ES2341948T3

ES2341948T3 - Celulas madre endoteliales, poblaciones, metodos de aislamiento y uso de las mismas.

Info

Publication number: ES2341948T3
Application number: ES02796023T
Authority: ES
Inventors: William C. Fanslow Iii; Anne-Marie C. Rousseau; Thomas O. Daniel
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2022-12-20
Also published as: AU2002360741A1; JP2005514062A; WO2003060077A2; US20030148512A1; DE60235836D1; JP4447033B2; US7833697B2; PL210872B1; EP1465983B1; WO2003060077A3; AU2002360741B2; MXPA04006154A; PL374312A1; EP1465983A2; EP1465983A4; CA2469472A1; CA2469472C; JP2008148702A; ATE462782T1

Abstract

Uso de un antibiótico específico para P1H12 para preparar una población enriquecida de células madre por medio de selección positiva a partir de una población original de células, siendo dichas células madre capaces de dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial.

Description

Células madre endoteliales, poblaciones, métodos de aislamiento y uso de las mismas.

Esta solicitud reivindica como prioridad a la solicitud provisional No. 60/343.498, presentada el 21 de diciembre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención proporciona células madre caracterizadas por tener la habilidad para renovar y la habilidad para dar lugar a células endoteliales o de tipo endotelial, métodos para aislar tales células madre y métodos para utilización de las mismas. También proporciona células de la progenie derivadas de las células madre de la
invención.

Antecedentes de la invención

El cuerpo de los mamíferos está compuesto de diferentes células comprometidas con el linaje que dan lugar a muchos de los tejidos del cuerpo de los mamíferos. A pesar de la diversidad de la naturaleza, morfología, características y función de tales células comprometidas con el linaje, actualmente se cree que la mayoría, si no todas, las células comprometidas con el linaje se derivan de diferentes células madre que dan lugar a una o más de las células comprometidas con el linaje del cuerpo de los mamíferos. Tales células madre constituyen únicamente un pequeño porcentaje del número total de células presentes en el cuerpo y pueden variar dependiendo de su compromiso relativo con un tipo particular de célula. Además, no se sabe qué marcadores asociados con las células comprometidas con el linaje están también presentes en las células madre. Un marcador que ha sido identificado como presente en las células madre, CD34, también se encuentra en un número significativo de progenitores comprometidos con el linaje (Asahara y colaboradores, 1997, Science, 275: 964). En particular, las células B (CD19^{+}) y las células mieloides (CD33^{+}) constituyen del 80 al 90% de la población de CD34^{+}. Además, estará presente una combinación de CD3, 8, 10, 15, 19, 20 y 33 sobre más del 90% de todas las células CD34^{+}. Por lo tanto, en vista de la pequeña proporción del número total de células en la médula ósea que son células madre, la incertidumbre de los marcadores asociados con las células madre a diferencia de las células más diferenciadas, y la inhabilidad general para hacer ensayos biológicos con células madre humanas, ha sido esquiva la identificación y purificación de células madre.

Las células endoteliales son una unidad celular organizacional de estructuras vasculares. Se requiere su compromiso lineal, expansión y montaje en vasos sanguíneos para organogénesis durante el desarrollo embrionario. Durante la angiogénesis, las células endoteliales en vasos existentes son activadas por factores de angiogénesis tales como TGF, FGF, y VEGF. Se forman nuevos vasos a través de la proliferación y migración de células, y del alargamiento y ramificación de los vasos existentes.

Se requiere la identificación de una fuente fácilmente disponible de células madre que pueda dar lugar a células endoteliales. La necesidad es particularmente aguda para células madre de fuentes de adultos, en vista de las restricciones recientemente colocadas para el uso de fondos federales para investigación sobre células madre embrionarias. La posesión de tales células madre permitirá la identificación de factores de crecimiento asociados con la regeneración de células endoteliales. Además, pueden existir aún factores de crecimiento no descubiertos u otros factores biológicos (por ejemplo, factores de transcripción) asociados con las primeras etapas de la dedicación de las células madre a un linaje de células endoteliales, la prevención de tal dedicación, y el control negativo de la proliferación de las células madre. La disponibilidad de las células madre sería extremadamente útil en trasplantes vasculares, ingeniería de tejidos, regulación de la angiogénesis, vasculogénesis, y la prevención de la misma. Las células madre y su progenie pueden encontrar uso en el tratamiento del daño y reparación del miocardio. Tales células madre también podrían ser utilizadas para introducir un gen en un individuo como parte de un régimen de terapia génica.

Resumen de la invención

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar una población enriquecida de células madre, que comprende la separación de dicha población enriquecida de células madre a partir de una primera población de células, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye al menos aproximadamente una concentración 100 veces mayor de células madre P1H12+ que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente de 1.000 hasta aproximadamente 4.000 veces mayor de células madre P1H12+ que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye además entre una concentración superior a dicha primera población de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a P1H12+ y seleccionar dicha población enriquecida de células que está enlazada a dicha molécula. En otra modalidad, dicha molécula es un anticuerpo. En otra modalidad, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, dicha molécula se deriva de un anticuerpo. En otra modalidad, dicha molécula es una molécula de fusión péptido-Fc. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y seleccionar dicha población enriquecida de células que está enlazada a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza con un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y remover de dicha población enriquecida de células a las células que no están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y seleccionar de dicha población enriquecida de células a las células que no están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y remover de dicha población enriquecida de células, las células que están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye al menos una población aproximadamente 100 veces mayor de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente al menos 1.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente al menos 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34+ o CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34- y CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34+ y CD45+. En otra modalidad, dicha molécula está enlazada a una entidad detectable. En otra modalidad, dicha entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica, o una entidad magnética. En otra modalidad, dicha molécula está enlazada a un sustrato sólido. En otra modalidad, dicho sustrato sólido es una superficie plástica, una superficie de vidrio, agarosa, acrilamida, lectina o una partícula magnética. En otra modalidad, dicho método comprende además la etapa de cultivar dicha población enriquecida de células madre para dar lugar células de la progenie que son P1H12+, CD144+, AC133+, CD202+, CD45-, VEGFR2+, tienen una mayor capacidad proliferativa que las HUVEC y las MVEC, y contienen Cuerpos de Weibel-Palade. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de un mamífero. En otra modalidad, dicho mamífero es un primate. En otra modalidad, dicho primate es un humano. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de médula ósea. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de tejido de hígado fetal.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una población de células madre preparada como anteriormente. En otra modalidad, dichas células madre son positivas para uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre es enriquecida por células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- y VEGFR2-. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre es enriquecida además por células madre que son CD34+ o CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre es enriquecida adicionalmente por células madre que son CD34+ y CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre es enriquecida adicionalmente por células madre que son CD34- y CD45+. En otra modalidad, dichas células madre contienen Cuerpos de Weibel-Palade. En otra modalidad, dichas células madre son células progenitoras endoteliales. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de un mamífero. En otra modalidad, dicho mamífero es un primate. En otra modalidad, dicho primate es un humano. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de médula ósea. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de tejido de hígado fetal.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una población de células de la progenie derivada de la población enriquecida de células madre de la Reivindicación 31, en donde dichas células de la progenie son P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, tienen una mayor capacidad proliferativa que las HUVEC y las MVEC, y contienen Cuerpos de Weibel-Palade.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula madre aislada que es P1H12+ y AC133+ y que puede autorenovarse y diferenciarse dentro de una célula endotelial. En otra modalidad, la célula madre aislada es adicionalmente CD148+, CD144-, VEGFR2- y CD202b-. En otra modalidad, dicha célula madre aislada es adicionalmente CD34+ o CD45+. En otra modalidad, dicha célula madre se deriva de un mamífero. En otra modalidad, dicho mamífero es un primate. En otra modalidad, dicho primate es un humano. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de sangre periférica. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de médula ósea. En otra modalidad, dicha primera población de células se deriva de tejido de hígado fetal. En otra modalidad, dicha célula madre aislada puede ser cultivada al menos durante 14 días en un medio completo que contiene 15% de suero. En otra modalidad, dicha célula madre aislada comprende además una secuencia heteróloga de
polinucleótidos.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una línea de células que comprende una célula madre aislada como se describió anteriormente o una célula de la misma progenie.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo de células madre que comprende una población sustancialmente homogénea de células madre como se describió anteriormente.

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En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una célula madre aislada como se describió anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, se selecciona dicho portador farmacéuticamente aceptable del grupo que consiste de solución salina, un gel, un hidrogel, una esponja, y una matriz.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula aislada de la progenie obtenida por cultivo de una célula madre aislada como se describió anteriormente aproximadamente durante 6 días hasta aproximadamente 3 semanas en medio completo con 15% de suero, en donde la célula de la progenie se caracteriza por ser P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, tienen una mayor capacidad proliferativa que las HUVEC y las MVEC, y contienen Cuerpos de Weibel-Palade.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo de células de la progenie que comprende una población sustancialmente homogénea de una célula aislada de la progenie como se describió anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una células aislada de la progenie como se describió anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, se selecciona el portador farmacéuticamente aceptable del grupo que consiste de solución salina, un gel, un hidrogel, una esponja, y una matriz.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una construcción para ingeniería de tejidos que comprende una célula madre aislada como se describió anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una construcción para ingeniería de tejidos que comprende la progenie de una célula madre aislada como se describió anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una construcción para ingeniería de tejidos que comprende una célula madre aislada como se describió anteriormente y una célula de la misma progenie.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para la identificación de un agente que induce diferenciación de una célula madre aislada como se describió anteriormente que comprende poner en contacto dicha célula madre aislada con un agente de prueba y detectar un cambio en dicha célula madre aislada, en done dicho cambio indica que dicho agente induce la diferenciación de dicha célula madre aislada.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para la generación de una construcción de tejido modificada por ingeniería genética que incluye células endoteliales, dicho método comprendiendo el cultivo de una célula madre aislada como se describió anteriormente en una construcción de tejido modificada por ingeniería genética.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno vascular que comprende la administración a un individuo que requiera del mismo de una célula madre aislada como se describió anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno vascular que comprende la administración a un individuo que requiera del mismo de una célula aislada de la progenie como se describió anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el efecto de diferentes inhibidores en la migración inducida por PMA de una célula madre derivada de células endoteliales de sangre humana en un ensayo de cierre de una herida.

La Figura 2 muestra el efecto de diferentes inhibidores en la migración inducida por EGF de una célula madre derivada de células endoteliales de sangre humana en un ensayo de cierre de una herida.

La Figura 3 muestra la capacidad proliferativa de las células madre y de las células de la progenie de la invención expresada como la producción de biomasa.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona células madre que pueden ser propagadas como células madre y que pueden dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial, métodos de aislamiento y la utilización de tales composiciones de células madre que las contienen, y las células derivadas de las mismas. Las células madre de la invención encuentran utilidad en terapia génica, ingeniería de tejidos, generación de tejidos, reparación de heridas, diagnóstico, como agentes angiogénicos, como agentes vasculogénicos, como agentes para el suministro de genes y de proteína, y como agentes terapéuticos.

En un aspecto, la presente invención proporciona células madre que tienen características que incluyen la habilidad de autorrenovación y diferenciación en células endoteliales y/o de tipo endotelial. En una modalidad, las células madre de la invención tienen un período de duplicación de 18 a 24 horas en un cultivo monocapa y persiste durante períodos más largos que las células endoteliales humanas primarias conocidas en el arte (es decir, las HUVEC). El período de duplicación depende del número de días que han sido incubadas las células madre en el cultivo. Es más corto al comienzo del cultivo. En cultivo, estas células madre se adhieren y migran sobre y/o en sustratos con base en colágeno y son capaces de diferenciarse en células con morfología y/o función típica de células endoteliales.

Las células madre de la presente invención expresan uno o más marcadores asociados con un fenotipo de célula madre endotelial y/o carecen de uno o más marcadores asociados con una célula diferenciada (por ejemplo, una célula que tiene una capacidad reducida para autorrenovación, regeneración, o diferenciación) y/o una célula de origen hematopoyético. Una molécula es un "marcador" de un tipo de célula deseado si se encuentra sobre un porcentaje suficientemente alto de células del tipo deseado de las mismas, y se encuentra sobre un porcentaje suficientemente bajo de células de un tipo no deseado de las mismas, que se puede lograr un nivel deseado de purificación del tipo deseado de células a partir de una población de células que comprende tanto tipos deseados como no deseados de células seleccionando células en la población de células que tiene al marcador. Un marcador puede desplegarse, por ejemplo, sobre 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más del tipo de células deseado, y puede despegarse sobre menos del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% o menos de un tipo de célula no deseado. Los ejemplos de marcadores característicos de una célula madre de la invención incluyen al antígeno P1H12 (también conocido como MUC18 y CD146; Solovey y colaboradores, 2001, J. Lab. Clin. Med. 138: 322-31; anticuerpos que reconocen a los mismos disponibles, por ejemplo, de CRP Inc., Denver, PA, catálogo no. MMS-470R) y AC133 (Bhatia, 2001, Leukemia 15: 1685-88). Los ejemplos de marcadores que carecen típicamente de células madre de la invención incluyen CD3, CD14, CD144, CD202b (también conocidos como Tek y Tie-2; ver Leukocyte Typing VII, Mason y colaboradores (ed. s), Oxford University Press, 2002, páginas 344 - 46), o cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, las células madre de la invención, después de aislamiento, son P1H12^{+} y AC133^{+}. Estas células madre también pueden ser bajas en CD34 o CD34^{-}, CD148^{+}, y/o CD45^{+} al momento del aislamiento. La célula madre de la invención puede carecer también de uno o más de los marcadores fenotípicos CD14^{-}, CD144, CD202b, y/o VEGRF2. Por lo tanto, en otra modalidad, las células madre son P1H12^{+}, CD148^{+}, AC133^{+}, CD34^{+}, CD45^{+}, CD144^{-}, CD202b^{-}, y VEGRF2^{-}.

El término "célula precursora", "célula progenitora", y "célula madre" se utilizan en forma intercambiable en el arte y aquí, y se refiere ya sea a una célula pluripotente, o de linaje no contaminado, a una célula progenitora que es potencialmente capaz de un número ilimitado de divisiones mitóticas ya sea para renovar su línea o para producir células de la progenie que se diferenciarán en células endoteliales o en células de tipo endotelial; o una célula progenitora comprometida con el linaje y su progenie, que es capaz de autorrenovación y es capaz de diferenciación en una célula endotelial. A diferencia de las células madre pluripotentes, las células progenitoras comprometidas con el linaje se considera generalmente que son incapaces de dar lugar a numerosos tipos de células que difieren fenotípicamente entre sí. En vez de eso, ellas dan lugar a una o posiblemente dos tipos de células comprometidas con el linaje.

En un aspecto, la presente invención proporciona células madre aisladas, individualmente o en poblaciones. El término "aisladas" o "purificadas" cuando se refiere a células madre de la invención significa células que están sustancialmente libres de células que transportan marcadores asociados con dedicación de linaje. En modalidades particulares, las células madre están al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% libres de tales tipos de células contaminantes. En otra modalidad, las células madre aisladas también están sustancialmente libres de moléculas solubles de ocurrencia natural. Como se discute en forma más completa más adelante, se puede obtener una célula madre sustancialmente purificada de la invención, por ejemplo, por medio de extracción (por ejemplo, a través de centrifugación por gradiente de densidad y/o citometría de flujo) a partir de una fuente natural tal como una muestra de tejido o de sangre. La pureza se puede medir por medio de cualquier método apropiado. Una célula madre de la presente invención puede ser purificada en un 99%-100%, por ejemplo, por citometría de flujo (por ejemplo, análisis FACS), como se discute más adelante.

En una modalidad, la presente invención proporciona una población enriquecida de células madre. Una "población enriquecida de células madre" es una en donde las células madre de la invención han sido parcialmente separadas de otros tipos de células, de tal manera que la población resultante de células madre tenga una mayor concentración de células madre que la que tenía la población original. La población enriquecida de células madre puede tener una concentración aproximadamente 10 veces, 100 veces, 500 veces, 1.000 veces, 2.000 veces, 3.000 veces, 4.000 veces, 5.000 veces, 6.000 veces, 7.000 veces, 8.000 veces, 9.000 veces, 10.000 veces superior de células madre que la que tenía la población original antes de la separación. Las células madre de la invención pueden, por ejemplo, formar por lo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más de la población enriquecida de células madre. La población enriquecida de células madre se puede obtener, por ejemplo, seleccionando contra células que exhiben marcadores asociados con células diferenciadas, u otros tipos de células indeseadas, y/o seleccionando células que exhiben marcadores asociados con las células madre de la invención, y/o por medio de la regeneración de células madre aisladas en sistemas definidos de cultivo, como se discute más adelante.

En otra modalidad, la presente invención proporciona líneas de células de células madre. Como se la utiliza aquí, una "línea de células" significa un cultivo de células madre de la presente invención, o células de la progenie de las mimas (por ejemplo, células endoteliales y/o de tipo endotelial), que pueden ser reproducidas durante un largo período de tiempo, preferiblemente indefinidamente, y cuyo término incluye, por ejemplo, células que son cultivadas, criopreservadas y cultivadas nuevamente después de la criopreservación. Como se lo utiliza aquí, un "cultivo" significa una población de células madre endoteliales crecidas en un medio y opcionalmente subcultivadas en consecuencia. Un cultivo de células madre puede ser un cultivo primario (por ejemplo, un cultivo que no ha sido subcultivado) o puede ser un cultivo secundario o posterior (por ejemplo, una población de células que ha sido subcultivada o pasada una o más veces).

Como se discutió anteriormente, las células madre de la presente invención se caracterizan por la presencia y/o la ausencia de ciertos marcadores que son específicamente reconocidos por una molécula. En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos de marcación de células madre de la invención. En una modalidad, se marcan las células madre con una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador que está asociado con una célula madre de la invención (por ejemplo, el antígeno P1H12). En otra modalidad, se pone en contacto una población de células con una molécula que se enlaza específicamente a un marcador bajo condiciones que permiten que la célula se enlace con el marcador, en donde la población de células incluye al menos una célula madre que tiene dicho marcador. En otra modalidad, se pone en contacto una población de células con una molécula que se enlaza específicamente con un marcador bajo condiciones que permiten que la molécula se enlace con el marcador, en donde la población de células incluye células madre que no tienen al marcador ni células madre que tengan al marcador. La molécula utilizada puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un ligando, una molécula de fusión Fc-péptido (por ejemplo, como se describe en la solicitud PCT publicada WO 01/83525 A2), u otra molécula. La molécula puede incluir opcionalmente una fracción adicional, por ejemplo, una que sea detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o colorimétrico) o una que ayude en el aislamiento de las células marcadas (por ejemplo, una fracción que sea enlazada por otra molécula o una partícula magnética).

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de células madre de la invención. Las células madre de la invención se pueden aislar, por ejemplo, por medio de la utilización de moléculas (por ejemplo, anticuerpos, derivados de anticuerpo, ligandos o moléculas de fusión Fc-péptido) que se enlazan con un marcador sobre las células madre (por ejemplo, el antígeno P1H12, CD34, CD45, AC133, y CD148) y positivamente selecciona células que enlazan la molécula (es decir, una selección positiva). Otros ejemplos de métodos de selección positiva incluyen a los métodos que promueven preferencialmente el crecimiento de un tipo deseado de célula en una población mezclada de tipos deseados y no deseados de células. Alternativamente, por medio del uso de moléculas que se enlazan a marcadores que no están presentes sobre el tipo deseado de célula, pero que están presentes sobre un tipo no deseado de célula, se pueden remover las células no deseadas que contienen tales marcadores de las células deseadas (es decir, una selección negativa). Otros métodos negativos de selección incluyen preferencialmente matar o inhibir el crecimiento de un tipo no deseado de célula en una población mezclada de tipos deseados y no deseados de células. En consecuencia, por medio del uso de selección negativa, selección positiva, o una combinación de los mismos, se puede lograr una población enriquecida de células madre.

Se pueden aislar las células madre endoteliales de la invención de una muestra obtenida de un individuos mamífero. El individuo puede ser cualquier mamífero (por ejemplo, bovino, ovino, porcino, canino, felino, equino, primate), pero es preferiblemente un humano. Se puede obtener la muestra de células a partir de cualquiera entre una cantidad de fuentes diferentes incluyendo, por ejemplo, médula ósea, tejido fetal (por ejemplo, tejido de hígado fetal), sangre periférica, sangre del cordón umbilical, y similares. Preferiblemente la fuente de células es de sangre periférica debido al uso de técnicas menos invasivas para obtener la muestra celular y de la población donante fácilmente disponible.

Con el propósito de obtener células madre de la invención, es necesario aislar, separar o remover las células madre de la invención de las otras células con las cuales ellas están normalmente presentes. Por ejemplo, cuando la fuente de células es de sangre periférica, se deben separar las células madre o enriquecerlas con otras células (por ejemplo, eritrocitos, plaquetas, monocitos, neutrófilos, macrófagos, y similares).

Se pueden emplear diferentes técnicas para separar las células madre de la invención removiendo inicialmente las células madre de la invención de otros tipos de células a través de las características de expresión del marcador y/o removiendo las células e linaje dedicado de las células madre de la invención en una forma similar. Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) son particularmente útiles para la identificación de marcadores de proteína de la superficie de la célula asociados con linajes particulares de células y/o etapas de diferenciación. Los anticuerpos pueden estar unidos a un soporte sólido (por ejemplo, cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpo). Los ejemplos de anticuerpos comercialmente disponibles que reconocen marcadores que dependen del linaje incluyen anti-AC133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA); anti-CD34 (Becton Dickinson, San José, CA), anti-CD31, anti-CD62E, anti-CD104, anti-CD106, anti-CD1a, anti-CD14 (todos disponibles con Pharmingen, Hamburgo, Alemania); anti-CD144 y anti-CD-13 (Immunotech, Marsella, Francia). El clon P1H12 (Chemicon, Temecula, CA; Catálogo Número MAB16985), produce un anticuerpo que reacciona específicamente con el antígeno P1H12 (también conocido como CD146, MCAM, y MUC18). El anticuerpo P1H12 localiza específicamente a las células endoteliales de todos los vasos incluidos los microvasos de tejido normal y canceroso. El anticuerpo P1H12 no tiñe células hematopoyéticas.

Los procedimientos para separación pueden incluir separación magnética, utilizando cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal, o agentes tales como los utilizados junto con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complemento y citoquinas, y "paneo" con anticuerpo ligado a una matriz sólida (por ejemplo, una placa), u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activados por fluorescencia, que pueden tener diferentes grados de sofisticación, por ejemplo, una pluralidad de canales de color, canales que detectan la dispersión de la luz de ángulo bajo y obtuso, y canales de impedancia. Convenientemente, los anticuerpos se pueden conjugar con marcadores, tales como cuentas magnéticas, que permiten la separación directa, biotina, que puede ser removida con avidina o estreptavidina enlazada a un soporte, fluorocromos, que pueden ser utilizados con un clasificador de células activado por fluorescencia, o similares, para permitir una fácil separación del tipo particular de célula. Se puede emplear cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células madre.

En una modalidad, se utilizan cuentas magnéticas enlazadas a anticuerpos selectivos para marcadores de la superficie de la célula presentes sobre un gran número de células comprometidas con el linaje de los sistemas hematopoyéticos (por ejemplo, células T, células B, (tanto células B como pre-B) y células mielomonocíticas) y/o poblaciones menores de células (por ejemplo, megacariocitos, mastocitos, eosinófilos y basófilos), ya sea antes, o simultáneamente con, o posterior al uso de una selección del antígeno P1H12 para remover las células comprometidas con el linaje u otras células de las células madre de la invención. Aproximadamente al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más de las células hematopoyéticas totales serán removidas; sin embargo, no es esencial remover cada tipo de célula terminalmente diferenciada. Se pueden remover plaquetas y eritrocitos (por ejemplo, por medio de técnicas de gradiente de densidad) antes de clasificación o separación de las células madre de las células restantes no plaquetarias, no eritrocíticas. Cuando se utiliza selección positiva en el protocolo, las células dedicadas que carecen del marcador positivamente seleccionado serán dejadas atrás. Sin embargo, en una modalidad se utiliza tanto selección positiva como negativa, de tal manera que en una etapa final de selección positiva, se minimiza el número de células dedicadas presentes. Alguien capacitado en el arte reconocerá que debido a la falta de capacidad proliferativa de muchos tipos de células en la mayor parte de la sangre periférica, sino en toda, el resto de las células definidas por linaje después del proceso de selección positiva y/o negativa fallará en proliferar y/o en adherirse a un sustrato con base en colágeno y serán removidas durante las técnicas de subcultivo celular. Se pueden lograr de esta manera composiciones que tienen aproximadamente más del 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más, en donde las células madre se identifican por ser P1H12^{+}, CD148^{+}, AC133^{+}, CD34^{+}, CD45^{+}, CD144^{-}, CD202b^{-}, y VEGRF2^{-} y por ser capaces de autorenovarse y dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial completamente diferenciadas.

Se pueden utilizar combinaciones de métodos de enriquecimiento para mejorar el tiempo o la eficiencia de la purificación o el enriquecimiento. Por ejemplo, después de una etapa de enriquecimiento para remover células que tengan marcadores que no sean indicativos del tipo de célula de interés, se pueden separar o enriquecer adicionalmente las células por medio de un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) u otra metodología que tenga alta especificidad. Se pueden emplear análisis multicolor con un FACS. Se pueden separar las células con base en el nivel de coloración para un antígeno particular o la carencia del mismo. Se pueden utilizar fluorocromos para marcar anticuerpos específicos para un antígeno particular. Tales fluorocromos incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína, rojo Tejas, y similares. Aunque se puede separar cada uno de los linajes presentes en una población en una etapa separada, típicamente por medio de un proceso de selección negativa, se prefiere que el tipo de célula de interés sea separada en una etapa en un proceso de selección positiva. Típicamente se recolectan las células en un medio completo (por ejemplo, EGM2, con los suplementos definidos; Clonetics Corporation) + 15% de suero. El suero puede ser xenogénico, autólogo, o alogénico. Se pueden emplear otras técnicas para selección positiva, que permiten una separación precisa, tal como columnas de afinidad, y similares.

Aunque el orden particular de separación no es crítico para esta invención, un orden preferido incluye una separación gruesa (por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad), seguido por una separación fina (por ejemplo, selección positiva de un marcador asociado con células madre (por ejemplo, el antígeno P1H12)). Típicamente la separación por gradiente de densidad es seguida por selección positiva para células P1H12^{+} que son luego cultivadas para obtener más células madre de la invención.

Se puede utilizar cualquiera de los marcadores específicos para el tipo de célula para selección o contra un tipo de célula particular. Los ejemplos de tales marcadores incluyen CD10/19/20 (asociados con células B), CD3/4/8 (asociados con células T), CD14/15/33 (asociados con células mieloides), y Thy-1, que está ausente sobre células T humanas. También, se puede utilizar rodamina 123 para dividir células CD34^{+} en subconjuntos "alto" y "bajo". Ver, Spangrude, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7433 para una descripción del uso de rodamina 123 con células madre de ratón. En una modalidad, las células madre de la invención son en su mayoría P1H12^{+}, CD148^{+}, AC133^{+}, CD144^{-}, CD202b^{-}, VEGRF2^{-}, y son bajas en rodamina.

Una vez que se han aislado las células madre, opcionalmente se pueden propagar en medio completo (por ejemplo, EGM2 que contiene los suplementos comercialmente disponibles de Clonetics Corp., por ejemplo, IGF, EGF, FGF, y VEGF) + 15% de FCS, medio acondicionado de otros tipos de células, tal como células estromales (por ejemplo, células estromales obtenidas de médula ósea, timo fetal o hígado fetal), conteniendo el medio factores de crecimiento asociados con el mantenimiento de células madre, el cocultivo con células estromales, o el medio que contiene factores de mantenimiento que soportan la proliferación de células madre, donde las células estromales pueden ser, por ejemplo, alogénicas o xenogénicas. Antes de utilizarlas en cocultivo, se pueden liberar las preparaciones de células estromales mezcladas de las células hematopoyéticas empleando anticuerpos monoclonales apropiados para la remoción de las células indeseadas, por ejemplo, con conjugados anticuerpo-toxina, anticuerpo y complemento, y similares. Alternativamente, se pueden utilizar líneas clonadas de células estromales donde las líneas estromales pueden ser alogénicas o xenogénicas. Además, las líneas de células de la invención se pueden cultivar en un sistema biorreactor.

En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para establecer y/o mantener poblaciones de células madre, o la progenie de las mismas, así como poblaciones mezcladas que contienen tanto células madre como células de la progenie tipo endoteliales, y las poblaciones de células así producidas. Como con las células madre de la invención, una vez se establece un cultivo de células tipo endoteliales o un cultivo mezclado de células madre y de células tipo endoteliales, se expande mitóticamente la población de células in vitro por medio de subcultivo en un medio fresco como lo dicta la densidad de las células en virtud de las condiciones que favorecen la proliferación celular, con o sin formación endotelial. Tales métodos de cultivo pueden incluir, por ejemplo, el subcultivo de células en medio de cultivo que carece de IGF, EGF, FGF, VEGF, y/o otro factor de crecimiento. Los cultivos que contienen células endoteliales y/o de tipo endotelial y los cultivos que contienen células madre y células endoteliales y/o de tipo endotelial pueden ser transferidos a medio fresco cuando se alcanza suficiente densidad de células. Aunque muchos de los tipos de células de la presente invención no demuestran apoptosis-inhibición típicas por contacto, ellas se vuelven inactivas cuando la densidad es máxima. Por lo tanto, en una modalidad, se evita o se minimiza la formación de una monocapa confluente de células, por ejemplo, por transferencia de una porción de las células a un nuevo recipiente de cultivo con medio fresco. Tal remoción o transferencia se puede hacer en cualquier recipiente de cultivo que tenga una monocapa
celular que exceda una densidad aproximadamente de 1 x 10^{6} células por recipiente T75 para cultivo de tejidos.

Alternativamente, se puede agitar el sistema de cultivo para evitar que las células se peguen.

Una vez se han establecido las células madre de la invención en el cultivo, como se describió anteriormente, se las puede mantener o almacenar en "bancos" de células que contienen ya sea cultivos continuos in vitro de células que requieren de transferencia regular, o, preferiblemente, células que han sido criopreservadas.

La criopreservación de células madre, o de otras células de la invención, se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos conocidos, tal como aquellos descritos en Doyle y colaboradores, (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, se pueden suspender las células en un "medio de congelación" tal como, por ejemplo, un medio de cultivo que contiene además 15-20% de suero fetal bovino (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), con o sin 5-10% de glicerol, con una densidad, por ejemplo, de aproximadamente 4-10 x 10^{6} células/ml. Se dispensan las células en viales de plástico o de vidrio que son sellados luego y transferidos a una cámara de congelación de un congelador pasivo o programable. La velocidad óptima de congelación se puede determinar empíricamente. Por ejemplo, se puede utilizar un programa de congelación que produzca un cambio de temperatura de -1ºC/min a través del calor de fusión. Una vez que los viales que contienen las células han alcanzado -80ºC, se los transfiere a un área de almacenamiento con nitrógeno líquido. Las células criopreservadas se pueden almacenar por períodos de años, aunque deben ser revisadas al menos una vez cada 5 años para verificar su viabilidad.

Las células criopreservadas de la invención constituyen un banco de células, del cual se pueden retirar porciones por descongelación y utilizarlas luego para producir un cultivo de células madre que contiene células madre, células endoteliales y/o de tipo endotelial, o tejido endotelial según se requiera. Generalmente la descongelación se debe realizar rápidamente, por ejemplo, transfiriendo un vial del nitrógeno líquido a un baño de agua a 37ºC. El contenido descongelado de los viales debe ser transferido inmediatamente bajo condiciones estériles a un recipiente de cultivo que contiene un medio apropiado tal como medio completo (por ejemplo, EGM2 que contiene IGF, EGF, FGF, y VEGF) + 15% de FCS. Es recomendable ajustar las células en el medio de cultivo hasta una densidad inicial de aproximadamente 1-3 x 10^{5} células/ml de tal manera que las células pueden acondicionar el medio tan rápido como sea posible, previniendo así una fase prolongada de latencia. Una vez en el cultivo, se pueden examinar diariamente las células, por ejemplo, con un microscopio invertido para detectar proliferación celular, y subcultivarlas tan pronto como ellas alcancen una densidad apropiada.

Se pueden retirar las células madre de la invención de un banco de células según se requiera, y utilizarlas para la producción de nuevas células madre, células endoteliales y/o de tipo endotelial y/o tejido endotelial ya sea in vitro, por ejemplo, como un cultivo endotelial tridimensional, como se describe más adelante, o in vivo, por ejemplo, por medio de administración directa de células al sitio donde se requieran células endoteliales nuevas o tejido. Como se describe aquí, se pueden utilizar las células madre de la invención para producir nuevo tejido endotelial para uso en un individuo donde las células fueron originalmente aisladas de la propia sangre del individuo o de otro tejido (es decir, células autólogas). Alternativamente, se pueden utilizar las células de la invención como células donantes ubicuas para producir nuevo tejido endotelial para uso en cualquier individuo (es decir, células heterólogas).

Una vez estabilizado, se puede utilizar un cultivo de células madre para producir células de la progenie tipo endoteliales y/o células endoteliales capaces de producir nuevo tejido endotelial. La diferenciación de células madre en células endoteliales o en células de tipo endotelial, seguida por la producción de tejido endotelial a partir de ellas, se puede activar por medio de factores de crecimiento exógenos específicos o cambiando las condiciones de cultivo (por ejemplo, la densidad) de un cultivo de células madre. Ya que las células son originales, pueden ser utilizadas para reconstituir un individuo irradiado y/o un individuo tratado con quimioterapia; o como fuente de células para linajes específicos, suministradas para su maduración, proliferación y diferenciación en uno o más linajes deseados. Los ejemplos de factores que pueden ser utilizados para inducir diferenciación incluyen eritropoyetina, factores de estimulación de colonias, por ejemplo, GM-CSF, G-CSF, o M-CSF, interleuquinas, por ejemplo, IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, y similares, Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF), Factor de Acero (Stl), o similares, cocultivo con Miocitos cardiacos, u otros tipos de células comprometidos con el linaje para inducir las células madre en transformación comprometidas con un linaje particular.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para el cultivo de células madre para dar lugar a células de la progenie, y a las células así producidas. En una modalidad, la célula de la progenie es P1H12^{+}, CD144^{+}, AC133^{-}, CD202b^{+}, CD45^{-}, VEGFR2^{+}, tiene una alta capacidad proliferativa comparada con las HUVEC y las MVEC, y contiene Cuerpos de Weibel-Palade.

En otra modalidad, las células madre son modificadas genéticamente para expresar genes para tipos específicos de factores de crecimiento tales como, por ejemplo, TGF-\beta, b-FGF, VEGF, FGF-18, y similares para diferenciación exitosa y/o mejorada a células endoteliales y/o rotación de la producción endotelial ya sea pre o post-implantación. Otros factores o genes que pueden ser inducidos en o transferidos dentro de células madre o progenie de células madre de la invención para beneficio terapéutico incluyen, por ejemplo, IL17R, TNFR, angiopoyetina-1 y -2, TWEAK, TWEAKR, así como otros antiinflamatorios o factores angiogénicos conocidos en el arte.

Se cree que el número de células endoteliales (EC) nativas y/o la viabilidad disminuye con el tiempo. Por lo tanto, en ciertas poblaciones de pacientes, por ejemplo, de personas mayores, la población residente de las EC que son competentes para responder a citoquinas angiogénicas puede ser limitada. Por lo tanto, las células madre de la invención pueden proporcionar la población deseada de células que resulta en mayor actividad angiogénica y de reparación de tejidos.

Se pueden utilizar las células de la invención para tratar individuos que requieran de la reparación o del reemplazo de tejido endotelial resultante de enfermedad o trauma, o para proporcionar una función cosmética, tal como crecimiento facial u otras características del cuerpo. El tratamiento puede implicar el uso de las células de la invención para producir nuevo tejido endotelial, y el uso de tejido endotelial así producido, de acuerdo con cualquiera de los métodos actualmente conocidos en el arte o que serán desarrollados en el futuro. Por ejemplo, las células de la invención pueden ser implantadas, inyectadas o bien administradas directamente en el sitio del tejido dañado de tal manera que ellas producirán nuevo tejido endotelial in vivo. En una modalidad, la administración incluye la administración de células madre endoteliales genéticamente modificadas.

En una modalidad, se prepara una formulación que contiene las células de la invención para inyectar directamente en el sitio donde se desea la producción de nuevo tejido endotelial. Por ejemplo, y no como una limitación, se pueden suspender las células de la invención en una solución de hidrogel para inyección. Alternativamente, se puede permitir que se endurezca la solución de hidrogel que contiene las células, por ejemplo en un molde (por ejemplo, una construcción de tejido tubular o vascular), para formar una matriz que tiene células dispersadas allí antes de la implantación. Una vez se ha endurecido la matriz, se pueden cultivar las formaciones de células de tal manera que las células se expanden mitóticamente antes de la implantación. Un hidrogel es un polímero orgánico (natural o sintético) que se entrelaza a través de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura reticular abierta tridimensional, que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que pueden ser utilizados para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato y sales del mismo, polifosfazinas, y poliacrilatos, que se entrelazan iónicamente, o polímeros en bloque tales como PLURONICS^{TM} o TETRONICS^{TM} (BASF Corp., Mount Olive, NY), copolímeros en bloque de óxido de polietileno-polipropilén glicol que se entrelazan por temperatura o pH, respectivamente. Los métodos de síntesis de los materiales de hidrogel, así como los métodos para preparar tales hidrogeles, son conocidos en el arte.

Tales formulaciones celulares pueden incluir adicionalmente uno o más e otros componentes, incluidos componentes seleccionados de la matriz extracelular, tales como uno o más tipos de colágeno conocidos en el arte, y/o factores de crecimiento y fármacos. Los factores de crecimiento que pueden ser incorporados en forma útil en la formulación celular incluyen uno o más factores de crecimiento tisular conocidos en el arte o que sean identificados en el futuro, tales como, pero sin limitarse a, cualquier miembro de la familia de TGF-\beta, IGF-I y -II, hormona de crecimiento, BMP tales como BMP-13, y similares. Alternativamente, las células de la invención pueden ser modificadas genéticamente para expresar y producir factores de crecimiento tales como BMP-13 o TGF-\beta. Más adelante se suministran los detalles sobre la modificación genética de las células de la invención. Los fármacos que pueden ser incorporados en forma útil en la formulación celular incluyen, por ejemplo, compuestos antiinflamatorios, así como anestésicos locales. Se pueden incluir también otros componentes en la formulación como por ejemplo, amortiguadores para suministrar un pH apropiado e isotonicidad, lubricantes, materiales viscosos para retener las células en o cerca del sitio de administración, (por ejemplo, alginatos, agares y gomas vegetales) y otros tipos de células que pueden producir un efecto deseado en el sitio de administración (por ejemplo, mejoramiento o modificación de la formación de tejido endotelial o sus características fisicoquímicas, soporte para la viabilidad de las células, o inhibición de la inflamación o rechazo). Las células pueden estar cubiertas por un recubrimiento apropiado para heridas para evitar que las células se salgan del sitio. Tales recubrimientos para heridas son conocidos por aquellos capacitados en el arte.

Alternativamente, las células madre de la invención pueden ser sembradas sobre una estructura o andamiaje tridimensional y cultivadas para permitir que las células crezcan y llenen la matriz o sean implantadas inmediatamente in vivo, donde las células sembradas proliferarán sobre la superficie de la estructura y forman un tejido endotelial de reemplazo in vivo en cooperación con las células del individuo. Tal estructura puede ser implantada en combinación con uno o más factores de crecimiento, fármacos, tipos adicionales de células, u otros componentes descritos anteriormente que estimulan la formación endotelial o bien refuerzan o mejoran la práctica de la
invención.

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Se pueden utilizar las células de la invención para producir nuevo tejido endotelial in vitro, que luego puede ser implantado, trasplantado o bien insertado en un sitio que requiere de reparación, reemplazo o aumento del tejido endotelial en un individuo. En una modalidad no limitante, las células madre de la invención son utilizadas para producir una construcción tridimensional de tejido in vitro, que es luego implantada in vivo. Como un ejemplo de la producción de construcciones tridimensionales de tejido, ver la Patente Estadounidense No. 4.963.489, publicada el 16 de octubre de 1990, de Naughton y colaboradores, que se incorpora aquí como referencia. Por ejemplo, se pueden inocular las células madre endoteliales o células madre endoteliales y células endoteliales y/o de tipo endotelial de la invención o "sembrarlas" sobre una estructura o andamio tridimensional, y hacer que proliferen o crezcan in vitro para formar un tejido endotelial vivo que puede ser implantado in vivo.

La estructura tridimensional puede ser de cualquier material y/o forma que permita que las células se unan a ella (o puede ser modificada para permitir que las células se unan a ella) y permitir que las células crezcan en más de una capa. Se puede utilizar una variedad de materiales diferentes para formar la matriz, incluyendo, pero sin limitarse a: nylon (poliamidas), dacrón (poliésteres), poliestireno, polipropileno, poliacrilatos, compuestos de polivinilo (por ejemplo, cloruro de polivinilo), policarbonato (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE, teflón), Thermanox (TPX), nitrocelulosa, algodón, ácido poligicólico (PGA), colágeno (en la forma de esponjas, trenzas, o hilos tejidos, y similares), suturas de tripa de gato, celulosa, gelatina, u otros materiales biodegradables de ocurrencia natural o materiales sintéticos, incluyendo, por ejemplo, una variedad de polihidroxialcanoatos. Cualquiera de estos materiales puede ser tejido en una malla, por ejemplo, para formar la estructura o andamiaje tridimensional. Los poros o espacios en la matriz los puede ajustar una persona capacitada en el arte para permitir o para evitar la migración de células dentro o a través del material de la matriz.

La estructura tridimensional, matriz, hidrogel, y similares, pueden ser moldeados en una forma adecuada para el tejido que va a ser reemplazado o reparado. Por ejemplo, donde se desee un injerto vascular, se puede moldear la estructura tridimensional en la forma de una estructura tubular y sembrarla con células madre endoteliales de la invención solas o en combinación con células estromales (por ejemplo, fibroblastos) y cultivarlas en consecuencia. Por ejemplo, además de las células de la invención, se pueden añadir otras células a la estructura tridimensional para mejorar el crecimiento o alterarlo, de una o más características del nuevo tejido endotelial formado sobre él. Tales células pueden incluir, pero no se limitan a, fibroblastos, pericitos, macrófagos, monocitos, células plasmáticas, mastocitos, y adipocitos, entre otros.

En aún otra modalidad, se pueden utilizar las células madre de la invención junto con un sistema de cultivo tridimensional en un "biorreactor" para producir construcciones de tejido endotelial que poseen propiedades bioquímicas, físicas y estructurales críticas de tejido endotelial humano nativo cultivando las células y el tejido resultante bajo condiciones ambientales que son típicamente experimentadas por tejido endotelial nativo. De este modo, se puede mantener el sistema tridimensional de cultivo bajo presurización intermitente y periódica y las células de la invención provistas de un suministro adecuado de nutrientes por convección. Es importante mantener un suministro adecuado de nutrientes para las células de la invención a través de una construcción de remplazo de tejido endotelial de aproximadamente 2 - 5 mm de espesor a medida que se incrementa la densidad aparente de la construcción. La presión facilita el flujo de fluido a través de la construcción tridimensional endotelial, mejorando así el suministro de nutrientes y la remoción de desechos de las células embebidas en la construcción. El biorreactor puede incluir una cantidad de diseños. Típicamente, las condiciones de cultivo incluirán la colocación de un estrés fisiológico sobre la construcción que contiene células similares a aquellas que se encontrarán in vivo. Por ejemplo, se puede cultivar la construcción vascular bajo condiciones que estimulen las presiones y las fuerzas de corte de los vasos sanguíneos (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6.121.042, que se incorpora aquí como referencia).

Las células madre, su progenie, y el tejido endotelial de la presente invención se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones. Estas incluyen, pero no se limitan a, trasplantes o implantes de las células ya sea en forma suelta o unida, por ejemplo, a una estructura tridimensional, como se describe aquí. Además, se puede administrar una inyección de matriz extracelular preparada a partir del nuevo tejido endotelial producido por las células de la invención a un individuo o se la puede utilizar para otros cultivos celulares. Tales células, tejidos, y la matriz extracelular pueden servir para reparar, reemplazar o aumentar el tejido endotelial que ha sido dañado debido a una enfermedad o traumatismo, o que falló en su desarrollo normal, o para propósitos cosméticos.

El tejido endotelial producido de acuerdo con la invención puede ser utilizado para reparar o reemplazar tejido endotelial dañado o destruido, para aumentar tejido endotelial existente, para introducir tejido nuevo o alterado, para modificar prótesis artificiales, o para unir tejidos biológicos o estructuras. Por ejemplo, y no a manera de limitación, modalidades específicas de la invención incluirían una válvula cardiaca de reemplazo preparada con las células madre endoteliales de la invención o su progenie y tejido vascular o injerto. En otra modalidad, se administran las células de la invención en combinación con factores angiogénicos para inducir o promover la formación de nuevos vasos o capilares en un individuo. Se pueden administrar las células de la invención antes de, o al mismo tiempo con, o después de una inyección del factor angiogénico. Además, se pueden administrar las células de la invención inmediatamente junto a, en el mismo sitio, o en una posición remota del sitio de administración del factor angiogénico. Por factor angiogénico se entiende un factor de crecimiento, proteína o agente que promueva o induzca angiogénesis en un individuo.

Además, se pueden utilizar las células o el tejido endotelial de la invención, por ejemplo, para seleccionar in vitro la eficacia y/o la citotoxicidad de compuestos, alérgenos, factores reguladores/de crecimiento, compuestos farmacéuticos, y similares, sobre células madre endoteliales, para elucidar el mecanismo de ciertas enfermedades determinado los cambios en la actividad biológica de las células madre endoteliales (por ejemplo, capacidad proliferativa, adhesión), para estudiar el mecanismo por medio del cual operan los fármacos y/o los factores de crecimiento para modular la actividad biológica de las células madre endoteliales, para diagnosticar y monitorear cáncer en un paciente, para terapia génica, suministro de genes o suministro de proteína; y para producir productos biológicamente
activos.

También se pueden utilizar células madre endoteliales en el aislamiento y evaluación de factores asociados con la diferenciación y maduración de células madre endoteliales. De este modo, se pueden utilizar células madre en ensayos para determinar la actividad del medio, tal como un medio acondicionado, evaluación de fluidos para la actividad de crecimiento celular, participación con dedicación de linajes particulares, o similares. Se pueden aplicar diferentes sistemas y se los puede diseñar para diferenciación inducida de las células madre con base en diferentes estreses fisiológicos. Por ejemplo, un sistema biorreactor que puede ser empleado con las células de la presente invención incluye biorreactores que estimulan tejido vascular.

Las células madre endoteliales, la progenie de las mismas (por ejemplo, células endoteliales diferenciadas y/o de tipo endotelial), y tejidos endoteliales derivados de las mismas de la invención pueden ser utilizados in vitro para seleccionar una gran variedad de agentes por la efectividad y citotoxicidad de agentes farmacéuticos, factores reguladores/de crecimiento, agentes antiinflamatorios, y similares. Con este fin, se pueden mantener las células o los cultivos de tejido de la invención in vitro y exponerlos al agente que va ha ser analizado. Se puede medir la actividad de un agente citotóxico por su habilidad para dañar o matar células madre endoteliales o su progenie en cultivo. Esto se puede evaluar fácilmente por medio de técnicas de coloración. Se puede evaluar el efecto de los factores reguladores/de crecimiento analizando el número de células vivas in vitro, por ejemplo, por medio del recuento total de las células, y del recuento diferencial de las células. Esto se puede lograr utilizando técnicas citológicas y/o histológicas estándar, incluido el uso de técnicas inmunocitoquímicas empleando anticuerpos que definen antígenos celulares de tipo específico. Se puede evaluar el efecto de diferentes fármacos sobre las células de la invención ya sea en un cultivo en suspensión o en un sistema tridimensional.

Las células madre endoteliales, su progenie, y los tejidos endoteliales derivados de ellas de la presente invención pueden producir un vehículo introducir genes y productos génicos in vivo para ayudar o mejorar los resultados del implante y/o para uso en terapias génicas.

Las células madre endoteliales que expresan un producto génico de interés, o tejido endotelial producido in vitro a partir de ellas, pueden ser implantadas en un individuo que es por lo demás deficiente en ese producto génico. Por ejemplo, los genes que expresan productos capaces de prevenir o aminorar los síntomas de diferentes tipos de enfermedades o trastornos vasculares, o que previenen o promueven trastornos inflamatorios, son de particular interés. En una modalidad, se modifican genéticamente las células de la invención para expresar un producto génico antiinflamatorio que serviría para reducir el riesgo de fracaso de la implantación o un cambio degenerativo adicional en el tejido endotelial debido a una reacción inflamatoria. Por ejemplo, se puede modificar genéticamente una célula madre endotelial de la invención para que exprese uno o más productos génicos antiinflamatorios incluyendo, por ejemplo, péptidos o polipéptidos correspondientes al idiotipo de los anticuerpos que neutralizan al factor de estimulación de colonias macrófagas (GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2, u otras citoquinas inflamatorias. IL-1 ha demostrado que disminuye la síntesis de proteoglicanos y colágenos de tipo II, IX, y XI (Tyler y colaboradores, 1995, Biochem. J. 227: 69-878; Tyler y colaboradores, 1988, Coll. Relat. Res. 82: 393-405; Goldring y colaboradores, 1988, J. Clin. Invest. 82: 2026-2037; y Lefebvre y colaboradores, 1990, Biophys. Acta. 1052: 366-72). TNF también inhibe la síntesis de proteoglicanos y colágeno de tipo II, aunque es mucho menos potente que IL-1 (Yaron, I., y colaboradores, 1989, Arthritis Rheum. 32: 173-80; Ikebe, T., y colaboradores, 1988, J. Immunol. 140: 827-31; y Saklatvala, J., 1986, Nature 322: 547-49). También, por ejemplo, se pueden modificar genéticamente las células de la invención para que expresen al gen que codifica la proteína humana reguladora del complemento que previene el rechazo de un injerto por parte del huésped. Ver, por ejemplo, McCurry y colaboradores, 1995, Nature Medicine 1: 423-27. En otra modalidad, se pueden modificar genéticamente las células madre endoteliales para incluir un gen o una secuencia de polinucleótidos que expresan o causan que se exprese un factor angiogénico.

Las células madre genéticamente alteradas son útiles para producir tanto proteínas recombinantes terapéuticas como no terapéuticas in vivo e in vitro. Se aíslan las células madre endoteliales de un donante (humano o no humano) como se describió anteriormente, transfectadas o transformadas con un polinucleótido recombinante in vitro o ex vivo, y se trasplantan en el receptor o se cultivan in vitro. Las células madre endoteliales genéticamente alteradas o la progenie producen la proteína recombinante deseada in vivo o in vitro. La proteína o la molécula producidas pueden causar un efecto terapéutico directo o indirecto o producir una proteína o molécula para diagnóstico.

Alternativamente, las células madre endoteliales o la progenie de la invención pueden ser genéticamente modificadas para expresar y producir factores de crecimiento tales como VEGF, FGF, EGF, IGF, así como agentes terapéuticos tales como TWEAK, TWEAKR, TNFR, otros agentes antiinflamatorios o agentes angiogénicos. Por ejemplo, el gen o la secuencia codificadora para tales factores de crecimiento o agentes terapéuticos estarían colocados en asociación operativa con un promotor regulado de tal manera que pueda ser controlada la producción del factor de crecimiento o agente en el cultivo. Las células de la invención pueden ser modificadas genéticamente para producir otros productos recombinantes benéficos para el trasplante tales como factores antiinflamatorios, por ejemplo, anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-2, y similares. Alternativamente, se pueden modificar genéticamente las células para "desactivar" la expresión de productos génicos nativos que promueven inflamación, por ejemplo, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, o "desactivación" de la expresión de MHC con el propósito de disminuir el riesgo de rechazo. Además, se pueden modificar genéticamente las células para uso en terapia génica para ajustar el nivel de actividad génica en un individuo para ayudar o mejorar los resultados del trasplante endotelial. Se pueden escoger las células modificadas genéticamente para seleccionar aquellas líneas de células que producen la mejoría de los síntomas de la enfermedad reumatoide o reacciones inflamatorias in vivo, y/o evitar la vigilancia inmunológica y el rechazo.

Se utilizan técnicas convencionales de ADN recombinante para introducir al polinucleótido deseado en las células madre o su progenie. El método preciso utilizado para introducir un polinucleótido (por ejemplo, un gen de reemplazo) no es crítico para la invención. Por ejemplo, los métodos físicos para la introducción de polinucleótidos en las células incluyen microinyección y electroporación. Los métodos químicos tales como la coprecipitación con fosfato de calcio y la incorporación de polinucleótidos en liposomas son también métodos estándar para la introducción de polinucleótidos en células de mamífero. Por ejemplo, se puede introducir ADN o ARN utilizando vectores estándar, tal como aquellos derivados de retrovirus de múrido y aviar (ver, por ejemplo, Gluzman y colaboradores, 1988, Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.). Los métodos estándar de biología molecular recombinante son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York), y se han desarrollado y utilizado exitosamente clínicamente vectores virales para terapia génica (Rosenberg, y colaboradores, 1990, N. Engl. J. Med, 323: 370). Otros métodos, tales como el consumo de polinucleótidos despojados a partir de una matriz recubierta con ADN son también abarcados por la invención (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5. 962.427, que se incorpora aquí como referencia). Los ejemplos de proteínas, polinucleótidos o moléculas que pueden ser producidos por medio de células madre recombinantes de la invención incluyen GMCSF, IGF, EGF, VEGF, FGF, y similares.

En una modalidad adicional, se pueden cultivar células madre endoteliales de la invención in vitro para producir productos biológicos con alto rendimiento. Por ejemplo, tales células que o bien producen en forma natural un producto biológico particular de interés (por ejemplo, un factor de crecimiento, un factor regulador, o una hormona peptídica y similares), o han sido genéticamente modificadas para producir un producto biológico, se podrían expandir por clonación. Si las células secretan el producto biológico en el medio nutriente, se puede aislar fácilmente el producto del medio agotado o del medio acondicionado utilizando técnicas estándar de separación, por ejemplo, tal como precipitación diferencial de proteína, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración por gel, electroforesis, y HPLC, por mencionar solo unas pocas. Alternativamente, un producto biológico de interés puede permanecer dentro de la célula y, por lo tanto, su recolección puede requerir lisar las células. Puede purificarse entonces el producto biológico utilizando una cualquiera o más de las técnicas enlistadas anteriormente.

Los usos terapéuticos de las células madre de la invención incluyen el trasplante de las células madre, poblaciones de células madre, o progenie de las mismas en individuos para tratar una variedad de estados patológicos incluyendo enfermedades y trastornos resultantes de daño del miocardio, trastornos o enfermedades circulatorias o vasculares, así como regeneración y reparación de tejido. Se introducen células madre o poblaciones de células madre (incluidas células madre genéticamente alteradas) en un individuo que requiera de tales células madre o que requiera de la proteína o molécula codificada o producida por la célula genéticamente alterada. Por ejemplo, en una modalidad, se pueden administrar las células madre a pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia que ha matado, reducido, o dañado células madre endoteliales, células endoteliales, o el endotelio de un individuo.

Si las células madre se derivan de una fuente heteróloga comparada con el individuo receptor, se administra típicamente en forma concomitante una terapia de inmunosupresión, por ejemplo, la administración del agente inmunosupresor ciclosporina o FK506. Sin embargo, debido al estado inmaduro de las células madre de la invención, puede que no se requiera de tal terapia inmunosupresora. Por lo tanto, en una modalidad, se pueden administrar las células madre de la invención a un receptor en ausencia de una terapia inmunomoduladora (por ejemplo, inmunosupresora). Alternativamente, se pueden encapsular las células en una membrana, que permite el intercambio de fluidos pero evita el contacto célula/célula. El trasplante de células microencapsuladas es conocido en el arte, por ejemplo, Balladur y colaboradores, 1995, Surgery 117: 189-94, 1995; y Dixit y colaboradores, 1992, Cell Transplantation 1:
275-79.

Se pueden introducir directamente las células en la sangre periférica o depositarlas en otros sitios en todo el organismo, por ejemplo, el bazo, el páncreas o sobre cuantas microportadoras en el peritoneo. Por ejemplo, se pueden trasplantar 10^{2} a 10^{9} células en un solo procedimiento, y se pueden llevar a cabo trasplantes adicionales según se requiera.

Se puede inducir diferenciación de las células madre ex vivo, o se pueden inducir alternativamente por contacto con tejido in vivo, (por ejemplo, por contacto con células endoteliales o componentes de la matriz celular). Opcionalmente, se puede administrar conjuntamente o administrar posteriormente un agente de diferenciación al individuo para promover la diferenciación de las células madre.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado comúnmente entendido por alguien ordinariamente capacitado en el arte al cual pertenece esta invención. Todos los títulos y subtítulos presentados aquí son únicamente para facilitar la lectura y no deben entenderse como limitantes de la invención. Los términos "un", "uno", "una" y "el", "la" como se los utiliza aquí pretenden abarcar el plural, a menos que el contexto claramente establezca la forma singular. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o análisis de la invención, se describen a continuación los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas aquí son incorporadas como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretende constituirse en limitantes. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar modalidades particulares y no limitar el alcance de
la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de Células Madre Endoteliales

Se fraccionó un volumen de 200 cc de sangre humana heparinizada con heparina sódica por medio de centrifugación sobre FICOLL^{TM} (American Biosciences, Piscataway, NJ) que tiene una gravedad específica de 1,077 para aislar PBMC. Las PBMC aisladas presentes en el "recubrimiento amortiguado" fueron resuspendidas aproximadamente, y no más de, 100 x 10^{6} células/ml en medio completo (EGM2 que contiene IGF, FGF, EGF, y VEGF + 15% de FCS; Cambrex Bioscience, Inc., Baltimore, MD). Se añadieron 10 \mug/ml de anticuerpos anti-P1H12 de ratón (Chemicon MAB16985) a las células y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente.

Se lavaron las células dos veces en medio completo o en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se las resuspendió aproximadamente en, pero no más de, 100 x 10^{6} células en 1 ml de PBS. Se añadieron 20 \mul de limaduras magnéticas anti-muIgG-MACS (cat. No. 130-047-101, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) a 20 \mul que contienen aproximadamente 10 x 10^{6} células para marcar con anticuerpo las células, y se incubaron las células a 4ºC durante 15 minutos. Se lavaron las células marcadas con anticuerpo una vez en PBS + 3% de albúmina de suero bovino (BSA), y se resuspendió en un volumen final de 5 ml de PBS + 3% de BSA.

Se corrieron luego las células marcadas con anticuerpo sobre una columna preparada MACS LS sobre un imán VARIOMAC^{TM} (Miltenyi Biotec). Se recolectó y descartó la fracción de flujo continuo, y se lavó la columna tres veces con PBS + 3% de BSA. Se removieron las células marcadas de la columna lavándola en ausencia del campo magnético. Se lavó la fracción eluida y se hizo recuento.

Se cultivaron las células de la fracción positiva aproximadamente a, pro típicamente no más de, 1-5 x 10^{6} células por pozo de una placa de colágeno IV de 6 pozos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) en medio completo. Después de 48 horas, se removieron las células no adheridas. El medio se agotó parcialmente dos veces por semana.

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Ejemplo 2 Caracterización de Células Madre Endoteliales

Se caracterizaron las células por medio de FACS en aislamiento y en diferentes momentos como se indica en las Tablas que vienen a continuación.

En aislamiento, las células parecen expresar niveles relativamente altos de antígeno P1H12, CD148, y AC133. Las células fueron negativas para CD202b y CD144. En algunos aislados una subpoblación de células CD45^{+} también expresó CD34^{+}. La cantidad de estas células doblemente positivas CD45^{+}/CD34^{+} expresadas como un porcentaje de las células totales varió y en algunos casos fue del 100%. La Tabla 1 muestra los marcadores medidos presentes sobre las células al momento del aislamiento. Se utilizó IgG1 de ratón como control para citometría de flujo; los datos del control están presentes en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Análisis por Citometría de Flujo y Fenotipo de las Células después de Enriquecimiento por Células P1H12+

1

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Durante el cultivo, cambió la apariencia de las células madre endoteliales y cambiaron los marcadores presentes sobre las células como se muestra en la Tabla 2.

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TABLA 2 Resumen de los marcadores de Superficie para un Donante Único durante el tiempo

2

TABLA 2 (continuación)

3

Ejemplo 3 Migración en un Plano de células endoteliales derivadas de células madre de sangre periférica humana en respuesta a estímulos y el efecto de inhibidores de migración

Se utilizó un ensayo de migración de células endoteliales en un plano (cierre de una herida) para cuantificar la migración de células endoteliales derivadas de sangre periférica en respuesta a PMA, EGF y otros estímulos de migración. En este ensayo, se mide la migración de células endoteliales como la velocidad de cierre de una herida circular en una monocapa de células cultivadas. La velocidad de cierre de una herida es lineal células endoteliales microvasculares renales y de piel, y está dinámicamente regulada por agentes que estimulan e inhiben la angiogénesis in vivo. Tanto las células endoteliales microvasculares renales como las células microvasculares dérmicas migran en respuesta a PMA y EGF y su migración puede ser regulada por medio de la adición de agentes angiogénicos al cultivo de migración (Wiley y colaboradores, 2001, Immunity 15: 837-46). Se aislaron las células madre de sangre humana periférica como se describe aquí y se aisló su progenie de células endoteliales derivadas de sangre periférica humana, hPBEC, se cultivaron, y utilizaron entre el subcultivo 6-11 como se describe aquí. Se replicaron exactamente lesiones circulares, "heridas" (600-800 micrones de diámetro) en monocapas famélicas confluentes de hPBEC en suero durante la noche (DMEM + 0,5% de FBS) a razón aproximadamente de 80.000 células/pozo utilizando una prensa de perforación con punta de silicio. Al momento de provocar la herida se suplementó el medio (DMEM + 0,1% de FBS) con 5 ng/ml de PMA (forbol-12-miristato-13-acetato), 40 ng/ml de EGF o combinaciones de 5 ng/ml de PMA o EGF e inhibidores de migración. Se midió el área residual de la herida en función del tiempo (0-14 horas) utilizando un microscopio y un software para análisis de imágenes (Bioquant; Nashville, TN). Se calculó la velocidad relativa de migración para cada agente y una combinación de agentes por medio de regresión lineal del área residual de la herida graficada contra el tiempo. En la Figura 1-2 se muestran los resultados. Las hPBEC migraron bien en respuesta a PMA (>= 50%) (Fig. 1) y más lentamente en respuesta a EGF (>= 35%) (Fig. 2). La adición de los agentes anti-angiogénicos huTek\DeltaFc (WO 00/75323), TweakR.Fc (WO 01/45730), nectina-3\alpha-Fc (B7L4.Fc) (WO 02/28902), y anticuerpo monoclonal CD148 en las concentraciones indicadas inhibió la migración de hPBEC inducida por PMA en un 40%, 40%, 79% y 100%, respectivamente, comparado con la proteína de control huIgG (Fig. 1). La adición de los agentes anti-angiogénicos huTek\DeltaFc, TweakR.Fc, nectina-3\alpha-Fc (B7L4.Fc), y anticuerpo monoclonal anti-CD148 en las concentraciones indicadas inhibió la migración de hPBEC inducida por EGF en un 50%, 100%, 95% y 100%, respectivamente, comparado con la proteína de control huIgG (Fig. 2).

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Ejemplo 4 Ensayo de Migración en Barrera

Se cultivaron durante la noche células madre endoteliales (18 horas) en medio (por ejemplo, medio EGM-2, Clonetics, Walkersville, MD) y en presencia o en ausencia de PMA (50 ng/ml), y luego se lavaron las células y se las marcó en PBS que contenía colorante calceína 4 \muM durante 2 horas. Después de marcar las células con calceína, fueron excitadas para fluorescer por excitación a 488 nm. Se lavaron las células en PBS, se resuspendieron en medio basal (EBM +/- 0,1% de FBS), y se colocaron en cultivo en insertos de bloques de flúor con tamaño de poro de 3 micras para placas de 24 pozos. Se cultivaron cincuenta mil células madre incluida la progenie de células endoteliales diferenciadas en 300 microlitros de medio basal en el inserto del bloque de fluorescencia y se colocaron los insertos que contenían las células en placas de cultivo estériles de 24 pozos que contenían 1 ml de medio con citoquinas y/o suero que tiene el potencial de provocar migración o movimiento (haptotaxis) de las células de la invención a través del filtro opaco de 3 micras del inserto en la placa de 24 pozos. Se detectó la migración de células a través del filtro midiendo el nivel de emisión de fluorescencia observado a 530 nm en el fondo del pozo utilizando un contador de multimarcación. Los resultados de la migración fueron similares a los resultados del ensayo de migración en un plano del Ejemplo 3 anterior.

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Ejemplo 5 Ensayo de Tubo Capilar/Formación de Cuerda

Se descongeló durante la noche una matriz de MATRIGEL^{TM} (Becton Dickinson, Bedford, MA), una preparación base solubilizada en membrana extraída de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a 4ºC sobre hielo. Se enfriaron también durante la noche una placa de 24 pozos (BD Labware, Franklin Lakes, NJ) y puntas de pipeta de 1000 \mul a 4ºC. El día del ensayo, se recubrieron en forma igual los pozos de la placa con 300 \mul de MATRIGEL^{TM} por pozo, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Se permitió que las placas recubiertas se incubaran a 37ºC durante 30 minutos para permitir que se polimerizara la matriz.

Se tripsinizaron las células madre endoteliales y/o las células endoteliales derivadas de las células madre, se las lavó en medio completo fresco (como se describe en el Ejemplo 1), y se hizo el recuento. Se sembraron en placa treinta mil células por pozo en 100 \mul de medio de crecimiento y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron 500 microlitros de medio de crecimiento fresco.

Se observaron las células 4 y 5 horas después de la siembra en placa. Se utilizaron células de control tratadas en forma idéntica excepto porque se sembraron en MATRIGEL^{TM} para comparación. A las 4 horas, las células de control mostraron adherencia general dispersa característica de las células que crecieron sobre plástico para cultivo de tejidos. Las células que crecieron sobre MATRIGEL^{TM} durante 4 horas formaron múltiples focos con células que conectan los focos dando la apariencia de cuerdas lumenales. La aparición de abundantes estructuras lumenales fue clara por medio de observación durante 24 horas del cultivo.

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Ejemplo 6 Localización In Vivo de Células Madre Administradas y la Progenie de las Células Madre

Este ejemplo demuestra que las células aisladas por medio del método descrito aquí migran in vivo hasta áreas que tienen actividad angiogénica y/o vasculogénica.

Se marcaron in vitro las células endoteliales derivadas de sangre periférica humana del donante 1017 (hPBEC; expandidas a partir de células progenitoras endoteliales derivadas de sangre como se describe en el Ejemplo 3) con una micra de cuentas fluorescentes amarillo verdosas (emisión a 515 nM; Molecular Probes, Eugene, OR). Se logró la marcación de las células por incubación de hPBEC del donante 1017 (5 x 10^{6} cuentas por 1 x 10^{6} células) durante 18 horas. Se removieron las células adheridas que habían incorporado cuentas con tripsinización breve y lavando una vez en PBS, para remover las cuentas no incorporadas, y se las sembró nuevamente en placa en medio de cultivo EC (como se describe en el Ejemplo 1) y se permitió que se unieran nuevamente. Se confirmó la marcación de las células por medio de un microscopio de luz invertido e inmunofluorescencia. El día de la inyección (ver más adelante) se removieron las hPBEC marcadas del donante 1017 por medio de tripsinización breve y se resuspendieron en PBS para inyección intradérmica (i. d.) o intravenosa (i. v.). Las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas marcadas (hMVEC-d) sirvieron como control y 5 x 10^{6} cuentas fluorescentes administradas solas en forma i. d. sirvieron como control negativo.

Se trasplantaron corazones de BALB/c neonatales de menos de 24 horas de edad en el pabellón auditivo (bilateral) de ratones hembra anestesiados BALB/c SCID de doce semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Inmediatamente después del trasplante, se inyectaron los ratones en la oreja, 4-5 mm del corazón trasplantado, ya sea con células hPBEC marcadas del donante 1017 (1 x 10^{6} células, i. d. ó 2 x 10^{6} células, i. v.), únicamente cuentas fluorescentes (5 x 10^{6} cuentas, i. d.) o células marcadas hMVEC-d (1 x 10^{6} células).

Inmediatamente después de la inyección i. d. de las células, se tomaron fotografías de la oreja del ratón anestesiado utilizando un sistema de microscopio que incluye un microscopio invertido motorizado equipado con objetivos 4x y 10x y una cámara CCD para detectar fluorescencia de baja luz, controlada por el software OPENLAB^{TM} (Improvision, Inc., Lexington, MA) para confirmar el depósito de células inmunofluorescentes verdes en el sitio de la inyección. Se fotografiaron isoinjertos de oreja en cada ratón receptor tanto a las 24 h como 144 horas después del trasplante/inyección de las células.

Se observaron los depósitos tanto de hPBEC marcadas vivas (donante 1017) como de cuentas fluorescentes solas confinadas en el sitio de la inyección inmediatamente después de la misma (1-2 horas). 24 horas después de la inyección, podían observarse hPBEC marcadas migrando fuera del sitio de la inyección hacia el corazón isquémico. 144 horas después de la inyección, los isoinjertos de corazón estaban latiendo y un mayor número de hPBEC marcadas inyectadas en forma i. d. había migrado desde el sitio de la inyección hacia el isoinjerto de corazón. Algunas hPBEC habían migrado en la porción del isoinjerto del corazón latiente donde se presente neovascularización, o en el área inmediatamente adyacente a él. Ni las cuentas inyectadas en forma i. d. ni las células marcadas inyectadas en forma i. v. podían ser detectadas 24 h ó 144 h después de la inyección. Las células inyectadas en forma i. d. se localizaron en el espacio interdérmico, cerca de la superficie de piel expuesta, permitiendo que el dispositivo para formación de imágenes las rastree más fácilmente que las células inyectadas en forma i. v., que necesitaron ser rastreadas histológicamente.

Aunque la invención anterior ha sido descrita con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad en su comprensión, será fácilmente evidente para aquellos ordinariamente capacitados en el arte a la luz de las enseñanzas de esta invención, que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

1. Uso de un antibiótico específico para P1H12 para preparar una población enriquecida de células madre por medio de selección positiva a partir de una población original de células, siendo dichas células madre capaces de dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 1.000 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente desde 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

5. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye además una concentración superior que dicha población original de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34.

6. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho enriquecimiento comprende:

(a): poner en contacto dicha población original de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y seleccionar de dicha población enriquecida de células, las células que se enlazan a dicha molécula;

(b): poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza a un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y remover de dicha población enriquecida de células, las células que no están enlazadas a dicha molécula;

(c): poner en contacto dicha población original de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b y VEGFR2 y seleccionar de dicha población enriquecida de células, las células que no están enlazadas a dicha molécula; o

(d): poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b y VEGFR2 y remover de dicha población enriquecida de células, las células que no están enlazadas a dicha molécula.

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8. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 1.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente desde 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

11. El uso de la reivindicación 8, en donde dicha población enriquecida de células madre es:

(a): enriquecida adicionalmente de células madre que son CD34+ o CD45+;

(b): enriquecida adicionalmente de células madre que son CD34- y CD45+; o

(c): enriquecida adicionalmente de células madre que son CD34+ o CD45+;

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12. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo está enlazado a una entidad detectable o a un sustrato sólido.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicha entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica, o una entidad magnética.

14. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho sustrato sólido es una superficie plástica, una superficie de vidrio, agarosa, acrilamida, lectina o una partícula magnética.

15. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha primera población de células se deriva de un mamífero.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde dicho mamífero es un primate.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde dicho primate es un humano.

18. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población original de células se deriva de sangre periférica, médula ósea o tejido de hígado fetal.

19. Una población enriquecida de células madre que incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre en comparación con una población original de células, y que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- y son CD34+ o CD45+, en donde dichas células madre pueden dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial.

20. Una población de células de la progenie derivadas de la población enriquecida de células madre de la reivindicación 19, en donde dichas células de la progenie son P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, tienen una capacidad proliferativa mayor que las HUVEC y las MVEC, y contienen Cuerpos de Weibel-Palade.

21. La población enriquecida de células madre de la reivindicación 19 ó 20 ó la población de células de la progenie de la reivindicación 21 para uso en terapia.

22. La población enriquecida de células madre o la población de células de la progenie de la reivindicación 21 para el uso especificado allí, en donde la terapia es el tratamiento de una enfermedad o trastorno vascular o circulatorio, o tiene por objeto la regeneración o reparación de tejidos.