with human immunoglobulin analog loci. These transgenic animals produce human antibodies in the substantial absence of light or heavy subunits of host immunoglobulin. See, for example, U.S. Patent No. 5,877,397 and 5,939,598.

De preferencia, los anticuerpos totalmente humanos contra CD40 se obtienen inmunizando ratones transgénicos. Uno de tales ratones se obtiene usando tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California), y se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 6.075.181, Preferably, fully human antibodies against CD40 are obtained by immunizing transgenic mice. One such mouse is obtained using XenoMouse® technology (Abgenix; Fremont, California), and is disclosed in US Pat. Nos. 6,075,181,

6.091.001 y 6.114.598. Para producir los anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento, se inmunizaron ratones transgénicos para el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera K humana con células Sf9 que expresan CD40 humano. Los ratones también pueden ser transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente humanos útiles en los procedimientos de la presente invención se caracterizan por tener propiedades de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento. 6,091,001 and 6,114,598. To produce the antibodies disclosed herein, transgenic mice were immunized for the human IgG1 heavy chain locus and the human K light chain locus with Sf9 cells expressing human CD40. Mice can also be transgenic for other isotypes. Fully human antibodies useful in the methods of the present invention are characterized by having binding properties similar to those exhibited by the monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 described herein.

Los fragmentos de los anticuerpos anti-CD40 son adecuados para uso en los procedimientos de la invención siempre que retengan la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total. Por consiguiente, un fragmento de un anticuerpo anti-CD40 retendrá la capacidad para unirse al antígeno CD40 de superficie de las células B. Tales fragmentos se caracterizan por tener propiedades similares al anticuerpo anti-CD40 antagonista de longitud total correspondiente, es decir, los fragmentos se unirán específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana, y están exentos de actividad agonista significativa pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. En el presente documento se hace referencia a estos fragmentos como fragmentos “que se unen al antígeno”. Fragments of the anti-CD40 antibodies are suitable for use in the methods of the invention as long as they retain the desired affinity of the full length antibody. Accordingly, a fragment of an anti-CD40 antibody will retain the ability to bind to the surface CD40 antigen of B cells. Such fragments are characterized by having properties similar to the corresponding full length antagonistic anti-CD40 antibody, that is, the fragments they will specifically bind to a human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell, and are free of significant agonist activity but exhibit antagonistic activity when they bind to a CD40 antigen in a human cell that expresses CD40. These fragments are referred to herein as "antigen binding" fragments.

Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al antígeno adecuados comprenden una parte de un anticuerpo de longitud total, por lo general la región de unión al antígeno o una de sus regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab’)2 y Fv y moléculas de anticuerpos de cadena simple. Por “Fab” se entiende un fragmento monovalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que está compuesto por la cadena ligera y parte de la cadena pesada. Por F(ab’)2 se entiende un fragmento bivalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Por “Fv de cadena simple” o fragmentos “sFv” del anticuerpo se entiende fragmentos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 y 5.856.456. Por lo general, el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun (1994) en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, Nueva York), páginas 269Suitable fragments of an antibody that bind to the antigen comprise a part of a full-length antibody, usually the antigen-binding region or one of its variable regions. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fab, F (ab ’) 2 and Fv fragments and single chain antibody molecules. By "Fab" is meant a monovalent fragment of an immunoglobulin that binds to the antigen that is composed of the light chain and part of the heavy chain. F (ab ’) 2 means a bivalent fragment of an immunoglobulin that binds to the antigen that contains both light chains and part of both heavy chains. By "single chain Fv" or "sFv" fragments of the antibody is meant fragments comprising the VH and VL domains of an antibody, in which these domains are present in a single polypeptide chain. See, for example, U.S. Patent Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030 and 5,856,456. Generally, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows sFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of sFv see Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pages 269

315. Los fragmentos de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas que se unen al antígeno dados a conocer en el presente documento también pueden conjugarse a una citotoxina para producir la lisis de las células cancerosas diana, como se describe a continuación en el presente documento. 315. Fragments of the anti-CD40 antagonist antibodies that bind to the antigen disclosed herein may also be conjugated to a cytotoxin to produce lysis of the target cancer cells, as described hereinbelow.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col. (1990) Nature Antibodies or antibody fragments can be isolated from phage antibody libraries generated using the techniques described in, for example, McCafferty et al. (1990) Nature

348: 552-554 (1990) y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548. Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (del orden de nM) por mezcla aleatoria de cadenas (Marks y col. (1992) Biol/Technology 10:779-783), así como por infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col. (1993) Nucleic, Acids Res. 21: 22652266). Por consiguiente, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. 348: 552-554 (1990) and in US Patent No. 5,514,548. Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 describe the isolation of murine and human antibodies, respectively, using phage libraries. Later publications describe the production of high affinity human antibodies (of the order of nM) by random chain mixing (Marks et al. (1992) Biol / Technology 10: 779-783), as well as by combinatorial infection and recombination in vivo as a strategy to build very large phage libraries (Waterhouse et al. (1993) Nucleic, Acids Res. 21: 22652266). Therefore, these techniques are viable alternatives to traditional monoclonal antibody hybridoma techniques for the isolation of monoclonal antibodies.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan y col. (1985) Science 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de la biblioteca de anticuerpos de fagos analizada anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab’-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter y col. (1992) Bio/Technology 10: 163-167). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de fragmentos de anticuerpos resultará evidente para el experto en la técnica. Various techniques have been developed for the production of antibody fragments. Traditionally, these fragments were obtained by proteolytic digestion of intact antibodies (see, for example, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al. (1985) Science 229: 81). However, these fragments can now be produced directly by means of recombinant host cells. For example, antibody fragments can be isolated from the phage antibody library discussed above. Alternatively, Fab’-SH fragments can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form F (ab ’) 2 fragments (Carter et al. (1992) Bio / Technology 10: 163-167). According to another approach, F (ab ’) 2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture. Another technique for the production of antibody fragments will be apparent to the person skilled in the art.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR 12.12 dados a conocer en el presente documento así como los anticuerpos que difieren de estos anticuerpos pero que retienen las CDR; y los anticuerpos con una o más adiciones, deleciones o sustituciones, en los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también abarca los anticuerpos anti-CD40 antagonistas desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976 y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se modifican para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40, en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo antiCD40 antagonista de la invención, o uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos como se señala a continuación. Anti-CD40 antagonist antibodies useful in the present invention include the monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR 12.12 disclosed herein as well as antibodies that differ from these antibodies but retain CDRs; and antibodies with one or more additions, deletions or substitutions, in which the antagonistic activity is measured by inhibition of proliferation and / or differentiation of B cells. The invention also encompasses deimmunized anti-CD40 antagonist antibodies, which may occur. as described in, for example, International Publication Documents No. WO 98/52976 and WO 0034317. In this manner, the residues within the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention are modified to make the antibodies non-immunogenic or less immunogenic for human beings while maintaining their antagonistic activity towards human cells expressing CD40, in which such activity is measured by the tests indicated elsewhere in this document. Also included within the scope of the claims are fusion proteins comprising an antagonistic antiCD40 antibody of the invention, or one of its fragments, whose fusion proteins can be synthesized or expressed from corresponding polynucleotide vectors, as known in the invention. technique. Such fusion proteins are described with reference to antibody conjugation as noted below.

Los anticuerpos de la presente invención pueden tener variaciones de secuencia producidas usando los procedimientos descritos en, por ejemplo, los documentos de Publicación de Patente Nº EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden provocar que un anticuerpo se una a MAC Clase II y desencadenar una respuesta de células T ayudantes no deseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión y aún pierda su capacidad para desencadenar una respuesta de células T no deseada. Cualquiera de tales sustituciones conservadoras o no conservadoras puede realizarse usando procedimientos reconocidos en la técnica, tales como los señalados en otra parte en el presente documento, y los anticuerpos resultantes se encontrarán dentro del alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden probarse de manera rutinaria para verificar su actividad antagonista, afinidad y especificidad usando los procedimientos descritos en el presente documento. The antibodies of the present invention may have sequence variations produced using the procedures described in, for example, Patent Publication Documents No. EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 and WO 98/52976. For example, it has been shown that sequences within the CDR can cause an antibody to bind to MAC Class II and trigger an unwanted helper T cell response. A conservative substitution may allow the antibody to retain binding activity and still lose its ability to trigger an unwanted T-cell response. Any such conservative or non-conservative substitutions may be made using methods recognized in the art, such as those set forth elsewhere herein, and the resulting antibodies will be within the scope of the invention. Variant antibodies can be routinely tested to verify their antagonistic activity, affinity and specificity using the procedures described herein.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en la práctica de la invención pueden tener uno Anti-CD40 antagonist antibodies useful in the practice of the invention may have one

o muchos mecanismos de acción. Un anticuerpo producido por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, o por cualquier otro procedimiento no dado a conocer en el presente documento, se encontrará dentro del alcance de esta descripción si posee al menos una de las siguientes actividades biológicas in vitro y/o in vivo: inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares intra apoptóticas de “supervivencia” en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; e; inhibición de transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L de fase sólida, deleción, anergia y/o inducción de tolerancia de células objetivo que llevan CD40 o de células que llevan ligandos de cognado para CD40 incluyendo, pero no limitados a, células T y células B, inducción de expansión o activación de células T reguladoras CD4+CD25+ (véase, por ejemplo, rechazo de tejidos específico de aloantígeno del donante por medio de interferencia CD40-CD40L, van Maurik y col. (2002) J. Immunol. 169: 5401-5404), citotoxicidad por medio de cualquier mecanismo (incluyendo, pero no limitados a, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), regulación descendente de proliferación, y/o apoptosis en células objetivo), modulación de secreción de citoquinas y/o expresión de moléculas en la superficie celular en células objetivo y combinaciones de las mismas. Los ensayos para tales actividades biológicas pueden realizarse como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Véanse también los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. transplant. 2: 6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology or many mechanisms of action. An antibody produced by any of the procedures described above, or by any other procedure not disclosed herein, will be within the scope of this description if it has at least one of the following biological activities in vitro and / or in vivo. : inhibition of immunoglobulin secretion by normal human peripheral B cells stimulated by T cells; inhibition of survival and / or proliferation of normal human peripheral B cells stimulated by Jurkat T cells; inhibition of survival and / or proliferation of normal human peripheral B cells stimulated by cells expressing CD40L or soluble CD40 ligand (sCD40L); inhibition of intra apoptotic intracellular "survival" signals in any cell stimulated by solid phase sCD40L or CD40L; and; inhibition of CD40 signal transduction in any cell after binding with solid phase sCD40L or CD40L, deletion, anergy and / or induction of tolerance of target cells carrying CD40 or of cells carrying cognate ligands for CD40 including, but not limited to, T cells and B cells, induction of expansion or activation of CD4 + CD25 + regulatory T cells (see, for example, rejection of donor alloantigen specific tissues by means of CD40-CD40L interference, van Maurik et al. (2002 ) J. Immunol. 169: 5401-5404), cytotoxicity by any mechanism (including, but not limited to, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), descending proliferation regulation, and / or apoptosis in target cells), modulation of cytokine secretion and / or expression of molecules on the cell surface in target cells and combinations thereof. Assays for such biological activities can be performed as described in the Examples herein. See also the tests described in Schultze et al. (1998) Proc. Natl Acad Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. transplant 2: 6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol 3: 77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology

79: 439-444; y Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082. 79: 439-444; and U.S. Patent Nos. 5,674,492 and 5,847,082.

Un ensayo representativo para detectar anticuerpos anti-CD40 antagonistas específicos para los epítopos del antígeno CD40 identificado en el presente documento es un “ensayo de unión competitiva”. Los ensayos de unión competitiva son ensayos serológicos en los que lo desconocido se detecta y cuantifica por su capacidad para inhibir la unión de un ligando conocido marcado a su anticuerpo específico. Esto también se conoce como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40 marcado por medio de anticuerpos candidatos en una muestra, por ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales surgidos contra uno o más epítopos de los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos anti-CD40 que reaccionan específicamente con un epítopo de interés pueden identificarse seleccionando una serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o fragmento de la proteína que comprende el epítopo particular de la proteína CD40 de interés. Por ejemplo, para CD40 humano, los epítopos de interés incluyen epítopos que comprenden residuos de aminoácido lineales o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso NP_690593) presentada en la Figura 4B (SEC ID Nº: 10), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4A (SEC ID Nº: 9; véase también GenBank Nº de acceso MN_152854), o de la isoforma larga de CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso CAA43045 y NP_001241) presentada en la Figura 4D (SEC ID Nº: 12), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4C (SEC ID Nº: 11; véase GenBank Nº de acceso X60592 y MN_001250). Como alternativa, podrían usarse ensayos de unión competitiva con anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados identificados anteriormente para seleccionar los anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos identificados anteriormente. A representative assay for detecting anti-CD40 antagonist antibodies specific for the epitopes of the CD40 antigen identified herein is a "competitive binding assay." Competitive binding assays are serological assays in which the unknown is detected and quantified by its ability to inhibit the binding of a known labeled ligand to its specific antibody. This is also known as a competitive inhibition assay. In a representative competitive binding assay, labeled CD40 polypeptide is precipitated by candidate antibodies in a sample, for example, in combination with monoclonal antibodies raised against one or more epitopes of the monoclonal antibodies of the invention. Anti-CD40 antibodies that react specifically with an epitope of interest can be identified by selecting a series of antibodies prepared against a CD40 protein or protein fragment comprising the particular epitope of the CD40 protein of interest. For example, for human CD40, epitopes of interest include epitopes comprising linear or non-linear amino acid residues of the short isoform of human CD40 (see GenBank Accession No. NP_690593) presented in Figure 4B (SEQ ID NO: 10), encoded by the sequence presented in Figure 4A (SEQ ID NO: 9; see also GenBank Accession No. MN_152854), or the long isoform of human CD40 (see GenBank Accession No. CAA43045 and NP_001241) presented in Figure 4D (SEC ID No.: 12), encoded by the sequence presented in Figure 4C (SEQ ID NO: 11; see GenBank Accession No. X60592 and MN_001250). Alternatively, competitive binding assays with suitable anti-CD40 antagonist antibodies identified above could be used to select monoclonal antibodies comparable to the antibodies identified above.

Los anticuerpos usados en tales inmunoensayos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos no marcados pueden usarse en aglutinación; los anticuerpos marcados pueden usarse en una amplia diversidad de ensayos, usando una amplia diversidad de marcadores. La detección de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre un anticuerpo anti-CD40 y un epítopo de interés puede facilitarse fijando una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, complejos enzima sustrato o cofactores, inhibidores de enzimas, complejos de grupos prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente es el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivos adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Tales reactivos marcados pueden usarse en una diversidad de ensayos conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoenzayos enzimáticos, por ejemplo, ELISA inmunoensayos fluorescentes y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; y 4.233.402. The antibodies used in such immunoassays may be labeled or unlabeled. Unlabeled antibodies can be used in agglutination; labeled antibodies can be used in a wide variety of assays, using a wide variety of markers. The detection of the formation of an antigen-antibody complex between an anti-CD40 antibody and an epitope of interest can be facilitated by attaching a detectable substance to the antibody. Suitable detection media include the use of markers such as radionuclides, enzymes, coenzymes, fluorescent, chemiluminescent, chromogens, substrate enzyme complexes or cofactors, enzyme inhibitors, prosthetic group complexes, free radicals, particles, dyes and the like. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase or acetylcholinesterase; Examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; An example of a fluorescent material is luminol; Examples of bioluminescent materials include luciferase, luciferin and aequorin; and examples of suitable radioactive material include 125I, 131I, 35S or 3H. Such labeled reagents can be used in a variety of known assays, such as radioimmunoassays, enzyme immunoassays, for example, ELISA fluorescent immunoassays and the like. See, for example, US Patents No. 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; and 4,233,402.

Cualquiera de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas o sus fragmentos de anticuerpos descritos previamente pueden conjugarse antes del uso en los procedimientos de la presente invención. Los procedimientos para producir anticuerpos conjugados son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD40 puede marcarse usando una marcación indirecta o un enfoque de marcación indirecta. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (especialmente 32P y 125I), reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen parejas de unión específicas. Any of the anti-CD40 antagonist antibodies or their antibody fragments described previously may be conjugated before use in the methods of the present invention. Methods for producing conjugated antibodies are known in the art. Accordingly, the anti-CD40 antibody can be labeled using indirect labeling or an indirect labeling approach. Suitable markers include fluorophores, chromophores, radioactive atoms (especially 32P and 125I), electron-dense reagents, enzymes and ligands that have specific binding partners.

Las enzimas se detectan normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa del rábano picante se detecta usualmente mediante su capacidad para convertir 3,3’,5,5’tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. “Pareja de unión específica” se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para éste. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando conocidas en la técnica. Debería entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los diversos marcadores en diferentes clases, ya que el mismo marcador puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, HRP puede servir como enzima o como antígeno para un mAb. Además, pueden combinarse diversos marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren marcadores en la práctica de esta invención: por consiguiente, podría marcarse un mAb con biotina, y detectarse su presencia con avidina Enzymes are normally detected by their activity. For example, horseradish peroxidase is usually detected by its ability to convert 3,3 ’, 5,5 ′ tetramethylbenzidine (TMB) into a blue pigment, quantifiable with a spectrophotometer. "Specific binding partner" refers to a protein capable of binding to a ligand molecule with high specificity, such as in the case of an antigen and a specific monoclonal antibody for it. Other specific binding partners include biotin and avidin or streptavidin, IgG and protein A, and the numerous receptor-ligand couples known in the art. It should be understood that the above description is not intended to categorize the various markers into different classes, since the same marker can serve in several different ways. For example, HRP can serve as an enzyme or as an antigen for a mAb. In addition, various markers can be combined for the desired effect. For example, mAbs and avidin also require markers in the practice of this invention: therefore, a mAb could be labeled with biotin, and its presence detected with avidin

125I, 125I,

marcada con o con un mAb anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención. labeled with or with an anti-biotin mAb labeled with HRP. Other permutations and possibilities will be readily apparent to those skilled in the art, and are considered as equivalent within the scope of the present invention.

Además, un anticuerpo (o su fragmento) puede conjugarse a un resto terapéutico tal como un agente terapéutico, por ejemplo. El resto del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que tenga una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una proteína tal como CTLA4-Ig, un anticuerpo o cualquier otra proteína, o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, activador tisular del plasminógeno, BLys (Estimulador de Linfocitos B), interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonias de granulocitos (“GCSF”) u otros factores de crecimiento. In addition, an antibody (or its fragment) can be conjugated to a therapeutic moiety such as a therapeutic agent, for example. The rest of the drug can be a protein or a polypeptide that has a desired biological activity. Such proteins may include, for example, a protein such as CTLA4-Ig, an antibody or any other protein, or biological response modifiers such as, for example, lymphokines, tumor necrosis factor, alpha interferon, beta interferon, nerve growth, platelet-derived growth factor, tissue plasminogen activator, BLys (Lymphocyte Stimulator B), interleukin 1 ("IL-1"), interleukin 2 ("IL-2"), interleukin-6 ( "IL-6"), granulocyte and macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF"), granulocyte colony stimulating factor ("GCSF") or other growth factors.

Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Amon y col. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs and Cancer Therapy", ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), páginas 243-256; ed. Hellstrom y col. Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known. See, for example, Amon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs and Cancer Therapy", ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pages 243-256; ed. Hellstrom et al.

(1987), Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y col. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), páginas 623653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera y col. páginas 475506 (Editrice Kurtis, Milán, Italia, 1985); Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col. (Academic Press, Nueva York, 1985), páginas 303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158. (1987), Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed; Marcel Dekker, Inc.), pages 623653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pages 475506 (Editrice Kurtis, Milan, Italy, 1985); Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pages 303-316; and Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158.

Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos como se describe en la Patente de EEUU Nº 4.676.980. Además, pueden usarse conectores entre los marcadores y los anticuerpos de la invención (véase Patente de EEUU Nº 4.831.175). Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden marcarse directamente o indirectamente (Patente de EEUU Nº 5.595.721). El tratamiento puede estar constituido por una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados en forma simultánea o consecutiva (documentos WO 00/52031 y WO 00/52473). Alternatively, an antibody can be conjugated to a second antibody to form an antibody heteroconjugate as described in US Patent No. 4,676,980. In addition, connectors between the markers and the antibodies of the invention can be used (see US Patent No. 4,831,175). Antibodies or their antigen binding fragments can be labeled directly or indirectly (US Patent No. 5,595,721). The treatment may consist of a combination of treatment with conjugated and unconjugated antibodies administered simultaneously or consecutively (WO 00/52031 and WO 00/52473).

Variantes de anticuerpos anti-CD40 antagonistas Anti-CD40 antagonist antibody variants

En los procedimientos de la presente invención pueden usarse variantes de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas biológicamente activas adecuadas. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-CD40 antagonista original. Por lo general, en la técnica están disponibles procedimientos para producir variantes de anticuerpos. Variants of suitable biologically active antagonist anti-CD40 antibodies can be used in the methods of the present invention. Such variants will retain the desired binding properties of the original anti-CD40 antagonist antibody. Generally, methods for producing antibody variants are available in the art.

Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descritos en el presente documento, por medio de mutaciones en la secuencia de ADN clonada que codifica el anticuerpo de interés. Los procedimientos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); Patente de EEUU Nº 4.873.192; y las referencias citadas en la misma. En el modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) puede encontrarse orientación para sustituciones adecuadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés. Las sustituciones conservadoras, tales como los intercambios de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser de preferencia. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln y Phe⇔Trpo⇔Tyr. For example, amino acid sequence variants of an anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-5.9 or CHIR-12.12 described herein, can be prepared by mutations in the cloned DNA sequence encoding the antibody of interest Procedures for mutagenesis and alterations of nucleotide sequences are well known in the art. See, for example, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); U.S. Patent No. 4,873,192; and the references cited therein. In the model of Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) guidance for suitable amino acid substitutions that do not affect the biological activity of the polypeptide of interest can be found. Conservative substitutions, such as exchanges of one amino acid with another having similar properties, may be preferred. Examples of conservative substitutions include, but are not limited to, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln and Phe⇔Trpo⇔Tyr.

En la construcción de variantes del polipéptido de interés del anticuerpo anti-CD40 antagonista, las modificaciones se realizan de manera tal que las variantes sigan teniendo la actividad deseada, es decir, afinidad de unión similar y sean capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y estén exentas de actividad agonista significativa pero que exhiban actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Obviamente, cualesquiera mutaciones realizadas en el ADN que codifica la variante polipéptido no deben colocar a la secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente Nº 75.444. In the construction of variants of the polypeptide of interest of the anti-CD40 antagonist antibody, the modifications are made such that the variants continue to have the desired activity, that is, similar binding affinity and are capable of specifically binding to a human CD40 antigen. expressed on the surface of a human cell and are free of significant agonist activity but that exhibit antagonistic activity when bound to a CD40 antigen in a human cell that expresses CD40. Obviously, any mutations made in the DNA encoding the polypeptide variant should not place the sequence outside the reading frame and preferably will not create complementary regions that could produce secondary mRNA structure. See Patent Application Publication No. 75,444.

Además, la región constante de un anticuerpo anti-CD40 antagonista puede mutarse para alterar la función efectora en una serie de formas. Por ejemplo, véase la Patente de EEUU Nº 6.737.056B1 y la Publicación de Solicitud de Patente Nº 2004/0132101A1, que dan a conocer mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a los receptores de Fc. In addition, the constant region of an anti-CD40 antagonist antibody can be mutated to alter effector function in a number of ways. For example, see US Patent No. 6,737,056B1 and Patent Application Publication No. 2004 / 0132101A1, which disclose Fc mutations that optimize antibody binding to Fc receptors.

De preferencia, las variantes de un anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos 70 % o 75 % de identidad de secuencia, de preferencia al menos 80 % u 85 % de identidad de secuencia, de más preferencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % ó 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para la molécula del anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descrito en el presente documento, o con una parte más corta de una molécula de anticuerpo de referencia. De más preferencia, las moléculas comparten al menos 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia. Para los fines de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando el algoritmo de búsqueda de identidad de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con parámetros de penalización de hueco abierto de 12 y penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de identidad de Smith-Waterman se enseña en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir del anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia en tan pocos como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido. Preferably, variants of a reference antagonist anti-CD40 antibody have amino acid sequences that have at least 70% or 75% sequence identity, preferably at least 80% or 85% sequence identity, more preferably at minus 90%, 91%, 92%, 93%, 94% or 95% sequence identity with the amino acid sequence for the reference antagonist anti-CD40 antibody molecule, for example, the CHIR-5.9 or CHIR monoclonal antibody -12.12 described herein, or with a shorter part of a reference antibody molecule. More preferably, the molecules share at least 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity. For the purposes of the present invention, the percent sequence identity is determined using the Smith-Waterman identity search algorithm using a related gap search with open hole penalty parameters of 12 and gap extension penalty of 2 , BLOSUM matrix of 62. The Smith-Waterman identity search algorithm is taught in Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2: 482-489. A variant may, for example, differ from the reference antagonist anti-CD40 antibody in as few as 1 to 15 amino acid residues, as few as 1 to 10 amino acid residues, such as 6-10, as few as 5, as few as 4, 3, 2, or even 1 amino acid residue.

Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos delecionados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos y puede tener 30, 40, 50 With respect to the optimal alignment of two amino acid sequences, the contiguous segment of the variant amino acid sequence may have additional amino acid residues or deleted amino acid residues with respect to the reference amino acid sequence. The contiguous segment used for comparison with the reference amino acid sequence will include at least 20 contiguous amino acid residues and may have 30, 40, 50

o más residuos de aminoácidos. Pueden hacerse correcciones para homología de secuencia asociadas con huecos o sustituciones conservadoras de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de Smith-Waterman). or more amino acid residues. Corrections can be made for sequence homology associated with gaps or conservative substitutions of residues (see Smith-Waterman's search algorithm).

La estructura química exacta de un polipéptido capaz de unirse específicamente a CD40 y que retiene la actividad antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 en células B malignas, depende de una serie de factores. Como en la molécula están presentes grupos amino y carboxilo ionizables, puede obtenerse un polipéptido particular como una sal ácida o básica, o en forma neutra. Todas las preparaciones que retienen su actividad biológica cuando se colocan en condiciones ambientales adecuadas están incluidas en la definición de anticuerpos anti-CD40 antagonistas como se usa en el presente documento. Además, puede aumentarse la secuencia de aminoácidos principal del polipéptido por derivatización usando restos de azúcar (glicosilación) o por otras moléculas complementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También puede aumentarse por conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de tal aumento se realizan a través de sistemas de procesamiento postraduccionales del huésped productor; otras de tales modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier caso, tales modificaciones están incluidas en la definición de un anticuerpo anti-CD40 usada en el presente documento siempre que no se destruyan las propiedades de antagonista del anticuerpo anti-CD40. Se espera que tales modificaciones puedan afectar cuantitativamente o cualitativamente la actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los diversos ensayos. Además, pueden modificarse residuos de aminoácidos individuales en la cadena por oxidación, reducción u otra derivatización, y el polipéptido puede escindirse para obtener fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no destruyen la actividad antagonista no retiran a la secuencia del polipéptido de la definición de anticuerpos anti-CD40 de interés según se usa en el presente documento. The exact chemical structure of a polypeptide capable of specifically binding to CD40 and retaining antagonistic activity, particularly when it binds to the CD40 antigen in malignant B cells, depends on a number of factors. Since ionizable amino and carboxyl groups are present in the molecule, a particular polypeptide can be obtained as an acidic or basic salt, or in a neutral form. All preparations that retain their biological activity when placed under suitable environmental conditions are included in the definition of anti-CD40 antagonist antibodies as used herein. In addition, the main amino acid sequence of the polypeptide can be increased by derivatization using sugar moieties (glycosylation) or by other complementary molecules such as lipids, phosphate, acetyl groups and the like. It can also be increased by conjugation with saccharides. Certain aspects of such an increase are carried out through post-translational processing systems of the producer host; Other such modifications may be introduced in vitro. In any case, such modifications are included in the definition of an anti-CD40 antibody used herein as long as the anti-CD40 antibody antagonist properties are not destroyed. It is expected that such modifications can quantitatively or qualitatively affect the activity, either by increasing or decreasing the activity of the polypeptide, in the various assays. In addition, individual amino acid residues in the chain can be modified by oxidation, reduction or other derivatization, and the polypeptide can be cleaved to obtain fragments that retain activity. Such alterations that do not destroy the antagonistic activity do not remove the polypeptide sequence from the definition of anti-CD40 antibodies of interest as used herein.

La técnica proporciona orientación sustancial con respecto a la preparación y al uso de las variantes de polipéptidos. En la preparación de las variantes de anticuerpos anti-CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué modificaciones a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la proteína nativa darán como resultado una variante que sea adecuada para uso como un componente terapéuticamente activo de una composición farmacéutica usada en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. The technique provides substantial guidance regarding the preparation and use of polypeptide variants. In the preparation of anti-CD40 antibody variants, one skilled in the art can easily determine which modifications to the nucleotide or amino acid sequence of the native protein will result in a variant that is suitable for use as a therapeutically active component of a Pharmaceutical composition used in the procedures disclosed herein.

Procedimientos de terapia usando los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención Therapy methods using the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas para tratar sujetos (es decir pacientes) que tienen una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposición a desarrollar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, en los que la enfermedad y/o inflamación está mediada por la señalización de CD40 mediada por ligando de CD40 en células que expresan CD40. Por el término “células que expresan CD40”, se entienden las células que expresan el antígeno CD40. Los procedimientos para detectar la expresión de CD40 en células son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, ELISA y similares. The procedures disclosed herein are directed to the use of anti-CD40 antagonist antibodies to treat subjects (ie patients) who have an autoimmune disease and / or an inflammatory disease, or a predisposition to develop an autoimmune disease and / or an inflammatory disease, in which the disease and / or inflammation is mediated by CD40 signaling mediated by CD40 ligand in cells expressing CD40. By the term "cells expressing CD40", the cells expressing the CD40 antigen are understood. Methods for detecting CD40 expression in cells are well known in the art and include, but are not limited to, PCR techniques, immunohistochemistry, flow cytometry, Western blotting, ELISA and the like.

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento son especialmente útiles para tratar enfermedades inflamatorias y/o enfermedades autoinmunes en las que está implicada la estimulación de CD40 mediada por ligando de CD40. Las composiciones de la invención se pueden administrar profilácticamente o terapéuticamente o en una combinación de las mismas. The procedures disclosed herein are especially useful for treating inflammatory diseases and / or autoimmune diseases in which CD40 stimulation mediated by CD40 ligand is involved. The compositions of the invention can be administered prophylactically or therapeutically or in a combination thereof.

Las enfermedades inflamatorias están caracterizadas por la inflamación y la destrucción de tejidos, o por una combinación de las mismas. “Enfermedad inflamatoria” incluye cualquier proceso mediado por el sistema inmune inflamatorio donde el evento iniciador o el objetivo de la respuesta imune implican antígeno o antígenos que no son autoantígenos, incluyendo, por ejemplo, aloantígenos, xenoantígenos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos desconocidos o alérgenos. Inflammatory diseases are characterized by inflammation and tissue destruction, or by a combination thereof. "Inflammatory disease" includes any process mediated by the inflammatory immune system where the initiating event or the objective of the imune response involves antigen or antigens that are not autoantigens, including, for example, alloantigens, xenoantigens, viral antigens, bacterial antigens, unknown antigens or allergens

Adicionalmente, para propósitos de la presente invención, el término “enfermedad(es) inflamatoria(s)” incluyen “enfermdad(es) autoinmune(s)”. Como se usa en el presente documento, el término “autoinmunidad” se entiende generalmente para abarcar procesos mediados por el sistema inmune inflamatorios que implican “autoantígenos”. En enfermedades autoinmunes, el/los autoantígeno(s) activan respuestas inmunes del huésped. Additionally, for purposes of the present invention, the term "inflammatory disease (s)" includes "autoimmune disease (s)". As used herein, the term "autoimmunity" is generally understood to encompass inflammatory immune system mediated processes that involve "autoantigens." In autoimmune diseases, the autoantigen (s) activate host immune responses.

Además, la presente revelación incluye tratamiento de inflamación asociado con rechazo de transplante de tejidos. “Rechazo de transplantes” o “rechazo de injertos” se refiere a cualquier respuesta inmune elaborada por el hospedador contra un injerto incluyendo pero no limitada a antígenos HLA, antígenos de grupo sanguíneo y similares. In addition, the present disclosure includes inflammation treatment associated with tissue transplant rejection. "Transplant rejection" or "graft rejection" refers to any immune response made by the host against a graft including but not limited to HLA antigens, blood group antigens and the like.

La invención también se puede usar para tratar la enfermedad injerto contra huésped, tal como aquella asociada con transplate de médula ósea, por ejemplo. En tal enfermedad injerto contra huésped, la médula ósea del donante incluye linfocitos y células que maduran en linfocitos. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, “enfermedad injerto contra huésped” o “reacción injerto contra huésped” se refiere a respuesta inmune mediada por células T en la que los linfocitos del donante reaccionan con los antígenos del hospedador. The invention can also be used to treat graft versus host disease, such as that associated with bone marrow transplantation, for example. In such graft versus host disease, the donor's bone marrow includes lymphocytes and cells that mature in lymphocytes. Therefore, as used herein, "graft versus host disease" or "graft versus host reaction" refers to a T-cell mediated immune response in which donor lymphocytes react with host antigens.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descrito en el presente documento se pueden usar de acuerdo con la invención para tratar trastornos autoinmunes y/o inflamatorios que incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares.En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención son útiles en tratar inflamación pulmonar incluyendopero no limitada a rechazo de injerto pulmonar, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiomática, bronquitis crónica, rinitis alérgica y enfermedades alérgicas del pulmón tales como neumonitis de hipersensibilidad, neumonía eosinófila, bronquiolitis obliterante debida a transplante de médula ósea y/o de pulmón, u otras causas, aterosclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, así como fibrosis pulmonar resultante de enfeemdades del colágeno, vasculars y autoinmunes tales como artritis reumatoide y lupus eritematoso. The anti-CD40 antagonist antibodies and the antigen-binding fragments thereof described herein can be used in accordance with the invention to treat autoimmune and / or inflammatory disorders that include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus ( SLE), discoid lupus, lupus nephritis, sarcoidosis, inflammatory arthritis, including, but not limited to, juvenile arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, ankylosing spondylitis and gouty arthritis, rejection of an organ or tissue transplant, hyperacute, acute or chronic rejection and / or graft versus host disease, multiple sclerosis, hyper IgE syndrome, polyarteritis nodosa, primary biliary cirrhosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, celiac disease (gluten-sensitive enteropathy), autoimmune hepatitis, pernicious anemia, autoimmune hemolytic anemia, psoriasis, scleroderma, myasthenia gravis, thromboc purpura autoimmune pathogenic, autoimmune thyroiditis, Graves' disease, hasimotoid thyroiditis, complex immune disease, chronic fatigue syndrome and immune dysfunction (SFCDI), polymyositis and dermatomyositis, cryoglobulinemia, thrombolysis, cardiomyopathy, pemphigus vulgaris, pulmonary interstitial fibrosis, sarcoidosis, diabetes Type I and Type II, delayed type hypersensitivity of type 1, 2, 3 and 4, allergy or allergic disorders, unwanted / unwanted immune responses to therapeutic proteins, asthma, Churg-Strauss syndrome (allergic granulomatosis), dermatitis atopic, allergic and irritating contact dermatitis, urticaria, IgE-mediated allergy, atherosclerosis, vaculitis, idiomatic inflammatory myopathies, hemolytic disease, Alzheimer's disease, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, and the like. In some other embodiments, antagonist anti-CD40 antibodies of the invention are useful in treating pulmonary inflammation including but not limited to pulmonary graft rejection, asthma, sarcoidosis, emphysema, cystic fibrosis, idiomatic pulmonary fibrosis, chronic bronchitis, allergic rhinitis and allergic lung diseases such as hypersensitivity pneumonitis, eosinophilic pneumonia, obliterating bronchiolitis due to bone marrow transplantation and / or of the lung, or other causes, graft atherosclerosis / graft flebosclerosis, as well as pulmonary fibrosis resulting from collagen, vascular and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and lupus erythematosus.

“Tratamiento” se define en el presente documento como la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un sujeto, o la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión a antígeno a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, donde un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria o una predisposición hacia una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, donde el objetivo es curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, hacer mejoras en o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera síntomas de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria. Por “tratamiento” también se entiende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un tejido aislado o una línea celular del sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposición hacia una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria , siendo el objetivo curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, hacer mejoras en o afectar a la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, los síntomas de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria o la predisposición hacia la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria. "Treatment" is defined herein as the application or administration of an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment to a subject, or the application or administration of an anti-CD40 antagonist antibody or its binding fragment to antigen to an isolated tissue or cell line of a subject, where a subject who has an autoimmune disease and / or an inflammatory disease, a symptom of an autoimmune disease and / or an inflammatory disease or a predisposition towards an autoimmune disease and / or a inflammatory disease, where the goal is to cure, heal, soothe, relieve, alter, remedy, improve, make improvements in or affect autoimmune disease and / or inflammatory disease, any symptoms of autoimmune disease and / or inflammatory disease or predisposition to the development of autoimmune disease and / or inflammatory disease. By "treatment" is also understood the application or administration of a pharmaceutical composition comprising an anti-CD40 antagonist antibody or an antigen binding fragment thereof to a subject, or the application or administration of a pharmaceutical composition comprising an anti antibody -CD40 antagonist or an antigen binding fragment thereof to an isolated tissue or a cell line of the subject, where the subject has an autoimmune disease and / or an inflammatory disease, a symptom associated with an autoimmune disease and / or an inflammatory disease , or a predisposition towards an autoimmune disease and / or an inflammatory disease, the objective being to cure, heal, calm, relieve, alter, remedy, improve, make improvements in or affect autoimmune disease and / or inflammatory disease, the symptoms of autoimmune disease and / or inflammatory disease or predisposition towards autoimmune disease and / or disease i inflammatory.

Se entiende por “actividad antiinflamatoria” una reducción o prevención de la inflamación. La terapia con al menos un anticuerpo anti-CD40 (o su fragmento de unión al antígeno) como se define en otro lugar en el presente documento causa una respuesta fisiológica que es beneficiosa con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, donde la enfermedad involucra células que expresan el antígeno CD40. Se reconoce que los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser útiles en evitar cambio fenotípico en células tal como proliferación, activación y similares. "Anti-inflammatory activity" means a reduction or prevention of inflammation. Therapy with at least one anti-CD40 antibody (or its antigen binding fragment) as defined elsewhere herein causes a physiological response that is beneficial with respect to the treatment of an autoimmune disease and / or an inflammatory disease. , where the disease involves cells that express the CD40 antigen. It is recognized that the procedures described herein may be useful in preventing phenotypic change in cells such as proliferation, activation and the like.

De conformidad con los procedimientos dados a conocer en el presente documento, al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista (o su fragmento de unión al antígeno) tal como se define en otras partes en el presente documento se usa para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria. Por “respuesta terapéutica positiva” con respecto a una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria se entiende una mejora en la enfermedad asociada con la actividad antiinflamatoria de estos anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, puede observarse un efecto antiproliferativo, la prevención de proliferación adicional de las células que expresan CD40, una reducción en la respuesta inflamatoria que incluye pero no se limita a secreción reducida de citoquinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en casos donde la célula que lleva CD40 es una célula B), combinaciones de los mismos, y similares, producción incrementada de proteínas antiinflamatorias, una reducción en el número de células autorreactivas, un incremento en tolerancia inmune, inhibición de supervivencia de células autorreactivas, y/o un decrecimiento en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células que expresan CD40. Tales respuestas terapéuticas positivas no están limitadas por la vía de administración y pueden comprender administración al donante, al tejido del donante (tal como por ejemplo perfusión de órganos), al huésped, cualquier combinación de ellas y similares. In accordance with the methods disclosed herein, at least one anti-CD40 antagonist antibody (or its antigen binding fragment) as defined elsewhere in this document is used to promote a positive therapeutic response with regarding the treatment or prevention of an autoimmune disease and / or an inflammatory disease. By "positive therapeutic response" with respect to an autoimmune disease and / or an inflammatory disease is meant an improvement in the disease associated with the anti-inflammatory activity of these antibodies or their antigen-binding fragments, and / or an improvement in the associated symptoms. With the disease That is, an antiproliferative effect can be observed, the prevention of additional proliferation of cells expressing CD40, a reduction in the inflammatory response that includes but is not limited to reduced secretion of inflammatory cytokines, adhesion molecules, proteases, immunoglobulins (in cases where the cell carrying CD40 is a B cell), combinations thereof, and the like, increased production of anti-inflammatory proteins, a reduction in the number of self-reactive cells, an increase in immune tolerance, inhibition of self-reactive cell survival, and / or a decrease in one or more symptoms mediated by stimulation of cells expressing CD40. Such positive therapeutic responses are not limited by the route of administration and may comprise administration to the donor, to donor tissue (such as organ perfusion), to the host, any combination thereof and the like.

La respuesta clínica puede evaluarse usando técnicas de examen tales como la formación de imágenes de resonancia magnética (RM), la formación de imágenes de rayos x, exploración por tomografía computerizada (TC), citometría de flujo o análisis por clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), histología, patología macroscópica y química de la sangre, incluyendo pero no limitadas a cambios detectables por ELISA, RIA, cromatografía y similares. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti-CD40 antagonista o con su fragmento de unión a antígeno puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. The clinical response can be evaluated using examination techniques such as magnetic resonance imaging (MRI), x-ray imaging, computerized tomography (CT) scan, flow cytometry or fluorescence-activated cell sorter analysis. (FACS), histology, macroscopic pathology and blood chemistry, including but not limited to changes detectable by ELISA, RIA, chromatography and the like. In addition to these positive therapeutic responses, the subject undergoing therapy with the anti-CD40 antagonist antibody or with its antigen binding fragment may experience the beneficial effect of an improvement in the symptoms associated with the disease.

Por “dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se entiende una cantidad de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al anticuerpo que, cuando se administra da lugar a una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con una enfermedad que comprende la estimulación de las células que expresan CD40. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de tratamiento puede comprender una única administración de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. By "therapeutically effective dose or amount" or "effective amount" is meant an amount of anti-CD40 antagonist antibody or its antibody binding fragment which, when administered, results in a positive therapeutic response with respect to the treatment of a subject with a disease that involves the stimulation of cells expressing CD40. In some embodiments, a therapeutically effective dose of an anti-CD40 antibody or its fragment is in the range from about 0.01 mg / kg to about 40 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 30 mg / kg , from about 0.1 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 1 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 25 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 20 mg / kg, from about 5 mg / kg to about 15 mg / kg, or from about 7 mg / kg to about 12 mg / kg. It is recognized that the treatment method may comprise a single administration of a therapeutically effective dose or multiple administrations of a therapeutically effective dose of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment.

Otra realización de la descripción es el uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas para el control de diagnóstico de los niveles proteicos en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente incluye el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I 35S o 3H. Another embodiment of the description is the use of anti-CD40 antagonist antibodies for the diagnostic control of protein levels in the tissue as part of a clinical testing procedure, for example, to determine the efficacy of a given treatment regimen. Detection can be facilitated by coupling the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase or acetylcholinesterase; Examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; An example of a fluorescent material includes luminol; Examples of bioluminescent materials include luciferase, luciferin and aequorin; and examples of suitable radioactive materials include 125I, 131I 35S or 3H.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y sus fragmentos de unión al antígeno, se pueden usarse en combinación con cualesquiera terapias conocidas para enfermedades autoinmunes Anti-CD40 antagonist antibodies and their antigen binding fragments can be used in combination with any known therapies for autoimmune diseases.

o inflamatorias, incluyendo cualquier agente o combinación de agentes que se conocen por ser útiles, o que se han usado o se están usando actualmente, para tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Tales terapias y agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares); terapia de radiación; terapia tal como terapia de esteroides y terapia no esteroídica, terapia de hormonas, terapia de citoquinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo,agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora y terapia antiinflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta y similares. De esta manera, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas descritos en el presente documento, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se administran en combinación con al menos otra terapia, incluyendo pero no limitada a, cirugía, perfusión de órganos, terapia de radiación, terapia de esteroides, terapia no esteroídica, terapia de antibióticos, terapia antifúngica, terapia de hormonas, terapia de citoqionas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora, terapia anti-inflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta, combinaciones de las mismas y similares. Por consiguiente, donde las terapias combinadas comprenden administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión a anticuerpo en combinación con administración de otro agente terapéutico y con esteroides como un ejemplo, los procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden coadministración, usando formulaciones distintas o una formulación farmacéutica individual y administración consecutiva en cualquier orden. or inflammatory, including any agent or combination of agents that are known to be useful, or that have been used or are currently being used, for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases. Such therapies and therapeutic agents include, but are not limited to, surgery or surgical procedures (for example, splenectomy, hepatectomy, lymphadenectomy, leukophoresis, cell, tissue or organ transplantation, intestinal procedures, organ perfusion and the like); radiation therapy; therapy such as steroid therapy and non-steroidal therapy, hormone therapy, cytokine therapy, therapy with dermatological agents (for example, topical agents used to treat skin conditions such as allergies, contact dermatitis and psoriasis), immunosuppressive therapy and distinct and similar monoclonal antibody anti-inflammatory therapy. Thus, the anti-CD40 antagonist antibodies described herein, or the antigen-binding fragments thereof are administered in combination with at least one other therapy, including but not limited to, surgery, organ perfusion, therapy. radiation, steroid therapy, nonsteroidal therapy, antibiotic therapy, antifungal therapy, hormone therapy, cytokione therapy, therapy with dermatological agents (for example topical agents used to treat skin conditions such as allergies, contact dermatitis and psoriasis ), immunosuppressive therapy, anti-inflammatory therapy of different monoclonal antibodies, combinations thereof and the like. Therefore, where the combination therapies comprise administration of an anti-CD40 antagonist antibody or its antibody binding fragment in combination with administration of another therapeutic agent and with steroids as an example, the methods disclosed herein comprise co-administration, using different formulations or an individual pharmaceutical formulation and consecutive administration in any order.

Donde los procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias pueden darse de manera simultánea, es decir, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra simultáneamente o dentro del mismo período de tiempo que la otra terapia (es decir, las terapias tienen lugar simultáneamente, pero el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno no se administra precisamente en el mismo momento que la otra terapia). Como alternativa, el anticuerpo anti-CD40 antagonista de la presente invención o su fragmento de unión al antígeno puede también administrarse antes de, o posteriormente a la otra terapia. La administración secuencial de las diferentes terapias contra el cáncer puede realizarse independientemente de que el sujeto tratado responda al primer curso de terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recaída. Where the methods disclosed herein comprise combined therapeutic regimens, these therapies can be given simultaneously, that is, the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment is administered simultaneously or within the same period of time that the other therapy (that is, the therapies take place simultaneously, but the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment is not administered precisely at the same time as the other therapy). Alternatively, the anti-CD40 antagonist antibody of the present invention or its antigen binding fragment can also be administered before, or after the other therapy. The sequential administration of the different cancer therapies can be carried out regardless of whether the treated subject responds to the first course of therapy to reduce the possibility of remission or relapse.

En algunas realizaciones de la revelación, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas descritos en el presente documento, o sus fragmentos de unión al antígeno, se administran en combinación con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, en los que el anticuerpo y el/los agente(s) terapéutico(s) se pueden administrar secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir, concurrentemente o dentro del mismo marco temportal). Los ejemplos de fármacos inmunosupresores adecuados que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos anti-CDE40 antagonistas de la invención incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel®), así como anticuerpos anti-células T tales como anti-CD3 (OKT3), antiCD4 y similares. Ejemplos de agentes antiinflamatorios adecuados incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamciclolona, betametasona, flucinocol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) tales como, por ejemplo, sulfasalazina, medicaciones que contienen mesalamina (conocidsa como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindaco y tomentina; anticuerpos antiinflamatorios tales como adalidumab (HUMIRA®, un antagonista de TNF-α) e infliximab (Remicade®, un antagonista de TNF-α), y similares. In some embodiments of the disclosure, the anti-CD40 antagonist antibodies described herein, or their antigen binding fragments, are administered in combination with immunosuppressive drugs or anti-inflammatory drugs, in which the antibody and the agent (s) ) therapeutic (s) can be administered sequentially, in any order, or simultaneously (that is, concurrently or within the same time frame). Examples of suitable immunosuppressive drugs that can be administered in combination with the antagonist anti-CDE40 antibodies of the invention include, but are not limited to, methotrexate, cyclophosphamide, mizoribine, chlorambucil, cyclosporine, such as, for example, aerosolized cyclosporine (see , United States Patent Application Publication No. US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf ™), mycophenolate mofetil and azathioprine (6-mercaptopurine), sirolimus (rapamycin), deoxyspergualine, leflunomon and its analogues of maltyl; and immunosuppressive proteins, including, for example, anti-CTLA4 antibodies and Ig condensations, anti-lymphocyte B-stimulating antibodies (for example LYMPHOSTAT-B ™) and Ig condensations (BLyS-Ig), anti-CD80 antibodies and etanercept (Enbrel®) , as well as anti-T cell antibodies such as anti-CD3 (OKT3), antiCD4 and the like. Examples of suitable anti-inflammatory agents include, but are not limited to, corticosteroids such as, for example, clobetasol, halobetasol, hydrocortisone, triamcyclolone, betamethasone, flucinocol, fluocinonide, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as NIDs (NSAIDs) such as NSAIDs, such as steroids for example, sulfasalazine, medications containing mesalamine (known as 5-ASA agents), celecoxib, diclofenac, etodolac, fenprofen, flurbiprofen, ibuprofen, ketoprofen, meclofamate, meloxicam, nabumetone, naproxen, oxaprozine, piroxyaprococcal, pheroxyaproxin, piroxyaproxin tomentine; anti-inflammatory antibodies such as adalidumab (HUMIRA®, a TNF-α antagonist) and infliximab (Remicade®, a TNF-α antagonist), and the like.

El rechazo a transplante y la enfermedad de injerto contra huésped pueden ser hiperagudas (humorales), agudas (mediadas por células T), o crónicas (etilogía desconocida), o una combinación de las mismas. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usan en algunas realizaciones para evitar y/o mejorar el rechazo y/o los síntomas asociados con rechazo a transplante hiperagudo, agudo, y/o crónico de cualquier tejido, incluyendo, pero no limitado a, hígado, riñón, páncreas, células de isletas del páncreas, intestino delgado, pulmón, corazón, córneas, piel, vasos sanguíneos, hueso, médula ósea heteróloga o antóloga y similares. Los tejidos de injerto se pueden obtener a partir de cualquier donante y se pueden transplantar en cualquier huésped receptor y así el procedimiento de transplante puede comprender transplantar tejido animal a humanos (por ejemplo, xenoinjertos), transplantar tejido de un ser humano a otro ser humano (por ejemplo, aloinjertos), y/o transplantar tejido de una parte de un ser humano a otra (por ejemplo, autoinjertos). El tratamiento con los anticuerpos de la invención puedereducir también las secuelas de transplante tales como fiebre, anorexia, anormalidades hemodinámicas, leucopenia, infiltración de células blancas del tejido/órgano transplantado, sí como infecciones oportunistas. Transplant rejection and graft versus host disease can be hyperacute (humoral), acute (mediated by T cells), or chronic (unknown ethylogy), or a combination thereof. Accordingly, anti-CD40 antagonist antibodies of the invention are used in some embodiments to prevent and / or improve rejection and / or symptoms associated with hyperacute, acute, and / or chronic transplant rejection of any tissue, including, but not limited to, liver, kidney, pancreas, islet cells of the pancreas, small intestine, lung, heart, corneas, skin, blood vessels, bone, heterologous or antologous bone marrow and the like. The graft tissues can be obtained from any donor and can be transplanted into any recipient host and thus the transplant procedure may include transplanting animal tissue to humans (e.g., xenografts), transplanting tissue from one human being to another human being. (for example, allografts), and / or transplant tissue from one part of a human being to another (for example, autografts). Treatment with the antibodies of the invention may also reduce transplant sequelae such as fever, anorexia, hemodynamic abnormalities, leukopenia, infiltration of white cells from the transplanted tissue / organ, as well as opportunistic infections.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar sólos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar y/o evitar rechazo de transplante tal como rechazo de transplante hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador. Por consiguiente, en algunas realizaciones donde los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usan para tratar y/o evitar rechazo de transplantes, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel®), así como anticuerpos anticélulas T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 y similares. In some embodiments, the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention can be used alone or in combination with immunosuppressive drugs to treat and / or prevent transplant rejection such as hyperacute, acute or chronic transplant rejection and / or graft disease versus host. Accordingly, in some embodiments where the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention are used to treat and / or prevent transplant rejection, the antibodies may be used in combination with suitable immunosuppressive drugs, including, but not limited to, methotrexate, cyclophosphamide. , mizoribine, chlorambucil, cyclosporine, such as, for example, aerosolized cyclosporine (see, US Patent Application Publication No. US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf ™), mycophenolate mofetil and azathioprine (6-mercaptopurine ), sirolimus (rapamycin), deoxiespergualine, leflunomide and their malononitriloamine analogues; and immunosuppressive proteins, including, for example, anti-CTLA4 antibodies and Ig condensations, anti-lymphocyte B-stimulating antibodies (for example LYMPHOSTAT-B ™) and Ig condensations (BLyS-Ig), anti-CD80 antibodies and etanercept (Enbrel®) , as well as T-cell antibodies such as anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 and the like.

Se contempla como tal que las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se usen en combinación con otros fármacos para mejorar adicionalmente los síntomas y consecuencias en los receptores de transplantes, tales como aquellos que reciben injertos pulmonares, por ejemplo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usaron para tratar rechazo de transplantes (tales como, por ejemplo rechazo hiperagudo, agudo y/o crónico o enfermedad de injerto contra huésped en receptores de transplante de pulmón) solos o en combinación con ciclosporina administrada parenteralmente y/o no parenteralmente, incluyendo por ejemplo ciclosporina oral, ciclosporina inyectable, ciclosporina aerosolizada (por ejemplo, inhalada) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones donde al menos un componente de la terapia es ciclosporina aerosolizada, la ciclosporina se administra al pulmón del receptor por inalación de ciclosporina en forma de pulverizador de aerosol que usa, por ejemplo, un dispositivo de administración presurizada o un nebulizador. La ciclosporina se puede administrar bien en forma de polvo seco o bien en forma húmeda. It is contemplated as such that the compositions and procedures described herein are used in combination with other drugs to further improve symptoms and consequences in transplant recipients, such as those receiving pulmonary grafts, for example. Accordingly, in some embodiments, the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention were used to treat transplant rejection (such as, for example, hyperacute, acute and / or chronic rejection or graft versus host disease in lung transplant recipients). alone or in combination with cyclosporine administered parenterally and / or non-parenterally, including, for example, oral cyclosporine, injectable cyclosporine, aerosolized cyclosporine (eg, inhaled) and combinations thereof. In some embodiments where at least one component of the therapy is aerosolized cyclosporine, cyclosporine is administered to the recipient's lung by cyclosporine inhalation in the form of an aerosol spray using, for example, a pressurized delivery device or a nebulizer. Cyclosporine can be administered either in dry powder form or in wet form.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar solos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar y/o evitar artritis reumatoide. Por consiguiente en algunas realizaciones donde los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención seusan para tratar artritis reumatoide. Por consiguiente en algunas realizaciones donde los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención se pueden usar para tratar artritis reumatoide, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitados a metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo RITUXAN®), el anticuerpo totalmente humanos HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®); anticuerpos anti-CD80, y y etanercept (ENBREL®), así como anticuerpos anti-células T tales como antiCD3 (OKT3), anti-CD4 y similares. Como se discute anteriormente, la efectividad del tratamiento se evaluó usando cualesquiera medios e incluyen, pero no se limitan a, efectividad según se mide por respuestas clínicas definidas por los criterios American Collage of Rheumatology, los criterios de la European League of Rheumatism o cualesquiera otros criterios. Véase por ejemplo, Nelson y col. (1995) Artritis Rheum. 38: 727-35 y van Gestel y col. (1996) Artritis Rheum. 39: 34-40. In some other embodiments, the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention can be used alone or in combination with immunosuppressive drugs to treat and / or prevent rheumatoid arthritis. Accordingly in some embodiments where the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention are used to treat rheumatoid arthritis. Accordingly in some embodiments where the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention can be used to treat rheumatoid arthritis, the antibodies can be used in combination with suitable immunosuppressive drugs, including, but not limited to methotrexate, cyclophosphamide, mizoribine, chlorambucil, cyclosporine. , tacrolimus (FK506, ProGraf ™), mycophenolate mofetil and azathioprine (6-mercaptopurine), sirolimus (rapamycin), deoxiespergualine, leflunomide and their malononitriloamine analogues; and immunosuppressive proteins, including, for example, anti-CTLA4 antibodies and Ig condensations, anti-lymphocyte B-stimulating antibodies (for example LYMPHOSTAT-B ™) and Ig condensations (BLyS-Ig), anti-CD20 antibodies (for example RITUXAN®) , the fully human HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®) antibody; anti-CD80 antibodies, and etanercept (ENBREL®), as well as anti-T cell antibodies such as antiCD3 (OKT3), anti-CD4 and the like. As discussed above, the effectiveness of the treatment was evaluated using any means and includes, but is not limited to, effectiveness as measured by clinical responses defined by the American Collage of Rheumatology criteria, the European League of Rheumatism criteria or any others. criteria See for example, Nelson et al. (1995) Rheum arthritis. 38: 727-35 and van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 34-40.

En aún otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar solos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar esclerosis múltiple, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores, incluyendo, pero no limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTATB™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo RITUXAN®), el anticuerpo totalmente humanos HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®); anticuerpos anti-CD80, y y etanercept (ENBREL®), así como anticuerpos anti-células T tales como anti-CD3 (OKT3), antiCD4 y similares. In still other embodiments, the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention can be used alone or in combination with immunosuppressive drugs to treat multiple sclerosis, the antibodies can be used in combination with immunosuppressive drugs, including, but not limited to, methotrexate, cyclophosphamide. , mizoribine, chlorambucil, cyclosporine, tacrolimus (FK506, ProGraf ™), mycophenolate mofetil and azathioprine (6-mercaptopurine), sirolimus (rapamycin), deoxiespergualin, leflunomide and their malononitrile analogues; and immunosuppressive proteins, which include, for example, anti-CTLA4 antibodies and Ig condensations, anti-lymphocyte B stimulating antibodies (for example LYMPHOSTATB ™) and Ig condensations (BLyS-Ig), anti-CD20 antibodies (for example RITUXAN®), the fully human HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®) antibody; anti-CD80 antibodies, and and etanercept (ENBREL®), as well as anti-T cell antibodies such as anti-CD3 (OKT3), antiCD4 and the like.

Formulaciones farmacéuticas y modos de administración Pharmaceutical formulations and modes of administration

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de esta invención se administran en una concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes y/o enfermedades antiinflamatorias. Para lograr este objetivo, los anticuerpos pueden formularse usando una diversidad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se administran por medio de inyección, por ejemplo, bien intravenosamente, bien intraperitonealmente o bien subcutáneamente. Los procedimientos para llevar a cabo esta administración se conocen por los expertos en la técnica. También es posible obtener composiciones que pueden administrarse por tópicamente u oralmente, o que pueden ser capaces de transmisión a través de membranas mucosas. The anti-CD40 antagonist antibodies of this invention are administered in a concentration that is therapeutically effective for preventing or treating autoimmune diseases and / or anti-inflammatory diseases. To achieve this goal, antibodies can be formulated using a variety of acceptable excipients known in the art. Typically, antibodies are administered by injection, for example, either intravenously, either intraperitoneally or subcutaneously. The procedures for carrying out this administration are known to those skilled in the art. It is also possible to obtain compositions that can be administered topically or orally, or that may be capable of transmission through mucous membranes.

La administración intravenosa se realiza de preferencia por medio de infusión durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas, de más preferencia durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas, de más preferencia aún durante aproximadamente 2 hasta aproximadamente 7 horas, todavía de más preferencia durante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo anti-CD40 que se administra. La infusión inicial con la composición farmacéutica puede administrarse durante un período de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas con infusiones posteriores administradas de manera más rápida. Las infusiones posteriores pueden administrarse durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 horas. Intravenous administration is preferably performed by means of infusion over a period of about 1 to about 10 hours, more preferably for about 1 to about 8 hours, more preferably still for about 2 to about 7 hours, even more preferably during about 4 to about 6 hours, depending on the anti-CD40 antibody that is administered. The initial infusion with the pharmaceutical composition can be administered over a period of about 4 to about 6 hours with subsequent infusions administered more quickly. Subsequent infusions can be administered over a period of about 1 to about 6 hours, including, for example, about 1 to about 4 hours, about 1 to about 3 hours, or about 1 to about 2 hours.

Una composición farmacéutica de la invención está formulada para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), o la infusión), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio A pharmaceutical composition of the invention is formulated to be compatible with its intended route of administration. Examples of possible routes of administration include parenteral (e.g., intravenous (IV), intramuscular (IM), intradermal, subcutaneous (SC), or infusion), oral and pulmonary (e.g., inhalation), nasal, transdermal administration (topical), transmucosal and rectal. The solutions or suspensions used for parenteral, intradermal or subcutaneous application may include the following components: a sterile diluent such as water for injection, saline, non-volatile oils, polyethylene glycols, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methylparabenos; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride

o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o de plástico. or dextrose The pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. Parenteral preparation can be included in ampoules, disposable syringes or multi-dose vials made of glass or plastic.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas se proporcionan típicamente por medio de técnicas convencionales en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. En Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) se describen procedimientos para preparar agentes que pueden administrarse parenteralmente. Véase también, por ejemplo, el documento WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizadas adecuadas para usar en los procedimientos descritos en la presente invención. Anti-CD40 antagonist antibodies are typically provided by conventional techniques in a pharmaceutically acceptable buffer, for example, sterile saline, sterile buffered water, propylene glycol, combinations of the above, etc. Procedures for preparing agents that can be administered parenterally are described in Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed .; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). See also, for example, WO 98/56418, which describes pharmaceutical formulations of stabilized antibodies suitable for use in the methods described in the present invention.

La cantidad de al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento a administrar se determinará fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica sin experimentación indebida. Los factores que influencian el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista (o fragmento del mismo) incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad particular sometida a terapia, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que se somete a terapia. De forma similar, la cantidad de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una o a múltiples dosis de este agente. Por lo general, al aumentar el peso del sujeto sometido al tratamiento, resulta de preferencia una dosis más alta del anticuerpo anti-CD40 o su fragmento. La dosis del anticuerpo anti-CD40 o su fragmento a administrar está en el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, de preferencia en el intervalo de 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg. The amount of at least one anti-CD40 antagonist antibody or its fragment to be administered will be readily determined by someone of ordinary skill in the art without undue experimentation. Factors that influence the mode of administration and the respective amount of at least one anti-CD40 antagonist antibody (or fragment thereof) include, but are not limited to, the particular disease undergoing therapy, the severity of the disease, the history. of the disease, and the age, height, weight, health and physical condition of the individual undergoing therapy. Similarly, the amount of anti-CD40 antagonist antibody or its fragment to be administered will depend on the mode of administration and whether the subject will be subjected to one or multiple doses of this agent. Generally, as the weight of the subject under treatment increases, a higher dose of the anti-CD40 antibody or its fragment is preferably preferred. The dose of the anti-CD40 antibody or its fragment to be administered is in the range of about 0.003 mg / kg to about 50 mg / kg, preferably in the range of 0.01 mg / kg to about 40 mg / kg. Therefore, for example, the dose may be 0.01 mg / kg, 0.03 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.5 mg / kg, 1 mg / kg , 1.5 mg / kg, 2 mg / kg, 2.5 mg / kg, 3 mg / kg, 5 mg / kg, 7 mg / kg, 10 mg / kg, 15 mg / kg, 20 mg / kg, 25 mg / kg, 30 mg / kg, 35 mg / kg, 40 mg / kg, 45 mg / kg or 50 mg / kg.

En otra realización de la divulgación, el procedimiento comprende la administración de dosis múltiples de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento. El procedimiento puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento. La frecuencia y duración de administración de las dosis múltiples de las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpo anti-CD40 o su fragmento pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica sin excesiva experimentación. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, de preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo de preferencia, se trata al sujeto con anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 y 10 semanas, de preferencia aproximadamente entre 2 y 8 semanas, de más preferencia aproximadamente entre 3 y 7 semanas, y aún de más preferencia durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El tratamiento puede llevarse a cabo anualmente para prevenir la recaída o tras la indicación de la recaída. También se apreciará que la dosis eficaz de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden ser el resultado y pueden resultar evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el presente documento. Por consiguiente, en una realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 7, 14 y 21 de un período de tratamiento. En otra realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un período de tratamiento. Realizaciones adicionales incluyen un régimen de dosificación que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de tratamiento; un régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo antiCD40 o su fragmento en los días 1 y 3 de una semana en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación de preferencia que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en el día 1 de una semana en un período de tratamiento. El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser consecutivos o pueden estar separados uno de otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. In another embodiment of the disclosure, the method comprises the administration of multiple doses of anti-CD40 antagonist antibody or its fragment. The method may comprise the administration of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 or more therapeutically effective doses of a pharmaceutical composition comprising a anti-CD40 antagonist antibody or its fragment. The frequency and duration of administration of the multiple doses of the pharmaceutical compositions comprising anti-CD40 antibody or its fragment can easily be determined by one skilled in the art without undue experimentation. In addition, treatment of a subject with a therapeutically effective amount of an antibody may include a single treatment or, preferably, may include a series of treatments. In a preferred example, the subject is treated with anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment in the range of about 0.1 to 20 mg / kg body weight, once a week for about 1 to 1 10 weeks, preferably about 2 to 8 weeks, more preferably about 3 to 7 weeks, and even more preferably for about 4, 5, or 6 weeks. Treatment can be carried out annually to prevent relapse or after indication of relapse. It will also be appreciated that the effective dose of antibody or its antigen binding fragment used for the treatment may increase or decrease in the course of a particular treatment. Dosage changes may be the result and may be apparent from the results of diagnostic tests as described herein. Accordingly, in one embodiment, the dosage regimen includes a first administration of a therapeutically effective dose of at least one anti-CD40 antibody or its fragment on days 1, 7, 14 and 21 of a treatment period. In another embodiment, the dosage regimen includes a first administration of a therapeutically effective dose of at least one anti-CD40 antibody or its fragment on days 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 of a week in a period of treatment. Additional embodiments include a dosage regimen having a first administration of a therapeutically effective dose of at least one anti-CD40 antibody or its fragment on days 1, 3, 5 and 7 of a week in a treatment period; a dosage regimen includes a first administration of a therapeutically effective dose of at least one anti-CD40 antibody or its fragment on days 1 and 3 of a week in a treatment period; and a preferred dosage regimen that includes a first administration of a therapeutically effective dose of at least one anti-CD40 antibody or its fragment on day 1 of a week in a treatment period. The treatment period may comprise 1 week, 2 weeks, 3 weeks, one month, 3 months, 6 months or one year. The treatment periods can be consecutive or they can be separated from each other by a day, a week, 2 weeks, a month, 3 months, 6 months or a year.

Varía desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, por ejemplo el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o su fragmento de unión al antígeno, puede ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otra dosis semejante que esté dentro el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede administrarse a lo largo de cada semana de dosificación del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse diferentes dosis terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno durante el transcurso de un período de tratamiento. It ranges from about 0.003 mg / kg to about 50 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 40 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 0.5 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 1 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 30 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 25 mg / kg, from about 3 mg / kg to about 20 mg / kg, from about 5 mg / kg to about 15 mg / kg, or from about 7 mg / kg to about 12 mg / kg Therefore, for example, the dose of any anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment, for example the anti-CD40 monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9 or its antigen binding fragment, can be 0.003 mg / kg, 0.01 mg / kg, 0.03 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.5 mg / kg, 1 mg / kg, 1.5 mg / kg , 2 mg / kg, 2.5 mg / kg, 3 mg / kg, 5 mg / kg, 7 mg / kg, 10 mg / kg, 15 mg / kg, 20 mg / kg, 25 mg / kg, 30 mg / kg, 35 mg / kg, 40 mg / kg, 45 mg / kg, 50 mg / kg, or another similar dose that is in the range from about 0.003 mg / kg to about 50 mg / kg. The same therapeutically effective dose of an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment may be administered throughout each week of antibody dosing. Alternatively, different therapeutically effective doses of an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment can be used during the course of a treatment period.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg). In some embodiments, the initial therapeutically effective dose of an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen-binding fragment as defined elsewhere herein may be in the lower dosage range (i.e., from about 0.003 mg / kg up to about 20 mg / kg) with subsequent doses within the upper dosage range (i.e., from about 20 mg / kg to about 50 mg / kg).

En realizaciones alternativas, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo antiCD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg). Por consiguiente, en una realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno es de aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg, incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno son de aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg. In alternative embodiments, the initial therapeutically effective dose of an antagonistic antiCD40 antibody or its antigen binding fragment as defined elsewhere herein may be in the upper dosage range (i.e., from about 20 mg / kg to approximately 50 mg / kg) with subsequent doses within the lower dosage range (ie, from 0.003 mg / kg to approximately 20 mg / kg). Accordingly, in one embodiment, the initial therapeutically effective dose of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment is from about 20 mg / kg to about 35 mg / kg, including about 20 mg / kg, about 25 mg / kg, about 30 mg / kg and about 35 mg / kg, and subsequent therapeutically effective doses of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment are from about 5 mg / kg to about 15 mg / kg, including about 5 mg / kg, 8 mg / kg, 10 mg / kg, 12 mg / kg and approximately 15 mg / kg.

En algunas realizaciones de la revelación, el tratamiento con anticuerpo anti-CD40 antagonista se inicia administrando una “dosis de carga” del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno al sujeto que necesita terapia con anticuerpos anti-CD40 antagonistas. Por “dosis de carga” se entiende una dosis inicial del anticuerpo anti-CD40 antagonista o de su fragmento de unión al antígeno que se administra al sujeto, en la que la dosis del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno administrado está dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg). La “dosis de carga” puede administrarse como una única administración, por ejemplo, una infusión única en la que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, o como administraciones múltiples, por ejemplo, infusiones múltiples en las que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, siempre que la “dosis de carga” completa se administre en un período de aproximadamente 24 horas. Tras la administración de la “dosis de carga”, se administran a continuación una o más dosis terapéuticamente eficaces adicionales del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno al sujeto. Pueden administrarse dosis terapéuticamente eficaces posteriores, por ejemplo, según un programa de dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, In some embodiments of the disclosure, treatment with anti-CD40 antagonist antibody is initiated by administering a "loading dose" of the antibody or its antigen-binding fragment to the subject in need of therapy with anti-CD40 antagonist antibodies. By "loading dose" is meant an initial dose of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen-binding fragment that is administered to the subject, in which the dose of the antibody or its antigen-binding fragment administered is within the range of higher dosage (ie, from about 20 mg / kg to about 50 mg / kg). The "loading dose" can be administered as a single administration, for example, a single infusion in which the antibody or its antigen binding fragment is administered via IV, or as multiple administrations, for example, multiple infusions in which the antibody or its antigen binding fragment is administered IV, provided that the full "loading dose" is administered over a period of approximately 24 hours. After administration of the "loading dose", one or more additional therapeutically effective doses of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment are then administered to the subject. Subsequently therapeutically effective doses may be administered, for example, according to a weekly dosing schedule, or once every two weeks, once every three weeks,

o una vez cada cuatro semanas. En tales realizaciones, las dosis terapéuticamente eficaces posteriores generalmente están en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg). or once every four weeks. In such embodiments, subsequent therapeutically effective doses are generally in the lower dosage range (ie, from 0.003 mg / kg to about 20 mg / kg).

Como alternativa, en algunas realizaciones, tras la “dosis de carga”, las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administran según un “programa de mantenimiento”, en el que la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses. En tales realizaciones, las dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno están en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos más frecuentes, por ejemplo, una vez cada dos semanas hasta una vez al mes, o dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes hasta aproximadamente 12 meses. Alternatively, in some embodiments, after the "loading dose", subsequent therapeutically effective doses of the antagonist anti-CD40 antibody or its antigen binding fragment are administered according to a "maintenance schedule", in which the therapeutically effective dose of the antibody or its antigen binding fragment is administered once a month, once every 6 weeks, once every two months, once every 10 weeks, once every three months, once every 14 weeks, once every four months, once every 18 weeks, once every five months, once every 22 weeks, once every six months, once every 7 months, once every 8 months, once every 9 months, once every 10 months, once every 11 months, or once every 12 months. In such embodiments, the therapeutically effective doses of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment are in the lower dosage range (i.e., from 0.003 mg / kg to about 20 mg / kg), in particular when the doses Thereafter they are administered at more frequent intervals, for example, once every two weeks up to once a month, or within the upper dosage range (i.e., from about 20 mg / kg to about 50 mg / kg), particularly when Subsequent doses are administered at less frequent intervals, for example, when subsequent doses are administered separately for approximately one month to approximately 12 months.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas presentes en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para usar en los procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden ser nativos o pueden obtenerse por medio de técnicas recombinantes y pueden ser de cualquier fuente, incluidas las fuentes de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón, rata, conejo, primate, cerdo y ser humano. De preferencia tales polipéptidos se obtienen de una fuente humana, y de más preferencia son proteínas humanas, recombinantes de líneas celulares de hibridoma. The anti-CD40 antagonist antibodies present in the pharmaceutical compositions described herein for use in the methods disclosed herein may be native or may be obtained by means of recombinant techniques and may be from any source, including sources of mammals such as, for example, mouse, rat, rabbit, primate, pig and human. Preferably such polypeptides are obtained from a human source, and more preferably they are human proteins, recombinant of hybridoma cell lines.

Las composiciones farmacéuticas útiles en la invención pueden comprender variantes biológicamente activas de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención. Tales variantes deben retener la actividad biológica deseada del polipéptido nativo tal que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un sujeto. Es decir, el anticuerpo anti-CD40 variante servirá como componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de manera similar a la observada para el anticuerpo antagonista nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o CHIR-12.12 como se expresa por la línea celular de hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. En la técnica están disponibles procedimientos para determinar si un anticuerpo anti-CD40 variante retiene la actividad biológica deseada, y sirve por consiguiente como un componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica. La actividad biológica de las variantes del anticuerpo puede medirse usando ensayos específicamente diseñados para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluidos los ensayos descritos en el presente documento. Pharmaceutical compositions useful in the invention may comprise biologically active variants of the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention. Such variants should retain the desired biological activity of the native polypeptide such that the pharmaceutical composition comprising the variant polypeptide has the same therapeutic effect as the pharmaceutical composition comprising the native polypeptide when administered to a subject. That is, the variant anti-CD40 antibody will serve as a therapeutically active component in the pharmaceutical composition in a manner similar to that observed for the native antagonist antibody, for example CHIR-5.9 or CHIR-12.12 as expressed by the hybridoma cell line 5.9 or 12.12, respectively. Methods are available in the art to determine if a variant anti-CD40 antibody retains the desired biological activity, and therefore serves as a therapeutically active component in the pharmaceutical composition. The biological activity of the antibody variants can be measured using assays specifically designed to measure the activity of the native antagonist antibody, including the assays described herein.

Cualquier composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti-CD40 antagonista que tenga las propiedades de unión descritas en el presente documento como el componente terapéuticamente activo puede usarse en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Por consiguiente, las composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización que comprenden uno o más de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención pueden prepararse como una solución o suspensión acuosa o no acuosa para la posterior administración a un sujeto de acuerdo con la invención. Cada una de estas composiciones comprenderá al menos uno de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la presente invención como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo. Por “componente terapéuticamente o profilácticamente activo” se entiende que el anticuerpo antiCD40 está específicamente incorporado en la composición para provocar una respuesta terapéutica o profiláctica con respecto al tratamiento, la prevención o el diagnóstico de una enfermedad o afección en un sujeto cuando se administra la composición farmacéutica a ese sujeto. De preferencia la composición farmacéutica comprende agentes estabilizantes, agentes de carga adecuados, o ambos para reducir al mínimo los problemas asociados con la pérdida de estabilidad y actividad biológica de las proteínas durante la preparación y el almacenamiento. Any pharmaceutical composition comprising an anti-CD40 antagonist antibody having the binding properties described herein as the therapeutically active component can be used in the methods disclosed herein. Accordingly, liquid, lyophilized or spray dried compositions comprising one or more of the anti-CD40 antagonist antibodies of the invention may be prepared as an aqueous or non-aqueous solution or suspension for subsequent administration to a subject according to the invention. . Each of these compositions will comprise at least one of the anti-CD40 antagonist antibodies of the present invention as a therapeutically or prophylactically active component. By "therapeutically or prophylactically active component" is meant that the antiCD40 antibody is specifically incorporated into the composition to elicit a therapeutic or prophylactic response with respect to the treatment, prevention or diagnosis of a disease or condition in a subject when the composition is administered. Pharmaceutical to that subject. Preferably the pharmaceutical composition comprises stabilizing agents, suitable loading agents, or both to minimize the problems associated with the loss of stability and biological activity of the proteins during preparation and storage.

Pueden añadirse compuestos de formulación a las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD40 antagonista de la invención. Estos compuestos de formulación pueden incluir, pero se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o agentes de carga. Los hidratos de carbono de preferencia incluyen azúcares o alcoholes de azúcares tales como mono-, di-o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sucrosa, dextrano, pullulano, dextrina, ciclodextrina α y β, almidón soluble, hidroxietil-almidón y carboximetilcelulosa, o sus mezclas. Se define “alcohol de azúcar” como un hidrocarburo C4 a C8 que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar pueden usarse de manera individual o en combinación. La concentración del azúcar o de alcohol de azúcar está entre 1,0 % y 7 % p/v., de más preferencia entre 2,0 % y 6,0 % p/v. Los aminoácidos de preferencia incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina, y betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. De preferencia los polímeros incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. Los tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en los documentos EP Nº 270.799 y Formulation compounds may be added to pharmaceutical compositions comprising an anti-CD40 antagonist antibody of the invention. These formulation compounds may include, but are limited to, oils, polymers, vitamins, carbohydrates, amino acids, salts, buffers, albumin, surfactants or fillers. Preferred carbohydrates include sugars or sugar alcohols such as mono-, di- or polysaccharides, or water soluble glucans. Saccharides or glucans may include fructose, glucose, mannose, sorbose, xylose, maltose, sucrose, dextran, pullulane, dextrin, cyclodextrin α and β, soluble starch, hydroxyethyl starch and carboxymethyl cellulose, or mixtures thereof. "Sugar alcohol" is defined as a C4 to C8 hydrocarbon having a hydroxyl group and includes galactitol, inositol, mannitol, xylitol, sorbitol, glycerol and arabitol. These sugars or sugar alcohols can be used individually or in combination. The concentration of sugar or sugar alcohol is between 1.0% and 7% w / v, more preferably between 2.0% and 6.0% w / v. Preferred amino acids include levógira (L) forms of carnitine, arginine, and betaine; however, other amino acids can be added. Preferably the polymers include polyvinylpyrrolidone (PVP) with an average molecular weight between 2,000 and 3,000, or polyethylene glycol (PEG) with an average molecular weight between 3,000 and 5,000. The surfactants that can be added to the formulation are shown in EP documents No. 270,799 and

268.110. 268,110.

Además, los anticuerpos pueden modificarse químicamente por conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida de circulación. Los polímeros preferidos y los procedimientos para ligarlos a péptidos, se muestran en las Patentes de EEUU Nº 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546. Los polímeros preferidos son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2 --CH2)n O--R donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. De preferencia, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, de más preferencia es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, de preferencia entre 1 y 1.000, de más preferencia entre 2 y 500. El PEG tiene de preferencia un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, de más preferencia entre 2.000 y 20.000, de la mayor preferencia entre 3.000 y 12.000. De preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, de más preferencia es un grupo hidroxi terminal. Este es el grupo hidroxi que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos pueden variarse para obtener un PEG/anticuerpo de la presente invención conjugado de manera covalente. In addition, the antibodies can be chemically modified by covalent conjugation to a polymer to, for example, increase their circulation half-life. Preferred polymers and methods for linking them to peptides are shown in US Pat. Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; and 4,609,546. Preferred polymers are polyoxyethylated polyols and polyethylene glycol (PEG). PEG is soluble in water at room temperature and has the general formula: R (O-CH2 -CH2) n O-R where R can be hydrogen, or a protecting group such as an alkyl or alkanol group. Preferably, the protecting group has between 1 and 8 carbons, more preferably it is methyl. The symbol n is a positive integer, preferably between 1 and 1,000, more preferably between 2 and 500. The PEG preferably has an average molecular weight between 1,000 and 40,000, more preferably between 2,000 and 20,000, most preferably between 3,000 and 12,000. Preferably, the PEG has at least one hydroxyl group, more preferably it is a terminal hydroxy group. This is the hydroxy group that is preferably activated to react with a free amino group in the inhibitor. However, it will be understood that the type and amount of the reactive groups can be varied to obtain a covalently conjugated PEG / antibody of the present invention.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Estos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. Se prefiere el POG. Una razón es porque la estructura central glicerol del glicerol polioxietilado es la misma estructura central que se presenta en la naturaleza en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono-, di-, triglicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no será considerada necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El POG tiene un peso molecular de preferencia en el mismo intervalo que PEG. La estructura para el POG se muestra en Knauf y col. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070, y puede encontrarse un análisis de conjugados POG/IL-2 en la Patente de EEUU Nº. 4.766.106. Water soluble polyoxyethylated polyols are also useful in the present invention. These include polyoxyethylated sorbitol, polyoxyethylated glucose, polyoxyethylated glycerol (POG) and the like. POG is preferred. One reason is because the glycerol central structure of polyoxyethylated glycerol is the same central structure that occurs in nature in, for example, animals and humans in mono-, di-, triglycerides. Therefore, this branching will not necessarily be considered as a foreign agent in the body. The POG has a molecular weight of preference in the same range as PEG. The structure for the POG is shown in Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263: 15064-15070, and an analysis of POG / IL-2 conjugates can be found in US Patent No. 4,766,106.

Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los procedimientos para preparar los sistemas de administración de liposomas se analizan en Gabizon y col. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsys. Eng. 9: 467. En la técnica se conocen otros sistemas de administración de fármacos y están descritos, por ejemplo, en Poznansky y col. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) páginas 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277. Another drug delivery system to increase circulatory half-life is the liposome. Procedures for preparing liposome delivery systems are discussed in Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; and Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsys. Eng. 9: 467. Other drug delivery systems are known in the art and are described, for example, in Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) pages 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277.

Los compuestos de formulación a incorporar en una composición farmacéutica deberían proporcionar estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Es decir, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debería retener su estabilidad física y/o química y debería tener la actividad biológica deseada, es decir, una o más de las actividades definidas anteriormente en el presente documento, incluidas, pero no limitadas a, inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T de Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares antiapoptóticas de “supervivencia” en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de la transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L de fase sólida; e inhibición de la proliferación de células B humanas malignas como se señaló en otra parte en el presente documento. The formulation compounds to be incorporated into a pharmaceutical composition should provide stability of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment. That is, the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment should retain its physical and / or chemical stability and should have the desired biological activity, i.e. one or more of the activities defined hereinbefore, including , but not limited to, inhibition of immunoglobulin secretion by normal human peripheral B cells stimulated by T cells; inhibition of survival and / or proliferation of normal human peripheral B cells stimulated by Jurkat T cells; inhibition of survival and / or proliferation of normal human peripheral B cells stimulated by cells expressing CD40L or soluble CD40 ligand (sCD40L); inhibition of "survival" intracellular antiapoptotic signals in any cell stimulated by solid phase sCD40L or CD40L; inhibition of CD40 signal transduction in any cell after binding with solid phase sCD40L or CD40L; and inhibition of the proliferation of malignant human B cells as noted elsewhere herein.

Los procedimientos para controlar la estabilidad de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide y Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los ensayos de estabilidad que se dan a conocer en el presente documento a continuación. En general, la estabilidad de las proteínas se mide a una temperatura elegida durante un período de tiempo especificado. En realizaciones de preferencia, una formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o al menos 6 meses, y/o es estable aproximadamente a 2-8 ºC durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses. Procedures for controlling protein stability are well known in the art. See, for example, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); and the stability tests disclosed in this document below. In general, protein stability is measured at a chosen temperature for a specified period of time. In preferred embodiments, a stable antibody pharmaceutical formulation provides stability of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment when stored at room temperature (approximately 25 ° C) for at least 1 month, at least 3 months, or at least 6 months, and / or is stable at approximately 2-8 ° C for at least 6 months, at least 9 months, at least 12 months, at least 18 months, at least 24 months.

Una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad física en un momento dado si no muestra signos visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o signos que pueden medirse (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de precipitación, agregación, y/o desnaturalización en esa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad química en un punto temporal dado si las medidas de estabilidad química son indicativas de que la proteína (es decir, el anticuerpo) mantiene su actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los procedimientos para controlar los cambios en la estabilidad química son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, procedimientos para detectar formas químicamente alteradas de la proteína tal como resultan del corte, usando, por ejemplo, SDSPAGE, SEC, y/o ionización de desorción ayudada por matriz/espectrometría de masas de dispersión; y degradación asociada con cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con desamidación), usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico. Véanse, por ejemplo, los procedimientos que se dan a conocer en el presente documento a continuación. A protein such as an antibody, when formulated in a pharmaceutical composition, is considered to maintain its physical stability at a given time if it does not show visual signs (i.e. discoloration or loss of transparency) or signs that can be measured (for example, using size exclusion chromatography (SEC) or UV light scattering) of precipitation, aggregation, and / or denaturation in that pharmaceutical composition. With respect to chemical stability, a protein such as an antibody, when formulated in a pharmaceutical composition, is considered to maintain its chemical stability at a given time point if chemical stability measures are indicative of the protein (i.e., the antibody) maintains its biological activity of interest in that pharmaceutical composition. Procedures for controlling changes in chemical stability are well known in the art and include, but are not limited to, procedures for detecting chemically altered forms of the protein as resulting from the cut, using, for example, SDSPAGE, SEC, and / or matrix-assisted desorption ionization / dispersion mass spectrometry; and degradation associated with changes in molecular charge (for example, associated with deamidation), using, for example, ion exchange chromatography. See, for example, the procedures disclosed in this document below.

Se considera que un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, cuando se formula en una composición farmacéutica, mantiene una actividad biológica deseada en un punto temporal dado si la actividad biológica deseada en ese momento está dentro del 30 %, de preferencia aproximadamente dentro del 20 % de la actividad biológica deseada exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica según se determina en un ensayo adecuado para la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento, y sus fragmentos que se unen al antígeno, pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Véanse también los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. Transplant. 2: 6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology 79: 439-444; y las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082. It is considered that an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment, when formulated in a pharmaceutical composition, maintains a desired biological activity at a given time point if the desired biological activity at that time is within 30%, of preference within approximately 20% of the desired biological activity exhibited at the time the pharmaceutical composition was prepared as determined in an assay suitable for the desired biological activity. Assays for measuring the desired biological activity of the anti-CD40 antagonist antibodies disclosed herein, and their fragments that bind to the antigen, can be carried out as described in the Examples herein. See also the tests described in Schultze et al. (1998) Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant 2: 6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol 3: 77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79: 439-444; and U.S. Patent Nos. 5,674,492 and 5,847,082.

En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede prepararse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos los procedimientos dados a conocer anteriormente en el presente documento. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIRIn some embodiments of the invention, the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment is formulated in a liquid pharmaceutical formulation. The anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment can be prepared using any method known in the art, including the methods disclosed herein above. In one embodiment, the antagonist anti-CD40 antibody, for example, the CHIR monoclonal antibody

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se produce de manera recombinante en una línea celular CHO. 12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment is produced recombinantly in a CHO cell line.

Tras su preparación y purificación, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede formularse como una formulación farmacéutica líquida de la manera expuesta en el presente documento. Donde el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debe almacenarse antes de su formulación, pueden congelarse, por ejemplo, a ≤ -20 ºC, y a continuación descongelarse a temperatura ambiente para formulación adicional. La formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. La cantidad de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno presente en la formulación tiene en consideración la vía de administración y el volumen de dosis deseado. Upon preparation and purification, the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment can be formulated as a liquid pharmaceutical formulation in the manner set forth herein. Where the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment must be stored before formulation, they can be frozen, for example, at ≤ -20 ° C, and then thawed at room temperature for further formulation. The liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment. The amount of antibody or its antigen binding fragment present in the formulation takes into account the route of administration and the desired dose volume.

De esta manera, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, o aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 10,0 mg/ml, aproximadamente 10,0 mg/ml hasta aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 25,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 30,0 mg/ml hasta aproximadamente 35,0 mg/ml, aproximadamente 35,0 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 40,0 mg/ml hasta aproximadamente 45,0 mg/ml, o aproximadamente 45,0 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras realizaciones, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 15:0 mg/ml, aproximadamente 16,0 mg/ml, aproximadamente 17,0 mg/ml, aproximadamente 18,0 mg/ml, aproximadamente 19,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 21,0 mg/ml, aproximadamente 22,0 mg/ml, aproximadamente 23,0 mg/ml, aproximadamente 24,0 mg/ml, o aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y un tampón que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, y otros valores tales dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0. En algunas realizaciones, el tampón mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente 7,0, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0. Thus, the liquid pharmaceutical composition comprises the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the CHIR-12.12 or CHIR-5.9 antibody, or its antigen binding fragment in a concentration of about 0.1 mg / ml to about 50 , 0 mg / ml, approximately 0.5 mg / ml to approximately 40.0 mg / ml, approximately 1.0 mg / ml to approximately 30.0 mg / ml, approximately 5.0 mg / ml to approximately 25.0 mg / ml, approximately 5.0 mg / ml to approximately 20.0 mg / ml, or approximately 15.0 mg / ml to approximately 25.0 mg / ml. In some embodiments, the liquid pharmaceutical composition comprises the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment in a concentration of about 0.1 mg / ml to about 5.0 mg / ml, about 5.0 mg / ml to approximately 10.0 mg / ml, approximately 10.0 mg / ml to approximately 15.0 mg / ml, approximately 15.0 mg / ml to approximately 20.0 mg / ml, approximately 20.0 mg / ml to approximately 25 , 0 mg / ml, approximately 25.0 mg / ml to approximately 30.0 mg / ml, approximately 30.0 mg / ml to approximately 35.0 mg / ml, approximately 35.0 mg / ml to approximately 40.0 mg / ml, approximately 40.0 mg / ml to approximately 45.0 mg / ml, or approximately 45.0 mg / ml to approximately 50.0 mg / ml. In other embodiments, the liquid pharmaceutical composition comprises the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment in a concentration of about 15: 0 mg / ml, about 16.0 mg / ml, about 17.0 mg / ml, approximately 18.0 mg / ml, approximately 19.0 mg / ml, approximately 20.0 mg / ml, approximately 21.0 mg / ml, approximately 22.0 mg / ml, approximately 23.0 mg / ml, approximately 24 , 0 mg / ml, or about 25.0 mg / ml. The liquid pharmaceutical composition comprises the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the CHIR-12.12 or CHIR-5.9 antibody, or its antigen binding fragment and a buffer that maintains the pH of the formulation in the range of approximately pH 5, 0 to about pH 7.0, including about pH 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 , 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, and other such values within from the range of about pH 5.0 to about pH 7.0. In some embodiments, the buffer maintains the pH of the formulation in the range of about pH 5.0 to about pH 6.5, about pH 5.0 to about pH 6.0, about pH 5.0 to about pH 5, 5, about pH 5.5 to about 7.0, about pH 5.5 to about pH 6.5, or about pH 5.5 to about pH 6.0.

En la formulación puede usarse cualquier tampón adecuado que mantenga el pH de la formulación del anticuerpo anti-CD40 líquida en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y la actividad biológica deseada del anticuerpo se mantengan como se señaló anteriormente en el presente documento. Los tampones incluyen pero no se limitan a, ácidos convencionales y sus sales, donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y sus sales que pueden usarse para tamponar la formulación farmacéutica líquida incluyen, pero no se limitan a, tampones de ácido succínico o succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La concentración del tampón en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón en la formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM. Any suitable buffer that maintains the pH of the liquid anti-CD40 antibody formulation in the range of about pH 5.0 to about pH 7.0 may be used in the formulation, provided that the physicochemical stability and the desired biological activity of the antibody are keep as noted earlier in this document. Buffers include but are not limited to conventional acids and their salts, where the counterion can be, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or magnesium. Examples of conventional acids and their salts that can be used to buffer the liquid pharmaceutical formulation include, but are not limited to, succinic acid or succinate, citric acid or citrate buffers, acetic acid or acetate, tartaric acid or tartrate, phosphoric acid or phosphate, gluconic acid or gluconate, glutamic acid or glutamate, aspartic acid or aspartate, maleic acid or maleate and malic or malate acid. The concentration of the buffer in the formulation can be from about 1 mM to about 50 mM, including about 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, or other similar values within the range of about 1 mM to about 50 mM. In some embodiments, the concentration of the buffer in the formulation is from about 5 mM to about 15 mM, including about 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, or other similar values within the range of about 5 mM to about 15 mM.

En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12,12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y tampón succinato o tampón citrato a una concentración que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, de preferencia aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5. Por “tampón succinato” o “tampón citrato” se entiende un tampón que comprende una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En una realización de preferencia, el contraión de succinato o citrato es el catión sodio, por consiguiente el tampón es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que sea eficaz cualquier catión. Otros posibles cationes de succinato o de citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio, amonio, calcio y magnesio. Como se señaló anteriormente, la concentración del tampón succinato o citrato en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores tales dentro del intervalo desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de tampón en la formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o aproximadamente 15 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, y tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato de sodio o citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, de preferencia aproximadamente 10 mM. In some embodiments of the invention, the liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the antagonist anti-CD40 antibody, for example, the CHIR 12,12 or CHIR-5.9 monoclonal antibody, or its antigen-binding fragment and succinate buffer or buffer. Citrate at a concentration that maintains the pH of the formulation in the range of about pH 5.0 to about pH 7.0, preferably about pH 5.0 to about pH 6.5. By "succinate buffer" or "citrate buffer" is meant a buffer comprising a succinic acid salt or a citric acid salt, respectively. In a preferred embodiment, the succinate or citrate counterion is the sodium cation, therefore the buffer is sodium succinate or sodium citrate, respectively. However, any cation is expected to be effective. Other possible succinate or citrate cations include, but are not limited to, potassium, ammonium, calcium and magnesium. As noted above, the concentration of the succinate or citrate buffer in the formulation may be from about 1 mM to about 50 mM, including about 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, or other such values within the range from about 1 mM to about 50 mM. In some embodiments, the concentration of buffer in the formulation is from about 5 mM to about 15 mM, including about 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, or about 15 mM. In other embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment at a concentration of about 0.1 mg / ml to about 50.0 mg / ml, or about 5.0 mg / ml to about 25.0 mg / ml, and succinate or citrate buffer, for example, sodium succinate buffer or sodium citrate, at a concentration of about 1 mM to about 20 mM, about 5 mM to about 15 mM, preferably about 10 mM.

Donde es deseable que la formulación farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 puede comprender además una cantidad de un agente de isotonicidad suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente isotónica. Por "prácticamente isotónica" se entiende que la formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240 mmol/kg hasta aproximadamente 360 mmol/kg, de preferencia aproximadamente 240 hasta aproximadamente 340 mmol/kg, de más preferencia aproximadamente 250 hasta aproximadamente 330 mmol/kg, aún de más preferencia aproximadamente 260 hasta aproximadamente 320 mmol/kg, de mayor preferencia aún aproximadamente 270 hasta aproximadamente 310 mmol/kg. Los procedimientos para determinar la isotonicidad de una solución son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar y col. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628. Where it is desirable that the liquid pharmaceutical formulation is practically isotonic, the liquid pharmaceutical formulation comprising a therapeutically effective amount of the antagonist anti-CD40 antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR5.9, or its antigen binding fragment , and a buffer to maintain the pH of the formulation within the range of about pH 5.0 to about pH 7.0 may further comprise an amount of an isotonicity agent sufficient to make the formulation practically isotonic. By "practically isotonic" is meant that the aqueous formulation has an osmolarity of about 240 mmol / kg to about 360 mmol / kg, preferably about 240 to about 340 mmol / kg, more preferably about 250 to about 330 mmol / kg, even more preferably about 260 to about 320 mmol / kg, more preferably still about 270 to about 310 mmol / kg. The procedures for determining the isotonicity of a solution are known to those skilled in the art. See, for example, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628.

Los expertos en la técnica están familiarizados con una diversidad de solutos farmacéuticamente aceptables útiles para proporcionar isotonicidad en las composiciones farmacéuticas. El agente de isotonicidad puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente invención hasta un valor prácticamente igual al de un líquido corporal. Es deseable usar un agente de isotonicidad fisiológicamente aceptable. Por consiguiente, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, puede comprender además componentes que pueden usarse para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares (polioles), incluidos, pero no limitados a, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol, y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos y sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto en la técnica conocerá otros agentes que son adecuados para proporcionar la tonicidad óptima de la formulación líquida. Those skilled in the art are familiar with a variety of pharmaceutically acceptable solutes useful for providing isotonicity in pharmaceutical compositions. The isotonicity agent can be any reagent capable of adjusting the osmotic pressure of the liquid pharmaceutical formulation of the present invention to a value practically equal to that of a body fluid. It is desirable to use a physiologically acceptable isotonicity agent. Accordingly, the liquid pharmaceutical formulation comprising a therapeutically effective amount of the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, and a buffer to maintain the pH of The formulation within the range of about pH 5.0 to about pH 7.0 may further comprise components that can be used to provide isotonicity, for example, sodium chloride; amino acids such as alanine, valine and glycine; sugars and sugar alcohols (polyols), including, but not limited to, glucose, dextrose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, trehalose, glycerol, sorbitol, and xylitol; acetic acid, other organic acids and their salts, and relatively minor amounts of citrates or phosphates. The person skilled in the art will know other agents that are suitable to provide the optimum tonicity of the liquid formulation.

En algunas realizaciones de preferencia, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 comprende además cloruro de sodio como el agente de isotonicidad. La concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 170 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 160 mM, aproximadamente 135 mM hasta aproximadamente 155 mM, aproximadamente 140 mM hasta aproximadamente 155 mM, o aproximadamente 145 mM hasta aproximadamente 155 mM. En una realización tal, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM. En otra de tales realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente cloruro de sodio 150 mM y aproximadamente succinato de sodio o citrato de sodio 10 mM, a un pH de aproximadamente pH 5,5. In some preferred embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprising a therapeutically effective amount of an anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, and a buffer for maintaining the pH of the formulation within the range of about pH 5.0 to about pH 7.0 further comprises sodium chloride as the isotonicity agent. The concentration of sodium chloride in the formulation will depend on the contribution of other components to the tonicity. In some embodiments, the concentration of sodium chloride is about 50 mM to about 300 mM, about 50 mM to about 250 mM, about 50 mM to about 200 mM, about 50 mM to about 175 mM, about 50 mM to about 150 mM , approximately 75 mM to approximately 175 mM, approximately 75 mM to approximately 150 mM, approximately 100 mM to approximately 175 mM, approximately 100 mM to approximately 200 mM, approximately 100 mM to approximately 150 mM, approximately 125 mM to approximately 175 mM, approximately 125 mM to approximately 150 mM, approximately 130 mM to approximately 170 mM, approximately 130 mM to approximately 160 mM, approximately 135 mM to approximately 155 mM, approximately 140 mM to approximately 155 mM, or approximately 145 mM to approximately 155 mM. In such an embodiment, the concentration of sodium chloride is approximately 150 mM. In another such embodiment, the concentration of sodium chloride is about 150 mM, the buffer is sodium succinate buffer or sodium citrate in a concentration of about 5 mM to about 15 mM, the liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment and the formulation has a pH of about pH 5.0 to about pH 7.0, about pH 5, 0 to about pH 6.0, or about pH 5.5 to about pH 6.5. In other embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, at a concentration of approximately 0.1 mg / ml to approximately 50.0 mg / ml or approximately 5.0 mg / ml to approximately 25.0 mg / ml, approximately 150 mM sodium chloride and approximately 10 mM sodium succinate or sodium citrate, at a pH of approximately pH 5, 5.

La degradación proteica por congelación descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de una formulación farmacéutica líquida de la presente invención puede inhibirse por incorporación de tensioactivos en la formulación para disminuir la tensión superficial en la interfase solución-aire. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR 5,9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 y comprende además un tensioactivo. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, un agente de isotonicidad tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, y comprende además un tensioactivo. Protein degradation by freezing thawing or mechanical shearing during the processing of a liquid pharmaceutical formulation of the present invention can be inhibited by incorporation of surfactants in the formulation to decrease surface tension at the solution-air interface. Accordingly, in some embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the antagonist anti-CD40 antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR 5.9, or its antigen binding fragment, a buffer to maintain The pH of the formulation within the range of about pH 5.0 to about pH 7.0 and further comprises a surfactant. In other embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, a buffer to maintain the pH of the formulation within the range of about pH 5.0 to about pH 7.0, an isotonicity agent such as sodium chloride in a concentration of about 50 mM to about 300 mM, and further comprises a surfactant.

Los tensioactivos típicos usados son tensioactivos no iónicos, incluidos los ésteres de polioxietilensorbitol tales como polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic F68; alcoholes de polioxietileno tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y polioxietilen-p-toctilfenol tal como Triton X-100. La estabilización clásica de compuestos farmacéuticos por medio de tensioactivos o emulsivos se describe, por ejemplo, en Levine y col. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165. Un tensioactivo de preferencia usada en la práctica de la presente invención es polisorbato 80. Cuando se incluye un tensioactivo, éste se añade típicamente en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 % (p/v), aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,4 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,005 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,005 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,03 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,03 % hasta aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 0,5 %, o aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 0,2 %. Typical surfactants used are nonionic surfactants, including polyoxyethylene sorbitol esters such as polysorbate 80 (Tween 80) and polysorbate 20 (Tween 20); polyoxypropylene-polyoxyethylene esters such as Pluronic F68; polyoxyethylene alcohols such as Brij 35; simethicone; polyethylene glycol such as PEG400; lysophosphatidylcholine; and polyoxyethylene-p-toctylphenol such as Triton X-100. Classical stabilization of pharmaceutical compounds by means of surfactants or emulsifiers is described, for example, in Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160-165. A preferred surfactant used in the practice of the present invention is polysorbate 80. When a surfactant is included, it is typically added in an amount from about 0.001% to about 1.0% (w / v), about 0.001% to about 0.5%, approximately 0.001% to approximately 0.4%, approximately 0.001% to approximately 0.3%, approximately 0.001% to approximately 0.2%, approximately 0.005% to approximately 0.5%, approximately 0.005% to approximately 0.2%, about 0.01% to about 0.5%, about 0.01% to about 0.2%, about 0.03% to about 0.5%, about 0.03% to about 0, 3%, about 0.05% to about 0.5%, or about 0.05% to about 0.2%.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, el tampón es tampón de succinato de sodio o de citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM; la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5 y la formulación comprende además un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 % o aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente de isotonicidad, tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIRAccordingly, in some embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises a therapeutically effective amount of the antagonist anti-CD40 antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, the buffer is buffer of sodium succinate or sodium citrate in a concentration of about 1 mM to about 50 mM, about 5 mM to about 25 mM, or about 5 mM to about 15 mM; the formulation has a pH of about pH 5.0 to about pH 7.0, about pH 5.0 to about pH 6.0, or about pH 5.5 to about pH 6.5 and the formulation further comprises a surfactant, for example, polysorbate 80, in an amount from about 0.001% to about 1.0% or about 0.001% to about 0.5%. Such formulations may optionally comprise an isotonicity agent, such as sodium chloride in a concentration of about 50 mM to about 300 mM, about 50 mM to about 200 mM, or about 50 mM to about 150 mM. In other embodiments, the liquid pharmaceutical formulation comprises the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the CHIR monoclonal antibody.

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; cloruro de sodio aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo cloruro de sodio a aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 20 mM; incluyendo succinato de sodio o citrato de sodio a aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; y opcionalmente un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 %, incluyendo aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %; donde la formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0. 12.12 or CHIR-5.9, or its antigen binding fragment, in a concentration of about 0.1 mg / ml to about 50.0 mg / ml or about 5.0 mg / ml to about 25.0 mg / ml, including approximately 20.0 mg / ml; about 50 mM sodium chloride to about 200 mM, including about 150 mM sodium chloride; sodium succinate or sodium citrate at a concentration of about 5 mM to about 20 mM; including sodium succinate or sodium citrate at about 10 mM; sodium chloride at a concentration of about 50 mM to about 200 mM, including about 150 mM; and optionally a surfactant, for example, polysorbate 80, in an amount from about 0.001% to about 1.0%, including about 0.001% to about 0.5%; where the liquid pharmaceutical formulation has a pH of about pH 5.0 to about pH 7.0, about pH 5.0 to about pH 6.0, about pH 5.0 to about pH 5.5, about pH 5.5 to about pH 6.5, or about pH 5.5 to about pH 6.0.

La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmente libre de conservantes y otros vehículos, excipientes, o estabilizadores señalados anteriormente en el presente documento. Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento anteriormente con la condición de que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Los ejemplos de vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables incluyen, pero no se limitan a, agentes tamponadores adicionales, codisolventes, tensioactivos, antioxidantes incluidos ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos de metales (por ejemplo, complejos Zn-proteína), y polímeros biodegradables tales como poliésteres. Puede encontrarse una discusión detallada de formulación y selección de vehículos, estabilizadores e isomolitos farmacéuticamente aceptables en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). The liquid pharmaceutical formulation may be essentially free of preservatives and other vehicles, excipients, or stabilizers noted hereinbefore. Alternatively, the formulation may include one or more preservatives, for example, pharmaceutically acceptable antibacterial agents, carriers, excipients or stabilizers described hereinbefore with the proviso that they do not adversely affect the physicochemical stability of the antagonist anti-CD40 antibody. or its antigen binding fragment. Examples of acceptable carriers, excipients or stabilizers include, but are not limited to, additional buffering agents, co-solvents, surfactants, antioxidants including ascorbic acid and methionine, chelating agents such as EDTA, metal complexes (eg, Zn-protein complexes) , and biodegradable polymers such as polyesters. A detailed discussion of formulation and selection of pharmaceutically acceptable vehicles, stabilizers and isomolites can be found in Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed .; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

Una vez que la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica descrita en el presente documento está preparada, puede liofilizarse para evitar la degradación. Los procedimientos para liofilizar composiciones líquidas se conocen por los expertos en la técnica. Justo antes de usar, la composición puede reconstituirse con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina, por ejemplo) que puede incluir componentes adicionales. Tras la reconstitución, la composición se administra de preferencia a los sujetos usando los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Once the liquid pharmaceutical formulation or other pharmaceutical composition described herein is prepared, it can be lyophilized to prevent degradation. Procedures for lyophilizing liquid compositions are known to those skilled in the art. Just before using, the composition can be reconstituted with a sterile diluent (Ringer's solution, distilled water or saline, for example) that may include additional components. After reconstitution, the composition is preferably administered to the subjects using procedures known to those skilled in the art.

Uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas en la fabricación de medicamentos Use of anti-CD40 antagonist antibodies in the manufacture of medicines

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con el tratamiento con al menos una terapia distinta. Por “coordinado” se entiende que el medicamento se usará antes, durante, o después del tratamiento del sujeto con al menos una terapia distinta. Los ejemplos de otras terapias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos anteriormente en el presente documento, es decir, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares); terapia de radiación; terapia tal como terapia de esteroides y terapia no esteroídica, terapia de hormonas, terapia de citoquinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo,agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora y terapia antiinflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta y similares, donde el tratamiento con la terapia adicional o con las terapias adicionales tiene lugar antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con el medicamento para tratar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con el tratamiento con al menos una terapia distinta como se señaló anteriormente en el presente documento. The present invention also provides the use of an anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment in the manufacture of a medicament for the treatment of an autoimmune disease and / or an inflammatory disease in a subject, in which the medicament is coordinated with treatment with at least one different therapy. By "coordinated" it is meant that the medication will be used before, during, or after the treatment of the subject with at least one different therapy. Examples of other therapies include, but are not limited to, those described above herein, that is, surgery or surgical procedures (eg, splenectomy, hepatectomy, lymphadenectomy, leukophoresis, cell, tissue or organ transplantation, intestinal procedures , organ perfusion and the like); radiation therapy; therapy such as steroid therapy and non-steroidal therapy, hormone therapy, cytokine therapy, therapy with dermatological agents (for example, topical agents used to treat skin conditions such as allergies, contact dermatitis and psoriasis), immunosuppressive therapy and distinct and similar monoclonal antibody anti-inflammatory therapy, where treatment with additional therapy or with additional therapies takes place before, during, or after the treatment of the subject with the medication to treat an autoimmune disease and / or an inflammatory disease in a subject , in which the medication is coordinated with the treatment with at least one different therapy as noted hereinbefore.

En algunas realizaciones, el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, , por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 revelado en el presente documento, o su fragmento de unión al antígeno, está coordinado con el tratamiento con otras dos terapias. Cuando el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista está coordinado con el tratamiento con otras dos terapias, el uso del medicamento puede ser antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con una o ambas de las otras terapias. In some embodiments, the medicament comprising the anti-CD40 antagonist antibody, for example the CHIR-12.12 or CHIR-5.9 monoclonal antibody disclosed herein, or its antigen binding fragment, is coordinated with treatment with two other therapies When the medication comprising the anti-CD40 antagonist antibody is coordinated with the treatment with two other therapies, the use of the medication may be before, during, or after the treatment of the subject with one or both of the other therapies.

La presente invención proporciona también el uso de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 revelado en el presente documento, The present invention also provides the use of an anti-CD40 antagonist antibody, for example the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9 disclosed herein,

: o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento se usa en un sujeto que ha sido pretratado con al menos otra terapia. Por “pretratado” o “pretratamiento” se quiere decir que el sujeto se ha tratado con una o más or its antigen-binding fragment in the manufacture of a medicament for treating an autoimmune disease and / or an inflammatory disease in a subject, in which the medicament is used in a subject that has been pretreated with at least one other therapy. By "pretreated" or "pretreatment" is meant that the subject has been treated with one or more

terapias, antes de recibir el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista therapies, before receiving the medicine comprising the anti-CD40 antagonist antibody

: o su fragmento de unión al antígeno. “Pretratado” o “pretratamiento” incluye sujetos que se han tratado con la otra terapia o las otras terapias dentro de 2 años, dentro de 18 meses, dentro de 1 año, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, dentro de 6 semanas, dentro de 1 mes, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 semana, dentro de 6 días, dentro de 5 días, dentro de 4 días, dentro de 3 días, dentro de 2 días, o incluso dentro de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende el anticuerpo antiCD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que se dan a conocer en el presente documento, o su fragmento de unión al antígeno. No es necesario que el sujeto haya sido un paciente que responde al tratamiento previo con la anterior terapia o anteriores terapias. Por consiguiente, el sujeto que recibe el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno podría haber respondido, o podría haber fallado al responder, al pretratamiento con la anterior terapia contra el cáncer, o a una o más terapias anteriores donde el tratamiento previo comprendía múltiples terapias. or its antigen binding fragment. "Pretreated" or "pretreatment" includes subjects who have been treated with the other therapy or other therapies within 2 years, within 18 months, within 1 year, within 6 months, within 2 months, within 6 weeks , within 1 month, within 4 weeks, within 3 weeks, within 2 weeks, within 1 week, within 6 days, within 5 days, within 4 days, within 3 days, within 2 days , or even within 1 day before the start of treatment with the medicament comprising the anti-CD40 antagonist antibody, for example, the monoclonal antibody CHIR-12.12 or CHIR-5.9 disclosed herein, or its binding fragment to the antigen. It is not necessary that the subject has been a patient who responds to previous treatment with the previous therapy or previous therapies. Therefore, the subject receiving the medicament comprising the anti-CD40 antagonist antibody or its antigen binding fragment could have responded, or could have failed to respond, to pretreatment with the previous cancer therapy, or to one or more therapies. previous where the previous treatment included multiple therapies.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no como limitación. The following examples are offered by way of illustration and not as a limitation.

EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas usados en los ejemplos a continuación son CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Los anticuerpos anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40 humano del subtipo IgG1 humana generados por inmunización de ratones transgénicos que llevan el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera K humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California)). Las células de insectos SF9 que expresan dominio extracelular CD40 se usan como inmunógeno. The anti-CD40 antagonist antibodies used in the examples below are CHIR-5.9 and CHIR-12.12. The anti-CD40 antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 are human anti-CD40 monoclonal antibodies (mAb) of the human IgG1 subtype generated by immunization of transgenic mice carrying the human IgG1 heavy chain locus and the human K light chain locus (XenoMouse® technology; Abgenix; Fremont, California). SF9 insect cells that express CD40 extracellular domain are used as immunogens.

En resumen, se condensaron esplenocitos de ratones inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x 63Ag8.653 en una relación de 10:1 usando polietilenglicol al 50 % como está descrito previamente por de Boer y col. (1988) J. Immunol. Meth. 113: 143. Las células condensadas se resuspendieron en medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM), y hIL-6 0,5 ng/ml (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). A continuación se distribuyeron las células fusionadas entre los pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos, de manera que cada una contenía 1 hibridoma en crecimiento en promedio. In summary, splenocytes from mice immunized with murine myeloma cells SP 2/0 or P 3 x 63 Agg 6,653 were condensed in a 10: 1 ratio using 50% polyethylene glycol as previously described by de Boer et al. (1988) J. Immunol. Meth. 113: 143. The condensed cells were resuspended in complete IMDM medium supplemented with hypoxanthine (0.1 mM), aminopterin (0.01 mM), thymidine (0.016 mM), and hIL-6 0.5 ng / ml (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). The fused cells were then distributed between the wells of 96-well tissue culture plates, so that each contained 1 growing hybridoma on average.

Tras 10-14 días se analizaron los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas para detectar la producción de anticuerpos específicos. Para la detección de anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, se combinaron los sobrenadantes de cada pocillo y se probaron para especificidad de actividad anti-CD 40 por ELISA en primer lugar. A continuación se usaron After 10-14 days the supernatants of the hybridoma populations were analyzed to detect the production of specific antibodies. For the detection of specific antibodies by hybridoma clones, supernatants from each well were combined and tested for specificity of anti-CD 40 activity by ELISA first. They were then used

5 los positivos para tinción fluorescente de células de las células B transformadas con VEB como se describió para el ensayo FACS anteriormente. Las células de hibridomas positivos se clonaron dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS que contenía hIL-6 0,5 ng/ml. 5 positive for fluorescent staining of cells of B cells transformed with EBV as described for the FACS assay above. Positive hybridoma cells were cloned twice by limiting dilution in IMDM / FBS containing 0.5 ng / ml hIL-6.

Un total de 31 esplenocitos se condensaron con las células de mieloma murino SP 2/0 para A total of 31 splenocytes were condensed with the murine myeloma cells SP 2/0 to

10 generar 895 anticuerpos que reconocen el CD40 recombinante en ELISA. En promedio aproximadamente el 10 % de los hibridomas producidos usando tecnología Abgenix XenoMouse® pueden contener la cadena ligera lambda de ratón en lugar de la cadena kappa humana. Se seleccionan los anticuerpos que contenían cadena ligera lambda de ratón y se descartaron. Se seleccionó un subgrupo de 260 anticuerpos que también mostraban unión al 10 generate 895 antibodies that recognize the recombinant CD40 in ELISA. On average about 10% of hybridomas produced using Abgenix XenoMouse® technology may contain the mouse lambda light chain instead of the human kappa chain. Antibodies containing mouse lambda light chain were selected and discarded. A subset of 260 antibodies was selected that also showed binding to the

15 CD40 de superficie celular para otro análisis. Los hibridomas estables seleccionados durante una serie de procedimientos de subclonación se usaron para caracterización adicionnal en ensayos de unión y funcionales. 15 CD40 cell surface for another analysis. Stable hybridomas selected during a series of subcloning procedures were used for additional characterization in binding and functional assays.

Se identificaron clones de otros 7 hibridomas que tenían actividad antagonista. En base a su Clones of another 7 hybridomas that had antagonistic activity were identified. Based on your

20 potencia antagonista relativa y actividades de ADCC, se seleccionaron dos clones de hibridoma para evaluación adiconal. Se llaman: 131.2F8.5.9 (5.9) y 153.8E2.D10,D6.12.12 (12.12). 20 relative antagonistic potency and ADCC activities, two hybridoma clones were selected for further evaluation. They are called: 131.2F8.5.9 (5.9) and 153.8E2.D10, D6.12.12 (12.12).

Tabla 1. Resumen del grupo de datos inicial con anticuerpos IgG1 anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIRTable 1. Summary of the initial data set with CHIR-5.9 and CHIR anti-CD40 IgG1 antibodies

12.12. 12.12.

25 25

Hibridom a madre Hybridoma to mother: Clones de hibridoma unión a la superfici e celular Antagonist a ADC C CD C CMCC # Secuenci a de ADN de la región V Hybridoma clones cell surface junction Antagonist to ADC C CD C CMCC # DNA sequence of region V

131.2F5 131.2F5: 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ - 12047 Sí 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ - 12047 Yes

153.8E2 153.8E2: 153.8E2D10D6.12 .9 +++ ND ND ND 12063 Sí 153.8E2D10D6.12 .9 +++ ND ND ND 12063 Yes

La línea de hibridoma de ratón 131.2F8.5.9 (Nº de CMCC 12047) y la línea de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (Nº de CMCC 12056) se han depositado en la American Type Culture The mouse hybridoma line 131.2F8.5.9 (CMCC No. 12047) and the hybridoma line 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC No. 12056) have been deposited with the American Type Culture

Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-22209 (EE.UU.)) bajo Número de Depósito de Patente PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente. Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-22209 (USA)) under Patent Deposit Number PTA-5542 and PTA-5543, respectively.

Los cDNA que codifican las regiones variables de los de los anticuerpos candidatos se amplificaron por PCR, se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se expusieron en las figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 2 (cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 4 (cadena pesada para mAb CHIR-12.12). Una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-12.12 se muestra en la figura 1B (véase también SEC ID Nº: 5), que difiere de la SEC ID Nº: 4 en que tiene un residuo de serina sustituido por el residuo de alanita en la posición 153 de la SEC ID Nº: 4. Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se exponen en las figuras 2ª y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 11 (secuencia codificante para cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 3 (secuencia codificante para cadena pesada para mAb CHIR12.12). Las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-5.9 se exponen en las figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 6 (cadena ligera para mAb CHIR-5-9) y SEC ID Nº: 7 (cadena pesada para mAb CHIR-59). Una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-5-9 se muestra en la figura 3B (véase también SEC ID Nº: 8), que difiere de SEC ID Nº: 7 en que tiene un residuo se serina sustituido por el residuo de alanina en la posición 158 de la SEC ID Nº: 7. The cDNAs encoding the variable regions of the candidate antibodies were amplified by PCR, cloned and sequenced. The amino acid sequences for the light chain and heavy chain of the CHIR-12.12 antibody were set forth in Figures 1A and 1B, respectively. See also SEQ ID NO: 2 (light chain for CHIR-12.12 mAb) and SEQ ID NO: 4 (heavy CHIR-12.12 mAb chain). A variant of the CHIR-12.12 mAb heavy chain is shown in Figure 1B (see also SEQ ID NO: 5), which differs from SEQ ID NO: 4 in that it has a serine residue substituted by the alanite residue in position 153 of SEQ ID NO: 4. Nucleotide sequences encoding the light chain and heavy chain of the CHIR-12.12 antibody are set forth in Figures 2 and 2B, respectively. See also SEQ ID NO: 11 (light chain coding sequence for CHIR-12.12 mAb) and SEQ ID NO: 3 (heavy chain coding sequence for CHIR12.12 mAb). The amino acid sequences for the light chain and heavy chain of the CHIR-5.9 antibody are set forth in Figures 3A and 3B, respectively. See also SEQ ID NO: 6 (light chain for CHIR-5-9 mAb) and SEQ ID NO: 7 (heavy CHIR-59 mAb chain). A variant of the CHIR-5-9 mAb heavy chain is shown in Figure 3B (see also SEQ ID NO: 8), which differs from SEQ ID NO: 7 in that it has a serine residue substituted by the alanine residue at position 158 of SEQ ID NO: 7.

Como se espera para los anticuerpos derivados de hibridomas independientes, hay variación sustancial en las secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes complementarias (CDR). La diversidad en la región CDR3 de VH se cree que el lo que determina más significativamente la especificidad del anticuerpo. As expected for antibodies derived from independent hybridomas, there is substantial variation in nucleotide sequences in the complementary determining regions (CDR). The diversity in the CDR3 region of VH is believed to be what most significantly determines the specificity of the antibody.

Como se muestra por medio del análisis FACS, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen específicamente al CD40 humano y pueden evitar la unión del ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con la unión previa del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular. La afinidad de unión de CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 al CD40 humano es de 5 x 10-10 M. As shown by FACS analysis, CHIR-5.9 and CHIR-12.12 specifically bind to human CD40 and can prevent binding of the CD40 ligand. Both mAbs can compete with the prior binding of the CD40 ligand to the CD40 of the cell surface. The binding affinity of CHIR-5.9 to human CD40 is 1.2 x 10-8 M and the binding affinity of CHIR-12.12 to human CD40 is 5 x 10-10 M.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9 son fuertes antagonistas e inhiben proliferación mediada por ligando de CD40 in vitro de células B normales. The monoclonal antibodies CHIR-12.12 and CHIR-5.9 are strong antagonists and inhibit CD40 ligand-mediated proliferation of normal B cells in vitro.

Ejemplo 1. CHIR-12.12 bloquea la señalización celular mediada por CD40L Example 1. CHIR-12.12 blocks cell signaling mediated by CD40L

El ligando de CD40 soluble (CD40L) activa las células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales, incluidos el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la activación de las vías de señales de NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona señales de supervivencia por reducción de PARP escindido e inducción de proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L también recluta TRAF2 y TRAF3 para la unión al dominio citoplasmático de CD40. The soluble CD40 ligand (CD40L) activates B cells and induces various aspects of functional responses, including increased survival and proliferation, and activation of the NFκB, ERK / MAPK, PI3K / Akt and p38 signal pathways. . In addition, CD40L-mediated CD40 stimulation provides survival signals by reduction of cleaved PARP and induction of antiapoptotic proteins, XIAP and Mcl-1, in normal B cells. CD40L-mediated CD40 stimulation also recruits TRAF2 and TRAF3 for binding to the cytoplasmic domain of CD40.

Los siguientes estudios demuestran que CHIR-12.12 inhibió directamente todos estos efectos de la estimulación en las células B humanas normales. Por ejemplo, el tratamiento con CHIRThe following studies show that CHIR-12.12 directly inhibited all these stimulation effects in normal human B cells. For example, treatment with CHIR

12.12 dio como resultado el aumento de escisión de caspasa-9, caspasa-3 y PARP así como la reducción de XIAP y Mcl-1 de una manera dependiente del tiempo y de la dosis, restaurando la apoptosis de las células B. El tratamiento con CHIR-12.12 también inhibió la fosforilación de IκB quinasa (IKK) α y β (vía de NFκB), ERK, Akt y p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por CD40L. Además, se encontró que CHIR-12.12 no provocó estos efectos apoptóticos sin la estimulación inicial de CD40 mediada por CD40L. 12.12 resulted in the increase in excision of caspase-9, caspase-3 and PARP as well as the reduction of XIAP and Mcl-1 in a time and dose dependent manner, restoring B-cell apoptosis. Treatment with CHIR-12.12 also inhibited the phosphorylation of IκB kinase (IKK) α and β (NFκB pathway), ERK, Akt and p38 in response to CD40L-mediated CD40 stimulation. In addition, it was found that CHIR-12.12 did not cause these apoptotic effects without the initial stimulation of CD40 mediated by CD40L.

CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 induciendo la escisión de PARP CHIR-12.12 inhibited CD40 ligand-mediated survival by inducing PARP cleavage

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 0.6 x 106 normal human B cells from healthy donors (percentage purity between 85 and 95%) were stimulated with 1 µg / ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Then CHIR-12.12 (10 µg / ml) and control IgG were added. Cells were collected at 0 and 20 minutes, at 2 hours, 6 hours, 18 hours and 26 hours. Excised caspase 9, cleaved caspase 3, cleaved PARP and β actin controls were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, se observó que la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporcionó señales de supervivencia ya que no dio lugar a aumentos de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida Briefly, it was observed that CD40L-mediated CD40 stimulation provided survival signals as it did not lead to increases in cleaved caspase 9, cleaved caspase 3

o PARP escindida con el tiempo, indicando que las células no estaban sufriendo apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado un aumento de estos productos de escisión, indicando que el tratamiento con CHIR-12.12 anuló los efectos de la unión de CD40L en las señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con cCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no mostrados). or PARP cleaved over time, indicating that the cells were not suffering apoptosis. However, treatment with CHIR-12.12 resulted in an increase in these cleavage products, indicating that treatment with CHIR-12.12 nullified the effects of CD40L binding on survival signals in normal B cells stimulated with cCD40L, restoring apoptosis of B cells (data not shown).

CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia” CHIR-12.12 inhibited the expression of "survival" antiapoptotic proteins

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de Mcl-1, XIAP, CD40 y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 0.6 x 10 6 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85-95%) were stimulated with 1 µg / ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Then CHIR-12.12 (10 µg / ml) and control IgG were added. Cells were collected at 0 and 20 minutes, at 2 hours, 6 hours, 18 hours and 26 hours. Mcl-1, XIAP, CD40 and β actin controls were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, la estimulación con sCD40L dio como resultado la expresión sostenida de Mcl-1 y XIAP con el tiempo. Sin embargo, el tratamiento de las células estimuladas con sCD40L con CHIR-12.12 dio como resultado una disminución en la expresión de estas proteínas con el tiempo (datos no mostrados). Como Mcl-1 y XIAP son señales de “supervivencia” capaces de bloquear la vía apoptótica, estos resultados demuestran que el tratamiento con CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en las células B normales estimuladas con sCD40L. Briefly, stimulation with sCD40L resulted in sustained expression of Mcl-1 and XIAP over time. However, treatment of sCD40L stimulated cells with CHIR-12.12 resulted in a decrease in the expression of these proteins over time (data not shown). Since Mcl-1 and XIAP are "survival" signals capable of blocking the apoptotic pathway, these results demonstrate that treatment with CHIR-12.12 eliminates blockage against apoptosis in normal B cells stimulated with sCD40L.

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) en células B normales. Treatment with CHIR-12.12 inhibited the phosphorylation of IKKα (Ser180) and IKKβ (Ser 181) in normal B cells.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los controles de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) y de IKK β total en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 1.0 x 106 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85-95%) were stimulated with 1 µg / ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Then CHIR-12.12 (10 µg / ml) and control IgG were added. Cells were collected at 0 and 20 minutes. IKK α (Ser180) and IKK β (Ser 181) and total IKK β controls were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, la estimulación por medio de sCD40L dio como resultado la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) a lo largo del tiempo; sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló esta respuesta a la estimulación de sCD40L en las células B normales (datos no mostrados). Briefly, stimulation by means of sCD40L resulted in the phosphorylation of IKKα (Ser180) and IKKβ (Ser 181) over time; however, treatment with CHIR-12.12 nullified this response to stimulation of sCD40L in normal B cells (data not shown).

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 de una manera dependiente de la dosis. Treatment with CHIR-12.12 inhibited CD40 ligand-mediated survival in a dose-dependent manner.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 24 horas. Se detectaron los controles de PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 0.6 x 106 normal human B cells from healthy donors (percentage purity between 85 and 95%) were stimulated with 1 µg / ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 µg / ml) and control IgG were then added. Cells were collected at 24 hours. The cleaved PARP and β actin controls were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y por lo tanto anuló la vía de señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados). Briefly, treatment with CHIR-12.12 resulted in an increase in PARP cleavage in cells stimulated with sCD40L in a dose-dependent manner and therefore nullified the survival signal pathway in normal B cells stimulated with sCD40L (data not shown).

CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia” de una manera dependiente de la dosis. CHIR-12.12 inhibited the expression of "survival" antiapoptotic proteins in a dose-dependent manner.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 22 horas. Se detectaron los controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 0.6 x 106 normal human B cells from healthy donors (percentage purity between 85 and 95%) were stimulated with 1 µg / ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (0.5, 2 and 10 µg / ml) and control IgG were then added. Cells were collected at 22 hours. The controls of Mcl-1, XIAP, cleaved PARP and β actin were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 redujo la expresión de Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y por lo tanto anuló estos bloqueos a la vía apoptótica en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados). Briefly, treatment with CHIR-12.12 reduced the expression of Mcl-1 and XIAP and increased the expression of PARP in cells stimulated with sCD40L in a dose-dependent manner and therefore nullified these blockages to the apoptotic pathway in B cells. normal stimulated with sCD40L (data not shown).

CHIR-12.12 no afecta la expresión de proteínas antiapoptóticas, PARP escindida y XIAP, en ausencia de señales de CD40L soluble. CHIR-12.12 does not affect the expression of antiapoptotic proteins, cleaved PARP and XIAP, in the absence of soluble CD40L signals.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control sola (es decir, las células no se estimularon previamente con sCD40L antes de añadir el anticuerpo). Las células se recogieron a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron los controles de XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, 1.0 x 10 6 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85-95%) were stimulated with CHIR-12.12 (10 µg / ml) and control IgG alone (i.e., non-cell were previously stimulated with sCD40L before adding the antibody). Cells were collected at 0, 4, 14 and 16 hours. XIAP, cleaved PARP and β actin controls were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, los resultados muestran que sin estimulación de sCD40L, las células expresaron Briefly, the results show that without stimulation of sCD40L, the cells expressed

concentraciones aumentadas de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP permaneció constante, tanto en las células tratadas con IgG de control como en las tratadas con CHIR-12.12 (datos no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no provoca apoptosis en las células B humanas normales sin estimulación de CD40L. Increased concentrations of cleaved PARP, while XIAP expression remained constant, both in the cells treated with control IgG and those treated with CHIR-12.12 (data not shown). These data indicate that CHIR-12.12 does not cause apoptosis in normal human B cells without CD40L stimulation.

CHIR-12.12 inhibe la fosforilación de IKKα (Ser180) e IKKβ (Ser181), Akt, ERK y p38 en las células B normales. CHIR-12.12 inhibits the phosphorylation of IKKα (Ser180) and IKKβ (Ser181), Akt, ERK and p38 in normal B cells.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1 % 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfo-IKKα, fosfo-IKKβ, IKKβ total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-p38 y p38 total en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, serum was deprived of medium containing 1% FBS 1.0 x 106 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85 and 95%) and stimulated with sCD40L 1 µg / ml (Alexis Corp ., Bingham, Nottinghamshire, UK). Cultures were treated with CHIR-12.12 (1 and 10 µg / ml) and control IgG. Cells were collected at 0 and 20 minutes. Phospho-IKKα, phospho-IKKβ, total IKKβ, phosfoERK, total ERK, phospho-Akt, total Akt, phospho-p38 and p38 total were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, la estimulación con sCD40L dio como resultado aumentos en la fosforilación de IKKα/β, fosforilación de ERK, fosforilación de Akt y fosforilación de p38, dando lugar así a la supervivencia y/o proliferación de las células. El tratamiento de las células con CHIR-12.12 anuló los efectos de la estimulación de sCD40L en estas vías de señales en las células B normales (datos no mostrados). Briefly, stimulation with sCD40L resulted in increases in IKKα / β phosphorylation, ERK phosphorylation, Akt phosphorylation and p38 phosphorylation, thus resulting in cell survival and / or proliferation. Treatment of the cells with CHIR-12.12 nullified the effects of stimulation of sCD40L in these signal pathways in normal B cells (data not shown).

CHIR 12.12 inhibe las vías de señales múltiples tales como PI3K y MEK/ERK en la cascada de señales de CD40. CHIR 12.12 inhibits multiple signal pathways such as PI3K and MEK / ERK in the CD40 signal cascade.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1 % 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron también con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml), Wortmanin (un inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 µM), LY 294002 (un inhibidor de PI3K/Akt; 10 y 30 µM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30 µg/ml). Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-IKKα/β y total en los lisados celulares por transferencia Western. In these experiments, serum was deprived of medium containing 1% FBS 1.0 x 106 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85 and 95%) and stimulated with sCD40L 1 µg / ml (Alexis Corp ., Bingham, Nottinghamshire, UK). Cultures were also treated with CHIR-12.12 (1 and 10 µg / ml), Wortmanin (a PI3K / Akt inhibitor, 1 and 10 µM), LY 294002 (a PI3K / Akt inhibitor; 10 and 30 µM) and PD 98095 (an inhibitor of MEK, 10 and 30 µg / ml). Cells were collected at 0 and 20 minutes. FosfoERK, phospho-Akt, total Akt, phospho-IKKα / β and total were detected in cell lysates by Western blotting.

Brevemente, los resultados muestran que CHIR-12.12 anuló la fosforilación de todas estas moléculas de transducción de señales, mientras que los inhibidores de transducción de señales mostraron sólo anulación específica de las señales, indicando que CHIR-12.12 probablemente inhibe en una etapa anterior a estas moléculas de transducción de señales mediadas por la estimulación por CD40L (datos no mostrados). Briefly, the results show that CHIR-12.12 annulled the phosphorylation of all these signal transduction molecules, while signal transduction inhibitors showed only specific signal cancellation, indicating that CHIR-12.12 probably inhibited at a stage prior to these signal transduction molecules mediated by CD40L stimulation (data not shown).

CHIR-12.12 inhibe la unión de las moléculas de señalización TRAF2 y TRAF3 al dominio citoplásmico de CD40 en las células B normales. CHIR-12.12 inhibits the binding of TRAF2 and TRAF3 signaling molecules to the cytoplasmic domain of CD40 in normal B cells.

En estos experimentos, se privaron de suero durante cuatro horas en medio que contenía FBS al 1 % 4,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU) durante 20 minutos. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se inmunoprecipitó CD40 usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), y se sondeó en una transferencia Western con mAb anti TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA), mAb anti TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), y mAb anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA). Brevemente, los resultados muestran que TRAF2 y TRAF3 co-precipitaron con CD40 tras la estimulación de sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló la formación del complejo de señal CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no mostrados). In these experiments, serum was deprived for four hours in medium containing 1% FBS 4.0 x 106 normal human B cells from healthy donors (purity percentage between 85 and 95%) and stimulated with sCD40L 1 µg / ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) for 20 minutes. Cells were collected at 0 and 20 minutes. CD40 was immunoprecipitated using polyclonal anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA), and probed in a Western blot with anti TRAF2 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti TRAF3 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA), and anti-mAb CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA). Briefly, the results show that TRAF2 and TRAF3 co-precipitated with CD40 after stimulation of sCD40L. In contrast, treatment with CHIR-12.12 canceled the formation of the CD40-TRAF2 / 3 signal complex in normal B cells stimulated with sCD40L. There were no changes in the expression of CD40 (data not shown).

Sin estar ligados por la teoría, los resultados de estos experimentos, y los resultados en los ejemplos resumidos anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR-12.12 es un anticuerpo monoclonal anti-CD40 antagonista de acción dual que tiene una única combinación de atributos. Este anticuerpo monoclonal totalmente humano bloquea las vías de señales de CD40 mediadas por CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B; este antagonismo da lugar finalmente a la muerte celular. CHIR-12.12 también media el reconocimiento y la unión por las células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Una vez que CHIR-12.12 está unido a las células efectoras, se liberan las enzimas citolíticas, dando lugar a la apoptosis y lisis de las células B. CHIR-12.12 es un anticuerpo antitumoral más potente que rituximab cuando se compara en modelos de tumores preclínicos. Without being bound by theory, the results of these experiments, and the results in the examples summarized above, indicate that the CHIR-12.12 antibody is a dual-acting antagonistic anti-CD40 monoclonal antibody that has a unique combination of attributes. This fully human monoclonal antibody blocks CD40L-mediated CD40 signal pathways for the survival and proliferation of B cells; This antagonism eventually results in cell death. CHIR-12.12 also mediates recognition and binding by effector cells, initiating antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Once CHIR-12.12 is bound to effector cells, cytolytic enzymes are released, resulting in apoptosis and lysis of B cells. CHIR-12.12 is a more potent antitumor antibody than rituximab when compared in preclinical tumor models. .

Ejemplo 2: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a un epítopo diferente que 15B8 en CD40 Example 2: CHIR-5.9 and CHIR-12.12 bind to a different epitope than 15B8 in CD40

Los anticuerpos monoclonales candidatos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión al CD40 pero no con 15B8, un mAb IgG2 anti-CD40 (véase documento de Publicación Internacional Nº WO 02/28904). Se diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos usando Biacore con chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada por medio de The candidate monoclonal antibodies CHIR-5.9 and CHIR-12.12 compete with each other for binding to CD40 but not with 15B8, an anti-CD40 IgG2 mAb (see International Publication Document No. WO 02/28904). Competitive antibody binding studies were designed using Biacore with CM5 biosensor chips with protein A immobilized by means of

acoplamiento de aminas, que se usó para capturar anti-CD40, CHIR-12.12, o 15B8. Se observaron las curvas de unión de asociación/disociación normales con concentraciones variables de CD40-his (datos no mostrados). Para los estudios de competición, se capturaron bien CHIR-12.12 o bien 15B8 en la superficie de la proteína A. Posteriormente se hizo fluir un 5 complejo CD40-his / Fab de CHIR-5.9 (CD40 100 nM: Fab de CHIR-5.9 1 µM), en concentraciones variables, a través de la superficie modificada. En el caso de CHIR-12.12, no se observó asociación del complejo observado, que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión de CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8, se observó asociación del complejo Fab CHIR-5.9 que indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al sitio de unión de CD40. Sin embargo, la Amines coupling, which was used to capture anti-CD40, CHIR-12.12, or 15B8. Normal association / dissociation binding curves were observed with varying concentrations of CD40-his (data not shown). For competition studies, CHIR-12.12 or 15B8 were captured either on the surface of protein A. Subsequently, a CD40-his / Fab complex of CHIR-5.9 was flowed (100 nM CD40: CHIR-5.9 Fab 1 µM), in varying concentrations, across the modified surface. In the case of CHIR-12.12, no association of the observed complex was observed, indicating that CHIR-5.9 blocks the binding of CHIR-12.12 to CD40-his. For 15B8, association of the Fab CHIR-5.9 complex was observed indicating that CHIR-5.9 does not block the binding of 15B8 to the CD40 binding site. However, the

10 tasa de disociación del complejo aumentó drásticamente (datos no mostrados). The dissociation rate of the complex increased dramatically (data not shown).

También se determinó que 15B8 y CHIR-12.12 no compiten por la unión de CD40-his. Este experimento se llevó a cabo capturando CHIR-12.12 en el chip biosensor de proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con hIgG1 control, uniendo CD40-his y a It was also determined that 15B8 and CHIR-12.12 do not compete for the binding of CD40-his. This experiment was carried out by capturing CHIR-12.12 on the protein A biosensor chip, blocking the residual sites of protein A with hIgG1 control, linking CD40-his and a

15 continuación haciendo fluir 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 se unió bajo estas condiciones indicando que CHIR-12.12 no bloquea la unión de 15B8 al CD40. 15 then flowing 15B8 over the modified surface. 15B8 joined under these conditions indicating that CHIR-12.12 does not block the binding of 15B8 to CD40.

Ejemplo 3: Propiedades de unión de los mAb CHIR-12.12 y CHIR-5.9 Example 3: Binding properties of CHIR-12.12 and CHIR-5.9 mAbs

20 Se inmovilizó proteína A en chips biosensores CM5 a través de acoplamiento de aminas. Se capturaron anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos, en una concentración de 1,5 µg/ml, sobre la superficie modificada del biosensor durante 1,5 minutos a 10 µl/min. Se hizo fluir CD40-his recombinante soluble sobre la superficie del biosensor en concentraciones variables. El anticuerpo y el antígeno se diluyeron en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 20 Protein A was immobilized on CM5 biosensor chips through amine coupling. Human anti-CD40 monoclonal antibodies, at a concentration of 1.5 µg / ml, were captured on the modified surface of the biosensor for 1.5 minutes at 10 µl / min. Soluble recombinant CD40-his was flowed over the surface of the biosensor in varying concentrations. The antibody and antigen were diluted in 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA,

25 Tensioactivo P al 20 0,005 % (HBS-EP). Se determinaron las constantes cinéticas y de afinidad usando el programa informático Biaevaluation con un ajuste de interacción modelo/global de 25 Surfactant P 20.005% (HBS-EP). Kinetic and affinity constants were determined using the Biaevaluation software with a model / global interaction setting of

1:1. 1: 1.

Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, hay una diferencia de 121 veces en la tasa de 30 disociación de CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que da como resultado una afinidad 24 veces mayor para CHIR-12.12. As shown in Table 2 below, there is a 121-fold difference in the rate of dissociation of CHIR-5.9 and CHIR-12.12 that results in a 24-fold affinity for CHIR-12.12.

35 35

Anticuerpo Antibody: ka (M-1 seg-1) kd (seg-1) KD (nM) ka (M-1 sec-1) kd (sec-1) KD (nM)

Anti-CD40,CHIR-5.9 Anti-CD40, CHIR-5.9: (12,35 ± 0,64) x 105 (15,0 ± 1,3) x 10-3 12,15 ± 0,35 (12.35 ± 0.64) x 105 (15.0 ± 1.3) x 10-3 12.15 ± 0.35

Anti-CD40,CHIR-12.12 Anti-CD40, CHIR-12.12: (2,41 ± 0,13) x 105 (1,24 ± 0,06) x 10-4 0,51 ± 0,02 (2.41 ± 0.13) x 105 (1.24 ± 0.06) x 10-4 0.51 ± 0.02

Ejemplo 4: Caracterización del epítopo para los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIRExample 4: Epitope characterization for the CHIR-12.12 and CHIR monoclonal antibodies

5.9 5.9

5 5

Para determinar la localización del epítopo en CD40 reconocido por los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se realizaron análisis SDS-PAGE y transferencia Western. Se separó CD40 purificado (0,5 µg) en un gel NUPAGE al 4-12 % bajo condiciones reductoras y no reductoras, se transfirió a membranas PVDF, y se sondeó con anticuerpos To determine the location of the epitope on CD40 recognized by the monoclonal antibodies CHIR-12.12 and CHIR-5.9, SDS-PAGE analysis and Western blotting were performed. Purified CD40 (0.5 µg) was separated on a 4-12% NUPAGE gel under reducing and non-reducing conditions, transferred to PVDF membranes, and probed with antibodies

10 monoclonales en una concentración de 10 µg/ml. Las transferencias se sondearon con IgG anti humano conjugada con fosfatasa alcalina y se desarrollaron usando el sustrato estabilizado Azul Western® para fosfatasa alcalina (Promega). 10 monoclonal in a concentration of 10 µg / ml. Transfers were probed with anti-human IgG conjugated to alkaline phosphatase and developed using the Western® Blue stabilized substrate for alkaline phosphatase (Promega).

Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR12.12 reconoce epítopos The results indicate that the anti-CD40 monoclonal antibody CHIR12.12 recognizes epitopes

15 tanto en la forma no reducida como en la forma reducida de CD40, exhibiendo la forma no reducida de CD40 mayor intensidad que la forma reducida de CD40 (Tabla 3; transferencias no mostradas). El hecho de que el reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional, parte del cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 reconoce principalmente la forma no 15 both in the non-reduced form and in the reduced form of CD40, the non-reduced form of CD40 exhibiting greater intensity than the reduced form of CD40 (Table 3; transfers not shown). The fact that recognition was positive for both forms of CD40 indicates that this antibody interacts with a conformational epitope, part of which is a linear sequence. The monoclonal antibody CHIR-5.9 mainly recognizes the form no

20 reducida de CD40 sugiriendo que este anticuerpo interactúa principalmente con un epítopo conformacional (Tabla 3; transferencias no mostradas). 20 reduced CD40 suggesting that this antibody interacts primarily with a conformational epitope (Table 3; transfers not shown).

Tabla 3. Identificación de dominios. Table 3. Domain identification.

Dominio 1 Domain 1: Dominio 2 Dominio 3 Dominio 4 Domain 2 Domain 3 Domain 4

mAb CHIR-12.12 mAb CHIR-12.12: - + - - - + - -

mAb CHIR-5.9 mAb CHIR-5.9: - + - - - + - -

mAb 15B8 mAb 15B8: + - - - + - - -

25 Para realizar un mapa de la región antigénica en CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se expresaron en células de insecto como proteínas de fusión GST. La secreción de los cuatro dominios se aseguró con una señal de secreción GP67. El sobrenadante de las células de insecto se analizó por análisis SDS-PAGE y transferencia Western para identificar el dominio que contenía el epítopo. 25 To map the antigenic region on CD40, the four extracellular domains of CD40 were cloned and expressed in insect cells as GST fusion proteins. The secretion of the four domains was secured with a GP67 secretion signal. The supernatant of the insect cells was analyzed by SDS-PAGE analysis and Western blotting to identify the domain that contained the epitope.

EL anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 reconoce un epítopo en el Dominio 2 bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras (Tabla 4; transferencias no mostradas). Por el contrario, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 exhibe reconocimiento muy débil para el Dominio 2 (Tabla 16; transferencias no mostradas). Ninguno de estos anticuerpos reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este análisis. The monoclonal antibody CHIR-12.12 recognizes an epitope in Domain 2 under both reducing and non-reducing conditions (Table 4; transfers not shown). In contrast, the CHIR-5.9 monoclonal antibody exhibits very weak recognition for Domain 2 (Table 16; transfers not shown). None of these antibodies recognize Domains 1, 3 or 4 in this analysis.

Tabla 4. Análisis del Dominio2. Table 4. Domain Analysis2.

Reducido Reduced: No reducido Not reduced

mAb CHIR-12.12 mAb CHIR-12.12: ++ +++ ++ +++

mAb CHIR-5.9 mAb CHIR-5.9: + + + +

10 Para definir con más precisión el epítopo reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron péptidos del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la secuencia PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12). Se generaron membranas de síntesis 10 To more precisely define the epitope recognized by the CHIR-12.12 mAb, extracellular Domain 2 peptides from CD40 were synthesized, corresponding to the sequence PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (residues 61-104 of the sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID Nº: 12). Synthesis membranes were generated

15 SPOT (Sigma) conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo secundario. Se desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por este anticuerpo. SPOT (Sigma) containing thirty-five 10-mer peptides with a displacement of 1 amino acid. Western blot analysis was performed with CHIR-12.12 mAb and anti-human IgG labeled with beta galactosidase as secondary antibody. The transfer was dismantled and re-probed with CHIR-5.9 mAb to determine the region recognized by this antibody.

20 Los análisis SPOTs sondando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 en una concentración de 10 µg/ml dieron reacciones positivas con las transferencias 18 a 22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se muestra en la Tabla 5. 20 SPOTs analyzes probing with anti-CD40 monoclonal antibody CHIR-12.12 at a concentration of 10 µg / ml gave positive reactions with transfers 18 to 22. The region of the sequence covered by these peptides is shown in Table 5.

25 Tabla 5. Resultados de análisis SPOTs sondeando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12. 25 Table 5. Results of SPOTs analysis probing with anti-CD40 monoclonal antibody CHIR-12.12.

Número de transferencia Transfer number: Región de la secuencia Sequence region

18 18: HQHKYCDPNL (residuos 78-87 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) HQHKYCDPNL (residues 78-87 of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12)

19 19: QHKYCDPNLG (residuos 79-88 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) QHKYCDPNLG (residues 79-88 of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12)

20 twenty: HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: HKYCDPNLGL (residues 80-89 of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO:

12) 12)

21 twenty-one: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) KYCDPNLGLR (residues 81-90 of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12)

22 22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) YCDPNLGLRV (residues 82-91 of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12)

Estos resultados corresponden a un epítopo lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº:10 o SEC ID Nº: 12). Este epítopo contiene Y82, D84 y N86, que se ha predicho que están implicados en la interacción CD40-ligando de CD40. These results correspond to a linear epitope of: YCDPNL (residues 82-87 of the sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12). This epitope contains Y82, D84 and N86, which have been predicted to be involved in the CD40-CD40 ligand interaction.

5 5

Los análisis SPOTs con mAb CHIR-5.9 mostraron un débil reconocimiento de los péptidos representados por las manchas 20-22 mostradas en la Tabla 6, sugiriendo implicación de la región YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) en su unión a CD40. Debe señalarse que los mAb CHIR-12.12 y CHR-5.9 compiten uno SPOTs with CHIR-5.9 mAbs showed a weak recognition of the peptides represented by the spots 20-22 shown in Table 6, suggesting involvement of the YCDPNLGL region (residues 82-89 of the sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12) in its binding to CD40. It should be noted that mAbs CHIR-12.12 and CHR-5.9 compete one

10 con el otro por la unión a CD40 en el análisis BIACORE. 10 with the other by binding to CD40 in the BIACORE analysis.

Tabla 6. Resultados de análisis SPOTs sondeando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9. Table 6. Results of SPOTs analysis probing with anti-CD40 monoclonal antibody CHIR-5.9.

20 twenty: HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o 12) HKYCDPNLGL (residues 80-89 of SEQ ID NO: 10 or 12)

21 twenty-one: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o 12) KYCDPNLGLR (residues 81-90 of SEQ ID NO: 10 or 12)

22 22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o 12) YCDPNLGLRV (residues 82-91 of SEQ ID NO: 10 or 12)

15 Los epítopos lineales identificados por los análisis SPOTs están dentro del módulo B1 de CD40. La secuencia del módulo B1 de CD40 es: 15 Linear epitopes identified by SPOTs are within the B1 module of CD40. The sequence of module B1 of CD40 is:

HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residuos 80-103 de SEC ID Nº: 10 o 12). HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residues 80-103 of SEQ ID NO: 10 or 12).

20 Dentro del epítopo lineal identificado para CHIR-12.12 está C83. Se sabe que este residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el epítopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga este enlace disulfuro (C83-C103) y/o aminoácidos vecinos conformacionalmente próximos a C103. 20 Within the linear epitope identified for CHIR-12.12 is C83. It is known that this cysteine residue forms a disulfide bond with C103. It is likely that the conformational epitope of the CHIR-12.12 mAb contains this disulfide bond (C83-C103) and / or neighboring amino acids conformationally close to C103.

25 25

Ejemplo 5: Realización de pruebas en modelos de enfermedades autoinmunes e inflamatorias Example 5: Testing in models of autoimmune and inflammatory diseases

Modelo de lupus eritematoso sistémico (LES). Model of systemic lupus erythematosus (SLE).

La CHIR-12.12 se probó en un modelo de lupus eritematoso sistémico (LES) en el que las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) de pacientes de LES se injetan en ratones SCID. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Duchosal y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 985CHIR-12.12 was tested in a systemic lupus erythematosus (SLE) model in which peripheral blood mononuclear cells (PMBC) of SLE patients are injected into SCID mice. See, for example, the model described in Duchosal et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 985

8. 8.

Después de transferencia de PBMC de pacientes de LES en ratones SCID, se determina si el tratamiento con CHIR-12.12 influye o no en la respuesta de linfocitos T a producción de autoantígenos y autoanticuerpos y en las manifestaciones morbosas tales como glomerulonefritis. El primer grupo de estudios prueba CHIR-12.12 como un agente individual seguido por probar el efecto en una combinación con otos agentes tales como CTLA4-Ig. After PBMC transfer of SLE patients in SCID mice, it is determined whether or not treatment with CHIR-12.12 influences T lymphocyte response to autoantigen and autoantibody production and morbid manifestations such as glomerulonephritis. The first group of studies tests CHIR-12.12 as an individual agent followed by testing the effect in a combination with other agents such as CTLA4-Ig.

Modelo de esclerosis múltiple. Multiple sclerosis model.

La encefalitis autoinmune experimental (EAE) del mono tití es un modelo para esclerosis múltiple humana. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Raine y col. (1999) Ann. Neurol. Experimental autoimmune encephalitis (EAE) of the marmoset monkey is a model for human multiple sclerosis. See, for example, the model described in Raine et al. (1999) Ann. Neurol

46: 144-60 y Hart y col. (2004) Lancet Neurol. 3: 588-97. CHIR-12.12 se une a CD40 de tití y se prueba para eficacia en este modelo. 46: 144-60 and Hart et al. (2004) Lancet Neurol. 3: 588-97. CHIR-12.12 binds to CD40 marmoset and is tested for efficacy in this model.

Inflamación y aterosclerosis Inflammation and atherosclerosis

Se prueba in vitro CHIR-12.12 por su capacidad para inhibir producción inducida por CD40L de enzimas que degradan matriz, expresión de factor tisular, citoquinas proinflamatorias y regulación ascendente de moléculas de adhesión. Estudios subsiguientes prueban la capacidad de CHIR-12.12 mostranso actividades antiinflamatorias in vivo usando ratones transgénicos que expresan la molécula CD40 humana. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Yasui (2002) Inty. Immunol. 14: 319-29. CHIR-12.12 is tested in vitro for its ability to inhibit CD40L-induced production of matrix degrading enzymes, tissue factor expression, proinflammatory cytokines, and upregulation of adhesion molecules. Subsequent studies test the ability of CHIR-12.12 to show anti-inflammatory activities in vivo using transgenic mice that express the human CD40 molecule. See, for example, the model described in Yasui (2002) Inty. Immunol 14: 319-29.

Transplante. Transplant.

Se prueba CHIR-12.12 por su capacidad para evitar rechazo de transplantes en modelos de primates no humanos. Los acacos cangrejeros receptores de aloinjertos renales se tratan con anticuerpo CHIR12.12. demostrando el efecto de aceptación de injerto con o sin fármacos inmunosupresores adicionales tales como ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, molécula CTLA4-Ig y anti-anticuerpo estimulador de linfocitos B y similares. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Wee y col. (1992) Transplantation 53: 501-7. CHIR-12.12 is tested for its ability to prevent transplant rejection in nonhuman primate models. Renal allograft receptor crayfish acacos are treated with CHIR12.12 antibody. demonstrating the effect of graft acceptance with or without additional immunosuppressive drugs such as cyclosporine, FK506, rapamycin, corticosteroids, CTLA4-Ig molecule and anti-B-cell stimulating antibody and the like. See, for example, the model described in Wee et al. (1992) Transplantation 53: 501-7.

Enfermedad de Alzheimer. Alzheimer disease.

. CHIR-12.12 se prueba primero in vitro por su capacidad para bloquear activación microglial. Los estudios de eficacia in vivo con CHIR-12.12 se llevan a cabo en ratones doblemente transgénicos que expresan CD40 humano y sobreproducen péptido beta-amiloide. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Tan y col. (2002) Nat. Neurosci. 5: 1288-93. . CHIR-12.12 is first tested in vitro for its ability to block microglial activation. In vivo efficacy studies with CHIR-12.12 are carried out in doubly transgenic mice that express human CD40 and overproduce beta-amyloid peptide. See, for example, the model described in Tan et al. (2002) Nat. Neurosci. 5: 1288-93.

Ejemplo 6: Estudios clínicos con CHIR-5.9 y CHIR-12.12 Example 6: Clinical studies with CHIR-5.9 and CHIR-12.12

Objetivos clínicos Clinical objectives

El objetivo general es proporcionar una terapia eficaz para artritis reumatoide (RA) marcando como objetivo células con una IgG1 anti-CD40. La señal para está enfermedad se determina en la fase I aunque puede obtenerse alguna medición de actividad en fase I. Inicialmente, el agente se estudia como un agente único, pero se combinará con otros agentes terapéuticos a medida que proceda el desarrollo. The general objective is to provide an effective therapy for rheumatoid arthritis (RA) by targeting cells with an anti-CD40 IgG1. The signal for this disease is determined in phase I although some measurement of activity can be obtained in phase I. Initially, the agent is studied as a single agent, but will be combined with other therapeutic agents as development proceeds.

Fase I Phase I

• •: Evaluar la seguridad y la farmacocinética – aumento de dosis en sujetos con RA. Evaluate safety and pharmacokinetics - dose increase in subjects with RA.

• •: Elegir la dosis en base a la seguridad, tolerabilidad y cambio en los marcadores séricos de CD40. En general se busca una dosis máxima tolerable (DMT) pero pueden resultar adecuadas otras indicaciones de eficacia (depleción de células que llevan CD40+, etc.) para el hallazgo de la dosis. Choose the dose based on safety, tolerability and change in serum markers of CD40. In general, a maximum tolerable dose (DMT) is sought, but other indications of efficacy (depletion of cells carrying CD40 +, etc.) may be appropriate for the dose finding.

• •: Consideración de más de una dosis, ya que puede ser necesario algún hallazgo de dosis en fase II. Consideration of more than one dose, as some phase II dose finding may be necessary.

• •: Los pacientes se dosifican semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en tiempo real. Inicialmente la dosis máxima permitida es un ciclo de 4 semanas. La Pk puede ser altamente variable dependiendo del estado morboso, densidad de CD40, etc. Patients are dosed weekly with real-time pharmacokinetic (Pk) sampling. Initially the maximum allowed dose is a 4 week cycle. Pk can be highly variable depending on the morbid state, density of CD40, etc.

• •: Este/estos ensayo(s) está(n) abierto(s) a sujetos con RA. This / these assay (s) is open to subjects with RA.

• •: La decisión para interrumpir o continuar los estudios se basa en la seguridad, las dosis y The decision to interrupt or continue studies is based on safety, doses and

• •: la evidencia preliminar de actividad terapéutica. preliminary evidence of therapeutic activity.

• •: La actividad del fármaco según se determina por la tasa de respuesta, se determina en la Fase II. The activity of the drug as determined by the response rate is determined in Phase II.

• •: Identificar dosi(s) para la Fase II. Identify dose (s) for Phase II.

Fase II Phase II

Se iniciarán varios ensayos en sujetos con RA. Puede probarse más de una dosis y más de un programa en una configuración al azar de fase II. Several trials will be initiated in subjects with RA. More than one dose and more than one program can be tested in a random phase II configuration.

• Marcar como objetivo una población de RA que tiene estándar actual fallido de cuidado (fallos de terapia de fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID) y de fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad (DMARD; por ejemplo oro y penicilamina)) • Target a population of RA that has a current standard of failed care (non-steroidal anti-inflammatory drug therapy (NSAID) and disease-modifying anti-rheumatic drug (DMARD; for example gold and penicillamine))

: imagen1 La decisión para interrumpir o continuar con el estudio se basa en la prueba del concepto terapéutico en Fase II image 1 The decision to interrupt or continue the study is based on the proof of the therapeutic concept in Phase II

: imagen1 Determinar si puede usarse un marcador sustituto como indicación temprana para la eficacia clínica image 1 Determine if a substitute marker can be used as an early indication for clinical efficacy

: imagen1 Identificar las dosis para la Fase III image 1 Identify the doses for Phase III

Fase III Phase III

La fase III dependerá de cuándo se detecta la señal en la fase II y de qué terapias competidoras se considera que son el estándar. Si la señal está en una fase de la enfermedad donde no hay estándar de terapia, entonces podrá servir un estudio de un único brazo, bien controlado, como ensayo fundamental. Si hay agentes competidores que se consideran estándares, entonces se realizan estudios directos. Phase III will depend on when the signal is detected in phase II and on which competing therapies are considered to be the standard. If the signal is in a phase of the disease where there is no standard of therapy, then a single-arm, well-controlled study may serve as a fundamental trial. If there are competing agents that are considered standards, then direct studies are conducted.

Ejemplo 7: Formulación farmacéutica líquida para anticuerpos anti-CD40 antagonistas Example 7: Liquid pharmaceutical formulation for anti-CD40 antagonist antibodies

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos del pH de la solución en la estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista CHIR-12.12 por medio de procedimientos biofísicos y bioquímicos para seleccionar el entorno de solución óptimo para este anticuerpo. Los resultados de calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostraron que la estabilidad de la conformación de CHIR-12.12 es óptima en formulaciones que tienen pH 5,5-6,5. En base a una combinación de análisis SDS-PAGE, HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y HPLC de intercambio catiónico (CEX-HPLC), la estabilidad fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de aproximadamente 5,0-5,5. En vista de estos resultados, una formulación farmacéutica The objective of this study was to investigate the effects of the pH of the solution on the stability of the anti-CD40 antagonist CHIR-12.12 by means of biophysical and biochemical procedures to select the optimal solution environment for this antibody. Differential scanning calorimetry (DSC) results showed that CHIR-12.12 conformation stability is optimal in formulations that have pH 5.5-6.5. Based on a combination of SDS-PAGE analysis, size exclusion HPLC (SEC-HPLC) and cation exchange HPLC (CEX-HPLC), the physicochemical stability of CHIR-12.12 is optimal at a pH of approximately 5.0- 5.5. In view of these results, a pharmaceutical formulation

5 líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR-12.12 a aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio 10 mM aproximadamente, cloruro de sodio 150 mM aproximadamente y que tiene un pH de aproximadamente pH 5,5. The recommended liquid comprising this antibody is a formulation comprising CHIR-12.12 at approximately 20 mg / ml formulated in approximately 10 mM sodium succinate, approximately 150 mM sodium chloride and having a pH of approximately pH 5.5.

10 Materiales y procedimientos 10 Materials and procedures

El anticuerpo CHIR-12.12 usado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal humano producido por un proceso de cultivo de células CHO. Este mAb tiene un peso molecular de 150 kDa y está constituido por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas The CHIR-12.12 antibody used in formulation studies is a human monoclonal antibody produced by a CHO cell culture process. This mAb has a molecular weight of 150 kDa and consists of two light chains and two heavy chains

15 unidas juntas por enlaces disulfuro. Está dirigido contra el receptor de CD40 de superficie celular en las células que expresan CD40, incluidas las células B normales y malignas, para el tratamiento de diversos tipos de cáncer y enfermedades autoinmunes/inflamatorias. 15 joined together by disulfide bonds. It is directed against the cell surface CD40 receptor in cells expressing CD40, including normal and malignant B cells, for the treatment of various types of cancer and autoimmune / inflammatory diseases.

La sustancia del fármaco anti-CD40 usada para este estudio fue un lote a granel de anti-CD40 The substance of the anti-CD40 drug used for this study was a bulk batch of anti-CD40

20 (CHIR-12.12) purificado derivado de células CHO. La composición de la sustancia del fármaco era de anticuerpo CHIR-12.12 9,7 mg/ml en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el estudio era la sustancia del fármaco recibida, seguida por congelación a ≤ -60 ºC, descongelación a TA y probada junto con muestras de estabilidad en los puntos temporales predeterminados. Las muestras de estabilidad se prepararon por diálisis 20 (CHIR-12.12) purified derived from CHO cells. The composition of the drug substance was CHIR-12.12 antibody 9.7 mg / ml in 10 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride, at pH 6.5. The control sample in the study was the substance of the drug received, followed by freezing at ≤ -60 ° C, thawing at RT and tested together with stability samples at predetermined time points. Stability samples were prepared by dialysis

25 de la sustancia del fármaco contra disoluciones de diferentes pH y la concentración de CHIR25 of the drug substance against solutions of different pH and the CHIR concentration

12.12 en cada una de las muestras se determinó por UV 280 tal como se presenta en la Tabla 12.12 in each of the samples was determined by UV 280 as presented in the Table

7. 7.

Tabla 7. Formulaciones de CHIR-12.12. Table 7. CHIR-12.12 formulations.

Composición tampón Buffer composition: pH Concentración de CHIR-12.12 (mg/ml) pH CHIR-12.12 concentration (mg / ml)

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride: 4,5 9,0 4,5 9.0

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium succinate, 150 mM sodium chloride: 5,0 9,3 5.0 9.3

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium succinate, 150 mM sodium chloride: 5,5 9,2 5.5 9.2

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride: 6,0 9,7 6.0 9.7

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride: 6,5 9,4 6.5 9.4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride: 7,0 9,4 7.0 9.4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride: 7,5 9,5 7.5 9.5

Glicina 10 mM, cloruro de sodio 150 mM 10 mM glycine, 150 mM sodium chloride: 9,0 9,5 9.0 9.5

La estabilidad fisicoquímica del anticuerpo CHIR-12.12 en las diversas formulaciones se ensayó usando los siguientes protocolos. The physicochemical stability of the CHIR-12.12 antibody in the various formulations was tested using the following protocols.

5 Calorimetría diferencial de barrido (DSC) 5 Differential scanning calorimetry (DSC)

La estabilidad conformacional de diferentes muestras de formulaciones se controló usando un MicroCal VP-DSC tras calentar de 15ºC hasta 90ºC a razón de 1ºC/min. The conformational stability of different samples of formulations was monitored using a VP-DSC MicroCal after heating from 15 ° C to 90 ° C at a rate of 1 ° C / min.

10 SDS-PAGE 10 SDS-PAGE

Se estimó la fragmentación y la agregación usando gel Tris-glicina al 4-20 % bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se detectaron las proteínas por medio de tinción con azul Coomassie. Fragmentation and aggregation were estimated using 4-20% Tris-glycine gel under non-reducing and reducing conditions. Proteins were detected by staining with Coomassie blue.

15 fifteen

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) Size exclusion chromatography (SEC-HPLC)

La fragmentación y agregación de proteínas se midieron también por medio de un sistema de HPLC Water Alliance con una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, con fosfato de sodio Protein fragmentation and aggregation were also measured by means of an HPLC Water Alliance system with a Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL column, with sodium phosphate

20 100 mM, pH 7,0 como fase móvil a un caudal de 0,7 ml/min. 20 100 mM, pH 7.0 as mobile phase at a flow rate of 0.7 ml / min.

Cromatografía de intercambio catiónico (CEX-H PLC) Cation Exchange Chromatography (CEX-H PLC)

La degradación relacionada con el cambio de cargas se midió usando un sistema de HPLC Waters 600s con una columna Dionex Propac WCX-10, con HEPES 50 mM, pH 7,3 como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3 como fase móvil B a un caudal de 0,5 ºC/min. Degradation related to load change was measured using a Waters 600s HPLC system with a Dionex Propac WCX-10 column, with 50 mM HEPES, pH 7.3 as mobile phase A and 50 mM HEPES containing 500 mM NaCl, pH 7.3 as mobile phase B at a flow rate of 0.5 ° C / min.

Resultados y discusión Results and Discussion

Estudio de estabilidad conformacional. Study of conformational stability.

El desplegamiento térmico de CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones térmicas, que representan probablemente la fusión de desplegamiento de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas más altas, la proteína presumiblemente se agregó, dando lugar a pérdida de la señal de DSC. Con la finalidad de examinar la formulación, se definió la temperatura de transición térmica más baja como la temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 5 muestra la temperatura de fusión térmica como una función de los pH de las formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5 proporcionaron anti-CD40 con estabilidad conformacional superior como se demuestra por las temperaturas de fusión térmica más elevadas. The thermal deployment of CHIR-12.12 revealed at least two thermal transitions, which probably represent the fusion of deployment of the Fab and Fc domains, respectively. At higher temperatures, the protein was presumably added, resulting in loss of the DSC signal. In order to examine the formulation, the lowest thermal transition temperature was defined as the melting temperature, Tf, in this study. Figure 5 shows the thermal melting temperature as a function of the pH of the formulations. Formulations at pH 5.5-6.5 provided anti-CD40 with superior conformational stability as demonstrated by higher thermal fusion temperatures.

Análisis SDS-PAGE. SDS-PAGE analysis.

Las muestras de formulaciones de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 se incubaron a 40 ºC durante 2 meses y se sometieron al análisis SDS-PAGE (datos no mostrados). Bajo condiciones no reductoras, se observaron especies con peso molecular (PM) de 23 kDa y 2,7 kDa en formulaciones con pH superior a 5,5, y se observaron especies con PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero aparecieron menos a pH 5,0-5,5. Pudo verse una especie con PM de 100 kDaa pH 7,5 ypH9,0, Samples of CHIR-12.12 formulations at pH 4.5-9.0 were incubated at 40 ° C for 2 months and subjected to SDS-PAGE analysis (data not shown). Under non-reducing conditions, species with molecular weight (MW) of 23 kDa and 2.7 kDa were observed in formulations with pH higher than 5.5, and species with PM of 51 kDa were observed in all formulations, but appeared less at pH 5.0-5.5. A species with PM of 100 kDaa pH 7.5 and pH9.0 could be seen,

Bajo condiciones reductoras, CHIR-12.12 se redujo en cadenas pesadas y cadenas ligeras libres con PM de 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. Las especies de 100 kDa parecieron no ser totalmente reducibles y aumentaron con el aumento del pH de la solución, sugiriendo que podría existir asociación covalente diferente de disulfuro en las moléculas. Como había otras especies con identidades desconocidas en SDS-PAGE, la comparación de estabilidad para cada formulación se basa en la pureza restante de CHIR-12.12. Las formulaciones a pH 5,0-6,0 proporcionaron un entorno más estable para CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por medio de SDS-PAGE (datos no mostrados). Under reducing conditions, CHIR-12.12 was reduced in heavy chains and free light chains with PM of 50 kDa and 24 kDa, respectively. The 100 kDa species appeared not to be fully reducible and increased with the increase in the pH of the solution, suggesting that there could be a different covalent association of disulfide in the molecules. As there were other species with unknown identities in SDS-PAGE, the stability comparison for each formulation is based on the remaining purity of CHIR-12.12. Formulations at pH 5.0-6.0 provided a more stable environment for CHIR-12.12. Few aggregates were detected by means of SDS-PAGE (data not shown).

Análisis SEC-HPLC. SEC-HPLC analysis.

5 El análisis SEC-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico principal, una especie de agregación como una especie de pico anterior separada de la especie del pico principal, una especie de fragmento grande como un pico meseta en la parte posterior de la especie del pico principal, y se detectaron especies de fragmentos pequeños posteriores a las especies del pico principal. Tras la incubación a 5ºC y 25ºC durante 3 meses, se detectaron 5 The SEC-HPLC analysis detected the CHIR-12.12 intact as the main peak species, an aggregation species as a species of anterior peak separated from the main peak species, a large fragment species such as a plateau peak in the back of the main peak species, and small fragment species subsequent to the main peak species were detected. After incubation at 5 ° C and 25 ° C for 3 months, they were detected

10 cantidades insignificantes de fragmentos y agregados de proteínas (<1,0 %) en las formulaciones anteriores y las especies del pico principal de CHIR-12.12 siguieron teniendo más del 99 % de pureza (datos no mostrados). Sin embargo, se desarrollaron gradualmente fragmentos de proteínas tras el almacenamiento a 40ºC y se formaron más fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como se muestra en la Tabla 8. Tras incubar las formulaciones de CHIR-12.12 10 insignificant amounts of protein fragments and aggregates (<1.0%) in the above formulations and the species of the main peak of CHIR-12.12 remained more than 99% pure (data not shown). However, protein fragments gradually developed after storage at 40 ° C and more fragments were formed at pH 4.5 and pH 6.5-9.0, as shown in Table 8. After incubating the CHIR-12.12 formulations

15 a 40 ºC durante 3 meses, se detectó aproximadamente 2-3 % de agregados en pH 7,5 y pH 9,0, mientras que se detectó menos del 1 % de agregados en las formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0, 15 to 40 ° C for 3 months, approximately 2-3% of aggregates at pH 7.5 and pH 9.0 were detected, while less than 1% of aggregates were detected in formulations at other pHs (data not shown). The results of SEC-HPLC indicate that CHIR-12.12 is more stable at a pH of approximately 5.0-6.0,

20 Tabla 8. Resultados de SEC-HPLC de muestras de estabilidad de CHIR-12.12 bajo condiciones de tiempo real y de almacenaje acelerado. 20 Table 8. SEC-HPLC results of CHIR-12.12 stability samples under real-time and accelerated storage conditions.

Muestra Sample: Pico principal % Fragmentos % Main peak% Fragments%

t=0 t = 0: 40 °C 1 m 40 °C 2 m 40 °C 3 m t=0 40 °C 1 m 40 °C 2 m 40 °C 3 m 40 ° C 1 m 40 ° C 2 m 40 ° C 3 m t = 0 40 ° C 1 m 40 ° C 2 m 40 ° C 3 m

Control Control: 99,4 99,2 99,9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 99.4 99.2 99.9 99.5 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0

pH 4,5 pH 4.5: 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1 99.4 93.2 86.0 81.3 <1.0 6.4 13.2 18.1

pH 5,0 pH 5.0: 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2 99.8 98.7 91.3 89.2 <1.0 <1.0 7.8 10.2

pH 5,5 pH 5.5: 99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8 99.8 98.9 91.4 90.6 <1.0 <1.0 7.6 8.8

pH 6,0 pH 6.0: 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7 99.6 97.7 90.4 87.3 <1.0 1.9 8.2 11.7

pH 6,5 pH 6.5: 99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0 5,6 9,9 12,4 99.3 93.4 89.0 86.9 <1.0 5.6 9.9 12.4

pH 7,0 pH 7.0: 99,2 93,9 87,4 85,1 <1,0 5,5 11,1 13,5 99.2 93.9 87.4 85.1 <1.0 5.5 11.1 13.5

pH 7,5 pH 7.5: 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2 99.1 92.8 84.4 81.9 <1.0 6.4 12.9 16.2

pH 9,0 pH 9.0: 99,3 82,4 61,6 50,6 <1,0 15,4 36,2 47,6 99.3 82.4 61.6 50.6 <1.0 15.4 36.2 47.6

Análisis CEX-FIPLC. CEX-FIPLC analysis.

El análisis CEX-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico principal, las variantes ácidas eluyeron más temprano que las especies del pico principal y las variantes de adición de lisina en el extremo C terminal eluyeron después de las especies de pico principal. La tabla 9 muestra la dependencia de los porcentajes de las especies restantes de CHIR-12.12 5 del pico principal y las variantes ácidas en el pH de la solución. La muestra de control ya contenía un alto grado de especies ácidas (aproximadamente 33 %), probablemente debido a los procesos de fermentación de etapa temprana y purificación. La susceptibilidad de CHIRThe CEX-HPLC analysis detected the intact CHIR-12.12 as the main peak species, acid variants eluted earlier than the main peak species and lysine addition variants at the C-terminal end eluted after the main peak species . Table 9 shows the dependence of the percentages of the remaining CHIR-12.12 5 species on the main peak and the acid variants on the pH of the solution. The control sample already contained a high degree of acidic species (approximately 33%), probably due to the early stage fermentation and purification processes. CHIR susceptibility

12.12 a las disoluciones de pH más alto se evidencia por dos hechos. Primero, la muestra de la formulación inicial a pH 9 (t = 0) ya generaba 12 % más especies ácidas que el control. 12.12 at higher pH solutions is evidenced by two facts. First, the sample of the initial formulation at pH 9 (t = 0) already generated 12% more acidic species than the control.

10 Segundo, el porcentaje de especies ácidas aumentó bruscamente con el aumento del pH. La degradación relacionada con el cambio de cargas se debe probablemente a la desamidación. Los datos anteriores indican que este tipo de degradación de CHIR-12.12 se redujo al mínimo a pH de aproximadamente 5,0-5,5. 10 Second, the percentage of acidic species increased sharply with the increase in pH. The degradation related to the change of charges is probably due to deamidation. The above data indicates that this type of degradation of CHIR-12.12 was minimized at a pH of approximately 5.0-5.5.

15 Tabla 9. Porcentaje de área de picos por CEX-HPLC para CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH bajo condiciones de tiempo real y de almacenamiento acelerado. 15 Table 9. Percentage of peak area by CEX-HPLC for CHIR-12.12 in different pH formulations under real-time and accelerated storage conditions.

Muestra Sample: Pico principal % Variantes ácidas % Main peak% Acid variants%

T=0 T = 0: 5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC t=0 5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC 5 ° C 25 ° C 40 ° C 40 ° C t = 0 5 ° C 25 ° C 40 ° C 40 ° C

3 m 3 m
3 m 3 m: 1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m 1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m

Control Control: 49,2 49,8 49,8 49,2 50,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6 49.2 49.8 49.8 49.2 50.3 32.0 33.7 33.7 32.0 33.6

pH 4,5 pH 4.5: 48,5 49,7 43,7 39,7 30,0 32,5 32,6 38,0 44,2 56,4 48.5 49.7 43.7 39.7 30.0 32.5 32.6 38.0 44.2 56.4

pH 5,0 pH 5.0: 49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 35,0 44,3 57,1 49.6 49.8 48.3 40.6 31.4 32.7 31.8 35.0 44.3 57.1

pH 5,5 pH 5.5: 50,7 50,3 48,1 40,0 30,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3 50.7 50.3 48.1 40.0 30.2 32.6 31.8 37.8 48.9 63.3

pH 6,0 pH 6.0: 50,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38,5 54,9 72,7 50.2 49.9 47.9 37.4 23.9 33.1 33.6 38.5 54.9 72.7

pH 6,5 pH 6.5: 49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 65,2 84,6 49.4 49.9 42.3 29.7 14.6 33.3 33.6 47.7 65.2 84.6

pH 7,0 pH 7.0: 49,7 49,9 21,9 - - 34,4 36,4 64,4 - - 49.7 49.9 21.9 - - 34.4 36.4 64.4 - -

pH 7,5 pH 7.5: 49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40,1 79,2 - - 49.3 48.3 12.7 - - 35.5 40.1 79.2 - -

pH 9,0 pH 9.0: 41,3 31,8 - - - 44,7 59,9 - - - 41.3 31.8 - - - 44.7 59.9 - - -

Conclusión conclusion

20 El pH tiene un efecto significativo en la estabilidad conformacional y fisicoquímica de CHIR20 pH has a significant effect on the conformational and physicochemical stability of CHIR

12.12. Se determinó que la degradación relacionada con el cambio de cargas es la principal vía de degradación para CHIR-12.12, que se redujo al mínimo a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad general, una formulación farmacéutica líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR-12.12 a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio 10 mM aproximadamente, cloruro de sodio 150 mM aproximadamente, y que tiene un pH de aproximadamente 5,5. 12.12. Degradation related to charge change was determined to be the main degradation pathway for CHIR-12.12, which was minimized to pH 5.0-5.5. Based on the general stability data, a recommended liquid pharmaceutical formulation comprising this antibody is a formulation comprising CHIR-12.12 at a concentration of approximately 20 mg / ml formulated in approximately 10 mM sodium succinate, approximately 150 mM sodium chloride , and which has a pH of approximately 5.5.

LISTADO DE SECUENCIAS SEQUENCE LIST

<110> Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel <110> Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel

<120> USO DE ANTICUERPOS ANTI-CD40 ANTAGONISTAS PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Y AUTOINMUNES Y RECHAZO DE TRANSPLANTE DE ÓRGANOS <120> USE OF ANTI-CD40 ANTIBODIES ANTAGONISTS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY AND AUTOIMMUNE DISEASES AND ORGAN TRANSPLANT REJECTION

<130> PP23725.001 (284072) <130> PP23725.001 (284072)

<150> 60/565.710 <150> 60 / 565,710

<151> 27-04-2004 <151> 04-27-2004

<150> 60/525.579 <150> 60 / 525,579

<151> 26-11-2003 <151> 11-26-2003

<150> 60/517.337 <150> 60 / 517,337

<151> 04-11-2003 <151> 04-11-2003

<160> 12 <160> 12

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <210> 1

<211> 720 <211> 720

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Secuencia codificadora para cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR<223> CHIR human anti-CD40 antibody light chain coding sequence

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)...(720) <222> (1) ... (720)

<400> 1 <210> 2 <400> 1 <210> 2

imagen2image2

<211> 239 <211> 239

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12 <223> CHIR-12.12 human anti-CD40 antibody light chain

<400> 2 <400> 2

imagen3image3

<210> 3 <210> 3

<211> 2016 <211> 2016

<212> ADN <212> DNA

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Secuencia codificadora para cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR<223> CHIR human anti-CD40 antibody heavy chain coding sequence

12.12 (con intrones) 12.12 (with introns)

<400> 3 <400> 3

imagen3image3

<210> 4 <210> 4

<211> 469 <211> 469

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12 <223> CHIR-12.12 human anti-CD40 antibody heavy chain

<400> 4 <400> 4

imagen3image3

<210> 5 <210> 5

<211> 469 <211> 469

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

5 5

<220> <220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12 <223> CHIR-12.12 human anti-CD40 antibody variant heavy chain

<400> 5 <400> 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

imagen3image3

<210> 6 <210> 6

<211> 239 <211> 239

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

<220> <220>

<400> 6 <210> 7 <400> 6 <210> 7

imagen3image3

<211> 474 <211> 474

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

5 5

<220> <220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-5.9 <223> CHIR-5.9 human anti-CD40 antibody heavy chain

<400> 7 <400> 7

10 10

imagen3image3

<210> 8 <210> 8

<211> 474 <211> 474

<212> PRT <212> PRT

<213> Secuencia artificial <213> Artificial sequence

5 5

<220> <220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-5.9 <223> CHIR-5.9 human anti-CD40 antibody variant heavy chain

<400> 8 <400> 8

10 10

imagen3image3

<210> 9 <210> 9

<211> 612 <211> 612

<212> ADN <212> DNA

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

5 5

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)...(612) <222> (1) ... (612)

10 <221> característica miscelánea 10 <221> miscellaneous feature

<222> (0)...(0) <222> (0) ... (0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma corta del CD40 humano <223> Coding sequence for the short isoform of human CD40

<400> 9 <400> 9

15 fifteen

imagen3image3

<210> 10 <210> 10

<211> 203 <211> 203

<212> PRT <212> PRT

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<400> 10 <400> 10

imagen3image3

<210> 11 <210> 11

<211> 834 <211> 834

<212> ADN <212> DNA

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<220> <220>

<221> CDS <221> CDS

<222> (1)...(834) <222> (1) ... (834)

<221> característica miscelánea <221> miscellaneous feature

<222> (0)...(0) <222> (0) ... (0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma larga del CD40 humano <223> Coding sequence for the long isoform of human CD40

<400> 11 <400> 11

imagen3image3

<210> 12<211> 277 <210> 12 <211> 277

<212> PRT <212> PRT

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<400> 12 <400> 12

imagen3image3

Claims

Reivindicaciones Claims

1. Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria 1. An anti-CD40 human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell expressing CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, for use in a procedure to treat a human subject of an inflammatory disease

o una enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: or an autoimmune disease, the procedure comprising administering to said subject a effective amount of the human anti-CD40 monoclonal antibody, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group constituted by:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano. a) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or to the monoclonal antibody CHIR-12.12 which can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543; b) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; c) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-89 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; d) a monoclonal antibody that competes with the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543 in a competitive binding assay; and e) a monoclonal antibody that is an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of any one of the preceding items a) -d), wherein said fragment maintains the ability to specifically bind to said human CD40 antigen.

2. Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: 2. Use of an effective amount of a human anti-CD40 monoclonal antibody, which is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40 in the preparation of a medicament for treating a human subject of an inflammatory disease or an autoimmune disease, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

3. 3.: El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmune está seleccionada del grupo constituido por lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, asma, síndrome de Churg-Strauss The monoclonal antibody of claim 1 or the use of claim 2, wherein said inflammatory disease or autoimmune disease is selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus (SLE), discoid lupus, lupus nephritis, sarcoidosis, juvenile arthritis, arthritis rheumatoid, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, ankylosing spondylitis, gouty arthritis, rejection of an organ or tissue transplant, graft versus host disease, multiple sclerosis, hyper IgE syndrome, polyarteritis nodosa, primary biliary cirrhosis, inflammatory bowel disease Crohn's disease, celiac disease (gluten-sensitive enteropathy), autoimmune hepatitis, pernicious anemia, autoimmune hemolytic anemia, psoriasis, scleroderma, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune thyroiditis, Graves' disease, Hasimoto's thyroiditis, complex immune disease , chronic fatigue syndrome and dysfunction i Immune (SFCDI), polymyositis and dermatomyositis, cryoglobulinemia, thrombolysis, cardiomyopathy, pemphigus vulgaris, interstitial pulmonary fibrosis, sarcoidosis, diabetes mellitus Type I and Type II, delayed type hypersensitivity type 1, 2, 3 and 4, allergy or allergic disorders, asthma, Churg-Strauss syndrome

(granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vasculitis, miopatías inflamatorias idiopáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica. (allergic granulomatosis), atopic dermatitis, allergic and irritant contact dermatitis, hives, IgE-mediated allergy, atherosclerosis, vasculitis, idiopathic inflammatory myopathies, hemolytic disease, Alzheimer's disease and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.

4. Four.: Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: A human anti-CD40 monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a human cell expressing CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, for use in a procedure to treat a human transplant rejection subject, the method comprising administering to said subject an effective amount of the antibody anti-human CD40 monoclonal, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group constituted by:

5. 5.: Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una Use of an effective amount of a human anti-CD40 monoclonal antibody, which is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a

célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: cell expressing human CD40 in the preparation of a medicament for treating a human transplant rejection subject, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said monoclonal antibody being anti -CD40 human selected from the group consisting of:

6. 6.: El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 4 o el uso de la reivindicación 5, en los que dicho tratamiento comprende adicionalmente administrar un agente inmunosupresor en el excipiente farmacéuticamente aceptable. The monoclonal antibody of claim 4 or the use of claim 5, wherein said treatment further comprises administering an immunosuppressive agent in the pharmaceutically acceptable excipient.

7. 7.: El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 6, en los que el agente inmunosupresor se selecciona del grupo constituido por ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, CTLA4-Ig y anticuerpo anti-estimulador de linfocitos B. The monoclonal antibody or the use of claim 6, wherein the immunosuppressive agent is selected from the group consisting of cyclosporine, FK506, rapamycin, corticosteroids, CTLA4-Ig and anti-B cell stimulator antibody.

8. 8.: Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando An anti-CD40 human monoclonal antibody that is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when

se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: binds to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, for use in a procedure to treat a human subject of rheumatoid arthritis, the method comprising administering to said subject an effective amount of the antibody anti-human CD40 monoclonal, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group constituted by:

9 Uso de una cantidad efectiva de anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: 9 Use of an effective amount of human anti-CD40 monoclonal antibody, which is capable of specifically binding to a human CD40 antigen expressed on the surface of a cell expressing human CD40 in the manufacture of a medicament for treating a human arthritis subject rheumatoid, said monoclonal antibody being free of significant agonist activity when bound to the CD40 antigen expressed on the surface of said cell, said human anti-CD40 monoclonal antibody being selected from the group consisting of:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano a) a monoclonal antibody that binds to an epitope capable of binding to the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or to the monoclonal antibody CHIR-12.12 which can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543; b) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-87 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; c) a monoclonal antibody that binds to an epitope comprising residues 82-89 of the human CD40 sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12; d) a monoclonal antibody that competes with the CHIR-5.9 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the CHIR-12.12 monoclonal antibody that can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543 in a competitive binding assay; and e) a monoclonal antibody that is an antigen-binding fragment of a monoclonal antibody of any one of the preceding items a) -d), wherein said fragment maintains the ability to specifically bind to said human CD40 antigen

10. 10.: El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 8 o el uso de la reivindicación 9, en los que dicho tratamiento comprende adicionalmente administrar un agente inmunosupresor en un excipiente farmacéuticamente aceptable. The monoclonal antibody of claim 8 or the use of claim 9, wherein said treatment further comprises administering an immunosuppressive agent in a pharmaceutically acceptable excipient.

11. eleven.: El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 10, en los que el agente inmunosupresor se selecciona del grupo constituido por ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, CTLA4-Ig, un anticuerpo anti-CD20 y anticuerpo anti-estimulador de linfocitos The monoclonal antibody or the use of claim 10, wherein the immunosuppressive agent is selected from the group consisting of cyclosporine, FK506, rapamycin, corticosteroids, CTLA4-Ig, an anti-CD20 antibody and anti-lymphocyte stimulator antibody

B. B.

12. El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo constituido por: 12. The monoclonal antibody or the use of any preceding claim, wherein said monoclonal antibody is selected from the group consisting of:

(i) (i): un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 44-54, 70-76 y 109-117 de SEC ID Nº: 2 o de SEC ID Nº: 6; a monoclonal antibody comprising a light chain variable domain containing residues 44-54, 70-76 and 109-117 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6;

(ii) (ii): un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº: 4 o de SEC ID Nº: 7; a monoclonal antibody comprising a heavy chain variable domain containing residues 50-54, 69-84 and 114-121 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7;

(iii) un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 46-52, 70-72 y 111-116 de SEC ID Nº: 2 o de SEC ID Nº: 6; y (iii) a monoclonal antibody comprising a light chain variable domain containing residues 46-52, 70-72 and 111-116 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6; Y

(iv) un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74, 115-120 de SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 7. (iv) a monoclonal antibody comprising a heavy chain variable domain containing residues 45-51, 72-74, 115-120 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7.

13. El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: 13. The monoclonal antibody or the use of claim 12, wherein said antibody is a monoclonal antibody comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

(i) (i): los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2; residues 21-132 of SEQ ID NO: 2;

(ii) (ii): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2; residues 21-239 of SEQ ID NO: 2;

(iii) SEC ID Nº: 2; (iii) SEQ ID NO: 2;

(iv) (iv): los residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4; residues 20-139 of SEQ ID NO: 4;

(v) (v): los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 4; residues 20-469 of SEQ ID NO: 4;

(vi) (saw): SEC ID Nº: 4; SEQ ID NO: 4;

(vii) los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 5; (vii) residues 20-469 of SEQ ID NO: 5;

(viii) SEC ID Nº: 5; (viii) SEQ ID NO: 5;

(ix) (ix): los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4; waste 21-132 of SEQ ID NO: 2 and waste 20-139 of SEQ ID NO: 4;

(x) (x): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 4; waste 21-239 of SEQ ID NO: 2 and waste 20-469 of SEQ ID NO: 4;

(xi) (xi): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 5; waste 21-239 of SEQ ID NO: 2 and waste 20-469 of SEQ ID NO: 5;

(xii) SEC ID Nº: 2ySEC ID Nº: 4; y (xii) SEQ ID NO: 2ySEC ID NO: 4; Y

(xiii) SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 5. (xiii) SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5.

14. El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: 14. The monoclonal antibody or the use of claim 12, wherein said monoclonal antibody comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of:

(i) (i): los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6; residues 21-132 of SEQ ID NO: 6;

(ii) (ii): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6; residues 21-239 of SEQ ID NO: 6;

(iii) SEC ID Nº: 6; (iii) SEQ ID NO: 6;

(iv) (iv): los residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7; residues 20-144 of SEQ ID NO: 7;

(v) (v): los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 7; residues 20-474 of SEQ ID NO: 7;

(vi) (saw): SEC ID Nº: 7; SEQ ID NO: 7;

(vii) los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 8; (vii) residues 20-474 of SEQ ID NO: 8;

(viii) SEC ID Nº: 8; (viii) SEQ ID NO: 8;

(ix) (ix): los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7; waste 21-132 of SEQ ID NO: 6 and waste 20-144 of SEQ ID NO: 7;

(x) (x): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 7; waste 21-239 of SEQ ID NO: 6 and waste 20-474 of SEQ ID NO: 7;

(xi) (xi): los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 8 waste 21-239 of SEQ ID NO: 6 and waste 20-474 of SEQ ID NO: 8

(xii) SEC ID Nº: 6ySEC ID Nº: 7; y (xii) SEQ ID NO: 6ySEC ID NO: 7; Y

(xiii) SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 8. (xiii) SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8.

15. fifteen.: El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo se une a antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-6 M. The monoclonal antibody or the use of any preceding claim, wherein said antibody binds to human CD40 antigen with an affinity (KD) of at least 10-6 M.

16. 16.: El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo se une a antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-8 M. The monoclonal antibody or the use of any preceding claim, wherein said antibody binds to human CD40 antigen with an affinity (KD) of at least 10-8 M.

17. 17.: El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho The monoclonal antibody or the use of any preceding claim, wherein said

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10 anticuerpo se selecciona del grupo constituido por el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543. The antibody is selected from the group consisting of the monoclonal antibody CHIR-5.9 which can be obtained from the hybridoma cell line deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5542 or the monoclonal antibody CHIR-12.12 which can be obtained from the cell line of hybridoma deposited in the ATCC as Patent Deposit No. PTA-5543.

15 18. El anticuerpo monoclonal o uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho fragmento está seleccionado del grupo constituido por un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena simple. 18. The monoclonal antibody or use of any preceding claim, wherein said fragment is selected from the group consisting of a Fab fragment, an F (ab ’) 2 fragment, an Fv fragment and a single chain Fv fragment.

19. El anticuerpo monoclonal o uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho 20 anticuerpo monoclonal se produce en una línea celular de CHO. 19. The monoclonal antibody or use of any preceding claim, wherein said monoclonal antibody is produced in a CHO cell line.