ES2339524B1 - Nuevo biomarcador como diana terapeutica en cancer de pulmon. - Google Patents
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Abstract
Nuevo biomarcador como diana terapéutica en
cáncer de pulmón.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de pronóstico de la evolución de la enfermedad en un
sujeto con adenocarcinoma de pulmón que comprende:
\bullet la medición de la expresión del gen de
RhoB; o
\bullet la medición del número de copias del
gen de RhoB;
en una muestra de dicho sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, caracterizado porque la detección de la
sobreexpresión o aumento en el número de copias del gen de RhoB en
relación con la expresión o el número de copias del mismo gen en una
muestra de control es indicativa del riesgo de metástasis, o
reaparición o reincidencia de actividad neoplásica.
La presente invención proporciona además
procedimientos de cribado para fármacos activos contra
adenocarcinoma de pulmón, para determinar la eficacia de una pauta
de tratamiento terapéutico en un sujeto con adenocarcinoma de
pulmón, así como inhibidores de la sobreexpresión del gen de RhoB
para su uso como medicamento o parasu uso en el tratamiento de
cánceres de pulmón no microcíticos (NSCLC).
Description
Nuevo biomarcador como diana terapéutica en
cáncer de pulmón.
La presente invención se refiere al área del
diagnóstico y terapia del cáncer. En particular, se refiere a la
sobreexpresión del gen RhoB y su impacto clínico en el cáncer de
pulmón no microcítico (NSCLC).
El cáncer de pulmón es la causa principal de las
muertes relacionadas con el cáncer a nivel mundial. Dado que tiende
a extenderse, o producir metástasis, de manera muy temprana en su
evolución, es un cáncer con alta letalidad y uno de los cánceres de
más difícil tratamiento. El cáncer de pulmón se puede extender a
ciertos órganos - particularmente las glándulas adrenales, el
hígado, el cerebro, y los huesos - los órganos más habituales para
la metástasis. A pesar de los avances en la cirugía, la
quimioterapia y la radioterapia, la tasa de supervivencia ha
mejorado poco en la última década, y la supervivencia a largo plazo
es muy baja. Se ha establecido que el cáncer de pulmón surge como
consecuencia de la acumulación de múltiples cambios genéticos en
genes críticos que controlan la motilidad, proliferación,
diferenciación y apoptosis celular. La identificación y
caracterización de estos cambios genéticos que ocasionan el
desarrollo y progresión del cáncer de pulmón es de gran interés para
mejorar el diagnóstico precoz y el desarrollo de una terapia
dirigida novedosa (Mazieres et al. 2004).
Los cánceres de pulmón, también conocidos como
carcinomas broncogénicos, se clasifican ampliamente en dos tipos:
cánceres de pulmón de célula pequeña o microcíticos (SCLC) y
cánceres de pulmón de célula no pequeña o no microcíticos (NSCLC).
Esta clasificación se basa en la apariencia microscópica de las
propias células tumorales. Los NSCLC son los cánceres de pulmón más
habituales, representando aproximadamente el 80% de todos los
cánceres de pulmón. Existen tres tipos principales de NSCLC que se
denominan en base al tipo de células que se encuentran en el tumor:
adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de
células grandes y también se observan mezclas de diferentes tipos de
NSCLC. Entre los cánceres de pulmón y particularmente NSCLC, el
adenocarcinoma de pulmón es el más frecuente, representando un
30-35% de todos los casos de cáncer de pulmón. El
adenocarcinoma de pulmón se define por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) como "un tumor epitelial maligno con patrones de
crecimiento tubular, acinar, o papilar, y/o la producción de
mucosidad por las células tumorales". Actualmente la OMS reconoce
cuatro categorías de adenocarcinomas: acinar, papilar,
bronquioloalveolar, y carcinoma sólido con formación de mucosidad.
La mayoría de los adenocarcinomas aparecen en la periferia del
pulmón, y, como resultado son frecuentemente asintomáticos en gran
parte de su evolución. Frecuentemente se localizan a nivel
subpleural y provocan una retracción pleural y un engrosamiento
mediante radiografías.
Muchos estudios han examinado la potencial
utilidad de marcadores moleculares en el diagnóstico precoz y la
terapia dirigida. Una familia particularmente interesante de
marcadores son las proteínas Ras, las cuales regulan importantes
funciones celulares que varían desde la diferenciación hasta la
proliferación celular. Funcionan como interruptores moleculares,
entre los estados de unión a GDP inactivo y los estados de unión a
GTP activo. El oncogén ras juega un papel fundamental en la
transformación maligna. Ras se encuentra mutado dando lugar a una
forma deficiente de GTPasa que conduce a su activación constitutiva
dando lugar a la proliferación descontrolada en aproximadamente el
50% del adenocarcinoma de pulmón. Los miembros estrechamente
relacionados de la familia de Ras, tales como guanosina
trifosfatasas pequeñas (GTPasas) homologas de Ras (Rho), también
están implicados en la regulación de una serie de procesos
celulares, tales como la organización del citoesqueleto de actina,
señalización inducida por estrés genotóxico, y la transformación
celulares. Estudios recientes han confirmado adicionalmente el papel
de las proteínas Rho en el cáncer al demostrar su implicación en la
transformación, supervivencia, invasión, metástasis, y angiogénesis
celulares. Además, los análisis en tumores humanos demuestran la
sobreexpresión de varias proteínas Rho en cánceres de mama, de RhoA
en tumores de células germinales testiculares, y de RhoC en
adenocarcinoma pancreático, en melanoma, y en cáncer de mama
(Mazieres et al. 2004).
Mientras que la mayoría de las proteínas Rho han
demostrado tener una función positiva en la proliferación y la
transformación de tumores malignos, la función específica de RhoB en
estos procesos parece ser más divergente.
Por un lado, Mazieres et al. (2004)
mostraron que la proteína RhoB se expresaba en pulmón normal y
disminuyó bruscamente a lo largo de la progresión del cáncer de
pulmón en estadios iniciales, concluyendo que la pérdida de
expresión de RhoB ocurre muy frecuentemente en carcinogénesis de
pulmón, reforzando su actividad potencial como un gen supresor de
tumores.
Sato et al. (2007) analizaron las
alteraciones en NSCLC de RhoB, demostrando que la expresión de RhoB
está frecuentemente regulada de manera negativa en NSCLCs mediante
múltiples mecanismos, y sugiriendo que RhoB es un gen supresor de
tumores en NSCLC.
US7135463 describe el uso de la proteína RhoB y
sus variantes para inhibir el crecimiento, migración, invasión,
metástasis de células cancerosas, la transformación de células
tumorales, y/o para modular la señalización oncogénica, en el que la
introducción de RhoB directa o indirectamente a través de una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica RhoB, en una célula
tumoral transformada o una célula cancerosa disminuye la
fosforilación de las proteínas Erk y Akt que inhiben el mecanismo de
supervivencia celular PI3-quinasa/Akt e impulsan la
muerte celular programada o apoptosis.
De manera similar, WO2007011415 describe el uso
de variantes de la proteína RhoB para inhibir el crecimiento,
metástasis, invasión, migración de células cancerosas, la
transformación de células tumorales, y/o para modular la
señalización oncogénica. Los polipéptidos variantes de RhoB se
introducen directa o indirectamente a través de una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica el polipéptido variante de RhoB, en
una célula tumoral transformada o una célula cancerosa, en el que el
polipéptido variante de RhoB suprime el crecimiento tumoral e
impulsa la apoptosis.
Por otro lado, el documento WO2008031910
describe varias líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico
que pueden experimentar metástasis hasta el hueso con gran eficacia.
Particularmente, describe líneas celulares específicas derivadas de
una línea celular de carcinoma bronquioalveolar (A459) que comparten
un patrón de expresión génica común caracterizado en la
sobreexpresión de por lo menos 3, 4, 5, ó 6 genes seleccionados
entre IL11, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBO1, y SLC26A2.
La detección precoz del cáncer de pulmón ha sido
desde hace tiempo un objetivo perseguido por los profesionales
sanitarios y los patólogos. Actualmente, la etapa de la enfermedad,
en base al sistema TNM (tumor primario / nódulo linfático/metástasis
distante), es el factor individual más importante en la
determinación de la supervivencia de los pacientes con cáncer de
pulmón. La identificación de pacientes con una mayor probabilidad de
metástasis, reaparición o reincidencia del cáncer es un foco
principal en la investigación molecular del cáncer. Como tal, y el
conocimiento de cambios moleculares iniciales puede tener fines
predictivos, ya que reflejan frecuentemente la duración de la
supervivencia del paciente o la sensibilidad a la terapia. En este
contexto, existe la necesidad de marcadores adicionales que pueden
servir para el pronóstico en pacientes con NSCLC, particularmente
pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Además, existe la necesidad
de biomarcadores validados que se puedan aplicar directamente y
utilizar en oncología clínica.
En un esfuerzo por identificar y caracterizar
los genes diana claves implicados en la evolución del NSCLC,
particularmente del adenocarcinoma de pulmón, los inventores han
hallado sorprendentemente que RhoB juega un papel critico en la
metástasis ósea, al aumentar la motilidad celular e impulsar la
colonización ósea. La sobreexpresión de RhoB en el adenocarcinoma de
pulmón representa un biomarcador de pronóstico nuevo y potente
potencialmente útil en el tratamiento clínico del cáncer de
pulmón.
Dado que actualmente los resultados del
tratamiento estándar del adenocarcinoma de pulmón son generalmente
escasos, existe la necesidad de agentes terapéuticos nuevos que
puedan prolongar o mejorar la tasa de respuesta (RR), la respuesta
completa (CR), la respuesta parcial (PR), la enfermedad estable
(SD), el tiempo hasta progresión (TTP), la supervivencia libre de
progresión (PFS), la supervivencia global (GS), o el beneficio
clínico, en pacientes
afectados.
afectados.
Los bisfosfonatos están indicados para una
amplia variedad de enfermedades relacionadas con el metabolismo
óseo, incluyendo la osteoporosis, la enfermedad de Paget, mieloma
múltiple, y metástasis óseas secundarias a tumores sólidos
avanzados. En pacientes con tumores, las metástasis óseas pueden dar
lugar a eventos relacionados con el esqueleto (SREs), incluyendo
fracturas patológicas, compresión de la columna vertebral,
hipercalcemia, dolor óseo que requiere radioterapia paliativa, y
cirugía ortopédica. Estas complicaciones esqueléticas conducen
frecuentemente a la pérdida de independencia funcional y a la
disminución de la calidad de vida y, de este modo, el objetivo de la
terapia es prevenir o retrasar la aparición de SREs para preservar
la independencia. Los bisfosfonatos son el medicamento de elección
para el tratamiento de lesiones osteolíticas y osteoblásticas
asociadas con la metástasis ósea y se ha observado que reducen
significativamente el riesgo de SREs. (Costa et al.
2007).
En particular, Li et al. (2008) han
demostrado que el ácido zoledrónico, un bifosfonato nitrogenado de
tercera generación, es incapaz de inducir la apoptosis, pero
ralentiza el crecimiento tumoral y prolonga la supervivencia para
los cánceres de pulmón de célula no pequeña.
Turner et al. (2007) discuten los efectos
de la lovastatina, que pertenece al grupo de las estatinas, un
inhibidor de la HMG-CoA reductasa sobre la
expresión, actividad de la isoforma de Rho, y la asociación con
inhibidores de la disociación de nucleótidos de guanina,
proporcionando de esta manera un mecanismo molecular en el que las
estatinas provocan una acumulación de Rho-GTP no
prenilado.
Hawk et al. (1996) sugirieron que la
lovastatina podía suprimir la formación de tumores de pulmón
inducidos por el carcinógeno químico NNK, posiblemente en una fase
promocional inicial, aunque esta supresión no parecía estar
relacionada con la presencia de K-ras mutadas o a
cambios en la expresión de K-ras.
WO2004024165 describe una composición
farmacéutica para el tratamiento de tumores malignos, en particular
el mieloma múltiple (MM), comprendiendo dicha composición en
combinación con un bisfosfonato, por ejemplo ácido zoledrónico o una
sal o éster, un inhibidor de
3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima
A (HMG-CoA) reductasa, para el uso simultáneo,
secuencial o separado.
WO2000016809 describe compuestos antisentido,
composiciones y procedimientos para modular la expresión de RhoB.
Las composiciones comprenden compuestos antisentido, particularmente
oligonucleótidos antisentido, dirigidos a ácidos nucleicos que
codifican RhoB. Se proporcionan procedimientos de utilización de
estos compuestos para la modulación de la expresión de RhoB y para
el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión de
RhoB.
Como parte del estudio exhaustivo sobre la diana
terapéutica de la presente invención, es decir la sobreexpresión de
RhoB en NSCLC, tal como el adenocarcinoma de pulmón, los inventores
han observado sorprendentemente que una combinación que comprende
lovastatina y ácido zoledrónico mejora significativamente la
supervivencia global cuando se compara con la administración de
ácido zoledrónico solo.
Además, los inventores también han observado que
la administración de células de pulmón transducidas lentiviralmente
con varios ARNsh contra RhoB (shRhoB) a ratones inmunodeprimidos
daba lugar a un descenso de su actividad prometastática, incluyendo
una reducción muy acusada de las lesiones osteolíticas y la carga
del tumor, en comparación con las células control.
Como tal, la combinación que comprende
lovastatina y ácido zoledrónico, así como agentes de ARNi basados en
shRhoB, han demostrado ser útiles en el tratamiento de NSCLC, tal
como el adenocarcinoma de pulmón, por ejemplo en la ralentización de
la progresión de la metástasis ósea.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de pronóstico de la evolución de la enfermedad en un
sujeto con adenocarcinoma de pulmón que comprende:
\bullet la medición de la expresión del gen
de RhoB; o
\bullet la medición del número de copias del
gen de RhoB;
en una muestra de dicho sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, caracterizado porque la detección de la
sobreexpresión o aumento en el número de copias del gen de RhoB en
relación con la expresión o el número de copias del mismo gen en una
muestra de control es indicativa del riesgo de metástasis, o
reaparición o reincidencia de actividad neoplásica.
En una realización, la presente invención se
refiere a un procedimiento de screening para fármacos activos contra
el adenocarcinoma de pulmón, comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón en presencia de un fármaco, o la medición de la afinidad de unión ente un fármaco y un polipéptido RhoB;
- b)
- la comparación de la expresión o números de copias medidas del gen de RhoB, o la afinidad de unión de la etapa a) a una muestra de control;
caracterizada porque una expresión o número de
copias reducido del gen de RhoB, o una mayor afinidad de unión en la
etapa a), en relación con la expresión o el número de copias del
mismo gen o la afinidad de unión del mismo polipéptido en una
muestra de control es indicativa de la actividad del fármaco contra
el adenocarcinoma de pulmón.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a un procedimiento para determinar la eficacia
de una pauta de tratamiento terapéutico en un sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, comprendiendo dicho procedimiento
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón de dicho sujeto, generando de este modo un nivel inicial;
- b)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una segunda muestra con células de adenocarcinoma de pulmón del mismo sujeto en un momento posterior a la administración de la pauta de tratamiento, obteniendo de este modo un nivel de prueba; y
- c)
- la comparación de los niveles inicial y de prueba;
caracterizada porque una expresión o número de
copias reducido del gen de RhoB en el nivel de prueba en relación
con el nivel inicial es indicativa de que la pauta de tratamiento es
eficaz en el sujeto.
Se proporcionan además inhibidores de la
sobreexpresión del gen de RhoB para su uso como medicamento o para
su uso en el tratamiento de NSCLC. Particularmente, estos
inhibidores se seleccionan entre:
- \bullet
- un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína RhoB, o un polipéptido que comprende una región de unión a RhoB;
- \bullet
- un péptido mimético del polipéptido Rhob;
- \bullet
- un ácido nucleico inhibidor del gen de Rhob seleccionado entre un oligonucleótido antisentido, un ribozima, y un agente ARNi seleccionado entre ARNds y ARNsh; o
- \bullet
- una combinación que comprende lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente aceptables de la misma.
Más particularmente, se proporciona una molécula
de ARNsh que tiene por lo menos un 70% de homología con la SEC ID
No. 3, preferiblemente en forma de un vector retroviral, para su uso
en la terapia génica de adenocarcinoma de pulmón. También
particularmente, se proporciona la combinación que comprende
lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos para su uso en el tratamiento del
adenocarcinoma de pulmón.
Se inocularon células de adenocarcinoma A549 por
vía intracardiaca en ratones inmunodeprimidos. Después de la
detección radiográfica de la metástasis ósea, se aislaron esas
subpoblaciones, se expandieron en un cultivo, y se volvieron a
inocular. Este procedimiento se repitió hasta obtener las
subpoblaciones altamente metastáticas M1M1, M1M4, y M1M3. Éstas se
volvieron a inocular en otros grupos de ratones, así como la
población parental. Su capacidad metastática se evaluó mediante el
análisis de imágenes de microrradiografías de los huesos largos, y
curvas de supervivencia libre metástasis de
Kaplan-Meier.
Mediante microarrays de expresión, se identificó
RhoB como uno de los genes sobreexpresados en todas las
subpoblaciones metastáticas. La sobreexpresión se validó mediante
RT-PCR y mediante análisis Western blot.
a. Preparación de la inhibición de RhoB mediante
un vector lentiviral con ARNsh específico para RhoB. Para el gen
sobreexpresado se utilizó un vector retroviral.
b. Efecto sobre la proliferación in vitro
del inhibidor de RhoB y el vector de control negativo
("scramble"). No se observaron cambios en la proliferación
in vitro mediante MTT entre el inhibidor de RhoB y el vector
"scramble".
Se inocularon células con ARNsh contra RhoB y
con un vector de control ("Scramble"). Después de 35 días tras
la inoculación, se observó un descenso significativo del área
radiográfica mediante el análisis de imágenes. Además, se verificó
la disminución de la carga del tumor mediante bioluminiscencia.
Se realizó una inmunohistoquímica de biopsias de
pacientes diagnosticados con adenocarcinoma con un anticuerpo
específico contra RhoB.
A. Pauta de administración de vehículo,
lovastatina (Lov), ácido zoledrónico (ZA), y una combinación de
lovastatina y ácido zoledrónico (Lov+ZA).
B. Curvas de supervivencia global a los 4 0 días
Curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia
global 40 días después de la inoculación celular de los diferentes
grupos tratados: Vehículo (control), Lovastatina (Lov) (10 mg/Kg/d),
Ácido zoledrónico (ZA) (3 \mug/Kg/d), o una combinación (Lov+ZA).
* p< 0,05, *** p< 0,001 vs control; \dagger p< 0,01 vs ZA
(Test Mantel-Cox). No hubo diferencias entre los
grupos de Control y Lovastatina.
C. Tratamiento con A549 TM M1M1 en cultivo.
Células MTT de A54 9 TM M1M1 24 h después de los diferentes
tratamientos farmacológicos: vehículo (Control); Lovastatina (Lov) 1
\muM; Ácido zoledrónico (ZA) 10 \muM o combinación (Lov+ZA)
(Lov 1 \muM + ZA 10 \muM) diluidos en medio de cultivo. La
densidad de siembra 10.000 cls/ml; tratamiento 72 h después de la
siembra en placas de cultivo de 96 pocillos. ** p< 0,001 vs.
control; \dagger p< 0,001 vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía ANOVA
seguido de test de Sheffé). Valores, medias +/- SEM.
Se trataron células TM M1M1 metastáticas de
adenocarcinoma A549 durante 4 días con un vehículo (Control);
lovastatina (Lov) 1 \muM y 0,5 \muM; ácido zoledrónico (ZA) 10
\muM y 5 \muM; y las combinaciones Lov 1 \muM + ZA 10
\muM; y Lov 0,5 \muM + ZA 5 \muM diluidos en medio de
cultivo. La inoculación duró 2 días y la densidad fue 2500
células/pocillo. Las fotografías tomadas de los cultivos que
siguieron los diferentes tratamientos mencionados muestran la
eficacia de las combinaciones Lov 1 \muM + ZA 10 \muM y Lov
0,5 \muM + ZA 5 \muM.
Después de 24 horas se midió la viabilidad
celular de células TM M1M1 metastáticas de adenocarcinoma A54 9 en
presencia de diferentes tratamientos farmacológicos. Los
tratamientos fueron con vehículo (Control), lovastatina (Lov) 1
\muM, ácido zoledrónico (ZA) 10 \muM, y la combinación Lov 1
\muM + ZA 10 \muM (Lov+ZA) diluidos en medio de cultivo, y se
aplicaron durante 72 h después de la siembra en placas de cultivo de
96 pocillos. La viabilidad celular se determinó midiendo la
concentración de MTT, un colorante tetrazolio amarillo soluble en
agua que se transforma en formazán violeta insoluble en agua
únicamente en las mitocondrias de células vivas. Después de la
solubilización de los cristales de formazán resultantes con
isopropanol, la absorbancia de la solución se controló a 540 nm. Los
valores se correlacionan directamente con el número de células vivas
que permanecen en el cultivo al completar la incubación. Densidad de
inoculación 1000 células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control;
\dagger p< 0,001 vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido
posteriormente de test Tamhane y contraste). Valores, medias +/-
SEM.
Se trataron células TM M1M1 metastáticas de
adenocarcinoma A54 9 durante 24 h con: vehículo (Control);
Lovastatina 1 \muM (Lov); Ácido zoledrónico 10 \muM (ZA); y la
combinación Lov 1 \muM + ZA 10 \muM (Lov+ZA) diluidos en medio
de cultivo. El test se realizó en una placa de 96 pocillos; las
células se sembraron (1000 células/pocillo) y se mantuvieron durante
72 h después del tratamiento. Se determinó la actividad de
caspasa-3 mediante el ensayo con
caspasa-Glo 3/7 luminiscente. Los ensayos se
realizaron sobre 12 réplicas para cada tratamiento. ** p< 0,001
vs. control, Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de
test Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM. Los resultados
demuestran que la combinación de lovastatina y ácido zoledrónico
aumenta la actividad de caspasa 3/7.
Se trató la línea celular humana de cáncer de
pulmón no microcítico H727 derivada de tumor carcinoide durante 24 h
con un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 1 \muM; ácido
zoledrónico (ZA) 10 \muM; y la combinación Lov 1 \muM + ZA 10
\muM diluidos en medio de cultivo. La incubación duró 6 días y la
densidad fue de 5000 células/pocillo. Las fotografías tomadas de los
cultivos que experimentan los diferentes tratamientos anteriores
demuestran la eficacia de la combinación Lov 1 \muM + ZA 10
\muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular humana H727 en presencia de los mismos
tratamientos. Las células se sembraron y se trataron durante 24 h
con vehículo (Control); Lovastatina (Lov) 1 \muM; Ácido
zoledrónico (ZA) 10 \muM o la combinación Lov 1 \muM + ZA 10
\muM (Lov+ZA) diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra
1000 células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p<
0,001 vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM.
Se trató la línea celular H727 durante 24 h con
un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 5 \muM; ácido
zoledrónico (ZA) 5 \muM; y la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM diluidos en medio de cultivo. La incubación duró 6 días y la
densidad fue de 5000 células/pocillo. Las fotografías tomadas de los
cultivos que experimentan los diferentes tratamientos anteriores
demuestran la eficacia de la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular humana de cáncer de pulmón no microcítico H727
derivada de tumor carcinoide en presencia de los mismos
tratamientos. Las células se sembraron y trataron durante 24 h con
vehículo (Control); Lovastatina (Lov) 5 \muM; Ácido zoledrónico
(ZA) 5 \muM o la combinación Lov 5 \muM + ZA 5 \muM (Lov+ZA)
diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra 1000
células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p< 0,001
vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM.
Se trató la línea celular H727 durante 72 h con
un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 5 \muM; ácido
zoledrónico (ZA) 5 \muM; y la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM diluidos en medio de cultivo. La incubación duró 4 días y la
densidad fue de 5000 células/pocillo. Las fotografías tomadas de los
cultivos que experimentan los diferentes tratamientos anteriores
demuestran la eficacia de la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular H727 en presencia de los mismos tratamientos.
Las células se sembraron y trataron durante 72 h con vehículo
(Control); Lovastatina (Lov) 5 \muM; Ácido zoledrónico (ZA) 5
\muM o la combinación Lov 5 \muM + ZA 5 \muM (Lov+ZA)
diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra 1000
células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p < 0,001
vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM.
Se trató la línea celular humana de cáncer de
pulmón no microcítico H4 60 derivada de un carcinoma de células
grandes durante 24 h con un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 1
\muM; ácido zoledrónico (ZA) 10 \muM; y la combinación Lov 1
\muM + ZA 10 \muM diluidos en medio de cultivo. La incubación
duró 5 días y la densidad fue de 1500 células/pocillo. Las
fotografías tomadas de los cultivos que experimentan los diferentes
tratamientos anteriores demuestran la eficacia de la combinación Lov
1 \muM + ZA 10 \muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular H460 en presencia de los mismos tratamientos.
Las células se sembraron y trataron durante 24 h con vehículo
(Control); Lovastatina (Lov) 1 \muM; Ácido zoledrónico (ZA) 10
\muM o la combinación Lov 1 \muM + ZA 10 \muM (Lov+ZA)
diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra 1000
células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p< 0,001
vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM.
Se trató la línea celular H460 durante 24 h con
un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 5 \muM; ácido
zoledrónico (ZA) 5 \muM; y la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM diluidos en medio de cultivo. La incubación duró 5 días y la
densidad fue de 1500 células/pocillo. Las fotografías tomadas de los
cultivos que experimentan los diferentes tratamientos anteriores
demuestran la eficacia de la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular H460 en presencia de los mismos tratamientos.
Las células se sembraron y trataron durante 24 h con vehículo
(Control); Lovastatina (Lov) 5 \muM; Ácido zoledrónico (ZA) 5
\muM o la combinación Lov 5 \muM + ZA 5 \muM (Lov+ZA)
diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra 1000
células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p< 0,001
vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias + /- SEM.
Se trató la línea celular H460 durante 72 h con
un vehículo (Control); lovastatina (Lov) 5 \muM; ácido
zoledrónico (ZA) 5 \muM; y la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM diluidos en medio de cultivo. La incubación duró 3 días y la
densidad fue de 1500 células/pocillo. Las fotografías tomadas de los
cultivos que experimentan los diferentes tratamientos anteriores
demuestran la eficacia de la combinación Lov 5 \muM + ZA 5
\muM.
Se midió la viabilidad celular con MTT de la
misma línea celular H460 en presencia de los mismos tratamientos.
Las células se sembraron y trataron durante 72 h con vehículo
(Control); Lovastatina (Lov) 5 \muM; Ácido zoledrónico (ZA) 5
\muM o la combinación Lov 5 \muM + ZA 5 \muM (Lov+ZA)
diluidos en medio de cultivo. Densidad de siembra 1000
células/pocillo; ** p< 0,001 vs. control; \dagger p < 0,001
vs. Lov o ZA (ANOVA de una vía seguido posteriormente de test
Tamhane y contraste). Valores, medias +/- SEM.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de pronóstico de la evolución de la enfermedad en un
sujeto con adenocarcinoma de pulmón que comprende:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB; o
- b)
- la medición del número de copias del gen de RhoB;
en una muestra de dicho sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, caracterizado porque la detección de la
sobreexpresión o el aumento en el número de copias del gen de RhoB
en relación con la expresión o el número de copias del mismo gen en
una muestra control es indicativa de riesgo para la metástasis, o
reaparición o reincidencia de actividad neoplásica.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El término "pronóstico de la evolución de la
enfermedad" se refiere a proporcionar información con respecto al
impacto de la presencia de adenocarcinoma de pulmón, por ejemplo,
según se determina mediante los procedimientos de la presente
invención, en la futura salud de un sujeto, o en otras palabras, el
pronóstico de la evolución de la enfermedad proporciona una
predicción de cómo progresará la enfermedad en un sujeto y si existe
la posibilidad de recuperación. Como tal, los procedimientos de la
presente invención, tal como se describirá a continuación, se pueden
utilizar para determinar la progresión del cáncer; por ejemplo, de
carcinoma de pulmón in situ a metástasis, en particular al
hueso, o reaparición o reincidencia de la actividad neoplásica.
En una realización de la presente invención, el
pronóstico de la evolución de la enfermedad comprende la
determinación de un resultado clínico seleccionado del grupo que
consiste en velocidad de respuesta (RR), respuesta completa (CR),
respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD), tiempo hasta la
progresión (TTP), supervivencia global (OS), y beneficio clínico,
que comprende respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), y
enfermedad estable (SD).
El término "velocidad de respuesta (RR)" se
refiere al porcentaje de pacientes cuyo cáncer disminuye o
desaparece después del tratamiento.
El término "respuesta completa (CR)" se
refiere a la desaparición de todos los signos del cáncer en
respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se
haya curado. También se denomina remisión completa.
El término "respuesta parcial (PR)" se
refiere a un descenso en el tamaño de un tumor, o en la extensión
del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento. También se
denomina remisión parcial.
El término "enfermedad estable (SD)" se
refiere a un cáncer que no crece ni decrece en extensión o
gravedad.
El término "tiempo hasta la progresión
(TTP)" es un sinónimo para "supervivencia libre de progresión
(PFS)" y se refiere a una medición del tiempo después de que se
haya diagnosticado o tratado una enfermedad, hasta que la enfermedad
empieza a empeorar. Aquí la medición para cada paciente es igual al
tiempo transcurrido desde el inicio del tratamiento en un paciente
en una prueba -tal como se define en el protocolo de pruebas- hasta
la detección de una progresión tumoral -tal como se define en el
protocolo de pruebas - o la aparición de cualquier fatalidad, lo que
sea primero. Si se detuvo la observación del paciente (por ejemplo,
al final del estudio) después de un periodo y no se observó ningún
evento, entonces este tiempo de observación se denomina
"censurado".
El término "supervivencia global (OS)" es
un sinónimo para "tiempo hasta la muerte (TTD)" o "tasa de
supervivencia" y se refiere al porcentaje de sujetos en un
estudio que han sobrevivido durante un periodo definido de tiempo.
Este porcentaje se indica habitualmente junto con el periodo de
tiempo desde la fecha del diagnóstico o tratamiento. Habitualmente,
la supervivencia global se mide desde el día de la cirugía hasta la
muerte relacionada con el tumor. Aquí, la medición para cada
paciente es igual al tiempo transcurrido desde el inicio del
tratamiento de un paciente en una prueba -tal como se define en el
protocolo- hasta la aparición de cualquier fatalidad. Si se detuvo
la observación del paciente, por ejemplo, al final del estudio,
después de un periodo t y el paciente sobrevivió a este tiempo,
entonces este tiempo de observación t se denomina
"censurado".
El término "sujeto" se refiere a un
organismo afectado de cáncer de pulmón, particularmente cáncer de
pulmón de célula no pequeña, más particularmente adenocarcinoma de
pulmón. Este sujeto puede ser un mamífero, preferiblemente un
humano, rata, ratón, o un primate no humano. Habitualmente el sujeto
es un paciente.
El término "metástasis" se refiere al
movimiento o expansión de células cancerígenas de un órgano o tejido
a otro. Las células cancerígenas se expanden normalmente a través
del torrente sanguíneo o el sistema linfático. El término
"metástasis" se refiere también a la formación de focos de
tumores secundarios en crecimiento progresivo en puntos discontinuos
a la lesión primaria. El proceso metastático es un mecanismo con
múltiples etapas en que una célula de cáncer metastático se escapa
del tumor primario, entra en la circulación, invade un punto de
tejido distante y desarrolla un tumor macroscópico en el sitio
diana.
El término "actividad neoplásica" se
refiere a una proliferación celular no regulada o anormalmente
regulada y el proceso de angiogénesis o la formación de nueva
vasculatura que da soporte a un neoplasma en el microambiente
endotelial alrededor del neoplasma. El término "neoplasma" se
refiere a células tumorales, células que presentan una proliferación
no regulada o anormalmente regulada como resultado de la
inestabilidad o mutación genética, y un endotelio en el que las
células endoteliales presentan una proliferación no regulada o
anormalmente regulada como resultado de un estado patogénico.
El término "muestra", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a una composición que se
obtiene o deriva de un sujeto de interés que contienen una entidad
celular y/u otra entidad molecular que va a caracterizarse y/o
identificarse en base a, por ejemplo, características físicas,
bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Cualquier muestra adecuada
en la que se puede determinar la sobreexpresión del gen de RhoB o el
número de copias del mismo está incluida en el alcance de la
presente invención.
En una realización, la muestra es un material
biológico obtenido de un sujeto, y puede ser cualquier muestra
orgánica, muestra de tejido, muestra de célula, fluido corporal,
precipitado de fluido corporal, o una muestra de lavado aislada de
un sujeto que tiene un cáncer de pulmón o con el riesgo de un cáncer
de pulmón (por ejemplo, en base al historial familiar o al historial
personal, tal como fumador crónico). Una muestra se puede obtener de
un sujeto de cualquiera de las maneras utilizadas en dispositivos
clínicos para obtener una muestra que comprende la célula o ácido
nucleico requerido, es decir ADN o ARN. Por ejemplo, las muestras se
pueden obtener a partir de muestras quirúrgicas recientes,
congeladas o muestras en parafina o biopsias de un órgano o tejido
que comprenden el ácido nucleico o célula adecuados a ensayar. Las
muestras adecuadas utilizadas en procedimientos para la detección o
pronóstico del cáncer se pueden obtener a partir de una muestra de
mama, conductos o lóbulos de los tejidos mamarios, muestra del
tracto gastrointestinal (por ejemplo, una biopsia de un pólipo), una
muestra de hígado, una muestra de tejido pancreático, una muestra de
médula ósea, una muestra de piel, una muestra de nódulo linfático,
una muestra de riñón, una muestra de pulmón, una muestra de músculo,
una muestra de hueso, una muestra de cerebro, o similar. La muestra
puede derivar de un fluido biológico, por ejemplo, sangre, médula
ósea, fluido cerebroespinal, fluido peritoneal, fluido pleural,
fluido linfático, suero, plasma, jugo pancreático, orina, quilo,
heces, eyaculado, esputo, aspirado de los pezones, fluido de los
conductos, saliva, muestras obtenidas con hisopos de conductos
orgánicos, muestras de lavado de colon, y muestras de cepillado. Los
tejidos y fluidos corporales se pueden recoger utilizando cualquiera
de los procedimientos conocidos en la técnica. Si es apropiado, la
muestra se puede obtener mediante la utilización de un procedimiento
de aspiración.
Entre las muestras habituales para la detección
o el pronóstico de adenocarcinoma de pulmón se incluyen, sin
limitación, células o tejido (por ejemplo, de una biopsia o
autopsia), tumores de pulmón sólidos, esputo, tos, lavado
broncoalveolar, cepillados bronquiales, mucosa bucal, sangre
periférica, sangre completa, concentrados de glóbulos rojos,
concentrados de plaquetas, concentrados de leucocitos, proteínas de
glóbulos rojos, plasma sanguíneo, plasma rico en plaquetas, un
concentrado de plasma, un precipitado de cualquier fracción del
plasma, un sobrenadante de cualquier fracción del plasma, fracciones
de proteínas del plasma sanguíneo, proteínas u otros componentes
sanguíneos purificados o parcialmente purificados, suero, tejido o
muestras de biopsia con aguja fina y fluido pleural, etc. aislados
de un sujeto con un cáncer de pulmón, o cualquier otro tumor, o
cualquier otro extracto del mismo, obtenidos de un sujeto de prueba,
voluntario sano o animal experimental.
En algunas realizaciones, puede ser deseable
separar las células de cáncer de pulmón de las células que no son de
cáncer de pulmón en una muestra. En algunas realizaciones, puede ser
deseable no separar las células de cáncer de pulmón de las células
que no son de cáncer de pulmón en una muestra. En algunas
realizaciones, una muestra puede estar sustancialmente libre de
células tumorales, por ejemplo, contiene menos de un 1, 5, 10, 20,
30, 40, ó 50% de células tumorales en comparación con las células no
tumorales en la muestra. En algunas realizaciones, las células no
tumorales pueden ser células epiteliales o linfocitos. En el caso de
evaluar el pronóstico de un sujeto con cáncer de pulmón, es
preferible utilizar una muestra que contiene la célula de cáncer de
pulmón. La muestra pueden ser células purificadas a partir de un
tejido. Además, las muestras biológicas se pueden obtener de un
sujeto o un sujeto en diferentes puntos de tiempo, incluyendo antes,
durante y/o después de un tratamiento.
Una muestra también puede incluir, sin
limitación, productos producidos en cultivos celulares por células
normales o transformadas, por ejemplo, a través de tecnología de ADN
recombinante o anticuerpos monoclonales. Una muestra también puede
ser una célula o una línea celular creada en condiciones
experimentales que no se aíslan directamente de un sujeto. Una
muestra también puede estar libre de células, derivada o sintetizada
artificialmente. Una muestra puede ser de una células o tejido
conocido por ser canceroso, sospechoso de ser canceroso, o que se
cree que no es canceroso (por ejemplo, normal o control).
El término "expresión" del gen de RhoB se
refiere al proceso de conversión de información genética codificada
en el gen de RhoB en ARN, por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, o ARNsn, a
través de la transcripción del gen, es decir, a través de la acción
enzimática de una ARN polimerasa, y para genes que codifican
proteínas, en la proteína a través de la traducción del ARNm maduro.
La expresión génica se puede regular en muchas etapas del proceso.
La "regulación positiva" o "activación" se refiere a la
regulación que aumenta la producción de los productos de expresión
génica, es decir, ARN o proteína, mientras que la "regulación
negativa" o "represión" se refiere a la regulación que
disminuye la producción. Las moléculas, por ejemplo, factores de
transcripción, que están implicados en la regulación positiva o la
regulación negativa se denominan frecuentemente "activadores" y
"represores", respectivamente.
La expresión del gen de RhoB se puede medir a
nivel de proteína, a nivel de ARNm, o a nivel de ADNc.
La expresión de la proteína derivada de RhoB se
puede medir utilizando cualquiera de los inmunoensayos disponibles
por la técnica. Entre los ejemplos de inmunoensayos útiles en la
determinación del nivel de expresión de la proteína se incluyen,
pero no se limitan a, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo, ensayo
de transferencia mediante Western, ensayo inmunofluorescente,
inmunoensayo enzimático, ensayo quimioluminiscente, ensayo
inmunohistoquímico, y ensayo inmunoabsorbente unido a enzima
(ELISA). Además, los inmunoensayos anteriores se pueden utilizar
combinados, tales como inmunoprecipitación seguido de transferencia
mediante Western. Los procedimientos anteriores se describen en
Principies and Practice of Immunoassay, Price y Newman, eds.,
Stochton Press, última ed. Dichos ensayos pueden ser inmunoensayos
directos, indirectos, competitivos, o no competitivos tal como se
describen por la técnica (Oelbrick, N. (1984) J. Clin. Chem.
Clin. Biochem., 22:895-904). La proteína a
analizar mediante dichos procedimientos se puede obtener
directamente de la muestra. Alternativamente, la proteína se puede
obtener como un lisado crudo o se puede purificar adicionalmente
mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia,
incluyendo la cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos
para la proteína RhoB (Sambrook, J. et al (2001) en
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Press, Plainview, N.Y.). Alternativamente, los niveles
de proteína RhoB se pueden detectar mediante immunohistoquímica de secciones de tumores fijadas o congeladas.
de proteína RhoB se pueden detectar mediante immunohistoquímica de secciones de tumores fijadas o congeladas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para la detección de proteína RhoB mediante
inmunoensayo, se pueden utilizar anticuerpos policlonales o
monoclonales anti-RhoB. Si se desean anticuerpos
policlonales, se puede utilizar suero que contiene anticuerpos
policlonales para la proteína RhoB o los anticuerpos policlonales se
pueden purificar de antígenos presentes en el suero mediante
cromatografía de inmunoafinidad. Alternativamente, los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra RhoB pueden ser producidos fácilmente
por un experto en la materia. Los procedimientos de producción de
anticuerpos monoclonales o policlonales son conocidos por un experto
en la materia (Goding, J. W. (1996) Monoclonal antibodies:
Principies and Practice, Plodermic Press, Inc., NY, N.Y., pág.
56-97; Hurn, B. A. L. et al. (1980) Meth.
Enzymol., 70:104-141).
Entre los inmunógenos adecuados que se pueden
utilizar para producir anticuerpos policlonales o monoclonales se
incluyen Usados celulares preparados a partir de células
transfectadas con una proteína RhoB recombinante, una proteína RhoB
recombinante o nativa parcial o sustancialmente purificada, o
péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos de RhoB. Los
vectores y su uso en la producción de proteínas recombinantes es
conocida por los expertos en la materia (Sambrook, J. et al.
(2001) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Press, Plainview, N.Y.).
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno
también se pueden producir mediante ingeniería genética. La
tecnología para la expresión de los genes de tanto la cadena pesada
como la cadena ligera en E. coli es la materia de las
solicitudes de patente PCT; publicación número WO 901443, WO 901443,
y WO 9014424 y en Huse et al. (1989) Science,
246:1275-1281.
Alternativamente, los anticuerpos
anti-RhoB se pueden inducir mediante la
administración de anticuerpos antiidiotipos como inmunógenos. De
forma práctica, se utiliza un anticuerpo anti-RhoB
purificado para inducir un anticuerpo antiidiotipo en un animal
huésped.
Alternativamente a los inmunoensayos, los
anticuerpos se pueden utilizar in situ para detectar la
proteína RhoB en la muestra. Los anticuerpos se pueden utilizar en
inmunofluorescencia directa o indirecta. Alternativamente, la
proteína RhoB se puede detectar in situ mediante el uso de
anticuerpo anti-RhoB radiomarcado o mediante el uso
de un anticuerpo anti-RhoB no marcado seguido de un
segundo anticuerpo radiomarcado reactivo al anticuerpo
anti-RhoB.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para
inmunoprecipitar la proteína RhoB a partir de una mezcla de
proteínas. El uso de la inmunoprecipitación como técnica sensible y
específica para detectar y cuantificar antígenos diana en mezclas de
proteínas es bien conocida para los expertos en la materia (véase,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Edition, (2001) Cold
Spring Harbor Press).
Los anticuerpos también se pueden fijar a
soportes sólidos para su uso en el aislamiento de la proteína Rhob
mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para la
cromatografía de inmunoafinidad son bien conocidas en la técnica
(Harlow, E. y Lañe, D. (1888) "Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)
e incluyen técnicas para fijar anticuerpos a soportes sólidos, de
manera que mantienen su actividad inmunoselectiva; las técnicas
utilizadas pueden ser aquellas en las que los anticuerpos se
adsorben al soporte, así como aquellas en las que los anticuerpos
están unidos covalentemente al soporte.
Un anticuerpo adecuado para la medición de la
expresión del gen de Rho B a nivel de proteína es Rho B (119)
sc-180 disponible comercialmente de Santa Cruz
Biotechnology, Inc. Rho B (119) es un anticuerpo policlonal de
conejo purificado por afinidad desarrollado contra un péptido que se
mapea en una región interna de Rho B de origen humano.
Los anticuerpos descritos anteriormente y los
fragmentos de unión a los mismos se pueden suministrar en un kit de
diagnóstico útil para la detección de alteraciones en la expresión
de proteína Rhob.
La expresión del gen de RhoB se puede controlar
a nivel de ARN mensajero (ARNm) según los procedimientos conocidos
en la técnica. Los procedimientos que utilizan la hibridación de
sondas de ácido nucleico al tránscrito de RhoB, incluyendo la
tecnología de microarray, visualización en gel, y transferencia
mediante Northern, se pueden utilizar para medir la presencia y/o
nivel de ARNm de RhoB. El ARNm también se puede evaluar utilizando
técnicas de amplificación, tales como RT-PCR o
RT-PCR cuantitativa a tiempo real.
El análisis de hibridación, que se basa en la
especificidad de las interacciones de nucleótidos, utiliza
oligonucleótidos o ADNc para identificar de manera selectiva o
capturar ADN o ARNm de la composición específica de secuencias. La
cantidad de ARNm o ADNc hibridada a una secuencia de captura
conocida se puede determinar cuantitativa o cualitativamente,
proporcionando de este modo la información sobre la representación
relativa de la proteína RhoB. También se puede realizar la
hibridación a arrays o chips tanto de ADN, ADNc, oligonucleóticos o
ARN, donde éstos se pueden producir según cualquier procedimiento
adecuado conocido por técnica. Por ejemplo, los procedimientos de
producción de grandes arrays de oligonucleótidos se describen en
US5.134.854, y US5.445.934 utilizando técnicas de síntesis dirigidas
por luz. Utilizando un sistema controlado por ordenador, se
convierte un array heterogéneo de monómeros, a través del
acoplamiento simultáneo en un número de sitios de reacción, en un
array heterogéneo de polímeros.
Alternativamente, los microarrays se generan
mediante la deposición de oligonucleótidos presintetizados sobre un
sustrato sólido, por ejemplo tal como se describe en WO95/35505.
Los procedimientos basados en secuenciación son
una alternativa. Estos procedimientos empezaron con el uso de
marcadores de secuencia expresada (ESTs), y ahora incluyen
procedimientos basados en marcadores cortos, tales como el análisis
en serie de la expresión génica (SAGE) y la MPSS (Massively Parallel
Signature Sequencing). Como tal, los niveles de expresión de ARNm en
una muestra de prueba se pueden determinar mediante la generación de
una biblioteca de ESTs a partir de dicha muestra de prueba. La
enumeración de la representación relativa de ESTs en la biblioteca
se puede utilizar para aproximar la representación relativa de un
tránscrito génico en la muestra de partida. Los resultados de los
análisis de EST de una muestra de prueba se puede entonces comparar
con el análisis de EST de una muestra de referencia que comprende
células de control para determinar los niveles de expresión
relativos de un polinucleótido que codifica RhoB.
El SAGE (Velculescu et al.,
Science (1995) 270:484) implica el aislamiento de marcadores
de secuencia cortos únicos de una localización específica en cada
tránscrito. Los marcadores de secuencia se concatenan, clonan y
secuencian. La frecuencia de tránscritos particulares en la muestra
de prueba de partida está reflejada por el número de veces que el
marcador de secuencia asociado se encuentra en la población de
secuencias.
La MPSS, descrita por Brenner et al.,
Nature Biotechnology 18:630-634 (2000), es
una estrategia de secuenciación que combina secuenciación no basada
en gel con la clonación in vitro de millones de plantillas
en microesferas separadas de 5 \mum de diámetro. En primer lugar,
se construye mediante clonación in vitro una biblioteca de
microesferas de plantillas de ADN. Esto va seguido del montaje de un
array plano de las microesferas que contienen plantillas en una
células de flujo a una densidad elevada (habitualmente superior a
3\times10^{6} microesferas/cm^{2}). Los extremos libres de las
plantillas clonadas en cada microesfera se analizan simultáneamente,
utilizando un procedimiento de secuenciación basado en fluorescencia
que no requiere la separación de fragmentos de ADN. Esta técnica
permite la identificación eficaz y el aislamiento de muchos cientos
de miles de secuencias individuales, la generación de una
"biblioteca" de ARNs pequeños. La abundancia o frecuencia de
aparición de cada secuencia diferente de una "biblioteca" de
ARNs pequeños es indicativo de la cantidad en la muestra original de
la que se obtuvo el ARN. Además, mediante la comparación de las
secuencias, que tienen habitualmente 17-20
nucleótidos de longitud, con una base de datos de ADN genómico, es
posible determinar los puntos en el ADN que actúan como origen para
los ARNs pequeños. Las comparaciones con las anotaciones del genoma,
bases de datos de ADNc, y otros datos se pueden utilizar
frecuentemente para identificar los precursores de ARN más grandes
de los ARNs pequeños. De manera más significativa, MPSS proporciona
la capacidad para dirigir la biología del ARN pequeño a una escala
amplia del genoma.
La expresión del gen de RhoB también se puede
controlar a nivel de ADNc. Los niveles de expresión del gen de RhoB
se determinan utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de
transcriptasa inversa (RT-PCR). La
RT-PCR es una técnica bien conocida en el sector que
se basa en que la enzima transcriptasa inversa transcribe de forma
inversa el ARNm para formar ADNc, que a continuación se puede
amplificar en una reacción PCR estándar. Los protocolos y kits para
llevar a cabo la RT-PCR son bien conocidos por los
expertos en la materia y están disponibles comercialmente.
La RT-PCR se puede llevar a cabo
de una manera no cuantitativa. Dicha RT-PCR de punto
final mide los cambios en los niveles de expresión utilizando tres
procedimientos diferentes: relativo, competitivo y comparativo.
Estos procedimientos tradicionales son bien conocidos en la técnica,
por ejemplo, visualización del amplicón en una electroforesis en
gel.
En una realización alternativa, la
RT-PCR se lleva a cabo a tiempo real y de manera
cuantitativa. La PCR a tiempo real es una técnica utilizada para
controlar el progreso de una reacción PCR en tiempo real. Al mismo
tiempo, se puede cuantificar una cantidad relativamente pequeña de
producto de PCR (ADN, ADNc o ARN). La PCR a tiempo real se basa en
la detección de la fluorescencia producida por una molécula
informadora que aumenta a medida que progresa la reacción. Esto
ocurre debido a la acumulación del producto de la PCR con cada ciclo
de amplificación. Estas moléculas informadoras fluorescentes
incluyen fluorocromos que se unen al ADN de doble cadena o sondas de
secuencia específica.
La RT-PCT cuantitativa a tiempo
real o la PCR a tiempo real han sido descritas ampliamente en la
bibliografía (véase, Gibson et al para un ejemplo inicial de
la técnica) y son posibles una serie de técnicas para controlar el
producto de PCR. Estas técnicas incluyen el uso de sondas
hidrolíticas (Taqman®), sondas en horquilla ("hairpin")
(Molecular Beacons), parejas de sondas para la técnica de FRET
(LightCycler), cebadores que incorporan una sonda en horquilla
(Scorpion), sistema Plexor^{TM}, cebadores en horquilla
(Amplifluor), cebadores que incorporan secuencias complementarias de
ADNzimas que dividen un sustrato informador incluido en la mezcla de
reacción (DzyNA), o colorantes fluorescentes (SYBR Green etc.).
Todas estas sondas, cebadores, o fluorocromos están disponibles
comercialmente y están bien caracterizados.
En una realización, la presente invención
proporciona cebadores con las SEC ID NO 4-6 para
realizar la RT-PCR o PCR de tiempo real. Los
cebadores con SEC ID NO 4 y 5 son particularmente adecuados para su
uso en el perfil de expresión del gen de RhoB utilizando
RT-PCR
Tal como se ha mencionado en la presente
invención, la RT-PCR cuantitativa a tiempo real o
PCR a tiempo real produce una lectura de fluorescencia que se puede
controlar de manera continua. Las técnicas de tiempo real son
ventajosas porque mantienen la reacción en un "único tubo".
Esto significa que no existe la necesidad de un análisis ulterior
para obtener resultados, lo cual conduce a resultados obtenidos más
rápidamente. Además, manteniendo la reacción en un medio de "único
tubo" se reduce el riesgo de contaminación cruzada y permite una
salida cuantitativa a partir de los procedimientos de la presente
invención. Esto puede ser particularmente importante en la
disposición clínica de la presente invención.
El reconocimiento de múltiples alteraciones de
ADN puede aumentar la identificación eficaz del cáncer. Las sondas
permiten que se midan múltiples tipos de ADN en la misma muestra
(PCR multiplex), ya que los colorantes fluorescentes con diferentes
espectros de emisión se pueden unir a las diferentes sondas. La PCR
Multiplex permite que los controles internos se coamplifiquen. Estas
sondas de hibridación permiten un nivel de discriminación imposible
de obtener con SYBR Green, ya que solo se hibridarán a verdaderas
dianas en una PCR y no a cebadores-dímeros u otros
productos no específicos.
Las variantes de la técnica de PCR básica tales
como PCR anidada, y similares también se incluyen en el alcance de
la presente invención. Ente los ejemplos se incluyen técnicas de
amplificación isotérmica tales como NASBA, 3SR, TMA, y
triamplificación, todas ellas conocidas en el sector y disponibles
comercialmente. Otros procedimientos adecuados de amplificación
incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barringer et
al, 1990), ensayo de Amplificación de Sondas dependiente de
Ligandos Múltiples Específico de Metilación
(MS-MLPA) (Nygren et al., Nucleic Acids
Res. 2005; 33(14) e128; www.mlpa.com), amplificación
selectiva de secuencias de polinucleótidos diana (US6,410,276),
reacción en cadena de la polimerasa con cebado con secuencias de
consenso (US4,437,975), reacción en cadena de la polimerasa con
cebado arbitrario (WO90/06995), pirosecuenciación, y amplificación
por desplazamiento de corte (WO2004/067726).
La expresión génica en una muestra de prueba
también se puede analizar utilizando la metodología de
"differential display" (DD). Esta familia de técnicas se basa
en la amplificación aleatoria de fragmentos de ADNc generados
mediante digestión por restricción, donde los fragmentos de ADNc se
utilizan como identificadores únicos de genes, acoplados con la
información sobre la longitud del fragmento o la localización del
fragmento en el gen expresado. La representación relativa de un gen
expresado en una muestra se puede entonces estimar en base a la
representación relativa del fragmento asociado con el gen que está
en el grupo de todos los posibles fragmentos. Los procedimientos y
composiciones para llevar a cabo DD son conocidos en la técnica,
véase, por ejemplo, US5.776.683; y US5.807.680.
Las secuencias del ADN genómico, proteína, ARNm,
y ADNc del gen de RhoB, o una región de las mismas, se proporcionan
a continuación. De la misma manera, los cebadores y sondas descritas
en la presente invención se proporcionan como las SEC ID No.
4-6.
La secuencia de nucleótidos del ADN genómico de
RhoB humana (NC_000002.10) (5'\rightarrow3', 2367 pb) se
proporciona en la siguiente secuencia SEC ID No. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de la proteína RhoB
humana (NP_004031.1) (196 aa) se proporciona en la siguiente
secuencia SEC ID No. 2:
La secuencia de nucleótidos del ARNm de RhoB
humana (NM_004040.2) (5'\rightarrow3', 2384 pb) se proporciona en
la siguiente secuencia SEC ID No. 7:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos del ADNc de RhoB
humana (CCDS1699.1) (5'\rightarrow3', 591 pb) se proporciona en la
siguiente secuencia SEC ID No. 8:
Las secuencias del ADN genómico, proteína, ARNm,
ADNc, cebadores, y sondas presentadas en la presente invención
también comprenden aquellas secuencias que tienen por lo menos un
70% de homología con respecto a las secuencias en SEC ID NO.
1-8, preferiblemente por lo menos un 80%, y más
preferiblemente por lo menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de
homología. Alternativamente, las formas generadas por splicing
alternativo, también están comprendidas en el alcance de la presente
invención.
El término "homología" se refiere al nivel
de similitud entre las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos en
términos de porcentaje de identidad posicional de nucleótidos o
aminoácidos, respectivamente, es decir, la similitud o identidad de
las secuencias. El porcentaje de homología entre dos secuencias se
puede calcular según los algoritmos FASTA o BLAST (Altschul et
al. "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 1990,
215, 403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast;
Lipman et al. "Rapid and sensitive protein similarity
searches". Science 1985, 227, 1435-1441.
http://www.ebi.ac.uk), que se incorporan en la presente invención
por referencia.
Cualquier otra técnica adecuada para medir la
expresión del gen de Rhob a nivel de proteína, ARNm, o ADNc también
está comprendida en el alcance de la presente invención.
En una realización alternativa de la presente
invención, el procedimiento de pronóstico de la evolución de la
enfermedad en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón comprende la
medición del número de copias del gen de RhoB.
Una metodología para determinar el número de
copias del gen de RhoB en una muestra es la hibridación in
situ, por ejemplo, hibridación in situ por fluorescencia
(FISH) (véase, Angerer, 1987 Meth. Enzymol 152: 649).
Generalmente, la hibridación in situ
comprende las siguientes etapas principales: (1) fijación del tejido
o estructura biológica a analizar; (2) tratamiento de
prehibridización de la estructura biológica para aumentar la
accesibilidad al ADN diana, y para reducir la unión no específica;
(3) hibridación de la mezcla de ácidos nucleicos al ácido nucleico
en la estructura biológica o tejido; (4) lavados posteriores a la
hibridación para eliminar los fragmentos de ácidos nucleicos no
unidos en la hibridación, y (5) la detección de los fragmentos de
ácido nucleico hibridados. Las sondas utilizadas en dichas
aplicaciones habitualmente se marcan, por ejemplo, con radioisótopos
o informadores fluorescentes. Las sondas preferidas son
suficientemente largas, por ejemplo, de aproximadamente 50, 100, ó
200 nucleótidos hasta aproximadamente 1000 o más nucleótidos, para
permitir la hibridación específica con el ácido o ácidos nucleicos
diana en condiciones rigurosas.
Otra metodología alternativa para determinar el
número de copias de ADN es la hibridación genómica comparativa
(CGH). En los procedimientos de hibridación genómica comparativa, se
marca un grupo de "prueba" de ácidos nucleicos con un primer
marcador, mientras que un segundo grupo de prueba (por ejemplo, de
una célula o tejido normal) se marca con un segundo marcador. La
proporción de hibridación de los ácidos nucleicos se determina
mediante la proporción de la unión del primer y segundo marcadores a
cada sonda de un grupo. Se detectan las diferencias en la proporción
de las señales de los dos marcadores, por ejemplo, debido a la
amplificación de genes en el grupo de prueba, y la proporción
proporciona una medición del número de copias del gen de RhoB,
correspondiente a la sonda específica utilizada. Se puede generar
una representación citogenética de la variación del número de copias
de ADN mediante CGH, lo cual proporciona unas relaciones de
fluorescencia a lo largo de la longitud de los cromosomas de los ADN
de prueba marcados de manera diferencial y ADN genómico de
referencia.
Los protocolos de hibridación adecuados para su
uso con los procedimientos de la presente invención se describen,
por ejemplo, en Albertson (1984) EMBO J.
3:1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:9138-9142; 430402EPAE PO Pub. No. 430:402;
Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In Situ Hybridization
Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1994).
Los ensayos basados en la amplificación también
se pueden utilizar para medir el número de copias del gen de RhoB.
En dichos ensayos, la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos
de RhoB actúa como plantilla en una reacción de amplificación (por
ejemplo, Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR). En una
amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación
será proporcional a la cantidad de plantilla en la muestra original.
La comparación con controles apropiados proporciona una medición del
número de copias del gen de RhoB, correspondiente a la sonda
específica utilizada, según el principio descrito anteriormente. Los
procedimientos de PCR cuantitativa a tiempo real que utilizan sondas
Taqman son conocidos en la técnica. Se proporcionan protocolos
detallados para PCR cuantitativa a tiempo real, por ejemplo, para
ARN en: Gibson et al., 1996, A novel method for real time
quantitative RT-PCR. Genome Res.
10:995-1001; y para ADN en: Heid et al.,
1996, Real time quantitative PCR. Genome Res.
10:986-994.
La transferencia Southern también se puede
utilizar para medir el número de copias del gen de RhoB. Con esta
metodología, se analiza el ADN en geles de agarosa o acrilamida para
fraccionar el ADN según el tamaño seguido de la transferencia del
ADN desde el gel hasta un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o
una membrana de nylon. A continuación, el ADN inmovilizado se
hibrida con una sonda marcada para detectar las muestras de ADN
complementarias a la sonda utilizada. El ADN se puede dividir con
enzimas de restricción antes de la electroforesis. Después de la
electroforesis, el ADN se puede despurinar parcialmente y
desnaturalizar antes o durante la transferencia al soporte sólido.
Las transferencias Southern son una herramienta habitual de los
biólogos moleculares (J. Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pág.
9.31-9.58 [1989]).
Un procedimiento potente para la determinación
del número de copias de ADN utiliza plataformas basadas en
microarrays. La tecnología de microarrays se puede utilizar porque
ofrece una resolución elevada. Por ejemplo, la CGH tradicional tiene
generalmente una resolución del mapeo limitada a 20 Mb; mientras que
en CGH basada en arrays, las relaciones de fluorescencia de los ADN
de prueba marcados de manera diferencial y ADN genómico de
referencia proporcionan una medición "locus por locus" de la
variación el número de copias de ADN, consiguiendo de esta manera
una mayor resolución de mapeo. Los detalles de un procedimiento de
microarray se puede hallar en la bibliografía. Véase, por ejemplo,
6232068USB US 6,232,068; Pollack et al., Nat Genet,1999,
23(1):41-6.
Cualquier otra técnica adecuada para medir el
número de copias del gen de RhoB también está comprendida en el
alcance de la presente invención.
Se ha observado que la sobreexpresión o aumento
en el número de copias del gen de RhoB en relación con la expresión
o el número de copias del mismo gen en una muestra de control son
marcadores útiles para el pronóstico de adenocarcinoma de pulmón. En
particular, dicha sobreexpresión o aumento en el número de copias
del gen de RhoB es indicativo del riego de metástasis, o reaparición
o reincidencia de actividad neoplásica.
La "sobreexpresión" de un gen de RhoB o un
"mayor" nivel o un nivel "elevado" de un polinucleótido o
proteína RhoB se refiere a un nivel de polinucleótido o proteína
RhoB que, en comparación con el nivel de control de RhoB, es de
forma detectable más elevado. De manera similar, un "aumento"
en el número de copias del gen de RhoB se refiere a un nivel del
número de copias de RhoB que, en comparación con un nivel de control
de RhoB, es de forma detectable más elevado.
La sobreexpresión o aumento en el número de
copias del gen de RhoB son términos relativos que significan que se
encuentra una diferencia detectable (más allá de la contribución del
ruido en el sistema utilizado para medirlo) en la cantidad de
expresión o número de copias del gen de RhoB relativo a cierta línea
base. En la presente invención, la línea base es la expresión génica
medida o el número de copias de una muestra de control, cuyo término
se define a continuación.
La comparación se puede llevar a cabo mediante
análisis estadístico sobre las mediciones numéricas de la expresión
o número de copias del gen de RhoB; o, se puede realizar a través
del examen visual de los resultados experimentales por
investigadores cualificados.
Por ejemplo, las intensidades de expresión
génica de un tejido enfermo se pueden comparar con las intensidades
de expresión generadas de tejido normal del mismo tipo (por ejemplo,
muestra de tejido de pulmón enfermo vs. muestra de tejido de pulmón
normal). Una relación de estas intensidades de expresión indica las
veces que cambia la expresión génica entre las muestras de prueba y
de control.
En una realización de la presente invención, la
sobreexpresión del gen de RhoB se determina cuando existe por lo
menos una diferencia de 1,5 veces en su expresión en relación con la
expresión del mismo gen en una muestra de control. En otra
realización de la presente invención, un aumento en el número de
copias del gen de RhoB se determina cuando existe por lo menos una
diferencia de 1,5 veces en su número de copias en relación con el
número de copias del mismo gen en una muestra de control.
El test t de Student es un ejemplo de test
estadístico robusto que se puede utilizar para buscar diferencias
significativas entre dos grupos. Cuanto más bajo es el valor de p,
es más concluyente la evidencia de que el gen muestra una diferencia
entre los diferentes grupos. Un valor de p inferior a 0,05 mediante
el test t pone de manifiesto que el gen es significativamente
diferente. Una evidencia más concluyente es un valor de p inferior a
0,05 después de tener en cuenta la corrección de Sidak. Para un
número amplio de muestras en cada grupo, un valor de p inferior a
0,05 después del test de aleatorización/permutación es la evidencia
más concluyente de una diferencia significativa.
Una "muestra de control" se refiere a una
muestra de material biológico representativo de sujetos sanos sin
cáncer. El nivel de expresión del gen de RhoB o el número de copias
del gen de RhoB en una muestra de control es de manera deseable
habitual de la población general de sujetos normales sin cáncer de
la misma especie. Esta muestra se puede recoger de un sujeto con el
objetivo de ser utilizada en los procedimientos descritos en la
presente invención o, puede ser cualquier material biológico
representativo de sujetos normales sin cáncer obtenido para otras
razones, pero sin embargo, adecuado para su uso en los
procedimientos de la presente invención. También se puede obtener
una muestra de control a partir de tejido normal del sujeto que
tiene cáncer o es sospechoso de tener cáncer. Una muestra de control
también se puede referir a un nivel determinado de expresión del gen
de RhoB o el número de copias del gen de RhoB representativos de la
población sin cáncer, que se han establecido previamente en base a
las mediciones de sujetos normales sin cáncer. Como tal, una muestra
de control no necesita ser un material, sino que pueden ser datos o
información relacionada con una muestra de control. Estos datos o
información se almacenan habitualmente en forma electrónico o papel.
Alternativamente, una muestra biológica de control puede referirse a
una muestra que se obtiene de un individuo diferente o puede ser un
valor normalizado basado en los valores de la línea base hallados en
una población. Además, una muestra de control se puede definir
mediante una edad, sexo, etnia u otros parámetros demográficos
específicos. En algunas situaciones, el control está implícito en la
medición concreta. Por ejemplo, se considera un procedimiento de
detección que sólo puede detectar RhoB o el número de copias del gen
de RhoB cuando está presente un nivel más elevado de lo habitual en
un sujeto normal sin cáncer, por ejemplo, un ensayo
inmunohistoquímico, para evaluar el nivel de RhoB o el número de
copias del gen de RhoB en comparación con el nivel de control o el
número de copias del gen RhoB, ya que el nivel de control o el
número de copias es natural y conocidos en el ensayo.
La presente invención se refiere además al uso
de un gen de RhoB, o una región del mismo, como marcador de
pronóstico de la metástasis, o la reaparición o la reincidencia de
actividad neoplásica en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para el screening de fármacos activos contra el
adenocarcinoma de pulmón, comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón en presencia de un fármaco, o la medición de la afinidad de unión ente un fármaco y un polipéptido RhoB;
- b)
- la comparación de la expresión o números de copias medidas del gen de RhoB, o la afinidad de unión de la etapa a) a una muestra de control;
caracterizado porque una expresión o número de
copias reducido del gen de RhoB, o una mayor actividad enzimática en
la etapa a), en relación con la expresión o el número de copias del
mismo gen o la afinidad de unión del mismo polipéptido en una
muestra de control es indicativa de la actividad del fármaco contra
el adenocarcinoma de
pulmón.
pulmón.
Como tal, la presente invención proporciona
procedimientos para identificar compuestos o agentes que se pueden
utilizar para tratar trastornos caracterizados por, o asociados con
una expresión o número de copias reducido del gen de RhoB. Estos
procedimientos incluyen habitualmente la etapa de screening de un
candidato, compuesto de prueba o agente para identificar compuestos
que son un agonista o antagonista de un polipéptido RhoB, y
específicamente por la capacidad de interaccionar con (por ejemplo,
unirse a) un polipéptido RhoB, para modular la interacción de un
polipéptido RhoB y una molécula diana, y/o para modular la expresión
de ácido nucleico de RhoB y/o la actividad del polipéptido RhoB. Los
candidatos, compuestos de prueba o agentes que tienen una o más de
estas capacidades se pueden utilizar como fármacos para tratar
trastornos caracterizados por una expresión o número de copias
reducido del gen de RhoB.
Una expresión o número de copias reducida del
marcador del gen de RhoB en un adenocarcinoma de pulmón también
puede servir para predecir la respuesta de ese cáncer a terapias
específicas. Este marcador molecular se puede utilizar para
seleccionar la terapia más apropiada para el sujeto.
Como tal, la presente invención proporciona
además un procedimiento para determinar la eficacia de una pauta de
tratamiento terapéutico en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón,
comprendiendo dicho procedimiento
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón de dicho sujeto, generando de este modo un nivel inicial;
- b)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una segunda muestra con células de adenocarcinoma de pulmón del mismo sujeto en un momento posterior a la administración de la pauta de tratamiento, obteniendo de este modo un nivel de prueba; y
- c)
- la comparación de los niveles inicial y de prueba;
caracterizado porque una expresión o número de
copias reducido del gen de RhoB en el nivel de prueba en relación
con el nivel inicial es indicativa de que la pauta de tratamiento es
eficaz en el sujeto.
La presente invención se refiere además al uso
de una molécula de nucleótido o anticuerpo que interaccionan con
ADN, ARN, proteína de RhoB, o un fragmento de los mismos, para el
pronóstico de la evolución de la enfermedad en un sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, para el screening de fármacos activos
contra el adenocarcinoma de pulmón, o para determinar la eficacia de
una pauta de tratamiento terapéutico en un sujeto con adenocarcinoma
de pulmón. Dicha molécula de nucleótido es un nucleótido que tiene
por lo menos un 70% de homología con respecto a la SEC ID NO.
4-6, preferiblemente por lo menos aproximadamente un
80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con respecto a
la SEC ID NO. 4-6. La molécula de anticuerpo que
interacciona con ADN, ARN, proteína de Rhob, o un fragmento de los
mismos, puede ser monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado o
biespecífico, o está conjugado a un segundo anticuerpo, o un
fragmento del mismo. Particularmente, la molécula de anticuerpo es
el anticuerpo policlonal Rho B (119), o una molécula de anticuerpo
que tiene preferiblemente por lo menos un 80% y más preferiblemente
por lo menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de
homología con el anticuerpo policlonal Rho B (119).
Un "fragmento" es una parte de una
secuencia de Rhob madura natural, nativa o endógena de longitud
completa que tiene uno o más residuos de aminoácidos eliminados. El
residuo o residuos de aminoácidos eliminados pueden estar en
cualquier parte del polipéptido, incluyendo en el extremo
N-terminal o el extremo C-terminal,
o internamente. Dicho fragmento tendrá por lo menos una propiedad
biológica en común con RhoB. Los fragmentos de RhoB tendrán
habitualmente una secuencia consecutiva de por lo menos 10, 15, 20,
25, 30, 40, 50 ó 60 residuos de aminoácidos que son idénticos a las
secuencias de la RhoB aislada de un mamífero, incluyendo RhoB de SEC
ID NO: 2.
Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "anticuerpo" es intercambiable con
"inmunoglobulina" y se refiere a inmunoglobulinas de la forma
general hallada en especies vertebradas, incluyendo mamíferos, tales
como humanos, primates, roedores, conejos y muchas otras especies en
las que se han identificado dichas inmunoglobulinas.
"Anticuerpo" significa moléculas que corresponden a
inmunoglobulinas completas, así como fragmentos de las mismas, tales
como Fab, F(ab')2, y Fv, que son capaces de unirse al
determinante epitópico.
El término "anticuerpo monoclonal" se
refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen
sólo una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de
inmunorreaccionar con un epitopo particular de un antígeno, mientras
que el término "anticuerpo policlonal" se refiere a una
población de moléculas de anticuerpo que contienen múltiples
especies de sitios de unión a antígeno capaces de interaccionar con
un antígeno particular. De este modo, una composición con
anticuerpos monoclonales muestra habitualmente una única afinidad de
unión para un antígeno particular con el que inmunorreacciona.
Los procedimientos para producir y cribar
anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridomas son
rutinarios y conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitante, se
pueden inmunizar ratones con un polipéptido de la presente invención
o una célula que expresa dicho péptido. Una vez se detecta una
respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos
para el antígeno en el suero de ratón, se recoge el bazo del ratón y
se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se
fusionan mediante técnicas conocidas a cualquier célula de mieloma
adecuada. Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante
dilución limitada. A continuación, los clones de hibridomas se
ensayan mediante procedimientos conocidos en la técnica para células
que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la
presente invención. Los fluidos ascíticos, que contienen en general
niveles elevados de anticuerpos, se pueden generar mediante la
inmunización de ratones con clones de hibridomas positivos.
Los anticuerpos policlonales se producen
habitualmente mediante la inmunización de un mamífero adecuado, tal
como un ratón, conejo o cabra. Frecuentemente se prefieren mamíferos
más grandes, ya que la cantidad de suero que se puede recoger es
mayor. Se inyecta un antígeno al mamífero. Esto induce a que los
linfocitos B produzcan inmunoglobulinas IgG específicas para el
antígeno. Esta IgG policlonal se purifica del suero de mamífero. En
cambio, los anticuerpos monoclonales derivan de una única línea
celular.
El término "anticuerpo quimérico" se
refiere a un anticuerpo en el que la región constante proviene de un
anticuerpo de una especie (habitualmente humana) y la región
variable proviene de un anticuerpo de otra especie (habitualmente
roedor). Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son
conocidos en la técnica.
El término "anticuerpo humanizado" tal como
se utiliza en la presente invención, se refiere a moléculas de
anticuerpo en las que se han sustituido aminoácidos en las regiones
que no son de unión a antígeno con el fin de que se asemeje lo más
posible a un anticuerpo humano, mientras mantiene aún la capacidad
de unión original. Dependiendo del contexto, esta expresión también
puede incluir anticuerpos "de primate", en los que un primer
anticuerpo obtenido de un
organismo que no es primate ha sido modificado para asemejarse lo más posible a una inmunoglobulina de primate.
organismo que no es primate ha sido modificado para asemejarse lo más posible a una inmunoglobulina de primate.
Un anticuerpo "biespecífico" o bifuncional
es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos parejas de cadena
pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los
anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una serie de
procedimientos incluyendo la fusión de hibridomas o la unión de
fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann,
Clin Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et
al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Una realización adicional de la presente
invención proporciona un kit para el pronóstico de la evolución de
la enfermedad en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón que
comprende reactivos para medir la expresión o el número de copias
del gen de RhoB. Dicho kit puede comprender adicionalmente reactivos
adecuados para realizar una análisis con microarray. En particular,
el kit según la presente invención comprende Rho B
(119):sc-180 Santa Cruz Biotechnology, Inc. Rho B
(119) es un anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad
desarrollado contra un péptido que se mapea en una región interna de
RhoB de origen humano. Alternativamente, el kit según la presente
invención comprende cebadores con SEC ID No. 4-6
para realizar la RT-PCR o PCR cuantitativa a tiempo
real.
La presente invención proporciona además un
amplicón de gen de RhoB aislado, donde el amplicón comprende más de
una copia de un polinucleótido seleccionado entre:
- a)
- un polinucleótido que codifica el polipéptido establecido en la SEC ID NO. 2;
- b)
- un polinucleótido establecido en la SEC ID NO. 1;
- c)
- un polinucleótido que tiene por lo menos un 70% de homología con el polinucleótido de a) o b); y
- d)
- un polinucleótido que se sobreexpresa en células de adenocarcinoma de pulmón que tiene por lo menos un 70% de homología con el polinucleótido de a) o b).
La presente invención se refiere además a
inhibidores de la sobreexpresión del gen de RhoB para su uso como
medicamento. Dicho uso como medicamento o método de tratamiento
comprende la administración a sujetos con NSCLC o a sujetos
susceptibles de desarrollar NSCLC incluyendo adenocarcinoma de
pulmón, carcinoma de células escamosas, o carcinoma de células
grandes de una cantidad eficaz de un inhibidor de la sobreexpresión
del gen de RhoB para combatir las afecciones asociadas con NSCLC, en
particular para evitar el desarrollo posterior a metástasis ósea, o
la reaparición o reincidencia de actividad neoplásica.
La presente invención también se refiere al uso
de los inhibidores de la sobreexpresión del gen de RhoB o cualquier
subgrupo de los mismos en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de NSCLC incluyendo adenocarcinoma de pulmón, carcinoma
de células escamosas, o carcinoma de células grandes, en particular
para evitar el desarrollo posterior en metástasis ósea, o la
reaparición o reincidencia de actividad neoplásica. Dicho de otra
manera, la presente invención proporciona inhibidores de la
sobreexpresión del gen de RhoB para su uso en el tratamiento de
NSCLC incluyendo adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células
escamosas, o carcinoma de células grandes, en particular para evitar
el desarrollo posterior a metástasis ósea, o la reaparición o
reincidencia de actividad neoplásica.
El término "tratar", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a invertir, aliviar o inhibir el
progreso del trastorno o afección al que se aplica dicho término, o
uno o más síntomas de dichos trastornos o afección. El término
"tratamiento" se refiere al hecho de tratar, lo cual se ha
definido anteriormente.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" o "cantidad eficaz" tal como se utilizan en la
presente invención, significan la cantidad de compuesto o componente
o agente farmacéutico activo que obtiene la respuesta biológica o
médica en un tejido, sistema, animal o humano que se está buscando,
a la luz de la presente invención, por un investigador, veterinario,
doctor u otro profesional clínico, que incluye la mejora de los
síntomas de la enfermedad en tratamiento.
Dado que la presente invención incluye
combinaciones que comprenden dos o más agentes, la "cantidad
terapéuticamente eficaz" es aquella cantidad de los agentes
tomados en conjunto, de manera que el efecto combinado proporciona
la respuesta biológica o médica deseada.
El término "inhibidor" pretende incluir
antagonistas y, se refiere a una molécula que directa o
indirectamente reduce la sobreexpresión del gen de RhoB, o la
actividad biológica de un polipéptido o proteína RhoB. Los
inhibidores de la sobreexpresión del gen de RhoB pueden incluir
anticuerpos, ácidos nucleicos, u otras moléculas.
En una realización, los inhibidores de la
sobreexpresión del gen de RhoB se pueden seleccionar entre:
- a)
- un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína RhoB, o un polipéptido que comprende una región de unión a RhoB;
- b)
- un péptido mimético del polipéptido Rhob;
- c)
- un ácido nucleico inhibidor del gen de RhoB seleccionado entre un oligonucleótido antisentido, un ribozima, y un agente ARNi seleccionado entre ARNds y ARNsh; o
- d)
- una combinación que comprende lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente aceptables de la misma.
La molécula de anticuerpo que se une
específicamente a una proteína RhoB puede ser monoclonal,
policlonal, quimérico, humanizado o biespecífico, tal como se
describe anteriormente en la presente invención.
El término "fragmento de anticuerpo" se
refiere más específicamente a estos fragmentos y/o polipéptidos de
tipo inmunoglobulina que no comprenden una inmunoglobulina
completa.
Un "polipéptido que comprende una región de
unión específica a RhoB" significa un polipéptido que incorpora
una o más regiones de unión que se unen específicamente a la
proteína RhoB de la SEC ID NO. 2. Un tipo clásico de región de unión
específica a antígeno es una región determinante de
complementariedad (CDR) hallada en una inmunoglobulina. Las CDRs son
secuencias de aminoácidos cortas que se unen específicamente al
antígeno en cuestión y proporcionan la base de la selectividad de
unión del polipéptido en el que reside. Las CDRs se identifican
habitualmente a partir de inmunoglobulinas, pero se pueden generar
mediante otros medios.
Las regiones de unión específica a antígeno
también incluyen secuencias de aminoácidos relativamente cortas que
se unen a un antígeno, incluso si estas secuencias no derivan de
CDRs. WO2004/044011, incorporada en la presente invención por
referencia, proporciona un ejemplo de cómo dichas regiones de unión
específica a antígeno (que no son CDRs) se pueden identificar y
desarrollar. Existen otros procedimientos conocidos por los expertos
en la materia. Una vez desarrollada, la región de unión especifíca a
RhoB se puede utilizar en una amplia variedad de estructuras y
armazones conocidas y futuribles, incluyendo cualquier isotipo de
inmunoglobulina o fragmento de la misma, y otros polipéptidos de
estructura o armazón que no son inmunoglobulinas para proporcionar
la especificidad de unión a antígeno. Todos estos polipéptidos se
consideran en la presente invención como "polipéptidos que
comprenden una región de unión específica a RhoB".
Un "péptido mimético" es un agente no
peptídico derivado de manera sintética creados en base al
conocimiento de los residuos críticos del polipéptido de un sujeto
que puede mimetizar la función normal del polipéptido. Los miméticos
de péptido pueden romper la unión de un polipéptido a su receptor o
a otras proteínas y, de este modo, interferir con la función normal
de un polipéptido. Por ejemplo, un mimético de RhoB interferiría con
la función normal de RhoB.
"Secuencia de ácidos nucleicos", tal como
se utiliza en la presente invención, se refiere a un
oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y fragmentos o partes
de los mismos, cuyos componentes poliméricos pueden ser ADN, ARN,
nucleótidos modificados, miméticos de nucleótidos, o combinaciones
de los mismos; y pueden ser de origen genómico o sintético, y pueden
ser cadena simple o doble, y representan la cadena de sentido o
antisentido.
El término "antisentido" tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a secuencias de
nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN
específica, habitualmente un ARNm diana. Se unen a ARNm mediante el
emparejamiento de bases de Watson-Crick, e inhiben
su mensaje diana a través de la degradación mediante ribonucleasa
(RNasa) H o mediante interferencia con la maquinaria de traducción.
Los oligonucleótidos antisentido se pueden estabilizar opcionalmente
con fosforotionatos, metilfosfonatos, nanopartículas de
polialquilcianoacrilato, y modificaciones en 2' de los azúcares. El
término "cadena antisentido" se utiliza en referencia a una
cadena de ácido nucleico que es complementaria a la "cadena de
sentido". Las moléculas antisentido se pueden producir mediante
cualquier procedimiento, incluyendo la síntesis mediante unión del
gen de interés en orientación inversa a un promotor viral que
permite la síntesis de una cadena complementaria. La designación
"negativa" se utiliza algunas veces en referencia a la cadena
antisentido, y "positiva" se utiliza algunas veces en
referencia a la cadena de sentido.
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Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "ribozima" significa una molécula de ARN que tiene una
actividad enzimática que es capaz de dividir o empalmar otras
moléculas de ARN separadas en una secuencia de bases de nucleótidos
de una manera específica. En referencia a una molécula de ARN
catalítica o enzimática se entiende una molécula de ARN que tiene
complementariedad en una región de unión a sustrato con el ARNm de
RhoB, y también tiene actividad enzimática que es activa para
dividir y/o empalmar ese ARNm, alterándolo de esta manera.
El término "agente ARNi" tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a compuestos y
composiciones que pueden actuar a través de un mecanismo de
interferencia de ARN (véase, para una referencia general, He y
Hannon, (2004) Nat. Genet. 5:522-532). Habitualmente
se utilizan agentes ARNi tales como ARN de corta interferencia
(ARNsi), ARN de doble cadena (ARNds), ARN en horquilla corta
(ARNsh), también denominado algunas veces como ARN en horquilla
pequeña, otros están en desarrollo. Cuando se introducen en una
célula o se sintetizan en una célula, los agentes ARNi se incorporan
en un complejo macromolecular que utiliza cadenas del agente ARNi
para marcar y dividir cadenas de ARN que contienen la secuencia
complementaria (o sustancialmente complementaria).
Tal como se contempla en la presente invención,
se diseñan oligonucleótidos antisentido, ADN de triple hélice,
aptámeros de ARN, agentes ARNi tales como ARNsi, ARNds, y ARNsh,
ribozimas y ARN de cadena simple para inhibir la expresión de RhoB,
de manera que se diseña la secuencia de nucleótidos elegida de la
molécula inhibidora para provocar la inhibición de la síntesis
endógena de proteína RhoB.
Por ejemplo, en base a la presente descripción,
se puede utilizar el conocimiento de la secuencia de nucleótidos de
RhoB para diseñar una molécula de ARNsi que inhiba la expresión de
RhoB sin demasiada experimentación. De manera similar, los ribozimas
se pueden sintetizar para reconocer secuencias de nucleótidos
específicas de una proteína de interés y dividirla (Cech. J. Amer.
Med Assn. 260:3030 (1988)). Las técnicas para el diseño de dichas
moléculas para su uso en la inhibición dirigida de la expresión
génica son bien conocidas por los expertos en la materia.
En una realización de la presente invención, el
inhibidor de la sobreexpresión del gen de RhoB es una molécula ARNsh
que tiene por los menos un 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99%, o 100% de homología con la SEC ID NO. 3, tal como se
proporciona a continuación.
Los oligonucleótidos antisentido, ribozimas, y
agentes ARNi se pueden preparar mediante cualquier procedimiento
conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácidos
nucleicos. Se incluyen técnicas para la síntesis química, tal como
síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente,
los oligonucleótidos antisentido, ribozimas, y agentes ARNi se
pueden generar mediante transcripción in vitro de secuencias
de ADN que codifican la molécula pertinente. Dichas secuencias de
ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores con
promotores de ARN polimerasa adecuados.
Los oligonucleótidos antisentido, ribozimas, y
agentes ARNi se pueden liberar a células mediante aplicación
directa, tal como transfección o formuladas en liposomas. Las
técnicas de transfección convencionales incluyen una variedad de
técnicas reconocidas en el sector para introducir ácido nucleico
exógeno (por ejemplo, ADN o ARN) en una célula huésped, incluyendo
coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección
mediada por DEAE-dextrano, lipofección,
(micro)inyección, o electroporación.
Los liposomas se pueden preparar utilizando
técnicas convencionales incluyendo sonicación, diálisis con
quelatos, homogeneización, infusión de disolvente acoplado con
extrusión, extrusión por congelación-descongelación,
microemulsificación, y otros. Los reactivos utilizados para
reticular un liposoma u otro agente que contenga lípidos con
oligonucleótidos antisentido, ribozimas, y agentes ARNi comprenden
un derivado fosfolípido para anclarse a un extremo de la
reticulación en la capa lipídica y un grupo reactivo en el otro
extremo para proporcionar un punto de unión a la biomolécula diana.
También se pueden utilizar liposomas polimerizados o liposomas
recubiertos con polímero. Dichos polímeros pueden estabilizar el
liposoma, reducir su depuración del cuerpo, y/o reducir su
inmunogenicidad. El liposoma se puede cargar con un residuo
funcional tal como un agente de diagnóstico o terapéutico durante o
después de su formación. El agente puede estar contenido en el
núcleo acuoso del liposoma o se puede incorporar o unir a su
membrana circundante.
Alternativamente, la liberación de
oligonucleótidos antisentido, ribozimas, y agentes ARNi se realiza a
través de una estrategia de terapia génica en la que los vectores,
incluyendo plásmidos, cósmidos, bacteriófagos, o vectores virales,
particularmente vectores retrovirales, lentivirales, o adenovirales,
se liberan a una célula o sujeto; o células que dirigen la expresión
de las moléculas, por ejemplo, células en las que se ha introducido
un vector que dirige la expresión de la molécula, se administran al
sujeto. Los vectores que dirigen la síntesis in vivo de
oligonucleótidos antisentido, ri-
bozimas, y agentes ARNi se pueden introducir en líneas celulares, células o tejidos de manera constitutiva o inducible.
bozimas, y agentes ARNi se pueden introducir en líneas celulares, células o tejidos de manera constitutiva o inducible.
Una molécula "vector" es una molécula de
ácido nucleico en la que se puede insertar ácido nucleico heterólogo
que entonces se puede introducir en una célula huésped apropiada.
Los vectores tienen preferiblemente uno o más orígenes de
replicación, y uno o más sitios en los que se puede insertar el ADN
recombinante. Los vectores frecuentemente tienen medios adecuados
mediante los cuales se pueden seleccionar las células con vectores
de aquellas sin vectores, por ejemplo, que codifican genes de
resistencia fármacos.
Una "célula huésped", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a una célula procariota o
eucariota que contiene ADN heterólogo que ha sido introducido en la
célula mediante cualquier medio, por ejemplo, electroporación,
precipitación con fosfato de calcio, microinyección, transformación,
infección viral, y similares.
"Heterólogo" tal como se utiliza en la
presente invención significa "de origen natural diferente" o
representa un estado no natural. Por ejemplo, si se transforma una
célula huésped con un ADN o gen derivado de otro organismo,
particularmente de otra especie, ese gen es heterólogo con respecto
a la célula huésped y también con respecto a los descendientes de la
célula huésped que portan ese gen. De forma similar, heteróloga se
refiere a una secuencia de nucleótidos derivada de e insertada en el
mismo tipo de células natural original, pero que está presente en un
estado no natural, por ejemplo un número de copias diferentes, o
bajo el control de diferentes elementos reguladores.
Los protocolos adicionales de terapia génica
pueden implicar aislar una población de células, por ejemplo,
células madre o células del sistema inmune de un sujeto,
opcionalmente expandir las células en cultivo de tejido, y
administrar un vector de terapia génica a las células in
vitro. A continuación, las células se pueden devolver al sujeto.
Opcionalmente, se pueden seleccionar in vitro células que
expresan el oligonucleótido antisentido, ribozima, o agente ARNi
deseados, antes de introducirlas en el sujeto. Alternativamente, se
puede utilizar una población de células, que pueden ser células de
una línea celular o de un individuo que no es el sujeto. Los
procedimientos de aislamiento de células madre, células del sistema
inmune, etc, de un sujeto son bien conocidos en la técnica. Dichos
procedimientos se utilizan, por ejemplo, para el trasplante de
médula ósea, trasplante de células madre de sangre periférica, etc.,
en individuos que está realizando quimioterapia.
En una realización adicional de la presente
invención, el inhibidor de la sobreexpresión de gen de RhoB es una
combinación que comprende lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos.
El término "y/o" se refiere a un "o"
no exclusivo, es decir, "A y/o B" incluye "A y B", asi
como "A o B". Como tal, la expresión "lovastatina y ácido
zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos", se refiere a las siguientes combinaciones:
- a)
- lovastatina y ácido zoledrónico;
- b)
- una sal farmacéuticamente aceptable de lovastatina y ácido zoledrónico;
- c)
- lovastatina y una sal farmacéuticamente aceptable de ácido zoledrónico; y
- d)
- una sal farmacéuticamente aceptable de lovastatina y una sal farmacéuticamente aceptable de ácido zoledrónico.
La lovastatina es un producto comercial que
puede ser proporcionado por las compañías TCI Europe NV, Sigma
Aldrich, entre otras. El número de registro CAS de lovastatina es
75330-75-5, y su fórmula estructural
es:
Ácido zoledrónico, al que también se hace
referencia como zoledronato, es un producto comercial que puede ser
proporcionado por las compañías Interchim Ambinter, ACIC Europe
Limited, entre otras. El número de registro CAS del ácido
zoledrónico es 118072-93-8, y su
fórmula estructural es:
El término "farmacéuticamente aceptable"
significa que un compuesto o combinación de compuestos deben ser
compatibles con los otros ingredientes de una formulación, y no ser
prejudiciales para el paciente. Para el uso terapéutico, las sales
de lovastatina o ácido zoledrónico son aquellas en las que el
contraión es farmacéuticamente aceptable.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables tal como se han mencionado anterior pretenden comprender
las formas de sales de adición de ácidos no tóxicos terapéuticamente
activas que la lovastatina y el ácido zoledrónico son cada uno
capaces de formar. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables se pueden obtener de manera adecuada mediante el
tratamiento de la forma básica de lovastatina y el ácido zoledrónico
con dicho ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden, por
ejemplo, ácidos inorgánicos tales como hidrácidos, por ejemplo ácido
clorhídrico o bromhidrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y ácidos
similares; u ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acético,
propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir,
etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico),
maleico, fumárico, málico (es decir, ácido hidroxibutanodioico),
tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico,
bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico,
salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y ácidos
similares. A la inversa, dichas formas de sales se pueden convertir
mediante el tratamiento con una base apropiada en la forma de base
libre.
En una realización de la presente invención, la
combinación que comprende lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales
farmacéuticamente aceptables de las mismas se pueden administrar de
manera simultánea, por separado o de una manera secuencial.
Como tal, la presente invención se refiere
además a una combinación de formulaciones farmacéuticas separadas en
forma de kit. Por ejemplo, un kit puede comprender dos formulaciones
farmacéuticas separadas que comprenden: 1) lovastatina o sales
farmacéuticamente aceptables de la misma; y 2) ácido zoledrónico o
sales farmacéuticamente aceptables del mismo. El kit puede
comprender también un recipiente para las formulaciones separadas,
tal como una botella compartimentada o un recipiente de papel de
aluminio compartimentado. Ejemplos adicionales de recipientes
incluyen jeringas, cajas, bolsas y similares. Habitualmente, un kit
comprende instrucciones para la administración de los componentes
separados. La forma kit es particularmente ventajosa cuando los
componentes separados se administran preferiblemente en formas de
dosificación diferentes (por ejemplo, oral y parenteral), se
administran a diferentes intervalos de dosificación, o cuando se
desea el ajuste de los componentes individuales de la combinación
por profesional clínico.
En general, se contempla que se puede utilizar
una cantidad diaria eficaz de ácido zoledrónico de aproximadamente
0,5 hasta aproximadamente 2000 mg. Una cantidad diaria eficaz de
lovastatina puede variar desde aproximadamente 5 mg hasta
aproximadamente 400 mg.
La dosis exacta y la frecuencia de
administración de los inhibidores de la sobreexpresión del gen de
RhoB dependen del compuesto concreto o la combinación utilizada, la
afección concreta en tratamiento, la gravedad de la afección en
tratamiento, la edad, el peso, el sexo, la extensión del trastorno y
la condición física general del paciente concreto, asi como otra
medicación que el individuo puede estar tomando, tal como es bien
sabido por los expertos en la materia. Además, es evidente que dicha
cantidad diaria eficaz puede disminuir o aumentar dependiendo de la
respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del
médico que prescribe los compuestos de la presente invención. Las
variaciones de la cantidad diaria eficaz mencionada anteriormente
sirven por tanto únicamente como guías.
Los siguientes ejemplos no limitativos ayudan a
ilustrar los principios de la invención.
Animales y cultivos celulares. Se
adquirieron ratones desnudos atímicos de cuatro semanas de vida de
Harlan (Barcelona, España) y se mantuvieron en condiciones
específicas libres de patógenos. La línea celular de adenocarcinoma
A549 fueron obtenidas del Dr. Gazdar. Todas las líneas celulares se
mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero
bovino fetal.
Se extrajo ARN utilizando Reactivo TRIzol (Life
Technologies) de tres placas de cultivo de 10 cm por línea celular y
se purificó utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). La
pureza y calidad se evaluó utilizando nanochips RNA 6000 (Agilent
Technologies, Alemania). A continuación, se utilizó el ADN para
sintetizar sondas complementarias (ADNc) utilizando el kit de
síntesis de ADNc de un ciclo (Affimetrix). Posteriormente, se
sintetizó ARNc y se marcó con ADNc como plantilla utilizando el kit
de marcado IVT (Affimetrix), y se purificó mediante GeneChip Sample
Cleanup Module (Affimetrix). Los ARNc marcados se fragmentaron y se
hibridaron a microarrays de oligonucleótidos de alta densidad de
GeneChip de Affimetrix Human Genome U133 2.0 según los protocolos
descritos en Gene Expression Analysis Technical Manual
(http://www.affimetrix.com). Se hibridaron 3 microarrays con 3
réplicas biológicas independientes por línea celular de 3 líneas
diferentes (denominadas M1M1, M1M3, y M1M4). Para cada línea
celular, se utilizó un grupo de tres extracciones de ARNm
independientes para hibridar cada microarray de oligonucleótidos de
alta densidad humanos de GeneChip. Como controles se utilizaron 6
líneas de células tumorales parentales: 3 transfectadas con el
vector de luciferasa y 3 no transfectadas. En total, se hibridó un
conjunto de 15 muestras: 6 controles y 9 líneas metastáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló el ARN total del 70-80%
de cultivos confluentes utilizando Trizol RNA (2 \mug) y DNasa I,
se trató y transcribió de forma inversa utilizando la transcriptasa
inversa Superscript II y cebadores oligo(dT). Se realizó un
Assay-on-Demand^{TM} (Applied
Biosystems) utilizando un sistema de detección de secuencias Gene
Amp 7300 (Applied Biosystems) para RHOB según las recomendaciones
del fabricante. El valor promedio de ciclo umbral (Ct) de las
muestras por triplicado se utilizó para calcular la expresión
génica. Los productos de PCR se normalizaron hasta los niveles de
\beta-actina. El experimento se repitió tres veces
con resultados idénticos.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de los datos de microarrays se
realizó utilizando la estrategia y procedimientos descritos en la
bibliografía (Castellano et al. 2007). En resumen, se utilizó
el algoritmo de RMA para la corrección de la base, la normalización
intra- e intermicroarrays y el cálculo de la señal de expresión
(2-4). Una vez calculada la señal de expresión
absoluta para cada gen (es decir, el valor de la señal para cada
conjunto de sondas) en cada microarray, se aplicó un procedimiento
(denominado SAM) (Tusher et al. 2001) para calcular la
expresión diferencial significativa y encontrar los conjuntos de
sondas para genes que caracterizan las muestras altamente
metastáticas. El procedimiento utiliza permutaciones para
proporcionar una inferencia estadística robusta de los genes más
significativos y proporciona valores de p ajustados a tests
múltiples utilizando FDR (Benjamini et al. 1995). El test
principal se realizó mediante el contraste de 4 muestras de control
frente a 9 muestras altamente metastáticas. Sin embargo, con 3
líneas metastáticas diferentes (M1M1, M1M3, MM1M4) realizadas por
triplicado, se realizaron análisis SAM múltiples para encontrar los
genes que mostraban una expresión diferencial significativa que
también eran estables en diferentes tests SAM. Se utilizó un corte
de FDR < 0,20 para todos los cálculos de expresión diferencial.
Se aplicaron todos estos procedimientos utilizando las herramientas
estadísticas "R" y Bioconductor. Tras la identificación del
conjunto de sondas para genes expresados de manera diferencial, se
analizó la correspondiente matriz de valores de expresión para todas
las hibridaciones de microarrays utilizando el algoritmo de
agrupación "hclust" implementado en "R". Este algoritmo
realiza un análisis de agrupación jerárquica con unión completa para
buscar similitudes entre los conjuntos de sondas basados en sus
valores de expresión en los diferentes microarrays de chips
analizados. El algoritmo clasifica los conjuntos de sondas en grupos
correlacionados que presentan perfiles de expresión o firmas de
expresión similares. Esta estrategia global permitió la selección de
genes claves significativos con perfiles de expresión similares.
Ensayos de metástasis: i.c. se realizó
tal como se ha descrito anteriormente (González et al.
2007).
Creación de imágenes por bioluminescencia y
análisis. Se anestesiaron ratones y se les inyectó
intraperitonealmente 1,5 mg de D-Luciferina en 100
\mul de PBS. La imagen se completó a los 2 min exactamente para
cada grupo de ratones con un sistema Xenogen IVIS acoplado un
software de adquisición y análisis Living Image (Xenogen Inc.). El
flujo de fotones se calculó para cada ratón mediante la utilización
de una región circular de interés para cada pata trasera. Los
valores base (de ratón inyectado con luciferina sin células
tumorales) se restaron de cada
medición.
medición.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la proliferación celular mediante un
ensayo MTT según las recomendaciones del fabricante (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Los experimentos se
repitieron tres veces y los datos se representaron como la media de
los pocillos por sextuplicado \pm SEM.
Se realizó una radiografía por rayos X bajo
anestesia, en posición de cubito supino sobre una película
radiográfica sensible (MIN-R, Eastman Kodak). Los
ratones se expusieron a radiación X a 20 kV durante 20 s utilizando
un instrumento Faxitron (modelo MX-20; Faxitron,
Buffalo Grove, IL, USA). El área de metástasis osteolitica se evaluó
con un sistema de análisis de imagen computerizada, AnalySIS®
(sistema de obtención de imágenes suave GmbH, Münster, Alemania). Se
capturaron imágenes escaneadas en una película de rayos X de alta
resolución con doble aumento a 1.200 ppi utilizando un scanner Epson
Expression 1680 Pro (Long Beach, CA, USA). La cuantificación del
área metastática se realizó dos veces después de la calibración por
dos observadores independientes. Para las curvas de
Kaplan-Meier la metástasis se valoró como el tiempo
transcurrido hasta la primera aparición de signos de caquexia y
dificultad para caminar.
Se analizaron todas las articulaciones
femorotibial mediante un sistema \muCT (micro CAT ^{TM}II,
Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN, USA) a 75,0 kVp y
250,0 uA. Los escaneados se realizaron a una resolución de 10
\mum. SE reconstruyeron imágenes 2D CT utilizando un procedimiento
de proyección de retro-convolución estándar con un
filtro Shepp-Logan. Las imágenes se almacenaron en
grupos de 3D con un tamaño de vóxel de 19 \mum x 19 \mum
x
23 \mum.
23 \mum.
Se obtuvieron construcciones lentivirales para
ARNsh de RhoB humana de Sigma (St. Louis, MO, USA). Para obtener
partículas virales, se transfectaron células de empaquetamiento con
8 \mug de ADN para cada tipo de fusión mediante el procedimiento
con fosfato clasicote según las recomendaciones del fabricante. Se
utilizó el vector pLKO "scramble" como control (que contiene
una secuencia shRHOB en la que se han cambiado aleatoriamente las
bases nucleotídicas). Dos días después de la transfección, los
sobrenadantes se centrifugaron durante 10 minutos a 600 g y se
filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45
\mum de poro. Para la infección por transducción, se sembraron
A549 a 1x10^{5} células y se incubaron durante toda la noche con
sobrenadantes virales en presencia de 4 \mug/ml de polibreno
(Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la infección, se incubaron
poblaciones de células en medio que contenía el antibiótico
apropiado durante dos semanas adicionales. Los grupos resistentes a
antibiótico se expandieron y se congelaron en cada pasaje
celular.
Se aislaron células metastáticas de la médula
ósea de las extremidades inferiores. Los ratones se sacrificaron
según los protocolos aprobados del Comité Local de Animales
(Universidad de Navarra, protocolo 003-04). Se
extirparon los huesos largos, y se lavaron de todos los tejidos
blandos. Se liberaron las células de la médula mediante
"flushing", introduciendo 5-10 mi de medio
\alpha-MEM que contenía 2 x
penicilina/estreptomicina con una aguja de calibre 27 en la epífisis
distal a través del compartimento de la médula ósea. Las
agrupaciones de células se desagregaron pasando el medio que
contenía las células a través de la jeringa con aguja del calibre 27
G. Las células se sembraron en placas de 10 ó 15 cm expandidas
durante 5 días en un medio que contenía 0,4 mg/ml de
G-418. Este procedimiento se realizó por separado
para cada fémur y tibia de 7 ratones por grupo. Se contaron las SCC
bajo la luz de un microscopio después de tinción con violeta
cristal.
Se extirparon las patas traseras, se extrajeron
cuidadosamente tejidos blandos del fémur, se fijaron durante 24 h en
formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron y se
descalcificaron en solución Osteosoft®. Después de la completa
deshidratación con alcohol, los huesos se incluyeron en parafina y
se tiñeron secciones de 5 \mum con H&E.
Para este análisis, se seleccionaron 35
individuos que se separaron en dos grupos seleccionados en base al
grupo de Enfermedad Progresiva (PD) comparado con un grupo Sin
Enfermedad (DF) después de la cirugía. El grupo PD incluía pacientes
con un historial de un cáncer de pulmón primario completamente
reseccionado que reincidió (reaparición o metástasis) después de un
periodo sin enfermedad de 6 meses después de la cirugía. Los
pacientes DF fueron el resto de individuos con cáncer de pulmón
primario completamente reseccionado sin signos de la enfermedad. Los
pacientes que realizaron cualquier tratamiento, ya sea radioterapia
o quimioterapia, después de la cirugía se excluyeron del análisis.
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético Local. Para
cada paciente se obtuvo un consentimiento y cuestionarios por
escrito (antecedentes y seguimiento). Los criterios de inclusión
fueron: histología (NSCLC: adenocarcinoma), y ausencia de cáncer en
los 5 años previos a la intervención quirúrgica del cáncer de
pulmón, excepto el melanoma o el cáncer de piel. El diagnóstico
histológico se determinó según la clasificación WHO. El estadiaje
patológico de los tumores se realizó según el sistema internacional
para el cáncer de pulmón. El periodo de seguimiento continuó hasta
el 31 de octubre del 2007. El tiempo de reincidencia se calculó
desde la intervención quirúrgica hasta la fecha de reincidencia.
Se utilizaron secciones de tejido fijados a
formalina y embebidos en parafina para los procedimientos
immunohistoquímicos. La parafina se extrajo de los tejidos y las
secciones se hidrataron a través de una serie graduada de etanol. La
actividad de peroxidasa endógena se detuvo con hidrógeno peroxidasa
al 3% durante 10 minutos. La extracción de antígeno por microondas
se llevó a cabo con tampón EDTA (mM, pH 8) durante 2 x 15 min. Los
sitios de unión no específica se bloquearon con suero normal de
cabra al 5% en TBS-Tween (tampón de lavado, Dako)
durante 30 minutos. Las secciones se incubaron con anticuerpo
policlonal de conejo anti-RhoB
(sc-180, Santa Cruz Biotechnology, Inc) durante toda
la noche a 4ºC. La dilución de trabajo fue: 1:75. Después de
enjuagar con TBS, las secciones se incubaron con el complejo
policlonal Envision (Dako). La actividad peroxidasa se demostró
mediante diaminobencidina. Finalmente, las secciones se lavaron en
agua, se contrastaron ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron
y se montaron en DPX. Los tejidos que expresaban diferentes niveles
de RhoB se incluyeron en cada banda inmunohistoquímica para unificar
la posible discordancia de intensidad.
Dos observadores de manera independiente y a
ciegas evaluaron la extensión e intensidad de la tinción en las
muestras. Para RhoB, la extensión se puntuó como el porcentaje de
células positivas (0-100%) y la intensidad de
tinción se evaluó en comparación con un control positivo externo
conocido (mareaje 1+, ligero; 2+, moderado y 3+, intenso). Las
lecturas independientes discordantes se resolvieron mediante la
revisión simultánea por ambos observadores.
Análisis estadístico. Se utilizó el test
de log-rank para calcular la significancia
estadística (valor de p) de las diferencias observadas entre las
curvas de Kaplan-Meier. Para estudiar las
diferencias en las velocidades de proliferación, crecimiento del
tumor, se analizaron las diferencias en el área metastática mediante
el test de Kruskall-Wallis con el test de
comparación múltiple de Dunn. Los valores se expresaron como la
media \pm SEM y la significancia estadística se definió como p
< 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***). Métodos
complementarios proporcionan una información adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Mazieres et al. (2004) Loss
of RhoB Expression in Human Lung Cancer Progression. Clinical
Cancer Research 10: 2742-2750.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Proyecto de Biomedicina Cima
S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVO BIOMARCADOR COMO DIANA
TERAPÉUTICA EN CÁNCER DE PULMÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 08014 (P0031)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> ES200802503
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2008-08-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótido relacionado con RhoB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttactgaaca cgatcagcag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> nucleótido relacionado con RhoB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagaacat ccccgagaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> nucleótido relacionado con RhoB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcgcaggtc ttttttgttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótido relacionado con RhoB
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttctgtc ccaatgtgcc catcatc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Procedimiento de pronóstico de la evolución
de la enfermedad en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón que
comprende:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB; o
- b)
- la medición del número de copias del gen de RhoB;
en una muestra de dicho sujeto con
adenocarcinoma de pulmón, caracterizado porque la detección
de la sobreexpresión o el aumento en el número de copias del gen de
RhoB en relación con la expresión o el número de copias del mismo
gen en una muestra de control es indicativo del riesgo de
metástasis, o reaparición o reincidencia de actividad
neoplásica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el pronóstico de la evolución de la enfermedad comprende la
determinación de un resultado clínico seleccionado del grupo que
consiste en velocidad de respuesta (RR), respuesta completa (CR),
respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD), tiempo hasta la
progresión (TTP), supervivencia global (OS), y beneficio clínico,
que comprende respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), y
enfermedad estable (SD).
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que la medición de la
expresión del gen de RhoB se determina a nivel de proteina, ARNm o
ADNc.
4. Uso de un gen de RhoB, o una región del
mismo, como marcador del pronóstico de metástasis, o reaparición o
reincidencia de actividad neoplásica en un sujeto con adenocarcinoma
de pulmón.
5. Procedimiento para el screening de fármacos
activos contra adenocarcinoma de pulmón, comprendiendo dicho
procedimiento:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón en presencia de un fármaco, o la medición de la afinidad de unión entre un fármaco y un polipéptido RhoB;
- b)
- la comparación de la expresión o números de copias medidas del gen de RhoB, o la afinidad de unión de la etapa a) a una muestra de control;
caracterizado porque una expresión o
número de copias reducido del gen de RhoB, o una mayor afinidad de
unión en la etapa a), en relación con la expresión o el número de
copias del mismo gen o la afinidad de unión del mismo polipéptido en
una muestra de control es indicativa de la actividad del fármaco
contra el adenocarcinoma de pulmón.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento para determinar la eficacia de
una pauta de tratamiento terapéutico en un sujeto con adenocarcinoma
de pulmón, comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una muestra con células de adenocarcinoma de pulmón de dicho sujeto, generando de este modo un nivel inicial;
- b)
- la medición de la expresión del gen de RhoB, o la medición del número de copias del gen de RhoB, en una segunda muestra con células de adenocarcinoma de pulmón del mismo sujeto en un momento posterior a la administración de la pauta de tratamiento, obteniendo de este modo un nivel de prueba; y
- c)
- la comparación de los niveles inicial y de prueba;
caracterizado porque una expresión o
número de copias reducido del gen de RhoB en el nivel de prueba en
relación con el nivel inicial es indicativo de que la pauta de
tratamiento es eficaz en el sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Uso de una molécula de nucleótido o
anticuerpo que interacciona con ADN, ARN, proteina de RhoB, o un
fragmento de los mismos, para el pronóstico de la evolución de la
enfermedad en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón, para el
screening de fármacos activos contra el adenocarcinoma de pulmón, o
para determinar la eficacia de una pauta de tratamiento terapéutico
en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que la
molécula de nucleótido es un nucleótido que tiene por lo menos un
70% de homología con la SEC ID NO. 4-6.
9. Uso según la reivindicación 7, en el que la
molécula de anticuerpo es un anticuerpo que tiene por lo menos un
70% de homología con RhoB (119).
10. Kit para el pronóstico de la evolución de la
enfermedad en un sujeto con adenocarcinoma de pulmón que comprende
un nucleótido que tiene por lo menos un 70% de homología con la SEC
ID NO. 4-6, o una molécula de anticuerpo que tiene
por lo menos un 70% de homología con RhoB (119).
11. Amplicón del gen de RhoB aislado, en el que
el amplicón comprende más de una copia de un polinucleótido
seleccionado entre:
- a)
- un polinucleótido que codifica el polipéptido establecido en la SEC ID NO. 2;
- b)
- un polinucleótido establecido en la SEC ID NO. 1;
- c)
- un polinucleótido que tiene por lo menos un 70% de homología con el polinucleótido de a) o b); y
- d)
- un polinucleótido que se sobreexpresa en células de adenocarcinoma de pulmón que tiene por lo menos un 70% de homología con el polinucleótido de a) o b).
\vskip1.000000\baselineskip
12. Uso de inhibidores de la sobreexpresión del
gen de RhoB, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), donde los
inhibidores se seleccionan entre:
- a)
- un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína RhoB, o un polipéptido que comprende una región de unión a RhoB;
- b)
- un péptido mimético del polipéptido RhoB;
- c)
- un ácido nucleico inhibidor del gen de RhoB seleccionado entre un oligonucleótido antisentido, un ribozima, y un agente ARNi seleccionado entre ARNds, ARNsi y ARNsh; o
- d)
- una combinación que comprende lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente aceptables de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Uso de inhibidores de la sobreexpresión del
gen de RhoB según la reivindicación 12, donde el inhibidor es una
molécula de ARNsh que tiene por lo menos un 70% de homología con la
SEC ID No. 3.
14. Uso del inhibidor de la sobreexpresión del
gen de RhoB según la reivindicación 13, en el que el ARNsh está en
forma de un oligonucléotido o vector.
15. Uso del inhibidor de la sobreexpresión del
gen de RhoB según la reivindicación 14, en el que el vector es un
plásmido, cósmido, bacteriófago, o un virus.
16. Uso de inhibidores según la reivindicación
12, en los que el inhibidor es una combinación que comprende
lovastatina y ácido zoledrónico, y/o sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos, y dicha combinación es para la
administración simultánea, separada o secuencial.
17. Uso de inhibidores según la reivindicación
16, donde el NSCLC se selecciona entre adenocarcinoma de pulmón,
carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes.
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|---|---|---|---|
| ES200802503A ES2339524B1 (es) | 2008-08-28 | 2008-08-28 | Nuevo biomarcador como diana terapeutica en cancer de pulmon. |
| PCT/ES2009/070347 WO2010023340A2 (es) | 2008-08-28 | 2009-08-19 | Nuevo biomarcador como diana terapéutica en cáncer de pulmón |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802503A ES2339524B1 (es) | 2008-08-28 | 2008-08-28 | Nuevo biomarcador como diana terapeutica en cancer de pulmon. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2339524A1 ES2339524A1 (es) | 2010-05-20 |
| ES2339524B1 true ES2339524B1 (es) | 2011-03-22 |
Family
ID=41396098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200802503A Withdrawn - After Issue ES2339524B1 (es) | 2008-08-28 | 2008-08-28 | Nuevo biomarcador como diana terapeutica en cancer de pulmon. |
Country Status (2)
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|---|---|
| ES (1) | ES2339524B1 (es) |
| WO (1) | WO2010023340A2 (es) |
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| US5962672A (en) * | 1998-09-18 | 1999-10-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of RhoB expression |
| US7135463B2 (en) * | 2000-06-16 | 2006-11-14 | University Of South Florida | RHoB as a suppressor of cancer cell growth, cell transformation, and metastasis |
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2009
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Also Published As
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| WO2010023340A2 (es) | 2010-03-04 |
| WO2010023340A3 (es) | 2010-05-20 |
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