ES2342122T3 - Composicion natural en base a extracto de miel monofloral chilena a partir de una especie vegetal nativa para el control de infecciones bacterianas en hortalizas y flores. - Google Patents
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Abstract
Composición natural para el control de infecciones bacterianas en papas, lechugas, hortalizas, carozos y flores en general caracterizada porque está elaborada a partir de extractos de flavonoides y/o fenoles de mieles monoflorales orgánicas que actúan en forma independiente como controladores de diferentes infecciones bacterianas, dicha miel monofloral orgánica es una miel de ulmo, compuesta de tal manera que al menos el 50% de los granos totales de polen presentes en ella correspondan a una sola especie vegetal y con la siguiente composición: **(Ver fórmula)** con un pH: 4,9 a 5,5.
Description
Composición natural en base a extracto de miel
monofloral chilena a partir de una especie vegetal nativa para el
control de infecciones bacterianas en hortalizas y flores.
La presente solicitud se dirige a una
composición natural en base a extracto de mieles monoflorales
chilenas provenientes de especies vegetales i nativas para el
control de infecciones bacterianas en vegetales en general. A modo
ilustrativo, la composición de la presente invención demostró ser
especialmente útil en el control de la pudrición blanda (Erwinia
spp.) en papas, hortalizas y flores en general.
Las enfermedades bacterianas afectan a cultivos
vegetales causando pérdidas en la agricultura. Un ejemplo de este
tipo de enfermedades corresponde a la pudrición blanda de hortalizas
(Soft rot) causada por bacterias del género Erwinia. Dentro
de este género bacteriano, la especie Erwinia carotovora pv.
carotovora afecta a diversos cultivos como el de papas,
alcachofas, apios, maravillas, espárragos, repollito de Bruselas,
repollos, coliflores, lechugas, berenjenas, rábano picante,
colinabo, melones, cebollas, pimientos, ruibarbos, tomates y nabos.
También afecta a algunas frutas, plantas ornamentales como los
bulbos de jacintos y calas y plantas nativas. En general la
susceptibilidad de las plantas que sean infectadas se debe a la
presencia de un órgano con abundante tejido parenquimático, células
en las cuales las bacterias pueden desarrollarse debido a la
presencia de una gran vacuola con agua y otros elementos
nutritivos.
La pudrición consiste en la maceración y ruptura
final del tejido parenquimático de todos los órganos de la planta
que finalmente da como resultado la muerte de la misma originando
que la producción se pierda. Lo anterior se debe a la acción de
enzimas que disuelven la lámina media, destruyendo así la pared
celular e impidiendo la conexión plasmodésmica, llevando a la
interrupción en la translocación de solutos indispensables para la
vida orgánica o de una planta. Sobre estas células comienza el
desarrollo de una masa mucilaginosa de bacterias, de un olor
insoportable, típico de pudrición bacteriana, de ahí el nombre de la
enfermedad.
Las pérdidas mundiales de hortalizas y flores
atribuidas a la pudrición blanda ascienden al orden de
US\textdollar
100.000.000 por año. (Ciampi et al., 1997). La enfermedad puede ocurrir en campos, en jardines, en invernaderos durante el periodo del cultivo o bien en la etapa de poscosecha. También, puede ocurrir durante el transporte y en lugares de venta. En los tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.) cuando se dan las condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad, la pérdida total puede llegar a un 75% de la producción, siendo rangos normales de pérdidas entre 2 a 5%. Se estima que, a nivel de campo se pierde un total de 5%, mientras que en tubérculos almacenados esta cifra puede ascender a un 15% (Ciampi et al., 1997) lo que equivale a una pérdida en Chile estimada de 167.250 toneladas de papas, tomando como base una producción nacional de 1.115.000 toneladas (Fuente ODEPA, (Oficina de Estudios y Políticas Agrarias) 2005).
100.000.000 por año. (Ciampi et al., 1997). La enfermedad puede ocurrir en campos, en jardines, en invernaderos durante el periodo del cultivo o bien en la etapa de poscosecha. También, puede ocurrir durante el transporte y en lugares de venta. En los tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.) cuando se dan las condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad, la pérdida total puede llegar a un 75% de la producción, siendo rangos normales de pérdidas entre 2 a 5%. Se estima que, a nivel de campo se pierde un total de 5%, mientras que en tubérculos almacenados esta cifra puede ascender a un 15% (Ciampi et al., 1997) lo que equivale a una pérdida en Chile estimada de 167.250 toneladas de papas, tomando como base una producción nacional de 1.115.000 toneladas (Fuente ODEPA, (Oficina de Estudios y Políticas Agrarias) 2005).
La industria Neozelandesa de las calas pierde
aproximadamente NZ\textdollar 2.000.000 por causa de esta
enfermedad, lo que equivale a 1.360.000 dólares americanos,
afectando entre el 15-20% de tubérculos en
almacenamiento. Si las condiciones son favorables para la
enfermedad, las pérdidas en condiciones de campo pueden ser totales
(Vanneste, 1997), razón por la cual en la actualidad sólo se usa, a
nivel comercial, la propagación in vitro encareciendo la
producción del cultivo. (Comunicación personal, Gerente de PIGA Seed
S.A., 2005).
En la actualidad existen serios problemas para
el control de estos patógenos debido a la falta de bactericidas
comerciales, simplemente los agricultores desechan los productos
hortícolas con pudrición.
Las medidas de control son de tipo preventivas
tales como: uso de tubérculos sanos, de semillas certificadas, de
cultivares resistentes, ejercer la rotación con cultivos no
encamados, descartar plantas enfermas, usar suelos con buen drenaje
y manejar la humedad relativa en bodegas. La erradicación del
patógeno es difícil y no se han demostrado buenos niveles de control
en condiciones experimentalmente de campo. Se cita en la literatura
el uso de formaldehído, de hipoclorito de sodio, de ácido cítrico y
de algunas formulaciones bactericidas como Strepto Plus (Sulfato de
gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina) utilizando dosis
entre 60-120 g/HL. Otro producto no muy utilizado
por colorear azul al órgano comestible es el oxicloruro de
cobre.
Por otra parte el control de éstas bacterias se
complica debido a que las i diferentes subespecies bacterianas del
complejo Erwinia carotovera, pueden causar pudrición blanda y
pie negro dependiendo de las condiciones del medio ambiente en el
cual las plantas son cultivadas. Además, el riesgo latente de
infección en tubérculos-semillas permite apreciar
los síntomas de la enfermedad sólo una vez que el cultivo se ha
establecido. Otro factor asociado es que los patógenos están
frecuentemente protegidos dentro de las lenticelas o del sistema
vascular y, por lo tanto, no son afectados por los desinfectantes
comerciales de uso habitual.
Dentro del ámbito del control con productos de
origen orgánico se puede mencionar la posibilidad de usar un
producto proveniente de extractos de frutos cítricos (CITRUPAR 80)
que actúa como un "antibiótico natural" para el control de
estos patógenos.
Es importante mencionar que se aprecia la
existencia de extractos de origen vegetal, como por ejemplo el
divulgado en las solicitudes de patente de invención de Chile
2886-2001 y 2377-2004, tanto como
insecticidas y acaricidas, como agentes de las sustancias activas
Hederacocido y Alfa-Hederina. Igualmente se observa
la solicitud de patente 67-1999 que comprende miel
en combinación con otros ingredientes útiles como cosméticos y para
desinfecciones sanitarias.
Por otra parte, la solicitud de patente de Rusia
RU2236248 de fecha 27 de diciembre de 2001 y publicada el 20 de
septiembre de 2004, divulga una preparación inmunotrópica de uso
medicinal y farmacológico, en que se proporciona una preparación en
base a miel obtenida a partir de abejas alimentadas con una
composición que comprende miel obtenida de una sola flor extraída de
la familia de plantas Compositae y que comprende flavonoides
específicos para incluir la síntesis de interferona Alfa y Beta que
presenta alta efectividad en el tratamiento de profilaxis viral y
bacteriana. En las solicitudes rusas RU2236247 y RU2236244 pueden
observarse composiciones similares.
Sin embargo, ninguna de las publicaciones del
diseño previo resuelve el problema de las infecciones bacterianas
que sufren los vegetales según se describió anteriormente. Como
fuera descrito, uno de los cultivos más afectados por estas
bacterias es la papa. (Solarium tuberosum L.). Utilizar por
lo tanto un compuesto toxico no es viable ya que no permitiría
consumir el tubérculo. A pesar de los buenos resultados obtenidos
in vitro utilizando químicos para controlar Erwinia
spp, no ha sido efectivo como método de desinfección de
tubérculos.
En el caso específico de control de pudrición
blanda en tubérculos de papa, se han utilizado productos como
streptoplus (sulfato), benzoato de sodio y dióxido de cloro,
o-fenilfenato, bactericidas experimentales como CGA
78039, hipoclorito de sodio y ácido cítrico al 1%, formaldehído,
seguido de secado con aire forzado.
Como la mayoría de los productos hortícolas
afectados con pudrición por Erwinia son consumidos como
alimentos, para controlar esta pudrición no se pueden utilizar
productos sintéticos derivados de antibióticos que puedan tener
efectos tóxicos para la especie humana. Además, la globalización hoy
en día no nos permite utilizar antibióticos ya que la mayor parte
del mercado internacional corresponde a países donde existen
barreras a productos derivados de antibióticos para el control de
este tipo de enfermedades bacterianas.
El documento de la Base de Datos de WPI semana
200470, Derwent Publications Ltd., Londres GB„ AN
2004-716837, XP-002446355 se refiere
a la actividad inmonotrópica de una miel obtenida a partir de la
familia de plantas Asteraceae (Compositae), propóleo y extracto de
flores y hojas, sin separar el efecto específico de cada componente
como inmunotrópico.
La Patente JP-03240451 A se
refiere a una mezcla de agua y miel a partir de la especie vegetal
Tithymalus helioscopios (Syn Euphorbia heiloscopia), y por lo
tanto, ni es miel de Ulmo (Eucryphia cordifoila) ni tampoco
existe relación entre ambas especies vegetales. Además, la Patente
JP-03240451 A establece que la mezcla obtenida es
útil para mantener los alimentos frescos, sin embargo, a diferencia
de la presente invención, no indica que esta mezcla es capaz de
evitar la enfermedad de "pudrición blanda" en vegetales causada
por la bacteria del género Erwinia carotovora pv.
carotovora (Syn Pectobacterium carotovorom subp.
carotovorum).
La Patente WO-2005/120250 A
divulga la clasificación de la miel de manuka, (Leptospermum
scoparium), especie vegetal proveniente de Nueva Zelanda, y su
actividad antibacteriana conocida como Factor Único Manuka (UMF),
clasificación válida para mieles de manuka.
El documento de Molan P.C. "The antibacterial
activity of honey 1. The nature of the antibacterial activity"
(La actividad antibacteriana de la miel 1. La naturaleza de la
actividad antibacteriana) BEE WORLD, BEE RESEARCH ASSOCIATION,
GERRARDS CROSS, GB, VOL 1-2, 1992, PÁGINAS
5-29 XP-002802515, issn:
0005-772X indica las propiedades antibacteriana
inherentes a la miel de abeja de cualquier origen botánico, sin
divulgar en la lista la susceptibilidad de las bacterias Erwinia
carotovora pv. Carotovora.
Los artículos "Pollen analysis of honeys from
the Los Lagos región of southern Chile" (Análisis de polen de
abejas desde la región de Los Lagos en el sur de Chile), HELMUT
HORN y MARÍA JESÚS AIRA, 1997 Scandinavian University Press y
"Estudio palinológico en 10 muestra de miel de ulmo (Eucryphia
cordifolia CAV.)", Miguel Ángle Trivelli, Alimentos, Vol. 12
- Nº3, 1987 se refieren a un estudio de la miel de Ulmo desde el sur
de Chile en base a los tipos de polen en estas abajas, sin embargo,
no menciona sus propiedades bactericidas.
La solución de la presente invención resuelve
los problemas previamente descritos mediante un producto en base a
mieles monoflorales que corresponde a un compuesto orgánico inocuo
cuya "materia prima es única para el mundo" ya que el origen
botánico de la miel a utilizar nos indica que sólo se puede producir
en Chile. Esto permite que el producto antibiótico controlador de
pudrición blanda se produzca en Chile y beneficie el control de las
bacterias en papas, vegetales y frutos por medio de un producto
natural que no daña las cualidades de la especie a la cual se aplica
y que cumple con todas las normas internacionales en esta materia.
Por otra parte, se presenta como una gran oportunidad para el sector
apícola nacional en general.
En resumen, las ventajas o beneficios del objeto
de la invención se presentan como sigue:
- -
- Producto 100% natural. Atóxico para humanos y animales.
- -
- Germicida de amplio espectro, de rápida acción y muy eficaz contra Erwina carotovora pv. Carotovora
- -
- No irrita la piel ni los ojos de humanos o animales y es inofensivo para las membranas mucosas.
- -
- Tiene propiedades de conservación, es decir, bacteriostáticas.
- -
- Óptima estabilidad en pH de 2 a 12 y temperaturas hasta 130ºC.
- -
- No es volátil.
- -
- Es "selectivo".
- -
- No es antibiótico, pero actúa en forma similar.
- -
- Es compatible con antibióticos, sulfatos, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 corresponde a un gráfico que muestra
la incidencia de pudrición blanda en tubérculos de papa de la
variedad Desireé tratados con mieles monoflorales en condiciones de
postcosecha.
La figura 2 corresponde a un gráfico que muestra
el origen botánico de una de las mieles probadas, M182, para
ejemplificar la invención.
La figura 3 corresponde a un gráfico que muestra
el origen botánico de una de las mieles probadas, M84, para
ejemplificar la invención. Esta miel representa una miel monofloral
de ulmo debido a que la frecuencia de los granos de polen de ulmo
encontrada fue superior al 50%.
La figura 4 corresponde a un gráfico que muestra
el origen botánico de una de las mieles probadas, M335, para
ejemplificar la invención.
La figura 5 corresponde al ejemplo 3 donde se
puede apreciar diferencias visuales de presencia de pudrición blanda
en lechugas tipo Great Lakes. De izquierda a derecha se observa una
lechuga no infectada, una lechuga infectada, una lechuga infectada
tratada con extracto M349, y una lechuga no infectada tratada con
extracto M349.
La figura 6 corresponde a la placa de ELISA
donde se observa la inhibición de crecimiento in vitro de
Erwinia carotovora pv. carotovora con extracto de miel
M349.
La figura 7 corresponde a la placa de ELISA con
P. syringae pv. Syringae. Las primeras tres filas
corresponden al crecimiento in vitro de la bacteria en medios
con extracto M349 y caldo de soya. El crecimiento de la bacteria se
aprecia a partir de la cuarta columna.
La figura 8 corresponde a la viabilidad de
espermatozoides de rata expuestos a distintas concentraciones de
extracto de miel M349 expresada en porcentaje de espermatozoides
vivos de rata (n=100), y tiempo de observación.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención esencialmente corresponde a una
composición obtenida a partir de extracto de flavonoides y/o fenoles
de mieles monoflorales, preferentemente mieles chilenas derivadas de
diferentes especies y que actúan en forma independiente como
controladores para diferentes infecciones bacterianas en diversas
especies vegetales.
El origen botánico de cada miel se determina a
través de un proceso de separación de los granos de polen por
centrifugación y su posterior tinción y observación en microscopio
de luz. Los datos fueron cuantificados estadísticamente. De esta
forma, una miel se considera monofloral cuando más del 50% del polen
presente en la miel corresponden a una sola especie vegetal.
Para llevar a cabo la extracción de la miel, y
sólo a modo ilustrativo dado que un técnico de nivel medio versado
en la materia podría claramente extrapolar las cantidades señaladas
a continuación, se lleva a cabo un proceso que contempla las
siguientes etapas:
- 1.
- Se pesa 50 gr de miel.
- 2.
- Se diluyen con 100 ml de agua destilada acidificada con HCI (pH=2).
- 3.
- La solución se pone en un matraz aforado de 250 ml y se enrasa hasta dicho volumen con agua ácida.
- 4.
- La solución se filtra con algodón y se pasa por una columna de resina Amberlita XAD-2 (250 mm de alto por 20 mm de diámetro), a una velocidad de goteo de 2 ml/min. Los compuestos fenólicos quedarán retenidos en la columna.
- 5.
- Se lava la columna con 100 ml de agua ácida. El líquido se desecha.
- 6.
- Se lava por segunda vez con 200 ml de agua destilada neutra. El líquido se desecha.
- 7.
- Se lava por tercera vez con 300 ml de metanol puro. El metanol eluirá los compuestos fenólicos de la columna. El metanol se colecta en un vaso o matraz limpio, y se traspasa a un balón para rotoevaporador de 500 ml.
- 8.
- La solución metanólica se concentra hasta sequedad en el rotoevaporador a 45ºC (tiempo aprox.: 12 hrs a velocidad de rotación alta).
- 9.
- El residuo se resuspende en 5 ml de agua destilada.
- 10.
- La suspensión se pone en un embudo de decantación y se agregan 5 ml de éter dietílico. Se colecta la fase etérea (fase coloreada inferior) y se vuelve a extraer con 5 ml de éter dos veces más.
- 11.
- La solución etérea se concentra hasta sequedad en el rotoevaporador a 45ºC (tiempo aprox.: 1 hr a velocidad de rotación alta).
- 12.
- El residuo se resuspende en 2 ml de agua destilada esterilizada con autoclave a 15 libras de presión (125ºC) por 15 minutos, posteriormente el extracto se filtra a través de filtros de jeringa de 0,45 um (tamaño de poro), y se guarda a -20ºC.
Con el proceso antes descrito fue posible
obtener extractos de mieles monoflorales con los cuales se llevaron
a cabo diferentes pruebas para el control de pudrición blanda
bacteriana en tubérculos de papas en general.
Un análisis cromatográfico para analizar los
compuestos fenólicos y flavonoides presentes en la miel permitió
determinar que los compuestos presentes en el extracto corresponden
a ácido gálico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido salicílico,
naringenina y kaempferol.
No obstante el procedimiento antes descrito,
también es posible obtener extractos etanólicos de miel. Para este
fin, en el punto 4 del proceso, se colecta parte de la miel diluida
y se filtra con filtros de 0,45 um y se guarda a -20ºC. En el punto
9 del proceso, el residuo se resuspende en alcohol etílico de 85º,
luego se filtra con filtros de 0,45 um y se guarda a -20ºC. En el
punto 12 del proceso, el residuo se resuspende en alcohol etílico de
85º, luego se filtra con filtros de 0,45 um y se guarda a -20ºC.
Este procedimiento permitió obtener un producto
de miel inocuo y orgánico, de fácil elaboración y compatible con el
manejo integrado de plagas y enfermedades. Al ser un producto
inocuo, puede ser utilizado en agricultura convencional y orgánica.
Posteriormente, el extracto puede ser formulado de diferentes
formas, como por ejemplo y no limitándose a, disolución en agua
destilada que puede ser presentado en un producto spray
(atomización) o como una solución bactericida.
Cuando se aplica el producto, su modo de acción
se debe a compuestos de origen floral no peroxídicos que actúan
inhibiendo el desarrollo bacteriano con una acción bacteriostática
sobre el patógeno. Es decir, es un producto de contacto.
El método de aplicación para su uso en la
inhibición del desarrollo bacteriano en vegetales está dado por
soluciones que contemplen dosis superiores al 10% del extracto. No
obstante, se han llevado a cabo estudios con otras formulaciones y
los resultados también han sido exitosos.
Los siguientes ejemplos muestran la eficacia en
el control de la enfermedad e inhibición del desarrollo de
Erwinia carotovora pv. Carotovora, al prolongar el tiempo de
poscosecha de productos hortícolas con la consecuente disminución de
pérdidas asociadas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el estudio experimental realizado para
mostrar la eficacia del producto que se presenta en esta solicitud
de patente, se observó la inhibición in vitro e in
situ del crecimiento de la bacteria Erwinia carotovora pv.
carotovora, bacteria causante de pie negro y pudrición húmeda de
la papa (Solanum tuberosum), por el efecto de soluciones
obtenidas a partir de 3 mieles monoflorales de ulmo (Eucryphya
cordifolia), especie nativa dominante del Bosque Templado de la
zona sur de Chile.
Para el crecimiento bacteriano se usó como medio
de cultivo el medio B de King (KB). El inoculo que se utilizó fue un
aislamiento bacteriano proveniente de tubérculos de papa comercial
de la zona de San Fernando. Posteriormente, se realizó una batería
bioquímica para determinar la bacteria y la cepa además de la
tinción de gram-, determinándose la cepa Erwinia carotovora pv.
carotovora (Ecc). El análisis in vitro de la inhibición
de crecimiento bacteriano se basó en la cuantificación de halos de
inhibición del crecimiento bacteriano midiendo el área de inhibición
con un planímetro, también se midió el MIC (concentración mínima de
inhibición) de cada miel y se utilizó la técnica de difusión en agar
(well diffusion agar) adicionando miel en el medio de cultivo a
distintos volúmenes observando el crecimiento bacteriano. Se
utilizaron concentraciones entre 10^{5} a 10^{7} UFC (unidades
formadoras de colonias/ml). El análisis estadístico se basó en un
diseño completamente al azar con análisis estadístico ANDEVA y
TURKEY-Kramer al 95-5 de confianza
respectivamente. Por otro lado, se analizó las mieles con una
solución azucarada con pH ajustado a 4 que contenía en proporción
promedio los azúcares más importantes presentes en las mieles.
Posteriormente se llevó a cabo un análisis de la
actividad in situ de mieles monoflorales de ulmo. Se analizó
la inhibición del crecimiento bacteriano en tubérculos de papa
variedad Desireé (principal papa de consumo del mercado chileno) de
dos maneras: 1) inoculando a través de una jeringa de 0,5 ml con
solución bacteriana y agua destilada con una concentración de
10^{7} UFC y colocando en el interior del tubérculo soluciones de
miel a distintas concentraciones con otra jeringa. 2) inoculando a
través de una jeringa de 0,5 ml con solución bacteriana y agua
destilada con una concentración de 10^{7} UFC y pincelando el
exterior del tubérculo con distintas soluciones de miel.
Las mieles que mostraron mayor actividad
bactericida contra Ecc fueron las mieles codificadas como M182, M84
y M335 cuyos orígenes botánicos se pueden observar en las figuras
que complementan la presente descripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mieles orgánicas e inocuas fueron preparadas
en distintas soluciones acuosas las cuales correspondían a: 1:10;
1:4; 1:1 (v/v). Todas las soluciones mostraron inhibición, sin
embargo la concentración al 50% dio los valores más altos. Los
resultados mostraron inhibiciones del crecimiento de las bacterias
entre un rango desde 40 a 80% en dosis 1:10 v/v de miel y agua
destilada en tubérculos de papa con una dosis bacteriana de (3,7 x
10^{7} UFC).
El número de muestras experimentadas mostró
diferencias significativas de inhibición en relación al control.
La figura 1 muestra el alto impacto que tuvo la
aplicación del producto en base a mieles monoflorales sobre la
muestra infectada. Dicho gráfico muestra que un 50% de concentración
v/v tuvo un alto porcentaje de control en la incidencia de la
pudrición blanda.
Respecto a la miel M335, cuyo origen botánico se
puede observar en la figura 4, es posible deducir resultados
significativos en su aplicación. Esta miel fue experimentada en
disoluciones de un 10% v/v. Mostró un 60% de inhibición del
crecimiento bacteriano in vitro en comparación con soluciones
de azúcares y ph ajustado a 4 presentes en promedio en las mieles
(fructosa 38,5% (w/w), glucosa 31%, 7,2% maltosa, 1,5% sacarosa)
(D'Arcy, 2001. Datos USDA), soluciones que no dieron o resultaron
ser menos efectivos para la inhibición in vitro de Erwinia
carotovora pv. Carotovora.
La miel M335 correspondió a un extracto de
flavonoides derivados de miel orgánica monofloral de ulmo que
controla la pudrición blanda bacteriana de tubérculos de papa en
post cosecha. Su composición es la siguiente:
Para evaluar la efectividad de la invención
descrita sobre la pudrición blanda bacteriana, se realizó el
siguiente estudio donde se utilizaron tubérculos semilla de cinco
variedades de papa (Desiree, Cardinal, Atlantic,
Karu-INIA y Pukara-INIA),
colocándolas bajo condiciones de almacenamiento. Se utilizaron los
siguientes tratamientos: 1. muestra sana 2. Inoculado con Erwinia
carotovora pv. carotovora, 3. Inoculado con Erwinia
carotovora pv. carotovora más aplicación de extracto de
miel M349, 4. Inoculado con Erwinia carotovora pv.
carotovora más aplicación del Producto
Citrupar-80.
El procedimiento o preparación del extracto de
miel así como la preparación del inóculos y la inoculación de las
cinco variedades de papas correspondió al mismo protocolo descrito
en el ejemplo 1.
Posteriormente, los tubérculos se distribuyeron
en cajas plásticas con un diseño factorial completamente al azar
para ser colocados en bodega en oscuridad y cubiertos con malla
Rachel y fueron analizados a los 50 días.
La severidad se evaluó cortando
longitudinalmente el centro de cada tubérculo, utilizando la escala
Horsfall-Barrat (1945) que considera el porcentaje
de área del tubérculo con pudrición de acuerdo a la siguiente
escala:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de las evaluaciones se sometieron a
análisis estadístico (Andeva), la separación se realizó de acuerdo a
la prueba DMS (p<0,05).
Previo al análisis Andeva los datos de la
variable incidencia se transformaron a raíz cuadrada del % más
0,5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos en este ensayo
permitieron concluir la evaluación de severidad en que se encontró
interacción entre las variedades a través de los parámetros
estadísticos descritos. El producto tuvo un buen efecto en reducir
el daño por pudrición blanda en las variedades Atlantic y Cardinal.
(Cuadro 1)
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar el crecimiento de la bacteria
Erwinia carotovora pv. carotovora se utilizaron lechugas tipo
Great Lakes (n=18) distribuidas en 4 tratamientos: muestra sana,
muestra infectada, lechugas tratadas con extracto M349 y lechugas
infectadas tratadas con extracto M349 en una solución de 10% v/v. La
infección artificial de las lechugas se realizó con atomizador a
punto de chorreo cubriendo toda la superficie de cada lechuga
infectada. Posteriormente se asperjaron los tratamientos. Cada
lechuga se embolsó en bolsas transparentes y se colocaron bajo
condiciones de invernadero a 30ºC por siete días.
La severidad se evaluó cortando
longitudinalmente el centro de cada tubérculo, utilizando la escala
Horsfall-Barrat (1945) que considera el porcentaje
de área del tubérculo con pudrición de acuerdo a la siguiente
escala:
Los datos de las evaluaciones se sometieron a
análisis estadístico (Andeva), la separación se realizó de acuerdo a
la prueba DMS (p<0,05).
Previo al análisis Andeva los datos de la
variable incidencia se transformaron a raíz cuadrada del % más
0,5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A los 7 días las lechugas Infectadas y tratadas
con extracto M349 no mostraron cambios significativos en cuanto a
presencia de la enfermedad en comparación con las muestras sanas y
las lechugas tratadas con extracto M349, obteniéndose niveles de
pudrición blanda en dichos tratamientos entre el 1 y el 6% de área
afectada con la enfermedad, por otra parte el grupo de lechugas
estadísticamente distinto correspondió al tratamiento de muestra
infectada donde los niveles de pudrición alcanzados son cercanos al
80% de pudrición.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El tratamiento en lechugas infectadas y tratadas
con extracto M349 controló la enfermedad en este periodo de
evaluación que se observo con pudrición correspondió a la muestra
enferma. (Figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la actividad bacteriostática del
extracto acuoso de miel M349 almacenado por 30 días a temperatura
ambiente y a -20ºC, sobre el control de crecimiento in vitro
de Erwinia carotovora pv. carotovora, a través de la
determinación de la concentración mínima del extracto capaz de
inhibir el crecimiento bacteriano (Figura 6).
De los resultados obtenidos se observa que el
extracto M349 almacenado a 25ºC inhibió el crecimiento in
vitro de Erwinia carotovora pv. carotovora en
concentraciones superiores de 0,188 \mul de extracto/? \mul
de solución. Por otra parte el extracto M349 almacenado a - 20ºC,
inhibió el crecimiento in vitro de Erwinia carotovora pv.
carotovora en concentraciones superiores de 0,188 \mul de
extracto/? \mul de solución.
Los resultados muestran que la actividad del
extracto de miel presentado en la solicitud de patente es capaz de
seguir inhibiendo el crecimiento de la bacteria causante de la
Pudrición Blanda incluso bajo condiciones de almacenamiento en
estantería a temperatura ambiente (25ºC) y almacenamiento a bajas
temperaturas.
No se encontraron diferencias significativas de
la actividad bacteriostática entre estos dos extractos almacenados
en diferentes condiciones de almacenamiento, la temperatura no
afectó la actividad bacteriostática del extracto.
\vskip1.000000\baselineskip
Pseudomonas syringae pv. syringae es una
bacteria Gram negativa, causante de la enfermedad denominada cáncer
bacteriano (bacterial cáncer), que ataca a árboles frutales como por
ejemplo: guindo, almendro, cerezo, damasco, duraznero, peral y a
algunos cultivos como arroz. Afecta a árboles jóvenes y adultos
desencadenando una serie de síntomas (síndrome). Dentro de los daños
más importantes encontramos la brotación desuniforme y retardada,
savia ácida, y exudación de goma. Sin embargo un ataque de mayor
importancia o sin control, es capaz de generar muerte de ramas
madres, yemas, flores e incluso del árbol completo (Figura 7). A su
vez, Ps. syringae pv syringae es capaz de afectar los frutos,
provocando una lesión café con un margen acuoso que impide su
comercialización. Todos estos daños se deben a bacteria que produce
la fitotoxina syringomicina, que consiste en un ácido graso de
longitud variable unido a un péptido cíclico.
Las formas de diseminación de la bacteria son
muy variadas, siendo la principal el arrastre por lluvia y la
penetración por heridas de poda.
El control de la enfermedad, corresponde a
medidas culturales, como por ejemplo, no podar con la madera mojada,
o la desinfección de tijeras y serruchos, y la eliminación de ramas
afectadas (que como última solución son quemadas). Es por esto que
la búsqueda de productos eficaces, que aseguren un buen control de
la enfermedad y que no dañen el medio ambiente (desde su producción
hasta su desecho) es primordial para la agroindustria nacional.
Debido a lo anterior, en la actualidad existe un gran interés en el
estudio de propiedades antimicrobianas de extractos de plantas y
otros productos que puedan asegurar un buen control de ésta y otras
enfermedades de características similares.
Se evaluó la actividad del extracto de miel M349
a través de la determinación de la concentración mínima del extracto
capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en placas ELISA (Figura
7).
El extracto M349, inhibió el crecimiento in
vitro de Pseudomonas syringae pv. syringae en
concentraciones superiores de 0,188 ul de extracto/\mul DE ?ul de
solución.
El extracto M349 in vitro, muestra una
promisoria actividad sobre el agente causal del cáncer bacteriano de
carozos, con un potencial uso como biocontrolador de la
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Las especies bacterianas y sus cepas analizadas
correspondieron a:
- 1.
- Enterobacter aerogenes Hormaeche y Edwards ATCC 13048, bacteria entérica causante de desórdenes gastrointestinales intrahospitalarios.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Escherichia coli (Migula) ATCC 25922, bacteria de tipo enteroagregativa (ECEAgg) capaz de sobrevivir largo tiempo en el intestino humano, que a través de toxinas genera cuadros diarreicos en una infección severa.
- 3.
- Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula ATCC 27853. Causante de infecciones a la piel asociadas principalmente a su presencia en infecciones nosocomiales (intrahospitalarias).
- 4.
- Salmonella typhi STH 2370 Causante de fiebre tifoidea, como otros patógenos entéricos, las infecciones por S. typhi se transmiten por los alimentos y el agua contaminada con heces de personas con infección aguda, excretores persistentes o portadores crónicos asintomáticos. El ser humano es el único huésped de S. typhi; no hay reservorios ambientales.
- 5.
- Vibrio cholerae ISP, causante del cólera, enfermedad gastrointestinal aguda asociada.
- 6.
- Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach ATCC 25923, bacteria que se encuentra en la piel y fosas nasales de las personas sanas, que causa gran variedad de infecciones, desde infecciones menores de la piel (furúnculos, ampollas, vejigas) y abscesos cutáneos hasta enfermedades que pueden poner en peligro la vida como neumonía, meningitis, endocarditis, síndrome del shock toxico (SST) y sepsis.
- 7.
- Streptococcus pneumoniae tipo B agente común de las enfermedades respiratorias bajas y altas, tales como neumonía y otitis media aguda (infecciones del oído medio), y de meningitis, que afectan a los niños y los adultos en todo el mundo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la actividad del extracto de miel M349
a través de la determinación de la concentración mínima del extracto
capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en placas ELISA con la
técnica microbiológica de microdilución en placas elisa de 96
pocillos (Broth microdilution methods) (Cuadro 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se eliminó la columna de porcentaje de extracto
porque está explicada en la columna de MIC.
El extracto de miel M349 inhibió el
crecimiento in vitro de todas las bacterias
distinguiéndose dos grupos según la concentración mínima de
inhibición (MIC) del extracto.
Para las bacterias: Enterobacter aerogenes,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Saimonella typhi,
Staphylococcus aureus, el MIC obtenido fue de 0,188 \mul de
extracto/\mul de solución
El extracto M349, inhibió el crecimiento in
vitro a una a menor concentración las bacterias Vibrio
cholerae y Streptococcus pneumoniae tipo B con un MIC obtenido
de 0,047 \mul de extracto/\mul de solución.
Se utilizaron espermatozoides de rata
(Balb-c), células consideradas como las más
sensibles para este tipo de evaluación. Los espermatozoides se
cultivaron en un medio complementado con distintas concentraciones
del extracto de miel M349(1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000
v/v)
Se evaluó la viabilidad celular de los
espermatozoides a distintos intervalos de tiempo (t=0 hr, t=1 hr,
t=2 hrs, t=4 hrs), se observaron aprox. 100 espermatozoides en cada
intervalo y se obtuvo el porcentaje de espermatozoides que
presentaban motilidad, parámetro de viabilidad celular. (Figura
8).
La Figura 8 muestra que exceptuando la
concentración 1:10 (Dosis alta para determinar toxicidad), alrededor
del 50% de los espermatozoides se observan activos a las 4 horas de
observación. Además a las 4 horas el número de espermatozoides vivos
observados es igual o superior al observado en el medio del control
para las concentraciones C4 (1:10000), C3 (1:1000) y C2 (1:100),
este resultado se interpreta como muy baja o casi nula la toxicidad
del extracto sobre estas células.
Claims (8)
1. Composición natural para el control de
infecciones bacterianas en papas, lechugas, hortalizas, carozos y
flores en general caracterizada porque está elaborada a
partir de extractos de flavonoides y/o fenoles de mieles
monoflorales orgánicas que actúan en forma independiente como
controladores de diferentes infecciones bacterianas, dicha miel
monofloral orgánica es una miel de ulmo, compuesta de tal manera que
al menos el 50% de los granos totales de polen presentes en ella
correspondan a una sola especie vegetal y con la siguiente
composición:
con un pH: 4,9 a
5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento para obtener un extracto de
miel monofloral orgánica útil en el control de infecciones
bacterianas en papas, lechugas, hortalizas, carozos i y flores en
general, donde dicha miel monofloral orgánica es una miel de ulmo y
está compuesta de tal forma que al menos el 50% de los granos
totales de polen presentes en ella corresponden a una sola especie
vegetal, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- pesar la cantidad de miel a utilizar,
- b)
- diluir dicha miel en agua destilada acidificada con HCI (pH=2),
- c)
- colocar la solución de la etapa anterior en un matraz aforado y enrasar con agua ácida,
- d)
- filtrar y pasar dicha solución por una columna de intercambio catiónico a una velocidad de goteo constante, de modo que los compuestos fenólicos queden retenidos en dicha columna,
- e)
- lavar dicha columna con agua ácida y desechar el líquido restante,
- f)
- lavar por segunda vez dicha columna con agua destilada neutra y desechar el líquido restante,
- g)
- lavar por tercera vez con metanol puro para eluir los compuestos fenólicos de la columna, luego colectar dicho extracto y traspasarlo a un balón para rotoevaporar hasta sequedad a vacío con temperatura de 45ºC, de modo de eliminar el solvente y concentrar los compuestos fenólicos obtenidos
- h)
- resuspender el residuo en agua destilada,
- i)
- decantar la suspensión y agregar éter dietílico, de modo de colectar una fase etérea y volver a extraer con éter dos veces más,
- j)
- concentrar dicha solución etérea en sequedad en rotoevaporador y
- k)
- resuspender el residuo en agua destilada esterilizada para posteriormente filtrar el extracto con filtros de jeringa de nitrocelulosa de 20 \mum y guardarlo a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación
2, caracterizado porque en la etapa d) el proceso de filtrado
se hace a través de algodón hidrófobo o papel filtro tipo Watman Nº
2, y la columna utilizada se puede seleccionar de columna de
intercambio catiónico con resina Amberlita XAD-2, y
la velocidad de goteo puede estar en el rango de 2\pm0,2 mL por
minuto en forma constante.
4. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación
2, caracterizado porque en forma alternativa es posible
obtener extractos de miel etanólicos, al colectar, en dicha etapa
d), parte de la miel diluida y filtrada y filtrarla para guardarla a
-20ºC; en dicha etapa I) resuspender el residuo en alcohol etílico
de 85º, filtrarlo y guardarlo a -20ºC; y en dicha etapa k)
resuspender el residuo en alcohol etílico de 85º, filtrarlo y
guardarlo a -20ºC.
5. Uso de una composición elaborada a partir de
extractos de flavonoides y/o fenoles de mieles monoflorales
orgánica, donde dicha miel monofloral es una miel de ulmo y está
compuesta de tal forma que al menos el 50% de los granos totales de
polen en ésta corresponden a una sola especie vegetal,
caracterizado porque sirve para controlar infecciones
bacterianas en papas, lechugas, hortalizas, carozos y flores en
general.
6. Uso de una composición de acuerdo a la
reivindicación 5 caracterizado porque sirve para controlar el
crecimiento de la bacteria Erwinia carotovora pv. Carotovora,
la cual es causante de pie negro y pudrición blanda de la papa.
7. Composición natural para el control de
infecciones bacterianas que comprende la composición de acuerdo a la
reivindicación 1, caracterizado porque está formulada en base
a la disolución en agua que permite presentarla como un producto
spray (atomización) o como una solución bactericida.
8. Composición natural para el control de
infecciones bacterianas que comprende la composición de acuerdo a la
reivindicación 1, caracterizado porque dicha composición
comprende al menos un 10% v/v de miel monofloral en base a extractos
de miel monofloral.
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