ES2342237T3 - Produccion de virus sinciciales respiratorios infecciosos a partir de secuencias clonadas de nucleotidos. - Google Patents

Abstract

LAS MOLECULAS AISLADAS DE POLINUCLEOTIDOS HACEN DE SUMINISTRO AL GENOMA Y ANTIGENOMA DEL RSV, INCLUIDOS LOS RSV HUMANOS, BOVINOS O MURINOS, LOS VIRUS SIMILARES AL RSV Y SUS QUIMERAS. EL GENOMA O ANTIGENOMA RECOMBINANTE SE PUEDE EXPRESAR CON UNA PROTEINA (N) O FOSFOPROTEINA (P) DEL NUCLEOCAPSIDE, UNA GRAN PROTEINA (L) DE POLIMERASA Y UN FACTOR DE ELONGACION DE POLIMERASAS DEL RNA PARA PRODUCIR PARTICULAS INFECCIOSAS DE RSV AISLADAS. EL GENOMA Y ANTIGENOMA DE RSV RECOMBINANTE SE PUEDE MODIFICAR PARA PRODUCIR CAMBIOS FENOTIPICOS DESEADOS, COMO VIRUS ATENUADOS PARA LA ELABORACION DE VACUNAS.

Description

Producción de virus sinciciales respiratorios infecciosos a partir de secuencias clonadas de nucleótidos.

Antecedentes de la invención

El virus respiratorio sincicial humano (VRS) es el patógeno respiratorio pediátrico más importante a escala mundial. Este agente altamente infeccioso y muy extendido aparece cada año en forma de epidemias estacionales. Casi todas las personas se infectan por lo menos una vez en sus dos primeros años de vida. La enfermedad del VRS es la responsable de un nivel considerable de morbilidad y mortalidad, especialmente entre las personas más jóvenes. En los Estados Unidos provoca un número estimado de 91.000 hospitalizaciones y 4500 muertes cada año y su impacto es muy superior en países menos desarrollados. Se ha llegado a reconocer asimismo el VRS como un agente importante causante de enfermedades en adultos inmunodeficientes y en las personas mayores.

La resistencia a la reinfección por el VRS provocada por la infección natural es incompleta pero aumenta gradualmente con la repetición de exposiciones. De este modo, el VRS puede infectar una pluralidad de veces durante la infancia y la vida adulta, pero la enfermedad grave se limita habitualmente a la primera, y a veces a la segunda, infección en toda la vida. El objetivo mínimo de la inmunoprofilaxis contra el VRS es provocar un nivel suficiente de resistencia para evitar las enfermedades graves asociadas a las infecciones iniciales.

Se ha desarrollado un cierto número de cepas atenuadas de VRS y se analizaron como vacunas durante las décadas de los años 60 y 70, pero no se encontró que estuvieran sobreatenuadas o subatenuadas, y en algunos casos presentaron inestabilidad genética, tal como es habitual en los virus con ARN monocatenario. Las estrategias de investigación para el desarrollo de vacunas contra el VRS son principalmente la administración parenteral del antígeno vírico purificado o el desarrollo del VRS vivo atenuado para su administración intranasal. La vía intranasal proporciona la estimulación directa de la inmunidad local. Ello anula parcialmente asimismo los efectos inmunodepresores de los anticuerpos séricos de procedencia materna específicos del VRS, que habitualmente se encuentran en las personas más jóvenes. La administración parenteral del VRS inactivado o del antígeno purificado del VRS en animales de laboratorio parece ser que se encuentra asociada a una mayor inmunopatología posterior a la provocación con el virus, similar a un mayor grado de enfermedad por VRS asociado a la vacuna inactivada con formalina que se analizó en la década de los años 60. Pero este efecto no se ha observado nunca en una infección del tracto respiratorio por VRS, lo que sugiere que los virus atenuados vivos presentan una ventaja importante en lo que se refiere a la seguridad. Hasta la fecha, sin embargo, no existe una vacuna autorizada o un tratamiento antivírico muy efectivo contra el VRS.

Los esfuerzos de las investigaciones para producir una vacuna apta contra el VRS se ven dificultados por un escaso crecimiento vírico en cultivos celulares, un ciclo de reproducción lento, la inestabilidad del virión, un genoma de ARN complementario y la complejidad de la organización del genoma y de los productos génicos. El VRS es miembro del género pneumovirus de la familia de los paramixovirus y su genoma monocatenario de ARN complementario de 15.222 nucleótidos se ha secuenciado completamente para el virus de la cepa natural A2 así como para la forma atenuada obtenida a partir de la misma.

Parece ser que algunos aspectos de la síntesis del ARN por el VRS siguen la pauta general de los virus con una cadena complementaria sin segmentar. El molde del genoma se encuentra herméticamente encapsidado con la proteína principal de la nucleocápside (N) y se asocia a la fosfoproteína (P) y la subunidad proteica grande (L) de la polimerasa. La transcripción se inicia en la región guía extragénica 3' y continúa a lo largo de toda la longitud mediante un mecanismo secuencial de finalización - inicio guiado por las señales de las secuencias cortas flanqueadoras de los genes. Ello produce por lo menos diez especies principales de ARNm que codifican por lo menos diez proteínas principales. La replicación del ARN se produce mediante un cambio a la síntesis de un "antigenoma" codificante que se encuentra asimismo herméticamente encapsidado y actúa de molde para la síntesis del genoma de la descendencia.

El ARN del genoma vírico de los virus con cadenas complementarias no es infeccioso por sí solo como ARN libre. En los viriones o en el interior de la célula, el ARN vírico se encuentra siempre herméticamente encapsidado en un núcleo de ribonucleoproteína. Dicha nucleocápside contiene las proteínas víricas necesarias para la transcripción y la replicación y se ha considerado durante mucho tiempo como la unidad mínima de infecciosidad (Brown et al., J. Virol. 1: 368 - 373 (1967)). Por lo tanto, se ha reconocido que la generación de ARN vírico sintético biológicamente activo a partir de ADNc requerirá la complementación mediante la proteína vírica, lo que provoca el ensamblaje de nucleocápsides funcionales (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 88: 9663 - 9667 (1991), y Collins et al., Virology 195: 252 - 256 (1993)). La capacidad para producir VRS vivos a partir del ADNc es de una importancia particular ya que permitiría la introducción de cambios genomanipulados específicos, entre ellos mutaciones atenuantes, en el genoma de virus infecciosos, en un esfuerzo para producir vacunas contra el VRS seguras y efectivas.

Se ha demostrado que los análogos cortos eliminados internamente del genoma o antigenoma de ARN ("minigenomas") participan en la transcripción y la replicación cuando se sintetizan en el interior de la célula en presencia de las proteínas víricas apropiadas. En el caso de dos rhabdovirus, los virus de la rabia y de la estomatitis vesiculosa, los virus infecciosos se han producido mediante la expresión conjunta de un antigenoma de ARN codificado por un ADNc completo en presencia de las proteínas N, P y L (Schnell et al., EMBO J. 13: 4195 - 4203 (1994) y Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 92: 4477 - 4481 (1995)).

El VRS presentan un cierto número de propiedades que lo diferencian de los otros miembros del género Pneumovirus de los paramixovirus mejor caracterizados de los géneros Paramyxovirus, Rubulavirus y Morbillivirus. Dichas diferencias comprenden un número superior de ARNm, un orden génico poco común en el extremo 3' del genoma, una variabilidad entre especies en el orden de los genes de la glucoproteína y el M2, una mayor diversidad en las regiones intergénicas, una proteína de enlace que presenta unas características del tipo mucina, una gran diversidad de la secuencia entre cepas y diversas proteínas que no se encuentran en ninguna o en la mayoría de los otros virus de ARN con cadena complementaria sin segmentar.

El VRS continúa siendo la causa más habitual de enfermedad vírica grave de las vías respiratorias bajas en recién nacidos y niños. Por consiguiente, continúa existiendo una necesidad urgente de disponer de la capacidad de diseñar una vacuna segura y efectiva que pueda prevenir las enfermedades graves en dicha población que a menudo requiere hospitalización. De un modo bastante sorprendente, la presente invención satisface ésta y otras necesidades relacionadas proporcionando un procedimiento para incorporar unos cambios definidos y predeterminados en el VRS infeccioso.

El documento WO 92/07940 (Samal) se refiere a unos genes que se obtienen a partir del virus respiratorio sincicial bovino (BRSV).

El documento WO 94/08022 (CSIRO) se refiere a un vector para proporcionar un gen exógeno a un dianocito, para la expresión del gen exógeno.

Grosfeld et al, Journal of Virology, vol. 69 n.º 9, septiembre de 1995 (páginas 5677 - 5686) se refiere a la replicación del ARN mediante un virus respiratorio sincicial (VRS) dirigida por las proteínas N, P y L.

Collins et al, PNAS volumen 88, noviembre de 1991 (páginas 9663 - 9667) se refiere al rescate de análogos sintéticos del ARN genómico del VRS.

Schnell et al, The Embo Journal, vol. 13, No. 8, páginas 4195 - 4203, 1994, se refiere a virus infecciosos de la rabia obtenidos a partir de ADNc clónico.

Murphy et al, Virus Research 32 (1994) 13 - 36 proporciona una actualización de los métodos de desarrollo de la vacuna contra el VRS y otras vacunas.

James E. Crowe, Vaccine, vol. 13, n.º 4, páginas 415 - 421 (1995) se refiere a unos métodos de desarrollo de vacunas contra las enfermedades provocadas por el VRS y el virus paragripal (VPG).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para producir un VRS infeccioso a partir de una o más moléculas de polinucleótidos que codifican dicho VRS, que comprende:

la expresión conjunta en una célula o lisado sin células de un vector de expresión que comprende un genoma o antigenoma de VRS, en el que el genoma o antigenoma de VRS recombinante se modifica por recombinación mediante la introducción de una mutación por inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, produciendo dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, acomodación al cultivo celular, restricción de la gama de hospedadores o una mayor inmunogenia del VRS en comparación con el VRS natural, y un vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótidos que codifican las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2 (ORF1) del VRS, con lo que se produce una partícula infecciosa del VRS.

La partícula infecciosa aislada de VRS puede ser una partícula vírica o subvírica. El virus infeccioso aislado del VRS puede ser un VRS humano, un VRS bovino o murino, o el genoma o el antigenoma pueden ser una quimera de dos o más genomas distintos de VRS, que presenten por ejemplo segmentos de nucleótidos de los VRS humano y bovino.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona un sistema para la producción recombinante, un sistema para la producción recombinante de partículas del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprenden uno o más vectores de expresión que comprenden un polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS, un polinucleótido que codifica una proteína de la nucleocápside (N), un polinucleótido que codifica una fosfoproteína de la nucleocápside (P), un polinucleótido que codifica una unidad proteica grande de la polimerasa (L) y un polinucleótido que codifica un factor de elongación proteico de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) del VRS, en la que, mediante la expresión de dichas proteínas N, P, L y M2 ORF1, se produce una partícula infecciosa y autorreplicante del VRS que comprende un polinucleótido que codifica el genoma o el antigenoma del VRS y dichas proteínas N, P, L y M2 (ORF1).

Ello puede implicar un vector de expresión que comprenda una molécula aislada de polinucleótido que codifique un genoma o antigenoma del VRS, en la que el genoma o antigenoma del VRS recombinante se modifica por recombinación mediante la incorporación de una mutación por inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, produciendo dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, un tamaño de calva reducido, restricción de la gama de hospedadores o un cambio en una partícula inmunógena del VRS en comparación con el VRS natural y un vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótidos que codifican las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que se expresa conjuntamente en una célula o lisado sin células, produciendo como consecuencia de ello un paquete infeccioso del VRS. El genoma o antigenoma del VRS y las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se pueden expresar conjuntamente mediante los mismos o distintos vectores de expresión. En algunos casos, cada una de las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se encuentran codificadas en distintos vectores de expresión. La molécula de polinucleótidos que codifica el genoma o antigenoma del VRS procede de una secuencia de VRS humano, bovino o murino, y puede ser una quimera de una secuencia de una cadena del VRS humano y por lo menos una secuencia del VRS no humano, o puede codificar el genoma o el antigenoma de una cepa natural de VRS. El genoma o antigenoma del VRS se puede modificar a partir de una cepa de VRS natural mediante una inserción, reordenación, eliminación o sustitución de nucleótidos, de tal modo que se codifique una alteración fenotípica que tenga como resultado la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al frío, un tamaño de calva reducido, una restricción de la gama de hospedadores o un cambio en un epítopo inmunógeno del VRS. El polinucleótido puede codificar un genoma o antigenoma de un VRS no humano o puede ser una quimera de un VRS no humano y por lo menos otro VRS de origen humano o no humano. La molécula de polinucleótidos que codifica el genoma o antigenoma se puede modificar asimismo para que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica una citocina, un epítopo de un linfocito T colaborador, una proteína G de un subgrupo distinto de VRS, un marcador de una zona de restricción o una proteína de un patógeno microbiano (por ejemplo un virus, bacteria u hongo) con capacidad para desencadenar una respuesta inmunitaria protectora en el hospedador pretendido.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona una célula o lisado sin células, que comprende:

(a)

un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS; y

(b)

un vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótidos que codifican las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2 (ORF1) del VRS;

con lo que mediante la expresión de dicho genoma o antigenoma del VRS y las proteínas N, P, L y del factor de elongación de la ARN polimerasa se combinan para producir una partícula infecciosa de VRS;

y en el que el genoma o antigenoma del VRS recombinante se modifica por recombinación mediante la incorporación de una mutación por inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, produciendo dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación a los cultivos tisulares, restricción de la gama de hospedadores o una mayor inmunogenia de la partícula del VRS en comparación con el VRS natural.

Mediante la expresión, el genoma o antigenoma y las proteínas N, P, L y del factor de elongación de la ARN polimerasa se combinan para producir una partícula infecciosa del VRS, tal como una partícula vírica o subvírica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema para la producción recombinante de partículas del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprenden una o más moléculas de polinucleótidos de ADN, comprendiendo las moléculas un polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS, un polinucleótido que codifica una proteína de la nucleocápside (N), un polinucleótido que codifica una fosfoproteína de la nucleocápside (P), un polinucleótido que codifica una subunidad proteica grande (L) de la polimerasa y un polinucleótido que codifica una proteína del factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) o el VRS, en el que mediante la expresión de dichas proteínas N, P, L y M2 ORF1, se produce una partícula infecciosa y autorreplicante de VRS que comprende un polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS, y dichas proteínas N, P, L y M2 (ORF1).

El genoma o antigenoma del VRS puede ser una secuencia de un VRS humano y versiones modificadas del mismo, tal como por ejemplo la SEC. ID. N.º 1 (que representa la secuencia codificante 5' a 3' mientras que el propio genoma es antisentido). El polinucleótido puede codificar asimismo un genoma o antigenoma de un VRS no humano, o codificar una quimera de VRS no humano y por lo menos otro VRS de origen humano o no humano.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B representan la construcción del ADNc que codifica el ARN antigenoma del VRS, representando la figura 1A las estructuras del ADNc y el antigenoma del ARN codificado (no se representa a escala). El diagrama del antigenoma comprende los siguientes aspectos: el triplete G no vírico del extremo 5' obtenido mediante el promotor T7, los cuatro marcadores de secuencia en las posiciones 1099 (que añade un nucleótido a la longitud), 1139, 5611, y 7559 (la numeración hace referencia a la primera base de la nueva zona de restricción), la ribozima y las secuencias de terminación T7 en tándem y el residuo no vírico simple de U fosforilado en la posición 3' obtenido en el extremo 3' mediante la ribozima de escisión (la zona de escisión se indica mediante una flecha). Se ilustran asimismo los segmentos de ADNc clónico que representan en conjunto el antigenoma completo. La caja ilustra la eliminación del sitio BamHI, una modificación que facilitó el ensamblaje: el fragmento natural BamHI-SalI (el sitio BamHI se representa en la línea superior en sentido positivo, subrayado) se sustituyó por un fragmento BglII-SalI obtenido mediante PCR (el sitio BglII se representa en la línea inferior, subrayado; su extremo de unión de 4 nucleótidos [representado en cursiva] es compatible con el del BamHI). Ello tiene como resultado el cambio de un único nucleótido (línea intermedia, subrayado) que es imperceptible en el nivel aminoácido.

La figura 1B representa los marcadores de la secuencia contenidos en el antigenoma de ARN codificado por el ADNc, encontrándose las secuencias en sentido positivo y numeradas con respecto al primer nucleótido del complemento de la región guía como 1; las identidades entre las cepas A2 y 18537, que representan los subgrupos A y B, respectivamente, se indican con puntos; las secuencias que representan las zonas de restricción del ADNc están subrayadas; las señales de transcripción de inicio del gen (GS) y de finalización del gen (GE) se encuentran encasilladas; el codón de iniciación del marco de lectura abierto de traducción N en la posición 1141 se representa con letra itálica y los marcadores de secuencia se indican debajo de cada secuencia. En la secuencia superior, se introdujo un único residuo C en la posición 1099 para crear un sitio AflII en la región intergénica NSII-N, y los nucleótidos AG de las posiciones 1139 y 1140 inmediatamente en la posición 5' del marco de lectura abierto de traducción N se sustituyeron con CC para crear un nuevo sitio NcoI. En la secuencia de la parte media, la sustitución de la G y el U de las posiciones 5612 y 5616, respectivamente, crearon un nuevo sitio StuI en la región intergénica G - F. En la secuencia inferior, una sustitución de la C en la posición 7560 originó un nuevo sitio SphI en la región intergénica F-M2.

La figura 2 representa la construcción de un ADNc D46/1024CAT que codifica el antigenoma del VRS que contiene la CAT ORF flanqueada por las señales de transcripción del VRS (que no se representan a escala, los segmentos específicos del VRS se representan en color oscuro y la secuencia CAT en color claro). La fuente de la casete de transcripción del gen CAT fue el minigenoma VRS-CAT de ADNc 6196 (diagrama de la parte superior). El minigenoma VRS-CAT contiene la región guía, las señales de inicio del gen (GS) y de finalización del gen (GE), las secuencias génicas no codificantes (NC) del VRS y la CAT ORF, con las zonas de la endonucleasa de restricción XmaI precediendo la señal GS y siguiendo a la señal GE. Se indican las longitudes en nucleótidos de dichos elementos y las secuencias (sentido positivo) que rodean los sitios XmaI se representan encima del diagrama. Se incorporó un ligador XmaI de 8 nucleótidos en el sitio StuI del plásmido predecesor D46 para construir el plásmido D46/1024. El fragmento XmaI - XmaI del plásmido 6196 se incorporó al plásmido D46/1024 para construir el plásmido D46/1024CAT. El ARN codificado por el ADNc D46 se representa en la parte inferior, comprendiendo tres residuos G no víricos en el extremo 5' obtenidos mediante el promotor T7 y el residuo U fosforilado en el extremo 3' obtenido mediante la escisión de la ribozima en cabeza de martillo; las longitudes en nucleótidos no comprenden dichos nucleótidos no víricos. El gen L se representa descentrado para indicar el solapamiento génico.

Descripción de las formas de realización específicas

La presente invención proporciona la producción de VRS infeccioso a partir de ADNc. El VRS infeccioso se produce mediante la expresión intracelular conjunta de un ADNc que codifica el genoma o antigenoma del ARN del VRS, junto con aquellas proteínas víricas necesarias para generar una nucleocápside que se transcriba y replique, preferentemente una o más secuencias que codifican una proteína principal de la nucleocápside (N o NP), la fosfoproteína de la nucleocápside (P), la subunidad proteica grande (L) de la polimerasa, y una proteína M2(ORF1). Las partículas infecciosas del VRS se producen mediante un sistema recombinante. El sistema de producción recombinante permite la introducción de cambios definidos en el VRS infecciosa, cuyos cambios resultan útiles en una amplia gama de aplicaciones tales como: el desarrollo de cepas vacunales atenuadas que presentan unas mutaciones atenuantes predeterminadas y definidas; el análisis de la biología molecular y la patogenia del VRS utilizando, por ejemplo, mutaciones definidas para alterar las funciones o la expresión de las proteínas del VRS; la mejora del crecimiento en cultivo; la identificación de mutaciones atenuantes en cepas vacunales actuales o futuras al diferenciar las mutaciones accidentales imperceptibles con respecto a las responsables de diferencias fenotípicas; la producción de virus vacunales modificados para adaptarse a la deriva antigénica: la mejora de la inmunogenia vacunal; la eliminación de epítopos asociados a inmunopatologías no pretendidas; la introducción de genes exógenos, completos o parciales, que codifican antígenos protectores para generar cepas de VRS con capacidad para producir inmunidad contra el VRS y contra el virus o agente a partir del que se ha obtenido el antígeno protector; la introducción de genes exógenos, completos o parciales, que codifican moduladores del sistema inmunitario tales como las citocinas o epítopos de los linfocitos T, para aumentar la inmunogenia del virus vacunal; etc.

Según la presente invención, se construye un ADNc que codifica un genoma o antigenoma del VRS para su expresión conjunta intracelular o in vitro con las proteínas víricas necesarias para formar el VRS infeccioso. Por "antigenoma del VRS" se entiende una molécula aislada de polinucleótido codificante que actúa como molde en la síntesis del genoma predecesor del VRS. Preferentemente se construye un ADNc que es una versión codificante del genoma del VRS, que corresponde al ARN intermedio de replicación, o antigenoma, de tal modo que se minimice la posibilidad de hibridación de los transcritos codificantes de las secuencias complementarias que codifican las proteínas necesarias para generar una nucleocápside que se transcriba y replique, es decir, las secuencias que codifican las proteínas N, P, L y M2(ORF1). En un sistema de minigenoma del VRS, el genoma y antigenoma son igualmente activos en lo que se refiere al rescate, tanto si se complementan con el VRS o mediante plásmidos, lo que indica que se pueden utilizar tanto el genoma como el antigenoma y, por lo tanto, la selección se puede realizar basándose en la metodología u otros motivos.

Un genoma natural del VRS comprende una molécula de polinucleótidos antisentido que, mediante el ARNm vírico complementario, codifica once especies de proteínas víricas, es decir, las especies no estructurales NS1 y NS2, N, P, matriz (M), hidrófoba pequeña (SH), glucoproteína (G), fusión (F), M2 (ORF1), M2(ORF2) y L, sustancialmente tal como se describe en Mink et al., Virology 185: 615 - 624 (1991), Stec et al., Virology 183: 273 - 287 (1991) y Connors et al., Virol. 208: 478 - 484 (1995). Para el propósito de la presente invención, el genoma o antigenoma del VRS recombinante de la presente invención necesita contener únicamente aquellos genes o partes de los mismos necesarios para producir las partículas infecciosas víricas o subvíricas codificadas de este modo. Además, los genes o partes de los mismos se han de proporcionar mediante más de una moléculas de polinucleótidos, es decir, se puede proporcionar un gen mediante el complemento o elemento similar de una molécula de nucleótidos independiente.

Por VRS recombinante se entiende una partícula vírica o subvírica del VRS o seudo-VRS obtenida directa o indirectamente a partir de un sistema de expresión recombinante o reproducida a partir de partículas víricas o subvíricas producidas a partir del mismo. El sistema de expresión recombinante utilizará un vector de expresión recombinante que comprenda el ensamblaje de por lo menos un elemento o elementos genéticos que desempeñen un papel regulador en la expresión génica del VRS, por ejemplo, un promotor, una secuencia estructural o codificante que se transcriba en ARN del VRS y secuencias apropiadas de iniciación y finalización de la transcripción.

Para producir VRS infecciosos a partir del genoma o el antigenoma expresado por el ADNc, el genoma o antigenoma se expresa conjuntamente con aquellas proteínas del VRS necesarias para (i) producir una nucleocápside capaz de replicar el ARN y (ii) crear nucleocápsides descendentes que sean competentes tanto para la replicación como la transcripción del ARN. La transcripción del genoma de la nucleocápside proporciona las otras proteínas del VRS e inicia una infección productiva. Alternativamente, se pueden proporcionar las proteínas del VRS necesarias para una infección productiva por expresión conjunta.

Se puede construir un antigenoma del VRS para utilizar en la presente invención, por ejemplo, mediante el ensamblaje de segmentos clónicos de ADNc, que representen en conjunto el antigenoma completo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; descrita en, por ejemplo, las patentes US n.º 4.683.195 y 4.683.202, y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications ("Protocolos de la PCR: Guía de Métodos y Aplicaciones"), Innis et al.; ed., Academic Press, San Diego (1990)) de copias de transcripción inversa del ARNm o ARN genómico del VRS. Por ejemplo, los ADNc que contienen el extremo izquierdo del antigenoma, que se extienden a partir de un promotor apropiado (por ejemplo, el promotor T7 de la ARN polimerasa) y el complemento de la región guía para el gen SH, se ensamblan en un vector de expresión apropiado, tal como un plásmido (por ejemplo, pBR322) diversos cósmidos, fagos o vectores de víricos de ADN disponibles. El vector se puede modificar por mutagenia y/o inserción de zonas de restricción únicas que contengan un polienlazador sintético diseñadas para facilitar el ensamblaje. Por ejemplo, un vector plasmídico que se describe en la presente memoria se obtuvo a partir del pBR322 mediante la sustitución del fragmento pstI-EcoR1 con un ADN sintético que contenía los sitios de los enzimas de restricción adecuados. El pBR322 estabilizó los nucleótidos 3716 - 3732 de la secuencia del VRS, cuyas eliminaciones o inserciones de nucleótidos mantenidos de algún otro modo, y la propagación del plásmido se realizó en la cepa bacteriana DH10B para evitar la duplicación y la inserción material que se produjo de algún otro modo en la proximidad del nt4499. Para facilitar la preparación, los genes G, F y M2 se pueden ensamblar en un vector independiente, tal como el L y las secuencias posteriores. El extremo derecho (por ejemplo, las secuencias L y posterior) del plásmido antigenoma pueden contener secuencias adicionales, si se pretende de este modo, tales como una ribozima flanqueadora y las secuencias de terminación de la transcripción T7 en tándem. La ribozima puede ser de tipo cabeza de martillo (por ejemplo, Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677 - 5686 (1995)), que podría producir un extremo 3' que contuviera un nucleótido simple no vírico, o puede ser cualquiera de las otras ribozimas adecuadas, tales como la del virus \delta de la hepatitis (Perrotta et al., Nature 350: 434 - 436 (1991)) que produciría un extremo libre 3' de nucleótidos que no pertenecen al VRS. Un segmento intermedio (por ejemplo, un fragmento G - M2) se introduce en la zona de restricción apropiada del plásmido guía - SH, que a su vez es el receptor del fragmento L - posterior - ribozima - finalizador, obteniéndose un antigenoma completo. En un ejemplo ilustrativo representado en la figura 1A, el extremo guía se construyó para que entrara en contacto con el promotor T7 de la ARN polimerasa que comprendía tres residuos G transcritos para una actividad óptima; la transcripción proporciona dichas tres G no víricas en el extremo 5' del antigenoma. Se pueden excluir dichas tres G no víricas para obtenerse un extremo 5' sin nucleótidos no víricos. Para generar un extremo 3' aproximadamente correcto, el extremo posterior se construyó adyacente a la ribozima en cabeza de martillo, que mediante la escisión proporcionaría un residuo simple de U fosforilado en la posición 3' del ARN codificado.

Se pueden realizar diversas inserciones y eliminaciones de nucleótidos en el genoma o antigenoma del VRS. La longitud en nucleótidos del genoma del VRS humano natural (15.222 nucleótidos) es un múltiplo de seis, y los elementos de los géneros Paramyxovirus y Morbillivirus cumplen la "regla del seis", es decir, los genomas (o minigenomas) se replican de un modo eficiente únicamente cuando su longitud en nucleótidos es un múltiplo de seis (lo que se considera un requisito para una separación precisa de los residuos de nucleótidos con respecto a la proteína NP de encapsidación). La alteración de la longitud del genoma del VRS mediante un residuo simple no tiene efecto alguno en la eficiencia de la replicación y el análisis de la secuencia de diversos minigenomas mutantes distintos que siguen el paso demostraron que se mantenían las diferencias en la longitud sin cambios compensatorios. De este modo, el VRS carece del requisito estricto de una longitud de genoma múltiple de seis y se pueden realizar inserciones y eliminaciones de nucleótidos en el genoma o antigenoma del VRS sin anular la replicación del VRS recombinante de la presente invención.

Unos medios alternativos para construir el ADNc que codifica el genoma o antigenoma comprenden la PCR por transcripción inversa utilizando unas condiciones de PCR mejoradas (por ejemplo, tal como se describe en Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91: 5695 - 5699 (1994)) para reducir el número de componentes de subunidades de ADNc hasta uno o dos elementos. En otras formas de realización, se pueden utilizar unos promotores distintos (por ejemplo, T3, SP6) o unos ribozimas distintos (por ejemplo, el del virus \delta de la hepatitis. Se pueden utilizar en la propagación distintos vectores de ADN (por ejemplo, cósmidos) para incorporar mejor el genoma o antigenoma de un tamaño superior.

Gracias a la presente invención se han hecho posibles diversas alteraciones del genoma o antigenoma del VRS para su incorporación en VRS recombinantes infecciosos. Por ejemplo, se pueden introducir genes exógenos, cambiar el orden de los genes, eliminar solapamientos de genes, sustituir el promotor del genoma del VRS con su antigenoma homólogo, eliminar partes de genes (por ejemplo, las prolongaciones citoplasmáticas de genes de glucoproteínas) e incluso eliminar genes completos. Se pueden realizar modificaciones en la secuencia para facilitar genomanipulaciones, tales como la inserción de zonas de restricción únicas en diversas regiones intergénicas (por ejemplo, un sitio StuI único entre los genes G y F) o en cualquier otro lugar. Se pueden eliminar secuencias génicas sin traducir para aumentar la capacidad de inserción de secuencias exógenas.

El VRS infeccioso producido a partir del genoma o antigenoma expresado por el ADNc puede ser de cualquier cepa de VRS o seudo-VRS, por ejemplo, humana, bovina, murina, etc., o de cualquier neumovirus, por ejemplo, el virus de la neumonía de ratones o el virus de la rinotraqueítis del pavo. Para provocar una respuesta inmunitaria protectora, la cepa de VRS ha de ser endógena al paciente que se pretende inmunizar, tal como un VRS humano que se utilice para inmunizar seres humanos. Sin embargo, se puede modificar el genoma o antigenoma, para expresar los genes del VRS de distintos tipos. De este modo, el VRS infeccioso destinado a la administración en seres humanos puede ser un VRS humano que se haya modificado para que contenga genes de un tipo de VRS bovino o murino con el propósito, por ejemplo, de la atenuación, o se puede modificar un VRS bovino para que contenga genes que codifiquen epítopos o proteínas que desencadenen la protección ante una infección por VRS humano, por ejemplo, los genes de la glucoproteína del VRS humano se pueden sustituir por los genes de la glucoproteína bovina de tal modo que el VRS bovino, que presenta una capacidad limitada para multiplicarse en un hospedador humano, desencadene una respuesta inmunitaria protectora en los seres humanos contra las cepas de VRS.

Las proteínas N, P y L, necesarias para la replicación del ARN, requieren un factor de elongación de la ARN polimerasa tal como la proteína M2(ORF1) para la transcripción asociativa. De este modo, se requiere la M2(ORF1) o un factor de elongación de la transcripción sustancialmente equivalente para los virus de ARN de cadena negativa para producir un VRS infeccioso y constituye un elemento necesario de las nucleocápsides funcionales durante la infección productiva. La necesidad de la proteína M2(ORF1) es coherente con su papel de factor de elongación de la transcripción. La necesidad de la expresión de la proteína del factor de elongación de la ARN polimerasa en el caso de los virus de ARN con cadena negativa constituye una característica de la presente invención. La M2(ORF1) se puede proporcionar mediante la expresión del gen M2 completo, aunque de este modo la segunda ORF2 se puede expresar también y ejercer un efecto inhibidor de la replicación del ADN. Por lo tanto, para la producción de virus infecciosos utilizando el gen M2 completo, se han de equilibrar las actividades de dos ORF para permitir una expresión suficiente de la M(ORF1) a fin de proporcionar la actividad de elongación de la transcripción, pero no tanta de la M(ORF2) para inhibir la replicación del ARN. Alternativamente, la proteína ORF1 se obtiene a partir de un ADNc genomanipulado para que carezca de la ORF2 o que codifique una ORF2 deficiente. La eficiencia en la producción de virus se puede aumentar asimismo mediante la expresión conjunta de genes de proteínas víricas adicionales, tales como los que codifican los constituyentes de la cubierta (es decir, las proteínas SH, M, G y F).

Los polinucleótidos aislados (por ejemplo, ADNc) que codifican el genoma o antigenoma y, por separado, las proteínas N, p, L y M2(ORF1), se incorporan por transfección, electroporación, inserción mecánica, transducción o procedimiento similar, a las células que puede soportar una infección productiva por VRS, por ejemplo, las células HEp-2, FRhL-DBS2, MRC y Vero. La transfección de secuencias de polinucleótidos aislados se puede realizar en células cultivadas mediante, por ejemplo, transfección en la que interviene el fosfato cálcico (Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham y Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1: 841 - 845 (1982)), transfección en la que interviene el DEAE-dextrano (Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)), transfección en la que intervienen lípidos catiónicos (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79 (1993)) o un reactivo de transfección disponible comercialmente, por ejemplo, LipofectACE® (Life Technologies). Las proteínas N, P, L y M2(ORF1) están codificadas por uno o más vectores de expresión que pueden ser iguales o distintos de los que codifican el genoma o antigenoma, y diversas combinaciones de los mismos. Se pueden incorporar proteínas adicionales, si se pretende de este modo, codificadas por su propio vector o por un vector que codifique una proteína N, P, L o M2(ORF1), o el genoma o antigenoma completo. Se puede realizar la expresión del genoma o antigenoma y las proteínas a partir de plásmidos sometidos a transfección, por ejemplo, con cada ADNc encontrándose bajo el control de un promotor para la ARN polimerasa T7, que a su vez se proporciona mediante infección, transfección o transducción con un sistema de expresión para la ARN polimerasa T7, por ejemplo, una cepa MVA del virus de la variolovacuna que exprese la ARN polimerasa T7 (Wyatt et al., Virology, 210: 202 - 205 (1995)). Las proteínas víricas y/o la ARN polimerasa T7, se pueden obtener asimismo a partir de células de mamíferos transformadas o mediante la transfección de ARNm o proteínas preformadas.

Alternativamente, la síntesis del antigenoma o genoma junto con las proteínas víricas mencionadas anteriormente se puede realizar in vitro (sin células) en una reacción combinada de transcripción - traducción, seguido por la transfección en células. O se puede sintetizar el antigenoma o genoma de ARN in vitro y someterlo a transfección en células que expresan las proteínas del VRS.

Disponer del clon infeccioso de la presente invención permite la alteración del genoma (o antigenoma) del VRS introduciendo mutaciones definidas. Por "clon infeccioso" se entiende el ADNc o un producto, sintético o de algún otro modo, que se puede transcribir en ARN con capacidad de actuar como molde para producir el genoma de partículas víricas o subvíricas infecciosas. Las mutaciones definidas se pueden introducir mediante técnicas convencionales (por ejemplo, mutagenia específica de una región) en una copia en ADNc del genoma o antigenoma. La utilización de subfragmentos del ADNc de antigenoma para ensamblar un ADNc antigenoma completo tal como se describe en la presente memoria tiene la ventaja de que cada región se puede genomanipular por separado (los ADNc más pequeños resultan más sencillos de manipular que los grandes) y a continuación ensamblarlos fácilmente en un ADNc completo. El ADNc del antigenoma o genoma completo, o cualquier subfragmento del mismo, se puede utilizar como molde de una mutagenia específica de oligonucleótidos. Ello se puede realizar mediante la forma intermedia de un fagómido de cadena simple, utilizando por ejemplo un kit Muta-gen de Bio-Rad, o un procedimiento que utilice un plásmido de doble cadena directamente como molde, tal como el kit de mutagenia Chameleon de Stratagene, o mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando tanto un iniciador de oligonucleótidos o un molde que contenga una o más mutaciones de interés. Un subfragmento mutado se puede ensamblar en el ADNc del antigenoma o genoma completo. Se conocen otras técnicas diversas de mutagenia y se encuentran disponibles para utilizar en la producción de mutaciones de interés en el ADNc del antigenoma o genoma del VRS. Las mutaciones pueden variar desde cambios en un nucleótido simple hasta la sustitución de fragmentos grandes de ADNc que contengan uno o más genes o regiones génicas.

De este modo, en una forma de realización presentada a título de ejemplo, las mutaciones se incorporan utilizando in vitro kit de mutagenia del fagómido Muta-gene disponible en Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA. En pocas palabras, se clona el ADNc que codifica un genoma o antigenoma de VRS en el plásmido pTZ18U y se utiliza para transformar las células DH5\alpha F' (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Las preparaciones de fagómidos se preparan tal como recomiende el fabricante. Los oligonucleótidos se preparan para la mutagenia mediante la introducción de un nucleótido alterado en la posición pretendida del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el genoma o antigenoma genéticamente alterado se amplía a continuación.

La capacidad para introducir mutaciones definidas en VRS infecciosos presenta muchas aplicaciones, entre ellas los análisis de la biología molecular y la patogenia del VRS. Por ejemplo, las funciones de las proteínas del VRS, entre ellas las proteínas NS1, NS2, SH, M2 (ORF1) y M2 (ORF2), se pueden investigar incorporando mutaciones que eliminen o reduzcan su nivel de expresión, o que proporcionen una proteína mutante.

A título de ejemplo adicional, la secuencia de la zona de escisión de la proteína F, o el supuesto dominio de enlace de la proteína G se puede modificar para analizar los efectos sobre el crecimiento en cultivo tisular y la infección y la patogenia en animales de laboratorio.

Los papeles que desempeñan diversas características estructurales del ARN genómico, tales como los promotores, las regiones intergénicas, el solapamiento de genes y las señales de transcripción se pueden analizar utilizando los procedimientos y las composiciones de la presente invención. El análisis de las proteínas que actúan en trans y de las secuencias de ARN que actúan en cis utilizando el antigenoma de ADNc completo se puede realizar en paralelo utilizando minigenomas del VRS (por ejemplo, Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995)), cuyo estado dependiente de los elementos auxiliares resulta útil en la caracterización de aquellos mutantes que son demasiado inhibidores para recuperarlos en los virus infecciosos independientes de la replicación.

Se ha desarrollado un cierto número de cepas atenuadas de VRS como vacunas experimentales para la administración intranasal utilizando múltiples ciclos de mutagenia química para introducir una pluralidad de mutaciones en un virus que ya se encontraba atenuado durante el pase en frío (por ejemplo, Connors et al., Virology 208: 478 - 484 (1995); Crowe et al., Vaccine 12: 691 - 699 (1994); y Crowe et al., Vaccine 12: 783 - 790 (1994)). El análisis en roedores, chimpancés, adultos y recién nacidos indica que algunas de estas cepas de vacunas experimentales son genéticamente relativamente estables, son muy inmunógenas y se pueden atenuar satisfactoriamente. El análisis de la secuencia de nucleótidos de algunos de estos virus atenuados indica que cada nivel superior de atenuación se encuentra asociado a dos o más nuevas sustituciones de nucleótidos y aminoácidos (Connors et al., supra). La presente invención proporciona la capacidad de distinguir entre mutaciones casuales sin repercusión fenotípica con respecto a las responsables de las diferencias fenotípicas como consecuencia de la incorporación de las mutaciones, por separado y en combinaciones diversas, en el genoma o antigenoma del VRS natural infeccioso. Este proceso identifica las mutaciones responsables de fenotipos tales como la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, un tamaño de calva reducido, restricción de la gama de hospedadores, etc. Las mutaciones de esta lista se pueden incorporar en diversas combinaciones para calibrar un virus vacunal hasta un nivel adecuado de atenuación, etc., tal como se pretenda. Además, la presente invención proporciona la capacidad de combinar mutaciones de cepas distintas de virus en una sola cepa.

La presente invención proporciona asimismo nuevos métodos de atenuación. Por ejemplo, los genes internos individuales del VRS humano se pueden sustituir por su VRS correspondiente bovino, murino o de otro tipo. Ello puede comprender parte o todo de uno o más de los genes NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) y L, o partes no inmunógenas de los genes G y F. Recíprocamente, se proporcionan los medios para generar un VRS bovino atenuado vivo incorporando genes atenuantes humanos en el contexto de un genoma o antigenoma del VRS bovino. El VRS humano que presenta glucoproteínas del VRS bovino presenta una restricción de la gama de hospedadores favorable para las preparaciones vacunales humanas. Las secuencias del VRS bovino que se pueden utilizar en la presente invención se describen en, por ejemplo, Pastey et al., J. Gen. Viol. 76: 193 - 197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29: 195 - 202. (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73: 737 - 741 (1992); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74: 2001 - 2004 (1993); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73: 2441 - 2444 (1992); y Zamora et al., Virus Res. 24: 115 - 121 (1992).

La presente invención proporciona asimismo la capacidad de analizar otros tipos de mutaciones atenuantes y de incorporarlas al VRS infeccioso para vacunas u otras aplicaciones. Por ejemplo, una cepa de virus de la neumonía de ratones no patógena adaptada en cultivo tisular (el homólogo murino del VRS) carece de la región posterior citoplasmática de la proteína G (Randhawa et al., Virology 207: 240 - 245 (1995)). Por analogía, se pueden eliminar o modificar los dominios citoplasmático y transmembrana de cada una de las glucoproteínas del VRS, F, G y SH, a fin de alcanzar la atenuación.

Otras mutaciones que se pueden utilizar en el VRS infeccioso de la presente invención comprenden las mutaciones en señales que actúan en cis identificadas durante el análisis de las mutaciones del minigenoma del VRS. Por ejemplo, el análisis de las inserciones y las eliminaciones de las secuencias flanqueadoras guía y posterior identificó promotores víricos y señales de transcripción y proporcionó una serie de mutaciones asociadas a diversos grados de reducción de la replicación o la transcripción del ARN. La mutagenia saturante (mediante la que cada posición a su vez se modifica con cada una de las alternativas de nucleótidos) de dichas señales que actúan en cis ha identificado asimismo muchas mutaciones con un nivel reducido (o en un caso aumentado) de replicación o transcripción del ARN. Cualquiera de dichas mutaciones se puede incorporar al genoma o antigenoma completo tal como se ha descrito en la presente memoria. Otras mutaciones implicaron la sustitución del extremo 3' del genoma con su homólogo del antigenoma, que se asocia a cambios en la replicación y la transcripción del ARN. Además, las regiones intragénicas (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 83: 4594 - 4598 (1986)) se pueden acortar o alargar o cambiar el contenido de su secuencia, y el solapamiento génico natural (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 5134 - 5138. (1987)) se puede eliminar o cambiar a una región intergénica distinta mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

En otra forma de realización, el VRS útil en una formulación vacunal se puede modificar ventajosamente para adaptarse a la deriva antigénica en los virus circulantes. Habitualmente, la modificación se realizará en las proteínas G y/o F. El gen completo de G o F, o el/los segmento(s) que codifica(n) las regiones inmunógenas particulares de los mismos, se incorporan al ADNc del genoma o antigenoma del VRS mediante la sustitución de la región correspondiente en el clon infeccioso o mediante la adición de una o más copias del gen de tal modo que se representen diversas formas antigénicas. La descendencia del virus obtenida a partir del ADNc del VRS modificado se utiliza a continuación en los protocolos de vacunación contra las nuevas cepas. Además, la inclusión del gen de la proteína G del subgrupo B del VRS amplía la respuesta para cubrir un mayor espectro de las diversas cepas de los subgrupos A y B presentes en la población humana.

Se puede genomanipular asimismo un clon infeccioso de la presente invención para aumentar su inmunogenia y producir un nivel de protección superior al que produce la infección natural, o al contrario, para identificar y eliminar epítopos asociados a reacciones inmunopatológicas no pretendidas. La mayor inmunogenia de las vacunas producidas mediante la presente invención corrige uno de los grandes obstáculos en el control del VRS, en particular la naturaleza incompleta de la inmunidad provocada por una infección natural. Se puede incorporar un gen adicional en, o en la proximidad de, el genoma o antigenoma del VRS que se encuentra bajo el control de un conjunto independiente de señales de transcripción. Los genes de interés comprenden aquellos que codifican las citocinas (por ejemplo, de la IL-2 hasta la IL-15, especialmente IL-3, IL-6 e IL-7, etc.), el \gamma-interferón y las proteínas ricas en epítopos de los linfocitos T cooperadores. La proteína adicional se puede expresar como una proteína separada o como una quimera genomanipulada a partir de una segunda copia de una de las proteínas del VRS, tales como la SH. Ello proporciona la capacidad de modificar y mejorar la respuesta inmunitaria contra el VRS tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo.

Para utilizar en vacunas, el virus producido según la presente invención se puede utilizar directamente en formulaciones vacunales o liofilizado, si se pretende de este modo, utilizando unos protocolos de liofilización muy conocidos por los expertos en la materia. Los virus liofilizados se mantendrán habitualmente a aproximadamente 4ºC. Cuando estén listos para utilizar, se reconstituyen los virus liofilizados en una disolución estabilizadora, por ejemplo, una disolución salina o que comprenda SPG, Mg^{++} y HEPES, con o sin aditivos, tal como se describirá posteriormente.

De este modo, las vacunas contra el VRS de la presente invención contienen como principio activo una cantidad inmunogénicamente efectiva del VRS producido tal como se ha descrito en la presente memoria. El virus modificado se puede incorporar a un hospedador con un excipiente y/o aditivo fisiológicamente aceptable. Los excipientes aptos resultan muy conocidos en la técnica y comprenden, por ejemplo, agua, agua con disolución amortiguadora, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Las disoluciones acuosas resultantes se pueden envasar para utilizar de este modo o liofilizadas, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de su administración, tal como se ha mencionado anteriormente. Las composiciones pueden comprender sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se necesite, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, por ejemplo ajustando el pH y con sustancias amortiguadoras, sustancias para ajustar la tonicidad, humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y similares. Los aditivos aceptables comprenden el aditivo de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre, que son materiales muy conocidos en la técnica.

Mediante la inmunización con una composición de VRS tal como se ha descrito en la presente memoria, con aerosoles, gotículas, por vía oral, tópica u otra vía, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo anticuerpos específicos contra las proteínas del virus VRS, por ejemplo, las glucoproteínas F y G. Como resultado de la vacunación, el hospedador pasa a ser por lo menos parcialmente o completamente inmune a la infección por VRS, o resistente a desarrollar una infección moderada o grave por VRS, en particular en las vías respiratorias bajas.

El hospedador al que se administra la vacuna puede ser cualquier mamífero susceptible de infección por VRS o un virus muy relacionado cuyo hospedador pueda generar una respuesta inmunitaria protectora contra los antígenos de la cepa vacunal. Por lo tanto, los hospedadores comprenden seres humanos, primates no humanos, bovinos, equinos porcinos, ovinos, caprinos, lagomorfos, roedores, etc. Por consiguiente, la presente invención proporciona unos procedimientos para crear vacunas para una pluralidad de usos veterinarios y en seres humanos.

Las composiciones vacunales que contienen el VRS de la presente invención se administran a un hospedador susceptible de infección por VRS, o de algún modo en riesgo de contraer la misma, para aumentar la propia capacidad de respuesta inmunitaria del hospedador. Dicha cantidad se define como una "dosis inmunogénicamente efectiva". En esta utilización, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y el peso del hospedador, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente se encuentra comprendida entre aproximadamente 10^{3} y aproximadamente 10^{6} unidades formadoras de calvas (PFU) o más virus por hospedador, más habitualmente entre aproximadamente 10^{4} y 10^{5} PFU virus por hospedador. En cualquier caso, las formulaciones vacunales han de proporcionar una cantidad de VRS modificado de la presente invención suficiente para proteger efectivamente el paciente hospedador contra una infección por VRS grave o potencialmente mortal.

El VRS producido según la presente invención se puede combinar con virus de otro subgrupo o cepas para alcanzar la protección contra diversos subgrupos o cepas de VRS, o se pueden genomanipular epítopos protectores de dichas cepas en un virus tal como se ha descrito en la presente memoria. Habitualmente, los distintos virus se encontrarán en una mezcla y se administrarán simultáneamente, poro se pueden administrar asimismo por separado. Por ejemplo, debido a que las glucoproteínas F de los dos subgrupos de VRS difieren únicamente en aproximadamente el 11% de la secuencia de aminoácidos, esta similitud constituye la base de una respuesta inmunitaria protectora cruzada, tal como se ha observado en animales inmunizados con el VRS o el antígeno F y provocados con una cepa heteróloga. De este modo, la inmunización con una cepa puede proteger contra distintas cepas del mismo subgrupo o de uno
distinto.

En algunos casos se puede pretender combinar las vacunas contra el VRS de la presente invención con vacunas que comprendan respuestas protectoras contra otros agentes, en particular otros virus infantiles. Por ejemplo, la vacuna contra el VRS de la presente invención se puede administrar simultáneamente con la vacuna contra el virus paragripal, tal como se describe en Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1175 - 1182 (1991). En otro aspecto de la presente invención se puede utilizar el VRS como vector para antígenos protectores contra otros patógenos de las vías respiratorias, tales como el virus paragripal, incorporando las secuencias que codifican dichos antígenos protectores en el genoma o antigenoma del VRS que se utiliza para producir el VRS infeccioso tal como se describe en la presente memoria.

Se pueden realizar administraciones simples o múltiples de las composiciones vacunales de la presente invención. En los recién nacidos y lactantes, se puede requerir una administración múltiple para provocar unos niveles suficientes de inmunidad. La administración se debería iniciar durante el primer mes de vida y continuar a intervalos a lo largo de la infancia, por ejemplo a los dos meses, seis meses, un año y dos años, necesarios para mantener unos niveles de protección suficientes contra la infección natural (silvestre). De un modo similar, los adultos que sean particularmente susceptibles de infecciones por VRS repetidas o graves, tales como, por ejemplo, los profesionales sanitarios, cuidadores profesionales, miembros de la familia de niños, ancianos, pacientes con las funciones cardiopulmonares afectadas, pueden requerir diversas inmunizaciones para establecer y/o mantener unas respuestas inmunitarias protectoras. Se puede realizar el seguimiento de los niveles de inmunogenia provocada determinando las cantidades de anticuerpos secretados y séricos neutralizantes y las dosis ajustadas o las vacunas repetidas tantas veces como sea necesario para mantener los niveles de protección pretendidos. Además, unos virus vacunales distintos pueden resultar ventajosos para distintos grupos de receptores. Por ejemplo, una cepa de VRS genomanipulada que exprese una proteína adicional rica en epítopos de linfocitos T puede resultar particularmente más ventajosa para los adultos que para los recién nacidos.

En otro aspecto de la presente invención se utiliza el VRS como vector para genoterapia transitoria de las vías respiratorias. Según la presente forma de realización el genoma o antigenoma del VRS recombinante incorpora una secuencia capaz de codificar un producto génico de interés. El producto génico de interés se encuentra bajo el control del mismo promotor, o de uno distinto, que controla la expresión del VRS. Se administra el VRS infeccioso producido mediante la expresión conjunta del genoma o antigenoma del VRS recombinante con las proteínas N, P, L y M2(ORF1) y que contiene una secuencia que codifica el producto génico de interés. La administración se realiza habitualmente mediante un aerosol, nebulizador u otro instrumento de aplicación tópica para las vías respiratorias del paciente que se está tratando. Se administra el VRS recombinante en un nivel suficiente para obtener la expresión del producto génico pretendido en unos niveles terapéuticos o preventivos. Los ejemplos de productos génicos que se administran en este procedimiento comprenden los que codifica, por ejemplo, aquellos particularmente aptos para la expresión transitoria, por ejemplo, la interleucina-2, la interleucina-4, el \gamma- interferón, el GM-CSF, el G-CSF, la eritropoyetina y otras citocinas, los glucocerebrósidos, la fenilalanina hidroxilasa, el regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis cística (CFTR), la hipoxantina - guanina fosforribosil transferasa, las citotoxinas, los genes oncoinhibidores, los ARN antisentido y los antígenos vacunales.

Se proporcionan los siguientes ejemplos a título ilustrativo y no limitativo.

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Ejemplo I

Construcción de un ADNc que codifica un antigenoma del VRS

Se construyó un clon de ADNc que codificaba el antigenoma de la cepa A2 del VRS, tal como se representa en la figura 1A. El ADNc se sintetizó en segmentos mediante transcripción inversa (RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos sintéticos como iniciadores y ARNm de VRS intracelular o ARN genómico aislado a partir de viriones purificados como molde. El ADNc final se flanqueó en el extremo guía mediante el promotor de la ARN polimerasa T7, que comprendía tres residuos de G transcritos para una actividad óptima. La transcripción tuvo como resultado la donación de dichas tres G no víricas al extremo 5' del antigenoma. Para generar un extremo 3' prácticamente correcto, se construyó el extremo posterior del ADNc adyacente a la ribozima en cabeza de martillo, que por escisión proporcionará un residuo simple de U fosforilado en la posición 3' al extremo 3' del ARN codificado (Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677 - 5686). La secuencia de la ribozima se siguió mediante un par de secuencias de terminación en tándem de la ARN polimerasa T7. (La adición de tres residuos G 5' y un residuo U 3' al minigenoma del VRS codificado por el ADNc que contenía el gen indicador de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) no tuvo efecto alguno en la expresión de la CAT cuando se complementó con el VRS.)

La figura 1A representa las estructuras del ADNc y del antigenoma codificado del ARN (no a escala). El diagrama del antigenoma (en la parte superior) comprende las siguientes características: el triplete G no vírico del extremo 5' proporcionado por el promotor T7, los cuatro marcadores de secuencia en las posiciones 1099 (que añade un nucleótido a la longitud), 1139, 5611 y 7559, la ribozima y las secuencias de terminación T7 en tándem, el residuo U fosforilado en la posición 3' no vírico proporcionado al extremo 3' por escisión de la ribozima. (La zona de escisión se indica con una flecha) (13).

Los segmentos de ADNc clonado (figura 1A, parte central) que representan en conjunto el antigenoma completo se construyeron mediante la RT-PCR del ARNm o ARN genómico del. Los ADNc que contienen el extremo izquierdo del antigenoma, que abarcan desde el promotor T7 y el complemento de la región guía hasta el gen SH, se ensamblaron en una versión del pBR322 (figura 1A, parte inferior) en la que se había eliminado el sitio BamHI natural por mutagenia y sustituido el fragmento PstI-EcoRI con un poliligador que contenía unas zonas de restricción únicas (que comprendían BstBI, BstXI, PacI, BamHI, MluI) diseñadas para facilitar el ensamblaje. El recuadro de la figura 1A representa la eliminación del sitio BamHI. El fragmento natural BamHI-SalI (el sitio BamHI se representa en la línea superior en sentido positivo, subrayado) se sustituyó con un fragmento BglII-SalI obtenido mediante PCR (el sitio BglII se representa en la línea inferior, subrayado; su extremo cohesivo de 4 nucleótidos [en cursiva] es compatible con el del BamHI). Ello tiene como resultado un cambio simple de nucleótido (línea central, subrayado) sin repercusión al nivel aminoácido. Dichas modificaciones en el vector facilitaron la construcción del ADNc convirtiendo en único el sitio BamHI del ADNc antigenoma.

Los genes G, F y M2 se ensamblaron en un plásmido independiente, al igual que las secuencias L, posterior y flanqueadora de la ribozima y las finalizadoras de la transcripción T7 en tándem. La parte G a M2 se incorporó a continuación en la ventana PacI-BamHI del plásmido guía a SH. Éste a su vez fue el receptor del fragmento L - guía - ribozima - finalizador incorporado en BamHI a MluI, obteniéndose el antigenoma completo.

Se introdujeron cuatro marcadores de la zona de restricción (figura 1B) en el ADNc antigenoma incorporando los cambios en los oligonucleótidos iniciadores utilizados en la RT-PCR. Ello se realizó para facilitar el ensamblaje, proporcionar unos medios para identificar el virus recombinante, e ilustrar la capacidad para introducir cambios en el VRS infeccioso. Tres sitios se encontraban en las regiones intergénicas y el cuarto en una región génica sin traducir, e implicaban un total de cinco sustituciones de nucleótidos y un nucleótido de inserción simple. Ello aumentó la longitud del antigenoma codificado en un nucleótido con respecto al natural hasta un total de 15.223 nucleótidos (SEC. ID. N.º 1, que representa la secuencia en sentido positivo 5' a 3 mientras que el propio genoma es de sentido
negativo).

Los marcadores de secuencia se incorporaron al ARN del antigenoma codificado por el ADNc tal como se representa en la figura 1B. Las secuencias son de sentido positivo y se numeran con respecto al primer nucleótido del complemento de la región guía como 1; las identidades entre las cepas A2 18537 (Johnson y Collins, J. Gen Virol. 69: 2901 - 2906 (1988)), que representan los subgrupos A y B, respectivamente, se indican con puntos; las secuencias que representan las regiones de restricción del ADNc están subrayadas; las señales de transcripción de inicio de gen (GS) y finalización de gen (GE) se encuentran encuadradas; el codón de iniciación del marco de lectura abierto de traducción en N en la posición 1141 se indica en cursiva, y los marcadores de secuencia se representan debajo de cada secuencia. En la secuencia superior, un residuo C simple se introdujo en la posición 1099 para crear un sitio AflII en la región intergénica NSII-N, y los nucleótidos AG en las posiciones 1139 y 1140 inmediatamente en la dirección 5' del marco de lectura abierto de traducción N se sustituyó con los nucleótidos CC para crear un nuevo sitio NcoI. En la secuencia central, la sustitución de G y U en las posiciones 5612 y 5616, respectivamente, creó un nuevo sitio StuI en la región intergénica G - F. Y, en la secuencia inferior de la figura 1B, la sustitución de C en la posición 7561 creó un nuevo sitio SphI en la región intergénica F-M2.

Todos los ADNc se secuenciaron en su totalidad, en la mayoría de los casos a partir de diversos ADNc independientes, antes de su ensamblaje. Los plásmidos que codificaban las proteínas individuales del VRS se describen en Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677 - 5686 (1995) y en Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1995).

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Ejemplo II

Transfección y recuperación del VRS recombinante

La estrategia para producir VRS infecciosos a partir del antigenoma expresado por el ADNc implicó su expresión conjunta con aquellas proteínas del VRS que resultan suficientes para (i) producir un antigenoma de la nucleocápside con capacidad de replicación del ARN y (ii) convertir la genoma de la nucleocápside de la descendencia competente para tanto la replicación como la transcripción del ARN. La transcripción mediante el genoma de la nucleocápside proporciona todas las demás proteínas del VRS e inicia una infección productiva.

Se procedió a la transfección del ADNc transmitido mediante el plásmido que codifica el antigenoma, junto con los plásmidos que codifican las proteínas N, P, L y M2(ORF1), en células HEp-2 que se habían infectado con la cepa recombinante MVA el virus de la variolovacuna descrita anteriormente que expresa la ARN polimerasa T7 (Wyatt et al., Virol. 210: 202 - 205 (1995)). La cepa MVA es un mutante de amplio espectro que crece de un modo tolerante en las células aviares mientras que en las células de los mamíferos se produce un bloqueo en una etapa final de la maduración del virión que reduce en gran manera la producción de virus infecciosos. En las células HEp-2, la cepa MVA recombinante era similar a las recombinantes basadas en la WR utilizadas más habitualmente (Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 83: 8122 - 8126 (1986)) con respecto al nivel de expresión de la polimerasa T7 y de la citopatogenia, pero el nivel de descendencia producido resultó suficientemente bajo para que los sobrenadantes se pudieran pasar a células recientes con una citopatogenia mínima. Ello debería facilitar la recuperación de cualquier VRS recombinante que se pudiera producir en células infectadas con el virus de la variolovacuna sometidas a transfección.

La transfección y recuperación del VRS recombinante se realizó del siguiente modo. Unos cultivos monocapa de células HEp-2 recibieron, por cada pocillo simple de una placa de seis pocillos un ml de medio de infección - transfección preparado mediante la mezcla de cinco plásmidos en un volumen final de 0,1 ml de medio Opti-MEM (Life Technologies), en particular 0,4 \mug cada uno de antigenoma, plásmidos N y P, y 0,1 \mug cada uno de los plásmidos L y M2(ORF1). Ello se combinó con 0,1 ml de Opti-MEM que contenía 12 \mul de LipofectACE (Life Technologies). Tras 15 min de incubación a temperatura ambiente, ello se combinó con 0,8 ml de OptiMEM que contenía suero fetal de ternera al 2% termoinactivado y 1,5 X 10^{6} pfu (unidades formadoras de calvas) de la cepa MVA del virus de la variolovacuna recombinante que codifica ARN polimerasa T7 (Wyatt et al., supra). Ello se añadió a las células y se sustituyó un día más tarde por Opti-MEM que contenía suero al 2%. Se incubaron los cultivos a 32ºC y se sembraron en el tercer día. Se realizó la incubación a 32ºC ya que se descubrió que el virus MVA es ligeramente sensible a la temperatura y es mucho más eficiente a esta temperatura inferior.

Tres días después de la transfección, los sobrenadantes del cultivo aclarado se pasaron por células recientes HEp-2 y se recubrió con metilcelulosa (para la posterior tinción con anticuerpos) o agarosa (para el aislamiento de calvas). Tras la incubación durante cinco días con metilcelulosa, se fijaron y tiñeron las células mediante un procedimiento indirecto con peroxidasa de rábano utilizando una mezcla de tres anticuerpos monoclonales murinos para la proteína F del VRS seguido por un anticuerpo antimurino enlazado con la peroxidasa de rábano y tras ello el procedimiento general de Murphy et al., Vaccine 8: 497 - 502 (1990).

Se detectaron numerosas calvas seudo-VRS contra un contexto genético de citopatogenia que probablemente era debido al bajo nivel del virus recombinante MVA-T7. Las calvas contenían una cantidad abundante de la proteína F del VRS, tal como indicaba la coloración marrón oscuro y presentaban los efectos citopáticos característicos del VRS, en particular la formación de sincicios.

Se seleccionaron las calvas seudo-VRS de entre las placas que se habían preparado en paralelo pero incubado en agarosa y teñidas con rojo neutro. Se diseminaron y se compararon con una cepa de laboratorio de la cepa A2 del VRS analizando las calvas y mediante tinción con anticuerpos. Las calvas obtenidas a partir de cultivos sometidos a transfección se parecen mucho a las de la cepa de laboratorio. Una diferencia fue que las calvas obtenidas a partir de los cultivos sometidos a transfección parecían ser ligeramente más pequeñas que las de la cepa de laboratorio, con una zona central menos clara. El virus recombinante puede diferir en el fenotipo de esta cepa vírica natural particular, probablemente limitándose ligeramente más a una propagación célula a célula y presentando una tasa reducida de citólisis. Con respecto a la propagación del virus liberado, el rendimiento del virus recombinante con respecto al de laboratorio en las células HEp-2 resultó sustancialmente idéntico a 32ºC o 37ºC. En los estudios iniciales, los virus recombinante y de laboratorio resultaron indistinguibles con respecto a la acumulación de ARNm y proteínas intracelulares del VRS.

Se analizó el VRS, purificado a partir de las calvas y sometido a tres pases, en paralelo con el virus de laboratorio mediante RT-PCR utilizando tres pares iniciadores que flanqueaban cuatro marcadores incorporados. Tres cepas víricas aisladas del VRS recombinante aisladas a partir de las calvas se diseminaron en paralelos con un cultivo de control si infectar. Los sobrenadantes del medio aclarado se trataron con polietilenglicol y una concentración elevada de sales (Zoller y Smith, DNA 3: 479 - 488 (1984)) para el virus y se extrajo el ARN a partir de los sedimentos con Trizol^{TM} (Life Technologies). Dichos ARN, en paralelo con los controles adicionales de ARN no añadido ó 0,1 \mug de ARN de una cepa vírica aislada de laboratorio A2, se trataron con desoxirribonucleasa, se volvieron a purificar, se fijaron cada uno de los mismos con 50 ng de hexámeros aleatorios y se incubaron en unas condiciones estándar a TA (reacciones de 40 \mul) con o sin transcriptasa inversa (Connors et al., Virol. 208: 478 - 484 (1995)). Se sometieron unas cantidades iguales de cada reacción a PCR (35 ciclos de 94ºC durante 45 s, 37ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min) utilizando tres distintos pares de iniciadores de desoxioligonucleótidos sintéticos. Par iniciador (A): sentido positivo, posiciones 925 - 942 y sentido negativo, posiciones 1421 - 1440, produciendo el producto esperado de 516 pares de bases (517 pares de bases en el caso de los virus recombinantes) que incluían los sitios AflII y NcoI incorporados, respectivamente, en la zona de unión entre los genes NS2 y N genes y en el gen N. Par iniciador (B): sentido positivo, posiciones 5412 - 5429 y sentido negativo, 5930 - 5949, produciendo el producto esperado de 538 pares de bases que abarcaban el sitio StuI incorporado en la zona de unión entre los genes G y F. Par iniciador (C): sentido positivo, 7280 - 7297 y sentido negativo, 7690 - 7707, produciendo un fragmento de 428 pares de bases que abarcaba el sitio SphI incorporado en la zona de unión entre los genes F y M2. Se analizaron los productos de la PCR por electroforesis en geles neutros que contenían agarosa al 1% y agarosa con un punto bajo de fusión al 2% en paralelo con marcadores de longitud molecular del ADN del X174 digeridos con HaeIII y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio. Se obtuvieron los productos de la PCR con los tamaños esperados. La producción de cada uno dependía de la etapa a TA, lo que indica que cada uno procedía del ARN en vez del ADNc contaminante.

Se analizaron los productos de la PCR mediante digestión con enzimas de restricción. La digestión de los productos del par iniciador A con los sitios AflII o NcoI produjo unos fragmentos que correspondían a 177 y 340 pares de bases esperados (AflII) o 217 y 300 pares de bases (NcoI). La digestión de los productos del par iniciador B con el sitio StuI produjo unos fragmentos comparables a los previstos de 201 y 337 pares de bases. La digestión de los productos de las reacciones del par iniciador C con el sitio SphI proporcionó unos productos que correspondían a 147 y 281 pares de bases esperados. Se analizaron los productos de la digestión mediante electroforesis en gel tal como se ha descrito anteriormente. La presencia de un producto de la PCR residual sin digerir con el sitio AflII se debía a la digestión incompleta, tal como se confirmó mediante su redigestión. De este modo, la digestión con enzimas de restricción demostró que los productos de la PCR que representaban un virus recombinante contenían los marcadores en la zona de restricción esperada al contrario de los que representaban la cepa de laboratorio. El análisis de la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR clonado confirmó que las secuencias abarcaban los marcadores de las zonas de restricción.

Tal como se representa en la Tabla 1, la eficiencia de la producción de VRS cuando se complementa con N, P, L y M2 (ORF1) resulta relativamente elevado, variando en los tres experimentos desde una media de 9,9 a 94,8 calvas por 0,4 \mug de ADNc antigenoma procesado y 1,5 X 10^{6} células. Debido a que dichas calvas se obtenían del pase, se desconocía el número de células infectadas presentes en cada pocillo de la transfección original. Aproximadamente cada pocillo sometido a transfección (54 de 56 en la Tabla 1) produjo virus. Debido a que la producción de VRS liberado por célula infectada es habitualmente muy baja (~10 pfu), incluso en unas condiciones ideales, y a que muchos pocillos produjeron varias veces esta cantidad (hasta 169 calvas en la Tabla 1), es probable que diversas células productoras de VRS se encontraran presentes en muchos de los pocillos de células sometidas a transfección.

No se recuperaron VRS si faltaba cualquiera de los plásmidos (por ejemplo, tal como se representa en la Tabla 1). El requisito de la M2(ORF1) se podía satisfacer asimismo con el gen completo M2(ORF1+2), siempre que el nivel de procesamiento del ADNc fuese bajo (0,016 \mug por 1,5 X 10^{6} células [Tabla 1]). A unos niveles superiores, la producción de virus se redujo enormemente, lo que indica que actúa asimismo una inhibición de la síntesis del minigenoma de ARN asociada a la M2(ORF2) en el genoma completo durante la infección productiva.

Dichos resultados demostraron que la producción de VRS infeccioso dependía en gran medida de la expresión de la proteína M2 (ORF1) además de las N, P y L. Asimismo, se demostró que el método de expresión óptimo de la M2(ORF1) era a partir de ADNc genomanipulado en el que se había eliminado la ORF2, aunque el ADNc completo que contenía ambas ORF soportaba asimismo la producción de VRS.

De este modo, como parte de la presente invención, la transcripción de los VRS difería de los virus de ARN con cadena complementaria sin segmentar descritos anteriormente al requerir una cuarta proteína designada en la presente memoria como M2(ORF1) y denominada anteriormente 22K o M2 (Collins et al., J. Virol. 54: 65 - 71 (1985)). Se descubrió que la proteína M2(ORF1) constituía un factor de elongación de la ARN polimerasa esencial para una transcripción asociativa secuencial. Dicho requisito proporciona la capacidad, como parte de la presente invención, de introducir cambios específicos y predeterminados en los VRS infecciosos.

TABLA 1 La producción de VRS infeccioso dependía de la expresión de la M2 ORF 1

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Ejemplo III

Construcción de VRS infecciosos con mutaciones predeterminadas para proporcionar el fenotipo pretendido

El presente Ejemplo ilustra la introducción de mutaciones predeterminadas específicas en el VRS recombinante infeccioso utilizando los procedimientos descritos anteriormente en la presente memoria. Para facilitar su manipulación el ADNc antigenoma se clonó como dos fragmentos independientes en plásmidos separados: un fragmento (el extremo izquierdo) contenía el promotor T7 junto con el nucleótido en el sitio BamHI en el nucleótido 8501 (D50 del ADNc), y el otro (el extremo derecho) contenía el sitio BamHI en el nucleótido 15223, junto con la ribozima y los finalizadores de la transcripción T7 (D39 del ADNc). D39 se separó a continuación en dos fragmentos y se dispuso cada uno en plásmidos fagómidos por separado: un fragmento (mitad izquierda, L1 del ADNc) desde el sitio BamHI hasta el sitio PmlI- en el nucleótido 12255, y el otro (mitad derecha, L2 del ADNc) desde el sitio PmlI hasta el extremo del finalizador T7. Las posiciones de las secuencias asignadas a la zona de restricción se presentan a título descriptivo y no pretenden por sí mismas definir todos los nucleótidos implicados.

Siguiendo el procedimiento general de Kunkel et al., Meth. Enzymol. 54: 367 - 382 (1987)), se diseminaron los plásmidos en una cepa dut ung de E. coli, la cepa CJ236, y se preparó el ADN de cadena simple mediante la infección de un fago auxiliar, el M13KO7. Se prepararon oligonucleótidos sintéticos fosforilados comprendiendo cada uno de ellos uno o más cambios en los nucleótidos de interés, se aparearon con el molde de la cadena simple por individualmente o más de uno a la vez, y se utilizaron para dirigir la síntesis del ADN mediante la ADN polimerasa T4. Se ligaron los productos y se transformaron en una cepa no dut ung de E. coli, DH5a o DH10B. Las colonias que contenían plásmidos mutantes se identificaron por digestión con enzimas de restricción o mediante el análisis de la secuencia. Se pueden utilizar fácilmente otros procedimientos de mutagenia.

Se modificaron las mitades L1 y L2 descritas anteriormente para que comprendieran diversas combinaciones de zonas de reconocimiento para distintos enzimas de restricción que no se presentan o son inusuales en el plásmido antigenoma. Dichos sitios se introdujeron utilizando sustituciones de nucleótidos que no provocan cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada L. Además, se modificó L1 para que comprendiera una mutación de la que se supone que proporciona un fenotipo ts. Se realizaron dos versiones de L1. En una versión, L1 se modificó en un ciclo simple de mutagenia para que comprendiera los sitios Bsu36I (nucleótido 9399) y SnaBI (11848), y una mutación denominada 530, obteniéndose los sitos 530L1 del ADNc. Se identificó la mutación 530 mediante el análisis de la secuencia del virus obtenido biológicamente cpts530-VRS e implica un cambio de nucleótido simple en la posición 10060 lo que tiene como resultado un cambio de aminoácido (de Phe a Leu) en la posición 521 de la cadena de aminoácidos de la proteína L. En una segunda versión, se modificó L1 en un ciclo simple para que comprendiera los sitios Bsu36I y SnaBI, obteniéndose los sitios L1 del ADNc. Se modificó L2 en un ciclo de mutagenia para que comprendiera los nuevos sitios PmeI (13342), RsrII (14083) y SnaBI (14477). En un segundo ciclo, se añadió el sitio BstEII (14318) y se eliminó el sitio natural de reconocimiento para el SnaBI (6956). Con ello se obtuvieron los sitios L2.

Se realizaron tres ADNc antigenoma completos mediante la introducción de los ADNc mutantes seleccionados L1 y L2 o fragmentos de los mismos en el D39 y combinando el mismo con el D50. El ADNc antigenoma "D53sites" contiene sitios L1 y sitios L2. El ADNc "530D53" contiene el fragmento BamHI-SpeI (10149) del sitio 530L1sites (que contiene las mutaciones Bsu36I y 530). El ADNc "530D53sites" contenía los sitios 530L1 y los sitios L2 (Tabla II). Se recuperó el virus recombinante de cada uno de los tres ADNc antigenoma mutantes completos utilizando la metodología de la presente invención y se sometieron a pases por lo menos dos veces y se analizaron directamente o siguiendo la purificación y amplificación de calvas. La presencia de mutaciones se confirmó mediante la RT-PCR del ARN vírico seguido por el análisis mediante la digestión por enzimas de restricción o la secuenciación de nucleótidos, o ambos procedimientos.

Se analizaron los virus genomanipulados con respecto a su capacidad de formar calvas en las células HEp-2 a 32ºC, 39ºC y 40ºC en paralelo con dos virus no recombinantes obtenidos biológicamente, HEK, un virus natural de la cepa A2 y el VRS cpts530, el virus a partir del que se identificó la mutación 530 mediante el análisis de la secuencia (Tabla II). Esta comparación demostró que los tres virus genomanipulados formaron calvas a 32ºC y demostraron que los valores de las preparaciones de los diversos virus se encontraban entre dos unidades logarítmicas decimales entre sí, lo que significa que se encontraban dentro del intervalo de variaciones experimentales que se observa habitualmente entre las preparaciones independientes de VRS. Los virus recombinantes que contenían la mutación 530 vieron muy afectada su capacidad para formar calvas a 39ºC o 40ºC, algo comparable al VRS cpts530. La presencia de zonas de restricción adicionales en 530D53sites con respecto 530D53 no tuvo un efecto observable en el fenotipo ts. El virus D53sites virus, que contenía los marcadores inactivos de la zona de restricción pero que carecían de la mutación 530, conservaron la capacidad de formar calvas a temperaturas superiores, algo comparable al tipo natural. Ello proporcionó no únicamente una identificación positiva de que la mutación 530 estaba implicada en el fenotipo ts del VRS cpts530, sino que demostró asimismo que se pueden incorporar sistemáticamente mutaciones puntuales en el VRS recombinante según la presente invención. En estos casos, los fenotipos resultantes de los virus genomanipulados fueron totalmente coherentes con la cepa progenitora y proporcionaron una confirmación directa y la reconstitución de una mutación de atenuación.

TABLA II Caracterización del fenotipo ts del VRS obtenido biológicamente con respecto al VRS recuperado a partir de clones de ADNc

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Ejemplo IV

Recuperación del virus sincicial respiratorio infeccioso que expresa un gen exógeno adicional

Los procedimientos descritos anteriormente se utilizaron para construir el VRS recombinante que contenía un gen adicional, codificando la cloranfenicol acetil transferasa (CAT). La secuencia de codificación de la CAT se flanqueó con unas secuencias de consenso de nucleótidos de inicio de gen y finalización de gen específicas del VRS, las señales de transcripción de la ARN polimerasa que depende del ARN vírico. El casete de transcripción quimérica VRS/CAT se incorporó en la región intergénica entre los genes G y F del antigenoma completo del VRS de sentido positivo codificado por el ADNc, y se recuperó el VRS recombinante infeccioso que expresaba la CAT. El ARNm de la CAT se expresó eficientemente y los niveles de G y ARNm eran comparables a los expresados por el VRS recombinante natural. Los virus que contenían la CAT y los naturales eran similares con respecto a los niveles de síntesis de las proteínas víricas principales.

Se utilizó el plásmido D46 para la construcción del ADNc que codificaba el ARN antigenómico del VRS que contenía el gen CAT. (Los plásmidos D46 y D50, este último mencionado en el Ejemplo III, son preparaciones distintas del mismo ADNc antigenoma). El D46 codifica el antigenoma completo, con 15.223 nucleótidos del VRS (un nucleótido más largo que el VRS natural) se utilizó para producir el VRS infeccioso recombinante descrito anteriormente. Durante su construcción, el ADNc antigenoma se modificó para que comprendiera cuatro nuevos sitios de restricción como marcadores. Uno de los mismos, un sitio StuI dispuesto en la región intergénica entre los genes G y F (posiciones 5611 - 5616 de la secuencia 3' - 5' del genoma natural), se seleccionó como sitio de inserción para el gen exógeno CAT. Se obtuvo una copia del CAT ORF flanqueado en el extremo en dirección 5' mediante la señal GS del VRS y en el extremo en dirección 3' mediante la señal RS GE a partir del mimigenoma VRS-CAT descrito anteriormente (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 88: 9663 - 9667 (1991) y Kuo et al., J. Virol. 70: 6892 - 6901 (1996)). La inserción de dicho casete de transcripción VRS/CAT en el sitio StuI, para obtener el ADNc D46/1024CAT, aumentó la longitud del antigenoma codificado hasta un total de 15.984 nucleótidos. Y, mientras que el VRS natural codifica diez ARNm subgenómicos principales, el virus recombinante previsto a partir del antigenoma D46/1024CAT codifica el gen CAT como undécimo ARNm. La estrategia de construcción se representa en la figura 2.

La producción de VRS infecciosos a partir del ARN antigenómico codificado por el ADNc, tal como se ha descrito anteriormente, implicó la expresión conjunta en las células HEP-2 de cinco ADNc por separado que codificaban el ARN antigenómico o las proteínas N, P, L o M2(ORF1), necesarias y suficientes para la replicación y la transcripción del ARN vírico. La expresión del ADNc se dirigió mediante la ARN polimerasa T7 proporcionada por un virus recombinante de la variolovacuna T7 basado en la cepa MVA. El virus recombinante MVA-T7 produjo una descendencia infecciosa suficiente para provocar una citopatogenia exhaustiva con el pase y, por lo tanto, se añadió citosina arabinósido, un inhibidor de la replicación del virus de la variolovacuna, 24 h después de la transfección y se mantuvo durante los seis primeros pases.

Se analizaron dos ADNc antigenoma con respecto a la recuperación del VRS: el ADNc D46 y el ADNc D46/
1024CAT. Cada uno proporcionó el VRS recombinante infeccioso. Las células infectadas con el virus recombinante D46/1024CAT expresaron unos niveles abundantes del enzima CAT. Para cada virus, se realizaron pases de los sobrenadantes de la transfección a células recientes y se realizaron un total de ocho pases en serie a intervalos de cinco a seis días con una multiplicidad de infección inferior a 0,1 pfu por célula.

La secuencia CAT del genoma D46/1024CAT se flanqueó mediante las señales GS y GE del VRS y, de este modo, se debería expresar como un ARNm poliadenilado independiente adicional. La presencia de dicho ARNm esperado se analizó mediante hibridación por inmunotransferencia de tipo Northern del ARN a partir de las células infectadas con el virus D46/1024CAT o el virus D46 en el octavo pase. La hibridación con una ribosonda específica de la CAT en sentido negativo puso de manifiesto una banda principal que presentaba el tamaño adecuado para ser el ARNm del CAT esperado, que comprendería 735 nucleótidos sin poli(A). Esta especia se retenía completamente con las partículas de látex oligo(dT), lo que demuestra que estaba poliadenilada. En algunos casos se detectó una especie secundaria de mayor tamaño específica de la CAT y que presentaba unas dimensiones adecuadas para ser un ARNm translectura de la G-CAT. El virus D46/1024CAT se había sometido a ocho pases con una baja multiplicidad de infección antes de la infección utilizada para preparar el ARN intracelular. No hubo indicios de formas más cortas de ARNm del CAT, que podría haber aparecido si el gen CAT se hubiera sometido a eliminación.

Las inmunotransferencias de replicación se hibridaron con una ribosonda en sentido negativo específica de los genes CAT, SH, G o F, estos dos últimos genes flanqueando el gen CAT incorporado. Las inmunotransferencias demostraron que la expresión del ARNm de SH, G y F subgenómicos era similar para los dos virus. Se utilizó la formación de imágenes con fósforo para comparar la cantidad de radiactividad hibridada en cada uno de las tres bandas de ARNm del VRS para D46/1024CAT y D46. Se determinó la proporción de la radiactividad entre D46/1024CAT y D46 para cada ARNm: SH, 0,77; G, 0,87; y F, 0,78. La desviación de la unidad indica probablemente que se cargó una cantidad ligeramente inferior de ARN para D46/1024CAT con respecto a D46, aunque es asimismo posible que el nivel global de acumulación de ARNm fuera ligeramente inferior para el VRS de D46/1024CAT. La demostración de que las tres proporciones eran similares confirma que el nivel de expresión de cada uno de dichos ARNm era aproximadamente el mismo para D46/1024CAT con respecto a D46. De este modo, la inserción del gen CAT entre los genes G y F no afectó drásticamente al nivel de transcripción de cualquiera de los dos genes.

Para caracterizar la síntesis de la proteína vírica, se marcaron células HEp-2 infectadas con [^{35}S]metionina, y los lisados celulares se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) tanto directamente como tras la inmunoprecipitación en unas condiciones en las que la recuperación del antígeno marcado se completó sustancialmente. La precipitación con antisuero de conejo contra el VRS purificado demostró que los virus D46/1024CAT y D46 expresaban unas cantidades similares de las proteínas víricas principales F1, N, P, M y M2. Es importante mencionar que se recuperó un nivel similar de la proteína M2 para cada virus debido a que su gen se encuentra en la dirección 3' con respecto al gen CAT incorporado. La acumulación de proteína F, que se codifica mediante el gen que se encuentra inmediatamente a continuación de la inserción en la dirección 3', se examinó asimismo mediante inmunoprecipitación con una mezcla de tres anticuerpos monoclonales anti-F. Se recuperó un nivel similar de la subunidad F_{1} para cada virus. Se realizó la formación de imágenes con fósforo de las principales proteínas víricas tal como mencionado anteriormente en diversos experimentos independientes y se puso de manifiesto una cierta variabilidad entre muestras, pero en global los dos virus no se podían distinguir basándose en el nivel de proteínas recuperadas. La precipitación con anticuerpos anti-CAT permitió recuperar una especie simple para el virus D46/1024CAT pero no para el virus D46. El análisis de la proteína marcada total demostró que las proteínas N, P y M se podían detectar sin inmunoprecipitación (aunque la detección de la última resultó complicada por su migración conjunta con una especie celular) y confirmó que los dos virus presentaban unos diagramas similares. La posición correspondiente a la proteína CAT contenía más radiactividad en el diagrama del D46/1024CAT en comparación con la del D46, tal como se confirmó mediante la formación de imágenes con fósforo de experimentos independientes. Ello indicó que la proteína CAT se podía detectar entre el total de proteínas marcadas sin precipitación, aunque esta demostración resultó complicada por la presencia de una banda del contexto genético de migración conjunta en los diagramas sin infectar e infectadas con el D46.

Se utilizó la RT-PCR para confirmar la presencia del gen CAT en la zona prevista del genoma del VRS recombinante. Se aisló el ARN intracelular total del sedimento celular del pase ocho del VRS tanto D46/1024CAT como D46. Se seleccionaron dos iniciadores que flanquearan el sitio de inserción, el sitio de la endonucleasa de restricción StuI en las posiciones del VRS 5611 - 5616: el iniciador de sentido positivo en la dirección 5' correspondía a las posiciones 5412 - 5429 y el de sentido negativo en la dirección 3' a las posiciones 5730 - 5711. El iniciador en sentido positivo se utilizó en la etapa de transcripción inversa (RT), y ambos iniciadores se incluyeron en la PCR.

La RT-PCR del virus D46 proporcionó un producto simple que correspondía al fragmento esperado de 318 nucleótidos, que representa la unión génica G/F sin una secuencia exógena adicional. El análisis del ARN vírico del D46/1024CAT proporcionó un producto simple cuya motilidad electroforética se correspondía bien con el fragmento esperado del nucleótido 1079, que representa la unión génica G/F que contenía el casete de transcripción CAT incorporado. La última PCR proporcionó una banda principal; la falta de productos menores detectables indicó que la población de genomas recombinantes no contenía un gran número de moléculas con una eliminación en dicha zona. Cuando se hubo realizado el análisis mediante la PCR en el ARN del virus D46/1024CAT sin la etapa de RT, no se observó banda alguna, lo que confirmó que el análisis era específico del ARN. Por lo tanto, el análisis mediante RT-PCR confirmó la presencia de un inserto en la longitud esperada de la zona esperada del ARN genómico del virus recombinante D46/1024CAT.

Se utilizó la expresión enzimática para determinar la estabilidad del gen CAT. Se analizaron los sedimentos celulares de todos los pases empezando a partir del tercero con respecto a la expresión del CAT. En el caso del virus D46/1024CAT, los tres ensayos presentaron la conversión del cloranfenicol marcado con [^{14}C] en formas acetiladas. A fin de investigar la estabilidad de la expresión, se analizaron virus de 20 ó 25 calvas individuales del pase tres u ocho, respectivamente, con respecto a la expresión del CAT. Todas las muestras dieron positivo y el nivel de expresión del CAT resultó similar para cada uno de las 25 cepas víricas aisladas del pase ocho, a juzgar por el ensayo de muestras parciales del lisado celular. Ello demostró que la actividad de la proteína CAT codificada por cada cepa vírica aislada permanecía inalterada por la mutación.

Para determinar la morfología y el tamaño de la calva, empezando con el segundo pase, se utilizó una octava parte del sobrenadante del medio (es decir, 0,5 ml) sembrado a partir de cada etapa de pase para infectar células recientes HEp-2 en placas de seis pocillos que se incubaron bajo un recubrimiento de metilcelulosa durante cinco a siete días. A continuación se fijaron y tiñeron las células mediante la incubación con anticuerpos monoclonales contra la proteína F del VRS seguido por un segundo anticuerpo enlazado con la peroxidasa de rábano. Anteriormente, se había observado que el VRS recombinante producido a partir del D46 del ADNc era indistinguible de la cepa vírica aislada de VRS silvestre natural con respecto a la eficiencia de la formación de calvas en un cierto intervalo de temperaturas in vitro, y la capacidad de replicar y provocar la enfermedad cuando se inocula en las vías respiratorias de chimpancés infectados previamente. Por lo tanto, el VRS recombinante D46 se consideró como una cepa natural. Se compararon las calvas producidas mediante los virus recombinantes D46 y D46/1024CAT mediante tinción con anticuerpos. La morfología de las placas era muy similar para los dos virus, aunque el diámetro medio de las calvas recombinantes que contenían la CAT era el 90 por ciento del correspondiente al virus D46, basándose en la determinación de treinta placas seleccionadas aleatoriamente para cada virus.

Se comparó la eficiencia de la replicación en los cultivos tisulares de los virus D46 y D46/1024CAT en un ciclo de crecimiento de una etapa simple. Se infectaron por triplicado con cada virus monocapas de células, se tomaron muestras a intervalos de 12 h y se cuantificaron mediante análisis de calvas. Los resultados demostraron que la producción de los virus D46/1024CAT con respecto a los D46 se retardaba y alcanzaba un valor máximo que era 20 veces inferior.

Estos resultados demuestran que resulta posible construir VRS recombinantes e independientes de colaboradores que expresen un gen exógeno, en este caso el gen CAT. La expresión dirigida por el VRS recombinante del ARNm subgenómico poliadenilado esperado que codificaba la proteína CAT, detectándose la proteína tanto mediante ensayo enzimático como mediante radioinmunoprecipitación. Otros ejemplos han producido VRS recombinantes con el gen de la luciferasa incorporado al mismo sitio CAT o con los genes CAT o de la luciferasa incorporados entre los genes SH y G. Dichos virus presentaban asimismo un crecimiento reducido mientras que numerosos virus recombinantes naturales recuperados presentaban un crecimiento sin alterar. Ello indica que el crecimiento reducido se asocia efectivamente al gen incorporado en vez de deberse a mutaciones aleatorias en cualquier zona del genoma. El descubrimiento de que la inserción de un gen exógeno en el VRS recombinante reduce el nivel de replicación y es estable durante el pase in vitro indica que proporciona al mismo tiempo otros medios para realizar la atenuación a fin de realizar la vacuna. Y estos resultados demuestran que la metodología descrita en la presente memoria permite recuperar un virus con un crecimiento limitado.

Estos resultados ilustran asimismo una ventaja de la estrategia de la expresión génica de los virus de cadena complementaria sin segmentar, en particular aquellos en los que las secuencias exógenas se pueden introducir como casetes de transcripción por separado que se expresan como un ARNm por separado. Los resultados demuestran asimismo que el VRS puede tolerar un aumento de la longitud del genoma de 762 nucleótidos en el caso del gen CAT hasta un total de 15.984 nucleótidos (1,05 veces la del VRS natural). El gen de la luciferasa que se recuperó satisfactoriamente es aproximadamente tres veces más largo.

Se conocen ARN polimerasas que dependen del ARN vírico que presentan una naturaleza propensa a los errores debido a la ausencia de mecanismos de revisión y reparación. En los genomas de virus con ARN, se estima una frecuencia de mutación en promedio de 10^{-4} a 10^{-5} por sitio (Holland et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 176: 1 - 20 (1992) y referencias del mismo texto). En el caso del VRS recombinante D46/1024CAT producido aquí, la expresión correcta del gen exógeno sería irrelevante para la replicación del virus y podría acumular mutaciones. Los pases descritos en la presente memoria implicaron una multiplicidad de las infecciones inferior a 0,1 pfu por célula, y la duración de cada nivel de pase indicó que estaba implicada una pluralidad de ciclos de infección. Aunque los rendimientos de los virus infecciosos obtenidos a partir de células de cultivos tisulares infectados por el VRS habitualmente son bajos, la síntesis macromolecular celular es importante y los bajos rendimientos de los virus infecciosos parecen representar una etapa ineficiente del empaquetamiento en vez de unos niveles bajos de replicación del ARN. Por lo tanto, el mantenimiento del CAT a lo largo de ocho pases en serie implicó varios ciclos de replicación del ARN. Resultó sorprendente que el gen no esencial CAT permaneciera intacto y con capacidad de codificar la proteína completamente funcional en cada una de las 25 cepas víricas aisladas analizadas en el octavo pase. Asimismo, el análisis mediante RT-PCR del ARN aislado en el octavo pase no detectó eliminaciones en el interior del gen CAT.

Debido a que la mayor diferencia antigénica entre los dos subgrupos antigénicos de VRS radica en la glucoproteína G, se puede construir el VRS recombinante para que exprese la proteína G del subgrupo heterólogo como gen adicional para proporcionar una vacuna divalente. Los genes de las proteínas de la envoltura de otros virus respiratorios, tales como el virus paragripal 3, se pueden incorporar asimismo para la expresión del VRS recombinante. Otros usos comprenden la expresión conjunta de moduladores inmunitarios tales como la interleucina 6 para aumentar la inmunogenia del VRS infeccioso. Se proporcionan otras utilizaciones, tales como emplear un VRS modificado tal como se ha descrito en la presente memoria como vector de genoterapia.

Aunque la presente invención se ha descrito con algún detalle a título ilustrativo y de ejemplo en aras de la claridad de comprensión, resultará evidente que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: El Gobierno de los Estados Unidos de América, representado por el Secretario del Ministerio de Sanidad y Servicios Sociales

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(B)

CALLE: Box OTT

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(C)

CIUDAD: Bethesda

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(D)

ESTADO: Maryland

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(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20892

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(G)

TELÉFONO: (301) 496-7056

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(H)

FAX: (301) 402-0220

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(I)

TÉLEX:

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(ii):

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE VIRUS SINCICIALES RESPIRATORIOS INFECCIOSOS A PARTIR DE SECUENCIAS CLONADAS DE NUCLEÓTIDOS

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(iii):

NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv):

FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIo: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25

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(v):

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: WO

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(B)

FECHA DE REGISTRO:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vi):

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US N. 60/007.083

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 27 de septiembre de 1995

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(vii):

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Parmelee, Steven W.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.990

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 15280-250-1PC

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(viii):

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A)

TELÉFONO: 206-467-9600

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(B)

FAX: 415-576-0300

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N. 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 15223 pares de bases

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(B)

TIPO: Ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: Simple

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N. 1:

4

6

7

8

9

10

11

12

Claims (43)

1. Procedimiento para producir una partícula de VRS infeccioso a partir de una o más moléculas de polinucleótidos que codifican dicho VRS, que comprende:

la expresión conjunta en una célula o lisado sin células de un vector de expresión que comprende un genoma o antigenoma de VRS, en el que el genoma o antigenoma de VRS recombinante se modifica por recombinación mediante la introducción de una mutación por inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, produciendo dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, acomodación al cultivo celular, restricción de la gama de hospedadores o una mayor inmunogenia de la partícula de VRS en comparación con el VRS natural, y un vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótidos que codifican las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2 (ORF1) del VRS, con lo que se produce una partícula infecciosa del VRS.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el genoma o antigenoma del VRS y las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se expresan mediante el mismo vector de expresión.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector de expresión que codifica el genoma o antigenoma del VRS y el vector de expresión que codifica las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa son distintos.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se codifican en dos o más vectores de expresión distintos.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se codifican cada una de ellas en vectores de expresión distintos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS es ADNc.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la partícula de VRS infeccioso es un virus.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS procede de una secuencia de VRS humano, bovino o murino.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS es una quimera de una secuencia de una cepa de VRS humano y por lo menos una secuencia de VRS no humano.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica el genoma o antigenoma del VRS codifica la secuencia de una cepa de VRS natural.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un VRS no humano.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la alteración fenotípica tiene como resultado la atenuación, la sensibilidad a la temperatura o la restricción de la gama de hospedadores.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma de un virus VRS no humano o es una quimera de VRS no humano y por lo menos otro VRS de origen humano o no humano.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos codifica un genoma o antigenoma del VRS de una cepa vacunal del VRS humano que se ha modificado mediante la inserción, eliminación o sustitución de un nucleótido.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la modificación codifica una alteración fenotípica.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la alteración fenotípica tiene como resultado la atenuación, la sensibilidad a la temperatura o la restricción de la gama de hospedadores.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la alteración fenotípica consiste en un cambio en un epítopo inmunógeno del VRS.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS de una cepa de VRS se ha modificado mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una citocina o un epítopo de un linfocito T colaborador.

19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS de una cepa de VRS se ha modificado mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de un sitio de restricción.

20. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS de una cepa de VRS se ha modificado mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína G de un subgrupo de VRS distinto del de dicha cepa de VRS.

21. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS de una cepa de VRS se ha modificado mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de un patógeno microbiano con capacidad de desencadenar una respuesta inmunitaria protectora.

22. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que por lo menos una de las proteínas víricas se obtiene mediante la infección conjunta con el VRS.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS comprende un promotor T7 enlazado de un modo funcional con dicha molécula de polinucleótidos y el vector de expresión que comprende una o más molécula de polinucleótidos que codifica las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) del VRS comprende un promotor T7 enlazado de un modo funcional con dicha una o más moléculas de polinucleótidos.

24. Célula o lisado sin células que comprende:

(a)

un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS; y

(b)

un vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótidos que codifican las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2 (ORF1) del VRS;

con lo que mediante la expresión de dicho genoma o antigenoma del VRS y las proteínas N, P, L y del factor de elongación de la ARN polimerasa se combinan para producir una partícula infecciosa de VRS;

y en el que el genoma o antigenoma del VRS recombinante se modifica por recombinación mediante la incorporación de una mutación por inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, produciendo dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación a los cultivos tisulares, restricción de la gama de hospedadores o una mayor inmunogenia de la partícula del VRS en comparación con el VRS
natural.

25. Célula o lisado según la reivindicación 24, en los que el genoma o antigenoma del VRS y las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se codifican mediante el mismo vector de expresión.

26. Célula o lisado según la reivindicación 24, en los que el vector de expresión que codifica el genoma o antigenoma del VRS y el vector de expresión que codifica las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa son distintos.

27. Célula o lisado según la reivindicación 24, en los que las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa se codifican en dos o más vectores de expresión.

28. Célula o lisado según la reivindicación 27, en los que las proteínas N, P, L y la del factor de elongación de la ARN polimerasa están cada una de ellas codificadas en distintos vectores de expresión.

29. Célula o lisado según la reivindicación 24, en los que la partícula VRS infeccioso es un virus.

30. Célula o lisado según la reivindicación 24, en el que la molécula de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del VRS es una secuencia de VRS humano, bovino o murino.

31. Célula o lisado según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en los que vector de expresión que comprende una o más moléculas de polinucleótido que las proteínas N, P y L y un factor de elongación de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) del VRS comprende un promotor T7 enlazado de un modo funcional con dicha una o más moléculas de polinucleótidos.

32. Sistema para la producción recombinante de partículas del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprenden uno o más moléculas de polinucleótidos de ADN, comprendiendo las moléculas un polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS, un polinucleótido que codifica una proteína de la nucleocápside (N), un polinucleótido que codifica una fosfoproteína de la nucleocápside (P), un polinucleótido que codifica una unidad proteica grande de la polimerasa (L) y un polinucleótido que codifica un factor de elongación proteico de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) del VRS, en el que mediante la expresión de dichas proteínas N, P, L y M2 ORF1, se produce una partícula infecciosa y autorreplicante del VRS que comprende un polinucleótido que codifica el genoma o el antigenoma del VRS y dichas proteínas N, P, L y M2 (ORF1).

33. Sistema según la reivindicación 32, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS es una secuencia del VRS humano.

34. Sistema según la reivindicación 33, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS humano es la SEC. ID. N.º 1.

35. Sistema según la reivindicación 32, en el que el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma de un virus VRS no humano virus o es una quimera de un VRS no humano y por lo menos otro VRS de origen humano o no humano.

36. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que el promotor de la transcripción es un promotor T7.

37. Sistema para la producción recombinante de partículas del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprenden uno o más vectores de expresión que comprenden un polinucleótido que codifica un genoma o antigenoma del VRS, un polinucleótido que codifica una proteína de la nucleocápside (N), un polinucleótido que codifica una fosfoproteína de la nucleocápside (P), un polinucleótido que codifica una unidad proteica grande de la polimerasa (L) y un polinucleótido que codifica un factor de elongación proteico de la ARN polimerasa que es una proteína M2(ORF1) del VRS, en la que, mediante la expresión de dichas proteínas N, P, L y M2 ORF1, se produce una partícula infecciosa y autorreplicante del VRS que comprende un polinucleótido que codifica el genoma o el antigenoma del VRS y dichas proteínas N, P, L y M2 (ORF1).

38. Sistema según la reivindicación 37, en el que el genoma o antigenoma del VRS se modifica mediante la inserción, reordenación, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos, provocando dicha mutación un fenotipo de atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación a los cultivos tisulares, restricción de la gama de hospedadores o una mayor inmunogenia de la partícula del VRS en comparación con el VRS natural.

39. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38 en el que VRS es un VRS humano.

40. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38 en el que el genoma o antigenoma del VRS es una quimera de dos o más genomas distintos del VRS.

41. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38 en el que el genoma o antigenoma quimérico comprende secuencias de nucleótidos del VRS humano y bovino.

42. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41 en el que se produce una partícula subvírica.

43. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 42, en el que uno o más vectores de expresión comprenden un promotor T7 enlazado de un modo funcional con dichos polinucleótidos.