ES2344189T3 - Agentes, composiciones y metodos que los utilizan utiles en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica, que comprende un soporte farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un vehículo viral de presentación que es una partícula viral no apta para la propagación in vivo, vehículo de presentación que presenta un polipéptido, donde dicho polipéptido comprende al menos un epítopo del beta-amiloide (Aβ), y donde dicho epítopo genera anticuerpos de unión con Aβ contra dicho epítopo durante la administración a un sujeto y donde dichos anticuerpos inhiben la agregación de dicho beta-amiloide.
Description
Agentes, composiciones y métodos que los
utilizan útiles en el tratamiento o la prevención de la enfermedad
de Alzheimer.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden un soporte farmacéuticamente aceptable y, como
ingrediente activo, un vehículo viral de presentación que es una
partícula viral no apta para la propagación in vivo,
presentando dicho vehículo de presentación un polipéptido, en el que
dicho polipéptido comprende al menos un epítopo de
beta-amiloide (A\beta), y en el que dicho epítopo
genera anticuerpos de unión a A\beta contra dicho epítopo cuando
se administra a un sujeto y en el que dichos anticuerpos inhiben la
agregación de dicho beta-amiloide.
Las enfermedades que forman placas se
caracterizan por la presencia de depósitos de placas amiloides en el
cerebro así como por la degeneración neuronal. Los depósitos
amiloides se forman por péptidos agregados a una masa insoluble. La
naturaleza del péptido varía según las enfermedades pero en la
mayoría de los casos, el agregado tiene una estructura de lámina
beta y se tiñe con tinción Rojo del Congo. Además de la enfermedad
de Alzheimer (EA), la enfermedad de Alzheimer de aparición precoz,
la enfermedad de Alzheimer de aparición tardía, la enfermedad de
Alzheimer presintomática, otras enfermedades caracterizadas por
depósitos amiloides son, por ejemplo, la amiloidosis SAA, el
síndrome islandés hereditario, el mieloma múltiple, y las
enfermedades priónicas. La enfermedad priónica más común en animales
son el temblor epidémico (escrapie) de ovejas y cabras y la
encefalopatía espongiforme (BSE) del ganado (Wilesmith y Wells
(1991) Curr Top Microbiol Immunol 172: 21-38).
En los humanos se han identificado cuatro
enfermedades priónicas: (i) kuru, (ii) la enfermedad
Creutzfeldt-Jakob (CJD), (iii) la enfermedad
Gerstmann-Streussler-Sheinker
(GSS), y (iv) y el insomnio familiar fatal (FFI) (Gajdusek (1977)
Science 197: 943-960; Medori, Tritschler et
al. (1992) N Engl J Med 326: 444-449).
\vskip1.000000\baselineskip
Las enfermedades priónicas implican la
conversión de la proteína priónica celular normal (PrP^{C}) en la
correspondiente isoforma escrapie (PrP^{Sc}). Las mediciones
espectroscópicas demuestran que la conversión de PrP^{C} en la
isoforma escrapie (PrP^{Sc}) supone una importante transición de
conformación, implicando que las enfermedades priónicas, como otras
enfermedades amiloidogénicas, son trastornos de la conformación
proteínica. La transición de PrP^{C} a PrP^{Sc} está acompañada
de una disminución de la estructura secundaria
\alpha-helicoidal (del 42% al 30%) y de un notable
incremento del contenido en lámina beta (del 3% al 43%) (Caughey
et al. 1991, Pan et al. 1993). Esta reestructuración
está asociada a propiedades fisioquímicas anormales, incluyendo la
insolubilidad de detergentes no desnaturalizantes y la resistencia
parcial a la proteolisis. Estudios anteriores han mostrado que un
péptido sintético homólogo a residuos 106-126 de PrP
humano (PrP 106-126) muestra algunas de las
propiedades fisicoquímicas y patogénicas de PrP^{Sc} (Selvaggini
et al. 1993, Tagliavini et al. 1993, Forloni, et.
al. 1993). El péptido muestra un notable polimorfismo
conformacional, adquiriendo diferentes estructuras secundarias en
diversos entornos (De Gioia et al. 1994). Tiende a adoptar
una conformación de lámina beta en soluciones tamponadas y se
acumula en fibrillas amiloides que son resistentes en parte a la
digestión con proteasa. Recientemente, los estudios cristalográficos
por rayos x de un complejo de anticuerpos 3F4 y su epítopo péptido
(PrP 104-113) han proporcionado una visión
estructural de esta flexible región que se considera es un
componente de la reestructuración conformacional esencial para el
desarrollo de una enfermedad priónica (Kanyo et al. 1999). La
identificación de clases de secuencias que participan en los
procesos de plegado-desplegado y/o
solubilización-agregación puede abrir una nueva vía
en el tratamiento de enfermedades que forman placas, basada en la
prevención de la agregación y/o la inducción de la desagregación
(Silen y Agard, 1989, Frenkel et al. 1998, Horiuchi y
Caughey, 1999).
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno
progresivo que tiene como resultado la demencia senil. De manera
general, la enfermedad presenta dos categorías: la aparición tardía
que se produce en la vejez (normalmente pasados los 65 años) y la
aparición precoz que se desarrolla mucho antes del periodo senil,
entre los 35 y 60 años por ejemplo. En ambos tipos de enfermedad, la
patología es similar, pero las anomalías tienden a ser más graves y
generalizadas en los casos que comienzan a una edad temprana. La
enfermedad se caracteriza por dos tipos de lesiones del cerebro, las
placas seniles y los nudos neurofibrilares. Las placas seniles son
áreas de neutrófilos desorganizados de hasta 150 mm con depósitos
amiloides extracelulares en el centro, visibles mediante análisis
microscópico de secciones de tejido cerebral. Los nudos
neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína tau
consistentes en dos filamentos enrollados entre sí en parejas.
\vskip1.000000\baselineskip
El principal componente de las placas seniles es
un péptido denominado A\beta o péptido
beta-amiloide (\betaAP). El péptido
beta-amiloide es un fragmento interno de
39-43 aminoácidos de una proteína precursora
denominada proteína precursora de amiloide (PPA). Varias mutaciones
de la proteína PPA han sido correlacionadas con la presencia de la
enfermedad de Alzheimer (Ver, por ej., Goate et al., Nature
349,704, 1991, valina^{717} a isoleucina; Chartier Harían et
al. Nature 353, 844, 1991, valina^{717} a glicina; Murrell
et al., Science 254, 97, 1991, valina^{717} fenilalanina;
Mullan et al., Nature Genet. 1, 345, 1992, una mutación
doble, cambiando lisina^{595}-metionina^{596}
por asparagina^{595}-leucina^{596}).
Se cree que tales mutaciones causan la
enfermedad de Alzheimer por el procesamiento incrementado o alterado
de la PPA en beta-amiloide, en particular, por el
procesamiento de la PPA en cantidades mayores de la forma larga del
beta-amiloide (es decir,
A\beta1-42 y A\beta1-43). Se
cree que las mutaciones en otros genes, como los genes de la
presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente el procesamiento de
la PPA generando mayores cantidades del
beta-amiloide de forma larga (ver Hardy, TINS 20,
154, 1997). Estas observaciones indican que el
beta-amiloide y en particular su forma larga, es un
elemento causativo de la enfermedad de Alzheimer.
También se conocen otros péptidos o proteínas de
los que hay pruebas de auto-agregación, como por
ejemplo, sin ánimo de ser exhaustivos, la amilina (Young AA. et
al., 1994, FEBS Lett, 343(3);237-41);
bombesina, ceruleína, octapéptido de colecistokinina, eledoisina,
pentapéptido relacionado con la gastrina, tetrapéptido de gastrina,
somatostatina (reducida), sustancia P; y péptido, hormona que libera
la hormona luteinizante, somatostatina N-Tyr (Banks
y Kastin, Prog Brain Res., 91:139-4, 1992).
La unión de anticuerpos monoclonales de elevada
afinidad (mAbs) a dichas regiones puede alterar la dinámica
molecular de todo el conjunto o cadena de proteínas. Mediante la
selección adecuada, se ha descubierto que los anticuerpos
monoclonales (mAbs) reconocen epítopos incompletamente plegados y
que inducen la conformación nativa en proteínas parcial o
incorrectamente plegadas (Frauenfelder et al. 1979, Blond y
Goldberg 1987, Karplus y Petsko 1990, Carlson y Yarmush 1992,
Solomon y Schwartz 1995).
\vskip1.000000\baselineskip
La Patente U.S. Nº 5.688.561 Solomon enseña
métodos de identificar anticuerpos monoclonales eficaces para
desagregar agregados de proteínas e impedir la agregación de dichas
proteínas. Específicamente, la Patente US Nº 5.688.561 muestra
anticuerpos monoclonales
anti-beta-amiloides eficaces para
desagregar placas beta-amiloides e impedir la
formación de placas beta-amiloides in vitro.
La Patente U.S. Nº 5.688.561 estipula el uso in vivo de
dichos anticuerpos para impedir la formación de placas por
agregación de placas beta-amiloides o para
desagregar placas beta-amiloides que ya se hayan
formado. Sin embargo, estas demostraciones no identifican un epítopo
que se pueda emplear para generar dichos anticuerpos. Además, estas
demostraciones no proporcionan medios para permitir la penetración
de dichos anticuerpos en el cerebro a través de la barrera
hematoencefálica (BHE). Además, esta patente no muestra el uso de la
tecnología de visualización del fago como método para suministrar
antígenos o anticuerpos. Y aún más, la Patente US Nº 5.688.561 no
muestra resultados experimentales de la efectividad in vivo
de dichos anticuerpos.
La EP 526511 de McMichael muestra la
administración de dosis homeopáticas (menos de o igual a 10^{-2}
mg/día) de beta-amiloide a pacientes con EA
preestablecida. En un ser humano típico con unos 5 litros de plasma,
incluso el límite superior de esta dosis debería generar una
concentración de no más de 2 pg/ml. La concentración normal del
beta-amiloide en el plasma humano se encuentra por
lo general en el rango de 50-200 pg/ml (Seubert
et al., Nature 359, 325-327 1992). Dado que
esta dosis propuesta apenas alteraría el nivel del beta- amiloide
endógeno en circulación y dado que la EP 526511 no recomienda el uso
de un coadyuvante, no parece plausible que resulte de ella ningún
beneficio terapéutico.
PCT/US98/25386 de Schenk y un artículo en
Nature de Schenk et al. (Nature,
400:173-177, 1999) muestran la administración de
inmunógenos beta-amiloides a un paciente a fin de
generar anticuerpos para prevenir la formación de placas o disolver
las placas existentes. Según Schenk, se necesita de 50 a 100 mg de
antígeno, de 1 a 10 mg si se emplea un coadyuvante. Estas enseñanzas
también estipulan que se puede lograr un efecto similar con la
administración directa de anticuerpos contra el
beta-amiloide, sin tener en cuenta en ambos casos la
barrera hematoencefálica que, en circunstancias normales, impide la
penetración de anticuerpos en el cerebro.
También es importante observar que estas
enseñanzas están normalmente restringidas al uso de "...cualquiera
de las formas que se producen de manera natural del péptido
beta-amiloide y particularmente las formas humanas
(es decir, A\beta39, A\beta40, A\beta41, A\beta42 o
A\beta43)" o "...polipéptidos más largos que incluyen, por
ejemplo, un péptido beta-amiloide, fragmento o
análogo activo junto con otros aminoácidos", o "multímeros de
agentes inmunogénicos monoméricos".
Estas enseñanzas ignoran, sin embargo, datos
anteriores que muestran que los primeros 28 aminoácidos del
beta-amiloide son suficientes para provocar
anticuerpos que desagregan o inhiben la agregación de placas
beta-amiloides in vitro (Hanan y Solomon,
Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 3:130-133, 1996;
Solomon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:452-455, 1996; Solomon et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 94:4109-4112, 1997).
Schenk and Schenk et al. no logran
mostrar el uso del epítopo N-terminal de placas
beta-amiloides del que se sabe que es un epítopo
secuencial compuesto de solamente cuatro residuos aminoácidos (EFRH,
SEC Nº ID:1) situados en posiciones 3-6 del péptido
beta-amiloide (Frenkel D., J. Neuroimmunol.,
88:85-90, 1998). Posteriormente se ha demostrado que
los anticuerpos contra este epítopo desagregan las fibrillas
beta-amiloides, restauran la solubilización de
placas beta-amiloides e impiden los efectos
neurotóxicos sobre las células PC 12 (Solomon, B. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:4109-4112, 1997; y
Solomon, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
93:452-455, 1996).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Este epítopo ha sido independientemente
confirmado como el epítopo unido por anticuerpos
anti-agregantes utilizando presentación de fago de
hexapéptido combinatoria aleatoria (Frenkel y Solomon, J. of
Neuroimmunol. 88:85-90, 1998).
El epítopo EFRH (SEC Nº ID:1) está disponible
para la unión de anticuerpos cuando el péptido
beta-amiloide se encuentra tanto en solución como en
agregados. El bloqueo de este epítopo por un anticuerpo monoclonal
impide la auto-agregación y permite la
resolubilización de agregados ya formados.
Estos hallazgos sugieren que las enseñanzas de
Schenk y sus colegas son ineficientes en el mejor de los casos. Dado
que, como ya se ha mencionado más arriba, la concentración normal
del beta-amiloide en el suero humano es de
50-200 pg/ml, se podría esperar que la inmunización
con ese péptido produjera bajos títulos de anticuerpos o una elevada
toxicidad si se utilizan fuertes coadyuvantes y por lo tanto no es
aplicable para terapia. De hecho, a fin de lograr títulos
significativos del suero de anticuerpos contra
beta-amiloides se requirió una serie de 11
inyecciones mensuales (Schenk et al., Nature,
400:173-177, 1999). El grado en que persistirán
estos títulos del suero a lo largo del tiempo no se conoce todavía y
este punto es especialmente crucial con respecto a la aparición
precoz de la enfermedad de Alzheimer.
Schenk y sus colegas también enseñan que un
péptido inmunogénico como el beta-amiloide puede ser
presentado sobre la superficie de un virus o bacteria. Sin embargo,
no logran enseñar el uso de un antígeno así presentado para lograr
la inmunización. No se hace mención a un epítopo en este contexto y
tampoco se proporcionan datos experimentales. Además, ni en Schenk o
en Schenk et al. tampoco se enseña el suministro de
anticuerpos en un vehículo de presentación. WO01/15655 A muestra
anticuerpos contra péptidos de neurofilamentos, un importante
componente del citoesqueleto neuronal que puede ser utilizado para
el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Colectivamente, el estado de la técnica no es
capaz de mostrar medios con los que se pueda generar in vivo
un título efectivo de anticuerpos anti-agregación en
un corto espacio de tiempo y/o ser introducido en el cerebro de los
pacientes que sufran una enfermedad en la que se forman placas.
Además, no ha sido establecida la persistencia de títulos generados
a través de las enseñanzas de la técnica anterior.
Existe por lo tanto una necesidad ampliamente
reconocida y sería altamente beneficioso contar con medios efectivos
de desagregar placas amiloides in vivo que tuvieran un efecto
duradero, elevada eficiencia, comienzo rápido, sin efectos adversos
sobre el sujeto tratado y que se pudieran producir rápidamente a
gran escala.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto de la presente invención se
proporciona una composición farmacéutica, que comprende un soporte
farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un vehículo
viral de presentación que es una partícula viral no apta para la
propagación in vivo, presentando dicho vehículo de
presentación un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende
al menos un epítopo de beta-amiloide (A\beta), y
en el que dicho epítopo genera anticuerpos de unión a A\beta
contra dicho epítopo cuando se administra a un sujeto y en el que
dichos anticuerpos inhiben la agregación de dicho
beta-amiloide.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se proporciona el uso de la composición farmacéutica
arriba mencionada en la fabricación de un medicamento para tratar la
enfermedad de Alzheimer.
De acuerdo también con otra característica de la
invención la enfermedad de Alzheimer se selecciona a partir del
grupo que consiste en la aparición precoz de la enfermedad de
Alzheimer, la aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer y la
enfermedad de Alzheimer presintomática.
De acuerdo con otras características de la
invención el vehículo es una partícula viral no apta para la
propagación in vivo.
De acuerdo también con otras características de
las realizaciones preferentes de la invención descritas la partícula
viral se selecciona de entre el grupo consistente en una partícula
viral ADN bicatenaria, una partícula viral ADN monocatenaria, una
partícula viral ARN de cadena positiva y una partícula viral ARN de
cadena negativa.
De acuerdo también con otras características de
las realizaciones preferentes de la invención descritas el vehículo
de presentación es un bacteriófago.
De acuerdo también con otras características de
las realizaciones preferentes de la invención descritas el vehículo
de presentación es un bacteriófago filamentoso.
De acuerdo también con otras características de
las realizaciones preferentes de la invención el vehículo de
presentación bacteriófago es fd.
De acuerdo con otras características de la
invención, el vehículo de presentación es incapaz de propagación
in vivo.
De acuerdo también con otras características de
las realizaciones preferentes de la invención una triple dosis de
10^{10} unidades del vehículo de presentación elegido induce un
título de anticuerpos de al menos 1:50.000 a los 30 días de
administración, tal como ha sido medido por ELISA.
\global\parskip0.900000\baselineskip
De acuerdo también con otras características de
la invención la porción inmunológica de un anticuerpo sirve para
unir al menos un epítopo de beta-amiloide
(A\beta) siendo capaz dicha porción inmunológica de dicho
anticuerpo de desagregar y/o impedir la agregación de dicho
A\beta.
En los dibujos:
Fig. 1a es una representación esquemática de un
anticuerpo IgM.
Fig. 1b es una fotografía de bromuro de etidio
tintado al 1,5% en gel de agarosa mostrando fragmentos cADN de las
cadenas ligera y pesada de IgM508. Vía 1: Kb (Escalera); Vías 2 y 3
V_{H} y fragmentos V_{L}, respectivamente, como lo indican las
flechas.
Fig. 1c es una fotografía de bromuro de etidio
tintado al 1,5% en gel de agarosa mostrando fragmento ADN scFv
derivado de anticuerpo IgM 508. Vía 1: Kb (Ladder); Vía 2: scFv 508
DNA (750 bp).
Fig. 1d es una representación esquemática de
fago filamentoso que muestra un scFv.
Fig. 1e es una representación esquemática de un
scFv soluble.
Fig. 2 es un mapa físico de plásmido
pCC-508F que se utiliza para la producción de la
proteína de fusión scFv-508-CBD
(también denominada aquí como 508(Fv)-CBD)
bajo control de promotor lac. Amp res - un gen que codifica la
\beta-lactamasa; V_{H} y V_{L} - secuencias
que codifican los dominios variables de las cadenas ligera y pesada
de scFv-508, respectivamente; Lin - un gen que
codifica un enlace (Gly4Ser)3 (SEC Nº ID:2) presente entre
los dominios variables V_{H} y V_{L}. También se muestra los
sitios de restricción y posiciones de los mismos.
Fig. 3 es un mapa físico de plásmido
pfFEKCA-508 que se utiliza de acuerdo con la
presente invención para expresión citoplásmica de la proteína de
fusión scFv-508-CBD bajo el control
de un promotor T7. Amp res - un gen que codifica la
\beta-lactamasa; V_{H} y V_{L} - secuencias
que codifican los dominios variables de las cadenas ligera y pesada
de scFv-508, respectivamente; Lin - un gen que
codifica un enlace (Gly4Ser)3 (SEC Nº ID:2) presente entre
los dominios variables V_{H} y V_{L}. Secuencias T7 de promotor
y T7 terminador - T7 promotor y T7 terminador, respectivamente.
También se muestra los sitios de restricción y posiciones de los
mismos.
Fig. 4 muestra un análisis del \betaAP al que
se une el anticuerpo 508(Fv)-CBD en un ensayo
ELISA. Los anticuerpos analizados fueron añadidos a pocillos
revestidos con \betaAP. Se detectaron anticuerpos unidos con
anticuerpos secundarios conjugados con HRP. El anticuerpo 508 IgM
parental fue utilizado como un control positivo. El anticuerpo
anti-\beta-galactosidasa
Gal6(Fv)-CBD fue utilizado como control
negativo.
Fig. 5 muestra el análisis PCR de insertos de
ADN bacteriófagos. ADN aislado de
pCC-508(Fv), vía 2, y
pCC-Galó(Fv), vía 3, fue amplificado por PCR y
separado en un gel de agarosa al 1,5%. Se utilizó tinción de bromuro
de etidio e iluminación UV para visualizar las bandas. La vía 1
contiene marcador del tamaño del ADN. La flecha indica la posición
de un scFv intacto migrando a aproximadamente 750 bp.
Fig. 6 muestra la expresión y purificación de
508(Fv)-CBD. De 5 a 10 \mug de proteína
fueron cargados en cada vía con un gel de poliacrilamida SDS al 14%.
Las proteínas fueron visualizadas mediante tinción Coomassie azul
brillante. La flecha marca la posición de la proteína de fusión
scFv-CBD. Vía 1 - extracto total de células a partir
de células BL21(DE3) no inducidas que portan el vector de
expresión 508((Fv)-CBD. Vía 2 - extracto total de
células a partir de células BL21(DE3) que portan el vector de
expresión 508((Fv)-CBD inducido durante 3 horas con
IPTG. Vía 3 - cuerpos de inclusión lavados, solubilizados y
reducidos que fueron utilizados en el replegado. Vía 4 - proteína
que no se unió a celulosa durante el replegado asistido por
celulosa. Vía 5 - proteína separada de la celulosa con TBS. Vía 6 -
proteína separada de celulosa cristalina con agua destilada. Vía 7 -
508(Fv)-CBD soluble recuperada de la celulosa
por neutralización y elución de pH elevado.
Fig. 7 muestra la estabilidad de
508(Fv)-CBD. La proteína
508(Fv)-CBD purificada fue almacenada a 4ºC
durante un día (cuadrados oscuros) o una semana (círculos oscuros),
y luego analizada para ver la unión \betaAP en un ensayo ELISA,
tal como se describe en la leyenda de la Figura 4. El anticuerpo no
relacionado Gal6(Fv)-CBD sirvió de control
negativo (cuadrados abiertos).
Fig. 8 muestra la determinación de la
afinidad-enriquecimiento de mutantes 508(Fv)
por análisis de restricción del ADN y PCR. Se analizó el ADN de 19
clones de micro biblioteca 508(Fv)-mutantes
antes (Figura 8a) y de 11 clones recogidos después de un ciclo de
selección por afinidad (Figura 8b). El ADN fue digerido con
PvuI y separado en un gel de agarosa al 1,5%. Una
scFv-CBD no mutada aparece como un fragmento 1250 bp
intacto (flecha superior). Un clon mutado está indicado por la
aparición de los fragmentos 700 bp (flecha media) y 550 bp (flecha
inferior). En la vía 1 se muestra un marcador de tamaño del ADN.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Fig. 9 muestra un análisis de la unión del
\betaAP (Figura 9a) y estabilidad (Figura 9b) de derivados
508(Fv) mutados en un ensayo ELISA. Los anticuerpos
analizados fueron añadidos a pocillos revestidos de \betaAP. Se
detectaron anticuerpos unidos almacenados a 4ºC durante un día o
durante una semana tal como se describe en la leyenda de la Figura
7. 508(Fv) tipo salvaje (cuadrados abiertos), C96F (cuadrados
oscuros), C96Y (círculos oscuros), C96S (triángulos oscuros). El
anticuerpo Gal6 (Fv)-CBD
anti-\beta-galactosidasa no
relacionado fue utilizado como control negativo (cuadrados
abiertos).
Fig. 10 muestra un análisis de la inhibición
específica de la unión del \betaAP por el anticuerpo
508F(Fv) en un ensayo ELISA competitivo. El anticuerpo fue
pre-incubado con diversas concentraciones de los
péptidos competitivos: \betaAP (ácidos 1-16 de SEC
Nº ID:3) (cuadrados negros) o el péptido no relacionado WVLD (SEC Nº
ID:4) (cuadrados abiertos), antes de ser añadidos a pocillos
revestidos de \betaAP. Se detectaron anticuerpos unidos como se
describe en la leyenda de la Figura 7.
Las Figs. 11a y 11b muestran secuencias de
nucleótidos (SEC Nº ID: 5) y de aminoácidos deducidas (SEC Nº ID:6)
de la cadena pesada de scFv 508F (Figura 11a); y la región variable
y enlace de la cadena ligera (Figura 11b). La secuencia de
aminoácidos está presentada por un código de tres letras; Los CDRs y
el enlace están subrayados.
Fig. 12 muestra la prevención del efecto tóxico
mediado por \betaAP sobre células PC 12 por 508F(Fv). Las
células fueron incubadas con \betaA fibrilar únicamente o con
\betaA fibrilar que había sido incubado con anticuerpos a
diferente fracción molar de anticuerpo/\betaAP, tal como se
indica. Se utilizó un ensayo
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
bromuro de tetrazolio (MTT) para calcular la supervivencia de las
células.
Fig. 13 muestra la desagregación de \betaA
fibrilar por 508F(Fv). El estado fibrilar de las fibrillas de
\betaA preformadas fue medido con o sin incubación con anticuerpos
a diferente fracción molar de anticuerpo/\betaAP, tal como se
indica. Se utilizó la fluorescencia del reactivo
tioflavina-T (ThT) en un ensayo ThT que es
proporcional a las fibrillas de \betaA para evaluar la morfología
de las fibrillas.
Las Figs. 14a-d muestran la
detección de fago filamentoso (ÍB8-EFRH) en
secciones del cerebro vía immunofluorescencia un día después de que
fuera aplicada una sola dosis intranasalmente. Aparición de fago
filamentoso en el bulbo olfatorio y secciones del hipocampo de
ratones utilizando anticuerpo fluorescente de antifago de conejo
(Figuras 14a y 14c, respectivamente) comparado con un cerebro de
conejo no tratado (Figuras 14b y 14d, respectivamente). Las
secciones fueron observadas utilizando un microscopio de
fluorescencia a una ampliación final de x 10.
Las Figs. 15a-d muestran la
desaparición del fago filamentoso (Í88-EFRH) del
cerebro del ratón 28 días después de una única administración
intranasal. La desaparición del fago filamentoso del bulbo olfatorio
y del hipocampo de ratones se demuestra en secciones de estos
órganos utilizando anticuerpo fluorescente de antifago de conejo
(Figuras 15a y 15c, respectivamente), en comparación con un cerebro
de ratón no tratado (Figuras 15b y 15d, respectivamente). Las
secciones fueron observadas utilizando un microscopio de
fluorescencia a una ampliación final de x 10.
Las Figs. 16a-d muestran la
histología de secciones cerebrales de ratón después de la
administración del fago f88-EFRH. Secciones
cerebrales del órgano olfatorio (Figura 16a) e hipocampo (Figura
16c) 28 días después de la administración del fago
f88-EFRH fueron tintadas con hematoxilina y eosina,
y comparadas con secciones de un cerebro no tratado (Figuras 16b y
16d, respectivamente). Las secciones tintadas fueron examinadas y
fotografiadas con una ampliación final de x 40.
Las Figs. 17a-d muestran la
detección por fluorescencia de biotina del fago
pCC-508F acoplado a \betaAP biotinilado (ácidos
1-16 de SEQ ID NO:3) en secciones cerebrales del
ratón después de una única administración intranasal. Aparición de
\betaAP (ácidos 1-16, SEC Nº ID:3) acoplado a fago
filamentoso mostrando scFv508F en secciones del bulbo olfatorio y
del hipocampo de ratones utilizando estreptavidina asociada a PE
(Figuras 17a y 17c, respectivamente) en comparación con un cerebro
de ratón no tratado (Figuras 17b y 17d, respectivamente). Las
secciones fueron observadas utilizando un microscopio de
fluorescencia a una ampliación final de x 20.
Las Figs. 18a-d muestran la
histología de un cerebro de ratón después de la administración de
fago pCC-508F asociado a \betaAP biotinilado
(ácidos 1-16 de SEC Nº ID:3). Secciones del órgano
olfatorio (Figura 18a) e hipocampo (Figura 18b) un día después de la
administración del fago fueron tintadas con hematoxilina y eosina, y
comparadas con secciones de cerebro de ratón no tratadas (Figuras
18c y 18d, respectivamente). Las secciones tintadas fueron
examinadas y fotografiadas a una ampliación final de x 40.
La Fig. 19 es un diagrama del programa de
inmunización con fago filamentoso mostrando el epítopo EFRH (SEC Nº
ID:1) de péptido \beta-amiloide.
Las Figs. 20a y 20b muestran la inmunización con
fago filamentoso f3 mostrando el epítopo EFRH (SEC Nº ID: 1) de
péptido \beta-amiloide como una fusión de
glicoproteína III (gpIII) de fago. Título de suero IgG de diferentes
sangrados de ratones inmunizados con el EFRH-fago de
acuerdo con el programa de la Figura 19 contra proteínas de la capa
del fago filamentoso de tipo salvaje (Figura 20a) y el epítopo
N-terminal (ácidos 1-16, SEC Nº
ID:3) de \beta-amiloide (Figura 20b).
La Fig. 21 muestra la inmunización de larga
duración con fago filamentoso f3. Título de suero IgG de diferentes
sangrados de ratones inmunizados con el EFRH-fago
contra proteínas de la capa del fago filamentoso de tipo salvaje y
el epítopo N-terminal (ácidos 1-16,
SEC Nº ID:3) de \beta-amiloide.
La Fig. 22 muestra la unión del anticuerpo
monoclonal \betaAP anti-agregación (mAb 10D5) a un
fago que presenta péptidos seleccionado de una biblioteca f88 de
fagos. Se utilizó mAb 5.5 no relacionado cultivado contra receptor
de acetilcolina como control negativo. Se añadieron anticuerpos a
pocillos revestidos de fago y se utilizó el ensayo ELISA para
detectar la unión.
La Fig. 23 muestra la unión de \betaAP mAb
(10D5) anti-agregación a un YYEFRH (SEC Nº
ID:7)-fago y VHEPHEFRHVALNPV (SEC Nº
ID:8)-fago. Se añadieron anticuerpos en
concentración de 1 g/ml a pocillos revestidos de fago y la unión fue
analizada mediante el ensayo ELISA. Se utilizó como control fago
filamentoso sin insertos.
Las Figs. 24a-b muestran la
inmunización con fago filamentoso f88 presentando el epítopo EFRH
(SEC Nº ID:1) del péptido \beta-amiloide como una
fusión de glicoproteína VIII (gpVIII) de fago. Título de suero IgG
de diferentes sangrados de ratones inmunizados con el
EFRH-fago contra proteínas de la capa del fago
filamentoso de tipo salvaje (Figura 24a) y el epítopo
N-terminal (ácidos 1-16, SEC Nº
ID:3) del péptido \beta-amiloide (Figura 24b).
La Fig. 25 muestra la inhibición del suero de un
ratón inmunizado a unirse a \betaAP por péptidos sintéticos
derivados de N-terminal del péptido
\beta-amiloide. El ensayo se realizó con una
dilución 1:3000 de suero después de que una tercera inmunización con
f88-EFRH reaccionara con los diversos péptidos en
varias concentraciones por pocillo, tal como se indica. Se utilizó
el péptido WVLD (SEC Nº ID:4) como control negativo.
La Fig. 26 muestra la prevención del efecto
tóxico mediado por \betaAP sobre células PC 12 por anticuerpos de
suero cultivados contra
f88-EFRH-fago. Las células fueron
incubadas con \betaA fibrilar únicamente, o con \betaA fibrilar
que había sido incubado con suero procedente del tercer sangrado a
diferente concentración. El control negativo fue suero de un ratón
no inmunizado. Se utilizó el ensayo MTT para estimular la
supervivencia de las células.
La Fig. 27 muestra la interferencia con la
formación de \beta-amiloide fibrilar por
anticuerpos en suero cultivados contra el
f88-EFRH-fago. Estimación de la
fluorescencia de ThT que se correlaciona con la cantidad de
\beta-amiloide fibrilar formado después de la
incubación durante una semana a 37ºC en presencia de muestras de
suero diluidas tal como se indica. El control negativo fue suero de
un ratón no inmunizado. El control positivo se hizo sin suero. La
formación de fibrillas se medió mediante el ensayo ThT.
La Fig. 28 ilustra la secuencia de aminoácidos
correspondiente a la proteína priónica humana
106-126 (SEC Nº ID:25) y a su homologa en el
ratón.
La Fig. 29 muestra el efecto de neurotoxicidad
del péptido PrP medido en el ensayo MTT. Se cultivó células PC 12 en
una placa de 96 pocillos en un medio DMEM complementado con insulina
2 \muM, 2M L-glutamina y 100 unidades de
penicilina/estreptomicina. La viabilidad celular fue evaluada
mediante el ensayo MTT después de incubación con PrP
106-126, (a diferentes concentraciones). El PrP
106-126 fue o bien preincubado durante 4 días a 37ºC
y luego añadido a las células durante 3 días (barras grises), o bien
fue preincubado durante 4 días a 37ºC y luego añadido a las células
durante 5 días (barras blancas) o fue preincubado durante 7 días a
37ºC y fue luego añadido a las células durante 5 días (barras
negras).
La Fig. 30 ilustra el alcance de la agregación
del péptido PrP, utilizando el ensayo de unión ThT. El PrP
106-126 (0-0.8 mg/ml) fue incubado
durante 7 días a 37ºC y se midió la emisión a 482 nm para determinar
el alcance de la agregación.
La Fig. 31 muestra el efecto protector de mAbs
3-11, 2-40 sobre la neurotoxicidad
del péptido PrP. Se cultivó células PC 12 en una placa de 96
pocillos en un medio DMEM complementado con insulina 2 \muM, 2M
L-glutamina y 100 unidades de
penicilina/estreptomicina y fueron incubadas durante tres días. Se
realizaron los siguientes tratamientos: (1) Control Positivo,
células no tratadas; (2) 100 \muM PrP 106-126 que
fueron preincubadas durante 7 días a 37ºC; (3,4,5) un péptido
agregado que fue preincubado durante 1 hora antes de su exposición a
las células junto con el mAbs 3-11 (tratamiento 3),
2-40 (tratamiento 4) y 3F4 (tratamiento 5). La
viabilidad celular fue evaluada utilizando el ensayo MTT.
La Fig. 32 ilustra la modulación de la
conformación del PrP por el mAbs. El PrP 106-126
(0.3 mg/ml) fue incubado durante 7 días a 37ºC (1) y con mAbs
2-40, 3-11 y 3F4 (tratamientos 2, 3
y 4, respectivamente). Los anticuerpos fueron incubados con la
muestra durante 24 horas o bien antes de la incubación del PrP
(barras grises) o una semana después de la incubación del PrP
(barras blancas). La formación de fibrillas fue evaluada mediante el
ensayo de enlace ThT.
La Fig. 33 muestra el efecto protector
dependiente de la concentración de mAb 3-11 contra
la formación del agregado fibrilar PrP. El PrP
106-126 (0.3 mg/ml) fue incubado durante 7 días a
37ºC con mAb 3-11 diluido (1:1, 1:10, 1:50,
correspondiente a tratamientos 1, 2, y 3, respectivamente). El
anticuerpo fue incubado con la muestra durante 24 horas o bien antes
(barras grises), o después de (barras blancas) la semana de
incubación del PrP. La formación de fibrillas amiloides se evaluó
utilizando el ensayo de enlace ThT.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a agentes y
composiciones farmacéuticas que pueden ser utilizados en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Concretamente, la
presente invención puede ser utilizada para (i) inducir la inmunidad
activa a antígenos derivados de placas en un receptor por
inmunización con al menos un epítopo de
beta-amiloide (A\beta) en un vehículo de
presentación, de modo que los anticuerpos provocados en respuesta a
la inmunización sean capaces de prevenir la formación de placas y/o
de desagregar las placas existentes; y (ii) inducir la inmunidad
pasiva administrando al menos una porción inmunológica de un
anticuerpo que pueda unirse a al menos un epítopo de A\beta
dirigido contra antígenos derivados de placas, clonado y presentado
en un vehículo de presentación, capaz de evitar la formación de
placas y de desagregar las placas existentes. Esta inmunidad pasiva
puede ser de una duración excepcionalmente larga si el vehículo de
presentación empleado es capaz de reproducirse en el receptor.
Los principios y el funcionamiento de la
presente invención se pueden comprender mejor con referencia a los
dibujos y descripciones que la acompañan.
Como se ilustra con más amplitud en los Ejemplos
1-15 de la sección de Ejemplos siguiente, los
antígenos derivados del péptido beta-amiloide fueron
presentados en la superficie de un fago filamentoso que fue
utilizado para la inmunización de animales experimentales. Todos los
péptidos empleados contenían el epítopo EFRH (SEC Nº ID:1, residuos
3-6, SEC Nº ID:3) del péptido
beta-amiloide (SEC Nº ID:3). El epítopo fue
presentado como una proteína de fusión de glicoproteína III o VIII
con capa de fago fd. Se emplearon dosis que iban de 1010 a 1012
fagos por inyección en un ratón BALB/c hembra de 8 semanas. El
programa de inmunización típico incluía tres inyecciones a
intervalos de 14 días, administradas intraperitoneal o
intranasalmente.
Durante y después del proceso de inmunización,
se analizó el título de anticuerpos en suero del ratón para la
producción de anticuerpos específicos A\beta por el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) tal como se detalla en los
métodos y materiales a continuación. Posteriormente se demostró que
los títulos del suero persistían durante 11 meses como respuesta a
un protocolo que incluía solamente 3 inmunizaciones. Mientras que
todos los epítopos analizados que contenían EFRH produjeron un
título, presentar el epítopo en la superficie de un vehículo de
presentación produjo títulos mucho más elevados e inesperados. Se
cree que estos títulos elevados son el resultado del gran número de
copias presentadas al sistema inmune utilizando este método y esta
idea está respaldada por resultados de ensayos de unión utilizando
cantidades controladas de sueros.
Las propiedades de
anti-agregación del anticuerpo policlonal obtenido
dirigido contra epítopos EFRH con respecto a la formación de
fibrillas beta-amiloides fueron medidas mediante el
ensayo de unión ThT. El suero, a la dilución de 1:10 y 1:100,
interrumpió la formación de la estructura fibrilar del
\beta-amiloide con un deterioro considerable de la
morfología fibrilar, tal como lo indica una reducción sustancial de
fluorescencia ThT. El suero no relacionado utilizado como control
(suero de un ratón no inmunizado) no inhibió de forma significativa
la formación fibrilar.
También se determinó el efecto del mismo suero
sobre la alteración de fibrillas \betaA ya formadas (la forma
tóxica de \betaAP). El suero de ratones inmunizados por EFRH con
fibrillas \betaA preformadas alteró la estructura fibrilar. El
anticuerpo de control no relacionado no tuvo un efecto significativo
sobre la morfología fibrilar. Unidos, estos resultados confirman la
capacidad del epítopo EFRH presentado en vehículos de presentación
adecuados de provocar la producción de anticuerpos
anti-agregación, que pueden inhibir o invertir el
proceso de formación fibrilar.
El suero diluido producido de acuerdo con la
presente invención impidió la neurotoxicidad del péptido beta
amiloide. Este resultado implica la utilidad clínica potencial para
impedir el deterioro cerebral de pacientes que presentan formación
de placas amiloides.
Como se ilustra con más amplitud en los Ejemplos
15-21 de la sección de Ejemplos más adelante, se
descubrió que los anticuerpos dirigidos (designados mAbs
3-11 y 2-40), que fueron generados
contra péptidos derivados de priones, son útiles para prevenir o
desagregar placas generadas por priones.
La unión del péptido derivado de prión (PrP
106-126) a estos mAbs produjo un efecto altamente
protector contra la agregación tal como fue medido por los ensayos
ThT y MTT. Los mAbs generados por la presente invención también
redujeron de manera significativa la agregación fibrilar del péptido
y convirtieron la forma agregada en una conformación desagregada tal
como se determinó en el ensayo de unión ThT.
La unión de mAbs 3-11 y
2-40 al péptido PrP ya sea en solución o al agregado
sugiere que este epítopo está implicado en el proceso de agregación
y puede actuar como un centro regulador controlando tanto la
solubilización como el proceso de desagregación del péptido PrP y
tal vez de toda la proteína PrP.
Según un aspecto de la presente invención se
suministra un agente para tratar la enfermedad de Alzheimer. El
agente según este aspecto de la presente invención comprende un
vehículo de presentación que presenta un polipéptido, siendo el
vehículo de presentación una partícula viral no apta para la
propagación in vivo, representando el polipéptido al menos un
epítopo de beta-Amiloide (A\beta), y siendo capaz
dicho epítopo de provocar anticuerpos capaces de desagregar y/o
impedir la agregación de A\beta.
\newpage
Según otro aspecto más de la presente invención
se suministra una composición farmacéutica para tratar la enfermedad
de Alzheimer. La composición de acuerdo con este aspecto de la
presente invención comprende una cantidad efectiva de un vehículo de
presentación que presenta un polipéptido, siendo el vehículo de
presentación una partícula viral no apta para la propagación in
vivo, representando el polipéptido al menos un epítopo de
A\beta, siendo capaz dicho epítopo de provocar una cantidad
efectiva de anticuerpos capaces de desagregar y/o impedir la
agregación de A\beta, y un soporte farmacéuticamente
aceptable.
El uso de antígenos de péptido beta amiloide en
conjunción con coadyuvantes para efectuar la inmunización ha sido
difícil hasta ahora debido a la combinación de elevada toxicidad y
títulos bajos resultantes. Utilizando métodos del estado anterior de
la técnica como punto de partida, se llevó a cabo la inmunización de
un ratón con un péptido beta-amiloide de 16
aminoácidos conjugado KLH (SEC Nº ID:9). Esta inmunización produjo
un título bajo pero mensurable contra
beta-amiloide.
La esplenectomía del ratón inmunizado facilitó
la preparación del hibridoma IgM 508 expresando scFvAb con
especificidad para beta-amiloide. A continuación se
extrajo el ARN de este hibridoma y se empleó para la clonación de
anticuerpos. El hibridoma IgM 508 mostró actividad específica en
A\beta. para impedir su efecto tóxico sobre células PC 12 (Anavi,
S. 1998, M. Se. tesis del departamento de Microbiología Molecular y
Biotecnología de la Universidad de Tel-Aviv,
Israel). Se clonaron separadamente las secuencias V_{H} y V de IgM
508 y se unieron utilizando un vector disponible en el mercado para
formar un anticuerpo monocatenario con especificidad
anti-beta-amiloide. Este anticuerpo
monocatenario fue expresado a continuación como una proteína de
fusión en una biblioteca de presentación de fagos y se seleccionaron
clones con una actividad anti beta-amiloide para
propagación en E. coli.
Otra realización de la invención fue demostrada
al determinar las constantes de unión aparentes del anticuerpo
purificado que presentaban fago a beta amiloide y que fueron medidas
por el procedimiento ELISA y se obtuvo la unión
media-máxima a una concentración de anticuerpos de
340 ng/ml, correspondiente a 8x10^{-6} M. Este resultado anticipa
que el anticuerpo monocatenario preparado será efectivo en
condiciones in vivo. Este fago también será capaz de alterar
las estructuras fibrilares ya formadas confirmando que el anticuerpo
monocatenario purificado es biológicamente activo, tal como lo
sugiere la determinación de la constante de unión.
Al llevar otro aspecto de la presente invención
a la práctica se descubrió que los anticuerpos monoclonales
dirigidos contra una secuencia de péptidos de una proteína priónica
eran eficaces para desagregar o impedir la formación de placas
priónicas.
Un modelo para evaluar la toxicidad del PrP
106-126 fue establecido por los presentes inventores
y lo utilizaron para someter a prueba la efectividad de dos clones
de inmunoglobulina [designados mAb 3-11 (IgM) y mAb
2-40 (IgG1)] en cuanto a sus capacidades
neuroprotectoras y desagregadoras.
Como se detalla con más amplitud en los Ejemplos
15-21, ambos mAb 3-11 y mAb
2-40 redujeron de manera significativa los efectos
tóxicos dosis-dependientes del PrP
106-126 sobre células PC-12. La
co-incubación de mAb 3-11 con PrP
106-126 impidió la agregación fibrilar, mientras que
la administración de mAb 3-11 a agregados ya
formados, tuvo como resultado la desagregación del 50% de las
fibrillas amiloides (Ejemplo 21).
A efectos de esta especificación y las
reivindicaciones que la acompañan los términos "paciente",
"sujeto" y "receptor" se utilizan de manera
intercambiable. Incluyen humanos y otros mamíferos que son el objeto
de tratamiento profiláctico, experimental o terapéutico.
A efectos de esta especificación y las
reivindicaciones que la acompañan los términos "péptido beta
amiloide" es sinónimo de "péptido
\beta-amiloide", "\betaAP",
"\betaA", y "A\beta". Todos estos términos se refieren
a péptidos que forman placas derivados de la proteína precursora de
amiloide.
Tal como se utiliza aquí, " proteína PrP",
"PrP", "prión" y "proteína priónica" se refieren a
polipéptidos que son capaces, bajo las condiciones apropiadas, de
inducir la formación de agregados responsables de enfermedades
provocadas por placas. Por ejemplo, la proteína priónica celular
normal (PrPC) se convierte en tales condiciones en la
correspondiente isoforma escrapie (PrP^{Sc}) que es responsable de
enfermedades por la formación de placas como, sin ánimo de
exhaustividad, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), o
enfermedad de las vacas locas, la encefalopatía espongiforme felina
de los gatos, kuru, la enfermedad Creutzfeldt-Jakob
(CJD), la enfermedad
Gerstmann-Straussler-Scheinker
(GSS), y el insomnio familiar fatal (IFF).
Tal como se utiliza en la especificación y en
las reivindicaciones, el término "desagregación" se refiere a
la solubilización de proteínas agregadas unidas normalmente por
enlaces no covalentes.
A efectos de esta especificación y las
reivindicaciones que la acompañan los términos "comprendiendo"
se refieren a la inclusión de uno o más elementos enumerados pero no
excluyen otros elementos no específicamente enumerados. Por ejemplo,
una composición que comprende el péptido A\beta abarca un péptido
aislado A\beta y un péptido A\beta como componente de una
secuencia de polipéptidos más grande. De manera similar, una porción
inmunológica de un anticuerpo puede ser incluida como parte más
grande del anticuerpo, es decir, todo el anticuerpo.
\newpage
Tal como se utiliza en la especificación y en la
sección de reivindicaciones que sigue, el término "tratamiento"
incluye fundamentalmente inhibir, ralentizar e invertir la
progresión de una enfermedad, especialmente la mejora de los
síntomas clínicos de una enfermedad o impedir la aparición de
síntomas clínicos de una enfermedad.
Dado que las placas amiloides asociadas a las
enfermedades descritas aquí están localizadas en el cerebro,
cualquier modalidad de tratamiento propuesto debe demostrar una
capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) así como
una capacidad de disolver las placas amiloides. Normalmente, el
tamaño medio de moléculas capaz de penetrar la barrera
hematoencefálica es aproximadamente 2 kDa. Los anticuerpos
monoclonales se encuentran normalmente en el rango de
135-900 kDa. Por lo tanto, el futuro uso terapéutico
de anticuerpos en el tratamiento de enfermedades de placas amiloides
debe basarse o bien en la reducción de su tamaño concurrente con la
retención de actividad o bien en el desarrollo de nuevas estrategias
de suministro.
Los pequeños péptidos sintéticos consistentes en
epítopos de antígenos, como el epítopo EFRH (SEC Nº ID:1) de
A\beta o el péptido PrP 106-126 (SEC Nº ID:25)
descritos aquí, son por lo general malos antígenos y necesitan ser
acoplados a un soporte más grande. Incluso después de acoplarse
pueden inducir sólo una respuesta inmune de baja afinidad. Por
ejemplo, la inyección de A\beta-KLH o
fibrilla-A\beta provoca una respuesta inmune muy
lenta (Anavi, S., 1998, M. Se. tesis del departamento de
Microbiología Molecular y Biotecnología de la Universidad de
Tel-Aviv, Israel) y se han realizado muchos
esfuerzos para evitar la respuesta de baja afinidad con éxito
limitado.
Dado que los efectos patológicos de los
polipéptidos que forman placas se mantienen solamente en el sistema
nervioso central (SNC), la capacidad de Abs altamente específicos de
prevenir dichas placas in vivo depende de la permeabilidad de
la barrera hematoencefálica (BHE). Por ejemplo, en la etapa
progresiva de la EA, las pruebas demuestran la alteración de la
permeabilidad de la barrera hematoencefálica, que puede conducir al
suministro directo de dicho anticuerpo desde la periferia al SNC
para desagregar placas ya formadas y minimizar otros efectos tóxicos
(Schenk et al., Nature 1999, 100:173-177).
Realizaciones preferentes de la presente invención incluyen el
suministro directo de Abs monoclonales presentados en vehículos de
presentación al cerebro a través de la barrera hematoencefálica.
Un creciente conjunto de pruebas muestra que las
carencias olfativas y cambios degenerativos en las vías olfativas
centrales se ven tempranamente afectados durante el desarrollo
clínico de la EA. Además, los patrones anatómicos implicados en la
EA sugieren que las vías olfativas pueden ser la etapa inicial del
desarrollo de la EA.
Las neuronas receptoras olfativas son células
bipolares que residen en el revestimiento epitelial de la cavidad
nasal. Sus axones atraviesan la placa cribriforme y se proyectan
hacia la primera sinapsis de la vía olfativa en la vía olfativa del
bulbo olfatorio del cerebro. Esta configuración los convierte en una
autopista por la que los virus y otras sustancias transportadas
pueden tener acceso al SNC a través de la barrera
hematoencefálica.
En las primeras etapas de la EA, la BHE puede
limitar la entrada de anticuerpos que circulan por la periferia del
SNC. En cambio, los anticuerpos anti-agregación
A\beta presentados sobre una superficie de fago tienen el
potencial no sólo de ser directamente suministrados al SNC por
administración intranasal sino también de impedir los daños
olfativos permanentes causados por el \betaA en los pacientes.
Como se ha indicado previamente, la administración intranasal
(Mathison et al., J. Drug Target, 1998) 5(6),
415-441; Chou et al., Biopharm Drug Dispos.
1997) 18(4):335-46; et al., Gene
Therapy 1995) 2:418-423) permite la entrada directa
de virus y macromoléculas en el LCR (líquido cefalorraquídeo) o
SNC.
El uso de neuronas receptoras olfativas como
punto de suministro de un vector de adenovirus está recogido en la
bibliografía. Se dice que este método provoca la expresión de un gen
indicador en el cerebro durante 12 días sin toxicidad aparente
(Draghia et al., Gene Therapy 2:418-423,
1995).
Por lo tanto, de acuerdo con la presente
invención, un vehículo que presenta una porción inmunológica de un
anticuerpo capaz de desagregar, o impedir la formación de un
agregado de polipéptidos asociado a la enfermedad de Alzheimer es
suministrado a través de esta ruta al cerebro en el que el vehículo
de presentación es una partícula viral no apta para la propagación
in vivo.
Dado que A\beta es continuamente producido por
células en tejidos periféricos que atraviesan la barrera
hematoencefálica (BHE) produciendo efectos tóxicos localizados en
poblaciones neuronales específicas, la administración intranasal de
dicho vehículo puede impedir también la progresión de la enfermedad
minimizando la cantidad de A\beta periférico disponible para
formar placas.
El uso de vehículos de presentación tales como
fagos filamentosos como sistema de suministro de medicamentos al SNC
abre nuevos horizontes a enfoques terapéuticos para la enfermedad de
Alzheimer, así como para otras enfermedades neurodegenerativas que
impliquen la agregación extracelular tóxica de péptidos humanos
tales como por ejemplo, enfermedades generadas por priones.
El vehículo de presentación de acuerdo con la
presente invención es de tipo viral (por ej., bacteriófago, como un
bacteriófago filamentoso, fd, por ejemplo). Por lo tanto, el
vehículo de presentación puede ser un virus de ADN bicatenario, un
virus de ADN monocatenario, un virus ARN (cadena positiva o
negativa). El vehículo de presentación es una partícula no apta para
la propagación in vivo.
El fago o vehículo viral está pensado como un
enfoque terapéutico in vivo dirigible. Aunque se han
expresado preocupaciones sobre la posible infección de la flora
natural intestinal (Delmastro et al., Vaccine 1997, 15:
1276-1285; Willis et al., Gene. 1993,
128:79-83; Poul et al., J. Mol. Biol. 1999,
288, 203-211), la inactivación UV del fago mostró
(Delmastro et al., Vaccine 1997, 15:
1276-1285) que son tan inmunogénicos como sus
homólogos infecciosos. El uso de fago inactivado puede impedir la
incorporación de transgenes codificados del fago en el núcleo para
su expresión subsiguiente en células anfitrionas (Larocca et
al., 1998, Hum. Gene Ther. 9:2393-2399), una
importante consideración práctica. Por lo tanto, los vehículos de
presentación empleados en la presente invención son no
replicantes.
El fago o presentación del virus implica la
expresión de clones cADN como proteínas de fusión con fago o
proteínas de membrana viral. Si los cADNs seleccionados para
expresión codifican antígenos, el fago o virus puede ser empleado
como un vehículo de presentación de antígenos que puede replicarse
opcionalmente dentro de un receptor.
Como se ha descrito anteriormente, de acuerdo
con las realizaciones preferentes de la presente invención, los
antígenos presentados por un fago o virus pueden ser utilizados
directamente para vacunación, sin purificación de los antígenos. En
este caso, el grueso de las proteínas con envoltura sirve para
estimular una respuesta general inmune porque son "no
autónomas" con respecto al sujeto vacunado. La fusión proteína de
membrana-antígeno provoca un anticuerpo específico
contra epítopos en el producto genético cADN presentado.
La presentación viral o fago de anticuerpos se
lleva a cabo, por ejemplo, fusionando la secuencia de codificación
de las regiones variables del anticuerpo a un fago o proteína de
membrana viral. Para ello, el mARN de regiones (V) variables
(V_{H} y V_{L}), aislado de las células que producen anticuerpos
es transcrito a la inversa en cADN y las cadenas pesadas y ligeras
ensambladas al azar para codificar Fv de cadena sencilla (scFv).
Estas casetes son clonadas directamente en un vector adecuado como
un vector fagémido para expresión y presentación en el fago o
superficie del virus. Esta conexión entre genotipo del anticuerpo y
el fenotipo permite el enriquecimiento del fago específico de
antígenos o anticuerpos del virus, utilizando antígeno etiquetado o
inmovilizado. El fago o virus que presenta un anticuerpo relevante
será retenido sobre una superficie revestida con antígeno, mientras
que los fagos o virus no adherentes serán eliminados. Los fagos o
virus unidos pueden ser recuperados de la superficie, reinfectados
en células anfitrionas adecuadas y recultivados para proseguir su
enriquecimiento y finalmente para análisis de unión.
El éxito de la presentación de virus o fago con
anticuerpo radica en la combinación de este método de presentación y
enriquecimiento. Los genes de anticuerpos del virus o fago pueden
ser secuenciados, mutados y filtrados para mejorar la unión del
antígeno.
Es posible reordenar los genes que codifican las
diversas regiones de una molécula de anticuerpo de manera que su
especificidad y afinidad con un antígeno se vean alteradas. El
anticuerpo puede ser mantenido en la superficie del fago o virus
para seguir con su manipulación o ser liberado como fragmento
soluble scFv (\sim25 kDa).
Desde su invención al principio de la década de
1990, la presentación de fago con anticuerpos ha revolucionado la
generación de anticuerpos monoclonales y su utilización. Ello se
debe a que la presentación del fago permite a los anticuerpos ser
realizados completamente in vitro, evitando el sistema
inmunológico y el procedimiento de inmunización y permitiendo el
diseño in vitro de la afinidad y especificidad del
anticuerpo. Se ha previsto por lo tanto que las estrategias de
desarrollo de vacunas más eficientes utilizarán esta tecnología.
Se puede añadir características adicionales al
vector para garantizar su seguridad y/o mejorar su eficacia
terapéutica. Dichas características incluyen, por ejemplo,
marcadores que pueden ser utilizados para seleccionar negativamente
contra células infectadas con el virus recombinante como
sensibilidad antibiótica. La selección negativa es por lo tanto un
medio con el que se puede controlar la infección porque suministra
el suicidio inducible a través de la adición de un antibiótico.
Dicha protección garantiza que si, por ejemplo, surgen mutaciones
que producen formas alteradas del vector viral o secuencia
recombinante, no se producirá transformación celular. También se
puede incluir características que limitan la expresión a tipos
particulares de células. Dichas características incluyen, por
ejemplo, elementos promotores y reguladores que sean específicos
para el tipo de célula deseado.
Los virus son agentes infecciosos muy
especializados que han evolucionado en muchos casos para eludir los
mecanismos de defensa del anfitrión. Normalmente, los virus infectan
y se propagan en tipos específicos de células. La especificidad de
destino de los vectores virales utiliza su especificidad natural
para dirigirse específicamente a tipos de células predeterminados e
introducir de ese modo un gen recombinante en la célula
infectada.
Como se utiliza en esta especificación y en las
reivindicaciones que siguen, el término polipéptido se refiere a un
tramo de aminoácidos covalentemente unidos a través de enlaces
peptídicos. Diferentes polipéptidos tienen diferentes
funcionalidades de acuerdo con la presente invención. Mientras que
de acuerdo con un aspecto de la invención un polipéptido se deriva
de un inmunógeno designado para inducir una respuesta inmune activa
en un receptor, de acuerdo con otro aspecto, un polipéptido se
deriva de un anticuerpo que se produce como resultado de la
provocación de una respuesta inmune activa, en por ejemplo, un
animal y que puede servir para inducir una respuesta inmune pasiva
en el receptor. En ambos casos, sin embargo, el polipéptido está
codificado por un polinucleótido de acuerdo con cualquier uso
posible de un codón.
Tal como se utiliza aquí, la frase "respuesta
inmune" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere
al desarrollo de una respuesta beneficiosa humoral (mediada por
anticuerpo) y/o celular (mediada por células T específicas de
antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra una proteína
de agregación (péptido que forma placas) en un paciente receptor.
Dicha respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la
administración de inmunógenos o una respuesta pasiva inducida por la
administración de anticuerpos o células T cebadas. Una respuesta
inmune celular es provocada por la presentación de epítopos de
polipéptido en asociación con moléculas MHC Clase I o Clase II, para
activar células T CD4^{+} coadyuvantes específicas de antígenos
y/o células T citotóxicas CD8^{+}. La respuesta puede también
implicar la activación de monocitos, macrófagos, NK, células,
basófilos, células dendríticas, astrositos, células de la microglia,
eosinófilas u otros componentes de inmunidad innata.
Tal como se utiliza aquí "inmunidad activa"
se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto por la
administración de un antígeno.
Tal como se utiliza aquí "inmunidad pasiva"
se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto sin la
administración de un antígeno. La " inmunidad pasiva" incluye
por lo tanto, la administración de un vehículo de presentación
replicante que incluya una porción inmunológica de un anticuerpo
presentado en su superficie a un receptor. Aunque la replicación de
dicho vehículo sea activa, la respuesta inmune es pasiva desde el
punto de vista del receptor.
A efectos de esta especificación y de las
reivindicaciones que la acompañan, los términos "epítopo" y
"determinante antigénico" se utilizan manera intercambiable
para referirse a un sitio en un antígeno al que responden células T
y/o B. Los epítopos de células-B pueden formarse de
aminoácidos contiguos o de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por
plegado terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de
aminoácidos contiguos se retienen normalmente por exposición a
disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por
plegado terciario se pierden normalmente en el tratamiento con
disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye normalmente al
menos 3, y de manera más general, al menos 5 o 8-10
aminoácidos en una conformación espacial única. Entre los métodos
para determinar la conformación espacial de epítopos se incluyen,
por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética
nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping
Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E.
Morris, Ed. (1996). Se puede identificar anticuerpos que reconocen
el mismo epítopo en un inmunoensayo simple mostrando la capacidad de
un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno
de destino. Las células-T reconocen epítopos
continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para células CD8 o
aproximadamente de 13 a 15 aminoácidos para células CD4. Las células
T que reconocen el epítopo pueden ser identificadas por ensayos
in vitro que miden la proliferación dependiente de antígenos,
como lo determina la incorporación de
^{3}H-timidina por las células T cebadas en
respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170,
1110-19, 1994), por destrucción dependiente de
antígenos (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al.,
J. Immunol. 156, 3901-3910) o por secreción de
citoquinas.
La presencia de una respuesta inmunológica
mediada por células puede ser determinada por ensayos de
proliferación (células T CD4^{+}) o ensayos CTL (ensayo de
linfocitos T citotóxicos). Las contribuciones relativas de las
respuestas humoral y celular al efecto protector o terapéutico de un
inmunógeno pueden distinguirse aislando separadamente IgG y células
T de un animal singeneico inmunizado y midiendo el efecto protector
o terapéutico en un segundo sujeto.
Tal como se utiliza aquí y en las
reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o
"inmunoglobulina" se utilizan de manera intercambiable y se
refieren a cualquiera de las varias clases de proteínas
estructuralmente relacionadas que funcionan como parte de la
respuesta inmune de un animal o receptor, las cuales incluyen las
proteínas IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas relacionadas.
En condiciones fisiológicas normales los
anticuerpos se encuentran en plasma y en otros fluidos corporales y
en la membrana de ciertas células y son producidos por linfocitos
del tipo denotado células B o su equivalente funcional. Los
anticuerpos de la clase IgG se componen de cuatro cadenas de
polipéptidos unidas entre sí por enlaces de disulfuro. Las cuatro
cadenas de moléculas IgG intactas son cadenas idénticas pesadas
denominadas cadenas-H y dos cadenas ligeras
idénticas denominadas cadenas-L.
A fin de producir anticuerpos policlonales, se
inmuniza a un huésped, como un conejo o una cabra, con el antígeno o
fragmento de antígeno, generalmente con un coadyuvante y, si fuera
necesario, acoplado a un soporte. Los anticuerpos del antígeno son
recogidos a continuación del suero del huésped. El anticuerpo
policlonal puede ser purificado en afinidad contra el antígeno
volviéndolo monoespecífico. Las experiencias anteriores han
demostrado que la producción estándar de anticuerpos policlonales no
es el método preferente para la preparación de anticuerpos de
desagregación para péptidos que forman placas debido a problemas de
toxicidad.
A fin de producir anticuerpos monoclonales, se
lleva a cabo la hiperinmunización de un donante adecuado, por lo
general un ratón, con el antígeno. A continuación se realiza el
aislamiento de células que producen anticuerpos esplénicos. Estas
células se fusionan con una célula caracterizada por la
inmortalidad, como una célula mieloma, para proporcionar un híbrido
de célula fusionada (hibridoma) que puede ser mantenida en cultivo y
que secreta el anticuerpo monoclonal requerido. Las células son
cultivadas a continuación, a granel, y los anticuerpos monoclonales
son cosechados de los medios de cultivo para su uso. Por definición,
los anticuerpos monoclonales son específicos de un epítopo sencillo.
Los anticuerpos monoclonales tienen a menudo constantes de afinidad
más bajas que los anticuerpos policlonales dirigidos contra
antígenos similares por esta razón.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales también pueden ser
producidos ex-vivo utilizando cultivos
primarios de células esplénicas o líneas de células derivadas del
bazo (Anavi, S., 1998. Locking the N-terminal of
the Alzheimer \beta-amyloid peptide prevenís the
neurotoxicity in cell cultures, M. Se. Thesis). Para producir
anticuerpos recombinantes (ver en general Huston et al, 1991;
Johnson y Bird, 1991; Mernaugh y Mernaugh, 1995), los ARNs
mensajeros de linfocitos-B que producen anticuerpos
de animales, o hibridomas son transcritos a la inversa para obtener
ADNs complementarios (cADNs). El cDNA del anticuerpo, que puede ser
de longitud total o longitud parcial, es amplificado y clonado en un
fago o plásmida. El cAD puede ser una longitud parcial de cADN de
cadena ligera y pesada, separado o conectado por un enlace. El
anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, se expresa utilizando un
sistema de expresión adecuado para obtener anticuerpos
recombinantes. El cADN de anticuerpos también puede obtenerse
filtrando las bibliotecas de expresión pertinentes.
El anticuerpo puede estar unido a un substrato
de soporte sólido o conjugado con una fracción detectable o estar
unido y conjugado al mismo tiempo como se conoce en la técnica. Para
un debate general de conjugación de fracciones enzimáticas o
fluorescentes ver Johnstone & Thorpe, Immunochemistry in
Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982. La
unión de anticuerpos a un substrato de soporte sólido también es
algo bien conocido por la técnica. Ver, para un debate general,
Harlow & Lañe Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Publications, New York, 1988 y Borrebaeck,
Antibody Engineering - A Practical Guide, W.H. Freeman and
Co.,
1992.
1992.
Tal como se utiliza aquí y en las
reivindicaciones, la frase "una porción inmunológica de un
anticuerpo" incluye un fragmento F(ab')_{2} de un
anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fv de un
anticuerpo, una cadena pesada de un anticuerpo, una cadena ligera de
un anticuerpo, una mezcla no asociada de cadena pesada y cadena
ligera de un anticuerpo, un heterodímero consistente en una cadena
pesada y una cadena ligera de un anticuerpo, un dominio catalítico
de una cadena pesada de un anticuerpo, un dominio catalítico de una
cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena
ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena pesada
de un anticuerpo, y una variante de cadena sencilla de un anticuerpo
que también es conocida como scFv. Además, el término incluye
inmunoglobulinas quiméricas que son los productos de expresión de
genes fusionados derivados de diferentes especies, una de las cuales
puede ser humana, en cuyo caso se dice que una inmunoglobulina
quimérica está humanizada. Normalmente, una porción inmunológica de
un anticuerpo compite con el anticuerpo intacto del que fue derivado
para la unión específica a un antígeno.
Opcionalmente, un anticuerpo o preferentemente,
una porción inmunológica de un anticuerpo, puede ser químicamente
conjugado con o expresado como una proteína de fusión con otras
proteínas. A efectos de esta especificación y las reivindicaciones
que la acompañan, dichas proteínas fusionadas están incluidas en la
definición de anticuerpos o una porción inmunológica de un
anticuerpo.
Tal como se utilizan aquí, los términos "
agente inmunogénico" o "inmunógeno" o "antígeno" se
utilizan de manera intercambiable para describir una molécula capaz
de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma durante la
administración a un receptor, ya sea sola, en conjunción con un
coadyuvante o presentada en un vehículo de presentación.
Tal como se utiliza aquí, el término
"coadyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se
administra en conjunción con un antígeno, aumenta la respuesta
inmune al antígeno, pero cuando se administra solo no genera una
respuesta inmune al antígeno. Los coadyuvantes pueden aumentar una
respuesta inmune por varios mecanismos incluyendo el reclutamiento
de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación
de macrófagos.
El preparado de acuerdo con la presente
invención puede ser administrado a un organismo per se, o en
una composición farmacéutica donde está mezclado con soportes o
excipientes adecuados.
Tal como se utiliza aquí una "composición
farmacéutica" se refiere a un preparado de uno o más ingredientes
activos descritos aquí con otros componentes químicos como soportes
y excipientes fisiológicamente adecuados. El objeto de la
composición farmacéutica es facilitar la administración de un
compuesto a un organismo.
Aquí el término "ingrediente activo" se
refiere al preparado responsable del efecto biológico.
En lo sucesivo, las frases "soporte
fisiológicamente aceptable" y "soporte farmacéuticamente
aceptable" que pueden utilizarse de manera intercambiable para
referirse a un soporte o un diluyente que no cause una irritación
significativa a un organismo y no suprima la actividad biológica y
las propiedades del compuesto administrado. Un coadyuvante está
incluido en estas frases.
Aquí el término "excipiente" se refiere a
una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para
facilitar la administración de un ingrediente activo. Ejemplos de
excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio,
diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa,
gelatina, aceites vegetales y glicoles de polietileno.
Se pueden encontrar técnicas para la formulación
y administración de medicamentos en "Remington's Pharmaceutical
Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
\newpage
Vías de administración adecuadas pueden incluir
por ejemplo la vía oral, rectal, transmucosal, especialmente
transnasal, intestinal o administración parenteral, incluyendo
inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares así como
inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas,
intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Alternativamente, se puede administrar un
preparado de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, a
través de inyección del preparado directamente en el cerebro del
paciente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden ser fabricadas por procesos bien conocidos por la
técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, disolución,
granulado, fabricación de grageas, pulverización, emulsión,
encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas a utilizar de
acuerdo con la presente invención pueden por lo tanto ser formuladas
de la manera convencional utilizando uno o más soportes
fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares,
que facilitan el procesado de los ingredientes activos en preparados
que, pueden ser utilizados farmacéuticamente. La formulación
correcta depende de la vía de administración elegida.
Para su inyección, los ingredientes activos de
la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas,
preferentemente en soluciones tamponadas fisiológicamente
compatibles como la solución de Hank, la solución de Ringer, o
solución salina fisiológica tamponada. Para la administración
transmucosal, se utilizan fluidos penetrantes adecuados para la
barrera a ser impregnada para la formulación. Dichos fluidos
penetrantes son por lo general conocidos por la técnica.
Para la administración oral, los compuestos
pueden ser formulados fácilmente combinando los compuestos activos
con soportes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por la
técnica. Dichos soportes permiten que los compuestos de la invención
sean formulados como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas,
líquidos, geles, jarabes, suspensiones para ingestión oral por un
paciente. Los preparados farmacológicos para uso oral pueden ser
realizados utilizando un excipiente sólido, opcionalmente triturando
la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de
añadir auxiliares adecuados si se desea, para obtener núcleos de
grageas o comprimidos. Excipientes adecuados son, en particular,
rellenos como azúcares, incluyendo la lactosa, sucrosa, manitol, o
sorbitol; preparados de celulosa como por ejemplo almidón de maíz,
almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,
tragacanto goma, metilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa,
carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente
aceptables como la polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se puede
añadir agentes desintegrantes, como polivinilpirrolidona reticulada,
agar, o ácido algínico o una de sus sales como el alginato de
sodio.
Los núcleos de comprimidos están provistos de
los revestimientos adecuados. Para ello, se pueden utilizar
soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente
goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol,
polietileno glicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y
disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se puede
añadir a los revestimientos de comprimidos o grageas colorantes o
pigmentos para su identificación o para caracterizar diferentes
combinaciones de dosis de compuestos activos.
Composiciones farmacéuticas que pueden ser
utilizadas oralmente, incluyen cápsulas duras hechas de gelatina así
como cápsulas blandas y selladas hechas de gelatina y un
plastificante como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden
contener los ingredientes activos en mezcla con un relleno como
lactosa, aglutinantes como el almidón, lubricantes como el talco o
el estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las
cápsulas blandas, los ingredientes activos pueden ser disueltos o
suspendidos en líquidos adecuados, como aceites grados, parafina
líquida o polietilenglicol líquido. Además, se puede añadir
estabilizadores. Todas las formulaciones para la administración oral
deberían hacerse en dosis adecuadas para la vía elegida de
administración.
Para administración bucal, las composiciones
pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formulados de
manera convencional.
Para su administración por inhalación nasal, los
ingredientes activos para su uso de acuerdo con la presente
invención se suministran convenientemente en forma de un spray
aerosol con nebulizador o pack presurizado que utiliza un gas
propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o
dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad
de dosificación puede determinarse mediante una válvula que
suministre una cantidad medida. Las cápsulas y comprimidos de, por
ejemplo, gelatina para su uso en un dosificador pueden formularse
con una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada
como lactosa o almidón.
Los preparados descritos aquí pueden ser
formulados para administración parenteral, por ejemplo, por
inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para
inyección pueden presentarse en forma de dosis unitarias, por
ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con, de manera
opcional, la adición de un conservante. Las composiciones pueden ser
suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos u oleosos
y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión,
estabilización y/o dispersión.
Las composiciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas del preparado
activo en forma soluble en agua. Adicionalmente, se puede preparar
suspensiones de los ingredientes activos como suspensiones para
inyección basadas en agua o en aceite, según sea pertinente.
Vehículos o disolventes lipofílicos adecuados incluyen aceites
grasos como el aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos
sintéticos como el etil oleato, triglicéridos o liposomas. Las
suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que
incrementan la viscosidad de la suspensión, como la celulosa
carboximetil de sodio, sorbitol o dextran. De manera opcional, la
suspensión puede contener también agentes o estabilizadores
adecuados que incrementen la solubilidad de los ingredientes activos
para permitir la preparación de soluciones altamente
concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede
ser en forma de polvo para su composición con un vehículo adecuado
como por ejemplo, solución estéril basada en agua exenta de
pirógenos, antes de su uso.
La preparación de la presente invención también
puede ser formulada en composiciones rectales como supositorios o
enemas de retención, utilizando por ejemplo bases de supositorios
convencionales tales como mantequilla de coco u otros
glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
su uso en el contexto de la presente invención incluyen
composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos
en una cantidad efectiva para lograr el propósito buscado. De manera
más específica, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una
cantidad de ingredientes activos eficaz para prevenir, aliviar o
mejorar síntomas de enfermedad o prolongar la supervivencia del
sujeto que está siendo tratado.
La determinación de una cantidad
terapéuticamente efectiva no presenta problemas para quienes dominan
la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada que
se suministra aquí.
Para cualquier preparado utilizado en los
métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente
efectiva puede ser inicialmente estimada a partir de ensayos con
cultivos celulares e in vitro. Por ejemplo, una dosis puede
ser formulada en modelos animales para lograr la concentración o
título de anticuerpos en circulación deseados. Dicha información
puede ser utilizada para determinar con mayor precisión dosis útiles
en humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los
ingredientes activos descritos en la presente especificación pueden
determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in
vitro, en cultivos celulares o en animales de experimentación.
Los datos obtenidos de estos ensayos con cultivos celulares e in
vitro y de los estudios con animales pueden ser utilizados para
formular una gama de dosis para su uso en humanos. La dosificación
puede variar según la forma de dosificación empleada y la vía de
administración utilizada. La formulación exacta, vía de
administración y dosificación pueden ser elegidos por cada
facultativo particular según el estado del paciente. (Ver por
ejemplo, Fingí, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis
of Therapeutics", Ch. 1 p.1).
La cantidad de la dosis y el intervalo pueden
ser ajustados individualmente para proporcionar niveles de
anticuerpos en plasma y cerebro que sean suficientes para impedir la
agregación o desagregar los agregados ya existentes (concentración
mínima efectiva, CME). La CME puede variar en cada preparado, pero
puede calcularse a partir de datos in vitro. Las dosis
necesarias para alcanzar la CME dependerán de las características
individuales y la vía de administración. Se puede utilizar ensayos
de unión para determinar las concentraciones en plasma.
También se puede determinar los intervalos de
dosificación utilizando el valor CME. Los preparados deberían
administrarse utilizando un régimen, que mantenga los niveles de
plasma por encima de la CME durante el 10-90% del
tiempo, preferentemente entre 30-90% y de manera más
preferente aún entre el 50-90%.
En función de la gravedad y del grado de
reacción de la enfermedad a tratar, la dosificación puede ser una
administración única o una pluralidad de ellas, durando el
tratamiento desde varios días a varias semanas o hasta que la cura
se produzca o se logre la mejoría de la enfermedad.
La cantidad de composición a administrar
dependerá, evidentemente, del sujeto que se trate, de la gravedad de
la enfermedad, de la forma de administración, de la opinión del
médico que receta, etc.
Las composiciones de la presente invención
pueden, si se desea, presentarse en un envase o en un dispositivo
dosificador, como un kit autorizado por la FDA, que puede contener
una o más formas de dosis unitarias que contengan el ingrediente
activo. El envase puede, por ejemplo, comprender lámina metalizada o
plástica como un envase ampolla. El envase o dosificador puede estar
acompañado de instrucciones de utilización. El envase o dosificador
también puede estar acompañado de un aviso asociado al recipiente
con una forma prescrita por una agencia del gobierno que regule la
fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, el cual refleje
la autorización por la agencia de la forma de las composiciones o su
administración para uso humano o veterinario. Dicho aviso, por
ejemplo, puede ser sobre el etiquetado autorizado por la FDA sobre
medicamentos con receta o de una etiqueta de producto autorizado.
También pueden prepararse composiciones que comprendan un preparado
de la invención formuladas en un soporte farmacéuticamente
compatible, colocadas en un recipiente adecuado y etiquetadas para
el tratamiento de una enfermedad indicada, como se detalla más
arriba.
\newpage
De manera general, la nomenclatura utilizada
aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente
invención incluyen técnicas de ADN recombinantes, moleculares,
bioquímicas y microbiológicas. Dichas técnicas están ampliamente
explicadas en la bibliografía. Ver por ejemplo, "Molecular
Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989);
"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes
I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et
al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley
and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide
to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988);
Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American
Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A
Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías tal como las
establecidas en la U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531;
5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook",
Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current
Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.
E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical
Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT
(1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular
Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los
inmunoensayos disponibles están ampliamente descritos en la
bibliografía científica y sobre patentes, ver por ejemplo, U.S. Pat.
Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987;
3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345;
4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521;
"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic
Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985);
"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S.
J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed.
(1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A
Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and
"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic
Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications",
Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al.,
"Strategies for Protein Purification and Characterization - A
Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) En este documento se
proporcionan otras referencias generales. Los procedimientos
indicados son bien conocidos por la técnica y se aportan en
beneficio del lector.
Se hace referencia a los siguientes materiales y
métodos que fueron empleados en los experimentos descritos en los
siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para llevar la presente invención a la práctica
se emplearon materiales y métodos experimentales tal como se
demuestra en los ejemplos que siguen:
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas de ADN recombinante fueron
realizadas esencialmente como se describen (Sambrook et al.,
1989). Los protocolos generales de tecnología de presentación de
fago-anticuerpos son de Pharmacia Biotech (Uppsala,
Sweden) Recombinant Phage Antibody System (RPAS).
\vskip1.000000\baselineskip
Los hibridomas 508 IgM utilizados como la fuente
de secuencias de región-variable de anticuerpos
fueron generados a partir de esplenocitos de un ratón que había sido
inmunizado con un péptido correspondiente a los 16 residuos
amino-terminal de \betaAP conjugados con
hemocianina de lapa, utilizada como soporte. La extracción de mRNA,
la síntesis de la primera cadena de cADN, ampliación PCR de las
secuencias de variable pesada (V_{H}) y variable ligera (V_{L}),
y ensamblaje de casetes scFv, se realizaron esencialmente de acuerdo
con los protocolos tal como se describen (Pharmacia Biotech RPAS
manual). El ADN 508 scFv ensamblado fue digerido con SfiI y
NotI, y 100 ng fueron ligados con 150 ng de vector ADN
preparado por digestión de fagémidos pCC-Galó(Fv)
(Berdichevsky Y et al., J Immunol Methods., 31;228(1
-2): 151 -62,1999) con SfiI y NotI. Este sistema de
presentación de fago ha sido diseñado para expresar scFv en la
proteína de fusión con dominio de unión a celulosa (CBD) derivado de
Clostridium thermocellum (Morag E et al. Appl Environ
Microbiol., 61(5): 1980-6, 1995). El ADN
ligado fue introducido en células XL-1 Blue
(Stratagene, La Jolla, CA) por transformación y los transformantes
fueron colocados en 2 placas de Agar YT que contenían 100 \mug/ml
de ampicilina y 1% de glucosa para cultivo durante la noche a
37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eligieron y cultivaron clones individuales,
cada uno en 5 ml 2 X YT, 1% glucosa, 100 \mug/ml Ampicilina
durante la noche a 30ºC. Se añadió IPTG a 1 mM durante un periodo de
inducción de 3 hr. Se aislaron proteínas de fusión
scFv-CBD solubles de cada clon por sonicación de
gránulos de células inducidas. A fin de identificar las
508(Fv) solubles funcionales de las no funcionales, 250
ng/pocillo de péptido \beta-amiloide fueron
covalentemente unidos a placas de microtitulación revestidas con
epoxy durante 16 hr a 4ºC (Solomon, B., et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 93:452-455, 1996). Las placas
fueron lavadas con PBS/0.05% - Tween 20 (PBST), y bloqueadas con una
mezcla de albúmina de suero bovino al 3% y leche en polvo en PBS
durante 16 hr a 4ºC. Las placas fueron lavadas a continuación e
incubadas con scFv-CBD soluble recuperadas de los
clones durante 1 hr a 37ºC. El anticuerpo unido fue detectado con un
antisuero anti CBD de conejo seguido por anticuerpos anti conejo de
cabra HRP-conjugados. Las placas fueron
desarrolladas con sustrato ABTS cromogénico de peroxidasa y se
registró la señal con un lector de placas de microtitulación ELISA a
405 nm. Los clones de fago positivo
(pCC-508(Fv)) fueron propagados y su ADN fue
secuenciado utilizando un secuenciador de ADN 373A de modelo
automatizado (Applied Biosystems, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresión de alto nivel en E. coli,
se clonaron derivados de 508(Fv) de tipo salvaje (wt) y
mutados en el vector pFEKCA3 tal como se describe en (Berdichevsky Y
et al, Protein Expr Purif.,
17(2):249-59, 1999). Este vector utiliza el
fuerte promotor T7 para expresión, en el que el gen de ARN
polimerasa T7 es transportado como un gen inducible por IPTG
controlado por lac represor en E. coli BL21 (DE3) (Studier,
F.W., et al., Methods Enzymol., 85, 60-89,
1990). Después de la inducción por IPTG, las proteínas
508(Fv)-CBD se acumularon como cuerpos de
inclusión insolubles. Fueron recuperadas por el método de replegado
asistido por celulosa como se ha descrito previamente (Berdichevsky
Y et al, Protein Expr Purif.,
17(2):249-59, 1999). Se utilizó
electroforesis de gel poliacrilamida SDS (SDS/PAGE) para separar
proteínas de acuerdo con su peso molecular en condiciones de
desnaturalización (Laemmli, U.K., Nature
227:263-270, 1970).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la proteína
508(Fv)-CBD purificada fue comprobada antes y
después de su almacenamiento a 4ºC durante 7 días. 250 ng/pocillo de
péptido \beta-amiloide fueron covalentemente
unidos a pocillos revestidos de epoxy de placas de microtitulación
durante 16 hr a 4ºC (Solomon B. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 94, 4109-4112, 1997). Los pocillos fueron
bloqueados con una mezcla de albúmina de suero bovino al 3% y
hemoglobina de bovino en PBS durante 2 hr a 37ºC, luego lavados e
incubados con la proteína 508(Fv)-CBD (0.5
g/ml o como se especifique de otro modo) durante 1 hr a 37ºC. Se
detectaron fragmentos de anticuerpos unidos por incubación con
anticuerpos anti-ratón de conejo
HRP-conjugados (BioMakor, Rehovot, Israel),
diluidos a 1:5,000 y anti CBD de conejo diluidos 1:10,000 en PBST
durante 1 hr a 37ºC. Los fragmentos de anticuerpos unidos fueron
controlados como se describe arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la técnica PCR splicing overlap
extensión (SOE) (Lefenbrve, B., et al., Biotechniques,
19:186-188, 1995) para reemplazar el codón de
cisteína V_{L} 96 de 508(Fv) por otros codones. Se utilizó
ADN pCC-508(Fv) como plantilla. En una
primera etapa, la plantilla de ADN fue amplificada con los
siguientes cebadores:
El cebador antisentido
508-mut-FOR:5'-CCCCCCTCCGAACGTSNATGGGTAACTcgatcgCTGATGGCAGTA-3'
(SEQ ID NO: 10) inserta un sitio de restricción PvuI
(subrayado), donde S representa nucleótidos C o G y N representa A,
C, T o G. Este cebador fue utilizado para el reemplazo del codón de
cisteína 96 por fenilalanina (F), leucina (L), serina (S), tirosina
(Y) o codones de triptofano. El cebador SfiI 5'BACK:
5'-ATCTATGCggcccagccggccATG-3'
(SEC Nº ID: 11) inserta un sitio SfiI en el extremo 5' de
scFv. El producto PCR resultante
(SfiI-508mut) corresponde a la mitad 5' de
508(Fv)-CBD. En la segunda etapa PCR, el
508(Fv)-CBD completo fue reensamblado
amplificando pCC-508(Fv) ADN con el producto
PCR SfiI-508mut de la etapa 1 actuando como
el cebador del extremo 5' y CBD(BX):
5'-GTGGTGCTGAGTggatcctaTACTACACTGCCACCGGG-3'
(SEC Nº ID: 12) como cebador del extremo 3'. El producto PCR final
(SfiI-508mut-BX) es un casete
508(Fv)-CBD completo con sustituciones en
V_{L} codón 96 y un sitio de restricción PvuI como mutación
silenciosa para análisis. El ADN
SfiI-508mut-BX fue digerido
con SfiI, PvuI y NotI y ligado en una ligadura
de tres fragmentos con SfiI y NotI linearizado
pCC-Galó(Fv) ADN que es un vector fagémido utilizado
para presentar un anti E. coli
\beta-galactosidasa scFv (Berdichevsky Y et
al, J Immunol Methods., 31;228 (1-2):
151-62, 1999). El ADN de fagémido ligado resultante
fue introducido en células de E. coli
XL-1-Blue por cultivos de
electroporación. Se utilizaron cultivos de E. coli para
producir fago de presentación por rescate con fago coadyuvante
M13K07 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra conteniendo partículas de fago
rescatado fue sometida a una ronda de selección por afinidad (ciclo
de selección de fagos por afinidad) y amplificación. Para el ciclo
de selección, se utilizó 0.5 \mug/ml de péptido
1-16 aminoácidos de \beta-amiloide
biotinilado (\betaAP(1-16), ácidos
1-16 de SEC Nº ID:3) en un volumen total de 1 ml.
Los fagos fueron pre-incubados con el péptido
biotinilado durante 2 horas a temperatura ambiente y la mezcla de
reacción fue estratificada en platos Petri de poliestireno de 30 mm
revestidos con estreptavidina. Los fagos no unidos fueron eliminados
mediante lavado exhaustivo con PBST. Los fagos fijados fueron
eluados con 0.3 ml de 0.1 M HCl titulado a pH 2.2 con glicina. El
eluato fue neutralizado con 80 \mul de 0.5 M Tris (HCI) pH 10, y
utilizado para infectar células de E. coli
XL-1-Blue. Se utilizaron colonias de
bacterias individuales que contenían partículas de fago amplificado
como plantilla para colonia PCR (Novagen Madison, USA) con cebadores
SfiI5'Back y CBD (BX). El producto PCR de aproximadamente el
tamaño de un fragmento scFv-CBD intacto
(aproximadamente 1250 bp) fue digerido con la enzima de restricción
PvuI y analizado por electroforesis en gel de agarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de scFv a
\betaAP(1-16) fue analizada por ELISA.
Placas revestidas con 50 \mul de 1 g/ml streptavidina en 0.1 M
NaHCO_{3}, pH 9.6, fueron lavadas tres veces con PBST y 50 \mul
de 6 ng/\mul \betaAP(1-16) biotinilado
fueron añadidos a continuación a los pocillos e incubados durante 30
min a 37ºC. Los pocillos fueron bloqueados con una mezcla de
albúmina de suero bovino al 3% y hemoglobina de bovino en PBS
durante 2 hr a 37ºC, luego lavados e incubados con scFv (0.5
\mug/ml o como se especifique de otro modo) durante 1 hr a 37ºC.
Para experimentos de inhibición, fueron
pre-incubados péptidos con el anticuerpo durante 30
min a 37ºC antes de su adición a los pocillos revestidos con
péptidos. Después del lavado, se detectaron fragmentos de
anticuerpos unidos tal como se describe arriba. Se propagaron clones
de fago específicos de unión a \betaAP y se aisló y secuenció su
ADN como se describe arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células PC 12 de feocromocitoma de
rata en DMEM complementadas con suero de caballo 5%, suero fetal
bovino 10%, 2 mM L-glutamina, y 100 unidades/ml
penicilina/estreptomicina e incubadas a 37ºC bajo CO_{2} 5%. Para
el ensayo de neurotoxicidad, las células PC 12 cultivadas fueron
sembradas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10^{4}
células/100 \mul/pocillo en un medio exento de suero complementado
con 2 M de insulina. El efecto sobre la prevención de la
neurotoxicidad de \betaA fue medido como sigue: 0.12 mM
\beta-amiloide que fue incubado durante una semana
a 37ºC para la generación de fibrillas, e incubado a continuación en
presencia de 508F(Fv)-CBD o con el
Gal6(Fv)-CBD no relacionado a una fracción
molar de \betaAP a scFv de 15:1 o 30:1 durante 24 hr. La mezcla
\betaA/anticuerpo fue añadida a los pocillos que contenían células
PC 12. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 2 días, después de
lo cual se evaluó la viabilidad de las células midiendo la actividad
redox celular con
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
bromuro de tetrazolio (MTT), como se describe en (Sladowski, D.
et al., J. Immunol. Methods.,
157:203-207,1993). Las placas fueron incubadas
durante una noche a 37ºC. se determinó la reducción MTT
colorimétricamente utilizando un lector de placas de microtitulación
ELISA establecido a 550 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
La agregación del péptido
\beta-amiloide fue medida por el ensayo de unión
con tioflavina T (ThT), en el que la intensidad de la fluorescencia
refleja el grado de formación de fibrillas
\beta-amiloides. La ThT tinta de modo
característico los depósitos de tipo amiloide (Levine, H. III,
Protein Sci., 2: 404-410,1993) y exhibe una emisión
de fluorescencia mejorada a 485 nm por excitación a 435 nm cuando se
añade a la suspensión de preparados de lámina-beta
agregados. Soluciones acuosas de 0.12 mM \betaAP en 0.1 M Tris
(HCl) pH 7.1 fueron incubadas a 37ºC durante 1 semana e incubadas a
continuación en presencia de 508F(Fv)-CBD o
con Gal6(Fv)-CBD no relacionado a una
fracción molar de \betaAP a scFv de 15:1 o 30:1 durante 24 hr. La
fluorescencia fue medida después de la adición de 1 ml de ThT (2 M
en 50 mM Glicina, pH 9) con un espectrofluorímetro
LSB-50 Perkin Elmer Ltd., UK.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividió en cuatro grupos a 12 ratones Balb/c
hembras de 3 ratones por grupo. Uno de los grupos fue utilizado como
control. Después de administrarles intranasalmente una única dosis
de 10^{11} partículas de fago (fago fd, tomado de una biblioteca
15-mer péptidos-fago que fue
suministrada por George P. Smith, University of Missouri, Columbia,
MO), los ratones fueron sacrificados a intervalos de 1, 14 y 28 días
en cada grupo y extraídos sus cerebros para su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la fusión de
ScFv-508F a gpIII de capa menor filamentosa para
investigar la capacidad del scFv de anti-agregación
\betaAP de ser transportado por un sistema de presentación de fago
filamentoso directamente al SNC.
Este scFv fue preparado a partir de hibridoma
508 anti-agregación tal como se describe
anteriormente y se conservó su actividad de fijación específica.
Nueve ratones Balb/c divididos en tres grupos fueron tratados como
sigue: los ratones de un primer grupo fueron tratados con 0.2 ml de
10^{-3} M biotina \betaA (1-16) únicamente. Los
ratones de un segundo grupo fueron tratados con una mezcla de fago
10^{10} portador de 508FscFv que fue preincubado con 0.2 ml de
10^{-3} M biotina \betaA(1-16) durante 1
hr. Los ratones de un tercer grupo fueron utilizados como control.
Después de administrarles intranasalmente una única dosis, los
ratones fueron sacrificados a intervalos de 1, 14 y 28 días en cada
grupo y extraídos sus cerebros para su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Inmediatamente después de la decapitación, los
cerebros fueron extraídos y cortados en dos mitades a lo largo del
seno medio-sagital. De manera aleatoria, una mitad
del cerebro fue fijada por inmersión en una solución de
paraformaldehído al 4% en solución tamponada de fosfato 0.1 M
durante dos horas a 4ºC y luego sumergidos para la protección contra
el frío en sucrosa al 4.5% en PBS 0.1 M durante la noche. Las
secciones fueron puestas a continuación en sucrosa al 30% durante 2
hr a 4ºC. Las secciones coronales que contenían el hipocampo y el
sistema olfativo fueron puestas en OCT y cortadas a espesores de 6
\mum con un criostato a -20ºC, y colocadas luego sobre placas de
cristal. Las placas fueron mantenidas a -70ºC. Estas placas fueron
utilizadas para la detección del fago utilizando una técnica de
inmunofluorescencia.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La otra mitad del cerebro
medio-sagital fue utilizada para preparar una
sección de tejido a la parafina para histología. La sección fue
fijada en paraformaldehído al 4% durante 2 horas y luego transferida
a formalina salina al 10% durante 2 días a temperatura ambiente,
para ser embebida en parafina a continuación y cortada a espesores
de 4 \mum sobre un microtomo y colocada a continuación sobre
placas de cristal. Las placas fueron mantenidas a temperatura
ambiente hasta ser usadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunofluorescencia: las secciones fueron
bloqueadas con albúmina de suero bovino al 3% en PBS durante 30 min.
y luego incubadas con suero policlonal de conejo anti fd (1:100) o
Estreptavidina acoplada con PE (sigma) durante 1 hr a 37ºC. Las
placas fueron lavadas a continuación tres veces, 5 min cada una, en
PBS, tratadas de nuevo con solución tamponada bloqueante durante 5
minutos a temperatura ambiente, y luego reaccionada con IgG
anti-conejo de burro r Cy^{TM} 3 secundario (para
la detección del fago) a 1:400 (sigma) o con estreptavidina acoplada
a PE, dilución 1:50, durante 1 hr a temperatura ambiente.
Finalmente, los preparados fueron lavados tres veces en PBS,
observados utilizando un microscopio de fluorescencia a una
ampliación final de x 10, y grabados en película o utilizando una
cámara digital Hamamatsu (C4742) y software informático Metamorph
(Universal Imaging; West Chester, PA).
Histología: Se tintaron secciones de seis
micrómetros con hematoxilina y eosina. Las secciones tintadas fueron
examinadas y fotografiadas a una ampliación final de 40. Por último,
los preparados fueron lavados tres veces en PBS, observados en un
microscopio, y grabados en película.
\vskip1.000000\baselineskip
Las inmunizaciones fueron llevadas a cabo con un
fago fd producido mediante ingeniería genética transportando el
péptido YYEFRH (SEC Nº ID:7) fusionado a su gpIII de capa menor. Se
utilizaron dosis de 10^{10} fagos por inyección para inmunizar a
intervalos de 14 días, mediante inyecciones intraperitoneales. Se
inyectó los fagos a los ratones con o sin coadyuvante completo de
Freund (Difco) en la primera inyección y el coadyuvante incompleto
de Freund (Difco) en la segunda inyección. A los 7 días de cada
inyección, los ratones fueron sangrados y su suero fue analizado
mediante ELISA para ver la reactividad de anticuerpos IgG tanto a
las proteínas con capa de fago y \betaA.
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca 15-mer
péptidos-fago utilizada en este estudio fue
suministrada por George P. Smith (University of Missouri, Columbia,
MO). La biblioteca consiste en aproximadamente 1.9 x 10^{9}
partículas de fago y comprende un repertorio de péptidos aleatorio
de residuos de 15 aminoácidos fusionados a la glicoproteína VIII del
fago fd. Los experimentos con esta biblioteca fueron llevados a cabo
según las instrucciones del proveedor (George P. Smith University of
Missouri, Columbia, MO).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la biotinilación de anticuerpos, se
incubaron 100 g de cada anticuerpo en 0.1 M NaHCO_{3}, pH 8.6,
durante 2 hr a temperatura ambiente con 5 \mug de éster de
N-hidroxisuccinimida biotinamidocoproato (Sigma, B
2643) de una solución stock de 1 mg/ml en dimetilformamida y
dializado a 4ºC contra solución salina fosfatada (PBS; 0.14M
NaCl/0.01 M solución salina fosfatada, pH 7.4) durante toda la
noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de biblioteca conteniendo 10^{9}
partículas de fago infeccioso fue sometida a tres rondas de
selección (ciclo de selección de fagos por afinidad o biopanning) y
amplificación. Para cada ciclo de selección se utilizó un anticuerpo
monoclonal biotinilado (1 \mug/\mul) en un volumen total de 25
\mul. Los clones de fago fueron pre incubados con el anticuerpo
biotinilado durante la noche a 4ºC, y las mezclas de reacción fueron
estratificadas en 1 ml de PBS conteniendo Tween 20 al 0.5% sobre
platos Petri de poliestireno de 30 mm revestidos de estreptavidina e
incubados durante 20 min a temperatura ambiente. Los fagos no
fijados fueron eliminados mediante lavado exhaustivo (10 veces
durante 10 min cada uno) en PBS/0.05% Tween 20. Los fagos fijados
fueron eluidos con 0.3 ml de 0.1 M HCl titrado con glicina pH 2.2.
El eluato fue neutralizado y utilizado para infectar células E.
coli K91. Después de tres rondas de selección, colonias
bacterianas individuales que contenían partículas amplificadas
fueron cultivadas en una placa de microtitulación y los fagos
seleccionados fueron analizados por ELISA para ver su capacidad de
fijarse al anticuerpo estudiado, tal como se describe más
adelante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La fijación de anticuerpos al fago fue analizado
mediante ELISA. Pocillos de placas de microtitulación (Maxisorb,
Nunc) fueron revestidos con 50 \mul (a dilución de 1:1000 en 0.1 M
NaHCO_{3}, pH 8.6) de suero anti-fago de conejo e
incubados durante toda la noche a 4ºC. Los pocillos fueron
bloqueados con una mezcla de albúmina de suero bovino al 3% a una
proporción de 1:1 (en PBS) durante 2 hr a 37ºC. Las placas
revestidas fueron lavadas tres veces con PBS/Tween 20 0.05%, y 50
\mul de clones de fago enriquecidos conteniendo 10^{10}
partículas de fago fueron añadidos a los pocillos e incubados
durante 1 hr a 37ºC. Después del lavado, el anticuerpo estudiado fue
añadido (1 \mug/ml o como se especifique de otro modo) y se dejó
que se fijara a la placa revestida durante la noche a 4ºC y se midió
la constante de fijación del mismo. Clones de fago positivos fueron
propagados y su ADN fue secuenciado en la región de inserción en la
Sequencing Unit of the Weizmann Institute of Science (Rehovot,
Israel) utilizando el Applied Biosystem Kit (United States, Applied
Biosystem).
\vskip1.000000\baselineskip
La glicoproteína VIII de capa de fago
filamentoso es presentada en aproximadamente 2700 copias en la capa
del fago. Se prepararon los siguientes oligonucleótidos:
sentido-5'-agctccGATGCTGAATTCGGTGATAGCGGC
TACGAAGTGCATCATCAGAAAcctgcag-3' (SEQ ID NO: 13); y antisentido-5'-ggTTTCTGATGATGCACTTCG
TAGCCGCTATCATGACGAAATTCAGCATCgg-3' (SEC Nº ID: 14). Estos oligonucleótidos fueron utilizados para formar un dúplex (68-70ºC, 10 minutos, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente) que codifica los aminoácidos 1-16 del \betaAP humano y contiene una mutación silenciosa de un sitio de restricción específico (EcoRI) que es útil para análisis posteriores. El dúplex fue fosforilado y ligado al fagémido f88-4 linearizado HindIII/PstI, que es un vector utilizado para presentar péptidos de fusión en gpVIII de fago filamentoso. El ADN del fagémido ligado resultante fue introducido en células E. coli K91K por transformación y los transformantes fueron colocados en 2 placas de Agar YT conteniendo 10 \mug/ml de tetraciclina y 1% de glucosa para su cultivo durante la noche a 37ºC. Se utilizaron colonias bacterianas individuales conteniendo partículas de fago para inocular 2YT medio conteniendo 10 \mug/ml de tetraciclina para su cultivo durante la noche a 37ºC para amplificación. El producto fagémido de ADN obtenido de cada colonia fue analizado por EcoRI. Clones positivos fueron amplificados para la preparación de
antígeno.
TACGAAGTGCATCATCAGAAAcctgcag-3' (SEQ ID NO: 13); y antisentido-5'-ggTTTCTGATGATGCACTTCG
TAGCCGCTATCATGACGAAATTCAGCATCgg-3' (SEC Nº ID: 14). Estos oligonucleótidos fueron utilizados para formar un dúplex (68-70ºC, 10 minutos, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente) que codifica los aminoácidos 1-16 del \betaAP humano y contiene una mutación silenciosa de un sitio de restricción específico (EcoRI) que es útil para análisis posteriores. El dúplex fue fosforilado y ligado al fagémido f88-4 linearizado HindIII/PstI, que es un vector utilizado para presentar péptidos de fusión en gpVIII de fago filamentoso. El ADN del fagémido ligado resultante fue introducido en células E. coli K91K por transformación y los transformantes fueron colocados en 2 placas de Agar YT conteniendo 10 \mug/ml de tetraciclina y 1% de glucosa para su cultivo durante la noche a 37ºC. Se utilizaron colonias bacterianas individuales conteniendo partículas de fago para inocular 2YT medio conteniendo 10 \mug/ml de tetraciclina para su cultivo durante la noche a 37ºC para amplificación. El producto fagémido de ADN obtenido de cada colonia fue analizado por EcoRI. Clones positivos fueron amplificados para la preparación de
antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo inmunizaciones con un fago fd
producido mediante ingeniería genética portando el péptido
VHEPHEFRHVALNPV (SEC Nº ID:8) fusionado con su glicoproteína VIII de
capa mayor. Se utilizaron dosis de 1010 fagos por inyección para
inmunizar a intervalos de 14 días, mediante inyecciones
intraperitoneales. Se inyectó el fago a los ratones con o sin
coadyuvante completo de Freund (Difco) en la primera inyección y
coadyuvante incompleto de Freund (Difco) en la segunda inyección. A
los 7 días de las inyecciones, los ratones fueron sangrados y su
suero fue analizado mediante ELISA para ver su reactividad a
anticuerpos IgG de las proteínas con capa de fago
y del \betaA.
y del \betaA.
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición de la fijación de anticuerpos a
\betaAP(1-16) por diversos pequeños
péptidos fue realizada utilizando 250 ng/pocillo de péptidos
\beta-amiloides (1-16)
biotinilados fijados covalentemente a placas ELISA tal como se
describe previamente. Las placas fueron lavadas con PBS/0.05% Tween
20 y bloqueadas con una mezcla de albúmina de suero bovino al 3% y
hemoglobina, proporción 1:1 (en PBS) durante 2 hr a 37ºC. Los
péptidos fueron pre incubados con dilución 1:3000 de suero después
de la tercera inmunización con f88-EFRH durante 30
min a 37ºC antes de su adición a pocillos revestidos con \betaAP y
fueron dejados toda la noche a 4ºC en ellos. Después del lavado, se
detectaron anticuerpos unidos por incubación con inmunoglobulina
anti-ratón de conejo HRP-conjugada,
tal como se describe arriba. Los resultados fueron derivados para
derivar el IC_{50}, que es la mitad de concentración molar de
péptido que inhibe totalmente la fijación de anticuerpos. Los
péptidos fueron sintetizados por Applied Biosystems Synergy Model
430A en la Unit for Chemical Services del Weizmann Institute of
Science por fase sólida utilizando química Fmoc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células PC 12 de feocromocitoma de
rata en DMEM complementadas con suero de caballo al 5%, suero de
ternero fetal al 10%, 2 mM L-glutamina, y 100
unidades/ml penicilina/estreptomicina e incubaron a 37ºC bajo
CO_{2} al 5%. Para el ensayo de neurotoxicidad, las células PC 12
cultivadas fueron sembradas en una placa de 96 pocillos a una
densidad de 10^{4} células/100 \mul/pocillo en un medio exento
de suero complementadas con 2 \muM de insulina. El efecto sobre la
prevención de la neurotoxicidad de \betaA fue medido como sigue:
0.12 mM de \beta-amiloide que fue incubado durante
una semana a 37ºC para la generación de fibrillas, e incubado
posteriormente en presencia de suero de ratón inmunizado con
fago-EFRH y suero de un ratón inmunizado con fago no
relevante a diluciones de 5:1 y 10:1 durante 24 hr. La mezcla de
anticuerpos \betaA fue añadida a los pocillos conteniendo células
PC 12. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 2 días, después de
los cuales se evaluó la viabilidad de las células midiendo la
actividad redox celular con
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
bromuro de tetrazolio (MTT), tal como se describe en (Sladowski, D.
et al., J. Immunol. Methods., 157:203-207,
1993). Las placas fueron incubadas durante la noche a 37ºC. La
reducción MTT fue colorimétricamente determinada utilizando el
lector de placas de microtitulación ELISA ajustado a 550 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones inmunizados con péptido sintético
correspondiente a la secuencia de PrP 106-126 humano
(SEC Nº ID:25) (suministrado por Chiron Technologies, Claton
Victoria, Australia) acoplado al soporte KLH de mayor tamaño fueron
utilizados para generar anticuerpos monoclonales siguiendo las
técnicas de fusión de Kohler y Milstein (Kohler and Milstein 1975).
Se ensayaron hibridomas para la producción de anticuerpos
específicos de péptidos mediante ELISA, de la manera siguiente: el
péptido PrP 106-126 fue covalentemente unido a los
grupos epoxy de placas de 96 pocillos revestidas de
Eupergit-C (Solomon et al. 1992, 1993). Los
grupos epoxy residuales fueron bloqueados incubando las placas con
leche desnatada al 3% (solución de bloqueo). Los sobrenadantes de
hibridomas no diluidos fueron aplicados durante 1 hora a 37ºC. Los
pocillos fueron exhaustivamente enjuagados (como en cada etapa del
procedimiento) e incubados a continuación con anticuerpos
anti-ratón de cabra etiquetados (HRP) peroxidasa de
rábano específicos para IgG o IgM de ratón (diluidos en solución de
bloqueo). Después del lavado, se visualizó la fijación de
anticuerpos utilizando orto-fenildiamina como
substrato para HRP. Se midió la densidad óptica a 492 nm. Los
anticuerpos monoclonales seleccionados fueron ampliados y
purificados de acuerdo con procedimientos publicados: IgG
molecules on a protein A column (Harlow et al. 1988). y
IgM on KaptiveM coloumn. Dos mAbs, a saber
2-40 y 3-11, fueron utilizados para
estudios posteriores. El mAb 3F4 fue adquirido en Senetek, Ca.
USA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos 3-11 (IgM) y
2-40 (IgG) fueron biotinilados. Las siguientes
bibliotecas (suministradas por G.P. Smith) fueron examinadas para
buscar el epítopo de los anticuerpos estudiados, tal como se
describió previamente en (Frenkel et al. 1998).
1. biblioteca fUSE5/15-mer en la
que se muestran 15-mer extraños en las 5 copias de
pIII.
2. biblioteca
f88-4/6-mer en la que se muestran
6-mer extraños en hasta \sim300 copias de pVIII
(gen VIII recombinante que codifica el péptido es inducible con
IPTG).
El ciclo de selección de los fagos por afinidad
(biopanning) para encontrar el epítopo de anticuerpos fue realizado
como se describió previamente en (Frenkel et al. 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
La fijación competitiva por ELISA de los
anticuerpos anteriores a péptido PrP covalentemente unido fue
realizada tal como se describe arriba. Los anticuerpos fueron
preincubados con péptido NMKH a fracción equimolar antes de
añadirlos a los pocillos.
\vskip1.000000\baselineskip
La agregación in vitro del péptido
106-126 fue inducida por incubación de una solución
acuosa de PrP 106-126 (10 mg/ml) para diversos
intervalos de tiempo a 37ºC. El péptido agregado fue incubado o bien
con anticuerpos monoclonales 2-40,
3-11 o 3F4 en condiciones que se especifican más
adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células PC 12 de feocromocitoma de
rata en DMEM complementado con suero de caballo al 8%, suero de
ternero fetal al 8%, 2 mM L-glutamina, y 100
unidades/ml penicilina/estreptomicina e incubaron a 37ºC bajo
CO_{2} al 5%. Para el ensayo de neurotoxicidad, las células PC 12
cultivadas fueron sembradas en una placa de 96 pocillos a una
densidad de 2 x 10^{4} células/100 \mul/pocillo en un medio
exento de suero complementadas con 2 \muM de insulina. Las células
fueron tratadas durante 3-5 días con 100 \muM PrP
106-126 preincubado 4-7 días a 37ºC.
La viabilidad celular fue evaluada por el ensayo MTT que mide la
actividad de las enzimas mitocondriales responsables de la
conversión de la sal de tetrazolio,
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-bromuro
de tetrazolio (MTT) en un producto de formazán en células viables
(Hansen et al. 1989). El MTT fue añadido a los pocillos en
una concentración final de 1 mg/ml e incubado con las células
durante 3 horas más a 37ºC. Se añadió tampón de lisis celular (SDS
al 20% peso/vol en una solución de dimetilformamida al 50%, pH 4.7),
y la placa fue incubada durante la noche a 37ºC. La reducción MTT
fue colorimétricamente determinada midiendo la densidad óptica (DO)
a 550 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de mAbs sobre la inhibición de
neurotoxicidad de PrP 106-126 fue determinado como
sigue: PrP 106-126 (10 mg/ml) fue incubado durante 7
días a 37ºC para inducir la agregación máxima del péptido. Se
añadieron anticuerpos monoclonales 3-11,
2-40 y 3F4 durante 1 hora a muestras de 1 mM del
péptido ya agregado. Las mezclas anticuerpo-péptido,
así como el péptido agregado solo, fueron aplicadas a las células en
una concentración final de péptidos de 100 \muM. Se evaluó la
viabilidad celular después de una incubación de 3 días a 37ºC con la
mezcla de reacción antes mencionada, tal como se describe arriba. La
viabilidad 100% fue definida como el valor del ensayo MTT para
células no tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cantidades crecientes del péptido PrP
106-126 (0-0.8 mg/ml) fueron
incubadas durante 7 días a 37ºC. Se midió la formación de fibrillas
amiloides criónicas mediante el ensayo de unión con Tioflavina T
(ThT). La fijación de la ThT a fibrillas amiloides de ciertos
orígenes genera una señal fluorescente específica: un desplazamiento
hacia el rojo de 114 nm en el pico de excitación desde 336 nm del
espectro de excitación de la solución colorante libre en solución a
un nuevo pico de excitación a 450 nm de la solución colorante
fijada. Adicionalmente, la solución colorante fijada tiene una
emisión mejorada a 482 nm (Naiki et al. 1989, LeVine 1993).
Luego siguió la agregación del péptido priónico utilizando muestras
de PrP 106-126 (0.3 mg/ml) en 0.1M Tris/HCl
pH-7.1 incubadas durante 7 días a 37ºC, con o sin
mAbs 3-11, 2-40 y 3F4 en diversas
diluciones. Se midió la desagregación de fibrillas amiloides
priónicas ya formadas utilizando muestras de PrP
106-126 que fueron incubadas durante 7 días a 37ºC y
luego complementadas con el mAbs durante otras 24 horas. Se midió la
fluorescencia (emisión a 482 nm después de excitación a 435 nm)
después de la adición de las muestras a ThT (2 \muM en 50 mM
glicina, pH-9).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos 1-6 siguientes se
refieren a la producción de una versión de cadena simple del
anticuerpo monoclonal anti-agregación. Los ejemplos
7-8 siguientes se refieren al suministro de un fago
de presentación de péptido o de anticuerpo al cerebro. Los ejemplos
9-14 siguientes se refieren a la producción de
títulos altos de anticuerpos policlonales
anti-agregación por inmunización directa con
antígenos de beta-amiloide presentados en un fago y
a la caracterización de estos anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunización de un ratón con un péptido de 16
aminoácidos de beta-amiloide (ácidos
1-16 de SEC Nº ID:3) conjugado a KLH (SEC Nº ID:9)
se llevó a cabo como se describe arriba. La inmunización repetitiva
produjo finalmente un título de anticuerpo bajo pero mensurable
contra beta-amiloide. La esplenectomía subsiguiente
del ratón inmunizado facilitó la preparación del hibridoma IgM 508
expresando scFvAb con especificidad en el
beta-amiloide. Posteriormente se extrajo ARN de este
hibridoma. El hibridoma IgM 508 mostró actividad específica en
A\beta para prevenir sus efectos tóxicos sobre células PC 12
(Anavi, S. 1998, M. Se. Tesis del departamento de Microbiología y
Biotecnología Molecular de la Universidad de
Tel-Aviv, I).
\vskip1.000000\baselineskip
MAb 508 mostró reconocimiento específico del
\beta-amiloide y previno sus efectos tóxicos sobre
células PC 12 (Anavi S., 1998, ibid). Para clonar el
anticuerpo 508 como un scFv en un vector de presentación de fago, se
extrajo ARN de 10^{8} células del hibridoma 508 y fue utilizado
como fuente para secuencias de codificación de región variable de
anticuerpos. Se utilizó RT-PCR para amplificar los
dominios variables que fueron clonados en el vector de presentación
de fago pCC-Gal6(Fv), como se describe en
Materiales y Métodos. Cuando se clonan anticuerpos derivados de
hibridoma como scFvs, algunos de los clones pueden contener
secuencias aberrantes que son no funcionales. Por lo tanto, para
identificar clones de fagémido portadores de agentes ligantes
funcionales de beta-amiloides de los clones
generados, se eligieron al azar 10 clones individuales y se produjo
de ese modo proteínas de fusión scFv-CBD. La Figura
2 muestra un mapa físico del plásmido pCC-508 que
fue utilizado para expresar 508-scFv. El dominio CBD
actúa como una detección inmunológica de proteína scFv soluble o
como un nuevo enfoque del replegado de cuerpos de inclusión de la
proteína scFv soluble de proteína sobreexpresada (Berdichevsky Y
et al, Protein Expr Purif.,
17(2):249-59, 1999). El plásmido utilizado
para la sobreexpresión de 508-scFv está representado
en la Figura 3. Las scFv-CBD solubles de los clones
seleccionados fueron incubadas en pocillos de una placa ELISA que
había sido revestida con péptido \beta-amiloide.
De los clones analizados, el 50% mostró fijación específica al
\betaAP. Las Figuras la-e muestran e ilustran la
preparación de 508 scFv a partir de anticuerpos IgM. La Figura 4
muestra la fijación al \betaAP por scFv-CBD
producida por un clon positivo que fue elegido para análisis
posterior. Se utilizó el análisis PCR para caracterizar su inserto
de ADN. Se descubrió que el clon positivo (designado
pCC-508(Fv)) contenía un inserto de ADN
intacto (Figura 5). La secuenciación de ADN de
pCC-508(Fv) confirmó que el clon expresa un
fragmento scFv intacto (ver, Figuras 1 la-b y SEC Nº
ID: 5 y 6, para secuencias de ácido nucleico y aminoácidos,
respectivamente, modificadas como se describe más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de secuenciación de ADN de
pCC508-(Fv) reveló la apariencia inusual de un residuo de cisteína
en la posición 96 de V_{L} CDR3 (Kabat, E. A. et al., Sequences
of proteins of immunological interest, 5th Ed., 1991). La
secuencia de aminoácidos deducida de V_{L} CDR3 es:
H^{89}QRSSYPCT^{97} (SEC Nº ID: 15). La presencia de un residuo
de cisteína impar en un scFv puede reducir su capacidad de plegado y
también disminuir su estabilidad en solución y su vida media de
almacenamiento. Por lo tanto, el 508(Fv) fue subclonado en un
vector de expresión y producido en E. coli como se describe
en Materiales y Métodos. La Figura 6 resume el proceso de producción
del 508(Fv)-CBD por el método de replegado
asistido por celulosa (Berdichevsky Y et al, Protein Expr
Purif., 17(2):249-59, 1999). Aunque el
508(Fv)-CBD podría ser purificado hasta casi
la homogeneidad (Figura 6 vía 7) mediante este método, se replegó
relativamente mal y fue inestable durante el almacenamiento a 4ºC
(Figura 7). Se asumió que la sustitución de la cisteína por un
residuo diferente podría incrementar la capacidad de producción y la
estabilidad del scFv soluble sin tener un efecto adverso sobre su
afinidad (Kirpriyanov, M.S. et al., Protein Engineering,
10:445-453, 1997).
Para la sustitución del codón 508 V_{L}
cisteína 96 se utilizó SOE PCR, lo cual permitió la sustitución de
Cys 96 por codones de fenilalanina, leucina, serina, tirosina o
triptófano. Además, el esquema PCR empleado permite la persistencia
del residuo de cisteína en esa posición. Mutantes de 508(Fv)
fueron clonados en el vector de fago
pCC-Gal6(Fv), con el resultado de la
generación de una micro biblioteca (con 6 variantes potenciales).
Los residuos de sustitución elegidos son por lo general aceptables
en esa posición CDR3, ya que se encuentran en diversos anticuerpos
de la base de datos Kabat (Kabat, E. A. et al., Sequences of
proteins of immunological interest, 5th Ed., 1991). Sin embargo,
los diferentes sustitutos pueden variar en su efecto sobre la
fijación del \betaAP. Para probar qué sustituto mantiene la
fijación \betaAP, se realizó un ciclo único de selección por
afinidad en la micro biblioteca de fagos
508(Fv)-Mut utilizando
\betaAP(1-16) biotinilado como antígeno de
captación. El análisis de restricción y amplificación PCR fue
utilizado para controlar el enriquecimiento de clones de biblioteca
después del ciclo de selección por afinidad. Cuando el ADN
508Mut-(Fv)-CBD es digerido con PvuI, se
obtiene un patrón de restricción típico por electroforesis en gel de
agarosa y tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos bp 750 y 500
bp inferiores representan el ADN 508Mut-(FV)-CBD,
mientras que un fragmento 1250 intacto representa
scFv-CBD del ADN pCC-Galó(Fv) que
fue utilizado como un vector. Se descubrió que antes de la selección
por afinidad la biblioteca estaba muy contaminada con el ADN vector
pCC-Gal(Fv). Esto resulta evidente por el
hecho de que el ADN de 18/19 clones de biblioteca tomados al azar no
estaba desdoblado en el sitio de la enzima PvuI establecido
adyacente a 508 V_{L} posición 96. Solamente uno de los 19 clones
analizados mostró el modelo de restricción esperado asociado a una
mutación (Figura 8a). Sin embargo, después de selección por
afinidad, 5/11 clones seleccionados al azar mostraron el modelo de
restricción esperada (Figura 8b). Esto indica un factor de
enriquecimiento de aproximadamente 10 veces, lo cual demuestra la
capacidad de los mutantes de 508 scFv de fijarse al epítopo
\betaAP(1-16). Las secuencias de ADN de los
5 mutantes fueron determinadas y se indican en la Tabla 1 siguiente.
Se descubrió que los sustitutos adecuados del codón 508 L1 cisteína
96 eran la fenilalanina, serina o tirosina.
Para seguir examinando los derivados mutados de
508 scFv, los genes mutados fueron subclonados en un vector de
expresión y sobreexpresados en E. coli, tal como se describe
para la proteína de tipo salvaje anterior. Las interacciones de las
diversas proteínas 508-(Fv) mutadas (Tabla 1) con
\betaAP(1-16) fueron analizadas en un
ensayo ELISA. Las Figuras 9a-b muestran que aunque
508-(Fv)-CBD de tipo salvaje se fija a la mitad de
la unión máxima (HMB) de 10^{-5} M, todos los mutantes mostraron
una unión mejorada a \betaAP: la HMB de C96S y C96Y es 5 X
10^{-6} M y la HMB de C96F es 10^{-7} M. Para seguir examinando
se eligió el mutante 508-scFv que porta la mutación
C96F (508F(Fv)), el cual muestra la afinidad y estabilidad de
almacenamiento más elevadas (Figuras 9a-b). Se
analizó la especificidad de la unión de
\betaAP(1-16) por 508F(Fv) en un
ELISA competitivo. Como se indica en la Figura 10, la unión de
508F(Fv)-CBD purificada al \betaAP fue
inhibida por péptido \betaAP(1-16) soluble
actuando como el competidor en la fase líquida de una manera
dependiente de la dosis. Se obtuvo la inhibición de la unión al 50%
a aproximadamente 1 \muM de competidor. La unión no se vio
afectada por un péptido irrelevante (WVLD, Nº ID. SEC.: 4).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de descubrir si 508F(Fv) muestra un
efecto protector similar al anticuerpo IgM parental en prevenir la
neurotoxicidad mediada por \betaA sobre células cultivadas, se
aplicó un test in vitro utilizando PC 12 de feocromocitoma de
rata como se describe en (Solomon B. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 94: 4109-4112,1997). Se midió la
viabilidad de las células expuestas a \betaA con o sin anticuerpo.
Como se muestra en la Figura 12, 508F(Fv) impidió la
neurotoxicidad de \betaA (viabilidad celular 90%) a una fracción
molar \betaAP:scFv de 15:1, mientras que el scFv no relacionado no
mostró ningún efecto. CBD purificado o el scFv sólo no tuvo efecto
sobre las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el efecto de 508F(Fv) sobre
la alteración de la fibrilla \betaA (la forma tóxica del
\betaAP) se utilizó el reactivo ThT que se une específicamente a
estructuras fibrilares (Levine, H. III, Protein Sci., 2:
404-410,1993). Se midió la interferencia con la
fibrilla \betaA ya formada a la misma fracción molar de
\betaAP:scFv como en el ensayo neurotóxico de \betaA y fue
cuantificada por fluorometría ThT. La Figura 13 muestra que
508F(Fv) incubado con fibrillas \betaA
pre-formadas alteró la estructura de la fibrilla
indicando deterioro importante de la morfología de la fibrilla, tal
como se demuestra por la reducción sustancial (62%) de la
fluorescencia ThT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones Balb/c hembras fueron tratadas con
vector de fago f88-EFRH por administración
intranasal. El propósito de este experimento era comprobar la
capacidad del fago filamentoso de llegar a la región del hipocampo a
través del tracto olfatorio. Dado que el fago no transporta ninguna
molécula específica con destino a células neuronales, debería
desaparecer sin causar daño varios días después de la
administración. A fin de investigar la aparición de fago en el bulbo
olfativo y la región del hipocampo, se utilizó doble etiquetado de
anticuerpos como sigue: fago antifilamentoso de anticuerpo
policlonal de conejo y anticuerpo monoclonal de ratón contra epítopo
EFRH fusionado a glicoproteína VIII de la superficie del fago. Un
día después de una única administración intranasal de 10^{11}
fagos, los animales mostraron dichos fagos en su bulbo olfativo e
hipocampo (Figuras 14a-d). Siete días después de la
administración se detectaron fagos en el bulbo olfativo de solo un
ratón de los tres sometidos al test, mientras que no aparecieron
fagos en el hipocampo. 28 días después de la administración no había
restos de fago (Figuras 15a-d). Como se indica en
las Figuras 16a-d, no había pruebas de cambios en la
población de neuronas del cerebro de los ratones tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para verificar si un fago filamentoso puede
transportar un anticuerpo al SNC a través del tracto olfatorio y
seguir manteniendo su actividad contra el
\beta-amiloide se incubó un fago filamentoso
presentando 508F con 10^{-3} M
\betaAP(1-16) biotinilado a fin de formar
un inmunocomplejo antígeno anticuerpo. Ratones Balb/c fueron
divididos en dos grupos y se les administró intranasalmente dos
antígenos diferentes: inmunocomplejo
508F-\betaAP(1-16) y para
comparación, \betaAP(1-16) biotinilado
solo. Después de una única dosis los ratones fueron sacrificados y
secciones cerebrales de los mismos preparadas y reaccionadas con
estreptavidina acoplada a un agente fluorescente. La fluorescencia
fue detectada únicamente en secciones cerebrales de ratones a los
que se administró
508F-\betaAP(1-16), pero
no, o en una medida mucho menor, en secciones cerebrales de ratones
a los que se administró \betaAP(1-16) solo
(Figuras 17a-d). Los ratones tratados no se
caracterizaron por resultados histológicos (Figuras
18a-d).
Queda por lo tanto asumido que el fago actúa
como un vehículo inerte de anticuerpos al cerebro, transportando la
molécula \betaAP(1-16) al cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
El epítopo anti-agregación en
\betaAP (EFRH, SEC Nº ID:1) está en las posiciones
3-6 de la secuencia de aminoácidos del \betaAP. A
fin de generar una respuesta inmune específica contra \betaAP, los
ratones fueron inmunizados con fago fd producido mediante ingeniería
genética portador del péptido YYEFRH (SEC Nº ID:7) fusionado a su
gpIII de capa menor de acuerdo con el programa de inmunización
indicado en la Figura 19. Se utilizaron dosis de 10^{10}
partículas de fago por inyección para inmunizar a intervalos de 14
días mediante inyección intraperitoneal. Al cabo de 7 días de cada
inyección, los ratones fueron sangrados y su suero analizado por
ELISA para reactividad de anticuerpos IgG contra fago de tipo
salvaje (no portador del péptido YYEFRH en su superficie) y contra
\betaAP (Figuras 20a-b). Esta vía de
administración produjo una respuesta muy elevada contra \betaAP
(1:750) después de la tercera inyección. Además, se encontró que la
inyección a través de fago portador de epítopo es duradera (Figura
21), no tóxica y puede darse sin coadyuvante. Se encontró que el
vector de fago era una herramienta inmunogénica para suscitar una
respuesta inmune de elevada afinidad a los 14 días de la primera
inyección. La respuesta inmune contra el péptido YYEFRH (SEC Nº
ID:7) es baja, comparada con la respuesta inmune contra el fago
entero y podría explicarse por el bajo número de copias de la gpIII
de fusión sobre la envoltura del fago. Por lo tanto, para nuevos
análisis se emplearon fagos presentando el epítopo a través de la
glicoproteína VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar un epítopo de péptido EFRH
desagregante se cribó una biblioteca fago-epítope
con anticuerpo biotinilado. Después de tres ciclos de selección y
amplificación del fago, se cultivaron 90 colonias bacterianas
individualmente aisladas en placas de microtitulación y se analizó
la unión de anticuerpos de sus fagos. El análisis ELISA reveló que
de los clones-fago que fueron seleccionados seguidos
de tres ciclos de selección de fagos por afinidad (biopanning), la
mayoría (más del 80%) se unió específicamente a mAb
anti-agregación, respectivamente. Se secuenció el
ADN de 6 clones positivos (Tabla 2). La secuencia EFRH (SEC Nº ID:1)
apareció en 4 clones, otro clon tuvo la secuencia EPRH (SEC Nº
ID:1), con solo un sustituto del residuo de prolina con
fenilalanina. En otro clon, el péptido insertado lleva la secuencia
de los tres residuos FRH (ácidos 2-4 de SEC Nº
ID:1), faltando el residuo de glutamato.
La unión del mAb anti-agregación
al fago portador de EFRH era dependiente de la concentración; se
obtuvo la unión media-máxima a una concentración de
anticuerpos de 100 ng/ml, correspondiente al 10^{-9} M (Figura 4)
que se parece al nivel de unión de estos anticuerpos a todo el
péptido. Un fago f88-EFRH específico (denominado
C3-II, tabla 2) mostró un nivel más alto de avidez
si se compara con los otros (Figura 22). Puede ser debido al nivel
más alto de exposición del epítopo EFRH en su superficie. Los
ensayos de unión de f88-EFRH o
f3-EFRH con la misma concentración de anticuerpos
anti-agregación (1 \mu/ml) demostraron un número
más elevado de copias del epítopo EFRH por fago que puede producir
un título de suero más alto por respuesta inmune del fago (Figura
23).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de generar la misma respuesta inmune
específica contra \betaAP, se inmunizó a ratones con fago fd
producido por ingeniería genética portador del péptido
VHEPHEFRHVALNPV (Nº ID SEC:8) fusionado a su gpVIII de la
capa mayor. Este fago fue seleccionado a partir de una biblioteca de
péptidos-fago 15-mer por un
anticuerpo \betaAP anti-agregación y presenta el
epítopo mAb (subrayado) dentro de \betaAP. Este fago fue utilizado
para inmunizar ratones como se describe. Al cabo de 7 días de cada
inyección con 10^{10} partículas de fago (sin coadyuvante) los
ratones fueron sangrados y su suero se analizó mediante ELISA para
ver su reactividad al anticuerpo IgG contra el fago de tipo salvaje
y contra \betaAP. Los resultados están resumidos en las Figuras
24a-b. Todos los animales mostraron una respuesta
mensurable de anticuerpos IgG contra el fago de tipo salvaje y los
títulos aumentaron con la segunda y tercera inyección. Esta ruta
también dio las mayores respuestas mensurables contra \betaAP
(1:50,000) después de la tercera inyección (Figura 24b).
\vskip1.000000\baselineskip
La interacción del suero de ratón inmunizado por
fago f88-EFRH con \betaAP fue analizada también
por experimentos de inhibición competitivos. La Figura 25 muestra la
inhibición de anticuerpos del suero de ratón con péptidos
sintetizados derivados de \betaAP, cada uno de los cuales incluye
la secuencia EFRH) como: DAEFRH (posiciones 1-6, SEC
Nº ID:3), DAEFRHD (posiciones 1-7, Nº ID SEC:3),
DAEFRHDSG (posiciones 1-9, Nº ID SEC:3), y el propio
\betaAP, DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (posiciones
1-40, Nº ID SEC:3).
La Figura 25 muestra que todos los péptidos
sintéticos que llevan el motivo EFRH (Nº ID SEC:1) inhibieron de
manera similar la unión del anticuerpo de suero de ratón a \betaAP
con valores IC_{50} de aproximadamente 5x10^{-6} M. Estos datos
indican que el epítopo de anticuerpo de suero de ratón en la
molécula \betaAP se compone de cuatro residuos de aminoácido
correspondientes a las posiciones 3-6 en el
\betaAP que se descubrió que actúa como un sitio regulador que
controla tanto la solubilización como el proceso de desagregación de
la molécula \betaA.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de descubrir si el suero de ratones
inmunizados con f88-EFRH muestra un efecto protector
similar al anticuerpo IgG parental en la prevención de la
neurotoxicidad mediada por \betaA para con células cultivadas, se
aplicó la prueba in vitro utilizando PC 12 de feocromocitoma
de rata tal como se describe en (Solomon B. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA., 94: 4109-4112, 1997). Se
midió la viabilidad de las células expuestas a \betaA con o sin
anticuerpos. Tal como se indica en la Figura 26, suero diluido a 1:5
impidió la neurotoxicidad de \betaA (80% viabilidad celular),
mientras que el suero no relacionado no mostró efectos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el efecto del suero de ratones
inmunizados con fB8-EFRH sobre la alteración de la
fibrilla \betaA (la forma tóxica de \betaAP) se utilizó el
reactivo ThT que se une específicamente a estructuras fibrilares
(Levine, H. III, Protein Sci., 2: 404-410, 1993). Se
incubaron muestras de \betaAP durante una semana a 37ºC y luego
se expusieron a anticuerpos de suero de ratón a diferentes
diluciones. La formación de fibrillas fue cuantificada por el ensayo
de unión por fluorimetría ThT. La Figura 27 muestra que el suero de
ratón, a dilución de 1: 5 y 1:20, alteró la estructura fibrilar de
\betaA con un amplio deterioro de la morfología fibrilar, tal como
lo indica la sustancial disminución del 75% de la fluorescencia
(dilución 1:5) y del 50% (dilución 1:20). El suero no relacionado
utilizado como control (suero de ratón no inmunizado), no inhibió de
manera importante la formación de fibrillas si se compara con el
suero inmunizado. Este resultado resalta de manera importante la
capacidad del epítopo EFRH presentada por un vector de fago
filamentosos de provocar una respuesta inmune resultante en un
anticuerpo anti-agregación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
15
La posible implicación de la proteína PrP en la
patogénesis de la degeneración de las células nerviosas y la
reacción de las células gliales condujo a la identificación de
secuencias de un PrP que desempeña un papel en la formación de
amiloides. Se demostró que un fragmento de PrP compuesto de
aminoácidos 106-126 era tóxico para las neuronas
hipocampales de rata (Forloni et al. 1993), para las células
cerebelares y corticales de ratón (Brown et al., 1994; 1997),
y que era particularmente altamente fibrilogénico (Selvaggini et
al. 1993). Las fibrillas formadas eran parcialmente resistentes
a la digestión de proteasas y mostraron propiedades de amiloides
in situ (Selvaggini et al. 1993, Tagliavini et
al. 1993). Péptidos sintéticos correspondientes a esta región de
PrP exhibieron flexibilidad conformacional desde una conformación
\beta-hélice a una conformación
\beta-lámina (Selvaggini et al. 1993) que
era similar a cambios conformacionales de PrPC a PrP^{Sc}. La
plasticidad conformacional de esta región queda más resaltada aún en
los hallazgos de dos cepas de priones distintas que muestran
diferentes sitios de desdoblamiento proteolítico en esta región
(Bessen and Marsh, 1994; Telling et al., 1996).
Como se describe más adelante, los autores de la
presente invención han generado mAbs específicos para epítopos
formados por los aminoácidos 106-126 de la proteína
PrP. Dichos anticuerpos son útiles para estudiar la morfología y
la
formación de placas y como posibles agentes para tratar o impedir las enfermedades de placas generadas por priones.
formación de placas y como posibles agentes para tratar o impedir las enfermedades de placas generadas por priones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron ratones inmunizados con un péptido
sintético correspondiente a la secuencia de aminoácidos del PrP
106-126 humano acoplado al soporte más grande KLH
para generar anticuerpos monoclonales reactivos contra epítopos en
este péptido. El suero derivado de los ratones inmunizados fue
sometido a ELISA y se detectaron y aislaron varios clones positivos
compuestos principalmente de moléculas (IgM) de inmunoglobulina M y
en menor medida de moléculas IgG.
Dos clones de inmunoglobulina que fueron
aislados como se describe arriba y denominados mAbs
3-11 (IgM) y mAb 2-40 (IgG1) fueron
utilizados en otros estudios.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
16
Bibliotecas de presentación de fagos presentando
varios fragmentos de péptido del polipéptido PrP
106-126 humano fueron generadas como se describe más
arriba en la sección de métodos. No se detectaron clones reactivos a
mAbs 3-11 o mAb 2-40 (para cada
biblioteca) después de 6 ciclos de selección de fagos por afinidad
en biblioteca (368 clones explorados) planteando la posibilidad de
que los epítopos que son reconocidos por estos anticuerpos sean de
una naturaleza conformacional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
17
Los anticuerpos anteriormente descritos
anti-PrP 106-126 fueron
pre-incubados con un péptido de una secuencia de
aminoácidos NMKH (SEC Nº ID:26) a fracción equimolar antes de
reaccionar con el polipéptido PrP 106-126 a fin de
determinar la capacidad de NMKH de competir con PrP
106-126 humano en la unión de anticuerpos. Como se
indica en la Figura 28, esta secuencia se conserva en gran medida
entre secuencias de humanos y ratones (y otros) con la excepción de
dos aminoácidos diferentes, MI09 en lugar de L y M 112 en lugar de
Y. Estas dos diferencias aportan probablemente diferencias
antigénicas entre la secuencia humana y del ratón, ya que los
anticuerpos que se derivaron de ratones inmunizados con la secuencia
humana correspondiente a PrP 106-126 no mostraron
reactividad cruzada con la secuencia del ratón correspondiente al
péptido PrP 106-126.
No se detectó competencia (según análisis ELISA)
entre NMKH y todo el péptido, apoyando el indicio de que el epítopo
puede depender de conformación tridimensional y no de la estructura
primaria. Además, co-reaccionando mAb 3F4
(reconociendo la secuencia MKHM) y mAb 3-11 con PrP
106-126 no produjo una respuesta aditiva, haciendo
pensar que sus epítopos pueden ser adyacentes o superpuestos
(Solomon y Balas, 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
18
La incubación de PrP 106-126 a
37ºC a diferentes concentraciones condujo a una agregación fibrilar
dosis dependiente medida por el ensayo de fluorescencia de unión con
Tioflavina T (Figura 30). Se seleccionó una concentración PrP
106-126 de 0.3 mg/ml para otros estudios.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
19
Dado que el principal órgano de destino de
PrP^{Sc} es el sistema nervioso, se utilizaron sistemas de modelo
neuronal in vitro para analizar la toxicidad PrP. Se
estableció una línea celular clonal que muestra propiedades
neuronales a partir de tumores del sistema nervioso central de ratas
(Schubert et al. 1974). Se ha demostrado que las células PC
12 de feocromocitoma de rata - una línea de células tumorales
clonadas parecidas a neuronas (Greene y Tischler, 1976) - permiten
la replicación in vitro de PrP^{Sc} (Rubenstein et
al. 1984). En cuanto tal, esta línea de células fue utilizada en
el presente estudio como modelo para detectar moléculas con la
capacidad de impedir la toxicidad inducida por fibrillas PrP.
Utilizando este sistema de modelo, se descubrió
que PrP 106-126 es tóxico para células PC 12 de una
manera dosis dependiente, toxicidad que está relacionada con el
estado conformacional del péptido y con el tiempo de exposición de
las células al péptido agregado. La viabilidad celular disminuyó
considerablemente (tal como se detectó en ensayo MTT), cuando las
células fueron incubadas con PrP 106-126 durante 5
días en comparación con una exposición de 3 días. Además, la
preincubación de PrP 106-126 a 37ºC antes de su
adición a las células incrementó su toxicidad probablemente al
aumentar la cantidad de fibrillas amiloides. La preincubación del
péptido durante 7 días tuvo como resultado una toxicidad
notablemente más alta que era dependiente de la concentración
(Figura 29). En las condiciones descritas, la viabilidad celular se
redujo el 10% a una concentración de 100 \muM de PrP
106-126 tal como fue medido en ensayo MTT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
20
El efecto citoprotector de mAb
3-11 y 2-40 está indicado en la
Figura 31. Mabs 3-11 y 2-40
inhibieron la muerte celular que fue inducida por 100 \muM de PrP
106-126. La viabilidad de células tratadas con una
mezcla de anticuerpos y el péptido fue del 85-89%,
en comparación con el índice de supervivencia del 40% de las células
tratadas sólo con el péptido (Los anticuerpos sin el péptido no
tuvieron efecto sobre la viabilidad celular). El efecto protector de
los anticuerpos estaba aparentemente relacionado con el epítopo
específico de la molécula PrP, dado que dicha protección no fue
demostrada con mAb 3F4 (viabilidad 44%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
21
La formación de fibrillas amiloides de PrP
106-126 fue detectada por un ensayo de unión con
tioflavina-T. Ambos mAbs 3-11 y
2-40 impidieron la agregación fibrilar y
desagregaron la forma agregada de este péptido. Se observó una
disminución significativa en la formación de fibrillas amiloides
(80% aproximadamente de prevención) cuando el PrP
106-126 fue incubado a 37ºC en presencia de los mAbs
3-11 y 2-40. Cuando se añadieron
estos anticuerpos a agregados ya formados de PrP
106-126, más del 50% de las fibrillas se
desagregaron. En cambio, mAb 3F4 tuvo menor eficacia tanto para
inhibir la formación de fibrillas amiloides como para inducir su
desagregación (Figura 32). Tanto la inhibición de la formación de
fibrillas amiloides como la inducción de desagregación fueron
dependientes de la concentración de anticuerpos y de la localización
del epítopo (Figuras 32-33).
El efecto protector de mAbs 3-11
y 2-40 de la presente invención y de mAb 3F4 fue
calculado tal como se indica en la Ecuación 1 siguiente:
Ecuación
1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCTCCG AACGTSNATG GGTAACTCGA TCGCTGATGG CAGTA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTATGCGG CCCAGCCGGC CATG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTGCTGA GTGGATCCTA TACTACACTG CCACCGGG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTCCGATG CTGAATTCGG TGATAGCGGC TACGAAGTGC ATCATCAGAA ACCTGCAG
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTTTCTGAT GATGCACTTC GTAGCCGCTA TCATGACGAA ATTCAGCATC GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAsn Met Lys His
\hfill
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAsn Met Lys His
\hfill
Claims (30)
1. Composición farmacéutica, que comprende un
soporte farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un
vehículo viral de presentación que es una partícula viral no apta
para la propagación in vivo, vehículo de presentación que
presenta un polipéptido, donde dicho polipéptido comprende al menos
un epítopo del beta-amiloide (A\beta), y donde
dicho epítopo genera anticuerpos de unión con A\beta contra dicho
epítopo durante la administración a un sujeto y donde dichos
anticuerpos inhiben la agregación de dicho
beta-amiloide.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde dicha partícula viral no apta para la
propagación in vivo se elige en el grupo que consiste en una
partícula viral de ADN bicatenario no apta para la propagación in
vivo, una partícula viral de ADN monocatenario no apto para la
propagación in vivo, una partícula viral de ARN de cadena
positiva no apta para la propagación in vivo y una partícula
viral de ARN de cadena negativa no apta para la propagación in
vivo.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicha partícula viral
no apta para la propagación in vivo es una partícula de
bacteriófago no apta para la propagación en vivo.
4. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde dicha partícula viral no
apta para la propagación in vivo se elige de forma que, menos
de 30 días después de una introducción de una triple dosis de
10^{10} unidades de ésta en el receptor, un título de dichos
anticuerpos sea superior a 1:50 000, de la manera determinada por el
análisis ELISA.
5. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde dicho epítopo es EFRH
(SEC Nº ID: 1), DAEFRH (residuos 1-6 de SEC Nº ID:
3), DAEFRHD (residuos 1-7 de la SEC Nº ID: 3), o
DAEFRHDSG (residuos 1-9 de la SEC Nº ID: 3).
6. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde dicho epítopo comprende
EFRH (SEC Nº ID: 1).
7. Utilización de una composición farmacéutica
según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la
producción de un medicamento destinado al tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer.
8. Utilización según la reivindicación 7, donde
dicha partícula viral no apta para la propagación in vivo se
elige en el grupo que consiste en un partícula viral de ADN
bicatenario no apta para la propagación in vivo, una
partícula viral de ADN monocatenario no apta para la propagación
in vivo, una partícula viral de ARN de cadena positiva no
apta para la propagación in vivo y una partícula viral de ARN
de cadena negativa no apta para la propagación
in vivo.
in vivo.
9. Utilización según la reivindicación 7, donde
dicha partícula viral no apta para la propagación in vivo es
una partícula de bacteriófago no apta para la propagación en
vivo.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer de aparición precoz.
11. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer de aparición tardía.
12. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer presintomática.
13. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, donde dicho medicamento está destinado a la
introducción en el organismo del receptor de manera que se inhiba la
agregación del beta-amiloide por aplicación de dicha
partícula viral no apta para la propagación in vivo en el
sistema olfativo del receptor.
14. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 13, donde dicho epítopo es EFRH (SEC Nº ID: 1),
DAEFRH (residuos 1-6 de la SEC Nº ID: 3), DAEFRHD
(residuos 1-7 de la SEC Nº ID: 3), o DAEFRHDSG
(residuos 1-9 de la SEC Nº ID: 3).
15. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, donde dicho epítopo comprende EFRH (SEC Nº
ID: 1).
16. Agente que comprende un vehículo viral de
presentación que es una partícula viral no apta para la propagación
in vivo, vehículo de presentación que presenta un
polipéptido, donde dicho polipéptido comprende al menos un epítopo
de beta-amiloide (A\beta), y donde dicho epítopo
genera anticuerpos de unión con A\beta contra dicho epítopo
durante la administración a un sujeto y donde dichos anticuerpos
inhiben la agregación de dicho beta-amiloide.
\newpage
17. Agente según la reivindicación 16, donde
dicha partícula viral no apta para la propagación in vivo se
elige en el grupo que consiste en una partícula viral de ADN
bicatenario no apta para la propagación in vivo, una
partícula viral de ADN monocatenario no apta para la propagación
in vivo, una partícula viral de ARN de cadena positiva no
apta para la propagación in vivo y una partícula viral de ARN
de cadena negativa no apta para la propagación in vivo.
18. Agente según la reivindicación 16 o la
reivindicación 17, donde dicha partícula viral no apta para la
propagación in vivo es una partícula de bacteriófago no apta
para la propagación en vivo.
19. Agente según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, donde dicha partícula viral no apta para
la propagación in vivo se elige de manera que, menos de 30
días después de una introducción de una triple dosis de 1010
unidades de ésta en el receptor, un título de dichos anticuerpos sea
superior a 1:50 000, de la manera determinada por el análisis
ELISA.
20. Agente según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, donde dicho epítopo es EFRH (SEC Nº ID:
1), DAEFRH (residuos 1-6 de la SEC Nº ID: 3),
DAEFRHD (residuos 1-7 de la SEC Nº ID: 3), o
DAEFRHDSG (residuos 1-9 de la SEC Nº ID: 3).
21. Agente según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, donde dicho epítopo comprende EFRH (SEC Nº
ID: 1).
22. Utilización de un agente según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en la producción de un
medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
23. Utilización según la reivindicación 22,
donde dicha partícula viral no apta para la propagación in
vivo se elige en el grupo que consiste en una partícula viral de
ADN bicatenario no apta para la propagación in vivo, una
partícula viral de ADN monocatenario no apta para la propagación
in vivo, una partícula viral de ARN de cadena positiva no
apta para la propagación in vivo y una partícula viral de ARN
de cadena negativa no apta para la propagación in vivo.
24. Utilización según la reivindicación 22,
donde dicha partícula viral no apta para la propagación in
vivo es una partícula de bacteriófago no apta para la
propagación in vivo.
25. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer de aparición precoz.
26. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer de aparición tardía.
27. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, donde la enfermedad de Alzheimer es la
enfermedad de Alzheimer presintomática.
28. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 27, donde dicho medicamento está destinado a
la introducción en el organismo del receptor de manera que se inhiba
la agregación de beta-amiloide aplicando dicha
partícula no apta para la propagación in vivo en el sistema
olfativo del receptor.
29. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 28, donde dicho epítopo es EFRH (SEC Nº ID:
1), DAEFRH (residuos 1-6 de la SEC Nº ID: 3),
DAEFRHD (residuos 1-7 de la SEC Nº ID: 3), o
DAEFRHDSG (residuos 1-9 de la SEC Nº ID: 3).
30. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 29, donde dicho epítopo comprende EFRH (SEC Nº
ID: 1).
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