ES2342874B2 - Peptidos ciclicos inhibidores del crecimiento celular. - Google Patents
Peptidos ciclicos inhibidores del crecimiento celular. Download PDFInfo
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Abstract
Péptidos cíclicos inhibidores del crecimiento
celular.
La presente invención se refiere al uso de
péptidos cíclicos definidos por la fórmula
ciclo(X^{1}X^{2}X^{3}X^{4}KFKKLQ), en donde X^{1},
X^{2}, X^{3} y X^{4} son indistintamente K o L para la
preparación de un medicamento que inhibe el crecimiento celular.
También se describe que dichos péptidos son efectivos para inhibir
la proliferación de células tumorales, y que los mismos son
apropiados para la preparación de un medicamento para el tratamiento
o profilaxis de tumores.
Description
Péptidos cíclicos inhibidores del crecimiento
celular.
La presente invención se refiere a decapéptidos
cíclicos que tienen propiedades inhibidoras del crecimiento
celular, en particular inhiben el crecimiento de diversas líneas
celulares tumorales.
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Los péptidos están cobrando cada vez más
importancia como fármacos. Es bien conocido que péptidos aislados de
la naturaleza o análogos de los mismos presentan una considerable
actividad inhibidora del crecimiento celular.
Por ejemplo en el artículo de Ali et al.,
Solid-Phase Total Synthesis of Cyclic Decapeptide
Phakellistatin 12, J. Nat. Prod., 2008, 71(6),
1059-1062, se describe que el decapéptido cíclico
Phakellistatin 12 de origen natural, ciclo(IFTLPPYIPP), es un
compuesto que inhibe el crecimiento de células cancerosas.
En el artículo de Montgomery et al., Didemnin
B: a new immunosuppressive cyclic peptide with potent activity
in vitro and in vivo . Transplantation, 1985,
40(1), 49-56, se describe el heptapéptido
cíclico Didemnin B de origen marino que presenta efectos
antiproliferativos frente a líneas celulares cancerosas.
En el artículo de Meier et al., Somatostatin
analog (octreotide) in clinical use: current and potential
indications, Schweiz Med. Wochenshr., 1992, 122(25),
957-968, se describe un octapéptido cíclico que
también tiene un efecto antiproliferativo.
En el artículo de Pettit et al., Isolation
and Structure of Stylostatin 1 from the Papua New Guinea Marine
Sponge Stylotella aurantium, J. Org. Chem., 1992, 57(26),
7217-7220, se describe un cicloheptapéptido aislado
de una esponja que tiene la estructura ciclo(LAIPFNS) y que
presenta propiedades inhibidoras del crecimiento de células de
leucemia.
En el artículo de Frorns et al., Constrained
derivatives of Stylostatin 1. 1. Synthesis and Biological Evaluation
as Potential Anticancer Agents. J. Med. Chem., 2003,
46(26), 5825-5833, se describe el
heptapéptido cíclico Stylostatin 1 y unos análogos sintéticos, que
presentan un efecto inhibidor del crecimiento de líneas celulares
cancerosas.
En el artículo de Gbankoto et al., Cytotoxic
Effect of Laxaphycins A and B on Human Lymphoblastic Cells
(CCRF-CEM) Using Digitised Videomicrofluorotmtry,
In vivo, 2005, 19(3), 577-582, se
describe que el tridecapéptido cíclico Laxaphycin B posee un efecto
citotóxico significativo e inhibe la división celular y el
crecimiento de células cancerosas humanas.
En la solicitud de patente europea
EP-A-0894092, se describe un
heptapéptido cíclico, Trunkamide A, aislado de Lissoclinum
sp., que presenta propiedades antitumorales frente a líneas
celulares de tumores humanos.
En la solicitud de patente PCT
WO-A-2005/034982, se describen
pentapéptidos cíclicos derivados del péptido natural Sansalvamide A
que presentan mejores propiedades antitumorales que el compuesto
natural.
Sin embargo los productos naturales y sus
derivados presentan ciertas desventajas, tales como una solubilidad
insuficiente en disolventes acuosos, o deben obtenerse mediante
procedimientos sintéticos complejos. Además, en algunas ocasiones
también presentan una vida media corta y la incapacidad de ser
administrados por vía oral debido a la proteólisis en el tracto
gastrointestinal.
Subsiste pues la necesidad de disponer de
compuestos que presenten una actividad inhibidora del crecimiento de
células cancerosas, que sean fáciles de sintetizar, que presenten
una cierta resistencia a la degradación por proteasas y que sean
solubles en disolventes acuosos.
Los autores de la presente invención han
desarrollado péptidos que resultan de fácil preparación, que
presentan actividad inhibidora del crecimiento de células cancerosas
y son solubles en disolventes acuosos.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la presente invención es el uso de
péptidos cíclicos definidos por una fórmula específica para preparar
un medicamento para inhibir el crecimiento celular.
Forma parte también del objeto de la invención
dichos péptidos cíclicos para uso como inhibidores del crecimiento
celular.
\newpage
También forma parte del objeto de la invención
el uso de dichos péptidos para preparar un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de tumores.
Forma parte también del objeto de la invención
dichos péptidos cíclicos para uso en el tratamiento o profilaxis de
tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 1 se presentan los resultados del
ensayo de inmunoblot y densitometría del efecto de los péptidos
sobre la ruta de supervivencia (señalización celular) de las MAPK,
(Mitogen Activated Phosphorilated Kinases), en concreto de la
fosfo-ERK1/2. Las bandas de proteínas se han
normalizado respecto al control. Los péptidos BPC88, BPC98 y BPC194
no muestran actividad bloqueadora de ERK1/2. Por el contrario, BPC96
y BPC198 bloquean la fosforilación (activación) de ERK 12 h
post-tratamiento de las células de carcinoma de
cérvix con los compuestos. Las bandas de actina corresponden a un
control de carga.
En la Figura 2 se presentan los resultados de
inmunoblot y densitometría del efecto de los péptidos de la
invención sobre PARP
(poli(ADP-ribosa)polimerasa) y p53.
Los péptidos BPC96, BPC98, BPC194, BPC198 muestran claramente
actividad apoptótica en células de carcinoma de cérvix puesto que,
respecto a las células control, la rotura de PARP y posterior
aparición del fragmento escindido (banda de 89 kD) es evidente en
todos los péptidos anteriormente citados. Es importante subrayar que
la actividad apoptótica ya se detecta 12 h
post-tratamiento de las células tumorales con los
nuevos compuestos. Las células HeLa expresan constitutivamente
p53vvt (http://p53.free.fr/p53_info/
p53_info.html). Los resultados del western blot de p53 muestran que los péptidos BPC88 y BPC96, debido a su actividad citotóxica, han producido un aumento de la proteína p53, producto del gen supresor de tumores p53.
p53_info.html). Los resultados del western blot de p53 muestran que los péptidos BPC88 y BPC96, debido a su actividad citotóxica, han producido un aumento de la proteína p53, producto del gen supresor de tumores p53.
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En el artículo de Monroc et al., Improvement
of cyclic decapeptides against plant pathogenic bacteria using a
combinatorial chemistry approach, Peptides, 2006, 27(11),
2575-2584, se describen decapéptidos cíclicos que
son activos frente a bacterias patógenas para las plantas como son
Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae y Xanthomonas
vesicatoria.
Los autores de la presente invención han
descubierto un grupo de dichos péptidos que presenta actividad
inhibidora del crecimiento celular, en particular inhiben el
crecimiento de células cancerosas, y que son apropiados para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de
tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la presente invención es el uso de
péptidos cíclicos que responden a la fórmula general (I):
(I)ciclo(X^{1}X^{2}X^{3}X^{4}KFKKLQ)
en donde: X^{1}, X^{2}, X^{3}
y X^{4} son indistintamente K o
L
para preparar un medicamento para inhibir el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, los péptidos de la
invención se emplean para preparar un medicamento para inhibir el
crecimiento de células cancerosas. En una realización preferida, los
péptidos de la invención se emplean para preparar un medicamento
para el tratamiento o profilaxis de tumores.
En el contexto de esta descripción se entiende
por "medicamento para inhibir el crecimiento de células
cancerosas" aquel medicamento que inhibe la proliferación de las
células de un tumor.
El término "tumor" se refiere a un tejido
que comprende células que crecen de forma incontrolada, esto es,
hiperproliferativamente. Los tumores incluyen leucemias, linfomas,
mielomas, plasmacitomas, y similares; así como tumores sólidos.
Ejemplos de tumores sólidos incluyen por ejemplo melanoma,
fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma
osteogénico, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing's, carcinoma de
colon, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma de células
escamosas, adenocarcinoma, tumor testicular, carcinoma epitelial y
retinoblastoma, así como aquellos propios del cáncer de mama,
cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de
ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello de útero, cáncer de
pulmón y cáncer de vejiga.
También forma parte del objeto de la invención
dichos péptidos cíclicos para uso como inhibidores del crecimiento
celular.
En una realización preferida, los péptidos
cíclicos son para uso como inhibidores del crecimiento de células
cancerosas.
En una realización preferida, los péptidos
cíclicos son para uso en el tratamiento o profilaxis de
tumores.
El término "ciclo" que se encuentra al
principio de la secuencia de aminoácidos en la fórmula general (I)
significa que el péptido es cíclico, de modo que el grupo
\alpha-carboxílico del aminoácido Q está unido
mediante un enlace peptídico con el grupo
\alpha-amino del primer aminoácido X_{1}.
En la fórmula (I) los aminoácidos se representan
mediante una única letra de acuerdo con la Comisión para la
Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, según se
describe en el libro Biochemical Nomenclature and Related
Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, Londres [ISBN
1-85578-005-4] y que
es bien conocida por el experto en la materia.
Según dicha nomenclatura, la letra K representa
el aminoácido L-lisina, que también se puede
abreviar mediante el código de tres letras como Lys, la letra L el
aminoácido L-leucina (Leu), la letra F el aminoácido
L-fenilalanina (Phe), la letra Q el aminoácido
L-glutamina (Gln).
En los péptidos de la invención todos los
aminoácidos tienen la configuración L.
Los péptidos que pertenecen a este grupo inhiben
el crecimiento celular y, por tanto, resultan apropiados para ser
empleados para preparar medicamentos citotóxicos, en particular
para preparar medicamentos que inhiben el crecimiento de células
cancerosas, y en particular para preparar medicamentos para el
tratamiento o profilaxis de tumores.
Los péptidos de la invención se presentan en la
Tabla I:
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Resultan preferidos los péptidos cíclicos que
tienen la estructura definida por las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4,
5, 6, 7, 8, y 15; más preferidos los péptidos definidos por las
secuencias SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, y 7.
Una característica de los péptidos de la
invención es su estructura cíclica. Según se describe en
WO-A-98/03192, los péptidos cíclicos
son más resistentes a los procesos proteolíticos en comparación con
sus homólogos lineales. De este modo la vida media de los péptidos
cíclicos en el cuerpo humano es más larga que la de los lineales.
Este hecho no se traduce en una persistencia negativa en el medio
ambiente, ya que dichos péptidos acaban degradándose finalmente por
las rutas biológicas habituales.
Los péptidos descritos en la invención tienen 10
aminoácidos, y son apropiados para ser preparados empleando los
procedimientos habituales de síntesis de péptidos en fase sólida
como los descritos por R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85,
2149-2154. Entre dichos procedimientos se pueden
mencionar:
- -
- el procedimiento que usa la resina 4-metilbencidrilamina (MBHA) funcionalizada con grupos amino, como soporte sólido para llevar a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los diferentes aminoácidos que integran el péptido y la etapa de ciclación, y
- -
- el procedimiento Multipin^{TM}, en el que se emplean las SvnPhase^{TM} Lanterns comercializadas por la empresa Mimotopes (Australia). En la página web http://vvvvw.mimotopcs.com/, se puede encontrar información sobre dicha técnica.
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Ambos procedimientos son bien conocidos por el
experto en la materia y se encuentran descritos por ejemplo en S.A.
Kates, F. Albericio Eds., Solid-Phase Synthesis.
A practical guide, Marcel Dekker, New York, 2000 (ISBN:
0-8247-0359-6), o en
K. Burguess Eds., Solid-Phase Organic
Synthesis, Wiley, John & Sons. New York. 1999 (ISBN:
0471318256).
Cuando se emplea la resina MBHA como soporte
sólido, habitualmente se incorpora a la resina un espaciador
bifuncional sensible al medio ácido, que permite el desanclaje del
péptido sintetizado en condiciones suaves.
Por ejemplo un espaciador bifuncional apropiado
es el Fmoc-Rink-Linker (número CAS:
145469-56-3) comercializado por la
empresa Iris Biotech (Alemania).
Dicho espaciador, una vez se ha unido con su
grupo carboxílico a un grupo amino de la resina MBHA, y se ha
eliminado el grupo protector Fmoc, presenta un grupo amino libre que
permite el anclaje de un aminoácido que tenga un grupo carboxílico
libre.
En el mercado se puede adquirir la resina
Fmoc-Rink-MBHA en la empresa Iris
Biotech, que ya tiene incorporado el espaciador mencionado.
Si el aminoácido tiene un grupo carboxílico
libre en la cadena lateral, como por ejemplo el ácido glutámico o el
ácido aspártico, entonces se puede unir al soporte sólido a través
de dicha cadena lateral, manteniendo disponibles el otro grupo
carboxílico y el grupo amino para la formación de nuevos enlaces
peptídicos.
Preferiblemente se emplea la resina MBHA
funcionalizada con grupos amino, como soporte sólido para llevar a
cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los diferentes
aminoácidos que integran el péptido y la etapa de ciclación.
En dicho procedimiento se utiliza la química del
grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) como
protector del grupo \alpha-amino de los
aminoácidos que se emplean para preparar los péptidos de la
invención.
Un procedimiento para la preparación de los
péptidos de la invención puede ser por ejemplo el que se describe a
continuación.
En la primera etapa se procede al anclaje del
ácido glutámico a la resina, a través del grupo carboxílico libre de
su cadena lateral. Los otros dos grupos reactivos del ácido
glutámico se mantienen protegidos para evitar reacciones
secundarias: por ejemplo, el grupo
\alpha-carboxílico en forma de éster alílico, y el
grupo \alpha-amino protegido por el grupo
Fmoc.
A continuación se elimina el grupo protector
Fmoc del grupo \alpha-amino del ácido glutámico, y
se incorpora el siguiente aminoácido del péptido que tiene el grupo
\alpha-amino protegido por el grupo Fmoc. El
enlace se establece entre el grupo carboxílico del nuevo aminoácido
y el grupo amino del ácido glutámico.
Este proceso de eliminación del grupo protector
Fmoc y la incorporación del nuevo aminoácido se repite hasta que se
completa un péptido con una estructura lineal.
En el caso del aminoácido lisina, el grupo amino
de la cadena lateral está protegido por el grupo Boc
(t-butiloxicarbonilo), que es estable a las
condiciones de eliminación del grupo Fmoc.
Una vez finalizados los acoplamientos se elimina
el éster alílico que protege el grupo
\alpha-carboxílico del ácido glutámico, y se
elimina el grupo Fmoc que protege el grupo
\alpha-amino del último aminoácido
incorporado.
Seguidamente se procede a la ciclación entre el
grupo \alpha-carboxílico del ácido glutámico y el
grupo \alpha-amino del último aminoácido
incorporado. De esta forma se obtiene un péptido cíclico unido a la
resina.
La escisión del péptido del soporte sólido se
realiza en condiciones ácidas e implica la ruptura del enlace entre
el grupo amino y el grupo bencidrilo del linker, conduciendo a la
formación del residuo de glutamina (Q), que se encuentra presente en
los péptidos de la invención, como se puede observar en la fórmula
general (I). Al mismo tiempo que se libera el péptido del soporte
sólido se eliminan los grupos Boc de los residuos de lisina.
Tras un proceso convencional de aislamiento, los
péptidos de la invención se obtienen con un buen rendimiento,
habitualmente comprendido entre el 70% y el 80%, en forma de sólidos
pulverulentos, y se caracterizan mediante análisis por HPLC, y
espectrometría de masas (ESI-MS,
MALDI-TOF o FAB-MS).
Sorprendentemente se ha comprobado que los
péptidos de la invención inhiben el crecimiento de células, en
particular el crecimiento de células cancerosas y, por tanto, pueden
ser empleados para preparar un medicamento para el tratamiento o
profilaxis de tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad inhibidora del crecimiento celular
de los péptidos de la invención frente a una línea celular tumoral
de origen mamario que se describe a continuación se ha evaluado
mediante la determinación del porcentaje (%) de inhibición del
crecimiento celular a una concentración de 40 \muM.
También se ha determinado la concentración de
péptido necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular de
diversas líneas tumorales descritas a continuación. Habitualmente
dicha concentración se denomina IC_{50} y se expresa en
\muM.
Estos tipos de ensayos son habituales en
microbiología y son bien conocidos por el experto en la materia.
Una descripción de la metodología empleada se encuentra por ejemplo
en: Brüggemann et al., Ifosfamide cytotoxicity on human tumor and
renal cells: role of chloroacetaldehyde in comparison to
4-hydroxyfosfamide. Cáncer Res. 1997,
57(13), 2676-2680; o en Puig et al., Fatty
acid metabolism in breast cáncer cells: differential inhibitory
effects of epigallocatechin gallate (EGCG) and C75. Breast
Cáncer Research and Treatment 2008, 109(3),
471-479.
Para evaluar el efecto inhibidor del crecimiento
de células cancerosas de los péptidos de la invención se emplearon
las siguientes líneas celulares:
- -
- MDA-MB-231 ATCC/HTB-26 (American Type Culture Collection),
- -
- HeLa ATCC/CCL-2 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España),
- -
- PANC-1 ATCC/CRL-1469 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España).
- -
- HepG2 HB-8065 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España),
- -
- A431 CRL-2592 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España), y
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares mencionadas resultan ser
indicadores apropiados para determinar la actividad de los
compuestos frente a tumores.
La línea celular
MDA-MB-231 es una línea celular
tumoral de origen mamario. Estas células fueron aisladas de una
paciente caucásica de 51 años y poseen una morfología epitelial. El
tipo de tumor que desarrolla es adenocarcinoma y su crecimiento en
cultivo es de tipo adherente. Para su proliferación en cultivo
requieren del medio DMEM (Medio Eagle's modificado de Dulbecco) +
10% FBS (suero fetal bovino) y unas condiciones de 37ºC y 5%
CO_{2}.
La línea celular HeLa es una línea de células
epiteliales humanas procedentes de un carcinoma de cuello uterino.
Fueron las primeras células humanas de las cuales se estableció una
línea celular en 1951. Proceden de la paciente Henrietta Lacks, de
ahí su nombre, una mujer afroamericana de 31 años. Se cultivan en
DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37ºC y 5% CO_{2}.
La línea celular HepG2 es una línea celular
procedente de tejido hepático de un chico caucásico de 15 años de
edad con carcinoma hepático diferenciado. Estas células son
epiteliales y en cultivo proliferan adheridas a la superficie. Se
cultivan en DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37ºC y 5%
CO_{2}.
La línea celular A431, originada a partir de un
carcinoma escamoso, fue establecida a partir de un tumor sólido de
una mujer de 85 años. Son células similares a las epiteliales,
adherentes y que crecen en monocapa. Además se caracterizan por
sobreexpresar el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR). Se cultivan en DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37ºC y
5% CO_{2}.
La línea celular PANC-1 es una
línea celular procedente de un adenocarcinoma pancreático de tipo
epitelial. Estas células crecen de forma adherente y requieren de
DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37ºC y 5% CO_{2} para su
cultivo en el laboratorio.
Los detalles de la experimentación se describen
en el apartado de Ejemplos.
En uno de los ensayos se determinó la actividad
inhibidora del crecimiento de células cancerosas como el porcentaje
(%) de inhibición del crecimiento celular de la línea celular
MDA-MB-231 frente a una
concentración 40 \muM de los péptidos de la invención, y se
observó que los péptidos de la invención inhiben el crecimiento
celular de la línea celular tumoral de origen mamario
MDA-MB-231. Como se verá en el
apartado de Ejemplos, algunos de ellos llegan a una inhibición
igual o superior al 50% a una concentración de 40 \muM.
En otro ensayo se determinó la actividad
citotóxica de los péptidos preferidos frente a las líneas de
células tumorales mencionadas anteriormente. De los resultados
obtenidos se puede concluir que los péptidos de la invención
presentan una considerable actividad inhibidora del crecimiento de
estas células. Excepto en el caso del péptido BPC196 frente a la
línea celular HepG2, todos los péptidos fueron activos a las
concentraciones ensayadas frente a todas las líneas celulares con
unos valores de IC_{50} comprendidos entre 18,5 y 57,5
\muM.
En el caso de las células HeLa, cinco péptidos
presentaron un valor de IC_{50} igual o inferior a 30 \muM,
siendo esta línea celular la más susceptible frente a los péptidos
de la invención.
El péptido BPC094 es el más activo frente a
todas las líneas celulares ensayadas con un IC_{50} comprendido
entre 18,5 y 23 \muM.
El péptido BPC088 también es activo frente a
todas las líneas celulares ensayadas, pero a concentraciones más
elevadas (IC_{50} comprendido entre 22,5 y 32,5 \muM).
También se identificaron péptidos selectivos
frente a una línea celular cancerosa: los péptidos BPC096 y BPC184
muestran selectividad frente a las células de HeLa y A431
respectivamente con un IC_{50} de 24,5 \muM.
Se ha comprobado además que los péptidos de la
invención tienen un efecto apoptótico en las células de carcinoma de
cérvix. Por ello se realizó el análisis de la rotura de PARP, enzima
final de la ruta de las caspasas, que se fragmenta en procesos
apoptóticos. Además, se analizó el efecto de los péptidos
seleccionados sobre la activación (fosforilación) de una de las
proteínas clave de la ruta de señalización celular de las MAPK
(p-ERK1/2) y sobre el producto del factor de
transcripción p53 (gen supresor tumoral). Una descripción de la
metodología utilizada se encuentra en Puig et al, Breast
Cáncer Research and Treatment, 2008, 109,
471-479.
Como se observa en la Figura 1, los péptidos
BPC88, BPC98 y BPC194 no muestran actividad bloqueadora de ERK1/2.
Por el contrario, BPC96 y BPCI98 bloquean la fosforilación
(activación) de ERK 12h post-tratamiento de las
células de carcinoma de cérvix con los compuestos.
Como se observa en la Figura 2, los péptidos
BPC96, BPC98, BPC194, BPC198 muestran claramente actividad
apoptótica en células de carcinoma de cérvix puesto que, respecto a
las células control, la rotura de PARP y posterior aparición del
fragmento escindido (banda de 89 kD) es evidente en todos los
péptidos anteriormente citados. Es importante subrayar que la
actividad apoptótica ya se detecta 12 h
post-tratamiento de las células tumorales con los
nuevos compuestos. Las células HeLa expresan constitutivamente
p53wt (http://p53.free.fr/p53_info/p53_info.html). Los resultados
del western blot de p53 muestran que los péptidos BPC88 y
BPC96 debido a su actividad citotóxica han producido un aumento de
la proteína p53, producto del gen supresor de tumores p53.
De los resultados obtenidos se puede concluir
que los péptidos de la invención presentan una considerable
actividad inhibidora del crecimiento de células tumorales de
características diversas.
La actividad hemolítica de los péptidos es una
característica que generalmente se analiza para determinar su grado
de toxicidad. La mencionada actividad hemolítica se ha evaluado
mediante la determinación de la liberación de hemoglobina que se
produce al poner en contacto una solución de dichos péptidos en
tampón de TRIS con suspensiones de eritrocitos al 5% en
volumen/volumen procedentes de sangre humana fresca. El resultado de
dicha determinación se expresa como el porcentaje de hemólisis que
se produce para una determinada concentración de péptido. Una
descripción de la metodología empleada para la determinación de la
actividad hemolítica se encuentra en Oren et al,
Biochemistry, 2000, 39, 6103-6114, y en Raguse et
al, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124,
12774-12785.
Se ha comprobado que los péptidos de la
invención presentan una actividad hemolítica que se puede
clasificar como baja, ya que la mayoría de ellos presentan un
porcentaje de hemólisis inferior al 33% a 375 \muM. Se observa,
pues, que los péptidos presentan hemólisis bajas incluso a una
concentración entre 6 y 21 veces superior a la cual son activos para
inhibir el crecimiento celular.
La estabilidad de los péptidos a la degradación
se ha evaluado mediante el tratamiento del péptido con suero humano
acuoso y la monitorización de su degradación por
MALDI-TOF a diferentes intervalos de tiempo. Se ha
comprobado que al cabo de 1,5 h a 2 h aún se detecta la presencia de
péptido en el medio.
Los péptidos de esta invención pueden ser
procesados por métodos convencionales de farmacia galénica en
composiciones farmacéuticas para administración oral, parenteral o
tópica, por ejemplo a mamíferos, incluidos los humanos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
preparar por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
los péptidos se pueden formular con excipientes, diluyentes o
vehículos comunes, y formular en comprimidos, cápsulas,
suspensiones, polvos y formulaciones similares. Ejemplos de
excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para dichas
formulaciones incluyen los siguientes: cargas y diluyentes como
almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes
aglutinantes como derivados de la celulosa, alginatos, gelatina y
polivinilpirrolidona; agentes humectantes como glicerol; agentes
disgregantes como carbonato cálcico y bicarbonato sódico; agentes
retardantes de la disolución como parafina; agentes tensioactivos
como monoestearato de glicerina; vehículos adsorbentes como caolín y
bentonita; y lubrificantes como talco, estearato cálcico y
magnésico, y polietilenglicoles sólidos.
Los péptidos se pueden formular también como
elixires o soluciones para una administración oral conveniente.
Adicionalmente, los compuestos se adaptan bien a
la formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y
similares.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen los
péptidos de la invención se pueden preparar siguiendo
procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, como por
ejemplo los descritos en el manual Remington: The Science and
Practice of Pharmacy, 20th Edition, Philadelphia, Lippincott,
Williams & Wilkins, 2000 [ISBN 0 683 306472].
En manuales de consulta accesibles para el
experto en la materia, como el libro Handhook of Pharmaceutical
Excipients, 4th Edition, London, Pharmaceutical Press, 2003
[ISBN 0 85369 472 9], se encuentra información sobre las
características de los agentes auxiliares descritos, y en la mayoría
de los casos también figuran ejemplos de las denominaciones
comerciales bajo las que se pueden encontrar dichos productos en el
mercado.
En general, los péptidos de la invención son
administrados en forma de dosis unitaria en un vehículo
farmacéuticamente aceptable que contiene la dosis requerida. La
dosificación de una composición farmacéutica que comprende los
péptidos de la invención variará de acuerdo con la formulación
farmacéutica, el modo de aplicación, y el sitio, huésped y tumor
particulares que se estén tratando.
En general, las dosis y regímenes adecuados para
un huésped dado pueden ser determinados mediante consideraciones
convencionales, por ejemplo mediante la comparación de las
actividades diferenciales del compuesto en cuestión y de un agente
antitumoral conocido, por ejemplo mediante un protocolo
farmacológico convencional apropiado. En este protocolo se tienen
en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la
dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la
condición del huésped, las combinaciones de fármacos, las
sensibilidades de reacción, y la severidad de la enfermedad.
La administración de los péptidos de la
invención se puede llevar a cabo continuamente o periódicamente
dentro de la dosis máxima que se tolera.
Los ejemplos que se exponen a continuación se
deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión
de la invención, y no como limitaciones al objeto de la misma.
En los ejemplos que siguen se emplean las
siguientes abreviaciones:
Al: alilo; Boc:
tert-butiloxicarbonilo; DIEA:
N,N-diisopropiletilamina; DMEM: Medio Eagle's
modificado de Dulbecco; EDTA, ácido etilendiaminotetracético;
ERK1/2: Señal extracelular regulada por las quinasas 1/2;
ESI-MS: espectrometría de masas con ionización por
electropulverización; FAB-MS: espectrometría de
masas por bombardeo con átomos rápidos (Fast Atom Bombardment - Mass
Spectrometry); FBS: suero fetal bovino; Fmoc:
9-fluorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofosfato
de N-óxido de
N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N-metilmetanaminio;
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol: HPLC: cromatografía
líquida de alta resolución; MALDI-TOF: ionización
desorción por láser asistida por una matriz - Tiempo de vuelo
(Matrix-Assisted Láser Desorption Ionization -
Time-of-Flight): MBHA:
4-metilbencidrilamina: MTT: bromuro de
3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio;
NMM: N-metilmorfolina; NMP:
N-metilpirrolidona; PAGE: gel de electroforesis de
poliacrilamida; PARP: Polimerasa de la poli-ADP
ribosa; PBS: tampón fosfato salino; PBS-T: tampón
fosfato salino-TRIS: Ph: fenilo; PMSF: fluoruro de
fenilmetilsulfonilo: PyBOP: hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-N-oxitris(pirrolidino)fosfonio:
SDS: dodecilsulfato sódico; TBS-T: solución de
tampón TRIS con 0,05% Tween-20; TFA: ácido
trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropilsilano;
TRIS: tris(hidroximetil)aminometano; UV:
ultravioleta.
Los productos
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Glu-OAl,
Fmoc-Leu-OH, la resina MBHA
funcionalizada con grupos amino, el espaciador bifuncional
Fmoc-Rink-Linker (número CAS:
145469-56-3), HBTU, PyBOP, y HOBt se
obtuvieron de Iris Biotech. Los productos TFA, NMP,
Pd(PPh_{3})_{4},
N,N-dietilditiocarbamato sódico, y TIS se
obtuvieron de Aldrich. Los productos piperidina, NMM, y DIEA se
obtuvieron de Fluka.
Las siguientes indicaciones sobre el
procedimiento para la preparación de los péptidos son de carácter
general:
- -
- Se emplearon aminoácidos que tienen el grupo \alpha-amino protegido con el grupo Fmoc.
- -
- Para la protección de la cadena lateral de la lisina se empleó el grupo Boc.
- -
- En las reacciones llevadas a cabo sobre soporte de resina se emplearon jeringas de 5 o 10 ml que tenían incorporado un filtro microporoso de polipropileno.
- -
- Todas las transformaciones y lavados se llevaron a cabo a 25ºC, a no ser que se indique lo contrario.
- -
- El análisis por HPLC se llevó a cabo con un flujo de 1,0 ml/min empleando una columna de fase reversa Kromasil (4.6 x 40 mm; tamaño de partículas de 3.5 \mum). Se emplearon gradientes lineales con TFA acuoso al 0,1% y TFA en acetonitrilo al 0,1%, con una relación comprendida entre 0,98:0,02 y 0,98:0,1 durante un período de tiempo de 7 minutos con detección UV a una longitud de onda de 220 nm.
- -
- Los espectros ESI-MS fueron adquiridos empleando un instrumento Esquire 6000 ESI ion trap LC/MS (Bruker Daltonics), operando en el modo positivo de iones (ES+).
- -
- Los espectros MALDI-TOF fueron adquiridos mediante un instrumento Ultraflex de la empresa Bruker.
- -
- Todas las relaciones entre los disolventes son volumen/volumen, a no ser que se especifique otra cosa.
\vskip1.000000\baselineskip
En una jeringa de 5 ml de capacidad, equipada
con un filtro microporoso en la parte inferior, se colocaron 200 mg
de resina MBHA con una funcionalización de 0,3 mmol/g, equivalentes
a 0,06 mmoles de grupos amino, y se llenó la jeringa con disolvente
para hinchar-lavar la resina de acuerdo con la
siguiente secuencia: CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min), una mezcla de
TFA y CH_{2}Cl_{2} (4:6, 1 x 20 min), CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5
min), una mezcla de DIEA y CH_{2}Cl_{2} (5:95, 3 x 1 min),
CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min), y NMP (5 x 0,5 min). La expresión
CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min) se refiere a que se realizaron 5
lavados con cloruro de metileno de 0,5 minutos cada uno. Después de
cada etapa de lavado se elimina el disolvente mediante un filtrador
de vacío múltiple (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold de Promega
Distribuidora).
El espaciador bifuncional se acopló a la resina
por tratamiento con 97 mg de
Fmoc-Rink-Linker (0,18 mmoles), 68
mg de HBTU (0,18 mmoles) y 31 \mul de DIEA (0,18 mmoles) en 1 ml
de NMP. Se mantuvo durante toda la noche y se comprobó que el test
de ninhidrina era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem.,
1970, 34, 595-598).
Después de lavar la resina con NMP (5 x 2 min),
ésta se trató con una mezcla de piperidina y NMP (3:7, 2 x 8 min)
para eliminar el grupo Fmoc presente en el grupo amino del
espaciador bifuncional, y, a continuación, se lavó con NMP (5 x 2
min).
Seguidamente la resina se trató con 74 mg de
Fmoc-Glu-OAl (0,18 mmoles), 68 mg
de HBTU (0,18 mmoles) y 31 \mul de DIEA (0,18 mmoles) en 1 ml de
NMP. Después de 4 h se comprobó que el test de ninhidrina era
negativo. A continuación se lavó con NMP (5 x 2 min).
La eliminación del grupo Fmoc y los lavados
subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito
anteriormente.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repitió para el resto
de los aminoácidos protegidos con el grupo
N^{\alpha}-Fmoc:
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH, y
Fmoc-Leu-OH. En cada etapa se
procedió al lavado con NMP (5 x 2 min).
El éster alílico C-terminal del
ácido glutámico incorporado al péptido fue eliminado bajo atmósfera
de nitrógeno por tratamiento con 347 mg de
Pd(PPh_{3})_{4} (0,3 mmoles) en 3 ml de una mezcla
de cloroformo, ácido acético y NMM (37:2:1) durante 5 h bajo
agitación. Pasado este tiempo la resina fue lavada con THF (3 x 2
min), NMP (3 x 2 min), una mezcla de DIEA y CH_{2}Cl_{2} (1:19,
3 x 2 min), N,N-dietilditiocarbamato sódico (0,03 M
en NMP, 3 x 15 min), NMP (10 x 1 min), CH_{2}Cl_{2} (3 x 2 min),
y NMP (3 x 1 min).
Después de eliminar el grupo Fmoc del último
aminoácido acoplado y proceder a los lavados como ya se ha descrito
anteriormente, se obtuvo el péptido lineal KKLLKFKKLQ.
Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Glu,
unido a la resina. En este estadio, el péptido contiene aún el
residuo de ácido glutámico, ya que la glutamina no se forma hasta la
escisión del péptido cíclico de la resina.
La ciclación del péptido se llevó a cabo
mediante tratamiento con 156 mg de PyBOP (0,3 mmoles), 40 mg de HOBt
(0,3 mmoles), y 104 \mul de DIEA (0,6 mmoles) en 1 ml de NMP.
Después de 24 horas a 25ºC, el test de ninhidrina fue negativo.
A continuación se lavó la resina con NMP (6 x 1
min) y CH_{2}Cl_{2} (6 x 1 min), y se escindió el péptido
cíclico de la resina mediante un tratamiento con 2 ml de una mezcla
de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5) durante 2 horas. Se recogieron los
filtrados en un vial mediante una presión positiva de nitrógeno. La
resina se lavó con una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5, 2 x
0,5 ml). Los filtrados se combinaron y se evaporaron casi a
sequedad bajo una corriente de nitrógeno hasta obtener un aceite.
Dicho aceite se precipitó con éter dietílico, se centrifugó, y el
éter se decantó. Este proceso se repitió 3 o 4 veces. Finalmente,
el producto sólido obtenido se disolvió en agua, y se liofilizó.
Se obtuvo un sólido pulverulento cuya estructura
se analizó por HPLC y se confirmó por ESI-MS,
MALDI-TOF o FAB-MS.
\newpage
Ejemplos 2 a
16
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
en el Ejemplo 1 se prepararon los péptidos cíclicos que figuran en
la Tabla II, en la que se incluye también el péptido del Ejemplo
1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se resuspendieron los péptidos en PBS 1X estéril
para tener una concentración final (stock) de 9600
\muM.
Se sembraron las células de cáncer de mama
MDA-MB-231 en una placa de cultivo
de 96 pocillos a una densidad de 7000 células/pocillo, de los cuales
solamente 60 son pocillos útiles, ya que el perímetro de la placa
se rellenó con agua para evitar evaporaciones. Después de 24 horas
de estar en cultivo, las células tumorales estaban totalmente
adheridas a la superficie del pozo y se trataron con cada uno de los
péptidos a una concentración final de 40 \muM.
Cada péptido de la invención se ensayó por
triplicado a una concentración de 40 \muM. Se dejó actuar el
péptido durante 48 horas, después se sacó el medio de cultivo y se
pusieron 100 \mul de medio de cultivo fresco con 10 \mul de MTT
durante 3 horas.
Las células vivas metabolizaron esta sal (MTT)
dando un metabolito soluble en DMSO que tiene una longitud de onda
máxima de absorción a 570 nm.
Se leyó la densidad óptica de la placa a 570 nin
y se compararon los resultados con los pocillos control que no han
sido tratados con el péptido.
En la Tabla III se presentan los resultados
obtenidos para algunos de los péptidos de la invención:
Se puede observar que los péptidos ensayados
inhiben el crecimiento celular de la línea celular tumoral de
origen mamario MDA-MB-231. Entre
ellos cabe destacar los péptidos BPC088, BPC202, BPC098, BPC198,
BPC194, BPC096, BPC094, y BPC184 que muestran un porcentaje de
inhibición igual o superior al 50% a una concentración de 40
\muM.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto inhibidor del crecimiento de células
cancerosas de los péptidos de la invención se determinó frente a las
siguientes líneas celulares:
MDA-MB-231
ATCC/HTB-26 (American Type Culture Collection), HeLa
ATCC/CCL-2, PANC-1
ATCC/CRL-1469, HepG2 HB-8065
(Eucellbank, Universidad de Barcelona, España), y A431
CRL-2592 (Eucellbank, Universidad de Barcelona,
España).
Las células tumorales de origen mamario
MDA-MB-231, las células procedentes
de un carcinoma de cuello uterino HeLa, y las células de un
adenocarcinoma pancreático PANC-1 se cultivaron en
medio DMEM (Gibco) que contenía un 10% de suero fetal bovino
(Bio-Whitakker), 1% de L-glutamina,
1% de piruvato sódico, 50 U/ml de penicilina, y 50 \mug/ml de
estreptomicina.
Las células procedentes de un carcinoma hepático
diferenciado HepG2, y las células de un carcinoma escamoso A431
fueron pasadas en un medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal
bovino, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, 50
U/ml de penicilina, y 50 \mug/ml de estreptomicina. Las células
estaban exentas de Mycoplasma y fueron propagadas en un
cultivo adherente de acuerdo con procedimientos bien establecidos y
conocidos en los laboratorios de cultivo celular. Las células se
mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía un 95% de
aire y un 5% de anhídrido carbónico.
La sensibilidad de las células frente a los
péptidos de la invención se determinó empleando el ensayo
colorimétrico estándar MTT.
Las células se sembraron en una placa de 96
pocillos con una densidad de 7 x 10^{3} células/100 \mul/pocillo
y se mantuvieron toda la noche a una temperatura de 37ºC para
conseguir la adhesión de las células a la pared del pocillo.
A continuación se eliminó el medio de cultivo,
se añadió medio de cultivo fresco con varias concentraciones del
péptido de la invención a ensayar, y se mantuvo 48 horas a una
temperatura de 37ºC.
Seguidamente, las células se alimentaron con
medio de cultivo exento de péptido (100 \mul/pocillo) y con 10
\mul de solución MTT (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO), y se
incubaron durante 3 h a 37ºC.
Después de eliminar cuidadosamente los
sobrenadantes, los cristales de MTT-formazan
formados por las células viables metabólicamente, se disolvieron en
dimetilsulfóxido (100 \mul/pocillo) y se midió la absorbancia a
570 nm en un lector multipocillo modelo Anthos Labtec 2010 1.7
Reader.
A partir de las lecturas obtenidas para cada una
de las concentraciones de los péptidos ensayados se determinó
mediante un tratamiento matemático la concentración necesaria para
inhibir el 50% del crecimiento celular, que se denomina
IC_{50}.
En la Tablas IV y V se presentan los resultados
de los ensayos de inhibición del crecimiento celular expresados
como IC_{50} en \muM:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede observar que los péptidos de la
invención presentan una considerable actividad inhibidora del
crecimiento de células tumorales de características diversas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células tratadas se sometieron a una lisis
en una solución tampón que contenía 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100
\mug/ml PMSF, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) y una
combinación de proteasa e inhibidor de fosfatasa (Sigma
Chemical).
Una muestra se extrajo para la determinación del
contenido de proteína mediante el ensayo de Lowry (BioRad). Los
extractos de proteína total se sometieron a un inmunoblot con
SDS-PAGE sobre un gel de
SDS-poliacrilamida del 4-12%
(phospo-ERK1/2, p53 y PARP), transferidos a
membranas de nitrocelulosa y bloqueadas durante una hora a
temperatura ambiente en un tampón bloqueante (2,5% leche descremada
en polvo en PBS-T [10 mM Tris-HCl pH
8,0, 150 mM NaCl and 0,05% Tween-20]) para evitar el
enlace de anticuerpos no específico.
Los blots fueron incubados con el anticuerpo
primario correspondiente diluido en un tampón bloqueante durante
toda la noche a 4ºC. Después de 3 lavados durante 5 minutos en
PBS-T, los blots fueron incubados durante una hora
con el anticuerpo secundario escogido de acuerdo con la especie de
origen del anticuerpo primario, y revelados empleando un kit
comercial (sustrato quimioluminiscente de West Pico).
Los blots se reinvestigaron con un anticuerpo
para \beta-actina para controlar la carga y
transferencia de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad hemolítica de los péptidos de la
invención se evaluó mediante la determinación de la liberación de
hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de los
péptidos con una suspensión de eritrocitos al 5% en volumen
procedentes de sangre humana fresca.
La sangre se recogió asépticamente empleando un
sistema Vacuntainer K2E (Belliver, Gran Bretaña) con EDTA, y se
almacenó a 4ºC durante un período inferior a 2 horas.
La sangre se centrifugó a 6.000 g durante 5
minutos para separar los eritrocitos. Éstos se lavaron tres veces
con tampón TRIS (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7.2), y se suspendieron
en tampón TRIS hasta obtener una suspensión que contenía un 10% en
volumen de eritrocitos.
Los péptidos se solubilizaron en tampón TRIS
hasta una concentración final 125,250, 500 y 750 \muM.
Se emplearon tres replicados para cada péptido y
concentración.
Se mezclaron 65 \mul de la suspensión de
eritrocitos al 10% en volumen con 65 \mul de la solución de
péptido en cada pocillo de una placa de 96 pocillos
Micro-Amps (Applied Biosystems, EE.UU.) (5% en
volumen de eritrocitos), y se incubó la mezcla durante 1 h a 37ºC
bajo agitación. De este modo las suspensiones de eritrocitos se
sometieron a concentraciones de péptidos de 62,5, 125, 250 y 375
\muM.
A continuación se centrifugaron las placas a
3.500 g durante 10 minutos, y se transfirieron alícuotas de 80
\mul del sobrenadante a microplacas de 100 pocillos (Bioscreen),
que se diluyeron con 80 \mul de agua milli-Q.
El grado de hemolisis se determinó a partir de
la absorbancia a 540 nm con un lector de placas Bioscreen.
El control positivo de hemolisis completa se
determinó en una solución de tampón TRIS que contenía melitina
(Sigma-Aldrich, España).
El porcentaje de hemolisis (H) se determinó
empleando la ecuación:
H =
100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]
donde Op era la densidad óptica
medida para una concentración de péptido determinada, Ob era la
densidad óptica de la solución tampón, y Om era la densidad óptica
para el control positivo con
melitina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La Tabla VI presenta los resultados de actividad
hemolítica para una concentración de péptido de la invención de 375
\muM, expresada como el porcentaje de hemolisis calculado según la
ecuación anterior:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos se observa que la
concentración en la que se llegaría a producir una hemolisis
significativa es aproximadamente entre 6 y 21 veces superior a la
concentración en la que el péptido presenta actividad inhibidora del
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de los péptidos de los Ejemplos
1, 4, 5, 6, y 7 en suero humano se determinó siguiendo el siguiente
protocolo:
Para cada ensayo se preparó 1 ml de suero humano
acuoso al 25% a partir de suero humano filtrado. A continuación se
añadieron 2,5 mg de péptido cíclico y la mezcla se calentó a 37ºC.
La estabilidad se monitorizó al cabo de 30 min, 1 h, 1,5 h y 2 h.
Para ello, después de cada intervalo de tiempo se tomó una alícuota
de 200 \mul a la que se añadieron 200 \muL de acetonitrilo, y la
muestra resultante se enfrío a 0ºC durante 15 min. A continuación,
el precipitado se centrifugó a 11000 rpm durante 5 min, el
sobrenadante se liofilizó. El sólido resultante se analizó por
MALDI-TOF utilizando ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
como matriz.
Para los péptidos de los Ejemplos 1, 5, y 7, al
cabo de 1,5 h aún se observa por MALDI-TOF la masa
correspondiente al péptido cíclico. Para los péptidos de los
Ejemplos 4 y 6, se observa la masa del péptido cíclico al cabo de 2
h de tratamiento.
<110> Universidad de Girona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos cíclicos antitumorales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P09050816
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<210> 5
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<210> 6
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<210> 7
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 7
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<210> 8
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
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<210> 15
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<213> Sintético
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<221> PÉPTIDO
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<223> cíclico
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> sintético
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<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
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<223> cíclico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
Claims (5)
1. Uso de péptidos cíclicos que responden a la
fórmula general (I):
(I)ciclo(X^{1}X^{2}X^{3}X^{4}KFKICLQ)
en donde: X^{1}, X^{2}, X^{3}
y X^{4} son indistintamente K o
L
para preparar un medicamento para inhibir el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso según la reivindicación 1 para preparar
un medicamento para inhibir el crecimiento de células
cancerosas.
3. Uso según la reivindicación 2 para preparar
un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 en donde los péptidos tienen la estructura definida por las
secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, y 15.
5. Uso según la reivindicación 4 en donde los
péptidos tienen la estructura definida por las secuencias SEQ ID NO:
1,4, 5, 6, y 7.
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