ES2340513T3

ES2340513T3 - Razones de arnm en sedimentos urinarios y/o orina como pronostico y/o marcador para el tratamiento y el diagnostico de cancer de protasta.

Info

Publication number: ES2340513T3
Application number: ES05843726T
Authority: ES
Inventors: Daphne Hessels; Gerald Verhaegh; Jack A. Schalken; Alfred J. Witjes
Original assignee: Stichting Katholieke Universiteit; Radboud University Medical Centre
Current assignee: Stichting Katholieke Universiteit; Radboud University Medical Centre
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2010-06-04
Anticipated expiration: 2025-12-23
Also published as: DE602005019294D1; US20100021884A1; US10752957B2; EP1761651A2; US9951390B2; US9096907B2; WO2006066965A2; CA2594125A1; US20200392588A1; US20120003640A1; US20160362746A1; EP2325334A1; JP4944041B2; IL183476A0; EP2226394B1; CA2491067A1; US20150307948A1; HK1148315A1; CA2594125C; US20180223375A1

Abstract

Un método para pronosticar el cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende: (a)evaluar la cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en dicha muestra biológica; (b)determinar un valor de la razón entre dicha cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y dicha cantidad de PSA; y (c)comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado, en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado, es indicativo de mayor riesgo de mortalidad por cáncer de próstata, que comparado con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado.

Description

\global\parskip0.900000\baselineskip

Razones de ARNm en sedimentos urinarios y/o orina como pronóstico y/o marcador para el tratamiento y el diagnóstico de cáncer de próstata.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al cáncer de próstata. Más específicamente, la presente invención se refiere no sólo a un método para detectar el cáncer de próstata sino también para pronosticarlo y determinar el estadio del mismo. La presente invención se refiere a la estadificación y el pronóstico del cáncer de próstata, determinando en una muestra de un paciente la razón entre los ARNm expresados en sedimentos urinarios de pacientes. La invención se refiere adicionalmente al uso de las razones entre los ARNm prostáticos como un marcador para el tratamiento y el diagnóstico del cáncer de próstata.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la última década, el cáncer de próstata se ha vuelto el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia entre los varones y la segunda causa principal de muerte masculina por cáncer, en la población occidental, después del cáncer de pulmón (Landis y col., 1998, CA Cancer J. Clin. 48(1):6-29). De todos los cánceres, la incidencia del cáncer de próstata se incrementa mucho más rápido con la edad. Como la longevidad se está incrementando entre la población occidental, continúa habiendo un aumento correspondiente en el número de cánceres de próstata, con un aumento esperado del 60%, solamente en esta década. La mortalidad se ha incrementado con una tasa más lenta, pero globalmente se ha duplicado en los últimos 50 años. Aunque la enfermedad se diagnostica típicamente en hombres con una edad superior a 65, su impacto sigue siendo significativo porque la esperanza de vida media de un hombre que muere por cáncer de próstata, se reduce en 9-10 años. Si se ha descubierto, el cáncer de próstata temprano se puede curar ahora quirúrgicamente en aproximadamente el 90% de los casos. Sin embargo, la enfermedad es lentamente fatal una vez que el tumor se expande fuera del área de la glándula y forma metástasis distantes. La detección precoz y la estadificación correcta tienen, por tanto, una gran importancia para la correcta elección de la terapia y deben mejorar la tasa de éxito de los tratamientos y reducir el índice de mortalidad asociado con el cáncer de próstata.

A pesar de numerosos avances en estos últimos años, la precisión con la que se puede determinar el estadio de una persona que padece cáncer de próstata, sigue siendo mejorable. La razón principal de ello es la falta de ensayos moleculares muy específicos y sensibles para determinar de forma adecuada el estadio y el hecho de que el tumor se expanda más allá de la próstata, es generalmente microscópico más que macroscópico y, por lo tanto, difícil detectar. El examen rectal digital de la próstata ha sido la piedra angular para determinar el estadio local del cáncer de próstata durante muchas décadas, pero a menudo se subestima la extensión de la enfermedad. Los ultrasonidos transrectales, por sí mismos, sólo tienen un valor limitado como medio para determinar el estadio del cáncer de próstata. La tomografía por ordenador y la formación de imágenes por resonancia magnética no han sido generalmente satisfactorias para determinar el estadio del cáncer de próstata (Kirby, 1997, "Prostate Cancer and Prostatic Diseases" 1:2-10). Unas aproximaciones recientes y prometedoras para determinar el estadio del cáncer de próstata, implican el uso de tecnologías bioquímicas y moleculares, centradas en marcadores proteicos o en sus ácidos nucleicos correspondientes que se expresan preferentemente en las células de la próstata (Lange, 1997, en "Principles and Practice of Genitourinary Oncology" compiladores Lippincott-Raven, Ch. 41:417-425).

Los marcadores tumorales se encuentran frecuentemente en una muestra biológica de pacientes con cáncer, en concentraciones elevadas comparados con los de personas sanas. Estos marcadores son frecuentemente proteínas o ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. Los marcadores tumorales también pueden ser moléculas de ácido nucleico no codificadoras. A veces tienen el potencial de ser útiles para determinar el estadio, vigilar y realizar un seguimiento de los pacientes con tumor.

El cambio de nivel del marcador tumoral, así como su valor comparado con una persona sana promedio, tiene el potencial de ser utilizado para vigilar la terapia del cáncer. Una subida persistente o un valor superior a un umbral definido, puede ser indicativo de un cáncer recurrente o de un estadio concreto del cáncer. En algunos casos, los marcadores tumorales también se pueden utilizar para detectar las personas sospechosas de tener cáncer, estando frecuentemente dichos marcadores tumorales en un número elevado, antes de la aparición de cualquier prueba clínica de la enfermedad.

La identificación de los marcadores o de los antígenos tumorales asociados con el cáncer de próstata, ha estimulado un interés considerable debido a su uso en la detección, el diagnóstico, el pronóstico, la gestión clínica y el tratamiento potencial del cáncer de próstata. De hecho, pacientes con la enfermedad confinada localmente, se pueden curar frecuentemente mediante prostatectomía radical o terapia de radiación, pero para pacientes con una enfermedad extendida de forma distante, no hay un tratamiento curativo disponible. Esto acentúa la necesidad de nuevas dianas terapéuticas específicas para la próstata (cáncer). Se han descrito distintos genes que se expresan específicamente en la próstata, p. ej., PSA (Sokoll y col., 1997, "Prostate-specific antigen. Its discovery and biochemical characteristics". Urol. Clin. North. Am. 24:253-259), el antígeno de la membrana específico de la próstata (PSM: Fair y col., 1997, "Prostatete-specific membrane antigen". Prostate 32:140-148), el antígeno de células pluripotenciales de la próstata (Reiter y col., 1998. "Prostate stem cell antigen: a cell surface marker overexpressed in prostate cancer". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735-1740), TMPRSS2 (Lin y col., 1999. "Prostate-localized and androgen-regulated expression of the membrane-bound serine protease TMPRSS2". Cancer Res. 59:4180-4184), PDEF (Oettgen y col., 2000. "PDEF, a novel prostate epithelium-specific ets transcription factor, interacts with the androgen receptor and activates prostate-specific antigen gene expression". J. Biol. Chem. 275:1216-1225), el gen-1 específico de la próstata (Herness, 2003. "A novel human prostate-specific gene-1 (HPG-1): molecular cloning, sequencing, and its potencial involvement in prostate carcinogenesis". Cancer Res. 63:329-336), e incluso algunos ARN no codificantes (ncARN), tales como PCA3 (Bussemakers y col., 1999. "DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer" [Cancer Res. 59:5975-5979], documentos de patentes WO98/045420, WO01/0235, WO2004/070056, WO2005/003387), PCGEM1 (Srikantan y col., 2000. "PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12216-12221) y la agrupación de los genes P704P, P712P y P775P (Stolk y col. 2004. P704P, P712P y P775P: "A genomic cluster of prostate-specific genes". Prostate 60:214-226). Solamente una fracción de estos genes se ha asociado con el pronóstico, la progresión y/o la capacidad metastásica del cáncer de próstata y con potencial para ser dianas terapéuticas valiosas. Los marcadores tumorales de la próstata más conocidos, utilizados para la vigilancia, el seguimiento, la supervisión y la elección de la terapia para el cáncer de próstata, son el antígeno PSA (antígeno específico de la próstata) y el antígeno PSM (membrana específica de la próstata).

PSA es una proteasa de serina codificada por el gen PSA situado en el cromosoma 19. Esta glicoproteína se expresa bajo control andrógeno en las células epiteliales glandulares de la próstata y es secretada en el plasma seminal para licuarla. La proteína PSA está confinada normalmente en la próstata, pero en el caso de enfermedad prostática, tal como cáncer o BPH (hiperplasia benigna de la próstata), la PSA se filtra a la sangre en donde está presente en diferentes formas, incluyendo una forma que está unida a complejos proteicos y una forma no unida a los mismos (EL-Shirbiny, 1994, Adv. Clin. Chem. 31:99). La medición de las concentraciones totales en suero de PSA es uno de los ensayos bioquímicos empleados más frecuentemente y aprobados por la FDA, para la detección y el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata. Los estudios realizados hasta la fecha han sugerido que la detección con PSA, conjuntamente con exámenes rectales digitales y ultrasonidos transrectales, aumentan la detección de cánceres de próstata tempranos, a menudo porque todavía están localizados en la glándula misma (Brawer y col., 1992, J. Urol. 147:841). El PSA sérico es también útil para el control de pacientes después de la terapia, especialmente después de prostatectomía quirúrgica. Sin embargo, las mediciones de PSA total también identifican una gran cantidad de pacientes con niveles anormalmente elevados, en los que posteriormente se observa que no tienen cáncer de próstata. Recientemente, el concepto de medir el porcentaje de la razón entre PSA libre/total, ha mostrado que incrementa la especificidad de la detección del cáncer de próstata en hombres con un PSA entre 4 y 10 ng/ml (Letran y col., 1998, J. Urol. 160:426).

El gen de PSM codifica una glicoproteína transmembranal expresada por las células epiteliales de próstata normal, de hiperplasia benigna de la próstata y, en un mayor grado, de tejido prostático canceroso. Bajos niveles de PSM también se detectan en algunos tejidos distintos (Israeli y col., 1994, Cancer Res. 54:1807). PSA y PSM también han sido dianas para las vías de aproximación molecular al cáncer de próstata usando RT-PCR (transcripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa). Los análisis con RT-PCR de sangre, nódulos linfáticos y médula ósea de pacientes con cáncer de próstata, empleando PSA y PSM, han mostrado la extrema sensibilidad de esta vía. Sin embargo, son

\hbox{necesarias otras
investigaciones para establecer la utilidad de  PSM como un marcador
del cáncer de próstata.}

Un marcador nuevo del cáncer de próstata, PCA3, fue descubierto hace algunos años mediante análisis de la expresión diferencial de genes, destinado a destacar los genes asociados con el desarrollo del cáncer de próstata (documento de solicitud de patente PCT número PCT/CA98/00346 y número de solicitud PCT/CA00/01154). PCA3 se sitúa en el cromosoma 9 y está compuesto por cuatro exones. Codifica por lo menos cuatro transcritos diferentes que se generan mediante corte y empalme alternativos y poliadenilación. Mediante el análisis con RT-PCR, se observó que la expresión de PCA3 estaba limitada a la próstata y estaba ausente en todos los demás tejidos, incluyendo los testículos, el ovario, la mama y la vejiga. El análisis con transferencia de tipo Northern mostraba que PCA3 se expresa de forma elevada en la gran mayoría de los cánceres de próstata examinados (47 de 50), mientras que no se detectaba la expresión o ésta era muy baja, en la hiperplasia benigna de la próstata o en células normales de la próstata de los mismos pacientes. Una búsqueda de la proteína codificada por el ORF putativo de PCA3, todavía no ha tenido éxito. Además, basándose en el análisis de la secuencia y en experimentos de traducción in vitro, no se ha encontrado un producto proteico para PCA3, por lo tanto se refuerza la opinión de que PCA3 es un ARN no codificante (ncARN). Así, aunque, sigue siendo posible que un polipéptido sea codificado por PCA3 (y degradado, procesado, etc., rápidamente), parece consistente que PCA3 es un ncARN.

PCA3 sería así el primer ARN no codificante descrito en relación con el cáncer de próstata. Una cosa que se ha demostrado claramente, sin embargo, es que PCA3 es el gen específico del cáncer de próstata más numeroso, identificado hasta la fecha. PCA3 se corta y se empalma alternativamente, se poliadenila y se hiperexpresa de 50-500 veces más en el 95% de los tejidos de cáncer de próstata y de metástasis de cáncer de próstata, en comparación con tejidos normales de la próstata (de Kok y col., 2002. "PCA3, a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors". Cancer Res. 62:2695-2698; Hessels y col., 2003. "PCA3-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer". Eur. Urol. 44:8-16). No se detecta una expresión en otros tejidos normales o cancerígenos. La expresión del marcador PCA3 junto con un segundo marcador específico de la próstata, tal como p. ej., PSA, se ha utilizado en métodos para determinar la presencia de cáncer de próstata en una muestra (documento WO2004/070056). Además, la expresión de PCA3 se ha considerado como un marcador para determinar la presencia o la ausencia de cáncer de próstata (Tinzl y col., 2004, Eur Urol. 46(2):182-186).

El gen PCA3 está compuesto por 4 exones (e1-e4) y por 3 intrones (i1-i3). Aunque PCA3 parece que está reconocido como el mejor marcador del cáncer de próstata identificado jamás, esta especificidad se ha refutado en la bibliografía. Por ejemplo, Gandini y col., (Cancer Res. 2003; 63(15):4747) reivindican que la expresión específica de la próstata de PCA3, está restringida a la del exón 4 del gen PCA3. Sin embargo, los solicitantes han mostrado en una solicitud de patente reciente, que esto no es el caso (documento WO05/003387). Hay una hiperexpresión de PCA3 que es por lo veces 20 veces mayor en carcinomas prostáticos, en comparación con tejidos normales o de BPH. Aunque la expresión de PCA3 parece que se incrementa con el grado del tumor y se detecta en lesiones metastásicas, una correlación verdadera entre la expresión de PCA3 y el grado del tumor no se ha establecido nunca.

En la investigación del cáncer, ahora se acepta sin problemas que la agresividad del cáncer está relacionada con el grado de invasión de la célula cancerosa. Cientos de artículos lo han demostrado. Aún más, los mecanismos moleculares asociados con la invasión y la metástasis cada vez se van entendiendo mejor. Sin embargo, estos hallazgos parecían restringidos a la detección de células cancerosas que circulaban en la sangre. La hipótesis de trabajo era que las células cancerosas invasivas migrarían con la corriente sanguínea y que de este modo, el número de células cancerosas en la circulación sería proporcional al grado de invasión de un cáncer. Mientras que este concepto ganó mucha atención hace más de cinco años, la validación experimental todavía no se ha conseguido. Así, el concepto de medir las células cancerosas en un fluido corporal, tal como sangre en particular, todavía se está debatiendo con vehemencia.

Con la introducción de tecnologías de amplificación altamente sensibles, tales como la tecnología de la PCR con la que se puede conseguir, en algunos estados, una detección tan pequeña como la de una sola célula tumoral en un fondo de células predominantemente normales, llegó a ser factible mejorar el diagnóstico del cáncer en muestras de sangre. Se asume que los transcritos de células epiteliales no se encuentran normalmente en la circulación sanguínea. Por lo tanto, la detección de estos transcritos en el suero o en el plasma podía indicar la presencia de células diseminadas del cáncer de próstata. En los últimos 12 años se han escrito numerosos artículos sobre la detección que se basa en la RT-PCR de células de cáncer de próstata diseminadas, empleando el ARNm de PSA como diana. Sin embargo, se han observado diferencias notables en la sensibilidad de los ensayos basados en la RT-PCR, puesto que estos ensayos eran cualitativos, no estaban normalizados y eran difíciles de reproducir en diferentes laboratorios (Foster y col., 2004, Oncogene, 23, 5871-5879). Para mejorar la sensibilidad de estos ensayos, los investigadores emplearon PCR anidada. Desafortunadamente, esto condujo a la amplificación de falsos transcritos (Smith y col., 1995, "Prostate-specific antigen messenger RNA is expressed in non-prostate cells: implications for detection of micrometastases" [Cancer Res. 55: 2640-2644)]. Estos transcritos detectados fueron producidos y secretados en bajas cantidades por cualquier célula normal en el cuerpo, tal como las células sanguíneas o las células epiteliales normales. Consecuentemente, los transcritos de ARNm de PSA se encontraron en el suero de mujeres y de testigos sanos (Henke y col., 1997, "Increased analytical sensitivity of RT-PCR of PSA mRNA decreases diagnostic specificity of detection of prostatic cells in blood" [Int. J. Cancer. 70:52-56]). Como tales, estos métodos basados en RT-PCR tenían un valor limitado. Los nuevos ensayos sensibles, cuantitativos y más reproducibles que empleaban patrones internos exógenos para la detección de los transcritos de ARNm de PSA y hK2, superaron este problema (Ylikoski y col., 2002, "Simultaneous quantification of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 mRNA in blood samples from patients with prostate cancer and benign disease" [Clin. Chem. 48:1265-1270]). Sin embargo, se presentó otro problema al usar transcritos órganoespecíficos a diferencia de los transcritos específicos del cáncer, tales como ARNm de PSA y ARNm de hK2. De hecho, los transcritos del ARNm de PSA se detectaron en el suero o en el plasma de hombres con y sin cáncer de próstata, después de biopsias de la próstata, lo que conducía a una señal falsa positiva de la presencia de una célula cancerosa diseminada (Moreno y col., 1997, "Transrectal ultrasound-guided biopsy cuases hematogenous dissemination of prostate cells as determined by RT-PCR" [Urology 49:515-520] y Polascik y col., 1999, "Influence of sextant prostate needle biopsy or surgery on the detection and harvest of intact circulating prostate cancer cells" [J. Urol. 162:749-752]). Por tanto, sigue existiendo una necesidad de identificar genes específicos del cáncer de próstata que sean auténticos y se hiperexpresen

\hbox{de forma elevada que podrían ser utilizados
 en un ensayo cuantitativo basado en la amplificación.}

El primer indicio de la aparición de células cancerosas en el conducto (y por tanto en un fluido glandular) fue proporcionado por Hessels y col., 2003 (Eur. Urol. 44: 8-16). Todavía está sin demostrar si el aumento relativo del número de células cancerosas en un órgano está correlacionado con su capacidad invasora. También existe una necesidad de mostrar si el aumento de células cancerosas en un fluido glandular se correlacionaría con el aumento de la capacidad invasora de células cancerosas en esa glándula (p. ej., la próstata). También está sin determinar si tal capacidad invasora estaría reflejada en la sangre, la orina u otro flujo corporal. De hecho, aunque la hipótesis de que un aumento de las células cancerosas en la sangre (cuando se originan a partir de líquidos glandulares) se correlaciona con el grado del cáncer, ya se

\hbox{ha propuesto hace bastante  tiempo, la validación clínica
de esa hipótesis todavía no se ha proporcionado.}

Debido al hecho de que el cáncer de próstata permanece siendo una enfermedad que amenaza la vida, que alcanza una porción significativa de la población masculina, sigue habiendo una necesidad de un diagnóstico, un pronóstico y/o un tratamiento y diagnóstico eficaces y rápidos. El desarrollo de ensayos moleculares para determinar el estadio de forma adecuada, que posibilite, entre otras cosas, la selección de una terapia apropiada, debe mejorar la tasa de supervivencia. Sin embargo, a pesar de numerosos avances en estos últimos años, la precisión con la se puede determinar el estadio de una persona que padece cáncer de próstata, no es óptima. Uno de los inconvenientes de usar PSA o PSM para determinar el estadio del cáncer de próstata, es que estos marcadores se expresan en células normales y en cancerosas. Además, los tumores mal diferenciados pueden escapar al diagnóstico puesto que tienden a producir significativamente

\hbox{menos proteína PSA que los
tumores menos agresivos. Este  es el caso del 10% de todos los
cánceres de próstata.}

Por ello, sigue habiendo una necesidad de proporcionar un ensayo mejor para la estadificación y el pronóstico del cáncer de próstata. También sigue habiendo una necesidad de proporcionar un ensayo para el cáncer de próstata que sea más fiable y más específico para la detección, la estadificación del cáncer de próstata y los métodos de tratamiento del mismo.

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

La presente invención trata de satisfacer estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la razón entre PCA3 y un segundo marcador específico de la próstata, ambos expresados en una muestra de orina, no sólo establece la presencia, la ausencia o la predisposición al cáncer de próstata sino que también determina de forma sorprendente, específica y sensible la capacidad agresiva del cáncer de próstata y las consecuencias de la enfermedad.

Además, se descubrió inesperadamente que el valor de la razón entre PCA3 y un segundo marcador específico de la próstata (p. ej., PSA) podría estar correlacionada con el volumen del tumor. Puesto que el pronóstico de un paciente individual con carcinoma de próstata está fuertemente correlacionado con el volumen del tumor, los ensayos moleculares de la presente invención están validados adicionalmente como herramientas para el pronóstico y muestran su precisión en el pronóstico de la enfermedad. Por tanto, los médicos pueden tomar decisiones más capacitadas. Por ejemplo, el régimen de tratamiento específico se puede adaptar a cada paciente para tratar de forma más eficaz el cáncer de próstata, basándose en el valor de la razón que se determina. En una realización particular, este segundo marcador específico de la próstata es PSA.

Por ello, la presente invención proporciona por primera vez un estudio de casos y testigos que muestra directamente la asociación entre la razón de la expresión entre PCA3/PSA en una muestra, el volumen del tumor y la agresividad del cáncer de próstata. Más particularmente, la presente invención se refiere a la determinación cuantitativa de la razón de la expresión entre los ARNm de PCA3/PSA en una muestra de orina, como marcador para la estadificación y la agresividad del cáncer de próstata.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o el pronóstico del cáncer de próstata en una persona, que comprende: (a) determinar el valor de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA expresado en una muestra; y (b) correlacionar la razón con la presencia o la ausencia de cáncer de próstata, así como la agresividad y el riesgo de mortalidad del cáncer de próstata.

En esta memoria, los términos "diagnóstico" (sustantivo), "diagnóstico" (adjetivo), "diagnosticar" y similares, tal y como son bien conocidos en la técnica, se refieren a una identificación del cáncer de próstata o a una predisposición a desarrollar cáncer de próstata, basándose en la detección de por lo menos una macromolécula (p. ej., PCA3, PSA). Los términos "prognosis", "pronóstico", "pronosticar" y similares, tal y como son bien conocidos en la técnica, se refieren a la capacidad de predecir, pronosticar o correlacionar una detección o una medición dada, con las consecuencias futuras del cáncer de próstata del paciente (p. ej., estado canceroso, probabilidad de curar el cáncer de próstata, supervivencia y similares). De acuerdo con una realización de la presente invención, una medición de la razón entre PCA3/PSA es un diagnóstico o una determinación del grado del tumor y/o del volumen del tumor. Por lo tanto, basándose en los conocimientos clínicos del grado del tumor y/o del volumen del tumor, esta razón posibilita un pronóstico de la enfermedad (p. ej., la tasa de supervivencia). En otra realización, una determinación de la razón a lo largo del tiempo posibilita predecir las consecuencias para el paciente (p. ej., aumento o disminución del estado cancerígeno, aumento o disminución del grado de un

\hbox{tumor prostático, probabilidad de curación del cáncer de
próstata, supervivencia y similares).}

Por razón testigo normal, se entiende una razón medida entre la expresión génica detectada en una persona normal y sana o en una población de personas que no padecen cáncer de próstata. Una persona normal es una sin síntomas clínicos de cáncer de próstata. Un aumento en la razón entre PCA3/PSA se corresponde con un aumento en la cantidad de ARNm de PCA3 detectado, sobre la cantidad de PSA detectado, y se correlaciona positivamente con el estado cancerígeno, el grado del tumor, el volumen del tumor y se correlaciona negativamente con la tasa de supervivencia. En cambio, una disminución de la razón entre PCA3/PSA se corresponde con una disminución de la cantidad de ARNm de PCA3 detectado, sobre la cantidad de PSA detectado y se correlaciona con una disminución del estado cancerígeno, del grado del tumor o del volumen del tumor, y se correlaciona con un aumento de la tasa de supervivencia.

La presente invención también se relaciona con métodos de tratamiento y de diagnóstico, es decir, con el uso del ensayo molecular de la presente invención para diagnosticar la enfermedad, elegir o adaptar el régimen de tratamiento más adecuado o correcto y/o vigilar la respuesta del paciente a la terapia.

Así, la presente invención también se refiere a un método para detectar, y para determinar más específicamente el estadio de un cáncer de próstata en una muestra procedente de una persona, a fin de elegir la terapia apropiada.

Los métodos de la invención se pueden realizar in vitro, ex vivo o in vivo. Sin embargo, un método más preferido es un método realizado sobre muestras biológicas, particularmente sobre muestras de orina, resecciones del tejido de la próstata, biopsias del tejido de la próstata, semen o sobre lavados vesicales.

En una realización, la presente invención caracteriza un método para determinar el pronóstico del cáncer de próstata en una persona, que comprende: (a) determinar el valor de la razón entre PCA3/segundos ARNm específicos de la próstata expresados en una muestra: y (b) correlacionar dicha razón entre PCA3/segundos ARNm específicos de la próstata con la presencia o la ausencia de cáncer de próstata, así como la agresividad o el riesgo de mortalidad del cáncer de próstata. En una realización particular, el segundo ARNm específico de la próstata es ARNm de PSA y la muestra de orina se obtiene después de un examen rectal digital (DRE).

En una realización particular, la presente invención se ocupa de un método para pronosticar el cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende: (a) evaluar la cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en la muestra biológica; (b) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA y (c) comparar el valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado, en donde un valor de la razón superior al valor umbral predeterminado, es indicativo de mayor riesgo de mortalidad por cáncer de próstata, que comparado con un valor de la razón inferior al valor umbral predeterminado.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método para pronosticar cáncer de próstata en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata; (b) poner en contacto la muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm de PSA; (c) determinar la cantidad de ARNm de PCA3 y la cantidad de ARNm de PSA presentes en la muestra biológica; (d) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ARNm de PCA3 y la cantidad de ARNm de PSA; y (e) comparar el valor de la razón entre la cantidad de ARNm de PCA3 y la cantidad de ARNm de PSA, con al menos un valor umbral predeterminado, en donde un valor de la razón superior al valor umbral predeterminado es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata más agresivo que al comparar con un valor de la razón inferior al valor umbral predeterminado que es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata menos agresivo.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método para determinar el volumen de un tumor de cáncer de próstata en una muestra biológica que comprende: (a) evaluar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en una muestra; (b) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA; y (c) comparar el valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado, en donde un valor de la razón superior al valor umbral predeterminado, es indicativo de un volumen mayor del tumor del cáncer de próstata, comparado con un valor de la razón inferior al valor umbral predeterminado.

En una realización particular adicional, la presente invención se refiere a un método para vigilar el crecimiento tumoral del cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende: (a) evaluar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en la muestra biológica en un primer momento; (b) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA; (c) repetir las etapas (a) y (b) empleando una muestra biológica procedente del paciente en un momento posterior; y (d) comparar el valor de la razón obtenida en la etapa (b) con el valor de la razón obtenido en la etapa (c), en donde un valor de la razón superior en la etapa (b) comparado con el valor de la razón obtenida en la etapa (c), es indicativo de la progresión del cáncer de próstata y de un volumen mayor del tumor a lo largo del tiempo.

En una realización particular adicional, la presente invención se refiere a un método para vigilar la progresión del cáncer de próstata en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata; (b) poner en contacto la muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PSA; (c) determinar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 y la cantidad de ácido nucleico de PSA presentes en la muestra biológica; (d) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ácido nucleico de PCA3 y la cantidad de ácido nucleico de PSA; (e) repetir las etapas (a) hasta (d) en un momento posterior; y (f) comparar el valor de la razón obtenido en la etapa (d) con el valor de la razón obtenido en la etapa (e), en donde un valor de la razón superior en la etapa (e) comparado con el valor de la razón obtenido en la etapa (d), es indicativo de la progresión del cáncer de próstata a lo largo del tiempo.

También se describe en esta memoria un equipo de reactivos para diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata que comprende por lo menos un medio de recipiente que tiene dispuesto dentro del mismo (a) al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata, seleccionado entre el grupo consistente en (i) una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:1, (ii) una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:2, una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria a (i) o a (ii), y (iv) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas con la secuencia de ácido nucleico de i, ii o iii; (b) al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PSA seleccionado entre el grupo consistente en (i) una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:1, (ii) una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria a (i), (iii) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas con la secuencia de ácido nucleico de (i) o (ii); y (c) instrucciones para determinar el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata, basadas en la detección de una razón particular entre el nivel de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y el nivel de ácido nucleico de PSA.

También se describe en esta memoria un método para determinar el riesgo de progresión del cáncer de próstata, después de la terapia que comprende: (a) evaluar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en una muestra antes de la terapia; (b) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA; (c) repetir las etapas (a) y (b) empleando una muestra biológica procedente del paciente después de la terapia; y (d) comparar el valor de la razón obtenido después de la terapia, con el valor de la razón obtenido antes de la terapia, en donde un valor de la razón superior en la muestra después de la terapia, comparado con el valor de la razón obtenido antes de la terapia, es indicativo de la progresión del cáncer de próstata.

\newpage

\global\parskip0.950000\baselineskip

Además, en una realización particular, la presente invención se refiere a un método para determinar el estadio del cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende: (a) evaluar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en la muestra biológica; (b) determinar un valor de la razón entre la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA; (c) comparar el valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado; y (d) correlacionar un valor de la razón con un estadio concreto del cáncer de próstata, en donde un valor de la razón superior al valor umbral predeterminado, indica un estadio más avanzado del cáncer de próstata, comparado con un valor de la razón inferior al valor umbral predeterminado, determinando de tal modo el estadio del cáncer de próstata.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método para pronosticar el cáncer de próstata en un paciente humano, que comprende: (a) realizar un ensayo de amplificación in vitro del ácido nucleico sobre una muestra biológica del paciente o sobre un extracto de la misma, empleando una primera pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y una segunda pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico de PSA; (b) cuantificar la secuencia de ácido nucleico de PCA3 y la secuencia de ácido nucleico de PSA; y (c) calcular una razón normalizada entre PCA3 y PSA, en donde la razón se puede correlacionar con un nivel de ARNm de PCA3 y un nivel de ARNm de PSA en el paciente, en donde la razón normalizada entre

\hbox{PCA3 y PSA se correlaciona positivamente con un  grado o
un estadio del cáncer de próstata.}

También se describe en esta memoria un equipo de reactivos para pronosticar el cáncer de próstata en un paciente que comprende: (a) una primera pareja de cebadores específica para amplificar un ácido nucleico de PCA3 asociado con el cáncer de próstata presente en una muestra del paciente; (b) una segunda pareja de cebadores específica para amplificar un ácido nucleico de PSA; (c) reactivos que permiten una detección cuantitativa de productos de la amplificación del ácido nucleico de PCA3 y de PSA, cuando el PCA3 y la segunda secuencia de ácido nucleico específico de la próstata están presentes; y (d) instrucciones para determinar el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata que se basan en la detección de una razón específica entre el nivel de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y el nivel de ácido nucleico de PSA.

En todavía otra realización, se determinan los niveles séricos de la proteína PSA para hacer una preselección de los pacientes que necesitan adicionalmente un ensayo de la razón PCA3/PSA. En una realización particular, se emplea un valor umbral para someter a ensayo adicionalmente 3 ng/ml del nivel de la proteína PSA sérica. Por supuesto, se pueden utilizar otros valores umbrales de la proteína PSA sérica, dependiendo de los requisitos particulares del ensayo (sensibilidad y especificidad de la diana). Además, los niveles del ARNm de PSA sérico podrían emplearse alternativamente de acuerdo con la presente invención, para hacer la preselección de los pacientes que requieren un ensayo de la razón PCA3/PSA.

En una realización relacionada, la razón entre los ARNm de PCA3/PSA expresados en una muestra, se determina detectando los ARNs codificados por los genes de PCA3 y de PSA, usando un método de amplificación. En otra realización, el método de amplificación del ARN está acoplado a la detección en tiempo real de los productos amplificados, usando sondas específicas fluorescentes. En aún otra realización, el método de la amplificación es PCR o RT-PCR. En una realización adicional, la RT-PCR es una RT-PCR en tiempo real o un método relacionado que posibilita la detección en tiempo real de los productos amplificados.

En otra realización, los ARNs codificados por los genes de PCA3 y de PSA se detectan en un extracto de ácido nucleico por un método de amplificación de ARN in vitro, denominado Amplificación Basada en Ácidos Nucleicos (NASBA). Por supuesto, se conocen otros métodos de amplificación del ARN, y, por tanto, los métodos presentes de la presente invención y los equipos de reactivos descritos en esta memoria, no están limitados al NASBA. Ejemplos no limitativos de tales métodos de amplificación del ARN incluyen la amplificación mediada con transcriptasa (TMA), la amplificación por círculo rodante, la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR).

En otra realización, los productos amplificados se detectan en una fase homogénea usando una sonda fluorescente. En una realización, se emplea la vía de "Beacon". En otra realización, los productos se detectan sobre fase sólida usando un método fluorescente o colorimétrico. Se debe entender, por tanto, que se pueden utilizar numerosos métodos fluorescentes, colorimétricos o enzimáticos de acuerdo con la presente invención, para detectar y/o cuantificar los ARNs. Otros tipos de sondas y cebadores marcados u otros tipos de métodos de detección, también se pueden utilizar en la presente invención (p. ej., ensayos de hibridación, tales como transferencias de tipo Northern, transferencias de manchas de puntos o transferencias por ranuras y sondas y cebadores radiomarcados).

La amplificación y/o la detección de los ARNs codificados por los genes de PCA3 y de PSA para determinar el nivel y la razón de la expresión de estos ARNs en una muestra, se puede realizar simultáneamente o por separado. La muestra biológica se puede seleccionar entre el grupo consistente en resección de tejido de la próstata, biopsias de tejido de la próstata, semen y lavados vesicales. La muestra de orina obtenida después de un examen rectal digital (DRE), es particularmente útil. Por supuesto, se debe entender que los métodos presentes y los equipos de reactivos también se podrían utilizar sobre una muestra de orina obtenida sin DRE, o en otros tipos de muestras, tales como esperma u orina mezclada con esperma (p. ej., primera muestra de orina después de una eyaculación), con la condición de que el método de amplificación y/o el método de detección sea suficientemente sensible para detectar los marcadores dirigidos hacia la diana (PCA3 y el segundo marcador). Experimentos mostraban que los métodos de la presente invención y los equipos de reactivos descritos en esta memoria, también se podrían realizar con estos tipos de muestras.

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

En una realización, los ARNs codificados por los genes de PCA3 y de PSA se amplificaron a partir de una célula que estaba en una muestra de orina de micción procedente de una persona.

En una realización, se cosechan las células recogidas de la muestra de orina y se realiza una extracción total del ácido nucleico. En una realización particular, la extracción total del ácido nucleico se realiza empleando un método de banda en fase sólida sobre perlas de sílice, tal y como describen Boom y col., 1990 (J. Clin. Microbiol. 28:495-503). En otra realización, se purifican los ácidos nucleicos empleando otro método de captura con diana (véase más abajo). Por supuesto, se debe entender que existen numerosos métodos de extracción y de purificación del ácido nucleico y que, por ello, se podrían utilizar otros métodos de acuerdo con la presente invención. Ejemplos no limitativos incluyen un método de extracción con fenol/cloroformo y un método de purificación con captura de la diana (véase más abajo). Otros métodos similares se describen en los libros de texto a los que se hace referencia en esta memoria. También se debe reconocer que numerosos medios para estabilizar o para proteger las células de la próstata contenidas en la muestra de orina o en otra muestra, así como para estabilizar o proteger el ARN presente en estas células, son bien conocidos en la técnica.

En otra realización, los métodos de la presente invención se realizan usando una muestra bruta, sin purificar o semipurificada.

Aunque se prefiere la determinación de una razón entre PCA3/segundo marcador específico de la próstata, basada en la detección del ARNm, la presente invención no está limitada por ello. Por ejemplo, una razón entre el ARNm de PCA3/la segunda proteína o polipéptido del marcador específico de la próstata, se puede emplear muy bien de acuerdo con la presente invención. El tipo de entidad molecular (p. ej., ARNm o polipéptido) que se detecta precisamente, se puede adaptar de este modo para adecuar las necesidades particulares mientras que el nivel de la macromolécula que se detecta se correlacione con la actividad transcripcional del gen a partir del cual se ha obtenido.

También se describe en esta memoria un equipo de reactivos de tratamiento y diagnóstico, de diagnóstico y de pronóstico del cáncer de próstata para detectar la presencia y la cantidad de ácidos nucleicos de PCA3 y de PSA en una muestra. Tal equipo de reactivos comprende generalmente un primer medio de recipiente que tiene dispuesto dentro del mismo al menos un sonda de oligonucleótido y/o un cebador que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 y/o de PSA (p. ej., ARN de PCA3, ARN de PSA) y un segundo medio de recipiente que contiene al menos otro cebador de oligonucleótido y/o sonda que se hibrida con las secuencias específicas de PCA3 o de PSA mencionadas anteriormente. En otra realización, un tercer medio de recipiente contiene sondas que se hibridan específicamente con los productos de la amplificación de PCA3 y de PSA. En una realización preferida, el equipo de reactivos incluye adicionalmente otros recipientes que comprenden componentes adicionales, tales como un oligonucleótido o un cebador adicional, y/o uno o varios de los siguientes: tampones, reactivos que se van a utilizar en el ensayo (p. ej., reactivos de lavado, polimerasas, testigos internos (IC) o similares) y reactivos capaces de detectar la presencia de sonda(s)/cebador(es) de ácido nucleico unidos. Por supuesto, son posibles numerosas realizaciones de los equipos de reactivos descritos en esta memoria. Por ejemplo, los diferentes medios de recipiente se pueden dividir en reactivos de la amplificación y reactivos de la detección. En una realización tal, el primer medio de recipiente contiene los reactivos de la amplificación o de la hibridación específicos para los ácidos nucleicos de la diana de la presente invención (p. ej., PCA3, PSA y/o ácidos nucleicos testigos internos) y el segundo medio de recipiente contiene los reactivos de la detección. Alternativamente, los reactivos de la detección y los reactivos de la amplificación pueden estar contenidos en el mismo medio de recipiente. Por supuesto, la separación o la reunión de los reactivos en el mismo o en diferentes medios de recipiente, es dictada por los tipos de métodos de extracción, de amplificación o de hibridación, y los métodos de detección utilizados así como otros parámetros que incluyen la estabilidad, la necesidad de conservación, etc. Además, los equipos de reactivos pueden incluir adicionalmente instrucciones para la puesta en práctica de los métodos de diagnóstico, tratamiento y diagnóstico, y/o pronóstico de la presente invención. Tales instrucciones pueden referirse a detalles referentes al protocolo experimental, así como a los valores umbrales para la razón entre PCA3/segundo marcador específico de la próstata, que se pueden
utilizar.

En un aspecto relacionado, la presente invención ofrece sondas y cebadores de ácidos nucleicos para la detección específica de la presencia de ARNm de PCA3 y del segundo marcador específico del cáncer de próstata (p. ej., PSA) en una muestra. También proporciona una agrupación de ácidos nucleicos que se unen a uno o a varios ácidos nucleicos de PCA3/PSA

También se describen en esta memoria métodos de la presente invención y los equipos de reactivos descritos en esta memoria para pronosticar el cáncer de próstata en un paciente, basándose en una determinación de la razón PCA3/PSA usando sedimentos urinarios después de un DRE, actuando la razón como un marcador para el tratamiento y el diagnóstico, y para el pronóstico, basándose en el aumento del porcentaje de células cancerosas en la orina, después del DRE.

En una realización particular de la presente invención, la detección de PCA3 se basa en usar el exón 1 de PCA3 como diana, mediante un cebador. En una realización tal particular, se emplean cebadores de cada lado del intrón 1 para amplificar una porción de las secuencias del exón 1 y del exón 2 de PCA3 (el intrón 1 es un intrón con aproximadamente 20 kb). Se pueden diseñar numerosos ejemplos de parejas de cebadores a partir de las secuencias de PCA3 de la presente invención y, por supuesto, no están limitadas al exón 1.

Así, la presente invención muestra por primera vez que la razón entre la expresión de PCA3 y de un segundo marcador específico del cáncer de próstata (p. ej., PSA), no sólo es útil para el diagnóstico, sino también para el pronóstico y el tratamiento y el diagnóstico. Por supuesto, la razón del pronóstico de la presente invención se puede emplear opcionalmente conjuntamente con otros marcadores del cáncer de próstata y de enfermedades neoplásicas, tales como el activador de plasminógeno urinario, el receptor del activador de plasminógeno urinario, el inhibidor 1 del plasminógeno, p53, E-caderina, PSM, VEGF, etc.

Además, según los conocimientos de los inventores, antes de la presente invención, no había informes que describieran que en los fluidos glandulares (por ejemplo, mama o próstata), el número de células cancerosas en la extrusión se correlacionaba con la capacidad invasiva del cáncer. Además, no había una técnica anterior que mostrara o sugiriera que la razón entre el ARNm de PCA3 y un segundo ARNm específico de la próstata (p. ej., PSA), aumenta con el volumen del tumor y la agresividad del cáncer y, por tanto, que tal razón se pudiera utilizar como un marcador para el tratamiento y el diagnóstico, el pronóstico o para determinar el estadio. Se afirma en esta memoria que antes de la presente invención, no se podía predecir si las células cancerosas agresivas iban a migrar a la corriente sanguínea o a la orina. El valor para el tratamiento y el diagnóstico y para el pronóstico de la razón de la presente invención se basa en demostrar un número de fenómenos, que no se habían mostrado previamente: (1) las células del cáncer de próstata agresivas son más invasivas; (2) las células más invasivas también son más capaces de invadir los acinos prostáticos; (3) de este forma, la fracción de células cancerosas en el sedimento urinario se incrementará; (4) de modo que la razón entre los ARNm de PCA3/segundo marcador (p. ej., PSA) aumentará; (5) el volumen del tumor también está correlacionado con la razón entre los ARNm de PCA3/segundo marcador; y (6) el aumento ligero de PCA3 con el grado y la disminución ligera del ARNm de PSA puede potenciar este efecto.

Así, de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, una vez que se determina la razón entre PCA3/segundo marcador (p. ej., PSA), es posible: (1) determinar la presencia, la ausencia o la predisposición a desarrollar cáncer de próstata; (2) si se detecta cáncer de próstata, determinar el estadio, el volumen del tumor, el grado del tumor y la agresividad del cáncer; (3) pronosticar las consecuencias de la enfermedad (pronóstico); y (4) identificar la terapia más apropiada para el paciente.

Además, una ventaja particular de la presente invención es el uso de una razón de la presente invención como herramienta para el tratamiento y el diagnóstico, el diagnóstico y el pronóstico. Aunque el valor particular de la razón PCA3/segundo marcador (p. ej., PSA) varía dependiendo del segundo marcador utilizado (para un estadio/un grado/un volumen dado del tumor), es idóneo variar sólo levemente con el tipo de método de amplificación/detección (una vez que se eligen las parejas concretas de PCA3/segundo marcador). Así, mientras que los métodos utilizados para determinar el nivel de PCA3 y el segundo marcador son comparables en términos de sensibilidad y especificidad, el valor de la razón para una muestra dada, debe ser más o menos el mismo (es decir, considerado estadístico similar debido a la variación en el método elegido). Por lo tanto, una vez que se elijen las parejas de marcadores, se pueden utilizar diversos métodos de detección de forma intercambiable, mientras que los métodos sean similarmente específicos y sensibles.

A menos que se definan de otra manera, los términos y la nomenclatura científicos y tecnológicos utilizados en esta memoria, tienen el mismo significado que el comprendido comúnmente por una persona experta en la técnica a la que se refiere esta invención. Las definiciones comúnmente entendidas de los términos de biología molecular, se pueden encontrar, por ejemplo, en el Diccionario de Microbiología y Biología Molecular, 2ª ed. (Singleton y col., 1994, John Wiley & Sons, Nueva York, NY) o el Diccionario Harper Collins de Biología (Hale y Marham, 1991, Harper Perennial, Nueva York, NY), Rieger y col., Glosario de genética: Clásica y molecular, 5ª edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1991; Alberts y col., Biología molecular de la célula, 4ª edición, Garland science, Nueva York, 2002; y Lewin, Genes VII, Oxford University Press, Nueva York, 2000. Generalmente, los procedimientos de los métodos de biología molecular y similares son métodos comunes empleados en la técnica. Tales técnicas convencionales se pueden encontrar en manuales de referencia, tales como por ejemplo Sambrook y col., (2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratories); y Ausubel y col., (1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

Otros objetos y ventajas de la presente invención se aclaran en la descripción siguiente.

Definiciones

En la presente descripción, se emplea extensivamente una variedad de términos. Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se va a dar a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

Las secuencias de nucleótidos se presentan en esta memoria con una cadena sencilla, en la dirección a 5' a 3', de izquierda a derecha, usando los símbolos de nucleótidos de una letra, tal y como se emplean generalmente en la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se utiliza conjuntamente con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar "uno" pero también es compatible con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más que uno".

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o el método que se va a emplear para determinar el valor. De forma rutinaria, una desviación del 10% al 15%, preferentemente 10%, está dentro del alcance del término "aproximadamente".

El término molécula o secuencia de "ARN" o "ADN" (así como a veces el término "oligonucleótido") se refiere a una molécula que comprende generalmente los desoxirribonucleótidos adenina (A), guanina (G), timina (T) y/o citosina (C). En el "ARN", la T está sustituida por uracilo (U).

La presente descripción se refiere a una variedad de términos rutinarios de la tecnología recombinante del ADN (rADN). Sin embargo, definiciones de ejemplos seleccionados de tales términos del rADN se proporcionan para mayor claridad y consistencia.

Tal y como se emplea en esta memoria, "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótidos", se refiere a un polímero de nucleótidos. Ejemplos no limitativos de los mismos, incluyen el ADN (p. ej., ADN genómico, ADNc), moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y quimeras de los mismos. La molécula de ácido nucleico se puede obtener por técnicas de clonación o sintetizada. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario (cadena codificante o cadena no codificante [complementaria]). El ácido ribonucleico convencional (ARN) y el ácido desoxirribonucleico (ADN) están incluidos en la expresión "ácido nucleico" y los polinucleótidos como análogos de los mismos. Una cadena principal de ácido nucleico puede comprender una variedad de enlaces conocidos en la técnica, que incluyen uno o varios enlaces azúcar-fosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico (denominados "ácidos nucleicos peptídicos" (PNA); Hydig-Hielsen y col., documento de publicación internacional PCT número WO 95/32305), enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato o combinaciones de los mismos. Los restos de azúcar del ácido nucleico pueden ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares que tienen sustituciones conocidas, p. ej., sustituciones en 2'-metoxi (que contienen un resto de 2'-O-metilribofuranosil; véase el documento PCT número WO 98/02582) y/o sustituciones en 2'-haluro. Las bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos conocidos de las mismas (p. ej., inosina u otros; véase "The Biochemistry of the Nucleic Acids" 5-36, Adams y col., compiladores, 11ª ed., 1992), o derivados conocidos de las bases púricas o pirimidínicas (véase, Cook, documento de publicación internacional PCT, número WO 93/13121) o residuos "abásicos" en los cuales la cadena principal no incluye bases nitrogenadas en uno o más residuos (Arnold y col., documento de patente de EE.UU., número 5.585.481). Un ácido nucleico puede comprender solamente azúcares, bases y enlaces convencionales, tal y como se encuentra en el ARN y el ADN, o puede incluir ambos componentes convencionales y sustituciones (p. ej., bases convencionales unidas a través de una cadena principal metoxi, o un ácido nucleico que incluye bases convencionales y uno o más análogos de las bases).

Molécula de ácido nucleico aislada. Una "molécula de ácido nucleico aislada", tal y como se entiende generalmente y se emplea en esta memoria, se refiere a un polímero de nucleótidos, e incluye, pero no debe limitarse a los mismos, ADN y ARN. La molécula de ácido nucleico "aislada" se purifica de su estado natural in vivo, obtenida por clonación o sintetizada químicamente.

La terminología "ácido nucleico de PCA3" y "ácido nucleico de PSA" o "polinucleótidos PCA3" y "polinucleótidos de PSA", se refiere a una secuencia de ácido nucleico de PCA3 o de PSA natural. En una realización, el ácido nucleico de PCA3 tiene la secuencia descrita en ID SEQ NOs:1 y 2. En una realización relacionada, el ácido nucleico de PSA tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO:38. En otra realización, el ácido nucleico de PSA codifica una proteína de PSA. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico de PCA3 que contiene el ORF previsto, codifica un polipéptido de PCA3. En otra realización, los ácidos nucleicos de PCA3 y de PSA son secuencias de ácido nucleico no codificante. En aún otra realización, las secuencias de PCA3 y de PSA que son reconocidas como dianas por las secuencias de PCA3 y de PSA incluidas en la presente invención, son secuencias naturales de PCA3 y de PSA encontradas en la muestra de una persona.

La terminología "pareja de amplificación" o "pareja de cebadores" se refiere en esta memoria a parejas de los oligonucleótidos (oligos) de la presente invención, que se seleccionan para ser utilizada juntas en la amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, a través de uno entre varios tipos de procesos de amplificación. Ejemplos no limitativos de una pareja de cebadores para amplificar PSA son ID SEQ NOs: 36 y 37.

"Amplificación" se refiere a cualquier procedimiento in vitro conocido para obtener copias múltiples ("amplicones") de una secuencia de ácido nucleico diana o de su complemento o de fragmentos de la misma. La amplificación in vitro se refiere a la producción de un ácido nucleico amplificado que puede contener algo menos que la secuencia completa de la región diana o su complemento. Los métodos conocidos para la amplificación in vitro incluyen, p. ej., la amplificación mediada con transcripción, la amplificación mediada con replicasa, la amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación con la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA que incluye el método de amplificación por desplazamiento múltiple de la hebra (MSDA)). La amplificación mediada con replicasa emplea moléculas de ARN autorreplicantes y una replicasa tal como la Q\beta-replicasa (p. ej., Kramer y col., documento de patente de EE.UU., número 4.786.600). La amplificación con PCR es bien conocida y emplea una polimerasa de ADN, cebadores y ciclación térmica para sintetizar copias múltiples de las dos cadenas complementarias de ADN o de ADNc (p. ej., Mullis y col., documentos de patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159). La amplificación con LCR emplea al menos cuatro oligonucleótidos separados para amplificar una diana y su cadena complementaria, usando múltiples ciclos de hibridación, de ligación y de desnaturalización (p. ej., el documento de publicación de la solicitud de patente europea número 0 320 308). La SDA es un método en el cual un cebador contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que permite que la endonucleasa haga una mella en una hebra de un dúplex de ADN hemimodificado que incluye la secuencia diana, seguido por la amplificación en una serie de etapas de extensión del cebador y desplazamiento de la hebra (p. ej., Walker y col., documento de patente de EE.UU. número 5.422.252). Otros dos métodos de amplificación conocidos por desplazamiento de la hebra, no requieren hacer una mella con la endonucleasa (Dattagupta y col., documento de patente de EE.UU. nº 6.087.133 y el documento de patente de EE.UU. nº 6.124.120 (MSDA)). Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de cebador oligonucleótido de la presente invención, se pueden emplear fácilmente en cualquier método de amplificación in vitro que se base en la extensión del cebador con una polimerasa. (véase en general, Kwoh y col., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25 y Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, Bio Technology 6:1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260; y Sambrook y col., 2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, tercera edición, CSH Laboratories). Según lo conocido en general en la técnica, los oligos se diseñan para unirse a una secuencia complementaria, bajo condiciones seleccionadas.

Electroforesis en gel de agarosa. La técnica de uso más extendido (aunque no la única) para fraccionar ADN bicatenario es la electroforesis en gel de agarosa. El principio de este método es que las moléculas de ADN migran a través del gel como si fuera un tamiz que retarda el movimiento de las moléculas más grandes en mayor grado y el movimiento de las moléculas más pequeñas en menor grado. Obsérvese que cuanto más pequeño sea el fragmento de ADN, mayor será la movilidad electroforética en el gel de agarosa.

Los fragmentos de ADN fraccionados por la electroforesis en gel de agarosa se pueden visualizar directamente por un procedimiento de tinción, si el número de fragmentos incluidos en el patrón es pequeño. Para visualizar un pequeño subconjunto de estos fragmentos, se puede aplicar una metodología denominada como procedimiento de hibridación (p. ej., hibridación de tipo Southern).

"Hibridación de ácidos nucleicos" se refiere en general a la hibridación de dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias que tienen secuencias de bases complementarias, que bajo condiciones apropiadas formarán una estructura bicatenaria favorecida termodinámicamente. Ejemplos de las condiciones de hibridación se pueden encontrar en los dos manuales de laboratorio mencionados anteriormente (Sambrook y col., 2000, ver más arriba y Ausubel y col., 1994, ver más arriba, o además en Higgins y Hames (compiladores) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)) y se conocen generalmente en la técnica. En el caso de una hibridación con un filtro de nitrocelulosa (u otro soporte distinto del nilón), como por ejemplo en el bien conocido procedimiento de transferencia de tipo Southern, se puede incubar un filtro de nitrocelulosa durante una noche a una temperatura representativa de la condición rigurosa deseada (60 - 65ºC para muy rigurosa, 50-60ºC para una condición rigurosa moderada y 40-45ºC para condiciones poco rigurosas), con una sonda marcada en una solución salina (6 x SSC o 5 x SSPE), 5 x Denhardt, 0,5% de SDS, y 100 \mug/ml de ADN vehículo desnaturalizado (p. ej., ADN de esperma de salmón). La sonda que no se une específicamente se puede separar a continuación por lavado mediante varios lavados en 0,2 x SSC/0,1% de SDS a una temperatura que se selecciona en función de la condición rigurosa deseada: temperatura ambiente (poco rigurosa), 42ºC (moderadamente rigurosa) o 65ºC (muy rigurosa). La sal y la concentración de SDS de las soluciones de lavado también se pueden ajustar para acomodar a la condición rigurosa deseada. La temperatura seleccionada y la concentración salina se basan en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN. Por supuesto, los híbridos de ARN-ADN también se pueden formar y detectar. En tales casos, las condiciones de hibridación y lavado se pueden adaptar según métodos bien conocidos por una persona con conocimientos en la técnica. Preferentemente se emplean condiciones rigurosas (Sambrook y col., 2000, ver más arriba). Otros protocolos o equipos de reactivos para la hibridación, disponibles en el comercio (p. ej., ExpressHyb® de BD Biosciencies Clonetech) que usan diferentes soluciones de reasociación y de lavado, también se pueden utilizar, ya que son bien conocidos en la técnica. Tal y como se conoce bien, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico que se va a determinar constituyen otros parámetros de las condiciones de hibridación. Obsérvese que variaciones en las condiciones anteriores se pueden conseguir a través de la inclusión y/o sustitución de reactivos bloqueantes alternativos, utilizados para suprimir el ruido de fondo en experimentos de hibridación. Los reactivos bloqueantes típicos incluyen el reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN desnaturalizado de esperma de salmón y formulaciones comerciales disponibles. La inclusión de reactivos bloqueantes específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación descritas anteriormente, debido a problemas con la compatibilidad. La hibridación de moléculas de ácido nucleico también comprende fragmentos de las moléculas descritas anteriormente. Además, las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con cualquier molécula de ácido nucleico mencionada anteriormente, también incluyen fragmentos complementarios, derivados y variantes alélicas de estas moléculas. Además, un complejo de hibridación se refiere a un complejo entre dos secuencias de ácido nucleico en virtud de la formación de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias G y C y entre las bases complementarias A y T; estos puentes de hidrógeno pueden estar adicionalmente estabilizados por interacciones de apilamiento de bases. Las dos secuencias complementarias de ácido nucleico se unen en una configuración antiparalela. Un complejo de hibridación se puede formar en solución (p. ej., análisis de Cot o de Rot) o entre una secuencia de ácido nucleico presente en la solución y otra secuencia de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte

\hbox{sólido (p. ej., membranas, filtros, chips,  pasadores o
portaobjetos de vidrio a los cuales se han fijado, p. ej.,
células).}

Los términos complementario o complementariedad se refieren a la unión natural de polinucleótidos, bajo condiciones salinas y de temperatura permisivas mediante apareamiento de las bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se une a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser "parcial", en la cual solamente se unen algunos de los ácidos nucleicos, o puede ser completa, cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y la resistencia de la hibridación entre las cadenas de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, que dependen de la unión entre las hebras de ácido nucleico.

El término "se hibrida" tal y como se utiliza de acuerdo con la presente invención, puede referirse a hibridaciones bajo condiciones rigurosas o no rigurosas, tal y como se ha descrito en esta memoria anteriormente. La determinación de las condiciones está en conformidad con el especialista en la técnica y se pueden determinar según los protocolos descritos en la técnica. La expresión "secuencias que se hibridan" se refiere preferiblemente a secuencias que muestran una identidad de la secuencia de por lo menos el 40%, preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, incluso más preferiblemente por lo menos el 70%, particularmente preferida por lo menos el 80%, más particularmente preferida, por lo menos el 90%, incluso más particularmente preferida, por lo menos el 95% y lo más preferible una identidad de por lo menos el 97%. Por otra parte, la expresión "secuencias que se hibridan" se refiere preferiblemente a secuencias que codifican una proteína PSA que tiene una identidad de la secuencia de por lo menos el 40%, preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, incluso más preferiblemente por lo menos el 70%, particularmente preferida al menos el 80%, más particularmente preferida, por lo menos el 90%, incluso más particularmente preferida, por lo menos el 95% y lo más preferido una identidad de por lo menos identidad el 97% con una secuencia de aminoácidos de una proteína PSA.

De acuerdo con la presente invención, el término "idéntico" o "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (p. ej., identidad del 60% o del 65%, preferiblemente, identidad del 70-95%, más preferiblemente identidad de al menos 95%), cuando se comparan y se alinean con una correspondencia máxima, con una ventana de comparación, o con una región designada tal y como se mide usando un algoritmo para la comparación de secuencias, que es conocido en la técnica, o mediante la alineación manual y la inspección visual. Las secuencias que tienen, por ejemplo, 60% a 95% o más de identidad de la secuencia, se consideraron que son sustancialmente idénticas. Tal definición también se aplica al complemento de una secuencia del ensayo. Preferentemente, la identidad descrita existe sobre una región que tiene por lo menos aproximadamente 15 a 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, más preferiblemente, sobre una región que tiene aproximadamente 50 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica saben cómo determinar el porcentaje de identidad entre/a lo largo de secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los que se basan en el programa de ordenador CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) o FASTDB (Brutlag. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), según se conoce en la técnica. Aunque el algoritmo de FASTDB no considera típicamente en su cálculo las deleciones o las adiciones internas no apareantes en las secuencias, es decir, los huecos, esto se puede corregir manualmente para evitar una sobrestimación de los % de identidad. CLUSTALW, sin embargo, tiene en cuenta los huecos de la secuencia en sus cálculos de la identidad. También están disponibles para los especialista en esta técnica, los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). El programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico emplea por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP emplea por defecto una longitud de palabra (W) de 3, y un valor esperado (E) de 10. La matriz de puntuaciones BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89, (1989), 10915) emplea alineaciones (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Por otra parte, la presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico cuya secuencia está degenerada en comparación con la secuencia de una molécula que se hibrida, descrita anteriormente. Cuando se utiliza de acuerdo con la presente invención, la expresión "estar degenerado como resultado del código genético" significa que debido a la redundancia del código genético, diferentes secuencias de nucleótidos codifican el mismo aminoácido. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden una o varias mutaciones o deleciones, y a moléculas de ácido nucleico que se hibridan con una de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria, que muestran una(s) mutación(iones) o una(s) deleción(iones).

Una "sonda" significa incluir un oligómero de ácido nucleico que se hibrida específicamente con una secuencia diana, en un ácido nucleico o su complemento, bajo condiciones que favorecen la hibridación, de tal modo que permiten la detección de la secuencia diana o de su ácido nucleico amplificado. La detección puede ser directa (es decir, el resultado de una sonda que se hibrida directamente con la diana o con la secuencia amplificada) o indirecta (es decir, el resultado de una sonda que se hibrida con una estructura molecular intermedia que enlaza la sonda con la diana o la secuencia amplificada). Una "diana" de una sonda se refiere en general a una secuencia dentro de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada (es decir, un subconjunto de la secuencia amplificada) que se hibrida específicamente con al menos a una porción de la secuencia de la sonda, mediante puentes de hidrógeno convencionales o "apareamiento de las bases." Las secuencias que son "suficientemente complementarias" permiten una hibridación estable de una secuencia de la sonda con una secuencia diana, incluso si las dos secuencias no son totalmente complementarias. Una sonda puede estar marcada o sin marcar. Una sonda se puede producir mediante clonación molecular de una secuencia de ADN específica o también se puede sintetizar. Numerosos cebadores y sondas que se pueden diseñar y utilizar en el contexto de la presente invención, pueden ser determinados fácilmente por una persona experta en la técnica a la que pertenece la presente invención. Ejemplos no limitativos de cebadores y de sondas se muestran en las Tablas 2-4. Una persona experta en la técnica puede diseñar muchas sondas y cebadores diferentes, basándose en las enseñanzas de esta memoria y en el conocimiento general común.

"Suficientemente complementaria" significa una secuencia contigua de bases de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con otra secuencia mediante puentes de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición en la secuencia usando el apareamiento de bases convencional (p. ej., emparejamiento de G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o varios residuos (que incluyen residuos abásicos) que no son complementarios, usando el emparejamiento de bases d convencional, pero que permiten que la secuencia completa se hibride específicamente con otra secuencia de bases bajo condiciones de hibridación apropiadas. Las bases contiguas de un oligómero son complementarias preferiblemente al menos aproximadamente en el 80% (81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%), preferiblemente al menos aproximadamente en el 90% con la secuencia con la que el oligómero se hibrida específicamente el oligómero. Las condiciones de hibridación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica, se pueden predecir fácilmente basándose en la composición y las condiciones de la secuencia, o se pueden determinar empíricamente usando un ensayo de rutina (véase Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", segunda edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989) en las secciones 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, particularmente en las secciones 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).

Las secuencias de ácido nucleico pueden ser detectadas usando la hibridación con una secuencia complementaria (p. ej., sondas de oligonucleótidos) (véanse los documentos de patente de EE.UU. nº 5.503.980 (Cantor), 5.202.231 (Drmanac y col.), 5.149.625 (Church y col.), 5.112.736 (Caldwell y col.), 5.068.176 (Vijg y col.), y 5.002.867 (Macevicz)). Los métodos para detectar la hibridación pueden hacer uso de una agrupación de sondas (p. ej., en un chip de ADN) para proporcionar la información de la secuencia sobre el ácido nucleico de la diana que se hibrida selectivamente con una secuencia de la sonda exactamente complementaria, en un conjunto de cuatro secuencias relacionadas de la sonda que difieren en un nucleótido (véanse los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.837.832 y 5.861.242 (Chee y col.)).

Una etapa de la detección puede emplear una variedad de métodos conocidos para detectar la presencia de ácido nucleico, mediante la hibridación con una sonda de oligonucleótido. Un ejemplo específico de una etapa de detección emplea un método de detección homogéneo, tal como se ha descrito con detalle previamente en Arnold y col., Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989), y los documentos de patente de EE.UU. nº 5.658.737 (Nelson y col.), 5.118.801 y 5.312.728 (Lizardi y col.).

Los tipos de métodos de detección en los cuales se pueden utilizar sondas, incluyen las transferencias de tipo Southern (detección del ADN), las transferencias de manchas de puntos o las transferencias por ranuras (ADN, ARN), y las transferencias de tipo Northern (detección del ARN). Las proteínas marcadas también se podrían utilizar para detectar una secuencia de ácido nucleico concreta a la cual se une (p. ej., detección de proteínas mediante tecnología de tipo Western: Guichet y col., 1997, Nature 385(6616): 548-552; y Schwartz y col., 2001, EMBO 20(3):510-519). Otros métodos de detección incluyen equipos de reactivos que contienen reactivos de la presente invención sobre un dispositivo de varilla y similares. Por supuesto, puede ser preferible el uso de un método de detección que sea susceptible de automatización. Un ejemplo no limitativo de eso incluye un chip u otro soporte que comprende una o varias (p. ej., una agrupación) de diferentes sondas.

Un "marcador" se refiere a un resto molecular o a un compuesto que se puede detectar o que puede conducir a una señal detectable. Un marcador se une, directa o indirectamente, a una sonda de ácido nucleico o al ácido nucleico que se va a detectar (p. ej., una secuencia amplificada). La marcación directa puede tener lugar a través de enlaces o interacciones que enlazan el marcador con el ácido nucleico (p. ej., enlaces covalentes o interacciones no covalentes), mientras que la marcación indirecta puede tener lugar empleando un "enlazador" o un resto que actúe como puente, tal como un(os) oligonucleótido(s) adicional(es), que se marca de forma directa o indirecta. Los restos que tienden un puente pueden amplificar una señal detectable. Los marcadores pueden incluir cualquier resto detectable (p. ej., un radionucleido, un ligando tal como biotina o avidina, una enzima o un sustrato enzimático, un grupo reactivo, un cromóforo tal como un colorante o una partícula con color, un compuesto luminiscente que incluye un compuesto bioluminescente, fosforescente o quimioluminiscente, y un compuesto fluorescente). Preferiblemente, el marcador sobre una sonda marcada es detectable en un sistema de ensayo homogéneo, es decir, en una mezcla, el marcador unido muestra un cambio detectable comparado con un marcador no unido.

Otros métodos para marcar ácidos nucleicos son conocidos, en los cuales un marcador se fija a una cadena de ácido nucleico cuando es fragmentada, lo que es útil para marcar ácidos nucleicos que se van a detectar por hibridación con una agrupación de sondas de ADN inmovilizadas (p. ej., véase el documento de patente PCT nº PCT/IB99/02073).

Un "marcador detectable homogéneo" se refiere a un marcador cuya presencia se puede detectar de forma homogénea, basándose en si la sonda marcada se hibrida con una secuencia diana. Un marcador homogéneo y detectable se puede detectar sin eliminar físicamente las formas hibridadas de las no hibridadas de la sonda marcada. Los marcadores detectables homogéneos y los métodos para detectarlos han sido descritos detalladamente en otro lugar (p. ej., véanse los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.283.174, 5.656.207 y 5.658.737).

Tal y como se emplea en esta memoria, "oligonucleótidos" u "oligos" definen una molécula que tiene dos o más nucleótidos (ribo o desoxirribonucleótidos). El tamaño del oligo se establecerá por la situación particular y en última instancia, por el uso particular del mismo y estará adaptado por consiguiente por la persona con conocimientos en la técnica. Un oligonucleótido se puede sintetizar químicamente o se puede obtener por clonación según métodos bien conocidos. Aunque están generalmente en forma monocatenaria, pueden estar en forma bicatenaria o incluso contener una "región reguladora". Pueden contener nucleótidos raros naturales o sintéticos. Se pueden diseñar para mejorar un criterio dado, como por ejemplo, la estabilidad. Las quimeras de desoxirribonucleótidos y de ribonucleótidos también pueden estar dentro del alcance de la presente invención.

Amplificación de la secuencia. Un método para generar grandes cantidades de una secuencia diana. Generalmente, uno o varios cebadores de la amplificación están reasociados con una secuencia de ácido nucleico. Usando las enzimas apropiadas, se amplifican las secuencias que se encuentran adyacentes a los cebadores, o entre los mismos.

Tal y como se emplea en esta memoria, un "cebador" define un oligonucleótido que es capaz de reasociarse con una secuencia diana, creando de este modo una región bicatenaria que puede servir como punto de iniciación para la síntesis de ácidos nucleicos bajo condiciones adecuadas. Los cebadores se pueden diseñar, por ejemplo, para ser específicos de determinados alelos, de modo que se utilicen en un sistema de amplificación específico del alelo. Por ejemplo, se puede diseñar un cebador para que sea complementario a un ARN corto de PCA3 que está asociado con un estado canceroso de la próstata, mientras que un ARN largo de PCA3 está asociado con un estado no canceroso (benigno) de la misma (documento PCT/CA00/01154 publicado con el número WO 01/23550). La región 5' del cebador puede ser no complementaria a la secuencia del ácido nucleico diana e incluir bases adicionales, tales como una secuencia de promotor (que se denomina un "cebador del promotor"). Los expertos en la materia apreciarán que cualquier oligómero que puede actuar como cebador, se puede modificar para incluir la secuencia 5' del promotor, y de este modo actuar como un cebador del promotor. De forma semejante, cualquier cebador del promotor puede servir como cebador, independientemente de su secuencia promotora funcional. Por supuesto el diseño de un cebador a partir de una secuencia de ácido nucleico conocida, es conocido en la técnica. En cuanto a los oligos, pueden comprender una variedad de tipos de diferentes nucleótidos. Los técnicos expertos pueden determinar fácilmente la especificidad de los cebadores seleccionados y de las sondas (p. ej., PSA, PCA3, secuencias testigos, etc....) realizando alineaciones/búsquedas por ordenador, usando bases de datos bien conocidas (p. ej., GenBank®).

Cebador de la amplificación. Un oligonucleótido que es capaz de reasociarse de forma adyacente a una secuencia diana y servir como punto de iniciación de la síntesis de ADN cuando se pone en condiciones en las cuales se inicia la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico.

NASBA. Amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, del inglés "Nucleic Acid Sequence Based Amplification") se puede realizar de acuerdo con técnicas conocidas (Malek y col., Methods Mol. Biol., 28:253-260, documentos de patente de EE.UU. nº 5.399.491 y 5.554.516). En una realización, la amplificación NASBA se inicia con la reasociación de un cebador P1 complementario (que contiene el promotor de la polimerasa de ARN T7) con la diana de ARNm. La transcriptasa inversa (RTasa) sintetiza entonces una hebra de ADN complementaria. El híbrido de ADN/ARN bicatenario es reconocido por la ARNasa H que digiere la hebra de ARN, dejando una molécula de ADN monocatenaria, a la cual se puede unir el cebador P2 efector. P2 sirve como un anclaje para la RTasa que sintetiza una segunda hebra de ADN. El ADN bicatenario resultante tiene un promotor funcional de la polimerasa de ARN T7, reconocido por la enzima respectiva. La reacción NASBA puede entrar entonces en la fase de amplificación cíclica que comprende seis etapas: (1) síntesis de moléculas cortas de ARN monocatenario complementario (10^{1} a 10^{3} copias por molde de ADN) a través de la polimerasa de ARN T7; (2) reasociación del cebador P2 con estas moléculas de ARN; (3) síntesis de una hebra de ADN complementaria mediante RTasa; (4) digestión de la hebra de ARN en el híbrido ADN/ARN; (5) reasociación del cebador P1 con el ADN monocatenario; y (5) generación de moléculas de ADN bicatenarias mediante RTasa. Debido a que la reacción de NASBA es isotérmica (41ºC), la amplificación específica del ssARN es posible si se evita la desnaturalización del dsADN en el procedimiento de preparación de la muestra. De este modo, es posible recoger el ARN en un fondo de dsADN sin obtener resultados falsos positivos debido al dsADN genómico.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa se puede realizar de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véanse, p. ej., los documentos de patentes de EE.UU. nº 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; y 4.965.188. En general, la PCR implica un tratamiento de una muestra de ácido nucleico (p. ej., en presencia de una polimerasa de ADN termoestable) bajo condiciones de hibridación, con un cebador oligonucleótido para cada hebra de la secuencia específica que se va a detectar. Un producto de la extensión de cada cebador que se sintetiza es complementario a cada una de las dos cadenas de ácido nucleico, con los cebadores suficientemente complementarios a cada hebra de la secuencia específica, para hibridarse con ella. El producto de la extensión, sintetizado a partir de cada cebador también puede servir como molde para una síntesis adicional de los productos de la extensión, usando los mismos cebadores. Después de un número suficiente de tandas de síntesis de los productos de la extensión, la muestra se analiza para determinar si está presente la secuencia o las secuencias que se van a detectar. La detección de la secuencia amplificada se puede realizar mediante visualización después de la tinción con bromuro de etidio (EtBr) del ADN, después de la electroforesis en gel, o usando un marcador detectable de acuerdo con técnicas conocidas, y similares. Para una revisión de las técnicas de PCR, véase "PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications", Michael y col., compiladores, Acad. Press, 1990.

La reacción en cadena de la ligasa (LCR) se puede realizar de acuerdo con técnicas bien conocidas (Weiss, 1991, Science 254:1292). La adaptación del protocolo para cumplir con las necesidades deseadas, la puede realizar una persona experta en la técnica. La amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) también se realiza de acuerdo con técnicas conocidas o adaptaciones de las mismas, para cumplir con las necesidades particulares (Walker y col. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; e ibid, 1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696).

Captura de la diana. En una realización, se incluye la captura de la diana en el método para aumentar la concentración o la pureza del ácido nucleico de la diana antes de la amplificación in vitro. Preferiblemente, la captura de la diana implica un método relativamente sencillo para hibridar y aislar el ácido nucleico diana, tal y como se ha descrito detalladamente en otro lugar (p. ej., véanse los documentos de patente de EE.UU. nº 6.110.678, 6.280.952, y 6.534.273). Hablando en general, la captura de la diana se puede dividir en dos familias, específica de la secuencia y no específica de la secuencia. En el método no específico, un reactivo (p. ej., perlas de sílice) se utiliza para capturar no específicamente los ácidos nucleicos. En el método específico de la secuencia, un oligonucleótido fijado a un soporte sólido, se pone en contacto con una mezcla que contiene el ácido nucleico diana, bajo condiciones de hibridación apropiadas, para permitir que el ácido nucleico de la diana se fije al soporte sólido, para permitir la purificación de la diana a partir de otros componentes de la muestra. La captura de la diana puede ser el resultado de una hibridación directa entre el ácido nucleico diana y un oligonucleótido fijado al soporte sólido, pero preferiblemente es el resultado de la hibridación indirecta con un oligonucleótido que forma un complejo de hibridación que enlaza el ácido nucleico diana con el oligonucleótido sobre el soporte sólido. El soporte sólido es preferiblemente una partícula que se puede separar de la solución, más preferiblemente una partícula paramagnética que se puede recuperar aplicando un campo magnético sobre el recipiente. Después de la separación, el ácido nucleico diana enlazado con el soporte sólido, se lava y se amplifica cuando la secuencia diana se pone en contacto con los cebadores, los sustratos y las enzimas apropiados en una reacción de amplificación in vitro.

Generalmente, las secuencias de oligómero de captura incluyen una secuencia que se une específicamente con la secuencia diana, cuando el método de captura es de hecho específico, y una secuencia de la "cola" que enlaza el complejo con una secuencia inmovilizada a través de hibridación. Es decir, el oligómero de captura incluye una secuencia que se une específicamente a su PCA3, PSA o a otra secuencia diana marcadora específicas de la próstata (p. ej., hK2/KLK2, PMSA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, PCGEM1) y a una secuencia de la cola fijada covalentemente en 3' (p. ej., un homopolímero complementario a una secuencia homopolímera inmovilizada). La secuencia de la cola que tiene, por ejemplo, 5 a 50 nucleótidos de longitud, se hibrida con la secuencia inmovilizada para enlazar el complejo que contiene la diana con el soporte sólido y purificar de este modo el ácido nucleico diana hibridado de otros componentes de la muestra. Un oligómero de captura puede emplear cualquier enlace de la cadena principal, pero algunas realizaciones incluyen uno o varios enlaces 2'-metoxi. Por supuesto, otros métodos de captura son bien conocidos en la técnica. El método de captura sobre la estructura de casquete (Edery y col., 1988, gene 74(2):517-525, documento de patente de EE.UU. nº 5.219.989) y el método basado en sílice son dos ejemplos no limitativos de los métodos de captura.

Una "sonda inmovilizada" o un "ácido nucleico inmovilizado" se refieren a un ácido nucleico que se une, directa o indirectamente, con un oligómero de captura a un soporte sólido. Una sonda inmovilizada es un oligómero unido a un soporte sólido que facilita la separación de la secuencia diana unida, del material no unido en una muestra. Cualquier soporte sólido conocido puede ser utilizado, por ejemplo las matrices y las partículas libres en solución, fabricadas con cualquier material conocido (p. ej., nitrocelulosa, nilón, vidrio, poliacrilato, polímeros mezclados, poliestireno, polipropileno de silano y partículas metálicas, preferentemente partículas paramagnéticas). Los soportes preferidos son esferas paramagnéticas monodispersas (es decir, de tamaño uniforme \pm aproximadamente 5%), que proporcionan de este modo resultados consistentes, a los cuales se une directamente de forma estable una sonda inmovilizada, (p. ej., a través de un enlace covalente directo, una quelación o una interacción iónica), o indirectamente (p. ej., a través de uno o de varios enlazadores), permitiendo la hibridación con otro ácido nucleico en solución.

ADN complementario (ADNc). Moléculas de ácido nucleico recombinantes sintetizadas mediante transcripción inversa del ARN mensajero ("ARN").

Tal y como se utiliza en esta memoria, el término "purificado" se refiere a una molécula (p. ej., ácido nucleico) que se ha separado de un componente de la composición en la cual estaba presente originalmente. Así, por ejemplo, un "ácido nucleico purificado" se ha purificado a un nivel no encontrado en la naturaleza. Una molécula "sustancialmente pura" es una molécula que carece de la mayoría de otros componentes (p. ej., 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% exenta de contaminantes). Por el contrario, el término "bruto" significa moléculas que no se han separado de los componentes de la composición original en la cual estaban presentes. Brevemente, las unidades (p. ej., 66, 67,... 81, 82, 83, 84, 85,... 91, 92%....) no se enumeran específicamente, pero sin embargo se consideran dentro del alcance de la presente invención.

La terminología "pronóstico", "estadificación" y" determinación de la agresividad" se definen en esta memoria como la predicción del grado de gravedad del cáncer de próstata y de su evolución, así como la perspectiva de recuperación tal y como se anticipa a partir del curso usual de la enfermedad. Según la presente invención, una vez que se ha determinado la agresividad del cáncer de próstata, se pueden escoger los métodos apropiados determinados.

En esta memoria la terminología "la puntuación de Gleason", que es bien conocida en la técnica, es el sistema de uso general más común para graduar/determinar el estadio y el pronóstico del adenocarcinoma. El sistema describe una escala de puntuación de 2 a 10, siendo 2 el estado menos agresivo y 10 el más agresivo. La puntuación es la suma de los dos patrones más comunes (grado 1-5) del crecimiento tumoral encontrado. Para hacer el recuento, un patrón (grado) tiene que ocupar más del 5% de la muestra de la biopsia. El sistema de puntuación requiere material de la biopsia (biopsia del núcleo o muestras quirúrgicas) para ser exacto; no se pueden utilizar preparaciones citológicas.

El "grado de Gleason" es el sistema más común empleado para graduar el cáncer de próstata. Implica asignar números al tejido canceroso de la próstata, que varían de 1 a 5, basándose en cómo las células cancerosas imitan la forma en que las células normales forman glándulas. Se asignan dos grados a los patrones más comunes de células que aparecen; estos dos grados (pueden ser iguales o diferentes) se suman a continuación para determinar la puntuación de Gleason (un número del 2 al 10).

El sistema de Gleason está basado exclusivamente en el patrón estructural de las glándulas del tumor de próstata. Este evalúa la eficacia de las células de cualquier cáncer particular para ser capaces de estructurarse ellas mismas en glándulas, que se asemejan a las de la próstata normal. La capacidad de un tumor de imitar la estructura de una glándula normal se denomina su diferenciación, y la experiencia ha mostrado que un tumor cuya estructura es cercana a la normal (bien diferenciada) tendrá probablemente un comportamiento biológico relativamente cercano al normal, es decir, que no es un cáncer muy agresivo.

El principio es bastante simple, una graduación de Gleason en la que se gradúa desde muy bien diferenciado (grado 1) hasta muy poco diferenciado (grado 5), se realiza generalmente en gran parte por la observación de la imagen microscópica del cáncer con poco aumento. Existen detalles adicionales importantes que requieren un mayor aumento, y una capacidad para graduar con precisión cualquier tumor, se consigue solamente con mucha práctica y experiencia en patología.

Los grados 1 y 2 de Gleason: estos dos grados se asemejan mucho a la próstata normal. Son los grados menos importantes porque aparecen raramente en la población general y porque confieren un pronóstico favorable que es únicamente ligeramente mejor que el grado 3. Ambos grados están compuestos por masa; en el grado 2 hay más agregado suelto y algunas glándulas migran (invaden) el músculo circundante (estroma).

Grado 3 de Gleason: este es el grado más común por el momento y también se considera bien diferenciado (como los grados 1 y 2). Esto es debido a que los tres grados tienen una "unidad glandular" normal, similar a la de una próstata normal; es decir, cada célula forma parte de una fila circular que forma el revestimiento de un espacio central (el lumen). El lumen contiene la secreción prostática como una próstata normal, y cada unidad glandular está rodeada por el músculo de la próstata que mantiene las unidades de las glándulas separadas. En contraposición con el grado 2, la migración de las glándulas (invasión) al estroma (músculo) es muy relevante y es la característica principal. Las células son más oscuras que pálidas y las glándulas tienen a menudo formas más variables.

Grado 4 de Gleason: este es probablemente el grado más importante porque es bastante común y debido al hecho de que, si está presente en gran cantidad, el pronóstico del paciente habrá empeorado generalmente (pero no siempre) de forma considerable. Aquí también hay un gran aumento en la pérdida de la estructura. Por primera vez, se observan roturas y la pérdida de la unidad glandular normal. De hecho, el grado 4 se identifica casi enteramente por la pérdida de la capacidad de formar unidades glandulares individuales y separadas, cada una con su lumen separado (espacio secretor). Esta distinción importante es simple en el concepto pero compleja en la práctica. La razón es que hay una variedad de vías aparentes diferentes en las cuales el esfuerzo del cáncer para formar las unidades glandulares se puede distorsionar. Cada cáncer tiene su propio conjunto parcial de herramientas con las cuales construye parte de la estructura normal. El grado 4 es como las ramas de un árbol grande, que se extienden en una variedad de direcciones desde el tronco (bien diferenciado) de los grados 1, 2 y 3. Se necesita mucha experiencia para dictar este diagnóstico, y no todos los patrones se distinguen fácilmente del grado 3. Esta es la clase principal de cáncer de próstata poco diferenciado, y su distinción del grado 3, es la decisión generalmente más importante para la determinación del grado.

Grado 5 de Gleason: El grado 5 de Gleason es un grado importante porque predice generalmente otra etapa significativa hacia un pronóstico desfavorable. Su importancia global para la población general es reducida por el hecho de que es menos común que el grado 4, y se observa raramente en los hombres en los que se ha diagnosticado un cáncer de próstata temprano en desarrollo. Este grado también muestra una variedad de patrones, mostrando todos que no hay ninguna evidencia de cualquier tentativa de formar unidades glandulares. Este grado se denomina frecuentemente indiferenciado, porque sus características no se distinguen significativamente para darle una apariencia diferente de los cánceres indiferenciados que aparecen en otros órganos.

Cuando un patólogo estudia las muestras de un cáncer de próstata con microscopio y les da un grado de Gleason, se realiza un intento de identificar dos patrones estructurales y se asigna un grado de Gleason a cada uno. Puede haber un patrón primario o más común y a continuación un patrón secundario o segundo patrón más común, los cuales trata de encontrar el patólogo para cada muestra; alternativamente, puede haber a menudo solamente un único grado puro.

Al desarrollar su sistema, el Dr. Gleason descubrió que dando una combinación de los grados de los dos patrones más comunes que se podía observar en cualquier muestra de un paciente particular, era capaz de predecir mejor la probabilidad de que un paciente particular mejorara o empeorara. Por lo tanto, aunque pueda parecer confusa, la puntuación de Gleason que da generalmente un médico a un paciente, es realmente una combinación o una suma de dos números, y es suficientemente exacta para ser utilizada de forma extensa. Estas sumas o puntuaciones combinadas de Gleason pueden ser determinadas del modo siguiente:

\bullet: La menor puntuación posible de Gleason es 2 (1 + 1), en donde el patrón primario y el secundario tienen un grado de Gleason 1 y, por lo tanto, cuando se adicionan ambos, su suma combinada es 2.

\bullet: Unas puntuaciones muy típicas de Gleason podrían ser 5 (2 + 3), en donde el patrón primario tiene un grado de Gleason 2 y el patrón secundario tiene un grado 3, o 6 (3 + 3), un patrón puro.

\bullet: Otra puntuación típica de Gleason puede ser 7 (4 + 3), en donde el patrón primario tiene un grado de Gleason 4 y el patrón secundario tiene un grado 3.

\bullet: Finalmente, la puntuación más alta posible de Gleason es 10 (5 + 5), cuando los patrones primario y secundario tienen ambos el grado de Gleason más alterado que es 5.

Otro modo de determinar el estadio del cáncer de próstata es usando el sistema TNM. Este describe la extensión del tumor primario (estadio T), la ausencia o la presencia de propagación a los nódulos linfáticos vecinos (estadio N) y la ausencia o la presencia de propagación distante, o metástasis (estadio M). Cada categoría de la clasificación TNM se divide en subcategorías representativas de su estadio particular. Por ejemplo, los tumores primarios (estadio T) se pueden clasificar en:

T1:: El tumor no se puede palpar en un examen rectal digital (DRE), o no se puede ver con estudios de formación de imagen, pero se han encontrado células cancerosas en la biopsia de una muestra;

T2:: El tumor se puede palpar durante un DRE y el cáncer está limitado dentro de la glándula prostática;

T3:: El tumor se ha extendido a través de la cápsula prostática (una capa de tejido fibroso que rodea la glándula prostática) y/o a las vesículas seminales (dos pequeñas bolsas próximas a la próstata que almacenan el semen), pero otros órganos no están afectados;

T4:: El tumor se ha propagado o fijado a tejidos cercanos a la próstata (con excepción de las vesículas seminales).

La implicación de los nódulos linfáticos se divide en las 4 categorías siguientes:

N0:: El cáncer no se ha extendido a ningún nódulo linfático;

N1:: El cáncer se ha extendido a un solo nódulo linfático regional (dentro de la pelvis) y no es más mayor de 2 centímetros;

N2:: El cáncer se ha extendido a uno o a varios nódulos linfáticos regionales y es mayor de 2 centímetros, pero no más de 5 centímetros; y

N3:: El cáncer se ha extendido a un nódulo linfático y es mayor de 5 centímetros (2 pulgadas).

La metástasis se divide generalmente en las dos categorías siguientes:

M0:: El cáncer no tiene metástasis (diseminación) más allá de los nódulos linfáticos regionales; y

M1:: El cáncer tiene metástasis en nódulos linfáticos distantes (parte exterior de la pelvis), en los huesos, o en otros órganos distantes, tales como los pulmones, el hígado o el cerebro.

Además, el estadio T se divide adicionalmente en las subcategorías T1a- c, T2a-c, T3a-c y T4a-b. Las características de cada una de ellas se conocen bien en la técnica y se pueden encontrar en una variedad de libros de texto.

Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología "marcador específico de la próstata" se refiere a cualquier molécula cuya presencia en la muestra indica que tal muestra contiene células de la próstata (o a marcador de las mismas). Por lo tanto, una "secuencia específica de la próstata" se refiere a un ácido nucleico o a una secuencia proteica encontrada específicamente en las células de la próstata y que generalmente no está en otros tejidos que podrían "contaminar" una muestra concreta. Para mayor certeza, cuando se emplea una muestra de orina, el segundo marcador específico de la próstata de acuerdo la presente invención, no tiene que ser expresado solamente en la próstata. De hecho, los marcadores que sólo se expresan en un órgano o un tejido son muy raros. Sin embargo, si el segundo marcador específico de la próstata se expresa en un tejido que no es de la próstata, esta expresión del tejido no prostático no debe comprometer la especificidad de este segundo marcador, con la condición de que esto ocurra en células de tejidos o de órganos que normalmente no están presente en la muestra de orina. Así, cuando la orina es la muestra, este segundo marcador específico de la próstata no se expresa normalmente en otros tipos de células (p. ej., células del sistema del tracto urinario) que se encuentran en la muestra de orina. De forma similar, si se emplea otro tipo de muestra (p. ej., una muestra de esperma), el segundo marcador específico de la próstata no debe ser expresado en otros tipos de células que se encuentran normalmente dentro de tal muestra.

Muestra testigo. La expresión "muestra testigo" o "muestra normal" significa en esta memoria una muestra que no contiene un cáncer elegido específicamente. En una realización particular, la muestra testigo no contiene cáncer de próstata ni es indicativa de la ausencia de cáncer de próstata. Las muestras testigo se pueden obtener a partir de pacientes/individuos que no están afectados de cáncer de próstata. Otros tipos de muestras testigo se pueden utilizar también. Por ejemplo, un marcador específico de la próstata se puede utilizar para asegurar que la muestra contiene células específicas de la próstata (este marcador se describe generalmente en esta memoria como el segundo marcador específico de la próstata). En un aspecto relacionado, se puede diseñar una reacción testigo para controlar el método mismo (p. ej., la extracción celular, la captura, la reacción de amplificación o el método de detección, el número de células presente en la muestra, una combinación de los mismos o cualquier etapa que se pudiera vigilar para validar positivamente que la ausencia de una señal (p. ej., la ausencia de la señal PCA3) no es el resultado de un defecto en una o en varias etapas). Una vez que se determina un valor umbral, se puede diseñar una muestra testigo dando una característica señal del valor umbral predeterminado y se puede emplear en los métodos de la presente invención. Los ensayos de diagnóstico/pronóstico se caracterizan generalmente por los 4 indicadores siguientes del comportamiento: sensibilidad (Se), especificidad (Sp), valor predictivo positivo (VPP), y valor predictivo negativo (VPN). La tabla siguiente presenta los datos utilizados para calcular los 4 indicadores del comportamiento.

1

La sensibilidad se corresponde con la proporción de personas que tienen un ensayo del diagnóstico positivo que han padecido de verdad la enfermedad o el estado (Se=a/a+c). La especificidad relaciona la proporción de personas que tienen un ensayo de diagnóstico negativo y las que no tienen la enfermedad o el estado (Sp=d/b+d). El valor predictivo positivo se refiere a la probabilidad de tener realmente la enfermedad o el estado (p. ej., cáncer de pulmón) cuando el ensayo de diagnóstico es positivo (VPP=a/a+b). Finalmente, el valor predictivo negativo es indicativo de la probabilidad de no tener realmente la enfermedad/el estado cuando el ensayo de diagnóstico es negativo (VPN=c/c+d). Los valores se expresan generalmente en %. La Se y la Sp se refieren generalmente a la precisión del ensayo, mientras que el VPP y el VPN se refieren a su utilidad clínica.

Valor de grado de admisión (umbral). El valor umbral de la predisposición o la presencia de cáncer de próstata se define a partir de una población de pacientes sin cáncer de próstata como la señal promedio de polinucleótidos de PCA3 o de fragmentos de los mismos, dividida por la señal promedio de los polinucleótidos, los polipéptidos o los fragmentos del segundo marcador específico del cáncer de próstata (p. ej., PSA), más las desviaciones estándares n (o la señal media promedio de las mismas). Los valores umbrales indicativos de la presencia o de la predisposición a desarrollar cáncer de próstata, pueden ser iguales o alternativamente, pueden ser valores diferentes. Puesto que los marcadores tumorales en muchos casos no sólo son producidos por células tumorales, la utilidad clínica obtenida a partir de un marcador dado implica a menudo encontrar un equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad. Tal compromiso se alcanza a menudo con un valor "umbral" específico, que se basa empíricamente en los datos recogidos. Se debe entender por tanto, que un experto en la técnica, a la cual pertenece la presente invención, será capaz con una experimentación rutinaria, de seleccionar un valor umbral concreto basándose en la especificidad y la sensibilidad deseadas, el tipo de muestra usada, la preparación de la misma, el estadio del cáncer, el hecho de que se emplea una razón más que un nivel absoluto de expresión de PCA3, y otros factores tales descritos en esta memoria. Más específicamente, en el caso de PCA3, la persona experta en la técnica puede escoger el valor umbral para que sea superior o inferior a lo valores de las razones ejemplificados de 132 x 10^{-3} y 200 x 10^{-3}, descritos en esta memoria. Sin hacer específicamente un listado de los todos los valores útiles superiores e inferiores que se pueden seleccionar para PCA3/PSA, y que están dentro del alcance de la presente invención, se debe entender que, por ejemplo, una razón normalizada de 100 x 10^{-3}, 150 x 10^{-3}, 175 x 10^{-3} o 250 x 10^{-3} podría ser seleccionada por un técnico experto para elegir un nivel útil de especificidad y de sensibilidad. Además, cuando se determina el nivel sérico de proteína PSA, se puede utilizar un umbral distinto del valor ejemplificado en esta memoria de 3 ng/ml, de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un valor umbral de 5 ng/ml, 10 ng/ml, etc., se puede utilizar de acuerdo con la presente invención cuando se realiza opcionalmente una preselección de las muestras en las que hay que someter a ensayo adicionalmente la razón PCA3/PCA. Los valores umbrales para determinar el estadio o para determinar la agresividad (pronosticando) del cáncer de próstata, se definen a partir de una población de pacientes que tienen cáncer de próstata en diferentes estadios o con una agresividad diferente (puntuación de Gleason) como la señal promedio de polinucleótidos de PCA3 o de fragmentos de los mismos, dividida por la señal promedio de polinucleótidos, polipéptidos o fragmentos de los mismos, de un segundo marcador específico de la próstata (p. ej., PSA), más las desviaciones estándares n (o su señal media promedio) para un estadio específico del cáncer de próstata. Dependiendo de la especificidad y de la sensibilidad deseadas del ensayo y del estadio,

\hbox{grado o volumen concreto del tumor de la
próstata que se va a detectar, se escogerá  un valor umbral
particular.}

Las terminologías "nivel" y "cantidad" se emplean en esta memoria de forma intercambiable cuando hacen referencia a PCA3, a PSA o a otro marcador que se está midiendo.

Una persona experta en la técnica entenderá que se pueden emplear numerosos métodos estadísticos en el contexto de la presente invención, para determinar si el ensayo es positivo o negativo o para determinar el estadio, el grado, el volumen particular del tumor de la próstata o su agresividad.

Variante. El término "variante" se refiere en esta memoria a una proteína o a una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente similar en estructura y actividad biológica a la proteína o al ácido nucleico de la presente invención, para mantener por lo menos una de sus actividades biológicas. Así, con la condición de que dos moléculas posean una actividad común y se puedan sustituir entre sí, se consideran variantes, tal y como se emplea este término en esta memoria, incluso si la composición o la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una molécula no es idéntica a la de la molécula encontrada en la otra secuencia, o si la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos no es idéntica.

Por una "muestra biológica" o una "muestra de un paciente" se entiende cualquier tejido o material obtenido a partir de un ser humano vivo o muerto, que pueda contener los ácidos nucleicos diana de PCA3 y de PSA. Las muestras incluyen, por ejemplo, cualquier tejido o material que pueda contener células específicas para las dianas de PCA3 y de PSA (u otro marcador específico de la próstata), tal como una biopsia de la próstata, orina, semen, lavados vesicales u otros fluidos, tejidos o materiales corporales. La muestra preferida según la presente invención es una muestra de orina recogida después de un examen rectal digital (u otros medios que aumentan el contenido en células de la próstata de la orina). La muestra biológica se puede tratar para romper físicamente el tejido o la estructura celular, liberando de este modo los componentes intracelulares en una solución que puede contener adicionalmente enzimas, tampones, sales, detergentes y similares que se utilizan para preparar la muestra para el análisis. En una realización particular, la muestra es una muestra de orina tomada después de un DRE.

Otros objetos, ventajas y características de la presente invención serán más evidentes después de la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de las realizaciones preferidas de la misma, dadas únicamente a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Habiendo descrito la invención en general, se hace ahora referencia a los dibujos adjuntos, mostrados a modo de ilustración de una realización preferida de la misma y en donde:

La Figura 1 muestra una realización de un principio del ensayo de la presente invención.

La Figura 2 muestra un análisis basado en el gen de PCA3, de sedimentos urinarios después de un DRE extendido. La Figura 2A muestra una representación gráfica de la sensibilidad sobre la especificidad. Los sedimentos urinarios fueron obtenidos después de un DRE extendido de una cohorte de 108 hombres con niveles de PSA sérico >3 ng/ml. La eficacia del diagnóstico del ensayo basado en PCA3 de los sedimentos urinarios se visualiza con una curva característica operativa relativa (ROC). Basándose en esta curva ROC, se determinó un nivel umbral de 200 x 10^{-3}. La Figura 2B muestra los valores de PCA3/PSA obtenidos a partir de los sedimentos urinarios de la Figura 2A, pero resumidos en diagrama de caja. Se observa el valor de la mediana de PCA3/PSA (línea horizontal negra y gruesa), valores atípicos (círculos abiertos) y extremos (estrellas). El valor umbral está indicado por una línea discontinua.

La Figura 3 muestra la importancia del pronóstico con PCA3/PSA. Los sedimentos urinarios fueron obtenidos después de un DRE extendido de una cohorte nueva de 136 hombres con niveles de PSA sérico >3 ng/ml. En un diagrama de caja, los valores de PCA3/PSA obtenidos a partir de estos sedimentos urinarios, se correlacionaron con la puntuación de Gleason. Se mostraron el valor de la mediana de PCA3/PSA (línea horizontal gruesa y negra), valores atípicos (círculos abiertos) y extremos (estrellas). Debido a pequeños ajustes en el ensayo, se determinó un nuevo valor umbral de 132 x 10^{-3} que se indica por una línea discontinua.

La Figura 4 muestra que el comportamiento de PCA3/PSA correlacionado con la puntuación de Gleason. En 49 pacientes, el cáncer fue identificado mediante evaluación histopatológica de las biopsias. En este caso, la distribución de las puntuaciones de Gleason se muestra en los casos en los que el ensayo de PCA3/PSA era positivo positivo/verdadero positivo y en los que el ensayo era negativo, empleando un valor umbral de 132 x 10^{-3} para la razón PCA3/PSA. Los números de los casos están en el eje y.

La Figura 5 muestra una realización de la presente invención en donde se muestra una correlación entre las puntuaciones de Gleason (sin cáncer y puntuaciones 4-9) y la razón media y mediana para los ARNm de PCA3/PSA en biopsias.

La Figura 6 es similar a la Figura 5 salvo que la correlación entre las puntuaciones de Gleason (sin cancer y puntuaciones 4-9) y la razón entre la media y la mediana para los ARNm de PCA3/PSA, se presenta como un gráfico.

La Figura 7 muestra la sensibilidad por grado del método de la presente invención, usando un umbral de PCA3/PSA de 132 x 10^{-3}.

La Figura 8 es similar a la Figura 7 salvo que los resultados se presentan en un gráfico.

La Figura 9 muestra la relación entre el volumen tumoral promedio y las razones particulares de los ARNm de PCA3/PSA (es decir, inferior a 132 x 10^{-3} y superior a 132 x 10^{-3}).

Descripción de realizaciones ilustrativas

Uno de los desafíos principales para los marcadores en el cáncer de próstata es cumplir con los requerimientos de un ensayo diagnóstico que también pronostique el comportamiento clínico del cáncer de próstata. El gen PCA3 se hiperexpresa fuertemente en el cáncer de próstata cuando se compara con las células epiteliales no cancerosas de la próstata, debido a un único mecanismo de regulación de la transcripción. En esta memoria se muestra que las células agresivas son más invasivas y por tanto más susceptibles de movilizarse y filtrarse en el sistema ductal. Además, se ha mostrado de forma inesperada que la razón PCA3/segundo marcador específico de la próstata (p. ej., PSA) esté correlacionada con el volumen del tumor. Por lo tanto, después de un DRE extendido, la razón entre el ARNm de PCA3/PSA se puede correlacionar con el estadio, el grado, el volumen del tumor y de este modo, con la agresividad biológica del cáncer de próstata, posibilitando así un diagnóstico y un pronóstico del cáncer más exactos, así como la prescripción médica de un régimen de tratamiento más apropiado para el paciente.

La Tabla 4 muestra la expresión de PCA3 en la próstata. La Tabla 6 muestra una comparación de la expresión del ARNm de PCA3 en la próstata. La Tabla 7 muestra la correlación entre PCA3/PSA y el estado canceroso del cáncer de próstata.

En una realización, se sometió a ensayo prospectivamente una cohorte nueva de pacientes que ingresaron en la clínica con niveles séricos de PSA elevados (> 3 ng/ml). Los pacientes recibieron una información sobre el estudio y firmaron su consentimiento para entrar en el estudio. Para la determinación histológica, se realizó una biopsia guiada por ultrasonidos para estudiar la presencia o la ausencia de cáncer. En 49 pacientes, el cáncer fue identificado por la evaluación histopatológica de las biopsias. La histología y la razón entre los ARNm de PCA3/PSA obtenidos inmediatamente antes de las biopsias, fueron comparadas.

Asombrosamente, se observó una correlación clara entre la puntuación de Gleason y el nivel de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA (Figuras 3, 5 y 6). Posteriormente, se estudió la distribución de los grados de Gleason en los casos en los que el ensayo era positivo/verdadero positivo y en los que el ensayo era negativo. Los falsos negativos tenían un grado menos significativo que los verdaderos positivos.

La razón entre los ARNm de PCA3/PSA analizada en sedimentos urinarios después de un DRE extendido se muestra, por lo tanto, como un parámetro para el pronóstico y para el tratamiento y el diagnóstico.

A pesar de numerosos avances en estos últimos años, la precisión con la que se puede estadificar y pronosticar a una persona que padece cáncer de próstata, está lejos de ser óptima. Una de las razones es que los marcadores de la próstata PSA y PSM, se expresan en células normales y cancerosas y su expresión tiende a disminuir en los tumores mal diferenciados (que son generalmente los de tipo más agresivo). Por lo tanto, el diagnóstico y el pronóstico se vuelven cada vez menos específicos y sensibles cuando los tumores tienden a estar mal diferenciados (grado de tumor en aumento) e incluso pueden escaparse del diagnóstico.

Por otra parte, PCA3 está fuertemente hiperexpresado en el cáncer de próstata cuando se compara con células epiteliales no cancerosas de la próstata y la expresión de PCA3 está restringida a la próstata, debido a un único mecanismo de regulación de la transcripción (Vearhaegh y col., 2000, J. Biol. Chem. 275:37496-37503). Se expresa de forma diferenciada en células cancerosas y células normales de la próstata, y su expresión no disminuye significativamente con el incremento del grado del tumor. PCA3 podría ser por ello una herramienta útil, que pueda superar los inconvenientes de PSA y de PSM en el

\hbox{diagnóstico, la estadificación y el tratamiento
 de los pacientes del cáncer de próstata.}

Aunque PCA3 ha mostrado ser una herramienta muy específica y sensible para el diagnóstico, su valor como herramienta para el pronóstico y el tratamiento y el diagnóstico, no se había establecido nunca antes de la presente invención. La presente invención muestra que la expresión de PCA3 se correlaciona con la agresividad biológica y por lo tanto se puede utilizar como un marcador para el pronóstico y/o el tratamiento y el diagnóstico. Además, la presente invención establece la utilidad de la razón entre el nivel de expresión de PCA3/PSA como un factor muy eficaz para el pronóstico/tratamiento y diagnóstico. Adicionalmente, los inventores han descubierto que el valor de la razón de la expresión de PCA3/PSA en una muestra, es una herramienta para el pronóstico/tratamiento y diagnóstico muy sensible y específica que se correlaciona con el grado del tumor, el volumen del tumor y la agresividad del cáncer. El uso de los marcadores de la próstata PCA3 y de PSA, y el hecho de que los niveles de expresión de PSA tienden a disminuir con la agresividad del cáncer de próstata, (que aumentaría el valor de la razón, un hecho que todavía se discute en la técnica) contribuyen a la sensibilidad y a la especificidad de los métodos de diagnóstico y de pronóstico de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención describe por primera vez métodos específicos y sensibles para el pronóstico del cáncer de próstata en un paciente, detectando el nivel de expresión (cantidad) de ARN codificado por el gen de PCA3 en relación con el nivel de expresión del ARN codificado por el gen de PSA en una muestra. El valor de la razón entre el nivel de expresión de PCA3/PSA se correlaciona con la presencia o la ausencia de cáncer de próstata y posibilita el establecimiento del estadio o de la agresividad de la enfermedad, para determinar el pronóstico del cáncer. Esto es particularmente útil para determinar el grado de gravedad de la enfermedad, para predecir su evolución y, lo más importante, para elegir inmediatamente el tipo de terapia adecuada para el paciente para incrementar sus posibilidades de recuperación.

Generalmente, la predisposición a desarrollar cáncer de próstata, la presencia de cáncer de próstata o la agresividad del cáncer de próstata, se pueden detectar en los pacientes basándose en la presencia de una elevada cantidad de polinucleótidos de PCA3 en una muestra biológica (p. ej., una muestra de orina después de un DRE) en relación con la cantidad de polinucleótidos de PSA (razón PCA3/PSA). Los cebadores y las sondas de polinucleótidos se pueden utilizar para detectar el nivel de los ARNm que codifican PCA3 y PSA, cuya razón es indicativa de la predisposición, la presencia, la ausencia y la agresividad (estadio) del cáncer de próstata. En general, la expresión elevada de un marcador de PCA3 en relación con un marcador de PSA en una muestra biológica, cuando se compara con muestras testigos normales, indica que la muestra contiene cáncer de próstata o es susceptible de desarrollar cáncer de próstata. En el caso específico en el que la muestra es positiva para cáncer de próstata, el valor de la razón entre los niveles de expresión de PCA3 y PSA se correlaciona con un estadio particular de la progresión o de la agresividad del cáncer de próstata (p. ej., una puntuación concreta de Gleason, volumen del tumor, etc.).

En una realización, los marcadores de PCA3 y de PSA de la presente invención son ácidos nucleicos tales como el ARNm de PCA3 y de PSA o fragmentos de los mismos asociados con el cáncer de próstata. El ácido nucleico de PCA3 puede tener la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:1 ó 2. Sin embargo, la terminología "ácidos nucleicos de PCA3" o similares no está limitada a las secuencias de SEQ ID NO:1 ó 2, o a fragmentos o a complementos de las mismas. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de PCA3 también se encuentran en GenBank® con el número de entrada AF103907. Además, las secuencias que son muy homólogas a tales secuencias, fragmentos o complementos de las mismas, también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. La secuencia de nucleótidos de PSA puede tener la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:38. Por supuesto, se entenderá que porciones o fragmentos de PCA3 y de PSA (p. ej., los ácidos nucleicos de PCA3 y de PSA) se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención y, por tanto, también se consideran marcadores de PCA3 y de PSA.

Un ejemplo no limitativo de un método de diagnóstico y de pronóstico/tratamiento y diagnóstico para el cáncer de próstata comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con al menos un sonda o un cebador de oligonucleótido que se hibrida con el ácido nucleico de PCA3 y detectar un nivel de oligonucleótido que se hibrida con el mismo; (b) poner en contacto la muestra biológica con al menos una sonda o un cebador de oligonucleótido que se hibrida con el ácido nucleico de PSA y detectar un nivel de oligonucleótido que se hibrida con el mismo; y (c) determinar la razón entre el nivel de oligonucleótido que se hibrida con PCA3 y el nivel de oligonucleótido que se hibrida con PSA. El valor de la razón entre PCA3 y PSA detectados se puede comparar con un valor umbral predeterminado y a partir del mismo se puede establecer la predisposición, la presencia, la ausencia y el estadio del cáncer de próstata, así como el volumen aproximado del tumor en el paciente.

En general, el pronóstico de un paciente se determina generalmente como desfavorable (es decir, un cáncer muy agresivo) cuando el valor de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA es superior a 200 x 10^{-3}. Un pronóstico intermedio se refiere a una razón entre los ARNm de PCA3/PSA entre 75 x 10^{-3} y 200 x 10^{-3} y un pronóstico favorable o con poco riesgo se corresponde con un valor de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA entre 0 y 75 x 10^{-3}. Las puntuaciones de Gleason que están asociadas con estas razones son >7; 6-7; y 0-5, respectivamente. Por supuesto los intervalos mencionados anteriormente de los valores de la razón podían diferir dependiendo de la sensibilidad y de la especificidad deseadas del ensayo y del segundo marcador elegido, específico de la próstata. Así, el técnico experto en la técnica podrá utilizar (y adaptar) diferentes valores umbrales o de grado de admisión, dependiendo de los requisitos particulares del ensayo.

En una realización particular, el nivel de polipéptido de un segundo marcador específico de la próstata (p. ej., PSA) se puede utilizar para determinar una razón PCA3/segundo marcador específico de la próstata. Así, un método de diagnóstico, pronóstico y tratamiento y diagnóstico para el cáncer de próstata también puede comprender: (a) poner en contacto una muestra biológica con al menos una sonda o un cebador de oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 y detectar un nivel de oligonucleótido que se hibrida con el mismo; (b) poner en contacto la muestra biológica con al menos un anticuerpo que se hibrida con el polipéptido de PSA y detectar un nivel de polipéptido que se hibrida con el mismo; y (c) determinar la razón entre el nivel de oligonucleótido que se hibrida con PCA3 y el nivel de anticuerpo que se hibrida con el polipéptido de PSA (es decir, determinar la razón entre los niveles de expresión de PCA3/PSA). El valor de la razón entre PCA3 y PSA detectado se puede comparar con un valor umbral predeterminado y de este modo, se puede establecer la predisposición, la presencia, la ausencia y el estadio del cáncer de próstata, así como el volumen aproximado del tumor en el paciente. Por supuesto, y tal y como se ejemplifica más abajo en esta memoria, la razón PCA3/PSA se puede determinar basándose en la detección del ARNm de PCA3 y de PSA.

En otra realización, los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para vigilar la progresión del cáncer de próstata en un paciente. En esta realización particular, los ensayos descritos anteriormente se realizan a lo largo del tiempo y se evalúa la variación de la razón entre el nivel de expresión de los ácidos nucleicos o las proteínas de PCA3 y de PSA presentes en la muestra (p. ej., muestra de orina). El cáncer de próstata se considera generalmente que está progresando cuando la razón entre los niveles de expresión detectados entre PCA3 y de PSA aumenta con el tiempo. En cambio, un cáncer no se considera que está progresando, cuando la razón entre los niveles de expresión de PCA3 y de PSA disminuye o permanece constante a lo largo del tiempo.

En un aspecto relacionado, es posible verificar la eficacia de la amplificación y/o de la detección del ácido nucleico, solamente realizando reacción(ones) como testigo externo, usando ácidos nucleicos diana testigos, altamente purificados añadidos a la mezcla de reacción de la amplificación y/o de la detección. Alternativamente, la eficacia de la recuperación del ácido nucleico a partir de células y/o de elementos celulares, el nivel de inhibición de la amplificación y/o la detección del ácido nucleico (si está presente) se pueden verificar y estimar añadiendo a cada muestra del ensayo, células o elementos celulares testigos (p. ej., un número definido de células procedentes de una línea celular de cáncer de próstata que expresa PCA3 y un segundo marcador), en comparación con reacción(ones) como testigo externo(s). Para verificar la eficacia de ambos, la preparación y la amplificación de las muestras y/o la detección, tales reacción(ones) como testigo externo(s) se pueden realizar usando una muestra del ensayo de referencia o una muestra en blanco adicionada con células, elementos celulares y/o partículas víricas portadoras de la(s) secuencia(s) de ácido nucleico testigo. Por ejemplo, una señal procedente de las secuencias del testigo interno (IC) presentes en las células, los virus y/o los elementos celulares añadidos a cada muestra del ensayo, que es más baja que la señal observada con la(s) reacción(ones) como testigo externo, se puede explicar por la lisis incompleta y/o la inhibición de los procesos de amplificación y/o de detección de una muestra dada del ensayo. Por otra parte, una señal procedente de las secuencias IC que es similar a la señal observada con la(s) reacción(ones) como testigo externo, confirmaría que la preparación de la muestra que incluye la lisis celular, es eficaz y que no hay una inhibición significativa de los procesos de amplificación y/o detección de una muestra dada del ensayo. Alternativamente, la verificación de la eficacia de la preparación de la muestra, sólo se puede realizar usando testigo(s) externo(s) analizado(s) por métodos distintos al ensayo de los ácidos nucleicos (p. ej., análisis usando microscopía, espectrometría de masas o ensayos inmunológicos).

Por lo tanto, en una realización particular, los métodos de la presente invención emplean ácidos nucleicos purificados, células de la próstata o partículas víricas que contienen secuencias de ácido nucleico que sirven como dianas para un testigo interno (IC) en ensayos para estudiar el ácido nucleico para verificar la eficacia de la lisis celular y de la preparación de la muestra, así como el comportamiento de la amplificación y/o de la detección del ácido nucleico. Más ampliamente, el IC sirve para verificar cualquier etapa seleccionada del procedimiento de la presente invención.

El IC en la PCR o en las técnicas de la amplificación relacionadas, puede ser ADN plasmídico muy purificado, superenrollado o linealizado por digestión con una endonucleasa de restricción y purificado de nuevo. Los moldes de IC superenrollado se amplifican con mucha menos eficacia (aproximadamente 100 veces menos) y de una manera menos reproducible que los moldes de ácido nucleico IC linealizados y purificados de nuevo. Por lo tanto, los testigos IC para la amplificación y la detección de la presente invención se preparan preferiblemente con moldes de ácido nucleico de IC linealizado y purificado de nuevo, cuando se emplean tales tipos de IC.

Los ácidos nucleicos, las células y/o los elementos celulares se incorporan en cada muestra del ensayo con la concentración apropiada para obtener una amplificación/detección eficaces y reproducibles del IC, basándose en realizar el ensayo durante la optimización del ensayo. El número óptimo de células testigo añadidas, que es dependiente del ensayo, es preferentemente el número mínimo de células que permite una señal de detección de IC altamente reproducible, sin tener ningún efecto perjudicial significativo sobre la amplificación y/o la detección de otra(s) diana(s) genética(s) del ensayo basado en el ácido nucleico. Una muestra a la que se añaden los ácidos nucleicos linealizados y purificados, las células, las partículas víricas o los elementos celulares, se denomina generalmente una "muestra adicionada".

En determinadas realizaciones, la cantidad de ARNm se puede detectar mediante un ensayo basado en la RT-PCR. En la RT-PCR, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se aplica junto con la transcripción inversa. En tal ensayo, se pueden utilizar por lo menos dos cebadores oligonucleótidos para amplificar una porción del ADNc de PCA3 o de PSA obtenido a partir de una muestra biológica, en donde por lo menos un oligonucleótido es específico (es decir, se hibrida) con un polinucleótido que codifica el ARN de PCA3 o de PSA. Los ADNc amplificados se pueden separar a continuación y detectar usando métodos que son bien conocidos en la técnica, tales como la electroforesis en gel y la tinción con bromuro de etidio. La amplificación se puede realizar sobre muestras biológicas tomadas a partir de un paciente del ensayo y de una persona que no está afectada con cáncer de próstata (muestra testigo), o empleado otros tipos de muestras testigo. La reacción de amplificación se puede realizar con distintas diluciones de ADNc (o directamente con distintas diluciones de la muestra biológica) que incluyen, por ejemplo, dos órdenes de magnitud. Un valor de la razón superior a un valor umbral predeterminado, es indicativo de la presencia, la predisposición a desarrollar cáncer de próstata, o de un estadio específico de progresión (agresividad) del cáncer de próstata. En general, una expresión elevada del ácido nucleico de PCA3 en relación con la expresión del ácido nucleico de PSA en una muestra biológica, en comparación con muestras testigos, indica la presencia o alternativamente, la predisposición a desarrollar cáncer de próstata. Un valor

\hbox{característico de la razón
también es indicativo del estadio y de la agresividad  del cáncer de
próstata detectado.}

En otras realizaciones, los ARNm de PCA3 y de PSA se detectan en un extracto de ácido nucleico procedente de una muestra biológica, mediante un método de amplificación in vitro del ARN, denominado amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). Se han descrito numerosas técnicas de amplificación y se pueden adaptar fácilmente a las necesidades particulares de una persona con conocimientos ordinarios. Ejemplos no limitativos de las técnicas de amplificación incluyen la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), la amplificación basada en la transcripción, el sistema de la replicasa Q\beta y NASBA (documento de patente US 6.124.120; Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6:1197-1202; Malek y col., 1994, Methods MoI. Biol., 28:253-260; y Sambrook y col., 2000, véase más arriba). Otros ejemplos no limitativos de los métodos de amplificación incluyen la amplificación por círculo rodante (RCA); la amplificación mediada con señal con tecnología de ARN (SMART); la reacción de amplificación con división de complejo (SCAR); la amplificación de ARN con división del promotor (SPAR).

La amplificación y/o la detección de las secuencias de ARN de PCA3 y de PSA se pueden realizar simultáneamente (p. ej., ensayos de amplificación en formato múltiple en tiempo real). Alternativamente, las sondas de oligonucleótidos que se hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de PCA3 o de PSA, se pueden utilizar en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos (p. ej., transferencias de tipo Southern y Northern, transferencia de manchas de puntos, transferencia por ranuras, hibridación in situ y similares) para determinar la presencia y/o la cantidad de polinucleótido de PCA3 y de PSA en una muestra biológica.

Alternativamente, los oligonucleótidos y los cebadores se podían diseñar para secuenciar directamente y determinar la presencia de secuencias de PCA3 específicas del cáncer de próstata y de PSA en la muestra del paciente, después de una etapa de amplificación. Tales métodos de diagnóstico basados en la secuenciación están automatizados y se incluyen en la presente invención.

La agresividad de los carcinomas se asocia con un potencial invasivo creciente de las células cancerosas (confirmado por una disminución de la regulación del gen de E-caderina supresor de la invasión, en cáncer de próstata con alto grado de agresividad). Es más probable que estas células invasivas se movilicen e invadan el sistema ductal. La presente invención tiene ventajas por el hecho de que la fracción de células invasivas en el sedimento urinario se incrementará después de un DRE extendido. Por lo tanto, según la presente invención, una muestra preferida que se va a someter a ensayo es orina, obtenida después de un examen rectal digital o de cualquier otro método que permita un aumento del número de células de la próstata en la muestra. Por supuesto, otras muestras tales como semen, orina y semen mezclados y lavados vesicales se pueden utilizar según la presente invención, mientras la muestra contenga suficiente material para permitir la detección de los ácidos nucleicos de PCA3 y de PSA (o de otro segundo marcador específico de la próstata).

Síntesis de ácido nucleico

El ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN) para poner en práctica la presente invención se puede obtener según métodos bien conocidos.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen las obtenidas por clonación, así como las sintetizadas químicamente. De forma similar, un oligómero que se corresponde con la molécula de ácido nucleico, o con cada uno de los fragmentos divididos, se puede sintetizar. Tales oligonucleótidos sintéticos se pueden preparar, por ejemplo, por el método del triéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981) o usando un sintetizador de ADN automatizado.

Un oligonucleótido se puede obtener sintéticamente o por clonación. Si es necesario, los extremos 5' de los oligómeros de pueden fosforilar empleando la quinasa de polinucleótidos T4. La fosforilación de las cadenas sencillas antes de la reasociación o para marcar, se puede conseguir empleando un exceso de la enzima. Si la fosforilación es para marcar la sonda, el ATP puede contener radioisótopos con actividad muy específica. Entonces, el oligómero de ADN se puede someter a reasociación y ligación con la ligasa T4 o una similar. Por supuesto, la marcación de una secuencia de ácido nucleico se puede realizar mediante otros métodos conocidos en la técnica.

Cebadores y sondas

Un experto en la técnica puede seleccionar los cebadores de ácido nucleico según métodos conocidos en la técnica. Las muestras que se van a someter a ensayo incluyen pero no deben ser limitadas a las muestras del ARN procedentes del tejido humano.

En una realización, la presente invención se refiere a cebadores de ácido nucleico y a sondas que son complementarios a una secuencia de nucleótidos que consiste en por lo menos 10 nucleótidos consecutivos (preferiblemente, 12, 15, 18, 20, 22, 25 o 30 [por supuesto, la secuencia podría ser más larga, véase más abajo]) procedentes de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que es al menos idéntica en un 90% a una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en:

(a): una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm de PCA3 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 ó 2;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm de PSA que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:38; y

(c): una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b).

La presente invención se refiere a un ácido nucleico para detectar y cuantificar específicamente, en una muestra, la presencia de secuencias de ácido nucleico de PCA3 que están asociadas con el cáncer de próstata, que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente o al menos un fragmento de las mismas, que se une bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de PCA3. En un aspecto relacionado, la presente invención caracteriza el ácido nucleico para la detección específica y la cuantificación, en una muestra, de la presencia de secuencias de ácido nucleico de PSA, que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente o al menos un fragmento de las mismas que se une, bajo condiciones rigurosas, a los ácidos nucleicos de PSA.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a oligos que se dirigen específicamente hacia la diana y permiten la amplificación (es decir, por lo menos un cebador para cada diana) de las secuencias de ARN de PSA y PCA3 asociadas con el cáncer de próstata.

Las sondas o los cebadores de oligonucleótidos de la presente invención pueden tener cualquier longitud adecuada, dependiendo del formato particular del ensayo y de las necesidades particulares y de las secuencias diana empleadas. En una realización preferida, las sondas o los cebadores de oligonucleótidos tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos (preferiblemente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32...) y pueden estar adaptados para ser especialmente adecuados para un sistema elegido de amplificación de ácidos nucleicos. Las sondas y los cebadores más largos también están dentro del alcance de la presente invención, y son bien conocidos en la técnica. Los cebadores que tienen más de 30, más de 40, más de 50 nucleótidos y las sondas que tienen más de 100, más de 200, más de 300, más de 500 más de 800 y más de 1000 nucleótidos de longitud también están incluidos en la presente invención. Por supuesto, los cebadores más largos tienen la desventaja de ser más costosos y, por ello, los cebadores que tienen entre 12 y 30 nucleótidos de longitud se diseñan y se emplean generalmente en la técnica. Tal y como se conoce bien en la técnica, las sondas en el intervalo de 10 a más de 2000 nucleótidos de longitud, se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. En cuanto al % de identidad descrito anteriormente, los tamaños no descritos específicamente de sondas y de cebadores (p. ej., 16, 17, 31, 24, 39, 350, 450, 550, 900, 1240 nucleótidos,...) también están dentro del alcance de la presente invención. En una realización, las sondas de oligonucleótidos o los cebadores de la presente invención se hibridan específicamente con un ARN de PCA3 (o con su secuencia complementaria) o un ARNm de PSA. Más preferiblemente, los cebadores y las sondas de PCA3 se escogerán para detectar un ARN de PCA3 que esté asociado con el cáncer de próstata. En una realización, las sondas y los cebadores utilizados en la presente invención, no se hibridan con los genes de PCA3 o de PSA (es decir, permite el gen elegido y el ácido nucleico expresado de PCA3 o de PSA). Debido a las similitudes estructurales y de la secuencia del gen de PSA con otros miembros de la familia de genes de la calicreína, la selección apropiada de secuencias de PSA para servir como sondas o cebadores específicos de PSA, es importantes para los métodos de amplificación y/o de detección de los ácidos nucleicos específicos de PSA.

En otra realización, otros marcadores específicos de la próstata se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. Ejemplos útiles de cebadores adecuados para PSA, hK2/KLK2, PSMA, la amplificación y la detección (p. ej., el documento de patente estadounidense nº 6.551.778) son bien conocidos en la técnica, así como los cebadores para la transglutaminasa 4, la fosfatasa ácida y PCGEM1. En una realización, el oligonucleótido de PSA también se puede hibridar con otros miembros de la familia de la calicreína, tales como la calicreína 2 (hK2/hKLK2). Un ejemplo de tales oligonucleótidos es la SEQ ID NO:39. Por supuesto, los oligonucleótidos de PSA que son específicos de PSA (es decir, diseñados para que no se hibriden con otros miembros de la familia de la calicreína) también se pueden utilizar. El experto en la técnica puede determinar fácilmente la especificidad de los cebadores o de las sondas seleccionados

\hbox{realizando
alineaciones/búsquedas por ordenador, usando bases  de datos bien
conocidas (p. ej., GenBank®).}

Tal y como se conoce comúnmente en la técnica, las sondas y los cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar teniendo en consideración el punto de fusión de la hibridación de los mismos con su secuencia diana (véase más abajo y en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª edición, CSH Laboratories; Ausubel y col., 1994, en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y.).

Para permitir que tenga lugar la hibridación bajo las condiciones del ensayo de la presente invención, los cebadores y las sondas de oligonucleótidos deben comprender una secuencia de oligonucleótidos que tenga por lo menos 70% de identidad (por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%), preferiblemente por lo menos 75% (75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%) y más preferiblemente por lo menos una identidad del 90% (90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 100%) con una porción de un polinucleótido de PCA3 o de PSA. Las sondas y los cebadores de la presente invención son los que se hibridan con una secuencia de ácido nucleico (p. ej., ADNc o ARNm) de PCA3 o de PSA, bajo condiciones de hibridación estrictas y los que se hibridan con homólogos del gen de PCA3 y de PSA bajo condiciones al menos moderadamente rigurosas. En determinadas realizaciones, las sondas y los cebadores de la presente invención tienen una identidad de secuencia total con las secuencias de los genes de PCA3 o de PSA (p. ej., ADNc o ARNm). Sin embargo, las sondas y los cebadores que difieren de las secuencias génicas naturales de PCA3 o de PSA que conservan la capacidad de hibridarse con una secuencia natural del gen de PCA3 o de PSA bajo condiciones rigurosas, también se pueden utilizar en la presente invención. Se debe entender que se podrían diseñar fácilmente otras sondas y cebadores y utilizar en la presente invención, basándose en la secuencia de ácido nucleico de PCA3 y de PSA descrita en esta memoria (SEQ ID NOs: 1, 2 y 36), usando los métodos de alineación y de análisis de secuencia por ordenador, conocidos en la técnica (véase, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, editado por Cold Spring Harbor Laboratory, 2000).

Por ejemplo, un cebador se puede diseñar para que sea complementario a un ARN corto de PCA3 que está asociado con un estado canceroso del cáncer de próstata, mientras que un ARN largo de PCA3 está asociado con un estado no canceroso (benigno) del mismo (documento PCT/CA00/01154 publicado con el número WO 01/23550). De acuerdo con la presente invención, el uso de tal cebador con los distintos reactivos necesarios, daría lugar un producto de la amplificación, solamente cuando un ARN corto de PCA3 asociado con el cáncer de próstata, está presente en la muestra. El PCA3 más largo (p. ej., que tiene una secuencia intercalada) no daría lugar a un amplicón. Por supuesto, la amplificación se podría diseñar de modo que se amplifique un ARNm corto de PCA3 (que carece de todos o de la mayoría de los intrones) y uno largo (que tiene al menos un intrón o una parte del mismo). En tal formato, el ARNm largo de PCA3 se podría utilizar como el segundo marcador específico de la próstata.

En otra realización, parejas de cebadores (o sondas) específicas para PCA3 o PSA se podrían diseñar para evitar la detección de los genes de PCA3 o de PSA o de ARNs de PCA3 o PSA sin cortar ni empalmar. Por ejemplo, las secuencias de los cebadores que se van a utilizar en la presente invención, podrían abarcar dos exones contiguos, de modo que no se pudieran hibridar con una unión entre exón/del intrón de los genes de PCA3 o de PSA. El producto de la amplificación obtenido por el uso de tal cebador será un intrón más pequeño entre dos exones elegidos (para ejemplo de tales cebadores y sondas, véanse las Tablas 2 a 4 más abajo). Por lo tanto, no se amplificarían las variantes sin cortar ni empalmar ni el ADN genómico. Una persona experta en la técnica reconocerá que se pueden diseñar numerosas sondas y emplear de acuerdo con una variedad de realizaciones de la presente invención. Esos ensayos se pueden adaptar usando la secuencia de PCA3 y la del segundo marcador específico de la próstata. Por supuesto, se pueden diseñar diferentes parejas de cebadores (y de sondas) a partir de cualquier parte de las secuencias de PCA3 (SEQ ID NOs:1, 2; véanse las Tabla 1-3 para ejemplos no limitativos de los cebadores y de las sondas que se pueden utilizar para amplificar o detectar PCA3). Por supuesto, los cebadores y las sondas también se podían diseñar basándose en la secuencia de PSA mostrada en SEQ ID NO:38 (GenBank® número de entrada M27274), así como en la secuencia de otros miembros de la familia de la calicreína, que son bien conocidos en la técnica, o cualquier otro segundo marcador escogido, específico de la próstata (p. ej., KLK2 (GenBank® número de entrada NM005551), PSMA (GenBank® número de entrada BC025672), transglutaminasa 4 (GenBank® número de entrada BC007003), fosfatasa ácida (GenBank® número de entrada BC016344), PCGEM 1 (GenBank® número de entrada AF223389).

Las sondas de la invención se pueden utilizar con cadenas principales naturales de azúcar fosfato, así como con cadenas principales modificadas que incluyen fosforotioatos, ditionatos, fosfonatos de alquilo y \alpha-nucleótidos y similares. Las cadenas principales de azúcar fosfato modificadas están ilustradas en general por Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295 y Moran y col., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019. Las sondas de la invención se pueden construir a base de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN), y preferiblemente de ADN.

Aunque la presente invención no depende específicamente del uso de un marcador para detectar una secuencia de ácido nucleico concreta, dicho marcador puede ser beneficioso, al incrementar la sensibilidad de la detección. Además, permite la automatización. Las sondas se pueden marcar según numerosos métodos bien conocidos (Sambrook y col., 2000, véase más arriba). Ejemplos no limitativos de marcadores detectables incluyen ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P y ^{35}S, ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables para el uso con sondas, que pueden permitir un aumento de la sensibilidad del método de la invención, incluyen biotina y radionucleótidos. Para un experto en la técnica será evidente que la elección de un marcador particular dicta la manera en la cual se une a la sonda.

Tal y como se sabe en general, los nucleótidos radiactivos se pueden incorporar en las sondas de la invención a través de distintos métodos. Ejemplos no limitativos de los mismos incluyen la fosforilación de los extremos 5' de las sondas, empleando ^{32}P ATP y quinasas de polinucleótidos, empleando el fragmento Klenow de la Pol I de E. coli en presencia de dNTPs radiactivos (p. ej., una sonda de ADN marcada uniformemente usando cebadores oligonucleótidos aleatorios), empleando el sistema SP6/T7 para transcribir un segmento de ADN, en presencia de uno o de varios NTPs radiactivos, y similares.

En una realización, el marcador utilizado en un ensayo de detección homogéneo es un compuesto quimioluminiscente (p. ej., los documentos de patente de EE.UU. nº 5.656.207; 5.658.737 y 5.639.604), más preferiblemente un compuesto de éster de acridinio ("AE"), tal como AE estándar o derivados del mismo. Los métodos para fijar los marcadores a los ácidos nucleicos y para detectar los marcadores, son bien conocidos (p. ej., véase Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), capítulo 10; los documentos de patente de EE.UU. nº 5.658.737, 5.656.207, 5.547.842; 5.283.174 y 4.581.333; y el documento de solicitud de patente europea nº 0 747 706). Los métodos preferidos para marcar una sonda con un compuesto AE fijado a través de un enlazador, se han descrito previamente con detalle (p. ej., véase el documento de patente de EE.UU. nº 5.639.604, véase el Ejemplo 8, del mismo).

La amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada o diana, se puede realizar a través de una variedad de métodos adecuados. Véase en general Kwoh y col., 1990. Am. Biotechnol. Lab. 8:14 25. Numerosas técnicas de amplificación se han descrito y se pueden adaptar fácilmente a las necesidades particulares de una persona experta en la técnica. Ejemplos no limitativos de las técnicas de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, RT PCR, RT-PCR en tiempo real, etc.), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), la amplificación basada en la transcripción, el sistema de replicasa Q\beta y NASBA (Kwoh y col. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 173-1177; Lizardi y col., 1988, Bio Technology 6:1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260; y Sambrook y col., 2000, véase más arriba). Otros ejemplos no limitativos de los métodos de amplificación, se han enumerado anteriormente.

Ejemplos no limitativos de métodos adecuados para detectar la presencia de los productos amplificados, incluyen los siguientes: gel de agarosa o de poliacrilamida, adición de colorante para marcar ADN en la reacción de amplificación (tal como bromuro de etidio, Picogreen®, verde SYBER, etc.) y la detección con un aparato adecuado (fluorómetro en la mayoría de los casos). Otros métodos adecuados incluyen la reacción de secuenciación (manual o automatizada); análisis de restricción (se construyeron sitios de restricción estipulados en las secuencias amplificadas), o cualquier método que implicaba la hibridación con una sonda específica de la secuencia (transferencia de tipo Southern o Northern, sondas TaqMan, moléculas fluorescibles, y similares). Por supuesto, otros métodos de amplificación están incluidos en la presente invención. Las moléculas fluorescibles se ejemplifican en esta memoria como un método para detectar los productos amplificados según la presente invención (véase más abajo).

Por supuesto en algunas realizaciones, la detección directa (p. ej., la secuenciación) de secuencias de PCA3 específicas del cáncer, así como de otro marcador específico de la próstata (p. ej., PSA), en una muestra, se puede realizar usando sondas o cebadores específicos.

En una realización, la presente invención se ha aprovechado de avances tecnológicos en métodos para detectar e identificar ácidos nucleicos. Por lo tanto, la presente invención es adecuada para la detección a través de una de estas herramientas, llamadas moléculas fluorescibles.

Las moléculas fluorescibles son sondas/cebadores monocatenarios para la hibridación de oligonucleótidos monocatenarios que forman una estructura de horquilla. El bucle contiene una secuencia de la sonda que es complementaria a una secuencia diana, y el vástago está formado por la reasociación de las secuencias del brazo complementarias que están localizadas a cada lado de la secuencia de la sonda/del cebador. Un fluoróforo se une covalente al extremo de un brazo y un inhibidor de la fluorescencia se une covalente al extremo del otro brazo. Las moléculas fluorescibles no despiden luz fluorescente cuando están libres en la solución. Sin embargo, cuando se hibridan con una cadena de ácido nucleico que contiene una secuencia diana, experimentan un cambio conformacional que les permite emitir luz fluorescente brillante (véanse los documentos de patente estadounidense 5.925.517 y 6.037.130). Las moléculas fluorescibles se pueden utilizar como sondas/cebadores detectores de un amplicón en pruebas de diagnóstico. Debido a que las moléculas fluorescibles no hibridadas son oscuras, no es necesario aislar los híbridos de sonda-diana para determinar, por ejemplo, el número de amplicones sintetizados durante un ensayo. Por lo tanto, las moléculas fluorescibles simplifican las manipulaciones que se requieren frecuentemente cuando se emplean medios de detección y de identificación tradicionales.

Usando diferentes fluoróforos coloreados, las moléculas fluorescibles también se pueden utilizar en ensayos de amplificación en formato múltiple, tales como ensayos que se dirigen a la amplificación y la detección simultáneas del ácido nucleico de PCA3 y del segundo ácido nucleico específico de la próstata (p. ej., PSA, [GenBank® número de entrada M27274, SEQ ID NO:38] hK2/KLK2 [GenBank® número de entrada NM005551], PSMA [GenBank®, número de entrada BC025672], transglutaminasa 4 [GenBank®, número de entrada BC007003], fosfatasa ácida [GenBank®, número de entrada BC016344], y PCGEM1 [GenBank®, número de entrada AF223389]). El diseño de las sondas/cebadores de las moléculas fluorescibles es bien conocido en la técnica y los programas de ordenador que ayudan a su diseño están disponibles comercialmente (p. ej., diseñador de moléculas fluorescibles de Premier Biosoft International). Las sondas/cebadores de las moléculas fluorescibles se pueden utilizar en una variedad de ensayos de hibridación y de amplificación (p. ej., NASBA y PCR).

De acuerdo con una realización de la presente invención, el producto amplificado se puede detectar directamente, usando moléculas fluorescibles como cebadores para el ensayo de amplificación (p. ej., ensayos NASBA o PCR en formato múltiple en tiempo real) o indirectamente, usando una sonda de molécula fluorescible que está cerca de los sitios de unión de la pareja de cebadores, con una longitud de 18 a 25 nucleótidos (p. ej., 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25) que se hibrida específicamente con el producto de la amplificación. Las sondas o los cebadores de las moléculas fluorescibles que tienen una longitud comprendida entre 18 y 25 nucleótidos, se prefieren cuando se utilizan según la presente invención (Tyagi y col., 1996, Nature Biotechnol. 14:303-308). Fragmentos más cortos podrían dar como resultado una señal menos fluorescente, mientras que los fragmentos más largos frecuentemente no incrementan significativamente la señal. Por supuesto, se podrían emplear también sondas y cebadores más cortos o más largos.

Ejemplos de cebadores del ácido nucleico que se pueden obtener a partir de las secuencias de ARN de PCA3 se muestran más abajo en las Tablas 2-4.

Ejemplos de cebadores del ácido nucleico que se pueden obtener a partir de las secuencias de ARN de PSA (p. ej., SEQ ID NO:11), se muestran a continuación. Otros cebadores de la presente invención se pueden obtener a partir de PSA. Por supuesto, también se pueden utilizar otras variantes bien conocidas en la técnica (documentos de patente estadounidense nº 6.479.263 y 5.674.682) como segundo marcador específico de la próstata. Debido a las similitudes estructurales y de la secuencia del gen de PSA con otros miembros de la familia del gen de la calicreína, la selección apropiada de secuencias de PSA que pueden servir como sondas o cebadores específicos de PSA, es importantes para los métodos de amplificación y/o de detección de ácidos nucleicos específicos de PSA. Ejemplos de cebadores adecuados para la amplificación y la detección de PSA, hK2/KLK2, PSMA (p. ej., documento de patente estadounidense 6.551.778) son bien conocidos en la técnica, así como de la transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1. En una realización, el oligonucleótido de PSA también se puede hibridar con otros miembros de la familia de la calicreína, tales como la calicreína 2 (hK2/hKLK2). Un ejemplo de un oligonucleótido tal, es SEQ ID NO:12.

Se debe entender que las secuencias y los tamaños de los cebadores descritos en las Tablas 2-4 son arbitrarios y que se pueden diseñar muchas secuencias distintas y emplearlas de acuerdo con la presente invención.

Aunque la presente invención se puede realizar sin el uso de una sonda que se dirija a las dianas de las secuencias de PCA3, tales como las uniones entre exones de PCA3, de acuerdo con la presente invención, tales sondas pueden añadir una especificidad adicional a los métodos y a los equipos de reactivos de la presente invención. Ejemplos no limitativos de sondas de ácido nucleico específicas que se pueden utilizar en la presente invención (y diseñar basándose en las secuencias de exones mostradas en la Tabla 2), se exponen en la Tabla 3, más abajo.

Generalmente, un cebador en la reacción de amplificación se hibrida específicamente con una secuencia en un primer exón (o un exón aguas arriba) y el otro cebador utilizado en la reacción de amplificación, se hibrida específicamente con una secuencia en un segundo exón (o un exón aguas abajo), y la sonda se hibrida con una secuencia que abarca la región 3' del primer exón y la región 5' del segundo exón. Es decir, la sonda es específica de una unión exón-exón elegida en una secuencia amplificada, preparada con un ARN empalmado y cortado de PCA3 que carece por lo menos de un intrón entre las secuencias aguas arriba y aguas abajo del exón, con las que se hibridan los cebadores. Los cebadores empleados en la amplificación de las secuencias del ARN empalmado y cortado que contienen una unión exón-exón escogida, se pueden determinar fácilmente usando métodos convencionales, siempre y cuando la región amplificada con la pareja de cebadores, contenga la secuencia de la unión exón-exón o su secuencia complementaria. Cualquier método para la amplificación del ácido nucleico se puede utilizar para amplificar la secuencia que contiene la unión exón-exón elegida y los procedimientos para usar cualquiera entre una variedad de métodos de amplificación bien conocidos, los pueden determinar fácilmente los expertos en la materia.

Las sondas que detectan una unión exón-exón elegida pueden estar marcadas con cualquiera entre una variedad de marcadores, que pueden dar como resultado de forma directa o indirecta, una señal cuando la sonda se hibrida con la secuencia amplificada que contiene la unión exón-exón. Por ejemplo, un marcador puede ser cualquier resto que produzca una señal colorimétrica, luminiscente, fluorescente, radiactiva o enzimática que se pueda detectar empleando métodos bien conocidos en la técnica. Una sonda no se tiene que marcar con un resto de marcador si la unión específica de la sonda con el ácido nucleico amplificado que contiene la unión exón-exón, da como resultado una señal detectable tal como, por ejemplo, un impulso eléctrico detectable.

Ejemplos de combinaciones de parejas de cebadores para la amplificación que amplifican la secuencia de ácido nucleico que incluye una unión exón-exón y las realizaciones de algunas secuencias de la sonda para la unión exón-exón, se muestran en la Tabla 4. Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de las sondas mostradas más abajo, también incluyen las secuencias complementarias de las secuencias mostradas, y las secuencias que incluyen cambios insignificantes en las secuencias específicas mostradas (es decir, cambios que no afectan a la capacidad de una sonda para hibridarse específicamente con la secuencia de la unión exón-exón elegida, bajo condiciones de hibridación convencionales). Además, aunque las secuencias de la sonda se muestran como secuencias de ADN, los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de ARN correspondientes o sus secuencias complementarias se pueden utilizar como sondas. También, los enlaces de la cadena principal de las secuencias de bases de la sonda pueden incluir uno o varios enlaces de ARN convencionales, enlaces de ADN, enlaces mezclados de ARN-ADN, u otros enlaces tales como los enlaces de 2'-O-metilo o enlaces de ácido nucleico y péptido, todos ellos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal y como se muestra en la Tabla 4 (primera columna), la unión exón-exón elegida que se va a detectar, puede unir los exones 1 y 2 (exón 1/exón 2), los exones 1 y 3 (exón 1/exón 3), los exones 2 y 3 (exón 2/exón 3) o los exones 3 y 4 (exón 3/exón 4). Las parejas de cebadores son secuencias situadas en dos exones diferentes que flanquean directa o indirectamente la unión exón-exón elegida (Tabla 4, segunda columna). Así, para una unión exón 1/exón 2, las parejas de cebadores son un cebador específico para una secuencia contenida en el exón 1 y otro cebador específico para una secuencia contenida en el exón 2. Pero para detectar una unión exón 2/exón 3 o una unión exón 3/exón 4, las parejas de cebadores se pueden seleccionar entre más de dos exones diferentes (véase más abajo en la columna 2) siempre y cuando la secuencia amplificada contenga la región de la unión exón-exón elegida. Los cebadores del "exón 4" incluyen cebadores específicos para una secuencia contenida en cualquier secuencia de los exones 4a, 4b, 4c o 4d.

Por supuesto, un experto en la técnica entenderá que se puede diseñar una variedad de sondas adicionales a partir de la misma región u otras regiones de SEQ ID NO:1, así como de SEQ ID NO:2 y 38 y otras secuencias de la presente invención, aunque se dirijan a la diana de las uniones entre exones o no. Se entenderá que los tamaños de las sondas mostradas en las Tablas 2 y 3 son arbitrarios y que se puede diseñar una variedad de secuencias distintas y emplearlas de acuerdo con la presente invención.

Una persona experta en la técnica reconocerá fácilmente que las secuencias de ácido nucleico de la presente invención (p. ej., las sondas y los cebadores) se pueden incorporar en cualquiera de los numerosos formatos establecidos de equipos de reactivos que son bien conocidos en la técnica.

En una realización del método descrito anteriormente, una sonda de ácido nucleico se inmoviliza sobre un soporte sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no están limitados a los mismos, plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, y resinas acrílicas, tales como perlas de poliacrilamida y de látex. Las técnicas para acoplar sondas de ácido nucleico a soportes sólidos, son bien conocidas en la técnica.

Las muestras para ensayo adecuadas para los métodos que escrutan los ácidos nucleicos de la presente invención, incluyen, por ejemplo, células o extractos de ácido nucleico de células, o líquidos biológicos (p. ej., orina). La muestra usada en los métodos descritos anteriormente variará basándose en el formato del ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, las células o los extractos que se van a someter a ensayo. Los métodos para preparar extractos de ácido nucleico a partir de células son bien conocidos en la técnica y se pueden adaptar fácilmente para obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado. Preferentemente, la muestra es una muestra de orina. Cuando se emplea una muestra de orina, esta debe contener por lo menos una célula de la próstata para permitir la identificación de los marcadores específicos de la próstata (p. ej., PCA3 y PSA) de la presente invención. De hecho, asumiendo que la semi-vida del ARNm de PCA3 en una muestra biológica sin tratar, no es adecuada para permitir fácilmente la conservación de la integridad de su secuencia, la muestra recogida, tanto si es orina u otra, debe contener, antes de un tratamiento de la misma, por lo menos una célula de la próstata. Se reconocerá que el número de células en la muestra tendrá un impacto sobre la validación del ensayo y sobre el nivel relativo de PCA3 medido (o de PSA u otro marcador específico de la próstata).

Equipos de reactivos para la detección del ARNm de PCA3 y de PSA

También se describe en esta memoria un equipo de reactivos para diagnosticar el cáncer de próstata de una forma que es sensible y específica (es decir, disminuyendo el número de falsos positivos). Tal equipo de reactivos comprende generalmente un primer medio de recipiente que tiene dispuesto dentro del mismo por lo menos una sonda o un cebador oligonucleótido que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica del cáncer de próstata. En otra realización, el equipo de reactivos comprende adicionalmente en un segundo medio de recipiente, sondas o cebadores oligonucleótidos que son específicos de otro marcador específico de la próstata (p. ej., PSA), de tal modo que permite la determinación de una razón, así como la validación de un resultado negativo con PCA3. En otra realización, el equipo de reactivos comprende adicionalmente en un segundo medio de recipiente, anticuerpos que son específicos de otro marcador específico de la próstata, validando de este modo la presencia de células de la próstata en una
muestra.

En una realización particular, este equipo de reactivos comprende una pareja de cebadores que permite la amplificación de PCA3 y por lo menos un marcador específico de la próstata, seleccionado entre PSA, hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1. En una realización preferida, el marcador específico de la próstata es ácido nucleico de PSA o proteína de PSA. Por supuesto, el equipo de reactivos descrito es esta memoria, también incluye el uso de un tercer marcador específico de la próstata.

Los oligonucleótidos (sondas o cebadores) del equipo de reactivos se pueden utilizar, por ejemplo, en un ensayo de tipo NASBA, PCR o de hibridación. Los ensayos de amplificación se pueden adaptar a una detección en tiempo real de los productos múltiples de la amplificación (es decir, ensayos de amplificación en tiempo real en formato múltiple).

En una realización particular relacionada, el equipo de reactivos descrito en esta memoria, incluye adicionalmente otros recipientes que comprenden componentes adicionales, tales como un oligonucleótido adicional o un cebador y/o uno o varios de los siguientes: tampones, reactivos que se van a utilizar en el ensayo (p. ej., reactivos de lavado, polimerasas o ácido nucleico o células testigo interno u otros) y reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda o de cebadores de ácido nucleico unida. Ejemplos de reactivos de detección incluyen, sin estar limitados a los mismos, sondas radiomarcadas, sondas marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina), y sondas de afinidad marcadas (biotina, avidina o estreptavidina). Por supuesto, la separación o la reunión de los reactivos en el mismo medio de recipiente o en diferentes medios, está dictada según los tipos de métodos de extracción, amplificación o hibridación, y los métodos de detección utilizados, así como otros parámetros que incluyen la estabilidad, la necesidad de conservación, etc. Se entenderá que diferentes permutaciones de los recipientes y de los reactivos anteriores y siguientes, también están incluidas en el equipo de reactivos descrito en esta memoria. El equipo de reactivos también puede incluir instrucciones en relación con cada uno de los posibles diagnósticos, pronósticos, tratamientos y diagnósticos o el uso, correlacionando una razón correspondiente entre el nivel de ARNm de PCA3 y el nivel de ARNm de PSA con un diagnóstico, un pronóstico, un tratamiento y diagnóstico o un uso concretos, así como una información sobre el protocolo experimental que se va a utilizar.

En una realización, los reactivos de detección son sondas de moléculas fluorescibles que se hibridan específicamente con los productos de la amplificación. En otra realización, los reactivos de detección son compuestos quimioluminiscentes tales como éster de acridinio (AE).

Por ejemplo, un equipo de reactivos dividido en compartimentos de acuerdo con el equipo de reactivos descrito en esta memoria, incluye cualquier equipo de reactivos en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Tales recipientes incluyen recipientes pequeños de vidrio, tiras de plástico o de papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficaz de los reactivos desde un compartimento hasta otro compartimento, de tal modo que las muestras y los reactivos no tienen una contaminación cruzada y los agentes o las soluciones de cada recipiente se pueden añadir de forma cuantitativa desde un compartimento a otro. Tales recipientes incluirán un recipiente que aceptará la muestra del ensayo (p. ej., un extracto de ARN procedente de una muestra biológica o de células), un recipiente que contiene los cebadores utilizados en el ensayo, recipientes que contienen enzimas, recipientes que contienen reactivos de lavado y recipientes que contienen los reactivos utilizados para detectar los productos de la extensión. Tal y como se ha mencionado anteriormente, la separación o la combinación de los reactivos puede estar adaptada por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención, según el tipo de equipo de reactivos que se prefiera (p. ej., un equipo de reactivos para diagnóstico basado en métodos de amplificación o de hibridación, o en ambos), los tipos de reactivos utilizados y su estabilidad u otras propiedades intrínsecas. En una realización, un recipiente contiene los reactivos de la amplificación y un recipiente separado contiene el reactivo de la detección. En otra realización, los reactivos de la amplificación y de la detección están contenidos en el mismo recipiente.

Los equipos de reactivos descritos en esta memoria también pueden contener oligonucleótidos que sirven como oligómeros de captura para purificar los ácidos nucleicos diana desde una muestra. Los ejemplos de oligómeros de captura tienen secuencias de por lo menos 15 nucleótidos, complementarios a una porción del ácido nucleico diana de PCA3. Las realizaciones de los oligómeros de captura pueden tener bases adicionales fijadas en un extremo 3' o 5' de la secuencia que es complementaria a la secuencia diana de PCA3, que puede actuar funcionalmente en una etapa de la hibridación para capturar el ácido nucleico diana. Tales secuencias adicionales son preferentemente una secuencia homopolímera de la cola, tal como una secuencia poli-A o poli-T, aunque otras realizaciones de secuencias de la cola están incluidas en los oligómeros de captura de la presente invención. En una realización, la proteína de unión CAP (p. ej., elF4G-4E) o una parte de la misma, se puede utilizar para capturar los ARNm que contienen la estructura de casquete (Edery y col., 1987, Gene 74(2):517-525). En otra realización, se emplea un reactivo de captura no específico (p. ej., perlas de sílice).

Los equipos de reactivos descritos en esta memoria que son útiles para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención, pueden incluir los que incluyan cualquier oligonucleótido de la amplificación y/o sonda de detección descritos en esta memoria, que se envasan de forma combinada entre si. Los equipos de reactivos también pueden incluir oligómeros de captura para purificar el ácido nucleico diana de PCA3 procedente de una muestra, cuyos oligómeros de captura pueden estar envasados junto con los oligonucleótidos de la amplificación y/o las sondas de detección. Finalmente, los equipos de reactivos descritos en esta memoria pueden incluir adicionalmente instrucciones para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención para diagnóstico, tratamiento y diagnóstico y/o pronóstico. Tales instrucciones se pueden referir a detalles relacionados con el protocolo experimental, así como con los valores umbrales que se pueden utilizar.

En otra realización, las células contenidas en muestras de orina de micción obtenidas después de un examen rectal digital atento cuidadoso, se recogieron y se lisaron en un tampón de lisis. Se extrajeron los ácidos nucleicos (p. ej., a partir del material lisado mediante extracción en fase sólida sobre lechos de sílice, por ejemplo). La detección de la presencia de ARN codificado por el gen de PCA3 en el extracto de ácido nucleico, se realiza mediante una amplificación específica in vitro del ARN, acoplada con una detección en tiempo real de productos amplificados mediante las sondas específicas fluorescentes. En este método, simultáneamente a la amplificación del ARN de PCA3 específico del cáncer de próstata, tiene lugar la amplificación del segundo marcador específico de la próstata (tal como el ARN de PSA) como testigo para estudiar la presencia de orina de células de la próstata en la muestra.

Los métodos de detección y de diagnóstico de la invención no requieren que se detecte la secuencia completa de ARN PCA3. Solamente es necesario detectar un fragmento o una longitud de ácidos nucleicos que sea suficiente para detectar la presencia del ácido nucleico de PCA3 procedente de una persona normal o afectada, la ausencia de tal ácido nucleico o una estructura alterada de tal ácido nucleico (tal como un patrón de corte y empalme aberrante). Para este fin, se emplea cualquiera de las sondas o los cebadores tal y como se han descrito anteriormente y muchos más se pueden diseñar tal y como se conoce convencionalmente en la técnica, basándose en las secuencias descritas en esta memoria y otras conocidas en la técnica.

Se debe entender que aunque la cuestión anterior se dirige específicamente a los pacientes humanos, las enseñanzas también se pueden aplicar a cualquier animal que exprese PCA3.

El método de la presente invención también se puede utilizar para vigilar la progresión del cáncer de próstata en pacientes, tal y como se ha descrito anteriormente.

La presente invención se ilustra con mayor detalle con los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos se proporcionan sólo a modo de ilustración y no se deben interpretar como una limitación del alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Las razones entre los ARNm de PCA3/PSA se correlacionan con el grado histológico en la biopsia

Para determinar si la razón entre el nivel de expresión de PCA y PSA es una buena herramienta para el pronóstico y el tratamiento y diagnóstico, se realizó un estudio en \sim150 pacientes que presentaban niveles elevados de PSA en suero (>3 ng/ml), como una indicación para la biopsia guiada con ultrasonidos y la determinación histológica de la presencia/ausencia de cáncer. Los pacientes recibieron la información del estudio y se requirió su consentimiento por escrito para entrar a formar parte del estudio. El cáncer se identificó y se confirmó en 49 pacientes, mediante biopsia guiada y análisis del grado histológico. El número de eventos, con histología en el área de GS (del inglés, "Gleason score"), que se considera ahora la más difícil para determinar la agresividad biológica (38 casos con una GS de la biopsia de 6 y 7).

En los sedimentos urinarios, después de un DRE extendido, la razón entre los ARNm de PCA3/PSA fue evaluada para determinar si esta razón se podía correlacionar con la agresividad biológica. Los niveles del ARNm de PSA eran utilizados para normalizar el ensayo, para corregir el número total de células nuevas de la próstata en la muestra.

En la Figura 3, la razón entre los ARNm de PCA3/PSA se compara con el grado histológico. Hay una correlación clara entre la puntuación de Gleason y el nivel de las razones entre los ARNm de PCA3/PSA, entre GS 5-8. El valor medio de la razón PCA3/PSA en caso de Gleason IV y V es 41, en caso de Gleason VI es 163, en caso de Gleason VII es 193 y en caso de Gleason VIII es 577 (Figura 3). Obsérvese que en los tres casos de GS 9, parece que hay una disminución.

La "distribución" de los grados de Gleason en los casos en los que el ensayo era positivo ("verdadero positivo") y en los que el ensayo era negativo ("falso negativo"), se analizó a continuación (Figura 4). Los resultados muestran que el ensayo de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA que usa los sedimentos urinarios después de un DRE extendido, es significativamente más positivo en los cánceres de grado alto. Este estudio corrobora la hipótesis de que las razones entre el ARNm de PCA3/PSA sirven como un factor pronóstico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

El análisis basado en el gen de PCA3 de sedimentos urinarios tiene valor pronóstico

Una cohorte nueva de aproximadamente 300 pacientes con niveles séricos elevados (>3 ng/ml) fueron sometidos a ensayo tal y como en el Ejemplo 1. Los pacientes recibieron la información del estudio y se requirió su consentimiento firmado para poder entrar a formar parte del estudio. Para la determinación histológica, se realizó una biopsia guiada por ultrasonidos para estudiar la presencia o la ausencia de cáncer. El cáncer se identificó en 108 pacientes mediante la evaluación histopatológica de las biopsias. Comparamos la histología con la razón entre los ARNm de PCA3/PSA obtenida inmediatamente antes de las biopsias.

Tal y como se observa en las Figuras 5-6, se observó una correlación clara entre la puntuación de Gleason (suma) y el nivel de las razones entre el ARNm de PCA3/PSA. Posteriormente, se analizó la distribución de los grados de Gleason, en los casos en los que el ensayo era positivo/verdadero positivo y en los que el ensayo era negativo. La sensibilidad por grado se proporciona empleando un umbral de 132 x 10^{-3}. La sensibilidad para detectar cánceres de grado alto (agresivos) es mayor. Es decir, los falsos negativos tenían un grado significativamente menor que los verdaderos positivos (Figuras 7 y 8).

De cara a lo anterior, se puede concluir que la razón entre los ARNm de PCA3/PSA, analizada en sedimentos urinarios después de un DRE extendido, constituye una herramienta poderosa para el tratamiento y diagnóstico, el diagnóstico y el pronóstico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Análisis detallado de los parámetros histopatológicos y de los resultados del ensayo de PCA3

La expresión del gen de PCA3 es específica de la próstata y está fuertemente incrementada en las células del cáncer de próstata, en comparación con las células no cancerosas de la próstata. Se ha demostrado con éxito que con el análisis basado en el gen de PCA3, se pueden detectar células del cáncer de próstata en sedimentos urinarios, después de un DRE extendido, véase 1 y 2 más arriba. Por lo tanto, PCA3 ha mostrado tener un potencial tremendo para el diagnóstico del cáncer de próstata. Habiéndose demostrado ahora que los tumores más agresivos podrían crecer de una forma más invasiva y difundir más células cancerosas a los conductos prostáticos, también se mostró que el análisis basado en el gen de PCA3, se correlaciona con un aumento de la puntuación de Gleason en biopsias y por lo tanto, tiene potencial como parámetro pronóstico (véanse los Ejemplos 1 y 2, más arriba). En este análisis del subgrupo, los parámetros histopatológicos de las muestras de la prostatectomía radical estaban correlacionados con los resultados del análisis basado en el gen de PCA3.

En un centro clínico, una cohorte de pacientes con cáncer de próstata recibió información y firmó su consentimiento para entrar a formar parte del estudio. 48 de estos pacientes fueron tratados mediante prostatectomía radical. Los parámetros histopatológicos de las muestras de la prostatectomía radical se compararon con la razón entre los ARNm de PCA3/PSA en sedimentos urinarios obtenidos antes de la cirugía. Se compararon todos los parámetros
pronósticos.

Tal y como se observa en la Figura 9, se observó una correlación entre el volumen tumoral total en las muestras de la prostatectomía radical y el nivel de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA.

Por tanto, la razón entre los ARNm de PCA3/PSA tiene un valor pronóstico con respecto el volumen tumoral total en pacientes con cáncer de próstata y, por lo tanto, con el estadio/grado y la agresividad del cáncer de próstata. Al emplear la razón entre los ARNm de PCA3/PSA, es también posible no sólo determinar el grado del tumor, sino también evaluar el tamaño del tumor. Como resultado del análisis de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA, se puede establecer un régimen de tratamiento apropiado adaptado para cada paciente. Además, el uso de la razón entre los ARNm de PCA3/PSA permite pronosticar más exactamente las consecuencias de la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Ensayo cuantitativo con RT-PCR de los ARNm de PCA3 y de PSA Materiales y Métodos Muestras de tejido

Se obtuvieron muestras procedentes de prostatectomía radical en el hospital Canisius Wilhelmina de Nijmegen y del hospital del Centro Médico Universitario de Nijmegen. Las muestras de próstata normal, de BPH y de tumor de próstata se obtuvieron recién recogidas, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se procesaron realizando cortes seriados. A intervalos regulares, se realizó una tinción con hematoxilina y eosina para determinar el porcentaje de células normales, de BPH y de células tumorales en los cortes del tejido. Las puntuaciones de Gleason y la clasificación de TNM de estos tumores se determinaron en el departamento de patología de ambos hospitales. El ARN del total se extrajo a partir de estas muestras de tejido, empleando el método de LiCI-urea (22).

Producción del ARN de PCA3 y de IS-PCA3

El patrón interno (IS-PCA3) se construyó empleando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio in vitro de "GeneEditor" (Promega). Tres sustituciones (TCC a CGT) de las posiciones 416 a 418 del ADNc de PCA3 (GenBank® AF103907) se introdujeron en la estructura artificial del ADNc de PCA3 (pMB45). Las mutaciones fueron confirmadas mediante un análisis de la secuencia de ADN.

El ADN plasmídico linealizado de pMB45 y del mutante de pMB45 servían como molde para las reacciones de transcripción in vitro, usando la polimerasa de ARN T3 (Roche Diagnostics). Los ARNs producidos in vitro se trataron con ADNasa-I, se purificaron mediante extracción con fenol, se precipitaron y se disolvieron en agua tratada con pirocarbonato de dietilo. La concentración y la integridad de los ARNs se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa, usando patrones de ARN. Los ARNs se almacenaron en partes alícuotas a -70ºC.

Reacción de la transcriptasa inversa

El ARN de PCA3 y el ARN de IS-PCA3 producidos in vitro, así como el ARN del tejido se emplearon como moldes para la síntesis del ADNc usando el equipo de reactivos para la síntesis de ADNc monocatenario (Amersham Biosciences). Los ARNs de PCA3 y de IS-PCA3 se diluyeron en 0,2 mg/ml de ARNt de E. coli (Roche Diagnostics) que se había utilizado como solución portadora del ARN. Para la preparación de una curva de calibración extendida, se mezclaron 5 x 10^{3} copias de ARN de IS-PCA3 con una cantidad variable (50 a 1 x 10^{7} copias) del ARN de PCA3. Para la determinación de PCA3 en una muestra de tejido, el ARN total se mezcló con 5 x 10^{3} copias del ARN de IS-PCA3. Las mezclas de ARN se calentaron durante 10 minutos a 65ºC, seguido de enfriamiento rápido sobre hielo. Al ARN se añadieron 0,2 \mug de cebador universal oligo-d(T)_{18}, DTT 2 mM y 5 \mul de una mezcla de reacción a granel de la primera hebra (Amersham Biosciences) con un volumen final de la reacción de 15 \mul. Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37ºC y las muestras de ADNc obtenidas se calentaron durante 5 minutos a 95ºC.

Amplificación con PCR

Para las amplificaciones con PCR, se emplearon los cebadores siguientes, específicos de PCA3: directo 5'-TGG
GAAGGACCTGATGATACA-3' (SEQ ID NO:40, nucleótidos 97-108 del exón 1 del ADNc de PCA3, GenBank® nº AF 103907 e inverso 5'-CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3' (SEQ ID NO:41, nucleótidos 459-477, que abarca los exones 3 y 4 del ADNc de PCA3). El cebador inverso estaba biotinilado. Se amplificaron cinco microlitros de la muestra de ADNc en una reacción PCR de 100 \mul que contenía: cebador inverso 0,133 \muM, cebador inverso biotinilado 0,065 \muM, cebador directo 0,2 \muM, desoxinucleótidos trifosfatos 250 mM (Roche Diagnostics), 2 unidades de polimerasa Super Taq (HT Biotechnology LTD) en tampón que contenía cloruro de magnesio 1,5 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 8,3), cloruro potásico 50 mM y 0,1% de Triton X-100. Sobre las mezclas de reacción se puso una capa de aceite mineral y se realizó el termociclado en un Thermal Cycler® (PerkinElmer Lifesciences Inc.) del modo siguiente: 95ºC durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto; seguido por una extensión final a 72ºC durante 10 minutos.

Ensayo de hibridación

Los productos de la PCR obtenidos se purificaron eliminando el aceite mineral. Diez microlitros de cada uno de los productos de la PCR se añadieron a un pocillo de una placa de microtitulación revestida con estreptavidina (InnoTrac Diagnostics) por triplicado. Cincuenta microlitros del tampón de ensayo DELFIA® que contenía NaCl 1,5 M, se añadieron a cada pocillo. Los productos biotinilados de la PCR fueron capturados en el pocillo revestido con estreptavidina durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación lenta. Las muestras se lavaron tres veces con la solución de lavado de DELFIA®. Los productos bicatenarios de la PCR fueron desnaturalizados usando 100 \mul de una solución de NaOH 50 mM, durante 5 minutos a temperatura ambiente, con agitación lenta. Las muestras se lavaron tres veces con la solución de lavado de DELFIA® para eliminar las hebras de ADN desnaturalizadas, no unidas. La sonda de detección de PCA3 (30 pg/\mul) marcada con Eu^{3+} (SEQ ID NO:42 5'(modC) _{20}CACATTTCCAGCCCCT-3') y la sonda de detección de IS-PCA3 (30 pg/\mul) marcada con Tb^{3+} (SEQ ID NO: 435'(modC)_{20}CACATTCGTAGCCCCT-3') se añadieron a cada pocillo en solución de tampón del ensayo de DELFIA® que contenía NaCl 1,5 M y 5 g/l de leche en polvo desnatada. Las sondas de detección se hibridaron con las hebras de ADN capturadas de PCA3 y de IS-PCA3 durante 2,5 horas a 37ºC. Las muestras se lavaron seis veces con la solución de lavado de DELFIA® a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron a cada pocillo 200 \mul de solución de potenciación de DELFIA®. El Eu^{3+} libre forma rápidamente un quelato altamente fluorescente y estable con los componentes de la solución de potenciación de DELFIA® (Eu^{3+}). Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación lenta, se hizo un recuento de la señal fluorescente obtenida a partir de los quelatos Eu^{3+}, con un contador 1420 Victor® Multilabel. A continuación, se añadieron 50 \mul de una solución de potenciador de DELFIA® (Tb^{3+}) a cada pocillo, para formar un quelato altamente fluorescente con Tb^{3+}. Después de incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente, cont agitación lenta, se midió la señal fluorescente obtenida a partir de los quelatos Tb^{3+}. Todos los reactivos de DELFIA y el recuento con el contador 1420 Victor Multilabel, se obtuvieron a partir de PerkinElmer Life Sciences.

Análisis estadístico

Usando el "Paquete estadístico para ciencias sociales" (SPSS), los datos se resumieron en una curva característica operativa relativa (ROC) para visualizar la eficacia de PCA3 como marcador. En esta curva la sensibilidad (verdaderos positivos) fue trazada sobre el eje Y, frente a la especificidad 1 (falsos positivos) sobre el eje X. En esta curva, todos los valores observados fueron considerados como valores umbrales arbitrarios. El área bajo la curva (AUC) y su intervalo de confianza del 95% (Cl) se calcularon como una medida para la eficacia discriminatoria del marcador sometido a ensayo. Si el marcador no tiene un valor discriminatorio, el valor de AUC está próximo a 0,5. En este caso, el AUC estará próximo a la diagonal en la curva. Si un marcador tiene un fuerte poder discriminatorio, la curva ROC estará próxima a la esquina superior izquierda (AUC está próxima a 1).

Las Figuras 2A y B muestran que la razón PCA3/PSA es un marcador potente y validado para el diagnóstico del cáncer de próstata.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Determinación cuantitativa basada en la fluorescencia con resolución temporal del ARNm de PCA3: una herramienta sensible para el pronóstico del cáncer de próstata

Para los materiales y los métodos, véase el Ejemplo 4.

Optimización del ensayo de hibridación

Los productos biotinilados de la PCR de PCA3 o de IS-PCA3 se utilizaron para optimizar las condiciones de reacción del ensayo de hibridación. Para ambas dianas y sus sondas de hibridación, las mejores señales fluorescentes con razones elevadas entre la señal y el ruido de fondo, se obtuvieron después de 150 minutos de incubación, a 37ºC en presencia de NaCl 1,5 M y 5 g/l leche en polvo desnatada. El cloruro sódico se utilizó para mejorar la hibridación y la función de la leche en polvo desnatada era bloquear la señal de fondo no específica. Con estas condiciones rigurosas, la mejor eficacia del ensayo de hibridación fue obtenida usando 30 pg/\mul de cada sonda.

Para verificar la posibilidad de hibridación cruzada entre las dianas y las sondas, se emplearon de 1 x 10^{2} hasta 1 x 10^{7} moléculas de ARN de PCA3 o de IS-PCA3 como moldes en la RT-PCR. Los productos biotinilados de la PCR se hibridaron a continuación con ambas sondas. Solamente después de la amplificación de 1 x 10^{6} moléculas de ARN de IS-PCA3, la sonda de PCA3 mostraba una ligera reactividad cruzada (0,1%) con la diana de IS-PCA3. Bajo estas condiciones optimizadas, la sonda de IS-PCA3 no mostraba una reactividad cruzada detectable con la diana de PCA3. La reactividad cruzada ligera de la sonda de PCA3 es debida a la estabilidad de las bases mal emparejadas. La unión de la sonda de PCA3 a la diana de IS-PCA3 es más estable que la unión de la sonda de IS-PCA3 con la diana de PCA3.

Amplificación con PCR

La mejor eficacia de la amplificación con PCR se obtuvo usando 0,2 \muM de cada cebador. Ylikoski (1999) ha mostrado que un gran exceso de cebador inverso biotinilado, competía con el producto biotinilado de la PCR por los sitios de unión a la estreptavidina (23). Por lo tanto, se utilizó una cantidad reducida de cebador inverso biotinilado para evitar una etapa de dilución de los productos de la amplificación, antes del ensayo de hibridación y para obtener una detección fiable de los productos de la amplificación. Para una amplificación óptima con la PCR, se empleó un cebador inverso sin marcar 0,133 \muM, un cebador inverso biotinilado 0,065 \muM, y un cebador directo 0,2 \muM.

Para determinar la eficacia de la amplificación de las dianas de PCA3 y de IS-PCA3, se amplificaron 5 x 10^{3} moléculas del ARN de PCA3 o del ARN de IS-PCA3 mediante RT-PCR, durante diferentes cantidades de ciclos de amplificación. Raeymaekers (1993) mostraba que la eficacia de la PCR se basaba en la ecuación para el crecimiento exponencial: log Nc= log Ni + c[log(1+f)], en donde Nc es la cantidad de producto generado después de c ciclos de amplificación, Ni es la cantidad inicial de diana, c es el número de ciclos de amplificación y f es la eficacia de la amplificación (24). Cuando el log Nc se representa gráficamente frente al número de ciclos de amplificación, entonces la pendiente de la curva iguala el log(1+f). Si la eficacia de la amplificación es la misma para las dianas de PCA3 y de IS-PCA3, entonces la pendiente de ambas curvas es la misma. Tanto PCA3 (f=0,63) e ISPCA3 (f=0,64) se transcribieron de forma inversa y se amplificaron con eficacias idénticas (datos no mostrados). Esto se confirmó cuando se representó gráficamente el log de la razón PCA3/IS-PCA3 frente al número de ciclos de amplificación. Se generó una línea horizontal que indicaba que la eficacia de la amplificación es la misma para ambas dianas (datos no mostrados).

La sensibilidad y el intervalo analítico del ensayo basado en PCA3, pueden estar afectados por la cantidad de ARN de IS-PCA3 que se añade a cada muestra. Por ejemplo, si la cantidad de patrón interno amplificado con cantidades variables de PCA3 es demasiado alta, no se pueden ampliar de forma suficiente cantidades pequeñas de ARN de PCA3, mediante RT-PCR para generar una señal detectable. Por lo tanto, la sensibilidad de la técnica se vuelve limitada. Lo mismo es válido para la amplificación mediante RT-PCR también de una cantidad demasiado pequeña de ARN de IS-PCA3 en presencia de una concentración elevada de ARN de PCA3. Por lo tanto, la interferencia entre la amplificación de las dianas de PCA3 y de IS-PCA3 se estudió mediante la amplificación con RT-PCR de cantidades variables de ARN de PCA3 con una cantidad constante de ARN de IS-PCA3. Las señales fluorescentes obtenidas para 5 x 10^{3} o 5 x 10^{4} moléculas de IS-PCA3 seguían siendo constantes después de la co-amplificación con 1 x 10^{2} hasta 5 x 10^{5} moléculas de PCA3. Solamente después de la co-amplificación con más de 1 x 10^{6} moléculas de PCA3, se redujeron ligeramente las señales fluorescentes de IS-PCA3 y de PCA3 (datos no mostrados). Este fenómeno es debido a la competición de ambas moléculas diana durante la PCR, así como a la fase de saturación de la reacción PCR. Estos datos indican que se pueden emplear ambas concentraciones de IS-PCA3 para la co-amplificación de PCA3, para obtener un intervalo lineal amplio para la cuantificación de PCA3. Cuando se co-amplificaron cantidades variables de IS-PCA3 con una cantidad constante de PCA3, se obtuvieron resultados similares (los datos no mostrados).

Límite de detección y capacidad de reproducción

Para determinar la sensibilidad y la linealidad de la técnica cuantitativa propuesta con RT-PCR, para la detección y la cuantificación del ARN de PCA3, se generó una curva de calibración. Se mezclaron cantidades variables de moléculas de ARN de PCA3 (en el intervalo de 50 hasta 1 x 10^{7} moléculas de ARN de PCA3) con 5 x 10^{3} copias de ARN de IS-PCA3. Tal y como se ha mostrado antes, ésta era la cantidad menor de IS-PCA3 que permitía un intervalo amplio lineal para la cuantificación de PCA3. Además, la ligera reactividad cruzada (0,1%) de la sonda de PCA3 con más de 5 x 10^{5} copias de IS-PCA3, se podía evitar, usando esta cantidad de IS-PCA3. La señal de fondo se definió como la señal obtenida cuando no estaba presente el ARN de PCA3 o el ARN de IS-PCA3. El límite de detección de este ensayo cuantitativo con RT-PCR, se determinó como dos veces la media de la señal de fondo. En este ensayo cuantitativo con RT-PCR, el límite de detección se correspondía con 50 copias de ARN de PCA3 usando 35 ciclos de amplificación con PCR. Puesto que la fase de saturación tenía el mismo efecto sobre ambas dianas (tal y como se ha expuesto anteriormente), se obtuvo una curva de calibración con un intervalo lineal amplio, que se extendía desde 50 hasta 1 x 10^{7} moléculas de ARN de PCA3 (datos no mostrados).

La capacidad de reproducción del ensayo con RT-PCR basado en PCA3 se estableció comparando cuatro curvas de calibración independientes. La serie de diluciones de las dianas de PCA3 y de IS-PCA3, la transcripción inversa, los ensayos con PCR y de hibridación de estas cuatro curvas de calibración, se prepararon y se analizaron con cuatro ensayos independientes. Tal y como se puede concluir por la curva de calibración combinada (datos no mostrados), la capacidad de reproducción global dentro del ensayo es buena con coeficientes de variación mediana (CV) del 6% (intervalo: 2-25%).

Cuantificación de la expresión del ARNm de PCA3 en muestras de tejido

El ensayo descrito de RT-PCR basado en PCA3 se utilizó para evaluar la utilidad potencial de PCA3 como marcador diagnóstico para el cáncer de próstata. La especificidad de PCA3 para la próstata se determinó midiendo el número de copias de ARN de PCA3 en el ADNc obtenido a partir de varios tejidos normales de la mama, la vejiga, el duodeno, el corazón, el hígado, el pulmón, el riñón, la próstata, la vesícula seminal, la piel, el estómago, los testículos y leucocitos de sangre periférica. Todas las muestras, excepto la de la próstata, eran negativas para PCA3 (datos no mostrados), lo que concordaba con los datos publicados anteriormente (20; 21).

A continuación, se determinó la expresión del ARN de PCA3 en las siguientes muestras de tejido; BPH (n=8), próstata normal (n=4), tumor de próstata que contiene un número igual o menor que el 10% de células de cáncer de próstata (n=13) y tumor de próstata que contiene más del 10% de células de cáncer de próstata (n=27), para evaluar la utilidad de PCA3 como un marcador tumoral de la próstata. No había diferencia en la expresión del ARN de PCA3 entre el tejido no canceroso de la próstata y el tejido de BPH y, por lo tanto, ambos se incluyeron en el grupo de testigos sin cáncer. En los tumores de próstata que contenían más del 10% de células de cáncer de próstata, el aumento mediano de la expresión de PCA3 era de 66 veces más (mediana, 158,4 x 10^{5}; intervalo, 7,0 x 10^{5}- 994,0 x 10^{5}) comparado con la expresión de PCA3 en testigos sin cáncer (mediana, 2,4 x 10^{5}; intervalo 0,2 x 10^{5}-10,1 x 10^{5}) (Tabla 4). Incluso en los tumores de próstata que contenían menos del 10% de células de cáncer de próstata, el aumento de la expresión de PCA3 era de once veces (mediana 25,3 x 10^{5}; intervalo 6,6 x 10^{5} - 166,0 x 10^{5}), comparado con la expresión en testigos sin cáncer. En 7 muestras humanas de prostatectomía radical, la expresión de PCA3 en las áreas del tumor, se comparó con la expresión de PCA3 en tejido de la próstata no neoplásico adyacente, de los mismos pacientes. Usando el ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en PCA3, se observó en estos tumores de próstata un aumento de la expresión de PCA3 desde 6 hasta 1500 veces más, comparada con la del tejido no neoplásico adyacente de la próstata (Tabla 6).

Para la determinación de la eficacia potencial para el diagnóstico del ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en PCA3, se realizó una curva característica operativa relativa (ROC) (datos no mostrados). El área bajo la curva (AUC) era 0,98 (95% de intervalo de confianza, 0,94-1,01), indicando que el ensayo basado en PCA3 es muy específico y tiene un fuerte valor de diagnóstico.

Discusión

La RT-PCR es actualmente el método utilizado más ampliamente para la detección de una pequeña cantidad de células neoplásicas en un fondo amplio de células normales. En estos últimos años, los ensayos de RT-PCR se han desarrollado para identificar células del cáncer de próstata empleando el ARNm de PSA y el ARNm de PSMA como las dianas empleadas de forma más común en esta técnica (25; 26; 26-29). Muchos de estos ensayos con RT-PCR eran cualitativos, lo que significa que proporcionaban una información con respecto a la presencia o la ausencia de estas dianas en los productos de la reacción con PCR. Como todos los ensayos con PCR, la RT-PCR es un ensayo extremadamente sensible. Sin embargo, después de la introducción del método de la RT-PCR anidada, los transcritos de PSA y de PSMA también fueron detectados en leucocitos de sangre periférica, obtenida a partir de donantes sanos (30; 31). Esto indica que los transcritos basales de los genes específicos de la próstata que podían estar presentes con niveles de fondo bajos, en células que no eran de la próstata, podrían dar como resultado una señal falsa positiva si la sensibilidad de la técnica de RT-PCR llegara a ser demasiado alta. La expresión del ruido de fondo de numerosos genes que antes se consideraban específicos del tejido o del tumor, ha contribuido al amplio intervalo de sensibilidad y especificidad entre los resultados de los estudios con RT-PCR. Estos resultados contradictorios se pueden atribuir a la falta de uniformidad entre los protocolos utilizados para la RT-PCR. La expresión de fondo de los genes específicos del tejido, no invalida su uso clínico. Sin embargo, implica que es necesario el desarrollo de técnicas más cuantitativas de RT-PCR para obtener resultados más reproducibles y fiables.

En la detección y el análisis de los productos de la RT-PCR, la transferencia de tipo Southern seguida de hibridación con sondas de oligonucleótidos radiactivos específicos, dominaba el campo de los ensayos de hibridación hace dos décadas. Aunque es sensible, esta técnica es cualitativa y requiere mucho tiempo. En la última década, ha habido una transición hacia alternativas no radiactivas, debido a los peligros para la salud y a los problemas asociados con el uso y la eliminación de radioisótopos.

Una de las nuevas tecnologías en el campo de la RT-PCR, es la detección en tiempo real con PCR de ácidos nucleicos en un tubo cerrado (32; 33). Esta técnica disminuye el riesgo de contaminación y también simplifica el análisis ya que no se requieren las etapas de hibridación después de la PCR. Por otra parte, se puede analizar simultáneamente una gran cantidad de muestras. El método utilizado de forma más extendida es la generación de una curva de calibración a partir de una serie de diluciones de plásmidos linealizados, que contienen el inserto de ADNc de interés. Esta serie de diluciones se amplifica en la misma serie que las muestras. Aunque su uso es muy generalizado, esta vía puede tener un impacto sobre la precisión del ensayo. Las muestras de ARN pueden ser más propensas a variaciones en la eficacia de la amplificación, que son debidas a los inhibidores presentes en la muestra transcrita de forma inversa, comparada con la amplificación del ADN plasmídico (34). Debido a la introducción de variaciones principales en la etapa de transcripción inversa, el número de copias obtenidas después de una RT-PCR en tiempo real, puede que no refleje el número de copias en la muestra antes de la síntesis del ADNc. El uso de un patrón interno exógeno en la curva de calibración y en las muestras corregirá cualquier diferencia que pueda tener lugar durante la síntesis del ADNc y podría superar este problema. Sin embargo, en los ensayos con PCR en tiempo real no se puede emplear un patrón interno competitivo tal. La diana y el patrón interno competirán por los reactivos de la PCR. Si existe una diferencia superior a diez veces existe entre la diana y el patrón interno, entonces la especie menos abundante no se amplificará suficientemente para la detección. Esto es debido a que la diana más abundante consumirá la mayoría de los reactivos de la PCR, especialmente los cebadores (34; 35). Para corregir estas variaciones de muestra-a-muestra en la PCR en tiempo real, se amplifica mediante RT un ARN celular, simultáneamente con el ARN diana. Los denominados genes de mantenimiento se emplean como patrones internos endógenos y la expresión de estos genes no debe variar en los tejidos o en las células durante la investigación o debido a un tratamiento experimental. Estos ARNs se tienen que expresar también casi al mismo nivel que el ARN diana. El número de copias de ARN diana se normaliza a continuación con la expresión del ARN del gen de mantenimiento abundante. Los rARNs pueden ser útiles como patrones internos puesto que están generados por una polimerasa distinta (36). Por lo tanto, sus niveles de expresión probablemente no variarán bajo condiciones que afecten a la expresión de los ARNs (37). Sin embargo, los rARNs se expresan a niveles muy superiores que el ARN diana. Por lo tanto, la normalización del ARN diana poco abundante con el gen de mantenimiento abundante (p. ej., rARN de 18 unidades Svedberg (S)) puede ser difícil. Este rARN 18S es muy abundante comparado con los transcritos del ARNm diana. Esto dificulta la resta exacta del valor de la línea de base en el análisis de los datos de la RT-PCR en tiempo real (38). Para superar estos problemas, Nurmi desarrolló un patrón interno similar a la diana, no competitivo y exógeno para un ensayo cuantitativo en tiempo real de PSA (34). Omitiendo el IS del análisis del ARNm de PSA usando PCR en tiempo real, se obtuvo como resultado una subestimación de 172 veces la cantidad de ARN de PSA en una muestra. Además, usando sondas marcadas con lantánido en lugar de las sondas convencionales con TaqMan®, eran capaces de detectar dos dianas distintas, incluso cuando la diferencia en sus cantidades de partida es de cien veces. Debido a la razón superior entre señal e interferencia, el límite de detección se pudo incrementar diez veces. Usando las sondas y los marcadores normales de TaqMan® con fluorescencia que decae rápidamente o de golpe, el límite de detección era 1000 copias de ARNm diana, mientras que la detección basada en lantánidos era capaz de detectar 100 copias del ARNm de PSA. Aunque este desarrollo sigue estando en fase de investigación y todavía no hay un instrumental disponible para la PCR en tiempo real para la detección de la fluorescencia resuelta en el tiempo, esta vía es una gran mejora de la PCR en tiempo real para cuantificaciones verdaderas de ARNm expresados a bajo nivel.

En una realización, se decidió no emplear la PCR en tiempo real para la cuantificación, debido a los problemas descritos anteriormente, en la corrección para la preparación de muestra-a-muestra y la cuantificación exacta. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo con RT-PCR cuantitativo, basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo para PCA3. Actualmente, la fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) se considera una de las técnicas no radiactivas más sensibles que permiten para distinguir entre la señal fluorescente rápida de corta duración, obtenida a partir del fondo de muestras biológicas y el tiempo de disminución de la fluorescencia de larga duración de las sondas de lantánido. La medición de la señal fluorescente del lantánido no tiene lugar hasta que transcurre un tiempo determinado desde el momento de la excitación. Durante este retardo, la señal fluorescente rápida de breve duración desaparece, lo que explica la alta sensibilidad de esta técnica (39). Ylikoski combinó ambas técnicas en su ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo para PSA (23; 40). Esto proporcionó una detección sensible, cuantitativa y lineal del ARNm de PSA en muestras biológicas. El ensayo cuantitativo descrito con RT-PCR basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo para PCA3, se basa en el principio que han utilizado.

Tal y como se ha expuesto anteriormente, el problema más desafiante asociado con la RT-PCR es la determinación de la cantidad de partida del ARN diana. Para la cuantificación de PCA3, una cantidad constante de patrón interno de ARN exógeno se añadió a cada muestra y a cada uno de los calibradores que cubrían el intervalo amplio lineal desde 50 hasta 1 x 10^{7} copias de ARN de PCA3. Este IS-PCA3 solamente contenía una diferencia de 3 pb en relación con el ARNm de PCA3. El patrón interno se añadió a la muestra antes de la síntesis del ADNc. Por lo tanto, puede corregir variaciones durante el procedimiento completo del ensayo, desde la transcripción inversa hasta la detección de los productos de la amplificación mediante el ensayo de hibridación. Hemos mostrado que ambas dianas se co-amplificaron igualmente debido a su semejanza de tamaño y de secuencia. La pequeña diferencia en la secuencia permitió la construcción de dos sondas específicas para la hibridación, para la detección de PCA3 y de IS-PCA3. Las condiciones de la hibridación se han optimizado para evitar hibridaciones cruzadas entre las sondas y sus dianas. Hemos mostrado que las dos dianas se detectaron selectivamente con las sondas en el ensayo de hibridación. Las sondas estaban marcadas con dos lantánidos diferentes, europio y terbio. Los picos agudos de la emisión y los diferentes tiempos de disminución del Eu^{3+} y Tb^{3+}, permiten la detección simultánea de ambos analitos en un pocillo de microtitulación. Para determinar la cantidad de partida del ARNm de PCA3 en una muestra, la razón entre la fluorescencia de PCA3/IS-PCA3 obtenida a partir de la muestra, fue comparada con las razones obtenidas a partir de los calibradores. Este ensayo de hibridación basado en TRF con marcador doble, en placas de microtitulación, permite la cuantificación del ARNm de PCA3 en un gran número de muestras, solamente con un conjunto aislado de doce calibradores. Por otra parte, la capacidad de reproducción del ensayo es buena, con unos coeficientes de variación mediana (CV) del 6% (intervalo 2-25%). Usando este método, se pueden detectar hasta 50 copias de PCA3, cuando se co-amplifican con cien veces más (5000 copias) de patrón interno. Esto no habría sido posible con la técnica convencional de la PCR en tiempo real, puesto que una diferencia de más de diez veces entre la diana y el patrón interno, conduciría a una amplificación insuficiente de las especies menos abundantes. La sensibilidad de esta técnica gana importancia en la determinación del diagnóstico, cuando se tienen que detectar pequeñas cantidades de la secuencia de interés. El método cuantitativo descrito de la RT-PCR basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo, es cuantitativo, más sensible, más rápido y más sencillo que el análisis convencional basado en la transferencia de tipo Southern y la hibridación de la membrana.

El ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo descrito en esta memoria para PCA3, mostraba que PCA3 se expresaba exclusivamente en la próstata. Esto concordaba con los datos publicados anteriormente (20; 21). Este ensayo cuantitativo con RT-PCR obtuvo valores AUC-ROC de 0,98 para PCA3. Esto muestra la gran capacidad de discriminación de este transcrito para diferenciar entre tejidos de la próstata cancerosos y no cancerosos. Bussemakers y sus colaboradores encontraron una hiperexpresión de 10-100 veces más de PCA3 en áreas del tumor, comparadas con el tejido de la próstata no neoplásico adyacente, basándose en análisis de transferencia de tipo Northern. Usando este ensayo cuantitativo basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo, mostramos que la expresión de PCA3 en áreas tumorales de las muestras de prostatectomía radical de 7 pacientes, se incrementaba de 6 a 1500 veces más, comparada con el tejido no neoplásico adyacente de la próstata. En el grupo no compatible de muestras del tejido, se observó un aumento de la expresión de PCA3 con una mediana de 66 veces más en los tumores de la próstata que contenían más del 10% de células tumorales. La mediana del incremento de la expresión de PCA3 de once veces más en las muestras de tejido de la próstata que contienen menos del 10% de células tumorales, indica que el ensayo de PCA3 es capaz de detectar algunas células cancerosas en un fondo en el que predominan las células no cancerosas. Estos datos estaban en concordancia con los datos obtenidos a partir del ensayo con PCR en tiempo real desarrollado recientemente (21).

Los datos combinados y el hecho de que PCA3 no se expresa en los leucocitos (presentes frecuentemente en los líquidos corporales), indican que el ensayo cuantitativo con RT-PCR para PCA3, es una gran promesa como herramienta de diagnóstico. Como tal, se podría aplicar en la detección de células cancerosas de la próstata en la sangre, la orina o semen, obtenidos a partir de pacientes de los que se sospecha que tienen cáncer de próstata. Recientemente, esta hipótesis fue sometida a ensayo por Hessels (Eur. Urol. 2003, véase más arriba) empleando el ensayo molecular descrito en esta memoria, para analizar sedimentos urinarios después de un examen rectal digital a fondo de la próstata. Los datos combinados mostraban que la determinación cuantitativa de los transcritos de PCA3 en sedimentos urinarios obtenidos después de un masaje exhaustivo de la próstata, tiene una especificidad elevada (el 83%) comparada con el PSA del suero (el 20%) para la detección del cáncer de próstata. Por otra parte, el valor predictivo negativo de este ensayo era del 90%. Por lo tanto, tiene un gran potencial en la reducción del número de biopsias.

En esta memoria se ha desarrollado un ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en la fluorescencia, resuelta en el tiempo, muy sensible, con un intervalo amplio de detección lineal desde 50 a 1 x 10^{7} copias de PCA3. En este ensayo, el patrón interno exógeno, similar a la diana controla las variaciones muestra-a-muestra procedentes de la síntesis del ADNc para el ensayo de hibridación. Este ensayo ha mostrado que PCA3 puede discriminar mucho entre los tejidos cancerosos y los no cancerosos de la próstata. Recientemente mostramos que este ensayo cuantitativo con RT-PCR es aplicable a la detección de células del cáncer de próstata en sedimentos de la orina. Así, los estudios en múltiples centros que emplean ensayos con PCA3 validados, pueden proporcionar la primera base de la utilidad de los diagnósticos moleculares en la práctica clínica urológica.

La eficacia potencial para el diagnóstico del ensayo basado en PCA3 se determinó midiendo cuantitativamente los transcritos de PCA3 en muestras de próstata no cancerosas y cancerosas. Antes de la reacción de transcripción inversa, el ARN total obtenido a partir de muestras de tejido de la próstata normal y con cáncer, se mezclaron con un patrón interno de ARN exógeno, similar a PCA3. Este patrón interno corrige las variaciones durante todo el procedimiento del ensayo. Después de la co-amplificación con RT-PCR de PCA3 y del patrón interno, las muestras se inmovilizaron sobre pocillos de microtitulación revestidos con estreptavidina. Cada diana se hibridó con una sonda específica, marcada con europio o terbio. La fluorometría resuelta en el tiempo se utilizó para la medición de estos quelatos de lantánido, altamente fluorescentes. La cuantificación de las copias del ARNm de PCA3 en una muestra, se determinó a partir de una curva de calibración que cubría el intervalo amplio lineal desde 50 hasta 1 x 10^{7} copias de PCA3.

Los tumores de la próstata mostraban un incremento de 66 veces en la expresión de PCA3 (mediana 158,4 x 10^{5} copias/\mug de ARN del tejido) cuando se comparaban con el tejido benigno de la próstata (mediana 2,4 x 10^{5} copias/\mug de ARN del tejido). Este aumento de la expresión se encontró en más del 95% de las muestras de cáncer de próstata estudiadas. Los datos presentados en esta memoria revelaban que las muestras de tejido que contenían menos del 10% de células cancerosas, se podían discriminar exactamente de las muestras no cancerosas. Por lo tanto, parece factible la detección de una pequeña fracción de células del cáncer de próstata en un fondo de células normales. La eficacia del diagnóstico del ensayo basado en PCA3, se visualizó en una curva de la característica operativa relativa. El área bajo la curva de 0,98 (95% de CI:0,94-1,01) confirmaba el gran poder discriminatorio de este ensayo. El ensayo cuantitativo con RT-PCR para PCA3 descrito, es una gran promesa como herramienta para ser utilizada en el pronóstico del cáncer de próstata (y el diagnóstico).

Recientemente, se ha identificado una variedad de genes específicos de la próstata, tales como el antígeno de la membrana específico de la próstata (PSMA) (12), NKX3.1 (13), el antígeno de la célula pluripotencial de la próstata (PSCA) (14), el gen-1 inductor del tumor de la próstata (PTI-1) (15), PCGEM-1 (16), PDEF (17), TMPRSS2 (18) y Prostase (19). Sin embargo, los diagnósticos basados en la expresión de estos genes específicos de la próstata, no han sido descritos. Además, el candidato más prometedor para un ensayo de detección para diagnóstico sigue siendo el gen de PCA3 específico de la próstata, puesto que su expresión está restringida a la próstata y la expresión está muy incrementada en más del 95% de los cánceres de próstata primarios (20; 21). Para demostrar adicionalmente la utilidad potencial de PCA3 como marcador de diagnóstico para el cáncer de próstata, se desarrolló un ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en la fluorescencia, resuelta en el tiempo (empleando un patrón interno exógeno y una curva de calibración externa). La sensibilidad y la especificidad de este ensayo cuantitativo con RT-PCR basado en la fluorescencia resuelta en el tiempo, para PCA3, se validaron usando un panel amplio de muestras de próstata normales y cancerosas bien caracterizadas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Cebadores del ácido nucleico de PCA3

2

\newpage

\global\parskip0.980000\baselineskip

TABLA 3 Sondas de ácido nucleico de PCA3

1000

TABLA 4

4

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Expresión del ARNm de PCA3 en muestras de próstata normal, de BPH y de tumor de próstata

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Comparación de la expresión del ARNm de PCA3 con próstata no cancerosa

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

9

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

1. Jensen O M, Esteve J, Moller H, Renard H. Cancer in the European Community and its member states. Eur J Cancer 1990; 26:1167-256.

2. Beduschi M C, Oesterling J E. Percent free prostate-specific antigen: the next frontier in prostate-specific antigen testing. Urology 1998; 51:98-109.

3. Brawer M K, Chemer M P, Beatie J, Buchner D M, Vessella R L, Lange P H. Screening for prostatic carcinoma with prostate specific antigen. J Urol 1992; 147:841-5.

4. Catalona W J, Smith D S, Ratliff T L, Dodds K M, Coplen D E, Yuan J J y col. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med 1991; 324:1156-61.

5. Brawer M K. Prostate-specific antigen. Semin Surg Oncol 2000; 18:3-9.

6. Nixon R G, Brawer M K. Enhancing the specificity of prostate-specific antigen (PSA): an overview of PSA density, velocity and age-specific reference ranges. Br J Urol 1997; 79 Suppl 1:61-7:61-7.

7. Polascik T J, Oesterling J E, Partin A W. Prostate specific antigen: a decade of discovery-what we have learned and where we are going. J Urol 1999; 162:293-306.

8. Kamoi K, Babaian R J. Advances in the application of prostate-specific antigen in the detection of early-stage prostate cancer. Semin Oncol 1999; 26:140-9.

9. Nixon R G, Brawer M K. Enhancing the specificity of prostate-specific antigen (PSA): an overview of PSA density, velocity and age-specific reference ranges. Br J Urol 1997; 79 Suppl 1:61-7:61-7.

10. Ukimura O, Durrani O, Babaian R J. Role of PSA and its indices in determining the need for repeat prostate biopsies. Urology 1997; 50:66-72.

11. Mettlin C J, Murphy G P, Ho R, Menck H R. The National Cancer Data Base report on longitudinal observations on prostate cancer. Cancer 1996; 77:2162-6.

12. Murphy G P, Barren R J, Erickson S J, Bowes V A, Wolfert R L, Bartsch G y col. Evaluation and comparison of two new prostate carcinoma markers. Free-prostate specific antigen and prostate specific membrane antigen. Cancer 1996; 78:809-18.

13. Xu L L, Srikantan V, Sesterhenn I A, Augustus M, Dean R, Moul J W y col. Expression profile of an androgen regulated prostate specific homeobox gene NKX3.1 in primary prostate cancer. J Urol 2000; 163:972-9.

14. Gu Z, Thomas G, Yamashiro J, Shintaku I P, Dorey F, Raitano A y col. Prostate stem cell antigen (PSCA) expression increases with high gleason score, advanced stage and bone metastasis in prostate cancer. Oncogene 2000; 19:1288-96.

15. Sun Y, Lin J, Katz A E, Fisher PB. Human prostatic carcinoma oncogene PTI-1 is expressed in human tumor cell lines and prostate carcinoma patient blood samples. Cancer Res 1997; 57:18-23.

16. Srikantan V, Zou Z, Petrovics G, Xu L, Augustus M, Davis L y col. PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Oct. 24; 97(22):12216-21 2001; 97:12216-21.

17. Oettgen P, Finger E, Sun Z, Akbarali Y, Thamrongsak U, Boltax J y col. PDEF, a novel prostate epithelium-specific ets transcription factor, interacts with the androgen receptor and activates prostate-specific antigen gene expression. J Biol Chem 2000; 275:1216-25.

18. Lin B, Ferguson C, White J T, Wang S, Vessella R, True L D y col. Prostate-localized and androgen-regulated expression of the membrane-bound serine protease TMPRSS2. Cancer Res 1999; 59:4180-4.

19. Nelson P S, Gan L, Ferguson C, Moss P, Gelinas R, Hood L, Wang K. Molecular cloning and characterization of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate-restricted expression. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:3114-9.

20. Bussemakers M J, van Bokhoven A, Verhaegh G W, Smit F P, Karthaus H F, Schalken J A y col. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res 1999; 59:5975-9.

21. de Kok J B, Verhaegh G W, Roelofs R W, Hessels D, Kiemeney L A, Aalders T W y col. DD3(PCA3), a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors. Cancer Res 2002; 62:2695-8.

22. Auffray C, Rougeon F. Purification of mouse immunoglobulin heavy-chain messenger RNAs from total myeloma tumor RNA. Eur J Biochem 1980; 107:303-14.

23. Ylikoski A, Sjoroos M, Lundwall A, Karp M, Lovgren T, Lilja H, Iitia A. Quantitative reverse transcription-PCR assay with an internal standard for the detection of prostate-specific antigen mRNA. Clin Chem 1999; 45:1397-407.

24. Raeymaekers L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Anal Biochem 1993; 214:582-5.

25. Grasso Y Z, Gupta M K, Levin H S, Zippe C D, Klein E A. Combined nested RT-PCR assay for prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in prostate cancer patients: correlation with pathological stage. Cancer Res 1998; 58:1456-9.

26. Ferrari A C, Stone N N, Eyler J N, Gao M, Mandeli J, Unger P y col. Prospective analysis of prostate-specific markers in pelvic lymph nodes of patients with high-risk prostate cancer. J Natl Cancer Inst 1997; 89:1498-504.

27. Goldman H B, Israeli R S, Lu Y, Lerner J L, Hollabaugh R S, Steiner M S. Can prostate-specific antigen reverse transcriptase-polymerase chain reaction be used as a prospective test to diagnose prostate cancer? World J Urol 1997; 15:257-61.

28. Katz A E, de Vries G M, Begg M D, Raffo A J, Cama C, O'Toole K y col. Enhanced reverse transcriptase-polymerase chain reaction for prostate specific antigen as an indicator of true pathologic stage in patients with prostate cancer. Cancer 1995; 75:1642-8.

29. Katz A E, Olsson C A, Raffo A J, Cama C, Perlman H, Seaman E y col. Molecular staging of prostate cancer with the use of an enhanced reverse transcriptase-PCR assay. Urology 1994; 43:765-75.

30. Smith M R, Biggar S, Hussain M. Prostate-specific antigen messenger ARN is expressed in non-prostate cells: implications for detection of micrometastases. Cancer Res 1995; 55:2640-4.

31. Lintula S, Stenman U H. The expression of prostate-specific membrane antigen in peripheral blood leukocytes. J Urol 1997; 157:1969-72.

32. Bustin S A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000; 25: 169-93.

33. Bernard P S, Wittwer C T. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem 2002; 48:1178-85.

34. Nurmi J, Wikman T, Karp M, Lovgren T. High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature hybridization assay. Anal Chem 2002; 74:3525-32.

35. Gibson U E, Heid C A, Williams P M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 1996; 6:995-1001.

36. Paule M R, White R J. Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 2000; 28:1283-98.

37. Barbu V, Dautry F. Northern blot normalization with a 28S rRNA oligonucleotide probe. Nucleic Acids Res 1989; 17:7115.

38. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple intenal control genes. Genome Biol 2002; 3:RESEARCH0034.

39. Soini E, Lovgren T. Time-resolved fluorescence of lanthanide probes and applications in biotechnology. CRC Crit Rev Anal Chem 1987; 18:105-54.

40. Ylikoski A, Karp M, Lilja H, Lovgren T. Dual-label detection of amplified products in quantitative RT-PCR assay using lanthanide-labeled probes. Biotechniques 2001; 30:832-6, 838, 840.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Hessels, Daphne

\hskip1cm

Verhaegh, Gerald

\hskip1cm

Schalken, Jack A.

\hskip1cm

Witjes, Alfred J.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Razones del ARNm en sedimentos urinarios y/o orina como marcador para el pronóstico y/o del tratamiento y diagnóstico del cáncer de próstata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 11957.124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150>

\vskip0.400000\baselineskip

<151>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn, versión 3.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2037

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1472)..(1472)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, c, g ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1517)..(1517)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, c, g ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1563)..(1563)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, c, g ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3582

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip0,8cm

16

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaagcac aaaaggaagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctgcccat cctttaagg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgatacagag gaattacaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgatacag aggaattaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaatggcag gggtgagaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagcacag agatccctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attttgttca aagacccttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagagctac tcaggaccag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttgaact gatgctcata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagctggc atcagaaaaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagctggc atcagaaaaa cagaggggag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagctggc atcagaaaaa cagaggggag atttgtgtgg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaggggtg agaaataaga aaggctgctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaaggctg ctgactttac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagaagaaa tagcaagtgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagaagaaa tagcaagtgc cgagaagctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagaagaaa tagcaagtgc cgagaagctg gcatcagaaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacagaggaa ttacaacaca tatacttagt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtgagaaa taagaaaggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacctgatg atacagagga attac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaattac aacac

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgatacag aggaattaca acac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgatacag aggtgagaaa taag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaggtgag aaataagaaa ggc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatacagagg tgagaaataa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatacagagg tgagaaataa gaaaggctgc tgac

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaggggtg agaaataag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcaatggca ggggtgag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcaatggca ggggtgagaa ataagaaagg ctgctgac

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacaaaagg aagcacagag atccctggga g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacagagat ccctgggag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacagagga cccttcgtg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagcacaa aaggaagcac agagatccct ggg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética (PSA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggaggat gaaacaggct gtgccga

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética (PSA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcattccca accctggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens (PSA)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip0,8cm

19

\hskip0,8cm

20

\hskip0,8cm

21

22

\newpage

\hskip0,8cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcattccca accctggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggaaggac ctgatgatac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estructura artificial sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagggatc tctgtgctt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = (modC)20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ncacatttcc agcccct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = (modC)20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ncacattcgt agcccct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Un método para pronosticar el cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende:

(a): evaluar la cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en dicha muestra biológica;

(b): determinar un valor de la razón entre dicha cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y dicha cantidad de PSA; y

(c): comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado, es indicativo de mayor riesgo de mortalidad por cáncer de próstata, que comparado con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica se selecciona entre el grupo consistente en: orina, resecciones del tejido de la próstata, biopsias del tejido de la próstata, semen o lavados vesicales.

3. El método según la reivindicación 2, en donde dicha muestra biológica es una muestra de orina obtenida después de un examen rectal digital.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha cantidad de PSA es la cantidad de ARNm de PSA.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a): poner en contacto una muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata;

(b): poner en contacto dicha muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm de PSA;

(c): determinar la cantidad de ARNm de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de ARNm de PSA presentes en dicha muestra biológica;

(d): determinar un valor de la razón entre dicha cantidad de ARNm de PCA3 y dicha cantidad de ARNm de PSA;

(e): comparar dicho valor de la razón entre dicha cantidad de ARNm de PCA3 y dicha cantidad de ARNm de PSA, con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata más agresivo, que comparado con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado que es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata menos agresivo.

6. Un método para determinar el volumen tumoral de un cáncer de próstata en una muestra biológica que comprende:

(a): evaluar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en una muestra;

(b): determinar un valor de la razón entre dicha cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y dicha cantidad de PSA;

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado, es indicativo de un volumen tumoral mayor del cáncer de próstata, que comparado con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

(a): evaluar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en dicha muestra biológica en un primer momento;

(c): repetir las etapas (a) y (b) empleando una muestra biológica procedente de dicho paciente en un momento posterior; y

(d): comparar el valor de la razón obtenido en la etapa (b) con el valor de la razón obtenido en la etapa (c),

en donde un valor superior de la razón en la etapa (b) comparado con el valor de la razón obtenido en la etapa (c), es indicativo de la progresión del cáncer de próstata y de un volumen tumoral mayor a lo largo del tiempo.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

(a): poner en contacto una muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata;

(b): poner en contacto dicha muestra biológica con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PSA;

(c): determinar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de ácido nucleico de PSA presentes en dicha muestra biológica;

(d): determinar un valor de la razón entre dicha cantidad de ácido nucleico de PCA3 y dicha cantidad de ácido nucleico de PSA; y

(e): repetir las etapas (a) hasta (d) en un momento posterior; y

(f): comparar el valor de la razón obtenido en la etapa (d) con el valor de la razón obtenido en la etapa (e),

en donde un valor de la razón superior en la etapa (e) comparado con el valor de la razón obtenido en la etapa (d), es indicativo de la progresión del cáncer de próstata a lo largo del tiempo.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde se utiliza una reacción de amplificación para determinar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata.

10. El método según la reivindicación 9, en donde dicha reacción de amplificación se selecciona entre el grupo consistente en:

(a): reacción en cadena de la polimerasa (PCR);

(b): ensayo de amplificación basada en ácidos nucleicos (NASBA);

(c): amplificación mediada con transcriptasa (TMA);

(d): reacción en cadena de la ligasa (LCR); y

(e): amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA).

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y dicho ácido nucleico de PSA se determinan empleando un ensayo de hibridación.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata se evalúa empleando al menos un oligonucleótido que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de PCA3 seleccionada entre el grupo consistente en:

(a): una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:1;

(b): una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:2; y

(c): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de (a) o de (b).

13. El método según la reivindicación 12, en donde la cantidad de dicho PSA se evalúa empleando al menos un oligonucleótido que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de PSA seleccionada entre el grupo consistente en:

(a): una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO:38; y

\newpage

(b): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de (a).

14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6, 7 y 12, en donde se evalúa la cantidad de proteína PSA contenida en dicha muestra biológica.

15. El método según la reivindicación 14, en donde se emplea un anticuerpo para evaluar dicha cantidad de proteína PSA.

16. Un método para la estadificación de un cáncer de próstata en una muestra biológica de un paciente que comprende:

(a): evaluar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y la cantidad de PSA en dicha muestra biológica;

(c): comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado; y

(d): correlacionar un valor de la razón con un estadio específico del cáncer de próstata,

en donde un valor de la razón superior a un valor umbral predeterminado, indica un estadio más avanzado del cáncer de próstata que comparado con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado, determinando de este modo el estadio del cáncer de próstata.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende adicionalmente determinar la puntuación de Gleason de una muestra de la próstata procedente de dicho paciente y correlacionar dicho valor de la razón PCA3/PSA y dicha puntuación de Gleason con un riesgo de mortalidad asociado con dicha enfermedad.

18. El método según la reivindicación 17, en donde dicho valor de la razón PCA3/PSA y dicha puntuación de Gleason se correlacionan con una predicción de la eficacia de un medicamento, las consecuencias para el paciente y/o un pronóstico del riesgo de enfermedad.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en donde dicha muestra biológica se obtiene a partir de un paciente que está en tratamiento de cáncer de próstata, entre dicho primer momento y dicho momento posterior, vigilando de este modo el efecto de dicho tratamiento sobre el crecimiento tumoral del cáncer o la progresión del cáncer de próstata.

20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 17 a 19, que comprende:

(a): realizar un ensayo para amplificar in vitro el ácido nucleico sobre una muestra biológica de dicho paciente o un extracto de la misma, empleando una primera pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específico del cáncer de próstata y una segunda pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico de PSA;

(b): cuantificar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 y dicha secuencia de ácido nucleico de PSA; y

(c): calcular una razón normalizada entre PCA3 y PSA, en donde dicha razón se puede correlacionar con un nivel de ARNm de PCA3 y un nivel de ARNm de PSA en dicho paciente,

en donde dicha razón normalizada entre PCA3 y PSA se correlaciona positivamente con un grado o un estadio del cáncer de próstata.

21. El método según la reivindicación 20, en donde dicha razón normalizada es superior a aproximadamente 200 x 10^{-3}, entre aproximadamente 75 x 10^{-3} y aproximadamente 200 x 10^{-3}, o entre aproximadamente 0 y aproximadamente 75 x 10^{-3}.

22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho valor umbral se selecciona entre 132 x 10^{-3} y 200 x 10^{-3}.

23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 20 y 21, que comprende adicionalmente el uso de un valor umbral de 3 ng/ml de proteína PSA sérica.