ES2340266T3 - Kit de analisis para cd14 humana de bajo peso molecular y anticuerpo. - Google Patents

Abstract

Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular, sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende: (a) un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2; y (b) un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17a a la posición de 26a del SEQ ID NO: 5; donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene rasgos característicos siguientes; (1) no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. Acceso FERM BP-7296), (2) muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y (3) se puede obtener de sangre humana.

Description

Kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular y anticuerpo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a un péptido que tiene una secuencia especifica de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos para CD14 humana de elevado peso molecular.

Además, la presente invención se refiere a un kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular y un método de medición de la misma. Por otra parte, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico novedoso de la sepsis en el que se determina directamente CD14 humana bajo peso molecular.

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Técnica anterior

Una molécula CD14 fue nombrada como una proteína identificada por una familia de anticuerpos que reconocen las glicoproteínas expresadas en la superficie de la membrana de los monocitos en la Tercera Conferencia de Tipificación de Leucocitos, 1986. En 1990, Wright et al. dilucidaron que la molécula de CD14 es un receptor de LPS, endotoxina ("Science", vol. 249, págs. 1431-1433, 1990). La molécula de CD14 es una glucoproteína que tiene un peso molecular de 53-55 kDa, y los análisis de ADNc revelaron que el ARNm de 1,4 KB tiene una secuencia codificante de 356 aminoácidos ("Nucleic Acids Research" (U.K.), vol. 16, págs. 4173, 1988).

Se informó de que las moléculas de CD14 humanas incluyen moléculas de CD14 soluble además de moléculas de CD14 unidas a membrana y la sangre contiene moléculas de CD14 soluble que tienen diferentes pesos moleculares ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 23, págs. 2144-2151, 1993). Además, Landmann, et al. realizaron análisis de transferencia Western de CD14 soluble en el suero de pacientes que sufrían sepsis e informaron de que CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa se encontraba a altos niveles en pacientes no supervivientes a la sepsis y en pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), y que en sueros normales, no se detectó esta molécula, pero se detectó CD14 soluble de 49 kDa, un peso molecular ligeramente menor que el anterior ("The Journal of Infectious Disease", vol. 171, págs. 639-644, 1995).

Stelter informó de que la diferencia en las cadenas de azúcar que participan en los subtipos que tienen diferentes pesos moleculares y dos subtipos de CD14 soluble que tienen diferentes pesos moleculares se encuentran en la sangre, incluso después de la eliminación de las cadenas de azúcar unidas a N y a O ("European Journal of Biochemistry" (Alemania), vol. 236, págs. 457-464, 1996). Además, Bufler et al. llevaron a cabo el análisis C-terminal de CD14 soluble e informaron de que un grupo GPI se une a un residuo serina en la posición 327 de CD14 soluble y que una molécula de CD14 soluble que tiene un peso molecular de aproximadamente 56 kDa es una de las especies moleculares a las que no está anclada GPI ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 25, págs. 604-610, 1995).

Los anticuerpos contra las moléculas de CD14 incluyen muchos anticuerpos anti-CD14, que se han elaborado y utilizado en la identificación de proteínas CD14, tales como MEM-18 preparado por Bazil et al. ("European Journal of Immunology" (Alemania), vol. 16, págs. 1583-1589, 1986), RoMo-1 preparado por Shutt et al. ("Allergie und Immunologie" (Alemania), vol. 34, págs. 17-26, 1988), y 3C10 preparado por Steinman et al. ("Journal of Experimental Medicine" (EE.UU.), vol. 158, págs. 126-145, 1983).

Además, los sistemas de análisis para CD14 solubles que utilizan los anticuerpos han sido referidos por Shutt et al. (DE-286876-A), Bazil et al. ("Molecular Immunology" (Reino Unido), vol. 26, págs. 657-662, 1989), y Grünwald et al. ("Journal of Immunological Methods" (Holanda), vol. 155, págs. 225-232, 1992), permiten el análisis de la CD14 soluble en fluidos corporales humanos.

Además, se han comercializado kits de ELISA para CD14 soluble de IBL-Hanburg, Medgenix, y R & D Systems, y se ha realizado el análisis de CD14 soluble de muchas enfermedades tales como la sepsis ("Clinical Immunology and Immunopathology" (EE.UU.), vol. 80, págs. 307-310, 1996, Y "Rinshokensa", vol. 38, págs. 341-344, 1994).

Sin embargo, se constató que CD14 soluble no es un marcador especifico de la sepsis debido a los incrementos en los niveles de las moléculas de CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa y 49 kDa (de informe a informe, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a alrededor de 55 kDa y 49 kDa, y lo mismo se aplicará en la siguiente descripción) en función del grado en el que transcurren las enfermedades, incluso en enfermedades salvo la sepsis ("Infection and Immunity" (EE.UU.), vol. 67, págs. 417-420, 1999; "Clinical and Experimental Immunology" (U.K.), vol. 120, págs. 483-487, 2000; "Clinical Experimental Immunology" (U.K.), vol. 96, págs. 15-19, 1994). Además, se espera que la CD14 soluble sea un indicador de la gravedad de la sepsis. Sin embargo, la CD14 soluble no se ha proporcionado como un producto para el diagnóstico de la sepsis, debido a la no correlación con el choque séptico ("Pediatric allergy and inmunology") (Dinamarca), vol. 8, págs. 194-199, 1997) y también la no correlación con el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ("European Journal of Clinical Investigation" (U.K.), vol. 28, págs. 672-678, 1998).

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Los autores de la presente invención han descubierto la presencia de una molécula de CD14 soluble con un bajo peso molecular de aproximadamente 36 kDa en la sangre, además de otras como los dos tipos de moléculas de CD14 soluble descritas anteriormente de alrededor de 55 kDa y 49 kDa referidas por Landmann et al. (CD14 elevado peso molecular (de informe a informe, los pesos moleculares son diferentes y no se limitan a alrededor de 55 kDa y 49 kDa, y lo mismo se aplicará en la siguiente descripción). Los autores de la presente invención han encontrado también la presencia de una pequeña cantidad de CD14 de bajo peso molecular en los individuos normales y de una mayor cantidad de CD14 de bajo peso molecular en pacientes que sufren sepsis. En consecuencia, los autores de la presente invención han validado la eficacia clínica del análisis en una CD14 soluble de bajo peso molecular. Sin embargo, los anticuerpos anti-CD14 conocidos en la técnica son los que reconocen una proteína CD14 soluble de elevado peso molecular o los que reconocen las proteínas CD14 solubles tanto de alto como de bajo peso molecular. Así pues, no se ha conocido en la técnica un anticuerpo que reconozca sólo una CD14 de bajo peso molecular. Además, se ha considerado que la secuencia de aminoácidos de la proteína CD14 de bajo de peso molecular es idéntica a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína CD14 soluble de elevado peso molecular, de manera que se considera que es difícil la preparación de un anticuerpo como se ha descrito antes y un análisis inmunológico directo de CD14 de bajo peso molecular, utilizando el anticuerpo. Por lo tanto, como análisis para CD14 soluble de bajo peso molecular, existe una propuesta en la que el nivel de CD14 de bajo peso molecular en sangre se obtiene de forma indirecta, restando el nivel de CD14 de elevado peso molecular en sangre del nivel total de la CD14 soluble en sangre (Publicación Internacional WO 01/22085).

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Descripción de la invención

En tales circunstancias, se ha deseado un análisis para determinar cualitativamente o cuantitativamente CD14 humana de bajo peso molecular con alta sensibilidad y especificidad de una manera conveniente, permitiendo el ensayo la determinación directa de la CD14 humana de bajo peso molecular y siendo útil para el diagnóstico de un paciente que sufre sepsis, y un kit de análisis para su análisis. Además, se ha deseado un anticuerpo contra la CD14 humana de bajo peso molecular útil para el análisis.

Los autores de la presente invención han inventado, como resultado de un estudio extenso, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, preparado utilizando un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Además, los autores de la presente invención han inventado un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4 que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5, así como un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, que compite con el mismo.

Además, los autores de la presente invención han inventado una prueba para determinar específicamente CD14 humana de bajo peso molecular de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 6 y un kit de análisis para la CD14 humana de bajo peso molecular, de acuerdo con la reivindicación 1 y la reivindicación 2. Sin embargo, además, los autores de la presente invención han inventado un nuevo método in vitro para la detección de la sepsis en el que la CD14 humana de bajo de peso molecular se determina directamente, de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

El anticuerpo de la presente invención puede ser utilizado en el kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular de la presente invención, y el kit permite la medición cualitativa o cuantitativa de CD14 humana bajo peso molecular con una alta sensibilidad y especificidad de una forma conveniente y es útil para el diagnóstico de un paciente que sufre de sepsis.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquemático de un kit de inmunocromatografía que utiliza un anticuerpo policlonal para el péptido S68, en la que la parte (A) es un diagrama esquemático del análisis inmunocromatográfico que utiliza F1031-8-3 marcado con oro coloidal como anticuerpo marcado y la parte (B) es un diagrama esquemático de un kit de inmunocromatografía que utiliza biotina y estreptavidina como segundas sustancias de unión.

La Fig. 2 muestra los resultados del análisis realizado en una sustancia patrón por un equipo de inmunocromatografía utilizando el anticuerpo policlonal para el péptido S-68.

La Fig. 3 muestra los resultados en los que sólo un péptido S68 inhibe la unión entre el anticuerpo policlonal para el péptido S68 y una proteína CD14 de bajo peso molecular, en la que la parte (A) muestra un estado en el que no se encuentra unión en los sueros de individuos normales y la parte (B) muestra la inhibición de la unión con el péptido S68 en los sueros de pacientes que sufren sepsis.

La Fig. 4 es un diagrama que representa una curva normalizada obtenida mediante un kit de IAE para CD14 de bajo peso molecular de la presente invención utilizando una proteína sCD14(1-3 07)S2 8 6C.

La Fig. 5 es un diagrama que ilustra un caso en que una proteína CD14 soluble derivada del suero de un individuo normal no afecta a los valores medidos por el kit de IAE para CD14 de bajo peso molecular de la presente invención utilizando sCD14(1-3 07)S2 8 6C.

La Fig. 6 es un diagrama que muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la proteína CD14 de bajo peso molecular y la proteína CD14 de elevado peso molecular en los sueros de pacientes que sufren sepsis utilizando el kit de IAE para CD14 de CD14 de bajo peso molecular y el kit de CD14-EIA (IBL-Hamburg) asequible comercialmente, respectivamente, con cromatografía de filtración en gel.

La Fig. 7 es un diagrama que muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la proteína CD14 de bajo peso molecular y la proteína CD14 de elevado peso molecular en los sueros de pacientes que sufren sepsis utilizando el kit de IAE para CD14 de bajo peso molecular y el kit CD14-EIA (IBL-Hamburg) asequible comercialmente, respectivamente, con cromatografía de filtración en gel, en la que las flechas de color negro en la parte superior de la figura indican respectivamente las posiciones de los marcadores utilizados para la calibración, es decir, desde el lado izquierdo, BSA, ovalbúmina, quimotripsinógeno-A, y ribonucleasa-A.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Más adelante, la presente invención se describirá con más detalle.

Las moléculas de CD14 soluble principales en la sangre humana incluyen moléculas de CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa y aproximadamente de 49 kDa (más adelante, "humana" puede omitirse y puede describirse como moléculas de CD14 de elevado peso molecular) descritas en el informe de Landmann, et al. descritas en la técnica anterior. Se confirma que las moléculas de CD14 de elevado peso molecular se unen a un anticuerpo F1025-3-1 (véase el documento WO 01/22085).

Por otra parte, también se encontró que hay un fragmento de CD14 que no se une al anticuerpo F1025-3-1, en otras palabras, la CD14 de bajo peso molecular, que tiene un menor peso molecular, está presente en lugar de la CD14 elevado peso molecular. También se muestra un aumento en el nivel de CD14 de bajo peso molecular en sangre con respecto a una enfermedad especifica (véase el documento WO 01/22085).

Más adelante, se dará una descripción de la CD14 humana de bajo peso molecular (más adelante, "humana" puede omitirse y se puede describir como CD14 de bajo peso molecular), proporcionada como analito del análisis de la presente invención.

La CD14 humana de bajo peso molecular proporcionada como analito del análisis de la presente solicitud tiene por lo menos las tres características siguientes:

1.

(1) no se une a un anticuerpo F1025-3-1;

2.

(2) se une específicamente a un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, teniendo el péptido 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2;

3.

(3) muestra un pico en el intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en la cromatografía de filtración en gel.

El rasgo característico (1) anteriormente descrito permite que la CD14 humana de bajo peso molecular proporcionada como analito del análisis sea reconocida como una molécula diferente de la CD14 de elevado peso molecular descrita anteriormente. El anticuerpo F1025-3-1 descrito en el rasgo característico (1) es un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, teniendo el péptido las secuencias de aminoácidos de las posiciones 316 a 328 de la CD14 humana completa descrita en SEQ ID NO: 5. Así, puesto que no se unen al anticuerpo F1025-3-1, es imaginable que las secuencias de las posiciones 316 y posteriores de la CD14 humana completa descrita en el SEQ ID NO: 5 no existan en la CD14 humana de bajo peso molecular.

El péptido que tiene los 16 aminoácidos descritos en el SEQ ID NO: 2 descrito en el rasgo característico (2) anterior corresponde a 16 residuos aminoácido de las posiciones 53 a 68 de la CD14 humana descrita en el SEQ ID NO: 5. Entre las proteínas humanas, con excepción de CD14 humana, no han sido conocidas hasta ahora otras proteínas que contengan la secuencia del SEQ ID NO: 2, de modo que la secuencia puede ser una secuencia específica para la CD14 humana. Este hecho confirma que el péptido proporcionado como analito del análisis en la presente solicitud puede ser una clase de CD14 humana.

Como rasgo característico (2') en lugar del rasgo característico (2), además, la CD14 humana de bajo peso molecular como analito del análisis en la presente solicitud se puede caracterizar por la unión a un anticuerpo que se une a un péptido que tiene 16 residuos aminoácido descrito en el SEQ ID: 2.

Del rasgo característico (3) anterior, la CD14 humana de bajo peso molecular como analito del análisis muestra el pico de elución en el intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa mediante cromatografía de filtración en gel. En general, un análisis de peso molecular con cromatografía de filtración en gel ocasiona variaciones en los resultados del análisis dependiendo de las condiciones experimentales incluyendo la resina utilizada para la cromatografía, las dimensiones de la columna, y el peso molecular del marcador utilizado. La CD14 humana de bajo peso molecular como analito del análisis de la presente solicitud está caracterizada porque puede distinguirse de la CD14 humana de elevado peso molecular en la cromatografía de filtración en gel y puede eluirse a pesos moleculares inferiores.

La CD14 humana de bajo peso molecular que tiene rasgos característicos, que pueden explicarse por los apartados (1) a (3) anteriores, se proporciona como analito del análisis en la presente solicitud. Otros rasgos característicos preferibles de la CD14 humana de bajo peso molecular como analito del análisis en la presente solicitud se describirán más abajo.

(4)

se une específicamente a un anticuerpo policlonal anti-CD14 humana.

La CD14 humana de bajo peso molecular como analito del análisis en la presente solicitud se une específicamente a un anticuerpo policlonal utilizando CD14 humana completa o CD14 humana completa recombinante como antígeno. Los ejemplos de los anticuerpos policlonales anti-CD14 humana incluyen: antisueros que tienen títulos de anticuerpos aumentados obtenidos mediante la inmunización de ratones con las proteínas CD14 de sangre humana, como se describe más adelante en el Ejemplo 3-(2)-[2], y los anticuerpos específicos incluidos allí.

Además, la CD14 humana de bajo peso molecular se caracteriza por su unión a un anticuerpo monoclonal anti-CD14 específico. Por ejemplo, la CD14 humana de bajo peso molecular está caracterizada concretamente porque se une a un anticuerpo monoclonal anti-CD14 que reconoce una secuencia de aminoácidos en las posiciones 17 a 26 de la CD14 humana completa descrita en el SEQ ID NO: 5 o a un anticuerpo monoclonal anti-CD14 que compite con el anticuerpo. Los ejemplos concretos de tal anticuerpo incluyen un anticuerpo F1031-8-3 descrito más abajo preparado utilizando CD14 de suero humano como antígeno y un anticuerpo F1106-13-3 descrito más abajo preparado utilizando CD14 humana recombinante como antígeno.

Por otro lado, la CD14 humana de bajo peso molecular se caracteriza adicionalmente de la siguiente manera. La CD14 humana de bajo peso molecular se caracteriza porque se puede unir a: uno de los anticuerpos monoclonales anti-CD14 que reconocen una secuencia de aminoácidos en las posiciones 17 a 26 de la CD14 humana completa descrita en el SEQ ID NO: 5 y un anticuerpo monoclonal anti-CD14 que compite con el anticuerpo; y un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, teniendo el péptido los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, como se ha descrito en el rasgo característico (2) anterior al mismo tiempo en dos posiciones. Por ejemplo, la CD14 humana de bajo peso molecular se caracteriza porque puede analizarse mediante un método sándwich utilizando una combinación de estos dos anticuerpos.

Los autores de la presente invención han encontrado que la CD14 humana de bajo peso molecular explicada en la descripción anterior es una proteína soluble de la sangre humana y existe más en la sangre de los pacientes que sufren sepsis en comparación con los individuos normales y que la proteína puede ser analizada directamente utilizando un anticuerpo específico. Por cierto, en el documento WO 01/22085 descrito anteriormente, se ilustra una proteína que tiene un peso molecular de 36 kDa como una de las especies moleculares de la CD14 de bajo peso molecular como analito del análisis.

Por cierto, la "CD14 soluble", descrita en la presente memoria significa una proteína existente en el plasma humano y se utiliza en contraste con la "CD14 unida a membrana" que se une a una membrana celular pero no se encuentra en el plasma humano.

El "anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno", utilizado en la presente invención significa un anticuerpo en el que se proporciona un péptido usado como "antígeno" como epítopo o parte de un epítopo. Además, es un anticuerpo que muestra la capacidad de unirse a un péptido utilizado como "antígeno" del "anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno". Los ejemplos del "anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno" incluyen los anticuerpos que representan las propiedades descritas anteriormente incluso aunque los anticuerpos se preparen utilizando los péptidos como sus inmunógenos con la adición de portadores o proteínas portadoras o de otros residuos aminoácido para proporcionar los péptidos respectivos como "antígenos" con inmuno-
genicidad.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente solicitud, se proporciona un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, consistiendo el péptido en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2. El SEQ ID NO: 5 describe la secuencia de aminoácidos de una CD14 humana completa. La secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 corresponde a las posiciones 1 a 68 de la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID: 5. Además, las secuencias de aminoácidos descritas en los SEQ ID NOS: 2, 3 y 4 corresponden a las posiciones 53 a 68 (16 residuos aminoácido), 1 a 17 (17 residuos aminoácido), y 14 a 32 (19 residuos aminoácido) de la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 5, respectivamente. Es decir, cada uno de los residuos aminoácido descritos en los SEQ ID NOS: 2 a 4 son residuos aminoácido consecutivos incluidos en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1.

El rasgo característico del anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención es que se une a CD14 humana de bajo peso molecular. Este rasgo permite que se utilice el anticuerpo en un kit de acuerdo con la presente invención.

Por otra parte, el peso molecular de la CD14 humana de bajo peso molecular es diferente del de la CD14 de elevado peso molecular, así como la secuencia de aminoácidos de la primera es más corta que la de la última. Por esta razón, la conformación de la CD14 de bajo peso molecular en la sangre es distinta de la de la CD14 de elevado peso molecular, de modo que sus reactividades con el anticuerpo pueden ser diferentes entre sí. Por lo tanto, es imaginable que el anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención se una fuertemente a la CD14 humana de bajo peso molecular.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente solicitud, se proporciona un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se puede unir a cualquier región de un péptido, que no esté limitado específicamente en tanto se una a un péptido que tenga los residuos aminoácido descritos en uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 2 a 4.

El rasgo característico del anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es que se une a la CD14 humana de bajo peso molecular. Este rasgo permite utilizar el anticuerpo en un kit de acuerdo con la presente invención.

Además, el peso molecular de la CD14 humana de bajo peso molecular es diferente de la de la CD14 de elevado peso molecular, y también la secuencia de aminoácidos de la primera es más corta que la de la última. Por esta razón, la conformación de la CD14 de bajo peso molecular en la sangre es distinta de la de la CD14 de elevado peso molecular, de modo que sus reactividades con el anticuerpo pueden ser diferentes entre sí. Por lo tanto, es imaginable que el anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se una fuertemente a la CD14 de bajo peso molecular.

La frase "unión a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2" significa que el anticuerpo se une específicamente a un péptido como antígeno, teniendo el péptido los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 y muestra una reacción antígeno-anticuerpo normal. Por ejemplo, la frase "unión a un péptido que tiene 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" significa que el anticuerpo se une específicamente a un péptido como antígeno, teniendo el péptido los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 y muestra una reacción antígeno-anticuerpo normal. La representación de la reacción antígeno-anticuerpo se puede identificar mediante un método de aglutinación, un método sándwich, un método directo en fase sólida o un método de unión en fase sólida, un método competitivo, etcétera.

La constante de disociación (KD) del anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, es, cuando la constante de disociación se expresa como la afinidad hacia el péptido o la CD14 de bajo peso molecular, preferiblemente de menos de 10^{-7} M, más preferiblemente 10^{-8} M o menos, aún más preferiblemente 10^{-9} M o menos.

En la preparación del anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente solicitud, el péptido usado como antígeno es un péptido que contiene 8 o más aminoácidos consecutivos del residuo aminoácido descrito en el SEQ ID NO: 2, preferiblemente 10 o más aminoácidos consecutivos, más preferiblemente 12 o más consecutivos, en particular preferiblemente 16 o más consecutivos. Por otra parte, en tanto que el péptido contenga 8 o más aminoácidos consecutivos del residuo aminoácido descrito en el SEQ ID NO: 2, las otras secuencias de aminoácidos no están limitadas. La secuencia de aminoácidos completa del péptido está derivada preferiblemente de una secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es preferiblemente un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, teniendo el péptido 8 o más aminoácidos consecutivos de los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. Es un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, teniendo el péptido preferiblemente 10 o más aminoácidos consecutivos, más preferiblemente 12 o más consecutivos, en particular preferiblemente 16 o más consecutivos.

El anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención y el anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto del segundo aspecto de la presente invención (en adelante, se pueden describir como los anticuerpos de la presente invención) pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Las especies del animal del que se origina el anticuerpo de la presente invención no están limitadas específicamente. Con el fin de facilitar la preparación del anticuerpo, son preferibles conejos, cabras, o similares. Además, las especies de inmunoglobulinas se pueden utilizar en cualquiera de las clases, subclases, e isotipos.

Los ejemplos de un método de preparación de un péptido que se va a utilizar como inmunógeno incluyen un método en el que se utiliza un sintetizador de péptidos empleado generalmente (Sintetizador de Péptidos Tipo 433A, Perkin-Elmer, Japón) o similar y un método de recombinación genética ("New Cell Engineering Experiments Protocols", Ed. Department of Carcinostatic Research, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Shujunsha).

Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido que tiene 8 aminoácidos consecutivos o más de los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 mediante un método Fmoc utilizando un sintetizador de péptidos de Tipo 433A. Después de la desprotección con TFA y separación mediante corte de la resina, el producto resultante se purifica utilizando una columna de HPLC C18 (Capcell-pak, Shiseido Co., Ltd.), para así preparar el péptido buscado.

Cuando el antígeno es una proteína, se puede utilizar directamente como inmunógeno. Sin embargo, cuando un péptido tiene de 8 a 30 residuos aminoácido o menos, el peso molecular del péptido es pequeño, no es suficiente para utilizarlo como inmunógeno, en general. En este caso, el péptido puede ser proporcionado como un antígeno uniendo el péptido a un portador o utilizando un método con Péptidos Antigénicos Múltiples (MAP). A continuación, se prepara y proporciona un péptido MAP con un peso molecular que permite que el antígeno tenga inmunogenicidad.

Los portadores que se van a unir a los péptidos descritos anteriormente incluyen proteínas portadoras y polímeros. Las proteínas portadoras utilizadas pueden ser heteroproteínas tales como albúmina de suero bovino, hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH), tiroglobulina, y ovalbúmina. Esas proteínas portadoras utilizan los grupos funcionales de la cadena lateral de un aminoácido de un péptido o proteína portadora o introducen un grupo maleimida, un grupo N-hidroxisuccinimida (NHS), o un grupo aldehído para permitir que el portador se una al péptido anterior. Los ejemplos de los polímeros incluyen sacáridos como manano y quitosano y polivinilpirrolidona (PVA). Esos polímeros pueden unirse a los péptidos anteriores por medio de adsorción o unión química como se ha descrito anteriormente.

El anticuerpo de la presente invención se puede preparar utilizando las tecnologías conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Procedures of Immunological Experiments, The Japanese Society for Immunology, Ed., Publicada por The Japanese Society for Immunology). Por ejemplo, un anticuerpo policlonal se puede preparar mediante el método siguiente.

Uno cualquiera de los diversos animales se puede inmunizar con una mezcla de 20 a 1.000 \mug de inmunógeno, preparado como se ha descrito antes con un coadyuvante como coadyuvante completo de Freund, coadyuvante RIBI, o ALUMBRE. Los ejemplos de los diferentes animales que se pueden utilizar incluyen caballo, oveja, cabra, cerdo, conejo, rata y ratón. Los procedimientos de inmunización que se pueden utilizar incluyen la administración intramuscular, la administración intradérmica, la administración subcutánea, la administración intraperitoneal, y la administración al nódulo linfático. Se puede administrar un refuerzo de inmunidad de tal manera que, cada 1-4 semanas después de la administración por primera vez, el inmunógeno mezclado con el coadyuvante, tal como coadyuvante incompleto de Freund, coadyuvante RIBI, o ALUMBRE se administra de manera similar o el inmunógeno se administra por vía intravenosa en forma directa. Se puede preparar un antisuero a partir de un animal inmunizado mediante un método de muestreo de sangre normal, por ejemplo, incluyendo el método: recoger sangre de la arteria carótida, vena auris, corazón, vena de la pierna, o similares; y separar el suero de la sangre por medio de centrifugación o similares. El antisuero resultante se somete a un método de precipitación por adición de sal que implica la adición de sulfato de amonio, sulfato de sodio, o similar para precipitar una fracción de \gamma-globulina. Luego, después de que la fracción ha sido dializada en el tampón apropiado, se puede preparar un anticuerpo policlonal purificado de la fracción de IgG frente a un péptido diana utilizando una matriz de afinidad de proteína A, proteína G, o similar capaz de purificar específicamente \gamma-globulina. Además, se puede realizar la purificación específica mediante la selección de un anticuerpo que se une al antígeno anterior.

Además, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el método siguiente.

El anticuerpo de la presente invención se puede preparar: fusionando inmunocitos de un animal inmunizado con células de mieloma para preparar hibridomas; y seleccionando un clon que produce un anticuerpo capaz de unirse al péptido anterior de los hibridomas. Preferiblemente, un inmunógeno es un péptido que tiene 10 o más residuos aminoácido consecutivos de las posiciones 53 a 68. Además, el inmunógeno es más preferiblemente un péptido que tiene 12 o más aminoácidos consecutivos, en particular, preferiblemente un péptido que tiene 16 aminoácidos consecutivos.

Aunque el mamífero que se va a inmunizar no está específicamente limitado, se selecciona preferiblemente considerando la compatibilidad con las células de mieloma que se van a utilizar en la fusión celular y, es preferiblemente, un ratón, rata, hámster, o similar. Las células de mieloma que se pueden utilizar son diferentes tipos de células bien conocidos la técnica, incluidas las células de mieloma P3, P3U1, SP2/0, NS-1, YB2/0, e Y3-AG1, 2 y 3.

La inmunización se puede realizar mediante un método conocido. Por ejemplo, la inmunización se realiza mediante la administración de un antígeno por vía intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, o en la almohadilla de la pata. El antígeno se puede administrar combinado con un coadyuvante, y es preferible administrar el antígeno varias veces. Los inmunocitos son preferiblemente células de bazo o células derivadas de nódulos linfáticos aislados durante varios días, por ejemplo, 3 días después de la administración final del antígeno. Los inmunocitos y las células de mieloma pueden fusionarse mediante un método conocido tal como el método de Milstein et al. (Methods in Enzymol., Vol. 73, pág. 3). Por ejemplo, se pueden mencionar el método con polietilenglicol (PEG) como agente de fusión, un método de fusión celular inducido por un campo eléctrico, o similares. La razón de mezcla de inmunocitos y células de mieloma no está particularmente limitada con tal que permita la fusión. Sin embargo, es preferible hacer la cantidad de células de mieloma 1/10 con respecto a su equivalente con respecto a los inmunocitos. En el método en el que la fusión celular se realiza utilizando PEG (peso molecular medio: de 1.000 a 4.000), la concentración de PEG no está particularmente limitada. Sin embargo, es preferible que la fusión se realice a una concentración de 50%. Se puede añadir un agente auxiliar tal como el dimetilsulfóxido (DMSO) como un potenciador de la eficacia de la fusión. La fusión se inicia con la adición de una disolución de PEG calentada a 37ºC a las células mixtas y se termina mediante la adición de un medio de cultivo después de hacer reaccionar la disolución y las células durante 1 a 5 minutos. Los hibridomas creados mediante la fusión se incuban durante 1 a 7 días en un medio de selección tal como un medio de cultivo que contiene hipoxantina, timidina, y aminopterina (medio HAT) para separarlos de las células no fusionadas.

Los hibridomas obtenidos son seleccionados adicionalmente por los anticuerpos producidos por ellos. Un hibridoma seleccionado se convierte en un anticuerpo monoclonal mediante un método de dilución limitante conocido para establecer un hibridomas productores de anticuerpos monoclonales. Cualquiera de los métodos conocidos puede ser utilizado como método de detección de la actividad de un anticuerpo que produce el hibridoma. Los ejemplos de los métodos incluyen un método ELISA, una reacción de aglutinación, y un radioinmunoanálisis. Los ejemplos del hibridoma establecido se pueden cultivar mediante un método conocido y se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir del sobrenadante del cultivo. Además, el hibridoma se administra a un mamífero que tenga compatibilidad con el mismo para permitir la proliferación y el hibridoma proliferado se obtiene de la ascitis. La purificación del anticuerpo se puede realizar utilizando un método de purificación conocido como precipitación por adición de sal, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad.

Además, como se ha descrito en el aspecto anterior, el anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en el kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular de la presente invención, es imaginable que se pueda preparar un anticuerpo que se une a la CD14 humana de bajo peso molecular pero no a la CD14 humana de elevado peso molecular.

Es imaginable que el anticuerpo que se une a la CD14 humana de bajo peso molecular pero no a la CD14 humana elevado peso molecular se pueda obtener mediante la preparación de un anticuerpo utilizando la CD14 de bajo peso molecular como antígeno y seleccionando un anticuerpo que no se une a la CD14 de elevado peso molecular.

Un método de preparación de la CD14 de bajo peso molecular se describe en el Ejemplo 16 del documento WO 01/72993. Además, utilizando el anticuerpo de la presente invención, la CD14 de bajo peso molecular se puede preparar mediante purificación específica a partir de suero humano, preferiblemente a partir del suero de un paciente que sufre sepsis.

Para seleccionar el anticuerpo que no se une a la CD14 de elevado peso molecular, la unión entre el anticuerpo resultante y la CD14 de elevado peso molecular puede analizarse mediante un método de aglutinación, un método de sándwich, un método directo en fase sólida o un método de unión en fase sólida, un método competitivo, o similares. Estos métodos se describirán más adelante.

La CD14 de elevado peso molecular se puede preparar utilizando un anticuerpo específico para la CD14 de elevado peso molecular, que se describe en el ejemplo 5 del documento WO 01/22085.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente solicitud, se proporciona un kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

El kit de la presente invención contiene un anticuerpo que se une a al menos una CD14 humana de bajo peso molecular o un fragmento del anticuerpo y analiza directamente la CD14 humana de bajo peso molecular en una muestra. Además, el kit detecta la CD14 humana de bajo peso molecular como analito, pero no detecta CD14 humana de elevado peso molecular, de manera que la CD14 humana de bajo peso molecular puede ser analizada directamente. El "fragmento de anticuerpo" significa Fab, Fab', o F(ab')_{2} del anticuerpo.

El kit de análisis para la CD14 humana bajo peso molecular de la presente invención comprende un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. En particular, preferiblemente, es un kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular, que incluye un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, consistiendo el péptido en los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, como anticuerpo que se une a la molécula humana de bajo peso molecular o fragmento de anticuerpo.

Como ejemplo del principio del ensayo, se describirá concretamente un kit de análisis para la CD14 humana de bajo peso molecular (en adelante, se puede describir como un kit de inmunoanálisis sándwich), que determina la CD14 humana de bajo peso molecular mediante un inmunoanálisis sándwich utilizando el "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" como ejemplo preferido de los anticuerpos de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.

Se puede utilizar un método bien conocido como inmunoanálisis sándwich. El principio, la aplicación y la modificación del análisis se describen, por ejemplo, en "Hypersensitive Enzyme Immunoassay", Eiji Ishikawa Ed., Center for Academic Publications Japan (1993), "New Utilization Examples and Applications to Diagnostic Reagent/Drug Development of Immunoassay", Immunoassay Development Research Society, Keiei-Kyoiku Shuppan, and "Enzyme Immunoassay" (3^{a} Ed), Eiji Ishikawa Ed., Igaku-Shoin Ltd. (1987).

Además, el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención contiene un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. Los rasgos característicos del anticuerpo que se une al péptido de 16 aminoácidos que se describe en el SEQ ID NO: 2, un método de preparación de ese anticuerpo, etcétera son exactamente los mismos que están de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. El anticuerpo puede ser, pero no está limitado específicamente, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo
monoclonal.

El inmunoanálisis sándwich es un método que utiliza dos o más tipos de anticuerpos que reconocen diferentes sitios en una proteína que se va a analizar usualmente, cuando el análisis se realiza mediante la formación de un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo.

En primer lugar, se prepara un portador insoluble junto con un primer anticuerpo y luego se proporciona como fase sólida o en un lugar de reacción. Se añade un espécimen al portador insoluble proporcionado como fase sólida y a continuación se les permite reaccionar entre sí. Después de que han reaccionado durante un período de tiempo predeterminado, la fase sólida se lava para eliminar de ella la sustancia no unida. Posteriormente, se añade un segundo anticuerpo marcado. Después de que la mezcla ha reaccionado durante un período de tiempo predeterminado, el anticuerpo marcado que no forma complejo se elimina lavando y luego se determina cualitativamente o cuantitativamente la cantidad de complejo unido a la fase sólida basándose en el producto marcado de una manera específica. El método sándwich puede utilizar uno cualquiera de un método que incluye dos etapas descrito anteriormente (método de doble etapa) y un método que incluye la etapa de la adición al mismo tiempo de un antígeno y de un anticuerpo marcado (método de una sola etapa).

En el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención, el análisis se realiza mediante la formación de un complejo del "anticuerpo que se une a los péptidos formados por los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a la CD14 humana de bajo peso molecular".

El formato del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención incluye: un portador insoluble unido con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID: 2 y una segunda sustancia de unión que se une a una CD14 de bajo peso molecular marcada (en adelante, puede describirse simplemente como una segunda sustancia de unión), o un portador insoluble unido con una secunda sustancia de unión y un anticuerpo que se une a un péptido marcado con los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2.

Los ejemplos de la segunda sustancia de unión incluyen un anticuerpo que se une a la CD14 de bajo peso molecular. El anticuerpo que se une a la CD14 de bajo peso molecular puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal y no está limitado específicamente. Es preferible el anticuerpo monoclonal con respecto a la afinidad con el inmunoanálisis sándwich que utiliza el anticuerpo que se une al péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. Además, la segunda sustancia de unión puede ser un fragmento del anticuerpo monoclonal. El fragmento de anticuerpo es Fab, Fab', o F(ab')_{2} del anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo que se une a la CD14 de bajo peso molecular (en adelante, puede ser descrito como un segundo anticuerpo) puede ser un anticuerpo que se une específicamente a la CD14 de bajo peso molecular o un anticuerpo que se une a la CD14 de elevado peso molecular.

La segunda sustancia de unión descrita antes es: un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los residuos aminoácido en las posiciones 17 a 26 del SEQ ID NO: 5; o un anticuerpo que compite con (que muestra reactividad cruzada con) un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los residuos aminoácido de las posiciones 17 a 26 del SEQ ID NO: 5.

Un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal se puede preparar, por ejemplo, usando de CD14 de elevado peso molecular, CD14 de bajo peso molecular, una mezcla de CD14 de elevado peso molecular con CD14 de bajo peso molecular, o CD14 recombinante como antígeno, como en el caso del método de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Un método ilustrado para preparar un segundo anticuerpo utilizando una mezcla de CD14 de elevado peso molecular con CD14 de bajo peso molecular, y CD14 recombinante como antígenos se mostrará en el Ejemplo 3 descrito más adelante.

Además, es preferible seleccionar un segundo anticuerpo de manera que, antes de la realización del análisis de hecho, como en el caso de Ejemplo 3 descrito más adelante, se construye preliminarmente un sistema para el método sándwich que incluye un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 aminoácidos residuos de aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 y un anticuerpo que es candidato para el segundo anticuerpo para confirmar la sensibilidad del análisis.

Por otra parte, los fragmentos del anticuerpo: Fab, Fab', y F(ab')_{2} se pueden preparar mediante un método bien conocido ("Hypersensitive Enzyme Immunoassay", escrito por Eiji Ishikawa, págs. 25-40, Center for Academic Publications Japan (1993)).

Además, en el inmunoanálisis sándwich, el ensayo se puede realizar sacando provecho de la segunda unión específica como método alternativo. Es un método para llevar a cabo un ensayo mediante la formación de un complejo de anticuerpo - antígeno - anticuerpo - segunda sustancia de unión específica - pareja de unión específica de la segunda sustancia de unión específica (en adelante, puede ser descrito como segundo compañero de unión específica).

En el paquete del inmunoanálisis sándwich de la presente invención, el ensayo se realiza mediante la formación de un complejo del "anticuerpo que se une a un péptido que tiene 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" - segunda sustancia de unión específica - segundo compañero de unión específica, o mediante la formación de un complejo de "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" - CD14 humana de bajo peso molecular - "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - segunda sustancia de unión específica - segundo compañero de unión específica.

El formato que saca provecho de la segunda unión específica del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención incluye: un anticuerpo marcado con una segunda sustancia de unión específica que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2; una segunda sustancia de unión específica que se une a CD14 de bajo peso molecular marcada; y un portador insoluble unido con un segundo compañero de unión específica, o incluye: un anticuerpo marcado que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2; una segunda sustancia de unión que une a CD14 de bajo peso molecular marcada con una segunda sustancia de unión específica, y un portador insoluble unido con un segundo compañero de unión específica.

Los ejemplos de la combinación de la segunda sustancia de unión específica y el segundo compañero de unión específica incluyen: un antígeno y uno de sus anticuerpos, un ligando y uno de sus receptores; una sustancia que contiene algunos azúcares y lectina, y biotina y avidina o estreptavidina.

Por otra parte, los ejemplos del inmunoanálisis sándwich incluyen: un análisis con formación de un complejo de anticuerpo - antígeno - anticuerpo - anticuerpo anti-inmunoglobulina que saca provecho de un anticuerpo contra un anticuerpo, es decir, un anticuerpo anti-inmunoglobulina; y un análisis con la formación de anticuerpo anti-inmunoglobulina - anticuerpo - antígeno - anticuerpo - segunda sustancia de unión específica - segundo compañero de unión específica que saca provecho del anticuerpo anti-inmunoglobulina y la segunda de unión específica.

El kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención lleva a cabo un ensayo: formando un complejo del "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" - anticuerpo anti-inmunoglobulina; formando un complejo de "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión a CD14 humana de bajo peso molecular" - anticuerpo anti-inmunoglobulina: formando anticuerpo anti-inmunoglobulina - "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" - segunda sustancia de unión específica - segundo compañero de unión específica, formando anticuerpo anti-inmunoglobulina - "segunda sustancia de unión a CD14 humana de bajo peso molecular" - CD14 humana de bajo peso molecular - "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - segunda sustancia de unión específica - segundo compañero de unión específica, o similares.

Cualquier método sándwich está dentro del alcance del análisis de la presente invención incluso aunque se forme una fase sólida, una sustancia marcada o similares sacando provecho de la segunda unión específica en tanto se realice un análisis mediante la formación de un complejo del "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular".

Un portador insoluble utilizado en el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención pueden ser cuentas, partículas de látex, partículas magnéticas, una placa, un tubo, una membrana, o similares. Los materiales de las cuentas, la placa o el tubo incluyen poliestireno, nailon, vidrio, goma de silicona, acero inoxidable y plástico. La membrana puede ser de celulosa, un derivado de celulosa, nitrocelulosa, polímero sintético poroso, fibra de vidrio, tela, género no tejido, papel de filtro, o similares. Las cuentas, las partículas de látex, las partículas magnéticas, o similares se pueden utilizar en una forma esférica. Una forma esférica ventajosa ya que ahorra espacio en el almacenamiento. La placa o el tubo se pueden utilizar en forma de pocillo. Una forma de pocillo es ventajosa ya que será aceptada en un instrumento comercial de medición automática, lector de placas, o similares. La membrana puede ser utilizada para un método inmunocromatográfico o un método de flujo continuo descrito más adelante.

El anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, la segunda sustancia de unión, la segunda sustancia de unión específica o su compañero, o el anticuerpo anti-inmunoglobulina se pueden unir al portador insoluble mediante un método de absorción térmica, método de unión química, o similares.

Además, es preferible someter la superficie de no adsorción del portador insoluble que está libre de la sustancia anterior a un tratamiento de bloqueo con cualquier sustancia que no afecte al sistema de análisis debido a que el tratamiento conferirá mayor especificidad y sensibilidad al sistema de análisis. Las sustancias que no afectan al sistema de análisis incluyen: proteínas como BSA y caseína; y tensioactivos tales como Tween 20 y NP-40.

Las marcas que se van a utilizar en el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención incluyen: enzimas tales como la peroxidasa, la fosfatasa alcalina, la \beta-D-galactosidasa, la oxidasa, y la uroquinasa; sustancias quimioluminiscentes tales como acridinio o uno de sus derivados y aecuorina o uno de sus productos modificados; sustancias fluorescentes tales como FITC; colorantes; oro coloidal, látex coloreado, e isótopos.

Por ejemplo, en el caso de la utilización de peroxidasa como enzima, se pueden ilustrar como sustrato cromogénico la 3,3',5,5'-tetrabenzidina o la 1,2-fenilendiamina. En el caso de la utilización de la fosfatasa alcalina, se puede ilustrar como sustrato cromogénico el fosfato de 4-nitrofenilo. En el caso de la utilización de \beta-D-galactosidasa, se puede ilustrar como un sustrato cromogénico el 2-nitrofenil-\beta-D-galactósido.

El marcaje enzimático del anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, la segunda sustancia de unión, la segunda sustancia de unión específica o su compañero, o el anticuerpo anti-inmunoglobulina se puede realizar mediante un método con glutaraldehído de dos etapas, el método del ácido peryódico, el método de la maleimida, el método de disulfuro de piridilo, o similares.

Aparte de la enzima, en el marcaje puede estar disponible una tecnología bien conocida como método de absorción térmica o método de unión química.

Es preferible el marcaje enzimático porque puede analizarse utilizando el sistema de cromometría convencional si se utiliza cualquier sustrato cromogénico ilustrado anteriormente y porque su sensibilidad es relativamente alta. Además, el marcaje utilizado en un kit sencillo tal como un kit que utiliza un método inmunocromatográfico o un método de flujo continuo descrito más adelante, es preferible porque el colorante, el oro coloidal, o el látex coloreado se pueden observar visualmente.

El kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención se caracteriza porque se realiza un análisis mediante un método sándwich e incluye un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2. El inmunoanálisis sándwich puede utilizar la tecnología bien conocida como se ha descrito anteriormente. Además de la descripción concreta anterior, cualquier kit basado en el inmunoanálisis sándwich está dentro del alcance del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención y no está limitado específicamente con tal que el kit incluya un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 y la segunda sustancia de unión específica de acuerdo con la reivindicación 1 (b) o 2 (b). Además, el contenido está limitado en tanto que no inhiba los resultados del análisis basados en el principio del análisis.

Por ejemplo, se pueden ilustrar como elemento constitutivo opcional un tampón o diluyente de un espécimen, un anticuerpo marcado, o similares, un sustrato cromogénico (véase la descripción anterior) adecuado para una enzima que cuando la enzima se utiliza para un anticuerpo marcado, un agente de bloqueo, un reactivo de parada, o una disolución de lavado. Además, una sustancia patrón también se puede ilustrar como elemento constitutivo opcional. Las sustancias patrón incluyen CD14 humana de bajo peso molecular y análogos de CD14 humana de bajo peso molecular.

Además, también está dentro del alcance del inmunoanálisis sándwich de la presente invención un kit que utiliza un método inmunocromatográfico o un método de flujo continuo sobre la base de un método sándwich como principio de análisis.

El método inmunocromatográfico es un método en el que un antígeno proporcionado como sustancia de ensayo en un espécimen se mueve a lo largo de una tira de ensayo hacia un portador insoluble en el que está inmovilizado un anticuerpo, mientras que el antígeno reacciona con un anticuerpo marcado que está dispuesto en la tira de ensayo de manera que sea capaz de moverse, y a continuación se forma un complejo de anticuerpo - antígeno - anticuerpo sobre el portador insoluble. En general, el antígeno se puede analizar mediante una sola etapa de goteo del espécimen sobre la tira de ensayo.

Por ejemplo, los aparatos para el método inmunocromatográfico se describen en el documento JP 01-063865 A, el documento WO 88/08534, y el documento WO 90/09592. Además, los aparatos para el método inmunocromatográfico que tienen canales de flujo con diferentes velocidades de desarrollo se describen en el documento WO 89/03993 y el documento WO 99/27364, y por ejemplo, los aparatos se pueden aplicar de modo que un anticuerpo marcado pueda reaccionar después de la formación de un complejo, permitiendo la reacción entre el anticuerpo inmovilizado y el antígeno.

Un ejemplo que utiliza el método inmunocromatográfico del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención se describirá a continuación.

Por ejemplo, un dispositivo (por ejemplo, un kit) es una tira de ensayo en la que se proporcionan una parte para la adición de la muestra, una parte para el reactivo, una parte para la detección, y una parte absorbente de manera que se permite que un espécimen líquido añadido sobre la parte para la adición de la muestra se mueva a lo largo de esas partes por ese orden. Es suficiente impregnar una segunda sustancia de unión marcada en la parte para el reactivo y se disponga un portador insoluble unido con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, en la parte para la detección.

El espécimen añadido sobre la parte para la adición de la muestra absorbe la segunda sustancia de unión marcada en la parte para el reactivo. La CD14 humana de bajo peso molecular reacciona con la segunda sustancia de unión marcada para formar un complejo mientras se mueve hacia la parte para la detección. En la parte para la detección, el complejo reacciona con el antígeno que se une al péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, dando como resultado la formación de un complejo de "anticuerpo que se une al péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" sobre un portador insoluble. Cualquier sustancia y reactivo del espécimen, que no estén implicados en la reacción, se mueven a la parte absorbente. Se puede determinar la marca del complejo formado en la parte para la detección, concretamente se puede determinar visualmente.

Se puede utilizar un portador poroso o similares como tira de ensayo. El portador poroso puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, celulosa, un derivado de celulosa, nailon, una fibra de nailon, una fibra de vidrio, o un polímero sintético poroso.

Parte de la tira de prueba se puede utilizar directamente como parte para añadir la muestra o parte para el reactivo. Alternativamente, se pueden utilizar por ejemplo, papel de filtro de celulosa, una fibra de vidrio, tejidos, géneros no tejidos, polímeros sintéticos porosos, o similares en función de la cantidad de la muestra o la dosis del reactivo.

Se pueden utilizar celulosa, un derivado de celulosa, nitrocelulosa, un polímero sintético poroso, una fibra de vidrio, tejidos, géneros no tejidos, papel de filtro, o similares para la parte para la detección como se ha descrito anteriormente.

Se puede utilizar un material que absorba agua para la parte absorbente. Los ejemplos del material que absorbe agua incluyen: un polímero absorbente tal como una esponja, papel de filtro de celulosa y papel de filtro.

Lo anterior es uno de los ejemplos del método inmunocromatográfico. Se puede añadir una parte de referencia para confirmar el progreso de una reacción, o se puede proporcionar la tira de ensayo con un soporte o cubierta con un recubrimiento externo. Sin embargo, el kit de la presente invención no se limita a ellos.

Además, como se ha descrito en la explicación sobre el inmunoanálisis sándwich, un kit para un método inmunocromatográfico, por medio del cual se forma un complejo del "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" sobre un soporte insoluble y se realiza un análisis mediante la formación de un complejo que utiliza un anticuerpo anti-inmunoglobulina y una segunda unión específica, también se encuentra en el alcance del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención.

El método de flujo continuo es un método por el cual un antígeno proporcionado como sustancia de análisis forma un complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo, junto con una disolución en un espécimen sobre una membrana proporcionada como portador insoluble. En este momento, la sustancia que no se fija a la membrana suele ser eliminada haciéndola pasar perpendicularmente a través de la membrana desde la parte anterior a la posterior.

El documento WO 88/01603 describe un aparato basado en un método de varias etapas por medio del cual un espécimen, un reactivo, y un limpiador se añaden gota a gota sobre una membrana.

El documento JP 06-273419 A describe un método que está siendo mejorado como método de una sola etapa en la que se forma una membrana de varias capas y se proporciona allí una parte para el reactivo para llevar a cabo el análisis sólo añadiendo gota a gota un espécimen.

En adelante, se describirá un ejemplo del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención utilizando un método de flujo continuo.

Por ejemplo, un dispositivo (esto es, un kit) es un kit en el que se disponen en capas una parte para la adición de la muestra, una parte para el reactivo, una parte para la detección, y una parte absorbente una encima de otra de manera que se permite que una muestra de líquido añadida en la parte para la adición de la muestra se mueva a lo largo de esas partes en ese orden. Es suficiente que una segunda sustancia de unión marcada se impregne en la parte para el reactivo y se disponga un portador insoluble unido con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, en la parte para la detección.

El espécimen añadido a la parte para añadir la muestra pasa a través de la parte para añadir la muestra perpendicularmente desde la parte superior a la posterior de la membrana (más adelante, sucede lo mismo con el movimiento de la muestra) y luego se absorbe la segunda sustancia de unión en la parte para el reactivo. La CD14 humana de bajo peso molecular reacciona con la segunda sustancia de unión marcada para formar un complejo mientras se mueve hacia la parte para la detección. En la parte para la detección, el complejo reacciona con el antígeno que se une al péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2, dando como resultado la formación de un complejo de "anticuerpo que se une al péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a la CD14 humana de bajo peso molecular" sobre un portador insoluble. Las sustancias y reactivos cualesquiera del espécimen, que no estén implicados en la reacción, se mueven a la parte absorbente. Se puede determinar la marca del complejo formado en la parte para la detección, en particular, se puede determinar visualmente. La marca se puede observar visualmente de una manera sencilla si se diseña un dispositivo de tal manera que la parte para la detección sea separable de la parte para añadir la muestra y de la parte para el reactivo o de la parte absorbente. Además, la marca se puede observar visualmente desde la parte para añadir la muestra, si la parte para añadir la muestra y la parte para el reactivo están fabricadas cada una de un material traslúcido, o desde el lado inferior si la parte absorbente se dispone sobre la parte para la detección (el lado de la parte para añadir la muestra) como en el caso del documento JP 06-0273419 A.

Se pueden aplicar los mismos miembros del método inmunocromatográfico y cada miembro puede ser formado como una membrana para permitir que la disolución se mueva en un espécimen.

Lo anterior es uno de los ejemplos del método de flujo continuo. Se puede añadir una parte de referencia para confirmar el progreso de una reacción, o se puede proporcionar cada miembro con un soporte o cubierto con un recubrimiento externo. Sin embargo, el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención no se limita a ellos.

Además, como se describe en la explicación sobre el inmunoanálisis sándwich, además de la formación de un complejo de "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" - CD14 humana de bajo peso molecular - "segunda sustancia de unión que se une a CD14 humana de bajo peso molecular" sobre un portador insoluble, también está dentro del alcance del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención un kit para el método de flujo continuo que lleva a cabo el análisis formando un complejo que utiliza el anticuerpo anti-inmunoglobulina y la segunda unión específica.

Además, el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención puede estar disponible para un análisis basado en un método MEDIA (documento JP 05-264552 A) para medir electroquímicamente las señales de una marca y un análisis basado en un método de inmunoanálisis ("Bioscience and Industry", vol. 61, p. 449-454, 2003) utilizando un microchip. Los kits de análisis que utilizan esos principios están dentro del alcance del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención en tanto que estén caracterizados por sus análisis basados en el inmunoanálisis sándwich e incluyan un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2.

El kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención está caracterizado por incluir un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2 y es capaz de determinar específicamente CD14 de bajo peso molecular. El espécimen que se va a utilizar en el kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención es preferiblemente un espécimen acuoso. Los ejemplos particularmente preferibles del espécimen incluyen sangre, componentes sanguíneos tales como suero o plasma, orina u otros fluidos corporales, sobrenadante de cultivo celular, y eluyente de la columna. Son útiles para la determinación de CD14 de bajo peso molecular en ellos. Sin embargo, a partir de especímenes, excepto el componente de la sangre humana, tales como la orina humana u otros líquidos corporales, los componentes de la sangre, la orina, u otros fluidos corporales de especies excepto seres humanos, sobrenadante de cultivo celular, y el eluyente de la columna, proteínas, polipéptidos, o similares que son análogos a los de CD14 de bajo peso molecular se pueden analizar también, así como la CD14 de bajo peso molecular. Cualquier kit de análisis para los polipéptidos anteriores, o similares, que son análogos a la CD14 de bajo peso molecular también está dentro del alcance del kit de inmunoanálisis sándwich de la presente invención, en tanto cada uno incluya un anticuerpo que se une a un péptido formado por los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2.

Además, en la explicación anterior, el fragmento Fab, Fab', o (Fab')_{2} del "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" se puede utilizar en lugar del "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2".

En la descripción anterior, los ejemplos concretos que utilizan el "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2" han sido descritos como ejemplos preferidos del anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. Sin embargo, también se pueden utilizar el anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, el anticuerpo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, excepto el "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2", o el fragmento Fab, Fab', o (Fab')_{2} de los anticuerpos.

Preferible es un kit de inmunoanálisis sándwich que utiliza el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención, es decir, el "anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2".

El nivel de CD14 de bajo peso molecular que se puede determinar específicamente mediante el kit de la presente invención aumenta en un paciente que sufre sepsis. Así, el análisis del CD14 de bajo peso molecular se proporcionará como índice diagnóstico de la sepsis y el kit de la presente invención es útil para el diagnóstico de la sepsis.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente solicitud, se proporciona un método de análisis para CD14 de bajo peso molecular con lo que la determinación de la CD14 humana de bajo peso molecular en un espécimen se lleva a cabo directamente utilizando un anticuerpo que se une al menos a una CD14 humana de bajo peso molecular para detectar la CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar la CD14 humana de elevado peso molecular.

El método de análisis de la presente solicitud es un método para el análisis de la CD14 humana de bajo peso molecular para detectar la CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular y utiliza un anticuerpo que se une al menos a una de las CD14 humanas de bajo peso molecular para determinar directamente la CD14 humana de bajo peso molecular en un espécimen. Preferiblemente, es un método para el análisis de CD14 de bajo peso molecular utilizando un anticuerpo de la presente invención. Más preferiblemente, es un método para el análisis de CD14 de bajo peso molecular utilizando un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, consistiendo el péptido en los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. Además, se prefiere un método para el análisis de CD14 de bajo peso molecular utilizando un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en los residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. En la explicación anterior, además, el "fragmento de anticuerpo, Fab, Fab', o (Fab')_{2}" puede utilizarse en lugar del "anticuerpo".

Además, es un método para un análisis de CD14 de bajo peso molecular con el que se determina la CD14 humana de bajo peso molecular mediante un inmunoanálisis sándwich.

El anticuerpo de la presente invención se puede utilizar como anticuerpo inmovilizado, anticuerpo marcado, o similares. Además, también se incluye un método de análisis que utiliza la segunda unión específica y un anticuerpo anti-inmunoglobulina. En este caso, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención se puede utilizar como anticuerpo libre, anticuerpo que se une a una segunda sustancia de unión específica o a un segundo compañero de unión específica, o similares.

El método para el análisis de la presente invención puede ser un método no competitivo o un método competitivo de inmunoanálisis sándwich, y también puede estar incluida la medición con un método inmunocromatográfico o un método de flujo continuo.

Los detalles se describen en el tercer aspecto de la presente invención.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente solicitud, se proporciona un método in vitro para la detección de la sepsis por el cual se analiza directamente la CD14 humana de bajo peso molecular de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9.

El método de diagnóstico para la sepsis analiza directamente la CD14 de bajo peso molecular.

El método para analizar directamente la CD14 de bajo peso molecular es el descrito en el cuarto aspecto de la presente solicitud. Además, el diagnóstico se puede realizar utilizando el kit descrito en el tercer aspecto de la presente solicitud.

Como se ha descrito en los ejemplos 3, 10 y 11 de más abajo, el análisis de la CD14 de bajo peso molecular en sangre de cada uno de los individuos normales y diversos tipos de pacientes confirmó que un paciente que sufría sepsis mostró específicamente un alto nivel de CD14 de bajo peso molecular. Este hecho significa que el resultado obtenido mediante el análisis utilizando el kit anterior puede ser utilizado como un índice en el diagnóstico de la sepsis. Por ejemplo, se determina el nivel de CD14 de bajo peso molecular en sangre de un paciente y luego se compara con el nivel patrón de los individuos normales obtenido, por ejemplo, promediando sus medidas, o con el intervalo de los niveles de los individuos normales. Por ejemplo, la media + 2DT o 3DT de los individuos normales se utiliza como corte y, cuando el nivel de CD14 de bajo peso molecular es superior a dicho nivel, se define como un índice positivo. Además, también se puede proporcionar un índice para el diagnóstico comparando el nivel medido de CD14 de bajo peso molecular de cada individuo con los niveles de CD14 de bajo peso molecular de los individuos normales y los pacientes que sufren sepsis o los niveles patrón obtenidos mediante la normalización de esos niveles de antemano. Por ejemplo, el nivel de CD14 de bajo peso molecular de un individuo normal se define como de 0 a 0,1 \mug/ml y el nivel de un paciente que sufre sepsis se define como de 0,2 \mug/ml o más, seguido de la comparación con el nivel medido para proporcionar un índice negativo, seudopositivo, o positivo.

Ejemplos

Más adelante, la presente invención se describirá más concretamente por medio de ejemplos. Sin embargo, los ejemplos son únicamente ilustrativos y no se debe considerar de ningún modo que la presente invención está limitada por los mismos. Además, los símbolos utilizados en la siguiente descripción están basados en los símbolos como una convención en la técnica.

Los fabricados por ProMedDx y Sera Care Life Science fueron adquiridos y utilizados como sueros de individuos normales y sueros de pacientes que sufrían sepsis utilizados en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos policlonales utilizando un péptido sintético como antígeno 1-(1) Preparación de péptido como antígeno <1>

Para unir un péptido que tiene la secuencia descrita en el SEQ ID NO: 2 (correspondiente a una secuencia en las posiciones 53 a 68 descritas en el SEQ ID NO: 5) (más adelante, descrito como péptido S68) a una proteína portadora en el extremo N de la misma a través de un grupo SH, el péptido se sintetizó insertando cisteína en el extremo N. Es decir, utilizando un sintetizador de péptidos ABI433A (Applied), las columnas de aminoácidos se alinearon de acuerdo con la secuencia de aminoácidos y se colocó una columna de aminoácidos de cisteína en el extremo N, llevando a cabo a continuación la síntesis automática. El péptido sintetizado se separó mediante corte de la resina mediante un procedimiento convencional y luego se precipitó con éter, se recuperó, y se disolvió en agua destilada de nuevo, seguido de liofilización. Después de disolver el péptido bruto resultante, el péptido se hizo eluir con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo de 5-70% utilizando una HPLC de fase inversa C18 (CAPCELL-Pak, Shiseido Co Ltd), seguido de la recogida de una fracción que contenía un péptido objetivo. La fracción recolectada se liofilizó y se obtuvieron de 2 a 3 mg de péptido purificado.

1-(2) Preparación del antígeno portador del péptido utilizando un péptido sintético <1>

Cada una de las dos clases de péptidos preparadas en 1-(1) se disolvió en agua destilada hasta 10 mg/mL y la disolución se mezcló con 10 mg/mL de hemocianina de lapa ojo de cerradura activada con maleimida (Imject Maleimide Activated Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (PIERCE)) en cantidades equivalentes. Después de que la mezcla hubo reaccionado durante 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se desaló mediante una columna NAP-10 (Amersham Bioscience) equilibrada con solución salina fisiológica para obtener 1 mg de antígeno portador del péptido S68 (más adelante, descrito como péptido S68-KLH). La concentración de las proteínas descritas en los siguientes ejemplos se obtuvo dividiendo la cantidad de KLH utilizada por la cantidad de líquido.

1-(3) Preparación de péptido como antígeno <2>

Se sintetizaron dos tipos de secuencias peptídicas representadas en la Tabla 1 utilizando un sintetizador de péptidos (PSSH-8, Shimadzu Corporation) del mismo modo que en 1-(1) y se purificaron, respectivamente. Se obtuvieron cantidades de aproximadamente 5 mg de cada uno de los péptidos. Por cierto, el "número" en la tabla representa el nombre de un péptido explicado más abajo y la "posición" representa la posición del mismo en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 5.

TABLA 1

1

1-(4) Preparación del antígeno portador del péptido utilizando el péptido sintético <2>

Cada uno de los péptidos preparado en 1-(3) se disolvió en PBS (pH 7,2) que contenía EDTA 0,1 M, y como en el caso 1-(2) se obtuvieron 3 mg de cada uno de los antígenos portadores de péptidos donde KLH se unió a los péptidos respectivos.

1-(5) Preparación del anticuerpo policlonal utilizando el péptido sintético <1>

Para la preparación de un anticuerpo policlonal contra el péptido S68-KLH preparado en 1-(2), se inmunizó un conejo utilizando el péptido S68-KLH. Es decir, se diluyeron 100 \mug de cada uno de los péptidos S68-KLH con 500 \muL de solución salina fisiológica y la disolución se mezcló con 500 \muL de coadyuvante completo de Freund (DIFCO) en cantidades equivalentes, seguido de la administración de la mezcla por vía subcutánea en el dorso de conejos hembra blancos New Zealand (Kitayama Labes) con un peso desde 2,1 a 2,2 kg. Después de 2 semanas, se diluyeron 100 \mug de cada uno de los péptidos S68-KLH con 500 \muL de solución salina fisiológica y la disolución se mezcló con 500 \muL de coadyuvante incompleto de Freund (DIFCO) en cantidades equivalentes, seguido de la administración de la mezcla por vía subcutánea en el dorso. Después de 2 semanas adicionales desde eso, se diluyeron 100 \mug de péptido S68-KLH con 1 mL de solución salina fisiológica y la disolución se administró en una vena de la oreja.

Después de 1 semana desde la finalización de la administración, se recolectó sangre de la vena del oído y el antisuero se separó de la sangre mediante procedimientos rutinarios y se purificó un anticuerpo. En primer lugar, se añadió sulfato de amonio al antisuero hasta una concentración final de saturación del 33%. Después de que la mezcla fuera agitada durante 1 hora a 4ºC, el precipitado separado se centrifugó. Luego, el precipitado se disolvió en tampón de fosfato 76 mM (más adelante, referido como PBS (pH 6,4)) y la disolución se dializó durante la noche. Después de filtrar el producto dializado, el producto filtrado se aplicó a una columna de proteína A (Prosep-A, Millipore). Después, se hizo eluir una fracción de unión de IgG con un tampón de hidrocloruro de glicina 0,1 M (pH 3,0) para obtener un anticuerpo purificado. Después de la diálisis con PBS (pH 6,4), se calculó la concentración de proteínas a partir de la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm (coeficiente de absorción: 0,533 mg/ml). Más adelante, se describirá el anticuerpo obtenido como un anticuerpo policlonal para el péptido S68.

1-(6) Preparación de anticuerpo policlonal utilizando el péptido sintético como antígeno <2>

Utilizando cada uno de los antígenos portadores de péptidos preparados en 1-(4), como en el caso de 1-(3), se realizaron la inmunización y la purificación del antisuero para preparar cada uno de los anticuerpos policlonales peptídicos (anticuerpos policlonales P001 y P002). Además, la inmunización se llevó a cabo de tal manera que el antígeno portador de péptidos (0,5 mg/conejo) se administró 5 veces en dos meses. Después de que se hubo recogido la sangre completa, se obtuvieron cada uno de los antisueros (antisueros P001 y P002).

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1-(7) Preparación del anticuerpo policlonal purificado específico

Para purificar sólo un anticuerpo contra el péptido S68 a partir de los anticuerpos policlonales para el péptido S68, se realizó la purificación específica mediante el método siguiente. En primer lugar, para unir el péptido S68 insertado con cisteína (más adelante, descrito como péptido C-S68) a un portador a través de un grupo SH, se mezclaron 200 \mug de péptido C-S68 por 1 ml de gel de SufoLink Coupling (Pierce) y se hicieron reaccionar de acuerdo su manual. Después de la finalización de la reacción, el grupo activo restante se bloqueó y a continuación se preparó una columna de afinidad de unión al péptido S68. A continuación, se aplicaron 7,92 mg de la fracción de IgG purificada descrita en 1-(3) y a continuación la columna se lavo con un tampón de fosfato (pH 7,4) (Dulbecco, más adelante, descrito como D-PBS (pH 7,9)), seguido de la elución del un anticuerpo anti-péptido S68 con el tampón de hidrocloruro de glicina 0,1 M (pH 3,0). Después de la elución, el pH se reajustó hasta la neutralidad y luego se realizó la diálisis con PBS, seguido del cálculo de la concentración de proteína a partir de la absorbancia a 280 nm (coeficiente de absorción: 0,533 mg/ml). Como resultado, se obtuvieron 0,52 mg de un anticuerpo anti-péptido S68 (más adelante, descrito como anticuerpo S68).

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Ejemplo 2 Preparación del anticuerpo monoclonal utilizando un péptido sintético como antígeno

Se disolvieron 20 \mug de péptido S68-KLH preparado en el Ejemplo 1-(2) en 100 \muL de solución salina fisiológica y se mezclaron con una cantidad equivalente de coadyuvante completo de Freund (DIFCO), seguido de la administración de 100 \muL de la mezcla a cada una de las almohadillas de las patas traseras de una rata hembra Wister de 8 semanas de edad. Al cabo de 2 semanas, se extirparon quirúrgicamente los ganglios linfáticos ilíacos y se realizó la fusión celular. La fusión celular se llevó a cabo de acuerdo con Tamie Ando y Takeshi Chiba: "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Manipulation", página 83, 1991 (Kodansha). En otras palabras, los linfocitos fueron separados de los ganglios linfáticos usando un filtro de células (Falcon) y se mezclaron con células de mieloma (Sp2/O-Ag14) a una proporción 5:1, seguido de la fusión celular utilizando polietilenglicol. Las células fusionadas se suspendieron en un medio HAT y se seleccionaron los hibridomas, seguido del escrutinio de los hibridomas productores del anticuerpo objetivo.

El escrutinio se realizó mediante un método ELISA en el que sCD14(1-307)S2 8 6C se inmovilizó directamente en una placa. Es decir, se añadieron 50 \muL de sCD14(1-307)S286C diluido con tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) a 1 \mug/mL a cada pocillo de una inmunoplaca (Maxisorb, Nunc) y se dejó reposar durante 1 hora a 37ºC. Después de eso, la placa se lavó con agua sometida a intercambio iónico 5 veces y luego se añadieron 100 \muL de PBS (pH 6,4) que contenía BSA al 0,1% a cada pocillo, dejando después en reposo la placa durante 1 hora a temperatura ambiente, para efectuar el bloqueo. A continuación, se añadió a cada pocillo el sobrenadante del cultivo tomado como muestra de los hibridomas seleccionados y se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después de eso, se lavó la placa 3 veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05%. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de una disolución obtenida diluyendo anticuerpo anti-inmunoglobulina de rata marcado con peroxidasa (Dako) con PBS que contenía suero de conejo al 10% diluido 1.000 veces. Después de la reacción a 37ºC durante 1 hora, la placa se lavó 5 veces de la misma forma que antes y se añadió a cada pocillo una disolución de tetrametilbenzidina (TMB, BioFix). Después de una reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con una disolución 0,5 M de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa (NJ-2100, Japan Intermed). Como resultado, se seleccionó un hibridoma capaz de producir un anticuerpo que se une a sCD14(1-3 07)S286C.

A continuación, a partir del pocillo seleccionado, se realizó la clonación mediante un método de dilución limitante de acuerdo con Tamie Ando y Takeshi Chiba: "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Manipulation", página 83, 1991 (Kodansha). Después de 10 días, igualmente, se realizó el escrutinio utilizando como índice la reactividad con sCD14(1-3 07)S286C y se seleccionaron 6 tipos de hibridomas. Los hibridomas seleccionados se cultivaron en un medio FCS/RPMI1640 al 10% (Sigma) y después se cultivaron en Hibridoma-medio SFM (Invitrogen) para producir un anticuerpo. El anticuerpo se purificó utilizando una columna de proteína G (Prosep-G column, Millipore). Se determinó que el subtipo de anticuerpo F1146-17-2 purificado era IgG2b-K de rata utilizando un kit de tipificación de rata (Zymed).

Por cierto, sCD14(1-307)S286C fue preparado utilizando el método descrito en el Ejemplo 9 del documento WO 01/72993.

Ejemplo 3 Estudio de sistema de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular

Utilizando los anticuerpos descritos en los ejemplos 1 y 2, se estudió el sistema de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular con un método IAE sándwich.

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3-(1) Preparación de CD14 humana recombinante

En primer lugar, para la preparación de un anticuerpo monoclonal contra CD14(1-285) para utilizarlo como segundo anticuerpo en el método de ELISA sándwich, se preparó sCD14(1-285) como inmunógeno en E. coli. Con el fin de expresar CD14(1-285) en E. coli, se construyó un plásmido de expresión pTrp1659 mediante el método siguiente.

En primer lugar, se sintetizaron el oligómero 8, que se une a (5'-agc tta gga att t-3') (SEQ ID NO: 15) y el oligómero 8, que se une a (5'-cta gaa att cct a-3') (SEQ ID NO: 16).

Los oligómeros se mezclaron en cantidades equivalentes y se calentaron a 99ºC durante 1 minuto, y la mezcla se recoció después enfriando gradualmente a temperatura ambiente. Además, su extremo 5' se fosforiló mediante la polinucleótido quinasa de T4 para preparar un conector.

A continuación, se sintetizaron un cebador efector (5'-aca tct aga tga cca cgc cag aac ct-3') (SEQ ID NO: 17) y un cebador antisentido (5'-ttt gga tcc tta cta gag atc gag cac tct-3') (SEQ ID NO: 18) y la PCR se realizó utilizando ADN polimerasa Pyrobest y el plásmido pM1659 descrito en el Ejemplo 8 del documento WO 01/72993 como molde.

Después de calentar una solución de reacción durante 2 minutos a 90ºC, se repitió 30 veces el ciclo de 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto.

El producto amplificado resultante de alrededor de 900 pb se sometió a digestión doble con XbaI y BamHI para recoger los fragmentos de ADN. El vector pM710 descrito en el Ejemplo 10 del documento JP 06-025289 A fue sometido a digestión doble con HindIII y BamHI y luego se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recogió. Después de la ligación triple del conector ya fosforilado, fragmento de ADN amplificado mediante PCR/fragmento digerido con XbaI + BamHI, y vector/fragmento HindIII + BamHI, que se han descrito anteriormente, el producto resultante fue transformado en células de E. coli competentes (JM109 (TOYOBO) para obtener un clon que contenía el plásmido objetivo. El ADN plasmídico se preparó mediante procedimientos rutinarios.

Con posterioridad, se preparó la cepa transformante JE7924 para la producción de CD14(1-285) utilizando un método de electroporación.

En primer lugar, se restableció E. coli JE7924 (J. Bacteriol 173, pág. 4799, (1991)) a partir de una provisión de glicerol y se incubó en un medio LB a 37ºC durante la noche. Además, las bacterias se inocularon en 50 ml de medio LB fresco y se incubaron continuamente hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,5 a 0,6, enfriando después directamente con hielo un matraz de cultivo durante 30 minutos. A continuación, las células de E. coli se recogieron y se lavaron dos veces con agua destilada esterilizada enfriada hielo y una vez con una disolución de glicerol al 10% enfriada con hielo, seguido de suspensión en 100 \muL de una disolución de glicerol al 10% enfriada con hielo. La suspensión se dispensó en dos tubos con alícuotas de 50 \muL y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido para preparar células competentes (JE7924), que fueron guardadas a -80ºC hasta el momento de su uso.

A continuación, se transformaron 50 pL de células competentes JE7924 con 30 ng de mediante el dispositivo de electroporación, Gene Pulser de BIO-RAD Co., Ltd. Además, los ajustes en este momento fueron un voltaje de 2,5 kV y una resistencia de 200 \Omega, y una capacitancia de 25 \muF. Después de eso, el producto resultante se incubó en una placa de agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina durante la noche para obtener un clon transformado con pTrp1659. Su clon se incubó a 37ºC durante la noche en medio LB y después se inoculó en un medio de nueva aportación, seguido de incubación durante 5 horas adicionales. La DO a 600 nm de la suspensión de cultivo llegó a 2-3, se añadió ácido 3\beta-indolacrílico (Sigma Co., Ltd.) a una concentración final de 100 \mug/mL y la mezcla se incubó a 37ºC durante 4 horas, dando como resultado la inducción de la expresión de sCD14(1-285). A continuación, se recogió E. coli y después se preparó un cuerpo de inclusión con Bug Buster Protein Extraction Reagent (Novagen, Co., Ltd.). Después de eso, el cuerpo de inclusión se disolvió en un tampón de SDS-PAGE y se llevó a cabo una SDS-PAGE para identificar la expresión de sCD14(1-285) mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-CD14.

Del mismo modo, se preparó sCD14(1-285) para utilizarlo como inmunógeno incubando una cepa transformante JE7924 en 1 litro de medio LB. En primer lugar, se centrifugó la disolución de cultivo. Después de recoger la células de E. coli, las células bacterianas se lavaron con D-PBS y se añadieron 50 ml de Bug Buster Protein Extraction Reagent (Novagen, más adelante denominado Bug Buster) a las células bacterianas recogidas. Las células bacterianas se suspendieron y dejaron reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la lisis, las células bacterianas fueron sometidas a un tratamiento de sonicación de 10 minutos (US-3, Iuchi Seieido) y se centrifugaron a 10.000 x g
a 4ºC durante 20 minutos para eliminar el sobrenadante. Del mismo modo, se realizó un tratamiento de sonicación adicional a las células y el precipitado resultante se suspendió en 50 mL de Bug Buster. La suspensión se añadió a 1 mL de lisozima de 10 mg/mL (Seikagaku Corporation), y la totalidad se agitó suavemente y dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Con posterioridad, se añadieron 200 ml de Bug Buster de alta concentración a 1/10 en volumen a la mezcla y la totalidad se agitó, sometiéndola después a centrifugación de manera similar para eliminar el sobrenadante. El precipitado resultante se suspendió mediante la adición de 200 ml de una concentración 1/10 de Bug Buster y luego la suspensión se centrifugó de manera similar, repitiendo después esta operación varias veces. Se añadieron 100 ml de D-PBS al precipitado obtenido finalmente, dando como resultado un cuerpo de inclusión.

Para la preparación de sCD14(1-285), el cuerpo de inclusión se disolvió en un tampón TE (pH 8,0, Nippon Gene) que contenía Triton-X100 al 1% y la disolución se sometió a congelación y descongelación 3 veces, recogiendo después un precipitado mediante centrifugación. El precipitado se disolvió en el tampón TE (pH 8,0, Nippon Gene) que contenía Triton-X100 al 1% de nuevo, y la disolución se enfrió con hielo y después se sometió a un tratamiento ultrasónico de 12 minutos con 250 \muA a intervalos de 10 segundos y se centrifugó, seguido de la recogida de un precipitado. El precipitado resultante se disolvió en un tampón TE (pH 8,0, Nippon Gene) con Triton-X100 al 1% y NaOH 0,2 M y después se trató a 37ºC durante 10 minutos, se centrifugó, y se volvió a disolver tres veces, seguido de la recogida de un precipitado. El precipitado resultante se disolvió en una disolución acuosa que contenía guanidina-ácido clorhídrico 6 M para preparar CD14(1-285) purificada. Su concentración se calcula mediante un análisis de la proteína de Bradford utilizando BSA como preparación patrón.

3-(2) Preparación del anticuerpo monoclonal anti-CD14 [1] Preparación de Anticuerpos F1106-13-3

Utilizando CD14(1-285) derivado de E. coli descrito antes como antígeno que se va a administrar, se preparó un anticuerpo monoclonal. En primer lugar, se mezclaron 20 \mug de sCD14(1-285) purificado con coadyuvante completo de Freund (DIFCO) en cantidades equivalentes, seguido de la administración intraabdominal de 200 \muL de la mezcla a un ratón ddy hembra de 6 semanas de edad. Después de 2 semanas, se mezclaron 20 \mug de sCD14(1-285) purificado con coadyuvante incompleto de Freund (DIFCO) en cantidades equivalentes, seguido de la administración intraabdominal de 200 \muL de la mezcla. Se administraron intraabdominalmente 50 \muL de antígeno a los ratones 3 días antes de la fusión celular. Al cabo de 3 días, el bazo se extirpó de forma aséptica. Los linfocitos se aislaron del bazo y se mezclaron con células de mieloma (P3x63-Ag. 8. U.1) a una proporción 10:1 y la fusión se realizó con polietilenglicol de acuerdo con el método descrito en Tamie Ando y Takeshi Chiba: "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Manipulation", página 83, 1991 (Kodansha). Después de seleccionar los hibridomas utilizando un medio HAT, se realizó el escrutinio de hibridomas productores de anticuerpos que se unen a sCD14(1-285) mediante un método ELISA.

En primer lugar, se diluyó CD14(1-285) con PBS (pH 6,4) a 0,4 \mug/mL y después se añadieron 50 \muL de la disolución resultante a cada pocillo de una immunoplaca (Maxisorb, NUNC) y se hicieron reaccionar a 4ºC durante la noche. Después de eso, la placa se lavó con agua sometida a intercambio iónico 5 veces y luego se añadieron a cada pocillo 100 \muL de PBS (pH 6,4) que contenía BSA al 0,5% para su bloqueo. A continuación, se añadió a cada pocillo el sobrenadante del cultivo del que se habían tomado muestras y se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después de eso, la placa se lavó 3 veces con solución salina fisiológica que contenía de Tween 20 al 0,05%. Con posterioridad, se añadieron a cada pocillo 50 \muL de una disolución obtenida diluyendo anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (Dako) con PBS que contenía suero de conejo al 10% 1.000 veces. Después de una reacción a 37ºC durante 1 hora, la placa se lavó 5 veces de la misma manera que antes y se añadió a cada pocillo una disolución de tetrametilbenzidina (TMB, BioFix). Después de una reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con una disolución 0,5 M de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa (NJ-2100, Japón Intermed). Basándose en los resultados, se seleccionó un pocillo que contenía un hibridoma que producía un anticuerpo que se unía a scud14(1-285). A continuación, a partir del pocillo seleccionado, se realizó la clonación mediante un método de dilución limitante de acuerdo con Tamie Ando y Takeshi Chiba: "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Manipulation", página 83, 1991 (Kodansha). Al cabo de 10 días, igualmente, se realizó el escrutinio utilizando la reactividad con sCD14(1-285) como un índice para seleccionar hibridomas. Como resultado, se seleccionaron 12 tipos de hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-sCD14(1-285).

Los hibridomas seleccionados se cultivaron en un medio FCS/RPMI1640 al 10% (Sigma) y después se cultivaron en Hibridoma-medio SFM (Invitrogen) para producir un anticuerpo. El anticuerpo fue purificado utilizando una columna con proteína A (Prosep-A, Millipore).

El subtipo de anticuerpo F1106-13-3, que era un anticuerpo que tenía una sensibilidad particularmente elevada, se determinó como IgG2b.K utilizando IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit (Roche).

[2] Preparación del anticuerpo F1031-8-3

El anticuerpo F1031-8-3 se preparó utilizando el método descrito en el Ejemplo 7 del documento WO 01/22085. Descrito brevemente, se disolvieron 20 \mug de proteína CD14 derivada de sangre humana en solución salina fisiológica y la disolución se mezcló con coadyuvante completo de Freund (DIFCO) en cantidades equivalentes. Luego, al cabo de 1 semana de cada una de una administración intra-abdominal inicial y una segunda administración 2 semanas después de la inicial, se confirmó un mayor nivel de título de anticuerpo en suero mediante un método ELISA en la reactividad de la proteína CD14 humana recombinante como en el caso del Ejemplo 5 del documento WO 01/22085. Se administraron intraabdominalmente 100 \mug de antígeno a un ratón como administración final y al cabo de 3 días el bazo se extirpó quirúrgicamente del ratón. Se aislaron linfocitos del bazo y se mezclaron con las células de mieloma (P3x63-Ag. 8. U.1) a una proporción de 10:1 y se realizó la fusión celular con polietilenglicol. Los hibridomas se seleccionaron utilizando medio HAT y después de una semana se realizó el escrutinio de los hibridomas productores de anticuerpos mediante el método ELISA descrito anteriormente. El hibridoma que había reaccionado con la proteína CD14 soluble inmovilizada se clonó mediante el método de dilución limitante. Después de 10 días, de manera similar, se realizó el escrutinio para obtener un anticuerpo monoclonal anti-CD14. Se obtuvo el anticuerpo F1031-8-3 que tenía el subtipo IgG2b\cdot\kappa determinado utilizando IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche) en forma de un anticuerpo típico.

3-(3) Estudio del sistema de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular

Para la preparación de un sistema capaz de detectar específicamente CD14 humana de bajo peso molecular, se preparó un sistema de IAE sándwich utilizando los anticuerpos descritos en los Ejemplos 1, 2 y 3-(2).

[1] Preparación del anticuerpo marcado con peroxidasa

Se preparó un anticuerpo marcado con peroxidasa de acuerdo con el método de Nakane et al. (J. Histochem. Cytochem., Vol. 22, pág. 1084, 1974). Es decir, se disolvieron 4 mg de peroxidasa (Toyobo) en agua destilada y la disolución se hizo reaccionar a 25ºC durante 20 minutos mediante la adición de ácido periódico 100 mM. Una vez completada la reacción, se añadió etilenglicol al 1,5% al producto de reacción y el conjunto se hizo reaccionar a 25ºC durante 10 minutos, seguido por diálisis frente a un tampón de acetato 1 mM (pH 4,4). Cada uno del anticuerpos F1031-8-3 y del anticuerpo F1106-13-3 purificados se dializó con un tampón de bicarbonato 10 mM (pH 9,5), y luego se mezclaron 4 mg de peroxidasa activada mediante la adición de 70 \mul de un tampón de bicarbonato 0,2 M (pH 9,5) por 4 mg con el antígeno en cantidades equivalentes para permitir una reacción a 25ºC durante 2 horas. A continuación, se añadieron 4 mg/mL de borohidruro de sodio y luego se hizo proseguir la reacción durante 2 horas a 4ºC. La solución de reacción se dializó con PBS, dando como resultado un anticuerpo F1031-8-3 marcado con peroxidasa (más adelante, puede ser descrito como F1031-8-3-HRP) y un anticuerpo marcado con peroxidasa F1106-13-3 (más adelante, puede ser descrito como F1106-13-3-HRP). La concentración de anticuerpo fue calculada a partir de la cantidad de anticuerpo utilizado y del volumen de la disolución de anticuerpo marcado.

[2] Preparación del sistema de IAE sándwich <1>

Se preparó un sistema de IAE sándwich de 2 etapas utilizando el anticuerpo S68 preparado como anticuerpo inmovilizado en el Ejemplo 1 y los anticuerpos preparados en el Ejemplo 3-(2)[1] y [2], como anticuerpos marcados. Es decir, el anticuerpo S68 se diluyó con D-PBS (pH 7,4) a 10 \mug/mL y después se añadieron 50 \muL de la disolución resultante a cada pocillo de una immunoplaca (Maxisorb, NUNC) y se hicieron reaccionar a 4ºC durante la noche. Después de eso, la placa se lavó con agua sometida a intercambio de iónico 5 veces y luego se añadieron 100 \muL de D-PBS que contenía StabilGuard al 0,1% (SurModics, Inc) y Tween 20 al 0,1% a cada pocillo para efectuar su bloqueo. Utilizando como diluyente PBS (pH 7,4) que contenía suero de individuos normales al 1% (suero del que se eliminó la CD14 soluble utilizando 3Cl0, más adelante, descrito como suero que absorbe CD14) y BSA al 0,1%, se prepararon los especímenes diluidos de sueros humanos de individuos normales y sueros humanos de pacientes que sufrían sepsis diluyendo los sueros 20 veces, respectivamente. Se añadió un espécimen diluido a una concentración de 50 \muL por pocillo y se hizo reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Una vez completada la reacción, el espécimen se lavó tres veces con solución salina fisiológica con Tween 20 al 0,05% y se añadieron a cada pocillo 50 \muL de F1031-8-3-HRP o F1106-13-3-HRP diluidos a 0,6 \mug/ml con PBS 76 mM (pH 8,0) que contenía de suero de rata al 5%, suero de ratón al 1% y Tween 20 al 0,1%. Después de una reacción a 37ºC durante 2 horas, la placa se lavó 5 veces de la misma forma que antes y se añadió una disolución de tetrametilbenzidina (TMB, BioFix) a cada pocillo. Después de una reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con una disolución 0,5 M de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa (NJ-2100, Japón Intermed). Como resultado, según se muestra en la Tabla 2, fue susceptible de ser analizada una proteína soluble en sangre, es decir, la CD14 de bajo peso molecular definida en la presente invención, que pudo no aumentar en un individuo normal, pero aumentar en un paciente que sufría sepsis grave en el sistema en el que se utilizó el anticuerpo derivado del péptido S68.

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[3] Preparación del sistema de IAE sándwich <2>

1.

1) Se preparó un sistema de IAE sándwich de 2 etapas utilizando el anticuerpo F1146-17-2 preparado como anticuerpo inmovilizado en el Ejemplo 2 y los anticuerpos preparados en el Ejemplo 3-(2) y [2], como anticuerpo marcado. El anticuerpo F1146-17-2 se diluyó con PBS (pH 6,4) a 120 \mug/mL y se añadieron 50 \muL de la disolución resultante a cada pocillo de una immunoplaca (Maxisorb, NUNC) y se hicieron reaccionar a 56ºC durante 30 minutos. Después de eso, la placa se lavó con agua sometida a intercambio iónico 5 veces y luego se añadieron a cada pocillo 100 \muL de PBS que contenía StabilGuard al 0,1% (SurModics, Inc) y Tween 20 al 0,1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), para efectuar su bloqueo. Utilizando como diluyente PBS (pH 6,4) que contenía BSA al 1%, se prepararon los especímenes diluidos de suero humano de individuos normales y los sueros humanos de pacientes que sufrían sepsis diluyendo los sueros 10 veces, respectivamente. Se añadió un espécimen diluido a una concentración de 50 \muL por pocillo y se hicieron reaccionaron a 25ºC durante 2 horas.

Una vez completada la reacción, la placa se lavó tres veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05% y se añadieron a cada pocillo 50 \muL de anticuerpo F1031-8-3 marcado con peroxidasa diluido a 0,5 \mug/mL con tampón de fosfato 76 mM (pH 8,0) que contenía de suero de rata al 5%, suero de ratón al 1% y Tween 20 al 0,1%. Después de una reacción a 25ºC durante 2 horas, la placa se lavó 5 veces de la misma forma que antes y se añadió a cada pocillo una disolución de tetrametilbenzidina (TMB, BioFix). Después de una reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con una disolución 0,5 M de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa (NJ-2100, Japón Intermed). Como resultado, al igual que con el anticuerpo S68, en el caso del anticuerpo monoclonal específico del péptido S68, como se muestra en la Tabla 2, fue susceptible de ser analizada la CD14 de bajo peso molecular, que casi no se encontró en el suero de individuos normales, pero se encontró a un alto nivel en el suero de pacientes que sufrían sepsis. Es decir, el resultado confirmó que un anticuerpo que se une al péptido S68 puede preparar un sistema sándwich, con independencia de que el anticuerpo sea policlonal o monoclonal.

2.

2) Se preparó un sistema de IAE sándwich de dos etapas, donde el anticuerpo inmovilizado utilizado fue el anticuerpo policlonal preparado utilizando el péptido sintético como antígeno en el Ejemplo 1-(6). Se realizó un análisis utilizando como especímenes sueros de individuos humanos normales y de pacientes humanos que sufrían de sepsis del mismo modo que en 3-[2], pero se utilizaron el anticuerpo policlonal P001, el anticuerpo policlonal P002 o el anticuerpo policlonal P012 en lugar de los anticuerpos S68. Como resultado, como se muestra en la Tabla 2, al igual que con el anticuerpo S68, en el caso del anticuerpo policlonal que utiliza el péptido sintético como antígeno, la CD14 de bajo peso molecular, que casi no se encontró en el suero de un individuo normal humano, pero se encontró a un alto nivel en el suero de un paciente que sufría sepsis, fue susceptible de ser analizada. Los resultados confirmaron que se puede realizar un sistema sándwich incluso en un sistema que utiliza un anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, el péptido que tiene de 8 a 16 residuos aminoácido seleccionados de las secuencias de aminoácidos de las posiciones 1 a 285 de la CD14 humana de elevado peso molecular.

En la Tabla 2, "++" representa una absorbancia de 4 veces o más a 450 nm frente a la absorbancia del propio disolvente y "+" representa una absorbancia de 2 veces o más, y "-" representa una absorbancia igual a la absorbancia del diluyente.

TABLA 2

2

[4] Preparación del sistema de IAE sándwich <3>

Se preparó un sistema de IAE sándwich de 3 etapas utilizando un anticuerpo F-1031-8-3 como anticuerpo inmovilizado y un anticuerpo S68 como anticuerpo marcado. El presente sistema de IAE se realizó biotinilando el anticuerpo S68 como sigue. Esto es, se añadieron 50 \muL de Éster de N-hidroxisuccinimida de Ácido D-Biotinoil-\varepsilon-aminocaproico (Roche), preparado a 300 \mug/mL disolviéndolo en DMSO a 0,5 ml de anticuerpo S68 preparado a una concentración de 0,93 mg/ml sustituyéndolo por un tampón de fosfato 0,05 M (pH 8,0) que contenía NaCl 0,15 M y la mezcla se hizo reaccionar mientras se agitaba durante 2 horas a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, el producto de la reacción fue sustituido por PBS (pH 7,4) mediante una columna de desalación (NAP-5, Amersham Bioscience). La concentración del anticuerpo S68 biotinilado preparado (más adelante, puede ser descrito como anticuerpo Bio-S68) se calculó utilizando un coeficiente de absorción de 1,4 basándose en la absorbancia a
280 nm.

El sistema de IAE sándwich inmovilizó el anticuerpo F1031-8-3 en una immunoplaca (NUNC) y lo bloqueó. Se retiró la disolución de bloqueo. Después, se añadieron a los pocillos 500 ng/mL de sCD14(1-307)s286c (en adelante, puede ser descrita como preparación patrón) disuelto en BSA/PBS al 0,1% y una disolución sin preparación patrón como control negativo, respectivamente. La placa se lavó después de una reacción a 37ºC durante 1 hora y, posteriormente, se añadieron 50 \muL de anticuerpo S68 biotinilado preparado a 1 \mug/mL diluyendo con PBS (pH 7,4) que contenía de suero de rata al 2%, suero de ratón al 1%, de suero de conejo al 1%, y Tween 20 al 0,1% y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Una vez completada la reacción, la placa se lavó y luego se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa diluida 10.000 veces (que se puede describir como SA-HRP, Invitrogen). La placa se lavó después de una reacción durante 1 hora. Después de desarrollar color con una disolución de TMB (BioFix), la reacción se finalizó con un líquido de terminación y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.).

Como se muestra en la Tabla 3, en el presente sistema, fue posible preparar un de sistema de IAE sándwich. En otras palabras, los autores confirmaron que se puede preparar un sistema de análisis sándwich incluso si se utiliza un anticuerpo que se une al péptido S68 como anticuerpo inmovilizado o se utiliza como anticuerpo libre o anticuerpo marcado. En la Tabla 3, "++" representa que la diferencia de absorbancia con 0 a 500 ng/mL de la preparación patrón es de 0,5 Abs o más, "+" representa 0,1 o más, y "-" representa menos de 0,1.

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[5] Preparación del sistema de IAE sándwich <4>

Se preparó un sistema de IAE de una etapa de tal manera que los anticuerpos inmovilizados y marcados fueron del mismo sistema que el de [2], y se añadieron simultáneamente un espécimen y el anticuerpo marcado. Esto es, se añadieron 25 \mul de cada una de las preparaciones patrón de 0 y 500 ng/mL a una placa con el anticuerpo S68 inmovilizado, seguido de la adición de 25 \muL of F1031-8-3-HRP preparado a 1 \muL/mL mediante dilución con PBS (pH 7,4) que contenía suero de rata al 2%, suero de ratón al 1%, suero de conejo al 1%, y Tween 20 al 0,1%. La reacción se llevó a cabo durante 1 hora a 37ºC. Una vez completada la reacción, la placa se lavó y se coloreó con una disolución de TMB (BioFix). Después, la reacción se finalizó con un líquido de terminación, seguido de la medición de la absorbancia a 450 nm utilizando un contador de la absorbancia en placa E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.). Como se muestra en la Tabla 3, también se elaboró un sistema de IAE sándwich en el presente sistema. Es decir, los autores de la presente invención confirmaron que un sistema de análisis sándwich que utiliza un anticuerpo que se une al péptido S68 puede llevar a cabo un análisis sin ninguna relación con la secuencia de reacción.

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[6] Preparación de sistema de IAE sándwich <5>

Los anticuerpos inmovilizados y marcados fueron del mismo sistema que los de [2], y se hicieron reaccionar de forma simultánea un espécimen y el anticuerpo marcado. Después, se preparó un sistema de IAE de dos etapas para reaccionar con el anticuerpo inmovilizado. Eso es, se mezclaron 25 \mul de cada una de las preparaciones patrón de 0 y 500 ng/mL con 25 \muL de F1031-8-3-HRP preparado a 2 \mug/ml con PBS (pH 7,4) que contenía suero de rata al 2%, suero de ratón al 1%, suero de conejo al 1%, y Tween 20 al 0,1%. Después de la finalización de la reacción, la solución de reacción se añadió a una placa con anticuerpo S68 inmovilizado, y la totalidad se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La placa se lavó y luego coloreó con una disolución de TMB (BioFix) y después la reacción se finalizó con un líquido de terminación, seguido de la medición de la absorbancia a 450 nm, utilizando un contador de absorbancia en placa E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.). Como se muestra en la Tabla 3, también se elaboró un sistema de IAE sándwich en el presente sistema. Es decir, los autores de la presente invención confirmaron que un sistema de análisis sándwich que utiliza un anticuerpo que se une al péptido S68 puede llevar a cabo el análisis sin ninguna relación con la secuencia de reacción.

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[7] Preparación del sistema de IAE sándwich <6> Se preparó un sistema de IAE sándwich utilizando la unión específica de biotina-estreptavidina.

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1) Sistema de análisis utilizando estreptavidina en el lado de la inmovilización

Se dispensó estreptavidina (PIERCE) diluida a 10 \mug/ml con PBS (pH 7,4) a inmunoplacas (NUNC) con alícuotas de 50 \muL y se inmovilizó tratándola a 4ºC durante la noche, respectivamente. Después del bloqueo, se descartó el líquido y se añadieron 25 \muL de cada uno de los anticuerpos S68 biotinilados preparados a 2 pg/ml con PBS (pH 7,4) que contenía de suero de rata al 2%, suero de ratón al 1%, suero de conejo al 1%, y Tween 20 al 0,1% y las preparaciones patrón a 0 y 500 ng/mL disueltas en BSA/PBS al 0,1%. Después de una reacción durante 1 hora a 37ºC, la placa se lavó y con posterioridad se añadieron 50 \muL de F1031-8-3-HRP diluido a 1 \mug/mL, seguido de una reacción a 37ºC durante 1 hora. Una vez completada la reacción, la placa se lavó y se coloreó con una disolución de TMB (BioFix) y, a continuación, la reacción se finalizó con un líquido de terminación, seguido de la medición la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.). Los presentes sistemas se analizaron de una manera similar, incluso si se añadían simultáneamente la preparación patrón, el anticuerpo S68 biotinilado, y el anticuerpo F1031-8-3 marcado con peroxidasa. Como se muestra en la Tabla 3, los sistemas de IAE sándwich se pudieron preparar en ambos sistemas.

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2) Sistema de análisis utilizando estreptavidina marcada con peroxidasa

El presente sistema se elaboró mediante el método indicado en [4]. Además, se estudió un método de 2 etapas, en el que se llevó a cabo una reacción a 37ºC durante 1 hora después de la adición simultánea de una preparación patrón y anticuerpo F1031-8-3 biotinilado (que puede ser descrito como Bio-F1031-8-3) preparado de acuerdo con [4] y se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa (Invitrogen) diluida aproximadamente 10.000 veces después del lavado. Una vez completada la reacción, la placa se lavó y se coloreó con una disolución de TMB (BioFix) y a continuación la reacción se finalizó con un líquido de terminación, seguido de la medición de la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro de placa E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.). Como se muestra en la Tabla 3, en el presente sistema, también se pudo preparar un sistema sándwich de IAE. Es decir, los autores de la presente invención confirmaron que se puede realizar el análisis incluso si se prepara una sustancia inmovilizada o marcada utilizando una segunda unión específica tal como la unión de la biotina y estreptavidina con tal que la CD14 de bajo peso molecular se encuentre intercalada entre un anticuerpo que se une al péptido S68 y un anticuerpo que se une al analito a analizar, la CD14 de bajo peso molecular de suero humano. Por cierto, "Str" representa estreptavidina y "Bio" representa biotinilado.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

3

Ejemplo 4 Preparación del sistema de análisis inmunocromatográfico 4-(1) Método inmunocromatográfico utilizando anticuerpo marcado con oro coloidal <1>

Se preparó un sistema de análisis que pudiera ser utilizado fácilmente en el laboratorio o junto al lecho del paciente. El perfil del sistema de análisis se mostró en la Fig. 1 (A). En primer lugar, se preparó un anticuerpo F1106-13-3 marcado con oro coloidal mezclando 1 mL de oro coloidal (40 nm de diámetro de partícula, BB Internacional) con 9 \mug de anticuerpo F1106-13-3. A continuación se preparó un lecho conjugado. Es decir, el anticuerpo F1106-13-3 marcado con oro coloidal se diluyó con un tampón de aplicación conjugada de manera que la absorbancia a 520 nm fuera de alrededor de 1,5 y después se aplicó 1 ml de la disolución resultante a una tira 33-Glass de 10 x 150 nm, seguido de secado a presión reducida durante la noche. En este momento, el título de anticuerpo del anticuerpo F1106-13-3 marcado con oro coloidal en un reactivo por análisis fue de aproximadamente 50 unidades (1 unidad equivale a 1 \muL de anticuerpo F1106-13-3 marcado con oro coloidal a una D0520 = 1,0). La membrana con el anticuerpo inmovilizado se preparó como sigue. El anticuerpo S68 se diluyó a 1 mg/ml con PBS (pH 7,4) y la disolución se aplico de forma lineal a una membrana de nitrocelulosa (FF85/100, Schleicher & Schuell) en una cantidad de 0,75 \muL/cm utilizando una máquina de recubrimiento de inyección de tinta fabricada por BioDot Co., Ltd. En este momento, se aplicó simultáneamente una línea de control (anticuerpo policlonal anti-ratón, Dako). Después del secado, la membrana se sumergió en un líquido de bloqueo que contenía caseína al 0,5% durante 30 minutos y luego se retiró una parte del exceso de líquido, seguido de nuevo de secado. A continuación, se formuló un reactivo inmunocromatográfico utilizando cada uno de los materiales preparados. Es decir, un lecho conjugado, una membrana inmovilizada, un lecho de absorción superior (Papel de filtro de Núm. 900 Schleicher & Schuell), o un lecho para añadir gota a gota la muestra (filtro de fibra de vidrio 33-Glass, Schleicher & Schuell) se anclaron a una lámina con el dorso de plástico PB020 (BioDot) que luego se cortó a 5 mm de ancho con un cortador de tiras fabricado por BioDot Co., Ltd. La tira cortada se ubicó en un estuche (NIPPN Technocluster, Inc.) y se proporciono como reactivo inmunocromatográfico.

Se realizó un análisis como se describe a continuación, utilizando el reactivo preparado. Se proporcionó como muestra una preparación patrón diluida 10^{n} veces en el rango de 10.000 a 1 ng/ml con BSA-PBS al 1%. Después, se añadieron gota a gota 100 \muL de la muestra al reactivo para determinar la presencia o ausencia de una línea después de haber dejado estar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los criterios de evaluación fueron los siguientes:

(++):

Nivel al cual se desarrolla una línea gruesa de modo que la línea se puede considerar claramente como positiva;

(+):

Nivel al que el desarrollo de color se puede considerar como una línea a pesar de que el desarrollo del color es pálido;

(\pm):

Nivel al cual se observa ligeramente lo que parece ser desarrollo de color, pero es difícil que sea reconocido como una línea, y

(-):

Nivel al que no se reconoce desarrollo del color.

Como resultado, como se muestra en la Fig. 2 y en la Tabla 4, se obtuvo una sensibilidad de "+" o mayor a una concentración de la muestra de 10 ng/mL o mayor. Por lo tanto, el resultado confirmó que el análisis se puede realizar de manera simple y rápida mediante un sistema inmunocromatográfico.

4-(2) Método inmunocromatográfico utilizando el anticuerpo marcado con oro coloidal <2>

El análisis se llevó a cabo mientras se dispusieron inversamente el antígeno inmovilizado y el anticuerpo marcado con oro coloidal del sistema de análisis inmunocromatográfico preparado en 4-(1). El marcador de oro coloidal del anticuerpo S68 y el sistema inmunocromatográfico se pudieron preparar del mismo modo que en 4-(1). Como resultado, como se muestra en la Tabla 4, se obtuvo una sensibilidad de "+" o mayor a una concentración de la muestra de 100 ng/mL o mayor.

TABLA 4

4

4-(3) Preparación del método inmunocromatográfico utilizando el sistema de estreptavidina-biotina

Además, se preparó un análisis inmunocromatográfico utilizando un sistema de estreptavidina-biotina. El perfil del análisis se muestra en la Fig. 1(B). En primer lugar, de acuerdo con el ejemplo 3-2[4], el anticuerpo F1031-8-3 se biotiniló. Después, se preparó estreptavidina marcada con oro coloidal mezclando 1 mL de oro coloidal (40 nm de diámetro de partícula, B.B. International) con 10 \mug de estreptavidina. La estreptavidina marcada con oro coloidal se diluyó con un tampón de aplicación conjugada para que la absorbancia a 520 nm fuera de alrededor de 1,5 y después se aplicó 1 ml de la disolución resultante a una tira 33-Glass de 10 x 150 nm, seguido de secado a presión reducida durante la noche. En este momento, el título de anticuerpo de la estreptavidina marcada con oro coloidal en el reactivo por prueba fue de aproximadamente 50 unidades (1 unidad equivale a 1 \muL de estreptavidina marcada con oro coloidal a DO520 = 1, 0). La membrana con el anticuerpo inmovilizado se preparó como sigue. El anticuerpo S68 se diluyó a 1 mg/ml con PBS (pH 7,4) y la disolución se aplicó de forma lineal a una membrana de nitrocelulosa (FF85/100, Schleicher & Schuell) a una cantidad de 0,75 \muL/cm utilizando una máquina de recubrimiento de inyección de tinta fabricada por BioDot Co., Ltd. En este momento, se aplicó simultáneamente una línea de control (anticuerpo policlonal anti-ratón, Dako). Después del secado, la membrana se sumergió en un líquido de bloqueo que contenía caseína al 0,5% durante 30 minutos y luego se retiró la parte en exceso de líquido, seguido de nuevo de secado. A continuación, se formuló un reactivo inmunocromatográfico utilizando cada uno de los materiales preparados.

Es decir, un lecho conjugado, una membrana inmovilizada, un lecho de absorción superior (filtro del Núm. 900, Schleicher & Schuell), o un lecho para añadir gota a gota la muestra (filtro de fibra de vidrio 33-Glass, Schleicher & Schuell) se anclan a una lámina con el dorso de plástico PB020 (BioDot) que luego se corta a 5 mm de ancho con un cortador de tiras fabricado por BioDot Co., Ltd. La tira cortada se ubicó en un estuche (NIPPN Technocluster, Inc.) y se proporcionó como un reactivo inmunocromatográfico. Se realizó un análisis como se describe a continuación utilizando el reactivo preparado. Se proporcionó como muestra una preparación patrón diluida 10^{n} veces en el intervalo de 10.000 a 1 ng/mL con BSA-PBS al 1%. Después, se añadieron gota a gota 100 \muL de la muestra a 100 \muL de reactivo que contenía 0,1 \mug de F1031-8-3 biotinilado, y la totalidad se mezcló. Luego, se añadieron gota a gota 100 \muL de la mezcla a un lecho para añadir gota a gota la muestra del estuche para determinar la presencia o ausencia de una línea después de haber dejado reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Por lo tanto, en el presente sistema, también se obtuvo una sensibilidad de "+" o mayor a una concentración de 100 ng/ml o mayor como en el caso de (1).

Ejemplo 5 Preparación del sistema de análisis de flujo continuo

Se preparó un sistema de análisis continuo de acuerdo con el documento JP 06-273419 A. Es decir, se suspendió 1 g de colorante disperso (Rojo Violeta, Kayaron, Co., Ltd.) en 10 ml de agua destilada y, a continuación se resuspendieron en 5 ml de agua destilada, después de lavarlos con agua destilada. Se añadieron 0,2 mL de anticuerpo F1031-8-3 a 0,5-mg/mL diluido con solución salina fisiológica a 0,2 mL del colorante disperso y el conjunto se incubó a 45ºC durante 30 minutos. Después de enfriar con hielo el producto resultante, se realizó la separación centrífuga. El precipitado resultante se resuspendió en PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 0,5% y lactosa al 10% para preparar un anticuerpo F1031-8-3 marcado con colorante disperso. A continuación, el anticuerpo F1031-8-3 marcado con colorante disperso se dispensó en alícuotas de 0,1 ml y se sumergió en el papel de filtro (Núm. 63, Advantec Toyo) cortado a 14 mm de diámetro, seguido de liofilización para preparar un cuerpo poroso adherido a un reactivo soluble.

La inmovilización sobre una membrana se realizó de la siguiente manera. En primer lugar, se aplicaron 2 mg/mL de anticuerpo S68 diluido con solución salina fisiológica sobre una membrana de nitrocelulosa (Advantec Toyo) de 5 micras de diámetro de poro y se secaron a 37ºC. A continuación, se realizó el bloqueo utilizando PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 1% para preparar una membrana con un anticuerpo inmovilizado. Los materiales preparados se ensamblan en un estuche en el siguiente orden. Se prepara un reactivo de análisis ensamblando el cuerpo poroso adherido a un reactivo soluble, la membrana con el anticuerpo inmovilizado, el papel de filtro de polipropileno laminado (Núm. 28, Advantec Toyo), y una placa transparente de policarbonato de 0,5 mm de espesor, en orden. Se inició un análisis mediante la adición de 0,5 ml de una muestra al reactivo de análisis y se realizó una evaluación observando el color de la parte posterior a simple vista después de que la muestra hubiera sido completamente absorbida.

Ejemplo 6 Especificidad del anticuerpo S68

Para confirmar la especificidad del anticuerpo S68 preparado en el Ejemplo 1, los autores de la presente invención estudiaron si el bloqueo se produce por un péptido mediante el mismo análisis que en el Ejemplo 3-(3). Es decir, el péptido S68 (secuencia de aminoácidos de las posiciones 53 a 68), el polipéptido sintético preparado de la misma manera que en Ejemplo 1 (secuencia de aminoácidos de las posiciones 53 a 58, secuencia de aminoácidos de las posiciones 57 a 62, y secuencia de aminoácidos de las posiciones 59 a 64), o el péptido de control negativo (Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys) se diluyeron a 0, 0,1, 1, y 10 \mug/mL y se añadieron 25 \muL de cada disolución diluida a 25 \muL de cada una de las disoluciones diluidas 50 veces de los sueros obtenidos de pacientes que sufrían sepsis y de los sueros de individuos normales para iniciar una reacción competitiva mezclándolos con un anticuerpo S68. Después de eso, se determinaron los niveles de CD14 de bajo peso molecular unida al anticuerpo S68 sin inhibición por cualquier péptido. Como resultado, como se muestra en la Fig. 3, tanto en los sueros de individuos normales que muestran bajos niveles como de los pacientes que sufren sepsis que muestran elevados niveles, se inhibió la unión entre el anticuerpo S68 y la proteína de bajo peso molecular en sangre en el caso del péptido S68 pero no se inhibió en el caso de otros péptidos parciales (cada uno con 6 aminoácidos) y un péptido control negativo. El resultado anterior confirmó que una proteína que iba a ser detectada en sangre por el anticuerpo S68 es reconocida específicamente por el anticuerpo S68. Además, el resultado también confirmó que la secuencia reconocida por el anticuerpo requiere una longitud de al menos 7 aminoácidos debido a que la inhibición no puede ser alcanzada por tres tipos de péptidos sintéticos (el número de aminoácidos: 6) correspondientes a los péptidos parciales del péptido S68.

Ejemplo 7 Velocidad de reacción constante del anticuerpo preparado

Las especificidades y las constantes de velocidad de reacción del anticuerpo S68 preparado en el Ejemplo 1 y el anticuerpo F1146-17-2 preparado en el Ejemplo 2 se analizaron utilizando Biacore 3000 (Biacore), respectivamente. En primer lugar, se preparó el péptido S68-BSA que se iba a inmovilizar de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1 utilizando BSA-maleimidada (Imject Maleimed Activated BSA, PIERCE). A continuación, el péptido S68-BSA se inmovilizó en un chip sensor CM5 (Biacore) utilizando un kit de acoplamiento de amina (Biacore). Se realizó un ensayo de tal manera que se utilizó HBS-EP (Biacore) como tampón de desplazamiento y se inyectaron una serie de diluciones (50, 100, 150, 200 y 300 nM) del anticuerpo F1146-17-2 en las células de flujo. El análisis de datos se realizó utilizando el soporte lógico Biaevaluation versión 3.0 (Biacore) restando los datos de la celda de referencia de los datos de medición de las celdas de flujo del péptido S68-BSA. Como resultado del análisis de la constante de disociación (KD), el anticuerpo F1146-17-2 mostró una afinidad tan alta como 4,8 x 10^{-9} M. Por cierto, el valor de la KD del anticuerpo policlonal para el péptido S68 de conejo purificado específicamente medida de un modo similar fue de 2,2 x 10^{-10} M.

Ejemplo 8 Especificidad del anticuerpo monoclonal anti-CD14 8-(1) Análisis del anticuerpo F1106-13-3

Para aclarar una región de unión (epítopo) del anticuerpo F1106-13-3, se sintetizó una membrana de una biblioteca peptídica (Custom SPOTS, Sigma Genosys) en la que se utilizaron 10 aminoácidos al mismo tiempo de la secuencia de aminoácidos de CD14 desde su extremo N para su análisis. Es decir, la membrana fue bloqueada basándose en su manual de instrucciones y después se hizo reaccionar con el anticuerpo F1106-13-3, se lavó, y más tarde se hizo reaccionar con anticuerpo anti-ratón unido a \beta-galactosidasa. Después de lavar la membrana, se detectó una secuencia de péptidos a la que estaba unido el anticuerpo utilizando X-gal. Por cierto, las secuencias peptídicas en la membrana de la biblioteca de péptidos se analizaron utilizando 19 péptidos que se sintetizaron de tal manera que 10 aminoácidos se sometieron a la síntesis al mismo tiempo con el fin de solapar dos aminoácidos de los extremos C respectivos de las secuencias de aminoácidos de las posiciones 1 a 154. Los péptidos se prepararon del mismo modo que en el
Ejemplo 1-(1).

El resultado constató que el anticuerpo F1106-13-3 se une a la región que corresponde a una secuencia de aminoácidos de las posiciones 17 a 26 (CNFSEPQPDW) del extremo N de CD14 de elevado peso molecular.

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8-(2) Análisis del anticuerpo F1031-8-3 <1>

Para confirmar la especificidad del anticuerpo F1031-8-3, utilizando CD14(1-285) derivada de E. coli descrita en el Ejemplo 3-(1) y sCD14(1-356) y sCD14(1-307)S286C preparada a partir de células COS utilizando los métodos descritos en los Ejemplos 8 y 9 del documento WO 01/72993, se determinó la actividad de unión.

En primer lugar, se inmovilizaron 250 ng/aplicación de CD14(1-356), sCD14(1-3 07)S286C, CD14(1-285), o BSA sobre una membrana, Hybond-C extra (Amersham Bioscience), y después de secar se bloquearon con Tween 20 al 0,05% que contenía 0,05 g/ml de leche desnatada (Meiji Milk Products), PBS (pH 6,4). Después de dejar estar el producto resultante durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadió el anticuerpo F1031-8-3 diluido a 3 \mug/mL con Tween 20 al 0,05% que contenía BSA al 0,5%, PBS (pH 6,4) y se hizo reaccionar durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido de un lavado con Tween 20 al 0,05%, PBS (pH 6,4).

A continuación, se añadió anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (DAKO) diluido 500 veces con Tween 20 al 0,05% que contenía suero de conejo al 10%, de PBS (pH 6,4) y se hizo reaccionar durante 30 minutos a 37ºC. Después, la membrana se lavó de manera similar, confirmando a continuación la actividad de unión del anticuerpo con el kit ECL (Amersham Bioscience). Como resultado, como se muestra en la Tabla 5, el anticuerpo F1031-8-3 se unió a sCD14(1-285), sCD14(1-307)S286C, y CD14(1-356) derivada de E. coli pero no a BSA. Así, el resultado constató que el anticuerpo F1031-8-3 reconocía específicamente todos los tipos de proteínas CD14. En la Tabla 5, "+" representa una situación en la que se detectó una mancha en la película y "-" representa una situación en la que no se detectó ninguna mancha.

TABLA 5

5

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8-(3) Análisis del anticuerpo F1031-8-3 <2>

Para aclarar una región de unión (epítopo) del anticuerpo F1031-8-3, se realizó el análisis de las manchas como en el caso de 8-(1). Sin embargo, en el método de las manchas, no se pudo especificar ninguna región de reconocimiento del anticuerpo F1031-8-3. Con el fin de analizar la similitud de las regiones de reconocimiento de ambos anticuerpos, en el sistema de IAE sándwich del Ejemplo 3-(3)[2] donde el anticuerpo S68 se utilizó como el inmovilizado y F1031-8-3-HRP se utilizó como el marcado, se realizó un ensayo de inhibición utilizando el anticuerpo F1106-1-3.

En primer lugar, como en el caso del Ejemplo 3-(3)[2], se añadieron 100 ng/mL de la preparación patrón y se hicieron reaccionar con una placa con el anticuerpo S68 inmovilizado. Después de lavar la placa, antes de la adición de F1031-8-3-HRP, se añadieron 25 \muL de tampón que contenía 6 \mug/mL de anticuerpo F1106-13-3, anticuerpo IgG de ratón, o sin anticuerpo. Luego, se añadieron 25 \muL de anticuerpo F1031-8-3-HRP, seguido de su medición de la misma manera que en el Ejemplo 3-(3)-[2].

Como se muestra en la Tabla 6, no se produjo la inhibición en el sistema con la adición del anticuerpo IgG ratón mientras que se produjo la inhibición de la unión entre el F1031-8-3 y la preparación patrón por el anticuerpo F1106-13-3. Este hecho indicó que el anticuerpo F1106-13-3 se puede unir al menos a una región que va a ser reconocida por el anticuerpos F1031-8-3. Por cierto, la "tasa de inhibición" se calculó a partir de cada descenso de la absorbancia al mismo tiempo que se definió la absorbancia del tampón solo como 100%.

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TABLA 6

6

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Ejemplo 8 Kit de análisis para la CD14 humana de bajo peso molecular 8-(1) Formato típico del kit de análisis para el sistema de IAE sándwich

Un formato típico de un kit de proteínas solubles que utiliza una combinación de anticuerpos inmovilizados y marcados que muestra altos niveles de CD14 humana de bajo peso molecular en los pacientes espécimen que sufren sepsis y los bajos niveles en especímenes de individuos normales en el Ejemplo 3-(3) se describirán a más abajo.

<1> Anticuerpo inmovilizado: Placa en la que se inmoviliza el anticuerpo S68

<2> Anticuerpo marcado: Anticuerpo F1031-8-3 marcado con peroxidasa

<3> Disolución sustrato (disolución de tetrametilbenzidina) Otras accesorias

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Ejemplo de configuración de un sistema en placa

<4> Disolución de lavado de la placa (disolución de NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%>

<5> Disolución de dilución de la muestra (disolución de PBS que contiene BSA al 0,1%)

<6> Líquido de terminación de la reacción (disolución 0,5 M de H_{2}SO_{4})

<7> Preparación patrón (CD14(1-307)S286C)

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Instrumentos de medida para realizar un análisis con el kit de análisis anterior <ejemplo>

<8> Espectrofotómetro de Placa (por ejemplo, E-Max (Molecular Device, Co., Ltd.))

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Ejemplos de configuración 8-(2) a (11) del kit de análisis para el sistema de IAE sándwich

Además de 8-(1), los ejemplos del kit de análisis para el sistema IAE sándwich se muestran en la Tabla 7. <1> representa una sustancia de unión inmovilizada en una placa. <2> representa una sustancia de unión marcada. Los elementos constitutivos de <3> a <7> y un instrumento de medida <8> como ejemplo de referencia son idénticos a 8-(1). <9> representa un anticuerpo unido a una segunda sustancia de unión específica.

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TABLA 7

7

8-(12) Curva patrón del kit de análisis para el sistema de IAE sándwich

Utilizando el kit de análisis de (1), se realizó un análisis de la misma manera que en el Ejemplo 3-(3)[2]. Es decir, se diluyó el anticuerpo S68 a 10 \mug/mL con D-PBS (pH 7,4) y se añadieron 50 \muL de la disolución resultante a cada pocillo de una immunoplaca (Maxisorb, NUNC). Después de una reacción a 4ºC durante la noche, la placa se lavó cinco veces con agua sometida a intercambio iónico y se bloqueó mediante la adición de 100 \muL de D-PBS que contenía StabilGuard al 0,1% (SurModics, Inc.) y Tween 20 al 0,1% a cada pocillo. A continuación, se utilizó como diluyente PBS 76 mM (pH 7,4) que contenía suero absorbente de CD14 al 1% y BSA al 0,1% para preparar una serie de diluciones de 0, 3, 25, 60, 100 y 150 ng/mL de preparación patrón de proteína CD14(1-307)S286C. La serie de diluciones de la preparación patrón se añadió a una cantidad de 50 \muL por pocillo y se hizo reaccionar durante 2 horas a 37ºC. Una vez completada la reacción, la placa se lavó tres veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05%. Después, se añadieron a cada pocillo 50 \muL de los anticuerpos marcados diluidos preparados diluyendo suero de rata al 5%, suero de ratón al 1%, y anticuerpo F1031-8-3 marcado con peroxidasa a 0,6 \mug/ml con PBS 76 mM (pH 8,0) que contenía Tween 20 al 0,1%. Después de una reacción a 37ºC durante 2 horas, la placa se lavó cinco veces de la misma manera que antes y se añadió a cada pocillo una disolución de tetrametilbenzidina (TMB, BioFix). Después de reaccionar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción finalizó con una disolución 0,5 M de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa (NJ-2100, Japón Intermed). La curva patrón preparada se muestra en la Fig. 4. Se mostró un sistema de análisis sencillo de alta sensibilidad en forma de una sensibilidad de medición de 0,6 ng/mL (blanco + 3DT).

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8-(13) Especificidad del sistema de IAE sándwich

Para estudiar la influencia de CD14 de elevado peso molecular presente en el suero humano sobre el sistema de análisis preparado, se añadió CD14 soluble derivada de suero de individuos normales a una concentración de 0 a 4 \mug/mL a la preparación patrón de CD14(1-307)S286C para llevar a cabo el ensayo igual que en (12). Como resultado, no hubo ninguna influencia sobre el nivel medido a pesar de que la concentración de CD14 soluble derivada de suero de individuos normales fue de 4 \mug/mL. El resultado constató que la reactividad cruzada del presente sistema de IAE sándwich de CD14 de elevado peso molecular fue de 0,3% o menos. En otras palabras, el resultado confirmó que el presente sistema no detecta el de CD14 de elevado peso molecular de suero humano y es específico de una proteína soluble que muestra un alto nivel en el suero de un paciente que sufre sepsis.

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8-(14) Evaluación del kit de análisis para el sistema de IAE sándwich

Se evaluó la reproducibilidad de los resultados del análisis del kit de (1). El coeficiente de variación (CV) de reproducibilidad intraserial utilizando 3 muestras de especímenes como en el caso de (12) fue de 5,8, 3,6 y 3,5% y la reproducibilidad entre las mediciones fue de 6,2, 5,2 y 5,1%, respectivamente. Así, se obtuvieron buenos resultados, mientras que no se observó influencia del anticoagulante (heparina, ácido cítrico, o EDTA). Los resultados descritos anteriormente mostraron que el presente kit tiene una capacidad suficiente para el análisis de CD14 humana de bajo peso molecular.

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8-(15) Ejemplo de kit de análisis inmunocromatográfico

1.

<1> Anticuerpo marcado: Anticuerpo F1031-8-3 marcado con oro coloidal

2.

<2> Lecho conjugado: Filtro de fibra de vidrio (33-Glass, fabricado por Schleicher & Schuell) en el que se aplica <1>

3.

<3> Membrana con anticuerpo inmovilizados: Membrana de nitrocelulosa (FF85/100, fabricada por Schleicher & Schuell) bloqueada con caseína al 0,5% y que tiene una línea de inmovilización del anticuerpos S68 y una línea de control (una línea de inmovilización de anticuerpo policlonal anti-ratón) aguas abajo de la línea de inmovilización.

4.

<4> Lecho para añadir gota a gota la muestra: Filtro de fibra de vidrio Glas-33 (fabricado por Schleicher & Schuell)

5.

<5> Lecho absorbente (papel de filtro Núm. 900 (fabricado por Schleicher & Schuell)

6.

<6> Lámina: Lámina con dorso de plástico PB020 (fabricada por BioDot); <2> a <5> se ensamblan en <6> de manera que se permita que el líquido añadido gota a gota en <4> fluya a través de <2>, <3>, y <5> por este orden.

7.

<7> Estuche (caja OEM disponible de NIPPN Technocluster, Inc.)

Por cierto, los esquemas de <1> a <5> se representan en la Fig. 1(A).

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8-(16) a (19) Ejemplo del kit de análisis inmunocromatográfico

La Tabla 8 muestra, además de 8-(15), los ejemplos del kit de análisis para el sistema de IAE sándwich que utiliza la segunda unión específica entre la unión de la biotina y la estreptavidina, y ejemplos de un kit de análisis para el sistema de IAE sándwich que utiliza el fragmento de un anticuerpo que se une a un péptido que tiene los 16 residuos aminoácido descritos en el SEQ ID NO: 2. <1> representa una sustancia de unión marcada. Los elementos constitutivos <2> a <7> son idénticos. Como sustancia que se va a aplicar en <3>, <3>-(i) representa una sustancia de unión que se va a inmovilizar en una membrana inmovilizada y <3>-(ii) representa una sustancia de unión que se va a inmovilizar en una línea de control. <8> representa un anticuerpo unido a una segunda sustancia de unión específica, siendo la sustancia un reactivo que se va a aplicar a <2> o <4> como en el caso de <1>, o que se va a añadir a un espécimen o a añadir simultáneamente con el espécimen.

Por cierto, los esquemas de (16) <1> a <5> se muestran en la Fig. 1(B) y (17) a (20) se entienden de un modo similar.

TABLA 8

8

Por cierto, F(ab')_{2} del anticuerpo S68 marcado con oro coloidal de (20)<1> se prepara de la siguiente manera. La preparación de F(ab')_{2} del anticuerpo S68 se realiza de la siguiente manera utilizando Pepsina Inmovilizada (Pierce). Es decir, el anticuerpo S68 se disuelve en un tampón de acetato 20 mM (pH 4,5) preparado a 5 mg/ml. Se preparan 0,25 mL de Pepsina Inmovilizada mediante suspensión de acuerdo con el protocolo de Pierce y se mezclan con 1 mL del anticuerpo anterior. A continuación, la mezcla se agita durante 4 horas en una incubadora a 37ºC, y después la reacción se termina mediante la adición de 1,5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). La solución de reacción se centrifuga (1000 xg) para separar un gel y un sobrenadante. A continuación, el sobrenadante separado se añade a 1 mL de prosep-A (Millipore) para permitir la unión de los péptidos incluyendo la porción Fc tal como fragmento Fc y no se digiere. Asimismo, se centrifuga la mezcla para recoger el sobrenadante, y luego el sobrenadante se dializa frente a PBS (pH 6,4). Se mide la absorbancia de F(ab)'_{2} a 280 nm y luego se calcula la concentración de F(ab)'_{2} a partir de la constante de absorción (0,533 mg/mL/cm^{-1}). El F(ab')_{2} resultante está marcado con oro coloidal como en el caso del Ejemplo 4, dando como resultado F(ab')_{2} del anticuerpo S68 marcado con oro coloidal.

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8-(21) Ejemplo de configuración de sistema de flujo continuo

1.

<1> Anticuerpo marcado con colorante: Anticuerpo S68 marcado con colorante ROJO VIOLETA

2.

<2> Lecho conjugado: Papel de filtro (Núm. 63, fabricado por Advantec Toyo Co., Ltd.) impregnado con el (1) anterior

3.

<3> Membrana con anticuerpo inmovilizado: Membrana de nitrocelulosa (Advantec Toyo) en la que está inmovilizado el anticuerpo S68

4.

<4> Lecho absorbente: Papel de filtro (Núm. 28, Advantec Tokio) plastificado con polipropileno

5.

<5> Estuche: caja descrita en el documento JP 06-273419 A (fabricada por Mochida Pharmaceutical); <2> a <4> se ensamblan en <5> de tal manera que se permite que el líquido añadido gota a gota en <2> fluya a través de <2>, <3> y <4> por este orden.

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Ejemplo 9 Detección de CD14 humana de bajo peso molecular (1) Cromatografía de filtración en gel <1>

Para el análisis de la sustancia en el suero de un paciente que sufría sepsis detectada mediante el kit de análisis descrito en el Ejemplo 8-(1), se fraccionó el suero del paciente que sufría sepsis a través de una columna de cromatografía de filtración en gel Superdex 200PC 3.2/30 (Amersham Bioscience) con SMART SYSTEM (Amersham Bioscience) utilizando D-PBS como tampón de elución. Después, cada fracción fue analizada utilizando el kit de análisis descrito en el Ejemplo 8-(1) y el kit CD14-IAE asequible comercialmente (IBL-Hamburgo). Se calculó su peso molecular calibrando la columna mediante la utilización de aldolasa (158 kDa), BSA (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa), y quimotripsina (25 kDa) del kit de calibración LMW y el kit de calibración HMW (Amersham Bioscience).

Como resultado, como se muestra en la Fig. 6, el kit CD14-IAE asequible comercialmente detectó CD14 soluble que tenía un peso molecular de aproximadamente 57 kDa, que se definió como CD14 soluble de elevado peso molecular de 49 a 55 kDa referida convencionalmente. Por otra parte, en el kit descrito en el Ejemplo 8-(1), se detectó un pico derivado de CD14 humana de bajo peso molecular detectado en un paciente que sufría sepsis en torno a un peso molecular de 35 a 45 kDa, pero no se detectó pico en torno a 57 kDa. Así, el resultado confirmó que el kit descrito en el Ejemplo 8-(1) detecta específicamente sólo una proteína soluble presente en la sangre.

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(2) Cromatografía de filtración en gel <2>

Como en el caso de (2)-<1>, se fraccionaron 50 \mul de suero de un paciente que sufría sepsis mediante una columna de cromatografía de filtración en gel Superdex 75 10/300 GL (Amersham Bioscience), utilizando acetato de amonio 200 mM (pH 6,8) como tampón de elución y se sometió al análisis utilizando cada kit. Su peso molecular se calculó mediante calibración de la columna utilizando BSA (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa), (quimotripsinógeno 25 kDa), y ribonucleasa A (13,7 kDa) a partir del kit de calibración LMW y el kit de calibración HMW (Amersham Bioscience).

Los resultados se muestran en la Fig. 7. En el kit descrito en el Ejemplo 8-(1), se detectó un pico derivado de CD14 humana bajo peso molecular en torno a un peso molecular de 25 a 35 kDa.

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(3) Columna de cromatografía de afinidad para el anticuerpo F1025-3-1

Cuando una fracción pico (por ejemplo, la fracción 12) derivada de CD14 humana de bajo peso molecular obtenida en (2)-<2> se aplica a la columna de cromatografía de afinidad para el anticuerpo F1025-3-1, se hace eluir un pico derivado de CD14 humana de bajo peso molecular en una fracción no absorbente de la columna de afinidad. Por cierto, el ajuste y el funcionamiento de la columna de afinidad para el anticuerpo F1025-3-1 puede realizarse sobre la base del método descrito en el Ejemplo 10 del documento WO 01/22085.

Estos resultados muestran que la CD14 humana de bajo peso molecular es una proteína soluble en sangre que se une específicamente a los anticuerpos contra un péptido específico descrito en el SEQ ID NO: 2 que tiene una secuencia detectada sólo en la CD14 humana y también se une a un anticuerpo anti-CD14 que reconoce una secuencia de aminoácidos de las posiciones 17 a 26 del extremo N de la CD14 humana. La filtración en gel determina que su peso molecular es de 25 a 45 kD. Por lo tanto, se puede definir que la CD14 humana de bajo peso molecular tiene un peso molecular más pequeño que la CD14 de elevado peso molecular (la CD14 nativa convencional). Además, la CD14 de bajo peso molecular no se une al anticuerpo F1025-3-1 que se une específicamente a CD14 de elevado peso molecular.

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Ejemplo 10 Análisis de CD14 de bajo peso molecular en sueros de pacientes que sufren diversos tipos de enfermedades

Se utilizaron 10 ejemplos, de los que se identificaron los productos aislados (Tabla 9), como suero de pacientes que sufrían sepsis. Además, el análisis se llevó a cabo utilizando el kit de análisis descrito en el Ejemplo 8-(1) en 52 ejemplos de individuos normales (31 ejemplos de sexo masculino y 21 ejemplos de sexo femenino), y pacientes que sufren diversos tipos de enfermedades (20 enfermedades, 60 ejemplos).

TABLA 9

9

El nivel de CD14 de bajo peso molecular en el suero de un individuo normal estuvo en el intervalo de 0,008 a 0,100 \mug/ml y su promedio fue de 0,04 \mug/ml. En el caso de un paciente que sufría sepsis, el nivel de CD14 de bajo peso molecular estuvo en el intervalo de 0,190 a 7, 260 \mug/mL y su promedio fue de 2,0 \mug/ml. El nivel de CD14 de bajo peso molecular del paciente que sufría sepsis fue superior al de los individuos sanos y al de los pacientes que sufrían de otros diversos tipos de enfermedades. Entre los pacientes que sufrían otros diversos tipos de enfermedades, no hubo ningún paciente que mostrara un alto nivel, en comparación con el del individuo normal.

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Ejemplo 11 Comparación con el kit de ELISA asequible comercialmente para CD14 soluble en la sangre 11-(1) Análisis de CD14 soluble en sangre de pacientes que sufren diversos tipos de enfermedades

Los especímenes del ejemplo 10 se analizaron utilizando el kit CD14 ELISA (IBL-Hamburgo) asequible comercialmente. El nivel de CD14 soluble en sangre (estimado como el total de CD14 de bajo peso molecular y CD14 de elevado peso molecular) de un individuo normal se encontraban en el intervalo de 5,6 a 11,2 \mug/ml, pero se observó un ejemplo de un alto nivel en el caso de un paciente que sufría sepsis. Sin embargo, muchos casos que mostraron altos niveles de CD14 soluble se encontraron en sueros de pacientes con varios tipos de enfermedades, de modo que no hubo ninguna diferencia con los pacientes que sufrían sepsis.

11-(2) Comparación con el kit utilizando anticuerpo S68

Se realizaron la comparación con y la investigación de los niveles medidos de CD14 de bajo peso molecular determinados en el Ejemplo 11. Como se muestra en la Tabla 10, el kit de CD14-IAE asequible comercialmente mostró una diferencia de casi 1,7 veces como máximo entre los normales, con diversas enfermedades, y con sepsis, mientras que el kit de análisis del Ejemplo 9-(1) mostró una diferencia de 50 veces entre los individuos normales y con sepsis, a pesar de no haber diferencia entre los individuos normales y con diversas enfermedades. Por lo tanto, se aclaró el resultado de que el nivel medido en el kit de análisis del ejemplo 9-(1) específicamente aumenta en la sepsis.

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TABLA 10

10

El nivel medio + 3 DT de las personas normales sometidas a ensayo se proporcionó en forma de un nivel de corte (CD14 de bajo peso molecular-EIA: 0,134 \mug/mL, CD14 asequible comercialmente-EIA: 11,14 \mug/mL) y luego los análisis se dividieron en muestras positivas (sepsis) y muestras negativas (normales + diversas enfermedades). Los resultados se muestran en la Tabla 11. De acuerdo con los resultados, se calcularon una tasa de idénticas entre ambos kits ((el número de idénticas para IAE positivos + el número de idénticas para IAE negativos)/total x 100), la sensibilidad (el número de idénticas para IAE positivos/ejemplos positivos x 100), y la especificidad (el número de idénticas para IAE positivos/ejemplos negativos x 100). Como resultado, como se muestra en la Tabla 12, en el caso CD14 de bajo peso molecular-EIA, la tasa idéntica fue 94,3%, la sensibilidad fue 100,0%, y la especificidad fue 93,8%. Así, se encontró que el CD14 de bajo peso molecular-EIA podría ser útil en el diagnóstico diferencial de la sepsis mediante la definición del nivel de corte. Por otra parte, en el caso de CD14-IAE asequible comercialmente, no hubo sensibilidad y especificidad que fueran específicas para permitir el diagnóstico de la sepsis.

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TABLA 11

11

TABLA 12

12

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Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se proporciona el anticuerpo preparado utilizando un péptido como antígeno, consistiendo el péptido en los residuos aminoácido del SEQ ID NO: 2.

Esos anticuerpos pueden ser utilizados en un kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular y el kit es capaz de determinar cuantitativamente o cualitativamente la CD14 humana de bajo peso molecular con alta sensibilidad de una manera sencilla, de modo que el kit es útil para el diagnóstico de un paciente que sufre sepsis. En la presente invención, se proporcionan el kit de análisis para CD14 humana de bajo peso molecular de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que contiene el anticuerpo anterior y el método de análisis de acuerdo con la reivindicación 6 o 7. Por otra parte, se proporciona el método in vitro novedoso para la detección de la sepsis, de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 en el que se analiza directamente la CD14 humana de bajo peso molecular.

<110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Kit para analizar CD14 humana de bajo peso molecular y anticuerpo

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<130> EP35092HVpau

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<140> EP 03 772 718.7

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<141> 13-06-2005

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<150> PCT/JP2003/014389

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<151> 12-11-2003

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<150> JP2002/328866

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<151> 12-11-2002

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<150> JP2003/330775

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<151> 22-09-2003

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<160> 18

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<170> Versión PatentIn 3.1

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<210> 1

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<211> 68

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 1

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\hskip1cm13

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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\hskip1cm14

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<212> PRT

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<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Humana

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 10

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<213> Humana

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<210> 12

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 12

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligómero:8 conexiones

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<400> 15

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agcttaggaa ttt

\hfill

13

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<210> 16

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<211> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligómero:8 conexiónA

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<400> 16

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ctagaaattc cta

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13

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<210> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador Efector

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<400> 17

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acatctagat gaccacgcca gaacct

\hfill

26

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Antisentido

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<400> 18

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tttggatcct tactagagat cgagcaatct

\hfill

30

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Kit para analizar CD14 humana de bajo peso molecular y anticuerpos

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<130> EP350 92HVpau

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<140> EP 03 772 718.7

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<141> 13-06-2005

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<150> PCT/JP2003/014389

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<151> 12-11-2003

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<150> JP2 002/328866

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<150> JP2003/330775

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<151> 22-09-2003

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<160> 18

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<170> Versión PatentIn 3.1

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<210> 1

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<211> 68

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 1

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Oligómero:8 conexiones

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13

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligómero:8 conexiónA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagaaattc cta

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Efector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatctagat gaccacgcca gaacct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttggatcct tactagagat cgagcaatct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Kit para analizar CD14 humana de bajo peso molecular y anticuerpos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> EP350 92HVpau

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 03 772 718.7

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 13-06-2005

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/JP2003/014389

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 12-11-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2002/328866

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 12-11-2002

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2003/330775

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-09-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Versión PatentIn 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm47

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligómero:8 conexiones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttaggaa ttt

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligómero:8 conexiónA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagaaattc cta

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Efector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatctagat gaccacgcca gaacct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttggatcct tactagagat cgagcaatct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Kit para medir una proteína CD14 humana de bajo peso molecular y el anticuerpo que se une a dicha proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<130> MD0688

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2 002/328866

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 12-11-2002

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2003/330775

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-09-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Versión PatentIn 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm62

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligómero:8 conexiónS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttaggaa ttt

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligómero:8 conexiónA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagaaattc cta

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Efector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatctagat gaccacgcca gaacct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttggatcct tactagagat cgagcaatct

\hfill

30

Claims (9)

1. Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular, sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2; y

(b)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17^{a} a la posición de 26^{a} del SEQ ID NO: 5;

donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene rasgos característicos siguientes;

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un kit de inmunoanálisis sándwich que detecta CD14 humana bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular, que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b)

un anticuerpo que compite con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5;

donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes;

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana.

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3. Un anticuerpo que se une a CD14 humana bajo peso molecular, pero no a CD14 de elevado peso molecular donde el anticuerpo se prepara mediante el uso de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 como antígeno, donde dicha CD14 humana de bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes;

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana.

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4. Un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^{a} a la posición de 26^{a} del SEQ ID NO: 5.

5. Un anticuerpo que compite con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5.

6. Un método in vitro para detectar CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular mediante un kit de inmunoanálisis sándwich que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2; y

(b)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición de 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5;

donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes;

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana.

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7. Un método in vitro para detectar CD14 humana de bajo peso molecular sin detectar CD14 humana de elevado peso molecular mediante un kit de análisis sándwich que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b)

un anticuerpo que compite con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5, donde dicha CD14 humana de bajo peso molecular, tiene los rasgos característicos siguientes:

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana.

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8. Un método in vitro para la detección de la sepsis en la sangre de un paciente que comprende las etapas de: medir la cantidad de una CD14 humana de bajo peso molecular en la sangre del paciente mediante un equipo de inmunoanálisis sándwich que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une al péptido de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^{a} a 26^{a} del SEQ ID NO: 5;

donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes:

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana;

comparando la cantidad medida con una cantidad patrón de un individuo normal, y evaluando si la cantidad medida es superior a la cantidad patrón de un individuo normal.

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9. Un método in vitro para la detección de la sepsis en la sangre de un paciente que comprende las etapas de: la medición de una cantidad de una CD14 humana de bajo peso molecular en la sangre de un paciente mediante un equipo de inmunoanálisis sándwich que comprende:

(a)

un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2;

(b)

un anticuerpo que compite con un anticuerpo que se une a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la posición 17^{a} a la posición 26^{a} del SEQ ID NO: 5, donde dicha CD14 humana bajo peso molecular tiene los rasgos característicos siguientes;

(1)

no se une al anticuerpo F1025-3-1 (Núm. de Acceso FERM BP-7296),

(2)

muestra un pico en un intervalo de peso molecular de 25 a 45 kDa en una cromatografía de filtración en gel, y

(3)

se puede obtener de sangre humana;

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comparando la cantidad medida con una cantidad patrón de un individuo normal, y evaluando si la cantidad medida es superior a la cantidad patrón de un individuo normal.