ES2346448T3 - Metodo para la preparacion por fermentacion de metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes. - Google Patents
Metodo para la preparacion por fermentacion de metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2346448T3 ES2346448T3 ES05700860T ES05700860T ES2346448T3 ES 2346448 T3 ES2346448 T3 ES 2346448T3 ES 05700860 T ES05700860 T ES 05700860T ES 05700860 T ES05700860 T ES 05700860T ES 2346448 T3 ES2346448 T3 ES 2346448T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- methionine
- abc
- yaec
- yaee
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Método para la preparación de L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes recombinantes en el que se atenúa o atenúan uno o una pluralidad de los genes yaeC, abc y yaeE, que codifican el sistema de absorción de metionina MetD2, en el que el gen yaeC codifica la proteína de unión periplasmática YaeC; el gen abc codifica una proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica una permeasa YaeE.
Description
Método para la preparación por fermentación de
metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes.
El objeto de la invención es un método para la
preparación por fermentación de L-metionina,
mediante uso de bacterias corineformes recombinantes, que captan
poca o ninguna metionina del medio circundante. Según la invención,
esto se logra mediante atenuación, especialmente desactivación, del
sistema de captación de metionina Met2, codificado a través de los
genes yaeC, abc y yaeE.
Los compuestos químicos, por medio de lo cual se
quiere decir en particular L-aminoácidos, vitaminas,
nucleósidos y nucleótidos y D-aminoácidos,
encuentran uso en medicina humana, en la industria farmacéutica, en
cosméticos, en la industria alimentaria y en alimentación
animal.
Muchos de estos compuestos se preparan mediante
fermentación de microorganismos, preferiblemente a partir de cepas
de bacterias corineformes, preparados especialmente a partir del
corynebacterium glutamicum.
Debido a la gran importancia, se ha llevado a
cabo un trabajo a través de la mejora de métodos de fabricación. Las
mejoras del proceso pueden implicar características técnicas de la
fermentación como, por ejemplo, agitación y suministro de oxigeno o
la composición del medio de cultivo tal como, por ejemplo, la
concentración de azúcar durante la fermentación o el procesamiento
de la producción, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio
iónico o las características de producción intrínseca del propio
microorganismo.
Para la mejora de las características de
comportamiento de estos microorganismos, se utilizan los métodos de
mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera, las
cepas que son resistentes a antimetabolitos, como por ejemplo el
análogo de lisina
S-(2-aminoetil)-cisteina o los
análogos de metionina
\alpha-metil-metionina, etionina,
norleucina, N-acetilnorleucina,
S-trifluorometilhomocisteina, ácido
2-amino-5-heptenoico,
seleno-metionina, metioninsulfoxamina, metoxina,
ácido 1-aminociclopentanocarboxilico, son
auxotróficos para metabolitos significativos reguladores y producen
L-aminoácidos.
Durante varios años se ha empleado la tecnología
de ADN recombinante para la mejora de cepas de cepas productoras de
aminoácidos de corynebacterium glutamicum, en la que se
amplifican genes de la biosintesis de aminoácidos particulares y se
investiga el efecto sobre la producción del
L-aminoácido.
Se ha marcado como objetivo proporcionar nuevas
bases para métodos mejorados para la preparación mediante
fermentación de L-metionina, con bacterias
corineformes.
Más abajo se mencionan
L-aminoácidos o aminoácidos, queriendo decir con
ello uno o una pluralidad de los aminoácidos proteinogénicos,
incluyendo sus sales, seleccionados del grupo de ácido
L-aspártico, L-asparagina,
L-treonina, L-serina, ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-glicina, L-alanina,
L-cisteina, L-valina,
L-metionina, L-isoleucina,
L-leucina, L-tirosina,
L-fenilalanina, L-histidina,
L-lisina, L-triptófano,
L-arginina, y L-prolina. Se prefiere
particularmente L-metionina.
Por aminoácidos proteinogénicos se entiende los
aminoácidos que aparecen en proteínas naturales, esto es, en
proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos.
Sirven como entidades estructurales para las proteínas en las que
están enlazados entre si mediante enlaces peptídicos.
La L-metionina o metionina
mencionada más abajo se refiere también a las sales como, por
ejemplo, hidrocloruro de metionina o sulfato de metionina.
La captación de metionina desde el medio de
fermentación es muy importante para la producción de metionina,
puesto que una posible reabsorción del producto excretado reducirla
la tasa de producción. Los genes atenuados yaeE, abc y yaeC
descritos en esta invención para corynebacterium glutamicum
codifican la proteína ABC de unión a ATP y la permeasa YaeE, que
juntos forman el sistema de captación de metionina MetD2, para la
proteína de unión periplasmática YaeC.
La atenuación, y particularmente la
desactivación, de uno o una pluralidad de los genes codificantes
yaeC, abc y yaeE para el sistema de captación de metionina MetD2
mejora la producción de L-metionina en las bacterias
corineformes correspondientes, en comparación con los organismos de
partida sin atenuación o desactivación de estos genes.
El objeto de la invención es un método para la
preparación mediante fermentación de L-metionina
mediante uso de bacterias corineformes recombinantes, que en
particular ya producen L-aminoácidos que captan
menos metionina que los organismos de partida, o nada de metionina,
del medio circundante, y en las cuales una o una pluralidad de la
secuencia o secuencias nucleotidicas que codifican yaeC, abc y yaeC
del sistema de captación de metionina MetD2 están atenuadas o en
particular desactivadas o expresadas a un nivel más bajo.
Un objeto adicional de la invención es un método
para la preparación mediante fermentación de
L-metionina, en el que se llevan a cabo las
siguientes etapas:
- (a)
- fermentar la L-metionina produciendo bacterias corineformes recombinantes en un medio, en el que se capta menos metionina que los organismos de partida o no se capta metionina del medio circundante, y en el que al menos se atenúan, y especialmente se desactivan o se expresan en un nivel más bajo, al menos uno de los genes que codifican yaeE, abc y yaeC para el sistema de captación de metionina MetD2,
- (b)
- enriquecer la L-metionina en el medio o en las células de la bacteria,
- (c)
- aislar la L-metionina deseada, en la que, opcionalmente, los componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa permanecen en porciones (> 0 a 100%) o en sus cantidades totales en el producto final.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias corineformes producen
L-metionina, preferiblemente ya antes de atenuar o
desactivar la captación de metionina del medio circundante, lo que
se logra por ejemplo atenuando o desactivando uno o una pluralidad
de los genes yaeE, abc y yaeC.
Se encontró que los microorganismos,
preferiblemente bacterias corineformes, que captan poca o ninguna
metionina del medio circundante, lo que se logra atenuando o
desactivando uno o una pluralidad de los genes que codifican yaeE,
abc y yaeC para el sistema de captación de metionina MetD2,
potencian la producción de L-aminoácidos,
especialmente L-metionina.
Las secuencias nucleotidicas de los genes de
corynebacterium glutamicum mencionados son conocidas para la
técnica anterior más reciente, y se pueden citar diferentes
Solicitudes de patentes junto con el banco de datos del
National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD,
USA).
National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD,
USA).
Genes yaeC:
- Designación:
- Proteína de unión periplasmática YaeC
- Función:
- Parte del sistema de captación de metionina MetD2
- Referencias:
- Secuencias 7061 y 709 del documento EP1108790
- Nº de acceso:
- AX127145 y AX120793
\vskip1.000000\baselineskip
Genes abc:
- Designación:
- Proteína de unión a ATP ABC
- Función:
- Parte del sistema de captación de metionina MetD2
- Referencias:
- Secuencias 7061, 708, 7060 y 707 del documento EP1108790; Secuencia 363 del documento WO0100805; Secuencia 509 del documento WO010084
- Nº de acceso:
- AX127145; AX120792; AX127144; AX120791; AX0667 81; AX065383
\vskip1.000000\baselineskip
Genes yaeE:
- Designación:
- Permeasa YaeE
- Función:
- Parte del sistema de captación de metionina MetD2
- Referencias:
- Secuencias 7060, 7061 y 706 del documento EP0100805; Secuencia 365 del documento W00100805
- Nº de acceso:
- AX127144; AX127145; AX120790; AX066783.
\newpage
Las secuencias que codifican los genes yaeC, abc
y yaeE descritos en las localizaciones del texto dadas se pueden
usar según la invención. Además, se pueden usar alélicos del gen
mencionado, que se dan mediante la naturaleza degenerativa del
código genético o mediante "mutaciones de sentido"
funcionalmente neutras.
En las reivindicaciones se pueden encontrar
realizaciones preferidas.
El término "atenuando" o "atenuar"
describe en este contexto la reducción o desactivación de la
actividad intracelular de uno o una pluralidad de sistemas
enzimáticos, o proteínas en un organismo, que están codificados por
el ADN correspondiente, en el que por ejemplo se usa un promotor
débil o un gen o alélico, que codifica una enzima correspondiente
con una menor actividad o se inactiva el gen o enzima o proteína
correspondiente y, si es necesario, se combinan estos rasgos.
Mediante las etapas de atenuación, la actividad
o concentración de las proteínas correspondientes se reducen en
general desde 0 hasta 75%, 0 hasta 50%, 0 hasta 25%, 0 hasta 10% o 0
hasta 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo
natural, o la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida.
La expresión "menor" se refiere a los
mismos porcentajes observados a la vista de la capacidad de
captación de los microorganismos recombinantes, en comparación con
los microorganismos de partida sin atenuación o desactivación del
sistema de captación de metionina MetD2.
La reducción de la concentración de proteína es
detectable mediante una separación proteica común mono y
bidimensional y una identificación óptica subsiguiente de la
concentración proteica en el gel usando un software de evaluación
apropiado. Un método común para la preparación de geles de proteínas
para bacterias corineformes y para la identificación de las
proteínas es la estrategia descrita en Hermann et al.
(Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). La
concentración de proteína se puede analizar igualmente mediante
hibridación por transferencia Western con un anticuerpo especifico
para la proteína dada (Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,
(1989)) y la interpretación óptica subsiguiente con el software
apropiado para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer
(1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte
Chemie 111: 2630-2647 (1999)). La actividad de las
proteínas que se unen a ADN se puede medir usando Ensayos de
Desplazamiento de Bandas de ADN (también denominado como retardo de
gel), como se describe por ejemplo en el libro de texto
"Bioanalytik" (Lottspeich/Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag
GmbH, Heidelberg, Alemania, 1998) y utilizado por Wilson et
al. (J. Bacteriol. 183: 2151-2155 (2001)). La
acción de las proteínas de unión a ADN sobre la expresión de otros
genes se puede mejorar usando diferentes métodos bien descritos de
los ensayos Reportergen (Sambrook et al., Molecular Cloning;
a Laboratory Manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Los microorganismos que son el objeto de la
presente invención pueden producir aminoácidos a partir de glucosa,
sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidones, celulosa, o a
partir de glicerol y etanol. Como agente, pueden estar implicadas
las bacterias corineformes, especialmente el género corynebacterium.
Para el género corynebacterium, se menciona corynebacterium
glutamicum, que se sabe que ejerce su capacidad para producir
L-aminoácidos.
Las cepas adecuadas del género corynebacterium,
especialmente la corynebacterium tipo glutamicum son especialmente
las cepas naturales.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
O como ejemplo la cepa productora de
L-metionina
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas con la denominación "ATCC" se
pueden obtener de la American Type Culture Collection (Manassas, VA,
USA).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las cepas con la designación "FERM" se
pueden obtener del National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki,
Japón). La cepa de corinebacterium denominada termoaminogen (FERM
BP-1539) se describe en la patente U.S.
5.250.434.
Para obtener la atenuación, tanto la expresión
del gen como las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas se pueden degradar o desactivar. Si es necesario se
combinan ambas medidas.
La expresión génica se puede disminuir mediante
manejo del cultivo adecuado o mediante cambio genético (mutación) de
las estructuras de señal de la expresión génica. Las estructuras de
señal de la expresión génica son por ejemplo genes represores, genes
activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a
ribosoma, el codón de partida y terminadores. Una persona experta en
la técnica puede encontrar información para este fin en la Solicitud
de patente WO 96/15246, en las publicaciones de Boyd y Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988),
Vosuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26:
3584-3590 (1998), Patek et al (Microbiology
142: 1297-309 (1996), y Journal of Biotechnology
104: 311-323 (2003)) y en libros de textos conocidos
de genética y biología molecular tales como, por ejemplo, el libro
de texto de Knippers "Moleculare Genetik" (Genética Molecular),
6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), o el de
Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y Clones), VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania (1990)).
Un ejemplo de la regulación deseada de la
expresión génica es la clonación de genes para ser atenuados bajo el
control de promotores inducibles mediante adición de cantidades
cerradas de promotores inducibles por IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido),
tales como por ejemplo el promotor trc o el promotor tac. Para este
fin, son adecuados los vectores tales como, por ejemplo, el vector
de expresión de Escherichia coli pXK99E (documento (WO
0226787; presentado según el tratado de Budapest del 31 de julio de
2001 como DH5alfa/pXK99E como DSM14440 en la Asociación Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania)
o pVWEx2 (Wendisch, tesis doctoral, Reports of the Jülich Research
Center, Jül-33 97, ISSN 0994-2952,
Jülich, Alemania (1997)), que hacen posible una expresión
dependiente de IPTG del gen clonado en corynebacterium
glutamicum.
Este método se incluyó por ejemplo en la patente
WO 0226787 para la expresión regulada del gen deaD mediante
integración del vector pXK99EdeaD en el genoma de corynebacterium
glutamicum, y por Simic et al. (Applied and Environmental
Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) a la expresión
regulada del gen glyA mediante integración del vector pKl8mobglyA en
corynebacterium glutamicum.
Un método adicional para reducir específicamente
la expresión génica es la tecnología antisentido, en la que se
emplean oligodesoxinucleótidos cortos o vectores en la síntesis de
ARN antisentido más largo en las células diana.
Allí, el ARN antisentido se puede unir a
segmentos complementarios de ARNm especifico y reducir su
estabilidad o bloquear su capacidad para bloquear la capacidad
translocadora. Una persona experta en la técnica puede encontrar un
ejemplo que se refiera a esto en Srivastava et al. (Applied
Environmental Microbiology, Oct 2000; 66 (10):
4366-4371).
Las mutaciones que conducen a un cambio o
reducción de las propiedades catalíticas son conocidas para el
estado de la técnica; se mencionan ejemplos en los trabajos de Qiu y
Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611-8617 (1997)), Sugimoto et al (Bioscience
Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997))
y mencionados por Móckel (tesis doctoral, Berichte des
Forschungszentrums Jülich (Jülich Research Center Reports),
Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania (1994). Las
presentaciones de resumen se pueden encontrar en libros de texto
conocidos sobre genética y microbiología, tales como por ejemplo
aquellas en Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética General),
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986).
Las transiciones, transversiones, inserciones y
supresiones se tienen en cuenta con las mutaciones. En la
dependencia de la acción del intercambio de aminoácidos sobre la
actividad enzimática, se debe hablar de "mutaciones de pérdida de
sentido" o "mutaciones sin sentido".
Las inserciones o supresiones de al menos un par
de bases en un gen conducen a "mutaciones de desplazamiento del
marco", como consecuencia de lo cual se forman falsos aminoácidos
o termina la producción prematuramente. Las supresiones de una
pluralidad de codones conducen típicamente a una ruptura completa de
la actividad enzimática.
Las instrucciones para la producción de tales
mutaciones son estado de la técnica, y se pueden encontrar en libros
de texto conocidos de genética y microbiología tales como por
ejemplo Knippers ("Molekulare Genetik") (Genética Molecular),
6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), o aquel
de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y Clones), VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania (1990), o aquel de Hagemann
("Allgemeine Genetik" (Genética General), Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart (1986).
Un método común de mutar genes de c.
glutamicum es el método de la "interrupción génica" y
"sustitución génica" descrito por Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991).
En el método de la interrupción génica, por
ejemplo, una porción central de la región codificante del gen de
interés se clona en un vector plasmidico, el cual se puede replicar
en un hospedante (típicamente E. coli), pero no en c.
glutamicum. Los vectores que merece la pena considerar son, por
ejemplo, pSUP301 (Simón et al., Bio/Technology 1,
784-791 (1983)), pK18 mob, pK19mob, pk18mobsacB o
pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69-73
(1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI,
USA, pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Groningen, Países
Bajos); Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:
32678-84, patente U.S. 5.487.993, pCR®Blunt
(Invitrogen, Groningen, Países Bajos); Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993) o
pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173
4510-4516). El vector plasmídico, que contiene el
área central de la región codificante del gen, se convierte
subsiguientemente mediante conjugación o transformación en la cepa
de c. glutamicum deseada. El método de conjugación se
describe por ejemplo en Schäfer et al. (Journal of
Bacteriology 172: 1663-1666 (1990) y Applied and
Environmental Microbiology 60:
756-759(1994).
Los métodos de transformación se describen por
ejemplo en Thierbach et al. (Applied Microbiology and
Biotechnology 29, 356-362 (1988), Duncan y Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et
al. (FEMS Microbiolgical Letters 123, 343-347
(1994)). Tras la recombinación homologa por medio de un suceso de
"entrecruzamiento", la región codificante del gen en cuestión
es interrumpida por la secuencia del vector y se obtienen dos alelos
incompletos, cada uno de los cuales carece de los extremos 3' ó 5'.
Este método se usó por ejemplo por Fitzpatrick et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580
(1994) para desactivar el gen recA de c. glutamicum.
Vectores que contienen al menos 15 y
preferiblemente 25 nucleótidos sucesivos de la porción central de la
región codificante de al menos uno de los genes yaeD, abc, o yaeE,
son igualmente un objeto de la presente descripción.
En el método de "sustitución génica", se
prepara una mutación, tal como por ejemplo una supresión, inserción
o sustitución de bases, en el gen de interés in vitro. El
alelo preparado por otro lado se clona en un vector no replicativo
para c. glutamicum, y este se convierte subsiguientemente
mediante transformación o conjugación en el hospedante deseado de
c. glutamicum. Tras la recombinación homologa por medio de
una primera integración que provoca el suceso de
"entrecruzamiento" y una segunda escisión que efectúa un suceso
de "entrecruzamiento" en el gen diana o en la secuencia
pretendida, se logra el atrapamiento de la mutación o del alelo.
Este método se describe en Scharzer y Pühler Bio/Technology 9:
84-87 (1991), y se usó por ejemplo por
Peters-Windisch et al. (Microbiology 144,
915-927 (1998), a fin de desactivar el gen pyc de
c. glutamicum mediante una supresión, o por Wehmeier et
al. (Microbiology 144: 1853-1862 (1998) para la
inserción de una supresión en el gen rel de c.
glutamicum.
Kirchner y Tauch (Journal of Biotechnology 104:
287-299 (2003)) proporcionan un repaso de diferentes
métodos genéticos para c. glutamicum.
De esta manera, se puede construir una inserción
o un intercambio de bases en uno o una pluralidad de los genes
seleccionados del grupo de yaeC, abc, y yaeE.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-aminoácidos, además de disminuir la
importación de metionina desde el medio circundante, lograr esto,
según la invención, atenuando uno o una pluralidad de los genes
seleccionados del grupo de yaeC, abc, y yaeE, una o una pluralidad
de enzimas de las rutas biosintéticas respectivas, de glucolisis, de
anaplerosis, del ciclo de ácido cítrico, del ciclo de fosfato de
pentosa de la exportación de aminoácidos y si es necesario proteínas
reguladoras, ya sea para fortalecer, o atenuar, especialmente
desactivar o disminuir la expresión.
A este respecto, el término
"fortalecimiento" o "fortalecer" describe el incremento en
la actividad intracelular o concentración de una o una pluralidad de
enzimas o proteínas en un microorganismo, que son codificadas por el
ADN correspondiente en el que se incrementa, por ejemplo, el número
de copias del gen o del gen, se usa un promotor fuerte o un gen o
alelo que para una enzima o proteína correspondiente codifica con
una mayor actividad, y si es necesario se combinan estas
medidas.
Mediante las medidas de fortalecimiento,
especialmente la sobreexpresión, la actividad o concentración de la
proteína correspondiente aumenta en general en al menos 10%, 25%,
50%, 75%, 100%, 150% 200%, 300%, 400% o 500%, máximo hasta 1000% o
2000% con relación a la de la proteína de tipo natural o la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida.
En general se prefiere el uso de genes
endógenos.
Bajo "genes endógenos" o "secuencias
nucleotídicas endógenas" se entiende el tipo de genes o
secuencias nucleotídicas presentes en la población.
Así, por ejemplo, para la preparación de
L-metionina, además de reducir la importación de
metionina desde el medio circundante, según la invención, para
lograrlo mediante atenuación de uno o una pluralidad de los genes,
seleccionados del grupo de yaeC, abc, y yaeE, se fortalece,
especialmente se sobreexpresa, uno o una pluralidad de los genes
escogidos del grupo de genes o alelos de la producción de metionina.
Bajo "genes o alelos de la producción de metionina" se
entienden marcos de lectura abierta todos juntos, preferiblemente
endógenos, genes o alelos, cuyo fortalecimiento/sobreexpresión puede
conducir a una mejora de la producción de metionina.
Para este fin, pertenecen entre otros los
siguientes marcos de lectura, genes o alelos: accBC, accDA, aecD,
cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2,
gdh, gnd, glyA, hom, hom^{FBR}, lysC, lySC^{FBR}, metA, metB,
metE, metH, metY, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^{FBR}, pgk, pknA,
pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsl, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC,
sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwal, zwf, y zwf A213T.
Estos se resumen y explican en la Tabla 1.
Además, puede ser ventajoso para la producción
de L-metionina, además de reducir la importación de
metionina desde el medio circundante, lograrla atenuando uno o una
pluralidad de los genes seleccionados del grupo de 5 yaeC, abc, y
yaeE, al mismo tiempo atenuando uno o una pluralidad de los genes
seleccionados del grupo de genes o alelos, que no son esenciales
para el crecimiento o producción de metionina, y especialmente
desactivando o reduciendo la expresión.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los siguientes marcos de lectura abierta
pertenecen entre otros para este fin: brnQ, ccpA1, ccpA2, citA,
citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2,
lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB y zwa2. En la Tabla 2 se
resumen y se explican.
Finalmente, puede ser ventajoso para la
producción de aminoácidos, especialmente
L-metionina, además de disminuir la importación de
metionina desde el medio circundante, por ejemplo, lograr esto
atenuando uno o una pluralidad de los genes, seleccionados del grupo
de yaeC, abc, y yaeE, para imposibilitar reacciones secundarias
indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms" en: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.) Academic Press, Londres, UK,
1982).
Los microorganismos preparados según la
invención son igualmente un objeto de la invención y se pueden
cultivar continua o discontinuamente en procesos por lotes o en
procesos de alimentación discontinua o de alimentación discontinua
repetida, con el fin de producir L-aminoácidos. Un
sumario de métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de
texto de by Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik), (Bioprocess Technology 1. Introduction to
Bioprocess Technology) (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1991) o en
Lehrbuch von Storhas, Bioreactoren und Periphere Einrichtungen
(Libro de texto de Storhas, (Bioreactors and Ancillary Equipment)
(Viewweg Publishers, Braunschweig/Wiesbaden (1994)).
El medio de cultivo a usar debe satisfacer de
manera adecuada las reivindicaciones de las cepas apropiadas. Las
descripciones de medio de cultivo de diferentes microorganismos
están contenidas en el libro de texto "Manual of Methods for
General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., USA, (1981)).
Como fuente de carbono, se usan azúcares e
hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa,
maltosa, molasas, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como
aceite de soja, aceite de girasol, aceite de nuez molida y aceite de
nuez de coco, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido
esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol,
y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Estos materiales se
pueden usar solos o como mezclas.
Como fuentes de nitrógeno, se pueden usar
compuestos que contienen nitrógeno orgánico tales como peptona,
extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, extracto
de maíz, extracto de haba de soja, y urea o compuestos inorgánicos
tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Como fuente de fósforo, se puede usar ácido
fosfórico, hidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales correspondientes que contienen so- dio. El
medio de cultivo debe contener además sales metálicas que son
necesarias para el crecimiento, tales como, por ejemplo, sulfato de
magnesio o sulfato de hierro. Finalmente, además de los materiales
mencionados anterior- mente, se añaden materiales para el
crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas. También se pueden
añadir al medio de cultivo precursores adecuados. Los materiales
aditivos se pueden añadir al cultivo en forma de cargas
individuales, o se pueden alimentar de una manera adecuada durante
el proceso de cultivo.
Para el control del pH del cultivo, se pueden
emplear de manera adecuada compuestos básicos tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal, o
compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para
el control de la espumación, se emplean agentes antiespumantes tales
como, por ejemplo, ésteres de poliglicol con ácidos grasos. Para
mantener la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio
materiales que actúan selectivamente, tales como antibióticos. Para
mantener las condiciones aerobias, se pueden alimentar en el cultivo
oxigeno o mezclas gaseosas que contienen oxigeno, tales como aire.
La temperatura del cultivo normalmente está entre 20 y 45ºC, y
preferiblemente entre 25 y 40ºC. El proceso de cultivo se continúa
hasta que se haya formado una cantidad máxima del producto
deseado.
Este objetivo se logrará normalmente en 10 a 160
horas.
Con los métodos de la invención, se puede
mejorar el resultado de las bacterias o del proceso de fermentación
en relación con la concentración del producto (producto por volumen
unitario), el rendimiento del producto (producto formado por fuente
de carbono utilizada), la formación de producto (producto formado
por volumen unitario y tiempo) u otro parámetro del proceso y sus
combinaciones en al menos 0,5%, al menos 1%, o al menos 2%.
Los métodos para la determinación de
L-aminoácidos son conocidos en la técnica. Los
análisis se pueden realizar como se describe en Spackmann et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1185-1190) mediante cromatografía de intercambio
aniónico con derivatización con ninhidrina subsiguiente, o se pueden
realizar mediante HPLC de fase inversa como se describe en Lindroth
et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174). Los expertos en la técnica también
encontrarán información sobre esto en Ashman et al. (en
Tschesche (Hrsg), Modern Methods in Protein Chemistry,
155-172, de Gruyter, Berlín 1985).
El proceso según la invención sirve para la
producción de L-metionina por fermentación.
La concentración de L-metionina
en el producto final se puede aproximar si es necesario mediante
adición de L-metionina hasta el nivel deseado.
Claims (8)
1. Método para la preparación de
L-metionina mediante fermentación de bacterias
corineformes recombinantes en el que se atenúa o atenúan uno o una
pluralidad de los genes yaeC, abc y yaeE, que codifican el sistema
de absorción de metionina MetD2, en el que el gen yaeC codifica la
proteína de unión periplasmática YaeC; el gen abc codifica una
proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica una permeasa
YaeE.
2. El procedimiento para la preparación mediante
fermentación de L-metionina según la reivindicación
1, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- enriquecer L-metionina en el medio o en las células bacterianas, y
- b)
- aislar dicho L-aminoácido, en el que opcionalmente los componentes del caldo de la fermentación y/o la biomasa permanecen en su totalidad o porciones en el producto final.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El método según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque se reduce la expresión del
polinucleótido o polinucleótidos que codifica o codifican
componentes de la captación de metionina desde el medio circundante,
seleccionados de los genes yaeC, abc y yaeE, que codifican el
sistema de captación de metionina.
4. El método según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque se disminuye la regulación y/o
propiedades catalíticas de los polipéptidos (proteínas enzimáticas),
para los cuales codifican los polinucleótidos yaeC, abc y
yaeE.
yaeE.
5. El método de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque para la preparación de
L-metionina se hacen fermentar bacterias
corineformes en las que al mismo tiempo se fortalece, especialmente
se sobreexpresa, uno o una pluralidad de los genes seleccionados del
grupo enumerado en la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
6. El método de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque para la preparación de
L-metionina se fermentan microorganismos
corineformes en los que al mismo tiempo se atenúa uno o una
pluralidad de genes, seleccionados del grupo enumerado en la Tabla
2:
7. El método según una o una pluralidad de
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se emplean
microorganismos del tipo corynebacterium glutamicum.
8. Bacteria corineforme recombinante, en la que
uno o una pluralidad de los genes, seleccionados del grupo de yaeC,
abc y yaeE, que codifican la captación de metionina desde el medio
circundante, codifican el sistema de captación de metionina MetD2,
se atenúa o atenúan, en comparación con el organismo de partida sin
el sistema de captación de metionina MetD2 atenuado, en la que el
gen yaeC codifica una proteína de unión periplasmática YaeC; el gen
abC codifica una proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica
una permeasa YaeE.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102004009454 | 2004-02-27 | ||
| DE102004009454A DE102004009454A1 (de) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2346448T3 true ES2346448T3 (es) | 2010-10-15 |
Family
ID=34853739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05700860T Active ES2346448T3 (es) | 2004-02-27 | 2005-01-13 | Metodo para la preparacion por fermentacion de metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1745138B1 (es) |
| CN (1) | CN1922329A (es) |
| AT (1) | ATE468402T1 (es) |
| DE (2) | DE102004009454A1 (es) |
| DK (1) | DK1745138T3 (es) |
| ES (1) | ES2346448T3 (es) |
| PL (1) | PL1745138T3 (es) |
| WO (1) | WO2005085463A1 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8389250B2 (en) * | 2006-01-04 | 2013-03-05 | Metabolic Explorer | Methods for producing methionine by culturing a microorganism modified to enhance production of cysteine |
| CN102703398B (zh) * | 2007-04-11 | 2014-06-04 | Cj第一制糖株式会社 | 组合物及甲硫氨酸的生产方法 |
| ES2689754T3 (es) * | 2012-08-20 | 2018-11-15 | Evonik Degussa Gmbh | Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae |
| DE102012016716A1 (de) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden |
| US9885066B2 (en) * | 2013-05-02 | 2018-02-06 | Dutch Dna Biotech B.V. | Organic acid pathway |
| PL3039153T3 (pl) | 2013-08-30 | 2019-02-28 | Evonik Degussa Gmbh | Mikroorganizm do wytwarzania metioniny o ulepszonej aktywności syntazy metioniny i wypływie metioniny |
| WO2015028675A1 (en) * | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Metabolic Explorer | A microorganism for methionine production with enhanced methionine efflux |
| US10208324B2 (en) | 2013-12-13 | 2019-02-19 | Basf Se | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals |
| CN107771214B (zh) | 2015-04-07 | 2022-01-18 | 代谢探索者公司 | 用于具有增加的2,4-二羟基丁酸外排物的优化的2,4-二羟基丁酸产生的修饰的微生物 |
| CN108239664B (zh) * | 2018-01-22 | 2020-01-03 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺 |
| KR101915433B1 (ko) * | 2018-02-13 | 2018-11-05 | 씨제이제일제당 (주) | 시트레이트 신타아제 (Citrate synthase)의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 L-아미노산 생산방법 |
| KR101947959B1 (ko) * | 2018-05-28 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK18872001A3 (sk) * | 1999-06-25 | 2002-12-03 | Basf Aktiengesellschaft | Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny zapojené do metabolizmu uhlíka a produkcie energie |
| KR100878332B1 (ko) * | 1999-06-25 | 2009-01-14 | 백광산업 주식회사 | 막 합성 및 막 운반 관련 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| US6815196B2 (en) * | 2000-09-02 | 2004-11-09 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding o-succinylhomoserine sulfhydrylase |
-
2004
- 2004-02-27 DE DE102004009454A patent/DE102004009454A1/de not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-01-13 WO PCT/EP2005/000242 patent/WO2005085463A1/en active Application Filing
- 2005-01-13 EP EP05700860A patent/EP1745138B1/en not_active Not-in-force
- 2005-01-13 DK DK05700860.9T patent/DK1745138T3/da active
- 2005-01-13 CN CNA2005800057920A patent/CN1922329A/zh active Pending
- 2005-01-13 PL PL05700860T patent/PL1745138T3/pl unknown
- 2005-01-13 AT AT05700860T patent/ATE468402T1/de active
- 2005-01-13 ES ES05700860T patent/ES2346448T3/es active Active
- 2005-01-13 DE DE602005021342T patent/DE602005021342D1/de active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1922329A (zh) | 2007-02-28 |
| EP1745138A1 (en) | 2007-01-24 |
| DK1745138T3 (da) | 2010-09-06 |
| WO2005085463A1 (en) | 2005-09-15 |
| DE102004009454A1 (de) | 2005-09-15 |
| PL1745138T3 (pl) | 2010-10-29 |
| ATE468402T1 (de) | 2010-06-15 |
| DE602005021342D1 (de) | 2010-07-01 |
| EP1745138B1 (en) | 2010-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2346448T3 (es) | Metodo para la preparacion por fermentacion de metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes. | |
| ES2382226T3 (es) | Procedimiento para la producción de L-metionina usando bacterias corineformes | |
| ES2382363T3 (es) | Procedimiento para la producción de l-aminoácidos mediante mutantes del gen glta que codifica la citrato sintasa | |
| ES2376035T3 (es) | Unidades de expresión de p-ef-ts en corynebacterium glutamicum. | |
| US9150827B2 (en) | Method for the fermentative production of L-amino acids with the aid of coryneform bacteria capable of using glycerin as the only carbon source | |
| US6921651B2 (en) | Process for the preparation of amino acids by using coryneform bacteria with attenuated 1-phosphofructokinase activity | |
| WO2005083082A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung rekombinanter coryneformer bakterien mit verminderter aktivität des regulators asur | |
| EP1456363B1 (en) | Alleles of the siga gene from coryneform bacteria | |
| US6783967B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the rpoB gene | |
| KR20040014489A (ko) | 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의한 ｌ-아미노산의생산 방법 | |
| WO2003023044A2 (en) | Process for the production of l-amino acids using coryneform bacteria | |
| EP1367130A1 (en) | Process for the preparation of L-amino acids using coryneform bacteria which contain an attenuated MalE gene | |
| US7083942B2 (en) | Alleles of the aceA gene from coryneform bacteria | |
| US7049106B2 (en) | Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria with an attenuated mqo gene | |
| WO2003054198A1 (en) | Alleles of the glucokinase gene coryneform bacteria | |
| US20050079588A1 (en) | Method for the fermentative production of L-amino acids, using coryneform bacteria | |
| DE102004055414A1 (de) | Allele des metK-Gens aus coryneformen Bakterien | |
| WO2003054207A2 (en) | Fermentation process for the preparation of l-amino acids using coryneform bacteria | |
| SK14592000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín | |
| KR20050114406A (ko) | 코리네형 세균으로부터의 ｌｙｓＣ 유전자의 대립유전자 | |
| SK4252001A3 (en) | Nucleotide sequences which code for the rp1k gene |