ES2343934B1 - Sistema de androesterilidad genico-citoplasmica en trigo. - Google Patents
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Abstract
Sistema de androesterilidad
génico-citoplásmica en trigo.
Semilla, célula, y grupo de células con
androesterilidad génico-citoplasmática que
incorporan genes restauradores de la fertilidad procedentes de
cromosomas de Hordeum chilense. Dichas células dan lugar o
son parte de plantas que forman la línea restauradora, e integran en
su material genético un fragmento del cromosoma 1H^{ch}, una doble
monosomía para 6H^{ch} y 6D, y/o la traslocación
6H^{ch}S/6DL.
Description
Sistema de androesterilidad
génico-citoplásmica en trigo.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biotecnología y, concretamente dentro de la mejora
genética vegetal. Se refiere a una célula vegetal con
androesterilidad génico-citoplasmática que incorpora
genes restauradores de la fertilidad procedentes de cromosomas de
Hordeum chilense. Dichas células dan lugar o son parte de
plantas que forman la línea restauradora, e integran en su material
genético un fragmento del cromosoma 1H^{ch}, una doble monosomía
para 6H^{ch} y 6D, y/o la traslocación 6H^{ch}S/6DL.
Uno de los métodos de Mejora Genética Vegetal
(MGV) más eficaces, que ha revolucionado la industria de las
semillas gracias principalmente a la ingeniería genética y química,
y objeto de numerosas patentes (EP 0,771,523 B2; EP 0,923,283 B1; EP
0,630,403 B1; US 7,164,058 B2), ha sido la producción de células
vegetales que den lugar a líneas de plantas androesteriles. Dichas
líneas androesteriles permitirían el establecimiento, junto con
otras líneas, de sistemas que permiten la obtención de variedades
híbridas. Las variedades híbridas de este tipo se denominan también
híbridos F1 y son, además de más productivas (un alto rendimiento de
las partes de la planta que pueden comercializarse, tales como
frutos y similares), debido a lo que se denomina "vigor
híbrido", más homogéneas (uniformidad en el color, sabor, tamaño
y similares), resultando en un mayor rendimiento del cultivo y en
una calidad uniforme del mismo.
El híbrido comercial es el producto del
cruzamiento entre dos líneas puras que se han seleccionado por su
capacidad para expresar heterosis. La combinación óptima ha sido
resultado de un proceso costoso y, como siempre en MGV, largo, de
evaluación en campo de decenas de miles de cruzamientos. En el
desarrollo del híbrido y en su producción comercial, salvo en
contados casos, la castración no es rentable hacerla manualmente
(castración mecánica o eliminación de las anteras, llamada también
emasculación). Los procedimientos que se utilizan son: la castración
química (sustancias que eliminan o inactivan los gametos
masculinos), la genética (nuclear) y la
génico-citoplásmica. Esta última es la que ha tenido
mayor éxito comercial.
Existen dos tipos principales de esterilidad
masculina genética que pueden ser explotados para la producción de
semillas híbridas en trigo: esterilidad masculina citoplasmática
("CMS") en líneas de substitución nuclear o aloplásmicas,
causada por la interacción incompatible de un citoplasma extraño con
el núcleo del trigo común, y esterilidad masculina génica
("GMS") en líneas euplásmicas, causada por una mutación
recesiva o una deleción de un gen(es) nuclear(es) que
normalmente confiere esterilidad masculina en el citoplasma del
trigo común. La CMS, que implica a un citoplasma extraño,
normalmente reduce la capacidad de rendimiento del híbrido, mientras
que la GMS, que implica a un citoplasma nativo, debería permitir una
expresión normal del genoma y, por ello, una capacidad total de
rendimiento del híbrido.
En el año 1962 Wilson and Ross describen que la
transferencia del núcleo del trigo harinero al citoplasma de
Triticum timopheevii (aloplasmia) induce esterilidad
masculina citoplasmática (CMS) manteniendo el resto de
características del trigo. Este descubrimiento provocó la búsqueda
de genes restauradores y fuentes alternativas de androestrilidad
génico-citoplásmica, con el objetivo último de
producir híbridos comerciales de trigo. La línea aloplásmica se
denomina Línea A, la línea portadora de los genes restauradores es
la Línea R y se denomina Línea B a la línea genéticamente idéntica a
A pero en el citoplasma original, que es por tanto autofértil. La
semilla híbrida se obtiene sembrando próximas las líneas A y R, y
recogiendo la semilla híbrida en la línea A. La línea A se mantiene
polinizándola con la
línea B.
línea B.
La revisión más completa sobre trigo híbrido que
existe es la de Pickett (Adv. Plant Breed., Suppl. J. Plant Breed.,
15, 1-259, 1993). En esta revisión se describen los
efectos sobre el trigo de 20 citoplasmas de los géneros Triticum,
Aegilops, Haynaldia y Secale. La conclusión es la misma que la
propuesta con anterioridad por otros autores; el citoplasma más útil
para producir semilla híbrida de trigo es el de Triticum
timopheevii, fundamentalmente por la ausencia de efectos
deletéreos frecuentes en otros sistemas (Virmani & Edwards,
Advances in Agronomy 36, 1983).
Las líneas con esterilidad masculina
citoplasmática (CMS) tienen una mutación en su genoma mitocondrial y
la esterilidad masculina se hereda como un carácter dominante,
transmitido por línea materna. La CMS puede ser empleada para la
producción de semillas híbridas solo si:
- 1-
- Están disponibles mutantes CMS en un cereal dado,
- 2-
- Están disponibles los genes de restauración (nucleares) para restaurar la fertilidad de las líneas CMS cuando las semillas son el producto cosechado,
- 3-
- La mutación CMS no está asociada a una penalización.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, el desarrollo de un sistema de
androesterilidad génico-citoplásmica en trigo
implica la obtención de una línea euplásmica, la obtención de líneas
androestériles de trigo (líneas aloplásmicas), y la obtención de
líneas restauradoras (Líneas R) seleccionando para la presencia de
los genes restauradores de la fertilidad en la F1, lo que implica el
descubrimiento e incorporación de genes restauradores (genes
Rf).
Existe una larga lista de genes Rf en trigo
distribuidos en los tres genomas (ABD) del trigo, casi siempre
procedentes de la especie donante del citoplasma (tabla 1), por lo
que abundan los procedentes de T. timopheevii y es frecuente
que estén localizados en los brazos cortos de los cromosomas del
grupo 1 y 6. Se han descrito varios brazos cromosómicos en el trigo
común que llevan genes que afectan a la fertilidad masculina, por
ejemplo brazos cromosómicos del grupo 4: el brazo largo del
cromosoma 4A (4AL), el brazo corto del cromosoma 4B (4BS) y el brazo
corto del cromosoma 4D (4DS), que llevan los genes normales de
fertilidad masculina Ms-A1, Ms-B1
y Ms-D1, respectivamente, y los brazos largos de
los cromosomas del grupo 5: 5A, 5B y 5D (5AL, 5BL y 5DL,
respectivamente), que llevan los genes Ms-A2,
Ms-B2 y Ms-D2, respectivamente.
Sin embargo, hasta ahora, sólo encontraron o introdujeron en el
locus Ms-B1, en la región distal del brazo
cromosómico 4BS (antes 4AS) había tres alelos recesivos que causan
esterilidad masculina. Se dijo que estos alelos, a saber,
ms-B1-a,
ms-B1-b y
ms-B1-c (con frecuencia
también llamados ms1a, ms1b y mslc, respectivamente), no causaban
efecto alguno, más allá de la esterilidad masculina, sobre el
rendimiento de la planta (revisado por Wilson & Driscoll,
1983).
\vskip1.000000\baselineskip
Hordeum chilense (2n=2x=14,
H^{ch}H^{ch}) es una cebada silvestre sudamericana que ha sido
utilizada como parental femenino para la síntesis de anfiploides
llamados tritórdeos (Martín, Journal of Cereal Science, 30,
85-95, 1999). Estos tienen por tanto citoplasma de
cebada. Retrocuzado el tritórdeo octoploide (H^{ch}H^{c}AABBDD)
repetidamente con trigo harinero (2n=6X=42, AABBDD) se genera una
línea aloplásmica androestéril, su núcleo tiene la constitución
genómica AABBDD del trigo y el citoplasma de la cebada, parental
femenino del anfiploide. En el proceso de obtención, antes de la
eliminación total de los cromosomas de la cebada, algunas líneas son
fértiles. Recientemente se ha descubierto que el brazo corto del
cromosoma 6H^{ch}S es responsable de esta restauración (Martín
et al. 2008. Australian Journal of Agricultural
Science 59 (3): 206-213). Sin embargo, en
hemiciqosis esta adición no es un restaurador efectivo, por lo
que en principio no parece interesante.
Es necesario, por tanto, encontrar un mecanismo
efectivo que permita la obtención de una línea restauradora de la
fertilidad en trigo que permita la producción de semillas
híbridas.
Los autores de la presente invención han
desarrollado una línea restauradora de la fertilidad en trigo,
construida mediante la introgresión en trigo de los factores
restauradores procedentes de H. chilense. Aunque en
hemicigosis la adición del brazo corto del cromosoma 6H^{ch}S no
es un restaurador efectivo, se ha visto que plantas doble
monosómicas 6H^{ch} 6D son fértiles, así como aquellas que
presentan la traslocación 6H^{ch}S/6DL. Además, un cromosoma
1H^{ch} con una delección casi de la totalidad del brazo largo
también restaura la fertilidad y es efectivo en hemicigosis.
Esta línea permite la producción de semillas
híbridas de trigo mediante el establecimiento de tres líneas: una
línea euplásmica, es un trigo harinero normal, la línea aloplásmica
de trigo en citoplasma de H. chilense (obtenida cruzando
tritórdeo ó anfiploide Hordeum chilense-trigo por trigo,
hasta la eliminación de todos los cromosomas de cebada, y la línea
restauradora. La línea aloplásmica se propaga mediante polinización
con la línea mantenedora, por lo que toda la progenie presenta
esterilidad masculina, puesto que el citoplasma se deriva del
parental femenino. Estas plantas con esterilidad masculina pueden
por tanto, ser empleadas como parentales femeninos en los
cruzamientos híbridos con la línea restauradora, sin la necesidad de
la emasculación física de las partes reproductivas masculinas del
parental femenino. La presencia de un gen restaurador de la
fertilidad masculina en la línea restauradora, da lugar a una
progenie híbrida F1 completamente fértil. Si en el parental
masculino no hay ningún gen restaurador de la fertilidad, se
obtienen híbridos con esterilidad masculina, útiles si los tejidos
vegetativos de la planta fueran los más apreciados, pero no cuando
la semilla es la parte más valorada de la planta.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a una semilla de trigo, de aquí en adelante semilla de trigo
de la invención, caracterizada por que su material genético
comprende:
- a.
- un fragmento del cromosoma 1H^{ch} de Hordeum chilense,
- b.
- una doble monosomía para 6H^{ch} y 6D,
- c.
- la traslocación 6H^{ch}S/6DL,
o cualquiera de sus combinaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia en el material genético de la
semilla de más de uno de estos factores (el fragmento del cromosoma
1H^{ch} de Hordeum chilense, una doble monosomía para
6H^{ch} y 6D o la traslocación 6H^{ch}S/6DL) hace que se obtenga
una línea restauradora mucho más efectiva que si sólo se encuentra
presente uno de estos factores.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, el material genético de la semilla de la invención
comprende la introgresión del fragmento del cromosoma 1H^{ch}
responsable de la restauración en hemicigosis y el brazo corto del
cromosoma 6H^{ch}.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
célula de trigo, de ahora en adelante célula de trigo de la
invención, caracterizada por que su material genético comprende:
- a.
- un fragmento del cromosoma 1H^{ch} de Hordeum chilense,
- b.
- una doble monosomía para 6H^{ch} y 6D,
- c.
- la traslocación 6H^{ch}S/6DL,
o cualquiera de sus combinaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, el material genético de la célula de la invención
comprende la introgresión del fragmento del cromosoma 1H^{ch}
responsable de la restauración en hemicigosis y el brazo corto del
cromosoma 6H^{ch}.
Se entiende por "trigo" en esta memoria, la
especie aestivum del Género Triticum, Tribu
Triticeae, Subfamilia Pooideae, Familia
Poaceae, Orden Poales, Clase Liliopsida, Phylum
Streptophyta, Reino Viridiplantae. Por
"traslocación" se entiende el intercambio entre dos o más
cromosomas.
En otro aspecto de la invención se proporciona
una planta de trigo, de ahora en adelante planta de trigo de la
invención, que comprende una pluralidad de células de trigo de la
invención, y/o producida tras el crecimiento de la semilla de trigo
de la invención.
Otro aspecto se refiere a un cultivo de células
de trigo de la invención, capaz de regenerar la planta de trigo de
la invención. En una realización preferida de este aspecto, las
células del cultivo de la invención proceden de embriones, células
meristemáticas, polen, hojas, raíces, raíz inclina, antera, pistilo,
flor, semilla, vaina o vástago de la planta de la invención.
El término "cultivo de células" en esta
memoria, hace referencia a un cultivo de células aisladas del mismo
o diferente tipo de tejido, o una colección de tales células
organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos
tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo,
cultivos de protoplastos, calli (grupo de callus o células vegetales
indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y células
vegetales que están aisladas de plantas o partes de las plantas,
tales como embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen,
hojas o anteras.
\newpage
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un grano de polen cuyo material genético es un derivado haploide del
material genético de la célula de trigo de la invención.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
método para producir semillas de trigo híbrido que comprende:
- a.
- obtener una línea euplásmica formada por plantas híbridas entre Hordeum chilense y Triticum sp.
- b.
- obtener una línea aloplásmica formada por plantas de trigo con androsterilidad génico-citoplasmática.
- c.
- obtener una línea restauradora androesteril formada por plantas de trigo de la invención.
- d.
- cruzar la línea obtenida en b) con la línea obtenida en c).
\vskip1.000000\baselineskip
Los híbridos entre Hordeum chilense y
trigo pueden obtenerse emasculando espigas de H. chilense y
polinizándolas con polen de trigo, al día siguiente de la
polinización se aplica una solución de ácido giberélico a 75 ppm y a
las tres semanas se rescata el embrión y se cultiva in vitro,
obteniéndose el híbrido. La duplicación cromosómica de éste da lugar
al anfiploide, el tritórdeo octoploide.
La línea aloplásmica se obtiene retrocuzando el
tritórdeo octoploide (H^{ch}H^{ch}AABBDD) repetidamente con
trigo harinero (2n=6X=42, AABBDD. La entrada de Hordeum
chilense a utilizar debe ser la línea H1 de la colección del
Instituto de Agricultura Sostenible. Otras entradas de la colección
pueden no producir androesterilidad de la línea aloplásmica.
La línea restauradora se podría obtener, pero
sin limitarnos, retrocuzando el tritórdeo octoploide
(H^{ch}H^{ch}AABBDD) repetidamente con trigo harinero (2n=6X=42,
AABBDD) y seleccionando con marcadores moleculares, como los
descritos en las figuras, para la presencia de los cromosomas
1H^{ch} y 6H^{ch}.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Productos de amplificación por PCR
usando el marcador ETS k01062 que amplifica específicamente el
cromosoma 6H^{ch}S en H. chilense y no produce un producto
de amplificación en trigo. La adición ditelosómica T21 de 6H^{ch}S
(T21AH1-11) se usa como control positivo. La linea
restauradora T593 es amplificada por este par de cebadores,
confirmando que el brazo del cromosoma 6H^{ch}S es responsable de
la restauración de la ferti-
lidad.
lidad.
Fig. 2. Hibridación in situ de las
células de los ápices de las raíces en metafase, de la línea
restauradora T593 (42 + 6H^{ch}S 6H^{ch}S). (a) GISH usando una
sonda de ADN genómico de H. chilense H1 (detectada con
antidigoxigenina-FITC). El ADN de los cromosomas de
trigo se detecta por tinción DAPI. (b) Señales doble FISH usando la
sonda pTa71 (detectada con streptavidina-Cy3) y una
sonda de ADN genómico de H. chilense H1 (detectada con
antidigoxigenina-FITC). Los cromosomas 6H^{ch}S
muestran un intenso brillo y también son detectados por las sondas
pTa71 (se encuentran indicados con flechas).
Fig. 3. Productos de amplificación por PCR
usando el par de cebadores consenso de cloroplasto
SSR-4. Se distingue un polimorfismo de 25 pb entre
los genomas cloroplásticos del trigo harinero y del H.
chilense. Fragmentos de amplificación de la línea de esterilidad
masculina aloplásmica T218 y de la línea restaurada fértil T593
confirman que llevan el citoplasma H1 y que no hay transmisión del
citoplasma parental.
Fig. 4. Desarrollo de la gametogénesis del polen
en las líneas fértiles T21 and T593 (A1-A5) y en la
línea estéril masculina T218 (B1-B5). (A1, B1)
Estado de tétrada normal después de la meiosis II en plantas con
esterilidad y fertilidad masculina. A2, B2. Se observan microsporas
uninucleadas tempranas normales tanto en los genotipos de
esterilidad como en los de fertilidad masculina. (A3) Microsporas
uninucleadas tardías normales durante la vacuolación de microsporas
en líneas fértiles. (A4) Granos de polen binucleados con núcleos
vegetativo y generativo perfectamente formado en genotipos fértiles.
(B4) Diferentes estados de generación de microsporas del genotipo de
esterilidad masculina en una sola antera. (A5) Granos de pollen
trinucleados normales en antesis. (B5) Ejemplos de diferentes
estados de degeneración al final de la microgametogénesis en la
línea de esterilidad masculina.
Fig. 5. Desarrollo del polen androestéril (parte
superior) y el fértil (parte inferior).
\newpage
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto el valor de los cromosomas 1H^{ch} y/o 6H^{ch}S, y de
la traslocación 6H^{ch}S/6DL) como restauradores de la fertilidad
de la línea aloplásmica.
Se obtuvo el tritordeo HT21 (2n = 8x = 56,
H^{ch}H^{ch}AABBDD) después de la hibridación de H.
chilense H1 (2n = 2x = 14, H^{ch}H^{ch}) con T.
aestivum cv. Chinese Spring, renombrado como T21 (2n = 6x = 42,
AABBDD).
Dos espigas de H. chilense fueron
emasculadas y justo antes de la polinización los vástagos se
introdujeron en un cultivo con una solución nutriente a la que se ha
añadido ácido giberélico en una proporción de 75 p.p.m. Las espigas
fueron polinizadas con polen de T. aestivum cv. Chínese
Spring y posteriormente mantenidas en un ambiente controlado a 20ºC
y luz continua. La solución del cultivo fue renovada en intervalos
de 2 días con la solución stock sin ácido giberélico. Las espigas de
cebada fueron protegidas con bolsas de polietileno ventiladas.
Se desarrolló un único grano en cada espiga. 16
días después de la polinización el grano fue extraído y se cultivó
el embrión del mismo por el procedimiento estándar en agar orquídea.
El conteo de los cromosomas en la raíz mostró que la planta tenía 28
cromosomas, como era de esperar de un híbrido de
cebada-trigo.
Las espigas de la planta híbrida son
esencialmente como las del trigo, pero más largas y más laxas que
las de la variedad Chínese Spring y, como en H. chilense, con
aristas cortas tanto en las glumas como en las lemas. El híbrido fue
tratado con colchicina al 0.3% por la técnica del decapitado y
algunas espigas dieron granos por autofecundación.
El anfiploide así obtenido, HT21, fue
recurrentemente cruzado con el parental de trigo T21, obteniendo una
línea aloplásmica llamada T218 (AABBDD). Esta línea portaba el
citoplasma de H. chilense, siendo totalmente estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
T218 fue polinizado y cruzado con el set de
líneas de cromosomas de adición en Chínense Spring. El híbrido
derivado del cruzamiento T218 x T21 de adición disómioca de
6H^{ch}S (brazo corto del cromosoma 6H^{ch}) fue retrocruzado de
nuevo como parental materno para la adición disómica de 6H^{ch}S.
La adición ditelosómica de 6H^{ch}S en T218 fue seleccionada y
denominada T593 (AABBDD + 6H^{ch}S 6H^{ch}S).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de investigar si otros genes
restauradores de la fertilidad eran capaces de restaurar la
fertilidad de la línea aloplásmica, T218 fue cruzado con 25 líneas
restauradoras de tres fuentes USDA, ARS, Aberdeen (PI 473558, PI
473559, PI 591553, PI 591554, PI 591555, PI 591556, PI 554584, Citr
17452, PI 383343, PI 383344, PI 473548, PI 473549, PI 473551, PI
473552, PI 473553, PI 473555 y PI 473556), CIMMYT (337405, 332258,
332231 y 332197) y líneas proporcionadas por el Dr. Chen, School of
Biological Technology and Engineering, Guizhou Normal University,
China (QR720, QR715, QR650 y QR3). Los híbridos se crecieron durante
dos años sucesivos y nunca se observó restauración de la
fertilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el conteo de los cromosomas somáticos, se
recolectaron porciones de 1 cm de longitud de las raíces de semillas
germinadas y pretratadas durante 4 horas en una solución acuosa de
colchicina (0.05%) a 25ºC. Fueron fijadas en una mezcla recién hecha
de 3 partes de etanol absoluto: 1 parte de ácido acético glacial
(v/v) y teñida por la técnica convencional de Feulgen.
Se estudió la microesporogénesis en diferentes
estados de desarrollo. Las espigas cortadas se introducen en una
mezcla de 3 partes de alcohol absoluto: 1 parte de ácido acético
glacial con unas gotas de cloruro de hierro (1 ml de una solución
acuosa saturada de cloruro de hierro por 200 ml de la mezcla 3:1).
El material fue transferido a alcohol de 90, tras
1-2 horas y guardado a 4ºC. Las anteras fueron
teñidas con acetocarmin al 0.1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo el ADN de plantas de 5 a 6 semanas,
de las líneas T218, T593, T21 y H1, de acuerdo con el protocolo de
Doyle and Doyle (1990). Para verificar la presencia del citoplasma
de H. chilense en las líneas aloplásmicas se emplearon las
secuencias consenso de cloroplastos ccSSR-4
desarrolladas por Chung & Staub (2003). Se llevó a cabo la PCR
(polymerase chain reaction) en 25 \mul de mezcla de
reacción como se describe en Chung & Staub (2003). Se empleó el
marcador ETS (expressed sequence tag) k01062 (Hagras et
al. 2005; Nasuda et al. 2005) para identificar el
cromosoma en la línea restauradora. La PCR se llevó a cabo como se
describe en Nasuda et al. (2005). Todos los productos de
amplificación fueron resueltos por electroforesis en gel de agarosa
y visualizados con bromuro de etidio.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extremos de las raíces fueron preparados
como se describe en la sección de observación citológica. Las
preparaciones se hicieron como se describe por Prieto et al.
(2001). La sonda pTa7, que contiene una unidad de
18S-5.8S-26S rDNA (8.9 kb) de T.
aestivum (Gerlach & Bedbrook 1979) fue marcada por
transcripción con biotin-11-dUTP
(Roche Corporate, Basel, Switzerland) y mezclada en la solución de
hibridación hasta la concentración final de 5 ng/\mul. Tras el
examen de los núcleos hibridados con su sonda de ADN respectiva, las
preparaciones fueron re-sondadas usando el genoma
total de H. chilense como sonda. El ADN total de H.
chilense fue marcado por trascripción con
digoxigenina-11-dUTP. El protocolo
de hibridación in situ fue el de Cabrera et al.
(2002). Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina fueron
detectadas con antidigoxigenina-FITC (Roche
Corporate) y conjugados de streptavidina-Cy3 (Sigma,
St. Louis, MO, USA), respectivamente. Los cromosomas fueron teñidos
y contados con DAPI
(4',6-diamidino-2-fenilindol)
339 y montados en Vectashield (Vector Laboratories, Inc.). Se
visualizaron usando un microscopio de epifluorescencia Leica. Las
imágenes se capturaron con una cámara SPOT CCD usando el software
SPOT 2.1(Diagnostics Instruments, Inc., Sterling Heights, MI,
USA) y procesado con el software Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc.,
San José, CA, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó un experimento con diseño al azar con
5 repeticiones en condiciones de invernadero, para evaluar la
morfología y fertilidad de Chínese Spring (T21), la adición
ditelosómica de 6H^{ch}S T21, la línea aloplásmica T218 y la línea
restauradora T593. Se cultivaron 5 plantas de cada fenotipo en
invernadero de diciembre a abril. Se mantuvo la temperatura en
invernadero entre 7 y 25ºC (noche/día), y se suplemento la luz para
mantener un fotoperiodo de 13 horas diarias. Se tomaron los datos de
la altura de la planta, aristas por planta, espiguillas por espiga y
semillas por planta, y se llevó a cabo un análisis de la varianza
usando el método de la diferencia menos significativa (l.s.d.)
(P \leq 0.05).
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el proceso de obtención de la línea
aloplásmica T21 en el citoplasma de H1, algunas plantas con
cromosomas remanentes de H. chilense llegaron a ser
parcialmente autofértiles. Con el fin de identificar los cromosomas
de H. chilense responsables de la restauración de la fertilidad
masculina, la línea T218 fue polinizada y cruzada con el set de
cromosomas de adición de las líneas de H1 en Chínese Spring (T21).
Se observó alguna fertilidad del polen en el híbrido de adición
ditelosómica de 6H^{ch}S derivado del cruzamiento de T218 x T21.
Este híbrido fue retrocruzado de nuevo con el ditelo 6H^{ch}S T21
y se seleccionó la adición ditelosómica de 6H^{ch}S en T218, que
se llamó T593. Esta línea fue completamente fértil.
Con el fin de verificar que el cromosoma
responsable de la restauración de la fertilidad fue 6H^{ch}S,
seleccionamos el marcador ETS k01062. La PCR con este marcador da un
amplificado diferente en trigo harinero y cebada (H. vulgare
cv. Betzes) (Nasuda et al. 2005), y es asignado al brazo
corto del cromosoma 6H en cebada. Más aún, se ha demostrado también
amplificado en el cromosoma 6H^{ch} en H. chilense (Hagras
et al. 2005). EST k01062 fue amplificado para el propósito
del presente trabajo en líneas T21, H1, T218, T593, y la adición
disómica de 6H^{ch} en T21 (llamada T21AH1-11)
(Fig. 1). No se obtuvo ningún producto de amplificación cuando se
uso T21 y T218 como patrón, mientras que se obtuvo un producto de
unos 370 pb cuando se amplificaron las líneas 6H^{ch}S ditelo H1,
T593 y T21. Este resultado confirma que la adición del brazo del
cromosoma 6H^{ch}S es responsable de la restauración, y podría
implicar que el brazo del cromosoma 6H^{ch}S lleva al menos un gen
restaurador de la fertilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea fértil T593 también se caracterizó
mediante técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH),
hibridación in situ genómica (GISH) en T593, usando el ADN
genómico de H. chilense H1 como sonda, claramente detectó la
adición ditelosómica de los cromosomas de H. chilense. (Fig.
2). La sonda pTa71, que contiene una unidad de
18S-5.8S-26S rDNA (localizada en la
región organizadora nuclear de los cromosomas (NORs)) combinada con
la sonda de ADN genómico de H. chilense se empleó para
confirmar la presencia de la adición ditelosómica 6H^{ch}S en la
línea restauradora T593 (Fig. 2). La NOR en Hordeum se
localiza en los segmentos cromosómicos 5HS y 6HS, por lo que la
presencia de la señal de la sonda pTa71 en los cromosomas de H.
chilense confirma los resultados de los marcadores moleculares
en identificar la adición ditelosómica 6H^{ch}S.
Para comprobar que la restauración de la
fertilidad es consecuencia de la adición cromosómica 6H^{ch}S, y
no como resultado de la pérdida de aloplasmia (transmisión del
citoplasma paternal a la línea T593), se emplearon varios pares de
primers ccSSR, que detectan polimorfismos entre H. chilense y
Chínese Spring, que son fácilmente visualizables en electroforesis
en agarosa. Se ha visto que el cebador ccSSR-4 es
polimórfico, amplificando productos de 200 bp en trigo, y 225 bp en
el citoplasma H1 (Atienza et al. 2007c). La línea T593 fue
amplificada con esta pareja de primers, confirmando que era una
línea aloplásmica (Fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
La CMS de la línea aloplásmica T218, así como la
fertilidad de la línea restauradora T593, fueron estables bajo
diferentes condiciones ambientales: cámara de crecimiento,
invernadero y campo abierto. Cuando se compara con el trigo común,
las líneas aloplásmicas T218 y T593 tuvieron un retraso de
3-4 días en la anthesis cuando se crecieron en el
invernadero y en la cámara de crecimiento bajo condiciones de días
largos, aunque la diferencia fue de 7 días cuando se creció en campo
abierto. Aparte de la carencia de polen viable en la linea de
esterilidad masculina, las plantas no exhibieron otras anormalidades
florales o del desarrollo. Ninguna arruga o defecto de germinación
se observó en las semillas de las líneas aloplásmicas.
Los datos de la tabla 2 muestran los resultados
de comparar las líneas T21, T218, la adición ditelosómica de
6H^{ch}S a T21 y T593, en términos de morfología y fertilidad en
condiciones de invernadero. El ditelo 6H^{ch}S T21 fue incluido en
el cuadro para comparar T593 vs ditelo 6H^{ch}S T21, por ejemplo,
los mismos genotipos en los citoplasmas de H1 y T21,
respectivamente. Por esta comparación es posible un mejor análisis
del efecto del citoplasma H1. Se ha visto que la línea T218 era
alrededor de 18 cm más corta (en altura) que la T21. Sin embargo,
aunque se observó que la línea restauradora T593 era unos 10 cm más
corta que la T21, en este cuadro no se encontró diferencias
significativas, ni con la T21 ni con el ditelo 6H^{ch}S T21. El
número de aristas por planta no fue estadísticamente significativo
entre los genotipos. El número de espiguillas por espiga fue menor
en la línea con esterilidad masculina T218 que en cualquier otro
genotipo, mientras la línea restauradora T593 mostraba un valor
intermedio entre el T21 y el ditelo 6H^{ch}S T21. El número de
vástagos por planta no fue significativamente diferente entre los
genotipos. El número de espiguillas por espiga fue menor en la línea
con esterilidad masculina T218 que en cualquier otro genotipo,
mientras que la línea restauradora T593 muestra un valor intermedio
entre el T21 y el ditelo 6H^{ch}S T21. El grado de esterilidad en
la línea con esterilidad masculina T218 fue de un 100%, y la línea
restauradora T593 mostró aproximadamente un 68% de granos viables
comparado con T21, y un 77% comparado con el ditelo 6H^{ch}S
T21.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea estéril aloplásmica T218 se cruzó con
25 líneas restauradas de diferentes sistemas CMS de trigo para
testar su habilidad de restaurar la fertilidad. Ninguna de las
plantas F1 mostró ningún grado de fertilidad cuando se crecieron en
campo abierto. Se llevó a cabo un segundo experimento empleando 25
líneas en condiciones de invernadero, pero de nuevo, ninguna de las
plantas F1 mostró ningún grado de fertilidad.
Claims (5)
1. Célula de trigo caracterizada por que
su material genético comprende:
- a.
- un fragmento del cromosoma 1H^{ch} de Hordeum chilense,
- b.
- una doble monosomía para 6H^{ch} y 6D,
- c.
- la traslocación 6H^{ch}S/6DL,
o cualquiera de sus combinaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Célula de trigo según la reivindicación 1,
donde dicha célula procede de embriones, células meristemáticas,
polen, hojas, raíces, raíz inclina, antera, pistilo, flor, semilla,
vaina o vástago.
3. Cultivo de células que comprende la célula
según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Uso de la célula de trigo según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, o del cultivo de células según la
reivindicación 3, para regenerar una planta de trigo.
5. Método de obtención de una planta que
comprende la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2,
que comprende:
- a.
- obtener una línea euplásmica formada por plantas híbridas entre Hordeum chilense y Triticum sp.,
- b.
- obtener una línea aloplásmica formada por plantas de trigo con androsterilidad génico-citoplasmática,
- c.
- obtener una línea restauradora que comprende células según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha línea restauradora se identifica mediante la amplificación por PCR del marcador ETS k01062 que corresponde a un fragmento del cromosoma 6H^{ch}S de H. chilense, y
- d.
- cruzar la línea obtenida en b) con la línea obtenida en c).
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200803286A ES2343934B1 (es) | 2008-11-18 | 2008-11-18 | Sistema de androesterilidad genico-citoplasmica en trigo. |
| PCT/ES2009/070416 WO2010058048A1 (es) | 2008-11-18 | 2009-10-02 | Sistema de androesterilidad génico-citoplásmica en trigo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200803286A ES2343934B1 (es) | 2008-11-18 | 2008-11-18 | Sistema de androesterilidad genico-citoplasmica en trigo. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2343934A1 ES2343934A1 (es) | 2010-08-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| US20030014773A1 (en) * | 2001-06-04 | 2003-01-16 | Ichiro Ohtsuka | Cytoplasmic male sterility-based system for hybrid wheat plant and seed production |
| AU2007249385B2 (en) * | 2006-05-09 | 2012-09-13 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant artificial chromosome platforms via telomere truncation |
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2008
- 2008-11-18 ES ES200803286A patent/ES2343934B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-02 WO PCT/ES2009/070416 patent/WO2010058048A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MARTIN A, et al. The development of tritordeum: a novel cereal for food processing. 1999. Journal of Cereal Science. Vol. 30, páginas 85-95. * |
| MARTIN A.C, et al. Male fertility restoration of wheat in Hordeum chilense cytoplasm is associated with 6HchS chromosome addition. 11.03.2008. Australian Journal of Agricultural Research. Vol. 59(3), páginas 206-213. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2343934A1 (es) | 2010-08-12 |
| WO2010058048A1 (es) | 2010-05-27 |
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