ES2338283T3 - Genes encontrados de celulas monociticas de mamiferos; reactivos relacionados. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN VARIAS PROTEINAS DE MONOCITOS DE PRIMATE, REACTIVOS ASOCIADOS CON ESTOS ACIDOS NUCLEICOS, INCLUYENDO ANTICUERPOS ESPECIFICOS Y PROTEINAS PURIFICADAS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS PROCEDIMIENTOS DE USO DE DICHOS REACTIVOS E INSTRUMENTACION DE DIAGNOSTICO ASOCIADAS.

Description

Genes encontrados de células monocíticas de mamíferos; reactivos relacionados.

Campo de la invención

La presente invención contempla composiciones relacionadas con genes encontrados en las células monocíticas, células que funcionan en el sistema inmune. Estos genes funcionan controlando el desarrollo, la diferenciación y/o la fisiología del sistema inmune de los mamíferos. En particular, la solicitud proporciona ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos y métodos de utilización de los mismos.

Antecedentes de la invención

El componente circulante del sistema circulatorio de los mamíferos comprende varios tipos celulares, incluyendo los glóbulos rojos y los glóbulos blancos sanguíneos de los linajes celulares eritroide y mieloide. Ver, por ejemplo, Rapaport (1987), Introduction to Hematology (2ª ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987), Blood: Textbook of Hematology. Little, Brown and Co., Boston, MA; y Paul (ed.) (1993), Fundamental Immunology (3ª ed.) Raven Press, N.Y.

Los monocitos son células fagocíticas que pertenecen al sistema de fagocitos mononucleares y residen en la circulación. Ver Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego. Estas células se originan en la médula ósea y permanecen solamente un tiempo corto en el compartimento medular una vez que se diferencian. Entran entonces en la circulación y pueden permanecer allí durante un periodo de tiempo relativamente largo, por ejemplo unos cuantos días. Los monocitos pueden entrar en los tejidos y en las cavidades corporales mediante el proceso denominado diapédesis, donde se diferencian a macrófagos y posiblemente a células dendríticas. En una respuesta inflamatoria, el número de monocitos en la circulación puede duplicarse, y muchos de este número incrementado de monocitos diapedizar al lugar de la inflamación.

La presentación del antígeno se refiere a los acontecimientos celulares en los cuales un antígeno proteináceo es captado, procesado por las células presentadoras de antígeno (CPA) y posteriormente reconocido para iniciar una respuesta inmune. Las células presentadoras de antígeno más activas han sido caracterizadas como los macrófagos, que son productos procedentes del desarrollo directo de los monocitos; las células dendríticas y ciertas células B.

Los macrófagos se encuentran en la mayor parte de los tejidos y son muy activos en la internalización de una amplia variedad de antígenos proteicos y microorganismos. Tienen una actividad endocítica muy desarrollada y secretan muchos productos importantes en el inicio de la respuesta inmune. Por esta razón, se cree que es probable que muchos genes expresados por los monocitos o inducidos por la activación de los monocitos sean importantes en la captación, el procesamiento y la presentación del antígeno o en la regulación de la respuesta inmune resultante.

Sin embargo, los monocitos están poco caracterizados, en términos de las proteínas que expresan y en términos de muchas de sus funciones y mecanismos de acción, incluyendo sus estados activados. En particular, los procesos y mecanismos relacionados con el inicio de la respuesta inmune, incluyendo el procesamiento y la presentación del antígeno, permanecen poco claros. La ausencia de conocimiento sobre las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de estas células limita su comprensión. Por tanto, condiciones médicas en las cuales la regulación, el desarrollo o la fisiología de las células presentadoras de antígeno es inusual, permanecen difíciles de controlar.

La descripción completa se refiere a varias proteínas y por tanto se ha utilizado la denominación "proteína monocítica". Sin embargo, se comprenderá que la invención está dirigida a YE01 según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Más específicamente, las células destructoras naturales ("Natural Killer") son capaces de lisar células transformadas e infectadas por virus. Las interacciones moleculares que desencadenan sus funciones citocílitas no se comprenden bien. En la técnica anterior, se han identificado receptores de inhibidores de las células destructoras que son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Colonna y Samaridis (1995), Science 2 68:405-408). Existe la necesidad de identificar los factores implicados en este mecanismo.

Resumen de la invención

Para identificar las moléculas que están implicadas en la generación de señales negativas, se inmunizaron ratones con un clon de células NK humanas y los anticuerpos fueron sometidos a selección por su capacidad para inhibir, cuando se unían de manera cruzada, la lisis mediada por células NK de ciertas dianas. Como resultado se identificó el anticuerpo DX26.

DX26 reconoce también un receptor presente en células NK en reposo, denominado DLAIR (receptor similar a inmunoglobulina asociado a leucocitos 1). El gen que codifica una proteína que es reconocida por DX26 ha sido clonado y denominado YE01. El producto del gen YE01 es un receptor similar a Fc gamma/alfa.

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Por tanto, la presente invención proporciona una proteína o péptido YE01 sustancialmente puro o recombinante que presenta al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID Nº: 6, 8 ó 10; con una secuencia natural YE01 de la SEC ID Nº: 6, 8 ó 10; o con una proteína de fusión que contiene la secuencia de YE01 y una proteína heteróloga.

Las secuencias de aminoácidos de las SEC ID N^{os}: 6 y 8 son idénticas. Por tanto, para evitar la duplicación de identificadores de secuencias, únicamente se hace referencia a la SEC ID Nº: 6 en las exposiciones de la presente.

Según se describe en la presente, la proteína sustancialmente pura o aislada contiene un segmento que presenta identidad de secuencia con la porción correspondiente de YE01, donde: la homología es al menos un 90% de identidad aproximadamente y la porción es de al menos 9 aminoácidos aproximadamente; la homología es al menos un 80% de identidad aproximadamente y la porción es de al menos 17 aminoácidos aproximadamente; o la homología es al menos un 70% de identidad aproximadamente y la porción es de al menos 25 aminoácidos aproximadamente. En otras formas, la invención proporciona tal composición en cuestión, donde: YE01 comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 6 ó 10. La proteína o péptido puede proceder de un animal de sangre caliente seleccionado de un mamífero, incluyendo un primate o un roedor. La invención se refiere también a una proteína o polipéptido que contiene al menos un segmento polipeptídico de la SEC ID Nº: 6 ó 10; presenta una pluralidad de porciones que muestran la identidad; es una variante alélica natural de YE01; tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos aproximadamente; presenta al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para la YE01 de mamífero; presenta una identidad de secuencia de al menos un 90% aproximadamente a lo largo de una longitud de al menos 20 aminoácidos aproximadamente con una YE01 de roedor; presenta al menos dos epítopos no solapantes que son específicos de una YE01 de primate; presenta una identidad de secuencia de al menos un 90% aproximadamente a lo largo de una longitud de al menos 20 aminoácidos aproximadamente con una YE01 de primate; está glucosilada; tiene un peso molecular de al menos 7 kD con glucosilación natural; es un polipéptido sintético; está unida a un sustrato sólido; está conjugada a otro resto químico; es una sustitución de 5 veces o menos de la secuencia natural; o es una variante por delección o inserción de una secuencia natural.

Otras composiciones incluyen aquellas que comprenden: una proteína o péptido YE01 estéril; la proteína o péptido YE01 y un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso incluyendo agua, solución salina y/o un tampón; y/o formulada para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

En las realizaciones de proteínas de fusión, la invención proporciona aquéllas que comprenden: la secuencia de la proteína madura de SEC ID Nº: 10; una marca para detección o purificación, incluyendo una secuencia FLAG, His6 o Ig; o la secuencia de otra proteína de la superficie celular.

En la presente se describen varios kits que incluyen aquéllos que contienen una proteína o polipéptido y un compartimento que contiene la proteína o el polipéptido; y/o instrucciones para la utilización o la eliminación de los reactivos del kit.

Anticuerpos y compuestos de unión incluyen aquéllos que comprenden la porción de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína YE01 natural, donde: la proteína es una proteína de primate; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab o Fab2; el compuesto de unión está conjugado a otro resto químico; o el anticuerpo está producido contra una secuencia peptídica de un polipéptido maduro de SEC ID Nº: 6 ó 10, está producido contra una YE01 madura; está producido contra una YE01 purificada; está inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a YE01 desnaturalizada; presenta una Kd hacia el antígeno de al menos 30 mM; está fijado a un sustrato sólido, incluyendo una esfera o una membrana de plástico; está en una composición estéril o está marcado de forma detectable, incluyendo una marca radiactiva o fluorescente. Se proporciona un kit que comprende el compuesto de unión incluyendo, por ejemplo, el compuesto de unión y: un compartimento que contiene el compuesto de unión; y/o instrucciones para la utilización o eliminación de los reactivos del kit. Preferiblemente, el kit es capaz de realizar un análisis cualitativo o cuantitativo.

Otras composiciones diferentes incluyen aquéllas que contienen: un compuesto de unión estéril; o el compuesto de unión y un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina y/o un tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

La invención se refiere también a un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína o un péptido o una proteína de fusión según se ha descrito, donde: la proteína procede de un mamífero, incluyendo primates; o el ácido nucleico codifica una secuencia peptídica antigénica de SEC ID Nº: 6 ó 10, codifica una pluralidad de secuencias peptídicas antigénicas de SEC ID Nº: 6 ó 10; presenta al menos un 80% de identidad con un ADNc natural que codifica el segmento; es un vector de expresión; contiene además un origen de replicación; procede de una fuente natural; contiene una marca detectable; comprende una secuencia de nucleótidos sintética; es menor de 6 kb, preferiblemente menor de 3 kb; procede de un mamífero, incluyendo primates; contiene una secuencia codificadora de longitud completa natural; es una sonda de hibridación para un gen que codifica la proteína; o es un cebador de PCR, un producto de PCR o un cebador de mutagénesis.

Se proporcionan varias células, incluyendo aquéllas que contienen un ácido nucleico recombinante descrito. Preferiblemente, la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate o una célula humana. Los kits con tales ácidos nucleicos incluyen aquéllos con el ácido nucleico y: un compartimento que contiene el ácido nucleico; un compartimento que contiene además una proteína o polipéptido YE01; y/o instrucciones para la utilización o la eliminación de los reactivos del kit. Preferiblemente, el kit es capaz de llevar a cabo un análisis cualitativo o cuantitativo.

Otros ácidos nucleicos descritos en la presente incluyen aquéllos que: hibridan bajo condiciones de lavado de 30ºC y menos de 2 M de sal con la SEC ID Nº: 5, 7 ó 9; presentan al menos un 85% de identidad aproximadamente a lo largo de un tramo de al menos 30 nucleótidos aproximadamente con la YE01 de primate. En realizaciones preferidas, las condiciones de lavado son de 45ºC y/o 500 mM de sal; o de 55ºC y/o 150 mM de sal; o la identidad es de al menos un 90% y/o el tramo es de al menos 55 nucleótidos; o la identidad es de al menos un 95% y/o el tramo es de al menos 75 nucleótidos.

Se describe también un método para modular la fisiología o el desarrollo de una célula o de una célula en cultivo de tejidos que comprende la puesta en contacto de la célula con un agonista o un antagonista de una YE01. En las realizaciones preferidas, la célula es un leucocito y el antagonista es hacia YE01 y es un anticuerpo monoclonal que se une a DLAIR-1.

La invención proporciona realizaciones específicas preferidas según está definido en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada I. General

La presente invención proporciona secuencias de ADN que codifican proteínas de mamífero expresadas en monocitos. Para una revisión de los monocitos y sus funciones, ver, por ejemplo, Gallin y col. (eds. 1988), Inflammation: Basis Principles and Clinical Correlates, Raven Press, NY; van Furth (ed. 1985), Mononuclear Phagocytes: Characteristics. Physiology and Function, Martinus Nijhoff, Dordrecht, Países Bajos.

Más adelante se proporcionan realizaciones humanas específicas de estas proteínas. Las descripciones posteriores están dirigidas a, a modo de ejemplo, genes de monocitos humanos, pero son aplicables de igual modo a realizaciones estructuralmente relacionadas, por ejemplo secuencias, de otras fuentes o de otras especies de mamífero, incluyendo variantes polimórficas o individuales. Éstas incluirán, por ejemplo, proteínas que presenten relativamente pocos cambios en la secuencia, por ejemplo menos del 5% aproximadamente, y en el número, por ejemplo menos de 20 sustituciones de residuos, típicamente menos de 15, preferiblemente menos de 10 y, más preferiblemente, menos de 5 sustituciones. Éstas incluirán también versiones que son truncadas de la longitud completa, según se describe, y proteínas de fusión conteniendo segmentos sustanciales de estas secuencias.

II. Definiciones

El término "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a estas proteínas monocíticas, por ejemplo en una interacción anticuerpo-antígeno, o a compuestos, por ejemplo proteínas, que se asocian específicamente con la proteína respectiva. Típicamente, la asociación estará en una interacción proteína-proteína natural fisiológicamente relevante, covalente o no covalente, y puede incluir miembros de un complejo multiproteico, incluyendo compuestos transportadores o parejas de dimerización. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula totalmente no relacionada, por ejemplo que tenga una forma molecular que interaccione con los determinantes de interacción apropiados. Las variantes pueden servir como agonistas o antagonistas de la proteína, ver, por ejemplo, Goodman y col. (eds.) (1990), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.

El término "complejo agente de unión:proteína monocítica", según se utiliza en la presente, se refiere a un complejo de un agente de unión y la proteína monocítica. Unión específica del agente de unión significa que el agente de unión tiene un sitio de unión específica que reconoce un sitio en la proteína monocítica respectiva. Por ejemplo, anticuerpos producidos contra la proteína monocítica y que reconocen un epítopo en la proteína monocítica, son capaces de formar un complejo agente de unión:proteína monocítica mediante unión específica. Típicamente, la formación de un complejo agente de unión:proteína monocítica permite la medida de la proteína monocítica en una mezcla de otras proteínas y productos biológicos. El término "complejo anticuerpo: proteína monocítica" se refiere a un complejo agente de unión:proteína monocítica en el cual el agente de unión es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o incluso un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo.

Las secuencias de ácidos nucleicos "homólogas", cuando se comparan, presentan una similitud significativa. Los estándares para la homología en ácidos nucleicos son medidas de la homología utilizadas generalmente en la técnica mediante comparación de las secuencias y/o la relación filogenética, o sobre la base de las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con mayor detalle más adelante.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo ARN, ADN o un polímero mixto, que está separado sustancialmente de los demás componentes que acompañan de forma natural a una secuencia nativa, por ejemplo proteínas y secuencias genómicas flanqueantes de la especie de origen. El término incluye una secuencia de ácido nucleico que ha sido extraída de su entorno existente en la naturaleza, e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado será en general una composición homogénea de moléculas pero contendrá, en algunas realizaciones, una pequeña heterogeneidad. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o en porciones que no son críticas para una función o actividad biológica deseada.

La "proteína monocítica" de la invención incluirá, cuando se utiliza en un contexto de proteínas, una proteína que tiene secuencias de aminoácidos como las mostradas en las SEC ID N^{os}: 6, 8 ó 10, o un fragmento significativo de tal proteína. Se refiere a un polipéptido que interacciona con los componentes de unión específica de la proteína monocítica respectiva. Estos componentes de unión, por ejemplo anticuerpos, se unen típicamente a la proteína monocítica con una elevada afinidad, por ejemplo de al menos 100 nM aproximadamente, normalmente mejor que 30 nM aproximadamente, preferiblemente mejor que 10 nM aproximadamente y, más preferiblemente, mejor que 3 nM aproximadamente.

Se describen también en la presente fragmentos o segmentos significativos de dicha proteína monocítica, incluyendo un tramo de residuos de aminoácidos de al menos 8 aminoácidos aproximadamente, en general de al menos 10 aminoácidos, más en general de al menos 12 aminoácidos, a menudo de al menos 14 aminoácidos, más a menudo de al menos 16 aminoácidos, típicamente de al menos 18 aminoácidos, más típicamente de al menos 20 aminoácidos, habitualmente de al menos 22 aminoácidos, más habitualmente de al menos 24 aminoácidos, preferiblemente de al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 28 aminoácidos y de al menos 30 aminoácidos aproximadamente o más. Las limitaciones de fragmentos o tamaños aplicables para la comparación con un grupo no implican necesariamente limitaciones de tamaño similares en los fragmentos para los demás.

Un ácido nucleico "recombinante" está definido por su método de producción o por su estructura. Con referencia a su método de producción, por ejemplo un producto producido mediante un proceso, el proceso es la utilización de técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, implicando por ejemplo la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente la selección o la producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico producido mediante la generación de una secuencia que comprenda la fusión de dos fragmentos que en la naturaleza no están contiguos entre sí, pero tiene la intención de excluir productos de la naturaleza, por ejemplo mutantes que tienen lugar de forma natural. Así, por ejemplo, están incluidos los productos producidos mediante la transformación de células con cualquier vector no existente en la naturaleza, igual que lo son ácidos nucleicos que contienen una secuencia derivada utilizando cualquier proceso con oligonucleótidos sintéticos. Esto se realiza a menudo para sustituir un codón por un codón redundante que codifique el mismo aminoácido o un aminoácido conservador, a la vez que se introduce o se elimina típicamente un sitio de reconocimiento de la secuencia. Alternativamente, se lleva a cabo para unir segmentos de ácidos nucleicos o funciones deseadas con el fin de generar una única entidad genética que contenga una combinación de funciones deseada que no se encuentra en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son a menudo la diana de tales manipulaciones artificiales, pero pueden incorporarse mediante diseño otras dianas específicas de sitio, por ejemplo promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias reguladoras, secuencias control u otras características útiles. Un concepto similar es aplicable a un polipéptido recombinante, por ejemplo una fusión. Están incluidos específicamente ácidos nucleicos sintéticos que, debido a la redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias procedentes de varias variantes específicas diferentes.

La "solubilidad" está reflejada por la sedimentación medida en unidades Svedberg, que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se llevaba a cabo clásicamente en una ultracentrífuga analítica, pero actualmente se lleva a cabo típicamente en una ultracentrífuga estándar. Ver, Freifelder (1982), Physical Biochemistry (2ª ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980), Biophysical Chemistry, partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Como determinación bruta, una muestra conteniendo un polipéptido supuestamente soluble es centrifugada en una ultracentrífuga estándar de tamaño completo a 50 Krpm aproximadamente durante 10 minutos aproximadamente, y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o un polipéptido soluble será típicamente menor de 30S aproximadamente, más típicamente menor de 15S aproximadamente, habitualmente menor de 10S aproximadamente, más habitualmente menor de 6S aproximadamente y, en realizaciones particulares, preferiblemente menor de 4S aproximadamente, y más preferiblemente menor de 3S aproximadamente. La solubilidad de un polipéptido o de un fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad de un polipéptido, incluyendo la temperatura, el entorno electrolítico, el tamaño y las características moleculares del polipéptido y la naturaleza del solvente. Típicamente, la temperatura a la cual se utiliza el polipéptido varía desde 4ºC aproximadamente hasta 65ºC aproximadamente. Normalmente la temperatura de utilización es mayor de 18ºC aproximadamente y más habitualmente mayor de 22ºC aproximadamente. Para fines de diagnóstico, la temperatura será aproximadamente de forma habitual la temperatura ambiente o mayor, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura será habitualmente la temperatura corporal, típicamente alrededor de 37ºC
para los humanos, aunque bajo ciertas situaciones la temperatura puede ser aumentada o disminuida in situ o in vitro.

El tamaño y la estructura del polipéptido estarán generalmente en un estado sustancialmente estable, y habitualmente no estarán en estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes de una manera que se aproxime a las interacciones naturales de la bicapa lipídica.

El solvente será normalmente un tampón biológicamente compatible, o un tipo utilizado para la conservación de las actividades biológicas, y normalmente se aproximará a un solvente fisiológico. Normalmente el solvente tendrá un pH neutro, típicamente entre 5 y 10 aproximadamente, y preferiblemente alrededor de 7,5. En algunas ocasiones se añadirá un detergente, típicamente uno suave no desnaturalizante, por ejemplo CHS o CHAPS, o estará a una concentración suficientemente baja como para evitar la alteración significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

"Sustancialmente pura" significa típicamente que la proteína está aislada de otras proteínas contaminantes, de ácidos nucleicos o de otros productos biológicos derivados del organismo de origen. La pureza o el "aislamiento" puede analizarse mediante métodos estándar y normalmente será al menos un 50% pura aproximadamente, más habitualmente al menos un 60% pura aproximadamente, generalmente al menos un 70% pura aproximadamente, más generalmente al menos un 80% pura aproximadamente, a menudo al menos un 85% pura aproximadamente, más a menudo al menos un 90% pura aproximadamente, preferiblemente al menos un 95% pura aproximadamente, más preferiblemente al menos un 98% pura aproximadamente y, en las realizaciones más preferidas, al menos un 99% pura.

"Similitud sustancial", en el contexto de comparación de secuencias de ácidos nucleicos, significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están alineados óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos un 50% aproximadamente de los nucleótidos, generalmente en al menos el 56%, más generalmente en al menos un 59%, habitualmente en al menos un 62%, más habitualmente en al menos un 65%, a menudo en al menos un 68%, más a menudo en al menos un 71%, típicamente en al menos un 74%, más típicamente en al menos un 77%, normalmente en al menos un 80%, más normalmente en al menos un 85% aproximadamente, preferiblemente en al menos un 90% aproximadamente, más preferiblemente en al menos de un 95 a un 98% aproximadamente o más y, en realizaciones particulares, tanto como en un 99% aproximadamente o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe una similitud sustancial cuando los segmentos hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva con una hebra, o su complemento, utilizando típicamente una secuencia derivada de las SEC ID Nº: 1 ó 3; 5, 7 ó 9; ó 11, 13 ó 15. Típicamente, la hibridación selectiva tendrá lugar cuando exista al menos un 55% de similitud aproximadamente a lo largo de un tramo de al menos 30 nucleótidos aproximadamente, preferiblemente al menos un 65% aproximadamente a lo largo de un tramo de al menos 25 nucleótidos aproximadamente, más preferiblemente al menos un 75% aproximadamente y muy preferiblemente al menos un 90% aproximadamente a lo largo de 20 nucleótidos aproximadamente. Ver, por ejemplo, Kanehisa (1984), Nucl. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de similitud, según se ha descrito, puede ser sobre tramos más largos y, en ciertas realizaciones, será sobre un tramo de al menos 17 nucleótidos aproximadamente, normalmente de al menos 20 nucleótidos aproximadamente, más normalmente de al menos 24 nucleótidos aproximadamente, típicamente de al menos 28 nucleótidos aproximadamente, más típicamente de al menos 40 nucleótidos aproximadamente, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos aproximadamente y, más preferiblemente, de al menos 75 a 100 nucleótidos aproximadamente o más.

"Condiciones rigurosas" en referencia a la homología o a la similitud sustancial en el contexto de la hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros, típicamente aquéllos controlados en las reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Ver, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968), J. Mol. Biol. 31:349-370. Una sonda de ácido nucleico que se une a un ácido nucleico diana bajo condiciones rigurosas es específica para dicho ácido nucleico diana. Tal sonda tiene típicamente más de 11 nucleótidos de longitud, y es suficientemente idéntica o complementaria a un ácido nucleico diana a lo largo de la región especificada por la secuencia de la sonda para unirse a la diana bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Proteínas monocíticas equivalentes de otras especies de mamífero pueden ser clonadas y aisladas mediante hibridación cruzada de especies estrechamente relacionadas. Ver, por ejemplo, más adelante. La similitud puede ser relativamente baja entre especies poco relacionadas y por tanto es aconsejable la hibridación de especies relativamente estrechamente relacionadas. Alternativamente, la preparación de una preparación de anticuerpos que presente menos especificidad de especie puede ser útil en procedimientos de clonaje para expresión.

La frase "se une específicamente a un anticuerpo" o "es inmunorreactiva específicamente con", cuando se refiere a una proteína o a un péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen significativamente a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos producidos hacia el inmunógeno proteína monocítica humana con la secuencia de aminoácidos representada en una SEC ID Nº: particular pueden ser seleccionados para obtener anticuerpos inmunorreactivos específicamente con esa proteína monocítica y no con otras proteínas. Estos anticuerpos reconocen proteínas muy similares a la proteína monocítica humana homóloga.

III. Ácidos Nucleicos

Estos genes de los monocitos son expresados específicamente en células dendríticas. Las realizaciones preferidas, según se describe, serán útiles en procedimientos estándar para aislar genes de otras especies, por ejemplo de animales de sangre caliente tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de proteínas relacionadas de individuos, cepas o especies. Están disponibles varios procedimientos diferentes para aislar con éxito un clon de un ácido nucleico adecuado sobre la base de la información proporcionada en la presente. Estudios de hibridación de transferencia Southern identificarán genes homólogos en otras especies bajo condiciones de hibridación apropiadas.

La proteína purificada o péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos estándar, según se describe más adelante. Péptidos sintéticos o la proteína purificada pueden ser presentados a un sistema inmune para generar anticuerpos policlonales y monoclonales. Ver, por ejemplo, Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, que se incorporan a la presente por referencia. Alternativamente, una composición de unión a una proteína CD puede ser útil como reactivo de unión específica, y puede aprovecharse su especificidad de unión para, por ejemplo, la purificación de una proteína monocítica.

La composición de unión específica puede ser utilizada para someter a selección una biblioteca de expresión producida a partir de una línea celular que exprese la proteína monocítica respectiva. Están disponibles muchos métodos de selección, por ejemplo la tinción estándar de un ligando expresado en superficie, o mediante cribado en fase sólida ("panning"). La selección de la expresión intracelular puede ser llevada a cabo también mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión pueden ser utilizadas para purificar mediante afinidad o seleccionar células que expresen el ligando.

Los segmentos peptídicos pueden ser utilizados también con el fin de producir oligonucleótidos apropiados para someter a selección una biblioteca con el fin de determinar la presencia de un gen similar, por ejemplo una variante idéntica o polimórfica, o para identificar un monocito. El código genético puede ser utilizado para seleccionar oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para el proceso de selección. En combinación con las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar clones deseados de una biblioteca.

Las secuencias complementarias serán también utilizadas como sondas o cebadores. Sobre la base de la identificación del probable extremo amino, otros péptidos serán particularmente útiles, por ejemplo acoplados con un vector anclado o con técnicas de PCR complementaria poli-A o con ADN complementario de otros péptidos.

Técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos de genes que codifican estas proteínas monocíticas, por ejemplo el subclonaje de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos en vectores de expresión, el marcaje de sondas, la hibridación de ADN, etcétera, están descritas en general en Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, que se incorpora a la presente por referencia y que será referido de aquí en adelante como "Sambrook y col.". Ver también, Coligan y col. (1987 y suplementos periódicos), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY, referido como "Coligan y col.".

Existen varios métodos para aislar las secuencias de ADN que codifican estas proteínas monocíticas. Por ejemplo, el ADN es aislado de una biblioteca genómica o de ADNc utilizando sondas oligonucleotídicas marcadas que tengan secuencias idénticas o complementarias a las secuencias descritas en la presente. Pueden utilizarse sondas de longitud completa o pueden generarse sondas oligonucleotídicas mediante comparación de las secuencias descritas con otras proteínas y la selección de cebadores específicos. Tales sondas pueden ser utilizadas directamente en ensayos de hibridación para aislar ADN que codifique proteínas monocíticas, o bien pueden diseñarse sondas para ser utilizadas en técnicas de amplificación, tales como PCR, para el aislamiento del ADN que codifica las proteínas monocíticas.

Para preparar una biblioteca de ADNc, se aísla el ARNm de células que expresen la proteína monocítica. El ADNc es preparado a partir del ARNm y ligado en un vector recombinante. El vector es transfectado a un huésped recombinante para su propagación, selección y clonaje. Los métodos para producir y someter a selección bibliotecas de ADNc son bien conocidos. Ver, Gubler y Hoffman (1983), Gene 25:263-269; Sambrook y col; o Coligan y col.

Para una biblioteca genómica, el ADN puede ser extraído de un tejido y bien cortado mecánicamente o digerido enzimáticamente para producir fragmentos de 12-20 kb aproximadamente. Los fragmentos son posteriormente separados mediante centrifugación en gradiente y clonados en vectores del bacteriófago lambda. Estos vectores y el fago son empaquetados in vitro según está descrito en, por ejemplo, Sambrook y col. o Coligan y col. Los fagos recombinantes son analizados mediante hibridación de placas según está descrito en Benton y Davis (1977), Science 196:180-182. La hibridación de colonias se lleva a cabo según está descrito de manera general en, por ejemplo, Grunstein y col. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961-3965.

El ADN que codifica una proteína monocítica puede ser identificado en bibliotecas de ADNc o genómicas por su capacidad para hibridar con las sondas de ácido nucleico descritas en la presente, por ejemplo en experimentos de hibridación de colonias o placas. Las regiones de ADN correspondientes son aisladas mediante métodos estándar familiares para los expertos en la técnica. Ver Sambrook y col.

Pueden utilizarse también diferentes métodos para amplificar secuencias diana, tal como la reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de preparar ADN que codifique proteínas monocíticas. La tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es utilizada para amplificar tales secuencias de ácido nucleico directamente a partir de ARNm, de ADNc y de bibliotecas genómicas o de bibliotecas de ADNc. Las secuencias aisladas que codifican proteínas monocíticas pueden ser utilizadas también como moldes para la amplificación por PCR.

En las técnicas de PCR, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos complementarios a dos regiones 5' de la región de ADN que va a ser amplificada. Posteriormente se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los dos cebadores. Ver Innis y col. (eds.) (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, San Diego, CA. Pueden seleccionarse cebadores para amplificar las regiones completas que codifican una proteína monocítica de longitud completa seleccionada o para amplificar segmentos de ADN más pequeños, según se desee. Una vez que tales regiones han sido amplificadas por PCR, pueden ser secuenciadas y pueden prepararse sondas oligonucleotídicas a partir de la secuencia obtenida utilizando técnicas estándar. Estas sondas pueden ser luego utilizadas para aislar ADNs que codifiquen otras formas de las proteínas monocíticas.

Los oligonucleótidos para ser utilizados como sondas son sintetizados químicamente de acuerdo con el método de los triésteres de fosforamiditas en fase sólida descrito por vez primera por Beaucage y Carruthers (1983), Tetrahedron Lett. 22(20):1859-1862, o utilizando un sintetizador automatizado, según está descrito en Needham-VanDevanter y col. (1984), Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. La purificación de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida nativa o mediante HPLC de intercambio aniónico según está descrito en Pearson y Regnier (1983), J. Chrom. 255:137-149. La secuencia del oligonucleótido sintético puede ser verificada utilizando el método de degradación química de Maxam y Gilbert en Grossman y Moldave (eds.) (1980), Methods in Enzymology 65:499-560, Academic Press, New York.

Se aisló un clon de células monocíticas humanas de una biblioteca de células monocíticas activadas y se denominó YE01. YE01 está relacionado con los receptores para Fc gamma y/o Fc alfa. Esta proteína es referida en la presente como receptor de Fc gamma/alfa y está descrito en la SEC ID Nº: 5 y 6. Un equivalente de ratón está codificado probablemente en el EST W55567.

Un gen similar fue clonado mediante clonaje de expresión utilizando el anticuerpo monoclonal DX26, que fue producido contra el inmunógeno del clon de células NK humanas NK681.D5, y seleccionado por la inhibición de la destrucción llevada a cabo por los clones de células NK de las células diana portadoras del receptor de Fc (SP2/0). Este aislado está descrito en la SEC ID Nº: 7 y 8.

El ácido nucleico y la supuesta secuencia de aminoácidos de una forma soluble de los receptores, denominada DLAIR-2, está descrita en la SEC ID Nº: 9 y 10. La secuencia señal se extiende desde Met1 hasta Thr21 aproximadamente. Aunque el gen fue descrito inicialmente como un gen derivado de monocitos, el análisis de la expresión indica que es más específico para expresión en linfocitos. Así, en el caso de YE01, el descriptor "gen monocítico" puede indicar su identificación original en una población enriquecida en ese tipo celular, aunque puede haber contenido también algunos otros tipos celulares. El análisis de la secuencia sugiere que YE01 es un miembro de la superfamilia de receptores de Ig, y está relacionado estrechamente con la familia CD8, que contiene un plegamiento de tipo VIJ, particularmente con los receptores de Fc alfa y/o gamma. Como contiene un motivo similar a ITAM, la proteína es posible que sea una versión linfocítica de los Receptores Inhibidores de las células Destructoras (KIR), que envían una señal negativa para inhibir la función de las células destructoras. Esta proteína presenta una función similar en la inhibición de la función efectora de los linfocitos, por ejemplo la presentación del antígeno o el inicio de la respuesta posterior.

En particular, la generación de señales a través de la molécula reconocida por el mAb DX26 (denominada Receptor similar a Inmunoglobulina Asociado a Leucocitos DNAX (DLAIR)), suministra una señal negativa a los clones de células NK que impide su actividad destructora de las células diana específicas. Sin embargo, la molécula es expresada en otros linfocitos, incluyendo células T y monocitos. Por tanto, el anticuerpo DX26 representa probablemente un anticuerpo que inhibe la destrucción por células NK y por células T citotóxicas, y la distribución en monocitos sugiere que la molécula puede inhibir funciones efectoras mediadas por monocitos o mediadas por linfocitos.

Esta invención proporciona ADN aislado o fragmentos aislados que codifican una proteína monocítica, según se define en las reivindicaciones adjuntas. Se describe también ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o un polipéptido biológicamente activo que es capaz de hibridar bajo condiciones apropiadas, por ejemplo alta rigurosidad, con las secuencias de ADN descritas en la presente. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una forma existente en la naturaleza, o una proteína o fragmento recombinante, y tener una secuencia de aminoácidos como la descrita en la SEC ID Nº: 6 ó 10. Las realizaciones preferidas serán aislados naturales de longitud completa, por ejemplo de un primate. En forma glucosilada, las proteínas presentarán tamaños mayores. Además, esta invención se refiere a la utilización de ADN aislado o recombinante, o de fragmentos del mismo, que codifican proteínas que son homólogas a cada proteína monocítica respectiva. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo promotores, intensificadores, señales de adición de poli-A y otros.

IV. Producción de Productos Génicos de Monocitos

Los ADNs que codifican estas proteínas monocíticas o fragmentos de las mismas pueden ser obtenidos mediante síntesis química, mediante procesos de selección de bibliotecas de ADNc o mediante procesos de selección de bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o de muestras de tejido.

Estos ADNs pueden ser expresados en una amplia variedad de células huésped para la síntesis de una proteína de longitud completa o de fragmentos que pueden utilizarse, por ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas y para estudios de estructura/función. Cada una de estas proteínas monocíticas o sus fragmentos pueden ser expresados en células huésped que están transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden ser sustancialmente purificadas para que estén libres de contaminantes proteicos o celulares, distintos de los derivados del huésped recombinante, y por tanto son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, o porciones del mismo, puede ser expresado como una fusión con otras proteínas.

Los vectores de expresión son típicamente construcciones de ADN o ARN autorreplicantes que contienen el gen monocítico deseado o sus fragmentos, normalmente unidos operativamente a elementos adecuados para el control genético que son reconocidos en una célula huésped adecuada. Estos elementos de control son capaces de llevar a cabo la expresión en un huésped adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para llevar a cabo la expresión dependerá de la célula huésped final utilizada. En general, los elementos de control genético puede incluir un sistema de promotores procarióticos o un sistema para el control de la expresión de promotores eucarióticos y, típicamente, incluyen un promotor de la transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de transcripción, intensificadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión de ribosomas adecuado y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión contienen también habitualmente un origen de replicación que permite al vector replicarse independientemente de la célula huésped.

Los vectores de esta invención contienen ADNs que codifican las diferentes proteínas monocíticas, o un fragmento de las mismas, codificando típicamente, por ejemplo, un polipéptido o proteína biológicamente activos. El ADN puede estar bajo el control de un promotor vírico y puede codificar un marcador para la selección. Esta invención contempla además la utilización de tales vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariótico que codifica una proteína monocítica en un huésped procariótico o eucariótico, donde el vector es compatible con el huésped y donde el ADNc eucariótico que codifica la proteína están insertado en el vector de tal manera que el crecimiento del huésped que contiene el vector exprese el ADNc en cuestión. Habitualmente, los vectores de expresión son diseñados para una replicación estable en sus células huésped o para amplificación con el fin de incrementar enormemente el número total de copias del gen deseable por célula. No es siempre necesario el requerir que un vector de expresión se replique en una célula huésped, por ejemplo, es posible llevar a cabo la expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en diferentes huéspedes utilizando vectores que no contengan un origen de replicación que sea reconocido por la célula huésped. Es posible también utilizar vectores que produzcan la integración de un gen monocítico o de sus fragmentos en el ADN del huésped mediante recombinación, o integrar un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, según son utilizados en la presente, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que llevan a cabo la expresión de genes unidos operativamente. Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente utilizada, pero todas las demás formas de vectores que realicen una función equivalente son adecuadas para ser utilizadas en la presente. Ver, por ejemplo, Pouwels y col. (1985 y Suplementos), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodriguez y col. (eds.) (1988), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Las células huésped adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos y gram positivos, por ejemplo E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo S. cerevisiae y Pichia y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas celulares en cultivo de tejidos establecidas procedentes de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo células de insectos y de aves, como de origen mamífero, por ejemplo de humanos, primates y roedores.

Los sistemas de vectores para huéspedes procarióticos incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Según se utiliza en la presente, E. coli y sus vectores serán utilizados genéricamente para incluir vectores equivalentes utilizados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o sus derivados. Vectores que pueden ser utilizados para expresar proteínas monocíticas o fragmentos incluyen, pero no se limitan a, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR450). Ver Brosius y col. (1988), "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10:205-236, Buttersworth, Boston, MA.

Eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, pueden ser transformados con vectores que contienen secuencias de genes monocíticos. Para los fines de esta invención, el huésped eucariótico más común es la levadura de panadero Saccharomyces cerevisiae. La misma será utilizada genéricamente para representar a los eucariotas inferiores, aunque están también disponibles otras varias cepas y especies. Los vectores de levaduras constan típicamente de un origen de replicación (a no ser que sean del tipo integrante), un gen para la selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus fragmentos y secuencias para la terminación de la traducción, poliadenilación y terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen promotores constitutivos tales como 3-fosfoglicerato quinasa y otros varios promotores de genes de enzimas glucolíticos, o promotores inducibles tales como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de la metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los tipos siguientes: autorreplicantes de bajo número de copias (tales como la serie YRp), autorreplicantes de alto número de copias (tales como la serie YEp); tipos integrantes (tales como la serie YIp) o minicromosomas (tales como la serie YCp).

Las células en cultivo de tejidos eucarióticas superiores son las células huésped preferidas para la expresión de la proteína monocítica. En principio, pueden utilizarse la mayor parte de las líneas celulares en cultivo de tejidos eucarióticas superiores, por ejemplo sistemas de expresión de baculovirus en insectos, ya sean de origen invertebrado o vertebrado. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero para conseguir un procesamiento apropiado, cotraduccionalmente y post-traduccionalmente. La transformación o la transfección y la propagación de tales células es de rutina. Líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñón de rata baby (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para tales líneas celulares incluyen normalmente un origen de replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, sitios de ayuste de ARN (por ejemplo, si se utiliza ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores pueden contener también un gen para selección o un gen para amplificación. Vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus portadores de promotores derivados de, por ejemplo, fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia o citomegalovirus. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, ver Okayama y col. (1985), Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo Poli-A, ver Thomas y col. (1987), Cell 51:503-512; y un vector baculovírico tal como pAC 373 o pAC 610.

En ciertos casos, las proteínas monocíticas no necesitan estar glucosiladas para producir respuestas biológicas en ciertos ensayos. Sin embargo, será a menudo deseable expresar un polipéptido monocítico en un sistema que proporcione un patrón de glucosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será el proporcionado de forma natural por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable por exposición del polipéptido, por ejemplo en forma no glucosilada, a proteínas glucosilantes apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, un gen monocítico puede ser cotransformado con uno o más genes que codifiquen enzimas glucosilantes de mamífero u otros enzimas glucosilantes. Se comprende además que una sobreglucosilación puede ser nociva para la actividad biológica de la proteína monocítica, y que una persona con experiencia puede llevar a cabo ensayos de rutina con el fin de optimizar el grado de glucosilación que confiera una actividad biológica óptima.

Una proteína monocítica, o un fragmento de la misma, puede ser manipulada para que se una a una membrana celular a través de fosfatidil inositol (PI), pero puede ser separada de las membranas mediante tratamiento con un enzima que corte fosfatidil inositol, por ejemplo fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Este enzima libera el antígeno en forma biológicamente activa y permite la purificación mediante procedimientos estándar de la química de proteínas. Ver, por ejemplo, Low (1989), Biochem. Biophys. Acta 988:427-454; Tse y col. (1985), Science 230:1003-1008; Brunner y col. (1991), J. Cell Biol. 114:1275-1283; y Coligan y col. (eds.) (1996 y suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, NY.

Ahora que estas proteínas monocíticas han sido caracterizadas, pueden prepararse fragmentos o derivados de las mismas mediante procesos convencionales para la síntesis de péptidos. Éstos incluyen procesos tales como los descritos en Stewart y Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Syntheses, Springer-Verlag, New York, NY; y Bodanszky (1984), The Principles of Peptide Synthesis, SpringerVerlag, New York, NY. Ver también Merrifield (1986), Science 232:341-347; y Dawson y col. (1994), Science 266:776-779. Por ejemplo, puede utilizarse un proceso con azidas, un proceso con ácido clorhídrico, un proceso con un anhídrido ácido, un proceso con un anhídrido mixto, un proceso con un éster activo (por ejemplo, p-nitrofenil éster; N-hidroxisuccinimida éster o cianometil éster), un proceso con carbodiimidazol, un proceso de reducción oxidativa o un proceso con diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. La síntesis en fase sólida y la síntesis en fase de solución son ambas aplicables para los procesos anteriores.

La proteína preparada y los fragmentos de la misma pueden ser aislados y purificados de la mezcla de reacción por medio de separación peptídica, por ejemplo mediante extracción, precipitación, electroforesis y varias formas de cromatografía, etcétera. Las proteínas monocíticas de esta invención pueden ser obtenidas con grados variables de pureza dependiendo de la utilización deseada. La purificación puede ser llevada a cabo mediante la utilización de técnicas conocidas de purificación de proteínas o mediante la utilización de los anticuerpos o parejas de unión descritos en la presente, por ejemplo en cromatografía de afinidad en un inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad en un inmunoabsorbente se lleva a cabo uniendo primeramente los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de las células de origen apropiadas, lisados de otras células que expresen la proteína o lisados o sobrenadantes de células productoras de las proteínas como resultado de técnicas de ADN, ver más adelante.

Múltiples líneas celulares pueden ser sometidas a cribado para seleccionar una que exprese dicha proteína a un nivel elevado en comparación con las otras células. Varias líneas celulares, por ejemplo la línea de células estromales de timo de ratón TA4, han sido sometidas a cribado y seleccionadas por sus propiedades favorables de manejo. Las proteínas de las células monocíticas naturales pueden ser aisladas de fuentes naturales o por expresión a partir de una célula transformada utilizando un vector de expresión apropiado. La purificación de la proteína expresada se consigue mediante procedimientos estándar, o puede ser combinada con medios producidos para la purificación eficaz con una alta eficacia a partir de lisados celulares o sobrenadantes. Para tales características de purificación pueden utilizarse segmentos FLAG o His_{6}.

V. Anticuerpos

Pueden producirse anticuerpos hacia estas diferentes proteínas monocíticas, incluyendo variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepa o especie, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas existentes en la naturaleza (longitud completa) como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, pueden producirse anticuerpos hacia las proteínas monocíticas en sus formas activas o en sus formas inactivas. Pueden utilizarse también anticuerpos anti-idiotípicos.

a. Producción de Anticuerpos

Pueden utilizarse varios inmunógenos para producir anticuerpos reactivos específicamente con estas proteínas monocíticas. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Puede utilizarse también la proteína existente en la naturaleza en forma pura o en forma impura. Péptidos sintéticos producidos utilizando las secuencias de las proteínas monocíticas humanas descritas en la presente pueden ser utilizados también como inmunógeno para la producción de anticuerpos hacia la proteína monocítica. La proteína recombinante puede ser expresada en células eucarióticas o procarióticas según se describe en la presente, y purificadas según se describe. El producto es posteriormente inyectado en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden ge-
nerarse anticuerpos monoclonales o policlonales para su uso posterior en inmunoensayos para medir la proteína.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, un inmunógeno, preferiblemente una proteína purificada, es mezclado con un adyuvante y se inmunizan animales con la mezcla. La respuesta inmune del animal hacia la preparación del inmunógeno es monitorizada mediante la toma de muestras de sangre de ensayo y la determinación del título de reactividad hacia la proteína monocítica de interés. Cuando se obtienen títulos apropiadamente elevados de anticuerpo hacia el inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Un fraccionamiento posterior de los antisueros para enriquecerlos en anticuerpos reactivos con la proteína puede ser realizado si se desea. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diferentes técnicas familiares para los expertos en este campo. Brevemente, células esplénicas de un animal inmunizado con un antígeno deseado son inmortalizadas, normalmente mediante fusión con una célula de mieloma. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein (1976), Eur. J. Immunol. 6:511-519, que se incorpora a la presente por referencia. Métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein-Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Las colonias producidas a partir de células inmortalizadas individuales son sometidas a selección por la producción de anticuerpos con la especificidad y la afinidad por el antígeno deseadas, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células puede ser mejorado mediante varias técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, pueden aislarse secuencias de ADN que codifiquen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo mediante el cribado de una biblioteca de ADN de células B humanas según el protocolo general descrito por Huse y col. (1989), Science 246:1275-1281.

Pueden producirse anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones de una sola cadena, contra fragmentos predeterminados de estas proteínas monocíticas mediante inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas transportadoras según se describió anteriormente. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secreten el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser sometidos a selección por su unión a proteínas monocíticas normales o defectuosas, o pueden ser sometidos a selección por su actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con una K_{D} de al menos 1 mM aproximadamente, más habitualmente de al menos 300 \muM aproximadamente, típicamente de al menos 100 \muM aproximadamente, más típicamente de al menos 30 \muM aproximadamente, preferiblemente de al menos 10 \muM aproximadamente y más preferiblemente de al menos 3 \muM aproximadamente o mejor. Están disponibles métodos estándar para la selección de preparaciones de anticuerpos de alta afinidad y selectivos.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios huéspedes mamífero, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. Puede encontrarse una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales en, por ejemplo, Stites y col. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo; Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, New York, NY; y particularmente en Kohler y Milstein (1975), Nature 256:495-497, que discuten un método para generar anticuerpos monoclonales. Resumiendo brevemente, este método implica la inyección a un animal de un inmunógeno para iniciar una respuesta inmune humoral. El animal es posteriormente sacrificado y se extraen células de su bazo, que son posteriormente fusionadas con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas es posteriormente sometida a selección con el fin de aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo hacia el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas procedentes del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido en la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o en vectores similares. Ver, Huse y col. (1989), "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 24 6:1275-12 81; y Ward y col. (1989), Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados uniendo a los mismos, covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y de técnicas de conjugación y están descritas extensamente en la literatura científica y en la literatura de patentes. Marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, etcétera. Patentes que describen la utilización de tales marcas incluyen las Patentes de EE.UU. N^{os} 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Pueden producirse también inmunoglobulinas recombinantes. Ver, Cabilly, Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; y Queen y col. (1989), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención pueden ser utilizados también para cromatografía de afinidad en el aislamiento de cada proteína monocítica. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están ligados a un soporte sólido, por ejemplo a partículas tales como agarosa, SEPHADEX, etcétera, donde un lisado celular puede ser pasado a través de la columna, la columna lavada, seguido por concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, mediante lo cual se liberará la proteína monocítica purificada.

Los anticuerpos pueden ser utilizados también para someter a selección bibliotecas de expresión por productos de expresión particulares. Normalmente los anticuerpos utilizados en tal procedimiento estarán marcados con un resto que permita la detección fácil de la presencia del antígeno por unión al anticuerpo.

Los anticuerpos hacia las proteínas monocíticas pueden ser utilizados para el análisis o para la identificación de componentes específicos de una población celular que expresen la proteína respectiva. Mediante el análisis de los productos de expresión de células que expresen las proteínas monocíticas es posible diagnosticar una enfermedad, por ejemplo condiciones inmunocomprometidas, condiciones de disminución de monocitos o la superproducción de monocitos.

Anticuerpos producidos contra cada monocito serán también útiles para producir anticuerpos anti-idiotípicos. Éstos serán útiles para detectar o diagnosticar diferentes condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de los antígenos respectivos.

b. Inmunoensayos

Una proteína particular puede ser medida mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayos en general, ver Stites y Terr (eds.) (1991), Basic and Clinical Immunology (7ª ed.). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden ser llevados a cabo en cualquiera de varias configuraciones, que están revisadas extensamente en Maggio (ed.) (1980), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985), "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; y Harlow y Lane, Antobodies: A Laboratory Manual, supra, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia. Ver también Chan (ed.) (1987), Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991), Principles and
Practice of Immunoassays, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988,) Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, NY.

Los inmunoensayos para la medida de estas proteínas monocíticas pueden ser realizados mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, los inmunoensayos para medir la proteína pueden ser ensayos de unión competitiva o no competitiva. En los ensayos de unión competitiva, la muestra a analizar compite con un analito marcado por sitios de unión específica en un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferiblemente, el agente de captura es un anticuerpo reactivo específicamente con la proteína monocítica producido según se describió anteriormente. La concentración del analito marcado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad de analito libre presente en la muestra.

En un inmunoensayo de unión competitiva, la proteína monocítica presente en la muestra compite con proteína marcada para unirse a un agente de unión específico, por ejemplo a un anticuerpo reactivo específicamente con la proteína monocítica. El agente de unión puede estar unido a una superficie sólida para llevar a cabo la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Alternativamente, el ensayo de unión competitiva puede ser llevado a cabo en fase líquida y puede utilizarse cualquiera de una amplia variedad de técnicas conocidas en este campo para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Después de la separación, se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de proteína marcada que se une.

Alternativamente, puede llevarse a cabo un inmunoensayo homogéneo en el cual no se necesite una etapa de separación. En estos inmunoensayos, la marca de la proteína es alterada por la unión de la proteína a su agente de unión específica. Esta alteración de la proteína marcada tiene como resultado una disminución o un incremento de la señal emitida por la marca, de tal manera que la medida de la marca al final del inmunoensayo permite la detección o la cuantificación de la proteína.

Estas proteínas monocíticas pueden ser también determinadas cuantitativamente mediante una variedad de métodos de inmunoensayos no competitivos. Por ejemplo, puede utilizarse un inmunoensayo de sándwich, de dos sitios, en fase sólida. En este tipo de ensayo, un agente de unión para la proteína, por ejemplo un anticuerpo, es fijado a un soporte sólido. Un segundo agente de unión para la proteína, que puede ser también un anticuerpo, y que se une a la proteína en un lugar diferente, es marcado. Una vez que ha tenido lugar la unión en ambos lugares de la proteína, el agente de unión marcado no unido es eliminado y se mide la cantidad de agente de unión marcado unido a la fase sólida. La cantidad de agente de unión marcado unido es directamente proporcional a la cantidad de proteína de la muestra.

Puede utilizarse análisis de transferencia Western para determinar la presencia de proteínas monocíticas en una muestra. Se lleva a cabo electroforesis en, por ejemplo, una muestra de tejido sospechosa de contener la proteína. Después de la electroforesis para separar las proteínas y de la transferencia de las proteínas a un soporte sólido adecuado tal como un filtro de nitrocelulosa, el soporte sólido es incubado con un anticuerpo reactivo con la proteína desnaturalizada. Este anticuerpo puede estar marcado o, alternativamente, puede ser que el mismo pueda ser detectado mediante la incubación posterior con un segundo anticuerpo marcado que se una al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoensayo anteriormente descritos emplean componentes de ensayo marcados. La marca puede estar en una variedad de formas. La marca puede ser acoplada directamente o indirectamente al componente deseado del ensayo según métodos bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse una amplia variedad de marcas. El componente puede ser marcado mediante cualquiera de varios métodos. Tradicionalmente se utiliza una marca radiactiva que incorpora ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P. Marcas no radiactivas incluyen ligandos que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como miembros de un par de unión específica para una proteína marcada. La elección de la marca depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugación con el compuesto, de los requisitos de estabilidad y de la instrumentación disponible. Para una revisión de diferentes sistemas de marcaje o de producción de señales que pueden ser utilizados, ver la Patente de EE.UU. Nº 4.391.904, que se incorpora a la presente por referencia.

Anticuerpos reactivos con una proteína particular pueden ser también medidos mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para revisiones de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo aplicables a la medida de anticuerpos mediante técnicas de inmunoensayo, ver, por ejemplo, Stites y Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7ª ed.) supra; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, supra; y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, supra.

Una variedad de formatos diferentes de inmunoensayo, de técnicas de separación y marcas puede ser también utilizada de manera similar a la descrita anteriormente para la medida de proteínas específicas. Además, se conocen muchos métodos para evaluar la selectividad de unión para una proteína específica o para proteínas estrechamente relacionadas.

VI. Proteínas Monocíticas Purificadas

Las secuencia de aminoácidos de la proteína monocítica humana FDF03 está proporcionada en la SEC ID Nº: 2. Una secuencia parcial de ratón está proporcionada en la SEC ID Nº: 4. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la YE01 humana para el miembro de la familia de Ig están proporcionadas en las SEC ID N^{os}: 5-10. Miembros de la familia de receptores, denominados KTE03, están descritos en las SEC ID N^{os}: 11-22.

Las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos que reconozcan tales segmentos y permiten la preparación de oligonucleótidos que codifiquen tales secuencias. Además, los reactivos de afinidad permiten la detección y la purificación de más proteínas, incluyendo formas de longitud completa o recombinantes. Y las secuencias de oligonucleótidos permiten la detección de ADNcs que codifican, o están estrechamente relacionados con, las mismas.

VII. Variantes Físicas

Esta invención incluye también proteínas o péptidos que tienen una similitud sustancial de la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 6 ó 10, según se define en las reivindicaciones adjuntas, especialmente variantes por ayuste. Se facilitan también variantes que presentan sustituciones, por ejemplo 20 o menos, preferiblemente 10 o menos y, más preferiblemente, 5 sustituciones o menos. Cuando las sustituciones son sustituciones conservadoras, las variantes compartirán similitud inmunogénica o antigénica o reactividad cruzada con la proteína de secuencia natural correspondiente. Las variantes naturales incluyen variantes individuales, alélicas, polimórficas, de cepa o de especie.

La similitud de secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencias, se determina optimizando las coincidencias de residuos, si es necesario, mediante la introducción de huecos según se requiera. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservadoras como coincidencias. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparragina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homólogas incluyen variaciones alélicas e interespecie naturales en la secuencia de cada proteína respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán desde un 50-100% de similitud (si pueden introducirse huecos) hasta un 75-100% de similitud (si se incluyen sustituciones conservadoras) con la secuencia de aminoácidos de la proteína monocítica relevante. Según se define en las reivindicaciones adjuntas, las medidas de identidad son de al menos un 80%, y más preferiblemente de al menos un 80%, y en realizaciones particularmente preferidas, de al menos un 85% o más. Ver también Needleham y col. (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff y col. (1983), Time Warps, String Edits, y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison a Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de programas de ordenador de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y el University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas monocíticas de mamífero correspondientes hibridarán típicamente con, por ejemplo, las SEC ID N^{os}: 5, 7 y/o 9 bajo condiciones rigurosas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas monocíticas respectivas hibridarán típicamente con el ácido nucleico apropiado bajo condiciones de hibridación rigurosas, a la vez que proporcionan pocas señales de hibridación positiva falsas. En general, las condiciones rigurosas son seleccionadas para que sean de 10ºC aproximadamente por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia que está siendo hibridada a una fuerza iónica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y a un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal en el lavado es de 0,02 molar aproximadamente a pH 7 y la temperatura es de al menos 50ºC aproximadamente. Otros factores pueden afectar significativamente a la rigurosidad de la hibridación, incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las hebras complementarias, la presencia de solventes orgánicos tales como formamida y el grado de desemparejamiento de bases. Una realización preferida incluirá ácidos nucleicos que se unirán a las secuencias descritas en formamida al 50% y NaCl 20-50 mM a 42ºC. En ciertos casos, puede relajarse la rigurosidad para detectar otros ácidos nucleicos que presenten una identidad de secuencias menos que completa.

El ADN de un gen monocítico aislado puede ser fácilmente modificado mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones tienen como resultado nuevas secuencias de ADN que codifican estos antígenos monocíticos, sus derivados o proteínas que tienen una actividad fisiológica, inmunogénica o antigénica muy similar.

Pueden utilizarse secuencias modificadas para producir antígenos mutantes o para incrementar la expresión. La expresión incrementada puede implicar la amplificación de genes, una transcripción incrementada, una traducción incrementada y otros mecanismos. Tales derivados de proteínas monocíticas mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la proteína respectiva o de sus fragmentos. El término "proteína monocítica mutante" incluye un polipéptido que de otro modo entraría dentro de las definiciones de homología de la proteína monocítica según se describió anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteína monocítica según se encuentra en la naturaleza, ya sea por medio de una deleción, sustitución o inserción. En particular, una "proteína monocítica mutante específica de sitio" incluye en general proteínas que tienen una similitud significativa con una proteína que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 6 ó 10. En general, la variante compartirá muchas actividades fisicoquímicas y biológicas, por ejemplo antigénicas o inmunogénicas, con esas secuencias, y en las realizaciones preferidas contienen la mayor parte o toda la secuencia descrita. Conceptos similares aplican a estas diferentes proteínas monocíticas,
particularmente a las encontradas en diferentes animales de sangre caliente, por ejemplo primates y mamíferos.

Aunque los sitios de mutación específica de sitio están predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos de sitio. La mutagénesis de las proteínas monocíticas puede llevarse a cabo produciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones, deleciones, inserciones, o cualquier combinación, para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino-terminales o carboxilo-terminales. Puede llevarse a cabo una mutagénesis aleatoria en un codón diana y los mutantes expresados pueden ser posteriormente sometidos a selección por la actividad deseada. Métodos para producir mutaciones por sustitución en lugares predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante técnicas de mutagénesis con el cebador M13 o de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ver también, Sambrook y col. (1989) y Ausubel y col. (1987 y Suplementos). Las mutaciones en el ADN normalmente no deberían colocar secuencias codificadoras fuera de los marcos de lectura y, preferiblemente, no crearán regiones complementarias que puedan hibridar para producir una estructura de ARNm secundaria tal como bucles u horquillas.

La presente invención proporciona también proteínas recombinantes, por ejemplo proteínas de fusión heterólogas utilizando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están fusionadas normalmente de la misma manera. Así, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido monocítico respectivo es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, producido típicamente como un único producto de la traducción y presentando propiedades derivadas de cada péptido de origen. Un concepto similar aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, pueden producirse nuevas construcciones de la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, dominios u otros segmentos pueden ser "intercambiados" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos, típicamente con proteínas relacionadas, por ejemplo dentro de la familia de Ig o de la familia de receptores de Fc. Preferiblemente, se utilizarán dominios estructurales intactos, por ejemplo porciones de Ig intactas. Ver, por ejemplo, Cunningham y col. (1989), Science 243:1330-1336; y O'Dowd y col. (1988), J. Biol. Chem. 2 63:15985-15992. Por tanto, nuevos polipéptidos quiméricos presentando nuevas combinaciones de especificidades resultarán de la unión funcional de especificidades que se unen a proteínas y otros dominios funcionales. Puede aplicarse también mutagénesis de barrido de alanina, preferiblemente a residuos que estructuralmente son exteriores a la estructura secundaria, con lo cual se evitan la mayoría de los residuos críticos que alteran generalmente la estructura terciaria.

"Derivados" de estos antígenos monocíticos incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes por glucosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden ser preparados mediante unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos de estas proteínas monocíticas o en los extremos N o C, por medios que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres alifáticos o amidas del extremo carboxilo o de residuos que contengan cadenas laterales de carboxilo, derivados O-acilo de residuos que contengan grupos hidroxilo y N-acil derivados del aminoácido aminoterminal o de residuos que contengan un grupo amino, por ejemplo lisina o arginina. Los grupos acilo son seleccionados del grupo de restos alquilo, incluyendo alquilo normal de C3 a C18, formando así especies alcanoil aroilo. La unión covalente a proteínas transportadoras puede ser importante cuando los restos inmunogénicos son haptenos.

En particular, están incluidas las alteraciones por glucosilación, producidas por ejemplo mediante la modificación de los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas posteriores de procesamiento. Un medio particularmente preferido para realizar esto es mediante exposición del polipéptido a enzimas de glucosilación derivados de células que proporcionan normalmente tal procesamiento, por ejemplo enzimas de glucosilación de mamíferos. Se contemplan también enzimas de desglucosilación. Están incluidas también versiones de la misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras pequeñas modificaciones, incluyendo residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina; u otros restos, incluyendo grupos ribosilo o reactivos de entrecruzamiento. Están incluidas también proteínas que contienen sustituciones, las cuales deben conservar una inmunogenicidad sustancial para producir anticuerpos que reconozcan una proteína de SEC ID Nº: 6 ó 10. Alternativamente, puede desearse producir anticuerpos que reconozcan ambas SEC ID Nº: 10. Típicamente, estas proteínas contendrán menos de 20 sustituciones de residuos de la secuencia descrita, más típicamente menos de 10 sustituciones, preferiblemente menos de 5 y más preferiblemente menos de 3. Alternativamente, las proteínas que comiencen y terminen en dominios estructurales conservarán normalmente la antigenicidad y la inmunogenicidad cruzada.

Un grupo importante de derivados son los conjugados covalentes de las proteínas monocíticas o fragmentos de las mismas con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden ser sintetizados en cultivo recombinante como fusiones N o C-terminales, o mediante la utilización de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en el entrecruzamiento de proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los lugares de derivatización de proteínas preferidos con agentes de entrecruzamiento son los grupos amino libres, los restos carbohidrato y los residuos de cisteína.

Se proporcionan también polipéptidos de fusión entre estas proteínas monocíticas y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos heterólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie, teniendo como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida. De igual modo, pueden construirse fusiones heterólogas que presentarán una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo luciferasa, con un segmento o un dominio de una proteína, por ejemplo un segmento de unión a un receptor, de tal manera que la presencia o la localización de la proteína fusionada puede ser fácilmente determinada. Ver, por ejemplo, Dull y col., Patente de EE.UU. Nº 4.859.609. Otras parejas de fusión génica incluyen la \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, amilasa alfa, alcohol deshidrogenasa y factor de apareamiento alfa de levaduras. Ver, por ejemplo, Godowski y col. (1988), Science 241:812-816.

Tales polipéptidos pueden tener también residuos de aminoácidos que hayan sido modificados químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación o la adición o eliminación de otros restos, particularmente de aquellos que tienen formas moleculares similares a grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje útiles, o servirán como dianas para la purificación, por ejemplo ligandos de afinidad.

Esta invención contempla también la utilización de derivados de estas proteínas monocíticas distintos de variaciones en la secuencia de aminoácidos o glucosilación. Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos derivados están generalmente dentro de tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de la cadena lateral y de los residuos terminales y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Tales derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de purificación tales como purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de unión. Por ejemplo, un antígeno proteína monocítica puede ser inmovilizado mediante unión covalente a un soporte sólido tal como Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, o adsorbido sobre superficies poliolefínicas, con o sin entrecruzamiento con glutaldehído, para ser utilizado en el ensayo o en la purificación de anticuerpos anti-proteínas monocíticas. Las proteínas monocíticas pueden ser también marcadas con un grupo detectable, por ejemplo radioyodadas mediante el procedimiento de la cloramina T, unidas covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugadas a otro resto fluorescente para ser utilizadas en ensayo de diagnóstico. La purificación de estas proteínas monocíticas puede ser efectuada mediante anticuerpos inmovilizados.

Los genes de las proteínas monocíticas aislados permitirán la transformación de células que carezcan de la expresión de la proteína monocítica correspondiente, por ejemplo de tipos o células de especies que carezcan de las proteínas correspondientes y presenten una actividad de fondo negativa. La expresión de genes transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares antigénicamente puras, con variantes definidas o de una única especie. Este procedimiento permitirá la detección y la discriminación más sensible de los efectos fisiológicos de estas proteínas monocíticas. Pueden aislarse y utilizarse fragmentos subcelulares, por ejemplo citoplastos o fragmentos de membrana.

VIII. Complejos Agente de Unión: Proteína Monocítica

Una proteína monocítica que se une específicamente a, o que es inmunorreactiva específicamente con, un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consta de la secuencia de aminoácidos de las SEC ID N^{os}: 6 ó 10, es determinada en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que fue producido contra la proteína de SEC ID Nº: 6, 10 o la combinación apropiada. Este antisuero es seleccionado para que tenga baja reactividad cruzada contra otros miembros de familias relacionadas, y tal reactividad cruzada es, o puede ser, eliminada mediante inmunoabsorción antes de su utilización en el inmunoensayo.

Con el fin de producir antisueros para ser utilizados en un inmunoensayo, la proteína de SEC ID Nº: 6, 10 es aislada según se describe en la presente. Por ejemplo, puede producirse proteína recombinante en una línea celular de mamífero. Una cepa de ratones singénicos tales como Balb/c es inmunizada con la proteína apropiada utilizando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo estándar de inmunización de ratones (ver Harlow y Lane, supra). Alternativamente, puede utilizarse como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias aquí descritas y conjugado a una proteína transportadora. Los sueros policlonales son recogidos y titulados frente a la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo en un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor son seleccionados y analizados para determinar su reactividad cruzada frente a otras proteínas relacionadas, utilizando un inmunoensayo de unión competitiva tal como el descrito en Harlow y Lane, supra, en las páginas 570-573. Ver también Hertzenberg y col. (eds., 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, vols. 1-4, Blackwell Science; y Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY. Preferiblemente, se utilizan en esta determinación dos proteínas relacionadas diferentes junto con una proteína monocítica dada. Por ejemplo, con la proteína de la familia de Ig, se utilizan al menos otros dos miembros de la familia para absorber epítopos compartidos. Junto con el miembro de la familia de Fc, se utilizan otros dos miembros de la familia. Estos otros miembros de la familia pueden ser producidos como proteínas recombinantes y aislados utilizando técnicas estándar de biología molecular y de química de proteínas, según se describe en la presente.

Pueden utilizarse inmunoensayos en el formato de unión competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína puede ser inmovilizada en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión del antisuero a la proteína inmovilizada es comparada con la de la proteína de SEC ID Nº: 6 ó 10. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada de las proteínas anteriores utilizando cálculos estándar. Aquellos antisueros con menos de un 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas enumeradas anteriormente son seleccionados y agrupados. Los anticuerpos que presentan reacción cruzada son posteriormente eliminados de los antisueros agrupados mediante inmunoabsorción con las proteínas anteriormente enumeradas.

Los antisueros inmunoabsorbidos y agrupados son posteriormente utilizados en un inmunoensayo de unión competitiva según se describió anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína inmunogénica (por ejemplo, la proteína monocítica de SEC ID Nº: 6, 10). Con el fin de llevar a cabo esta comparación, las dos proteínas son analizadas cada una de ellas en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de proteína requerida para inhibir el 50% de la unión del antisuero a la proteína inmovilizada. Si la cantidad requerida de la segunda proteína es menor de dos veces la cantidad de proteína, por ejemplo de SEC ID Nº: 2, que es requerida, se dice entonces que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado contra el inmunógeno.

Se comprende que las proteínas monocíticas son cada una de ellas una familia de proteínas homólogas que comprenden dos o más genes. Para un producto génico particular, tal como la proteína miembro de la familia de Ig humana, la invención incluye no sólo las secuencias de aminoácidos aquí descritas sino también otras proteínas que son variantes alélicas, polimórficas, no alélicas o de especie. Se comprende también que el término "proteína monocítica humana" incluye mutaciones no naturales introducidas mediante una mutación deliberada utilizando la tecnología recombinante convencional, tal como mutación de un solo sitio, o mediante la escisión de secciones cortas del ADN que codifica estas proteínas o variantes por ayuste del gen, o mediante la sustitución o la adición de un pequeño número de aminoácidos nuevos. Tales pequeñas alteraciones deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Por tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son inmunorreactivas específicamente con una proteína monocítica respectiva designada existente en la naturaleza. Modificaciones de proteínas particulares consideradas secundarias, incluirán la sustitución conservadora de aminoácidos con propiedades químicas similares, según se describió anteriormente para cada familia de proteínas como un todo. Alineando una proteína óptimamente con la proteína de SEC ID Nº: 6 y 10, y utilizando los inmunoensayos convencionales descritos en la presente para determinar la inmunoidentidad, pueden determinarse las composiciones de proteínas descritas en la presente.

IX. Usos

La presente invención proporciona reactivos que serán útiles en aplicaciones de diagnóstico según se describe en otro lugar de la presente, por ejemplo en la descripción general para anormalidades del desarrollo, o más adelante en la descripción de kits de diagnóstico.

Los genes monocíticos, por ejemplo ADN o ARN, pueden ser utilizados como un componente de un ensayo forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos proporcionadas pueden ser marcadas utilizando, por ejemplo, ^{32}P o biotina y utilizadas para sondar transferencias de polimorfismos de fragmentos de restricción estándar, proporcionando un carácter medible para facilitar la distinción entre individuos. Tales sondas pueden ser utilizadas en técnicas forenses bien conocidas tales como la determinación de la impronta genética. Además, sondas nucleotídicas producidas a partir de las secuencias monocíticas pueden ser utilizadas en ensayos in situ para detectar anormalidades cromosómicas.

Anticuerpos y otros agentes de unión dirigidos hacia las proteínas monocíticas o los ácidos nucleicos monocíticos pueden ser utilizados para purificar la molécula de proteína monocítica correspondiente. Según se describe en los ejemplos siguientes, la purificación con anticuerpos de proteínas monocíticas es posible y practicable. Anticuerpos y otros agentes de unión pueden ser utilizados también en diagnóstico para determinar si están presentes componentes monocíticos en una muestra de tejido o en una población celular, utilizando técnicas bien conocidas aquí descritas. La capacidad para unir un agente de unión a una proteína monocítica proporciona un medio para diagnosticar enfermedades asociadas con una mala regulación de la expresión. Anticuerpos y otros agentes que se unen a las proteínas monocíticas pueden ser también útiles como marcadores histológicos. Según se describe en los ejemplos posteriores, la expresión de cada una de estas proteínas está limitada a tipos tisulares específicos. Dirigiendo una sonda, tal como un anticuerpo o un ácido nucleico, hacia la proteína monocítica respectiva, es posible utilizar la sonda para distinguir tipos tisulares y celulares in situ o in vitro.

Esta invención se refiere también a reactivos que pueden presentar un valor terapéutico significativo. Las proteínas monocíticas (existentes en la naturaleza o recombinantes), fragmentos de las mismas y anticuerpos hacia las mismas, junto con compuestos identificados como con afinidad de unión a la proteína monocítica, pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con una fisiología o un desarrollo anormales, incluyendo una proliferación anormal, por ejemplo condiciones cancerosas o condiciones degenerativas. La proliferación anormal, la regeneración, la degeneración y la atrofia pueden ser moduladas mediante un tratamiento terapéutico apropiado utilizando las composiciones proporcionadas en la presente. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anormal o con la generación anormal de señales por un monocito, por ejemplo como una célula presentadora de antígeno, es una diana para un agonista o un antagonista de la proteína. Las proteínas probablemente desempeñan una función en la regulación o el desarrollo de las células hematopoyéticas, por ejemplo de las células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas, por ejemplo a la presentación del antígeno y a las funciones efectoras resultantes.

Por ejemplo, el anticuerpo DX26 muestra que los anticuerpos inhibidores serán útiles para modular las funciones de las células NK o de las células T, por ejemplo la destrucción. Tal modulación será típicamente un efecto del 20%, aumentando o disminuyendo, por ejemplo el efecto destructor, pero en las realizaciones preferidas tendrá un efecto del 30%, 40%, 50% o más. Como la distribución es también en monocitos, la molécula afectará también probablemente a la regulación de las funciones efectoras del sistema inmune mediadas o iniciadas por los monocitos, por ejemplo respuestas autoinmunes, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, condiciones inflamatorias, etc. Estas moléculas pueden afectar también a la eliminación de condiciones neoplásicas, por ejemplo el rechazo de tumores.

Se conocen otras condiciones anormales del desarrollo en tipos celulares que se ha demostrado que poseen ARNm de proteínas monocíticas mediante análisis de transferencia Northern. Ver Berkow (ed.) The Merk Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; y Thorn y col., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY. Las anormalidades del desarrollo o funcionales, por ejemplo del sistema inmune, producen anormalidades y condiciones médicas significativas que pueden ser susceptibles de prevención o tratamiento utilizando las composiciones aquí proporcionadas.

Las proteínas monocíticas recombinantes o los anticuerpos pueden ser purificados y administrados posteriormente a un paciente. Estos reactivos pueden ser combinados para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. En particular, éstos pueden ser útiles en el contexto de vacunas, en las que el antígeno es combinado con una de estas versiones terapéuticas de agonistas o antagonistas. Estas combinaciones pueden ser esterilizadas por filtración y colocadas en formas de dosificación, tal como mediante liofilización, en viales de dosificación o almacenadas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también la utilización de anticuerpos o de fragmentos de unión de los mismos, incluyendo formas que no se unen al complemento.

La selección de fármacos utilizando anticuerpos o receptores o fragmentos de los mismos, puede identificar compuestos que tengan afinidad de unión a estas proteínas monocíticas, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Pueden utilizarse luego ensayos biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca y es por tanto un bloqueante o antagonista en cuanto a que bloquea la actividad de la proteína. De igual modo, un compuesto con actividad estimulante intrínseca podrá activar la célula a través de la proteína y es por tanto un agonista en cuanto a que estimula la célula. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos hacia las proteínas como antagonistas.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo la forma de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosificaciones para el tratamiento deben ser valoradas con el fin de optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar directrices útiles sobre las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de enfermedades particulares proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosificación humana. Están descritas varias consideraciones, por ejemplo en Gilman y col. (eds.) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press; y (1990), Remington's Pharmacological Sciences (17ª ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. En ellas y más adelante se discuten métodos de administración, por ejemplo para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos en, por ejemplo, Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. Se espera normalmente que los rangos de dosificación estén en cantidades menores de concentraciones de 1 mM, típicamente menores de concentraciones de 10 \muM aproximadamente, normalmente menores de 100 nM aproximadamente, preferiblemente menores de 10 pM (picomolar) aproximadamente, y muy preferiblemente menores de 1 fM (femtomolar) aproximadamente, con un vehículo apropiado. Formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, serán utilizados a menudo para la administración continua.

Las proteínas monocíticas, fragmentos de las mismas y anticuerpos hacia las mismas o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden ser administrados directamente al huésped que va a ser tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugar los mismos a proteínas transportadoras tales como ovoalbúmina o seroalbúmina antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden ser administradas en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado solo, es preferible presentar el mismo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones contienen típicamente al menos un ingrediente activo, según se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser farmacéuticamente y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y de no ser nocivo para el paciente. Las formulaciones incluyen todas aquellas que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosificación unidad y pueden ser preparadas mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el arte de la farmacia. Ver, por ejemplo, Gilman y col. (eds.) (1990), Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press; y (1990), Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis y col. (eds.) (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman y col. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; y Lieberman y col. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. La terapia de esta invención puede ser combinada con, o utilizada en asociación con, otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos.

La forma existente en la naturaleza y la forma recombinante de las proteínas monocíticas de esta invención son ambas particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que son capaces de seleccionar compuestos por su actividad de unión a las proteínas. En los años recientes se han desarrollado varios métodos de ensayos automatizados para permitir el proceso de selección de decenas de miles de compuestos en un corto periodo. Ver, por ejemplo, Fodor y col. (1991), Science 251:767-773 y otras descripciones de bibliotecas de diversidad química, que describen medios para analizar la afinidad de unión por una pluralidad de compuestos. El desarrollo de ensayos adecuados puede verse facilitado enormemente por la disponibilidad de grandes cantidades de las proteínas monocíticas purificadas, por ejemplo versiones solubles de las mismas, según son proporcionadas por esta invención.

Por ejemplo, pueden encontrarse a menudo antagonistas una vez que la proteína ha sido definida estructuralmente. El análisis de análogos potenciales de las proteínas es actualmente posible tras el desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados que utilizan una proteína de superficie purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas mediante la utilización de las técnicas de selección descritas en la presente. Son de particular importancia los compuestos que se ha encontrado que tienen afinidad de unión combinada por múltiples antígenos de superficie de células relacionadas, por ejemplo compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de una proteína monocítica.

Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos mediante la utilización de la proteína monocítica recombinante en una variedad de técnicas de selección de fármacos. Las ventajas de la utilización de una proteína recombinante en la selección por ligandos específicos incluyen: (a) una fuente renovable mejorada de la proteína a partir de una fuente específica; (b) un número potencialmente mayor de antígenos por célula dando una mejor proporción de la señal respecto al ruido en los ensayos; y (c) especificidad de variantes de especie (produciendo teóricamente una mayor especificidad biológica y de enfermedad).

Un método para seleccionar fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que están transformadas de manera estable con moléculas de ADN recombinante que expresan una proteína monocítica. Pueden aislarse células que expresen esa proteína en aislamiento de cualquier otra. Tales células, en forma viable o fijada, pueden ser utilizadas para ensayos estándar de unión a proteínas de superficie. Ver también, Parce y col. (1989), Science 246:243-247; y Owicki y col. (1990), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Los ensayos competitivos son particularmente útiles, en los cuales las células (fuente de la proteína monocítica) son puestas en contacto e incubadas con un anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por el antígeno, tal como un ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión hacia la composición de unión está siendo medida. Las composiciones de unión marcadas unidas y libres son posteriormente separadas para determinar el grado de unión a la proteína. La cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo marcado que se une a la fuente conocida. Pueden utilizarse muchas técnicas para separar el reactivo unido del reactivo libre con el fin de determinar el grado de unión. Esta etapa de separación podría implicar típicamente un procedimiento tal como la adhesión a filtros seguido por lavado, la adhesión a un plástico seguido por lavado o la centrifugación de las membranas celulares. Podrían utilizarse también células viables para seleccionar por los efectos de fármacos sobre estas funciones mediadas por la proteína monocítica, por ejemplo la presentación del antígeno o la función cooperadora.

Otro método utiliza membranas de células huésped eucarióticas o procarióticas transformadas como fuente de una proteína monocítica. Estas células están transformadas de manera estable con vectores de ADN que dirigen la expresión de la proteína apropiada, por ejemplo una forma manipulada unida a la membrana. Esencialmente, las membranas serían preparadas a partir de las células y utilizadas en ensayos de unión tal como el ensayo competitivo anteriormente descrito.

Otro procedimiento más es la utilización de una proteína monocítica purificada, solubilizada, no purificada o solubilizada, procedente de células huésped eucarióticas o procarióticas transformadas. Esto permite un ensayo de unión "molecular" que tiene las ventajas de una especificidad incrementada, la capacidad de ser automatizado y el ensayo de fármacos de alto rendimiento.

Otra técnica para la selección de fármacos implica un procedimiento que proporciona un proceso de selección de alto rendimiento de compuestos que tengan una afinidad de unión adecuada a la proteína monocítica respectiva y está descrita con detalle en Geysen, Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. En primer lugar, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de ensayo que son péptidos pequeños sobre un sustrato sólido, por ejemplo puntas de plástico o alguna otra superficie apropiada, ver Fodor y col., supra. Posteriormente todas las puntas de plástico se hacen reaccionar con la proteína monocítica purificada solubilizada, no purificada o solubilizada, y se lavan. La etapa siguiente implica la detección del reactivo unido, por ejemplo un anticuerpo.

Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es la determinación de la estructura física mediante, por ejemplo, técnicas de cristalografía de rayos X o RMN bidimensional. Éstas proporcionarán indicaciones sobre qué residuos de aminoácidos forman las regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas ver, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, NY.

X. Kits

Esta invención se refiere también a la utilización de estas proteínas monocíticas, fragmentos de las mismas, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de una proteína monocítica o de su mensaje. Típicamente, el kit tendrá un compartimento conteniendo un péptido monocítico definido o un segmento génico definido o un reactivo definido que reconozca el uno o el otro, por ejemplo anticuerpos.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a la proteína monocítica respectiva contendrá típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida por la proteína; una fuente de la proteína monocítica (existente en la naturaleza o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la proteína monocítica. Una vez que los compuestos han sido sometidos a selección, aquéllos que tengan una afinidad de unión adecuada por la proteína pueden ser evaluados en ensayos biológicos adecuados, como es bien conocido en la técnica, con el fin de determinar si actúan como agonistas o como antagonistas para regular la función del monocito. La disponibilidad de polipéptidos monocíticos recombinantes proporciona también estándares bien definidos para calibrar tales ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una proteína monocítica en una muestra contendrá típicamente un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo, que tenga afinidad de unión conocida por la proteína monocítica, una fuente de la proteína monocítica (existente en la naturaleza o recombinante) y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar la proteína monocítica. Se suministrarán normalmente compartimentos conteniendo reactivos e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para la proteína monocítica respectiva o sus fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de la proteína y/o sus fragmentos. Tales ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales, y además pueden implicar la detección de antígenos en suero, etcétera. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo antígeno-proteína monocítica) o heterogéneos (con etapa de separación). Existen varios ensayos comerciales tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), inmunoensayo fluorescente marcado en un sustrato (SLFIA), etcétera. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos no marcados utilizando un segundo anticuerpo que esté marcado y que reconozca el anticuerpo hacia la proteína monocítica o hacia un fragmento particular de la misma. Ensayos similares han sido también discutidos extensamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987), Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991), Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988), Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY. En particular, los reactivos pueden ser útiles para el diagnóstico de poblaciones de monocitos en muestras biológicas, ya sea para detectar un exceso o bien una deficiencia de monocitos en una muestra. El ensayo puede estar dirigido al análisis histológico de una biopsia, o a la evaluación del número de monocitos en una muestra de sangre o tejido.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos frente a una proteína monocítica, ya que ello puede ser el diagnóstico de diferentes estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de la proteína monocítica puede tener como resultado diferentes reacciones inmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anormales, particularmente en condiciones celulares proliferativas tales como el cáncer o la diferenciación anormal.

Frecuentemente, los reactivos para ensayos de diagnósticos son suministrados en kits con el fin de optimizar la sensibilidad del ensayo. En relación con la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, del protocolo y de la marca, se proporciona un anticuerpo o un receptor marcado o no marcado, o la proteína monocítica marcada. Esto es normalmente junto con otros aditivos tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señales tales como sustratos para enzimas, etcétera. El kit contendrá también instrucciones para la utilización y la eliminación apropiadas de los contenidos después de su uso. Típicamente, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos son proporcionados como un polvo liofilizado seco, donde los reactivos pueden ser reconstituidos en un medio acuoso que proporcione las concentraciones apropiadas de los reactivos para llevar a cabo el ensayo.

Muchos de los constituyentes anteriormente mencionados de los ensayos de selección de fármacos y de diagnóstico, pueden ser utilizados sin modificación o bien pueden ser modificados de una variedad de formas. Por ejemplo, el marcaje puede ser realizado uniendo covalentemente o no covalentemente un resto que proporcione directamente o indirectamente una señal detectable. En muchos de estos ensayos, la proteína, el compuesto de ensayo, la proteína monocítica o los anticuerpos hacia la misma pueden estar marcados directamente o indirectamente. Las posibilidades del marcaje directo incluyen grupos de marcas: radiomarcas tales como ^{125}I, enzimas (Patente de EE.UU. Nº 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina y marcas fluorescentes (Patente de EE.UU. Nº 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio de la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de fluorescencia. Las posibilidades de marcaje indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguido por la unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcas anteriores.

Existen también numerosos métodos para separar la proteína unida de la proteína libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. La proteína monocítica puede ser inmovilizada en diferentes matrices seguido por lavado. Matrices adecuadas incluyen plástico tal como una placa de ELISA, filtros y esferas. Los métodos para inmovilizar la proteína monocítica en una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa a un plástico, utilización de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. La última etapa de este procedimiento implica la precipitación del complejo proteína/anticuerpo mediante uno de varios métodos, incluyendo los que utilizan, por ejemplo, un solvente orgánico tal como polietilén glicol o una sal tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables de anticuerpos con fluoresceína descrito en Rattle y col. (1984), Clin. Chem. 30:1457-14 61, y la separación de partículas magnéticas con doble anticuerpo según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.659.678.

Métodos para unir proteínas o sus fragmentos a diferentes marcas han sido descritos extensamente en la literatura y no requieren una discusión detallada en la presente. Muchas de las técnicas implican la utilización de grupos carboxilo activados mediante la utilización de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para la unión, etcétera. Las proteínas de fusión serán también útiles en estas aplicaciones.

Otro aspecto del diagnóstico descrito en la presente implica la utilización de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de la proteína monocítica respectiva. Estas secuencias pueden ser utilizadas como sondas para detectar niveles del mensaje en muestras de pacientes sospechosos de tener una condición anormal, por ejemplo cáncer o un problema inmune. La preparación de secuencias de nucleótidos de ADN y ARN, el marcaje de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y discusión en la literatura. Normalmente, una sonda oligonucleotídica tendrá al menos 14 nucleótidos aproximadamente, normalmente al menos 18 nucleótidos aproximadamente, y las sondas polinucleotídicas pueden tener hasta varias kilobases. Pueden emplearse varias marcas, muy comúnmente radionúclidos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, pueden emplearse también otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve luego como sitio para la unión de avidina o de anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, fluoróforos, enzimas, etcétera. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplices específicos, incluyendo dúplices de ADN, dúplices de ARN, dúplices híbridos ADN-ARN o dúplices de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar marcados y se lleva a cabo un ensayo en el que el dúplice está unido a una superficie, de tal manera que después de la formación del dúplice en la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplice. La utilización de sondas hacia el nuevo ARN antisentido puede llevarse a cabo en cualquier técnica convencional, tal como la hibridación de ácidos nucleicos, la selección de más y menos, el sondaje recombinatorio, la traducción del híbrido liberado (HRT), y la traducción del híbrido secuestrado (HART). Esto incluye también técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se contemplan también kits de diagnóstico que analizan también la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o el pronóstico puede depender de la combinación de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. Por tanto, los kits pueden analizar combinaciones de marcadores. Ver, por ejemplo, Viallet y col. (1989), Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.

XI. Aislamiento de la Pareja de Unión

Habiendo aislado un miembro de una pareja de unión de una interacción específica, existen métodos para aislar el otro miembro de la pareja. Ver, Gearing y col. (1989), EMBO J. 8:3667-3676. Por ejemplo, puede determinarse un medio para marcar una proteína de la superficie del monocito sin interferir con la unión a su receptor. Por ejemplo, una marca de afinidad puede ser fusionada al extremo amino o al extremo carboxilo del ligando. Una biblioteca de expresión puede ser sometida a selección por la unión específica a la proteína monocítica, por ejemplo mediante separación y clasificación de células, u otro proceso de selección para detectar subpoblaciones que expresen tal componente de unión. Ver, por ejemplo, Ho y col. (1993), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:11267-11271. Alternativamente, puede utilizarse un método de cribado en fase sólida ("panning"). Ver, por ejemplo, Seed y Aruffo (1987), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:3365-3369. Puede aplicarse también un sistema de selección con dos híbridos produciendo las construcciones apropiadas con las secuencias de las proteínas monocíticas disponibles. Ver, por ejemplo, Fields y Song (1989), Nature 340:245-246.

Pueden aplicarse las técnicas de entrecruzamiento de proteínas con marca para aislar las parejas de unión de una proteína monocítica. Esto permitirá la identificación de proteínas que interaccionen específicamente con la proteína monocítica apropiada.

El amplio alcance de esta invención se comprenderá mejor con referencia a los ejemplos siguientes, que no tienen la intención de limitar la invención a realizaciones específicas.

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Ejemplos I. Métodos Generales

Muchos de los métodos estándar siguientes están descritos o referenciados en, por ejemplo, Maniatis y col. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel y col., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel y col. (1987 y Suplementos), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley/Greene, NY; Innis y col. (eds.) (1990), PCR Protocols: A Guide to Method and Applications, Academic Press, NY.

Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Ver, por ejemplo, Ausubel y col. (1987 y Suplementos periódicos); Deutscher (1990), "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; Coligan y col. (1996 y Suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY; y la literatura de los fabricantes sobre la utilización de productos para la purificación de proteínas, por ejemplo Pharmacia, Piscataway, NJ o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo a una secuencia FLAG o equivalente que puede ser fusionada mediante una secuencia eliminable por proteasas. Ver, por ejemplo, Hochuli (1989), Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990), "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering. Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe y col. (1982), OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Técnicas inmunológicas estándar están descritas en, por ejemplo, Hertzenberg y col. (eds., 1996), Weir's Handbook of Experimental Immunology, vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzimology, volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y 163. Ver también, por ejemplo, Paul (ed.) (1993), Fundamental Immunology (3ª ed.), Raven Press, N.Y.

Análisis mediante FACS están descritos en Melamed y col. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988), Practical Flow Cytometry, Liss, New York, NY; y Robinson y col. (1993), Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, NY.

II. Aislamiento de Monocitos Humanos

Donantes sanos fueron sometidos a leucoforesis. Se utilizaron gradientes de Percoll para aislar las células mononucleares que fueron sometidas posteriormente a elutriación centrífuga. Ver, Figdor y col. (1982), Blood 60:46-53; y Plas y col. (1988), Expt`l. Hematol. 16:355-359. Esta fracción de monocitos altamente enriquecida fue cultivada durante 5-7 días en presencia de GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml), según está descrito en Romani y col. (1994), J. Exp. Med. 180:83-93; y Sallusto y col. (1994), J. Exp. Med. 179:1109-1118.

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Para la producción de células dendríticas, se obtuvieron células CD34+ humanas según sigue. Ver, por ejemplo, Caux y col. (1995), páginas 1-5, en Banchereau and Schmitt, Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plenum Press, NY. Células de sangre periférica o de cordón, a veces por CD34+ seleccionadas, fueron cultivadas en presencia del Factor de Células Madre (SCF), GM-CSF y TNF-a en medio RPMI 1640 libre de endotoxinas (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS; Flow Laboratories, Irvine, CA), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 10^{-5} M 5X, penicilina (100 mg/ml). Este medio es referido como medio completo.

Las células CD34+ fueron sembradas para su expansión en frascos de 25 a 75 cm^{2} (Corning, NY) a 2 x 10^{4} células/ml. Las condiciones óptimas fueron mantenidas dividiendo estos cultivos los días 5 y 10 con medio que contenía GM-CSF y TNF-a frescos (concentración celular: 1-3 x 10^{5} células/ml). En ciertos casos, las células fueron seleccionadas mediante FACS por la expresión de CD1a en el día 6 aproximadamente.

En ciertas situaciones, las células fueron recogidas rutinariamente después de 12 días de cultivo y finalmente las células adherentes fueron recuperadas utilizando una solución de EDTA 5 mM. En otras situaciones, las células CD1a+ fueron activadas mediante resuspensión en medio completo a 5 x 10^{6} células/ml y activadas durante el tiempo apropiado (por ejemplo, 1 ó 6 horas) con 1 mg/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, Sigma) y 100 ng/ml de ionomicina (Calbiochem, La Jolla, CA). Estas células fueron expandidas durante otros 6 días y se aisló el ARN para la preparación de una biblioteca de ADN.

III. Aislamiento del ARN y Construcción de la Biblioteca

El ARN total es aislado utilizando, por ejemplo, el procedimiento de tiocianato de guanidina/gradiente de CsCl según está descrito por Chirgwin y col. (1978), Biochem. 18:52 94-52 99.

Alternativamente, el ARN poli(A)+ es aislado utilizando el kit de aislamiento de ARNm, OLIGOTEX (QIAGEN). Se generan ADNcs de doble hebra utilizando, por ejemplo, el sistema plasmídico SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para la síntesis del ADNc y el clonaje de los plásmidos. El ADNc de doble hebra resultante es clonado unidireccionalmente en, por ejemplo, pSport1 y transfectado por electroporación a células ELECTROMAX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

IV. Secuenciación

El ADN aislado de clones recogidos aleatoriamente, o después de hibridación substractiva utilizando células no activadas, fue sometido al análisis de la secuencia de nucleótidos utilizando técnicas estándar. Puede utilizarse un kit de secuenciación de ciclos Taq DiDeoxy Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los fragmentos de ADN marcados son separados utilizando un gel para la secuenciación de ADN de un secuenciador automatizado apropiado. Alternativamente, el clon aislado es secuenciado según está descrito en, por ejemplo, Maniatis y col. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel y col., Biology, Greene Publishing Associates, Brookling, NY; o Ausubel y col. (1987 y Suplementos), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Están disponibles también métodos de secuenciación químicos utilizando, por ejemplo, las técnicas de secuenciación de Maxam y Gilbert.

V. Aislamiento de los Genes de las Proteínas Monocíticas Humanas

El clon YE01 fue secuenciado y analizado para determinar los marcos de lectura abiertos. El clon fue analizado posteriormente para extender la secuencia del ácido nucleico hasta un marco de lectura abierto completo o casi completo.

El ARNm es preparado a partir de las poblaciones celulares apropiadas mediante el kit Fast-Track (Invitrogen), a partir del cual se genera ADNc utilizando, por ejemplo, el Sistema de Plásmidos SuperScript para la síntesis de ADNc procedente de GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD), esencialmente según está descrito por el fabricante. Una modificación del procedimiento puede incluir la sustitución de los adaptadores de SalI suministrados con el kit por otros adaptadores para el clonaje. El ADNc resultante de estas células es utilizado para generar bibliotecas, por ejemplo en el plásmido PCDNA II (Invitrogen). El ADNc es clonado en el poliadaptador y utilizado para transformar una cepa apropiada, por ejemplo DH10B de E. coli. El plásmido es aislado y purificado, por ejemplo con el sistema de Qiagen (Chatsworth, CA) que se utiliza para generar sondas de ARN a partir del, por ejemplo, promotor de SP6.

Las sondas de ARN son marcadas utilizando, por ejemplo, el Genius System (Boehringer-Mannheim) según está descrito por el fabricante. Transferencias a filtros de la biblioteca de ADNc pueden ser prehibridadas, por ejemplo a 42ºC durante 3-6 horas en tampón de Church (50% de formamida, SSPE 6X, NaHPO_{4} 50 mM pH 7,2, SDS 7%, N-lauril sarcosina 0,1%, reactivo de bloqueo de Boehringer-Mannheim 2%). Los filtros son sondados, por ejemplo durante una noche en el mismo tampón que contiene las sondas apropiadas. Los filtros son lavados, por ejemplo según está descrito por el Genius System. Se seleccionan las colonias que hibridan.

Los ADNcs completos de las proteínas monocíticas humanas son secuenciados mediante, por ejemplo, el método de terminación de la cadena en didesoxinucleótidos con polimerasa de T7 (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) utilizando ADN de doble hebra como molde. Se lleva a cabo la búsqueda en bases de datos y el análisis de la secuencia utilizando los programas de IntelliGenetics (Mountain View, CA) para determinar si existe homología entre clones previamente descritos.

Las SEC ID N^{os}: 1-4 describen secuencias relacionadas con el gen FDF03 humano y secuencias equivalentes de ratón. Igualmente, las SEC ID N^{os}: 5-10 muestran secuencias relativas a productos del gen YE01 humano, incluyendo una variantes por ayuste y un transcrito que codifica una producto soluble. Las SEC ID N^{os}: 11-22 proporcionan secuencias de las realizaciones de los productos del gen KTE03, y muestran evidencia de variantes por ayuste.

VI. Construcciones de Genes Monocíticos Recombinantes

ARN Poli(A)+ es aislado de poblaciones celulares apropiadas, utilizando por ejemplo el kit de ARNm FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA). Las muestras son sometidas a electroforesis en, por ejemplo, un gel de agarosa al 1% conteniendo formaldehído y transferidas a una membrana GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA). La hibridación se lleva a cabo, por ejemplo, a 65ºC en NaHPO_{4} 0,5 M pH 7,2, SDS 7%, EDTA 1 mM y BSA (fracción V) 1% con ADNc génico de monocitos marcado con ^{32}P-dCTP a 10^{7} cpm/ml. Después de la hibridación los filtros son lavados tres veces a 50ºC en SSC 0,2X, SDS 0,1% y expuestos a una película durante 24 horas.

La construcción génica recombinante puede ser utilizada con el fin de generar una sonda para detectar el mensaje. El inserto puede ser cortado y utilizado en los métodos de detección anteriormente descritos.

VII. Expresión de la Proteína de Genes Monocíticos en E. coli

Se utiliza PCR para producir una construcción conteniendo el marco de lectura abierto, preferiblemente en asociación operativa con un promotor apropiado, secuencias para la selección y reguladoras apropiadas. El plásmido de expresión resultante es transformado en una cepa de E. coli apropiada, por ejemplo Topp5 (Stratagene, La Jolla, CA). Los transformantes resistentes a ampicilina (50 \mug/ml) son cultivados en Caldo Luria (Gibco) a 37ºC hasta que la densidad óptica a 550 nm sea 0,7. La proteína recombinante es inducida con isopropil-bD-tiogalacto-piranósido (Sigma, St. Louis, MO) 0,4 mM y la incubación de las células se continúa a 20ºC durante 18 horas adicionales. Células procedentes de 1 litro de cultivo son recogidas por centrifugación y resuspendidas, por ejemplo en 200 ml de sacarosa al 30% enfriada en hielo, Tris HCl 50 mM pH 8,0, ácido etiléndiaminotetraacético 1 mM. Después de 10 minutos sobre hielo, se añade agua enfriada en hielo hasta un volumen total de 2 litros. Después de 20 minutos sobre hielo, las células son eliminadas por centrifugación y el sobrenadante es clarificado mediante filtración a través de Millipak 60 5 \mum (Millipore Corp., Bedford, MA).

La proteína recombinante es purificada mediante métodos de purificación estándar, por ejemplo diferentes métodos de cromatografía de intercambio iónico. Pueden utilizarse también métodos de inmunoafinidad utilizando los anticuerpos descritos posteriormente. Pueden utilizarse métodos de afinidad cuando se ha generado una marca epitópica en una construcción de expresión.

VIII. Creación de Mapas de los Genes Monocíticos Humanos

El aislamiento de ADN, la digestión con enzimas de restricción, la electroforesis en gel de agarosa, la transferencia Sourthern y la hibridación se llevan a cabo según técnicas estándar. Ver, Jenkins y col. (1982), J. Virol. 43:26-36. Pueden prepararse transferencias con una membrana de nailon Hybond-N (Amersham). La sonda es marcada con ^{32}P-dCTP; el lavado se lleva a cabo a una rigurosidad final de, por ejemplo, SSC 0,1X, SDS 0,1%, 65ºC.

Alternativamente, un panel híbrido de células somáticas de ratón de BIOS Laboratories (New Haven, CT) puede ser combinado con métodos de PCR.

IX. Análisis de la Variación Individual

A partir de los datos de la distribución, se selecciona un tipo celular abundante fácilmente accesible para la toma de muestras de individuos. Utilizando técnicas de PCR, se analiza una población grande de individuos para determinar este gen. Se utiliza ADNc u otros métodos de PCR para secuenciar el gen correspondiente en los diferentes individuos y se comparan sus secuencias. Esto indica el grado de divergencia entre poblaciones raciales u otras poblaciones, así como la determinación de qué residuos es probable que sean modificables sin efectos dramáticos sobre la función.

X. Preparación de Anticuerpos

Se generaron proteínas monocíticas recombinantes por expresión en E. coli según se mostró anteriormente y se analizaron para determinar su actividad biológica. Pueden utilizarse proteínas activas o desnaturalizadas para la inmunización de los mamíferos apropiados para la producción de suero policlonal o para la producción de anticuerpos monoclonales. Se seleccionan anticuerpos para ser utilizados en transferencias Western, frente al antígeno nativo o desnaturalizado, y para aquellos que modulan una actividad biológica.

XI. Aislamiento de Genes Monocíticos de Primates Equivalentes

Los clones de ADNc humanos que codifican estos genes son utilizados como sondas, o para diseñar cebadores de PCR con el fin de encontrar equivalentes en diferentes especies de primates, por ejemplo chimpancés.

XII. Utilización de Reactivos para Analizar Poblaciones Celulares

La detección del nivel de células monocíticas presentes en una muestra es importante para el diagnóstico de ciertas condiciones de enfermedad aberrantes. Por ejemplo, un incremento del número de monocitos en un tejido o en el sistema linfático puede ser indicativo de la presencia de una hiperplasia monocítica, del rechazo de un tejido o un injerto o de inflamación. Una población con pocos monocitos puede indicar una reacción anormal a, por ejemplo, una infección bacteriana o vírica, que puede requerir el tratamiento apropiado para normalizar la respuesta monocítica.

El análisis mediante FACS utilizando un agente de unión marcado específico para una proteína monocítica de la superficie celular, ver, por ejemplo, Melamed y col. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988), Practical Flow Cytometry, Liss, New York, NY; y Robinson y Col. (1993), Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, NY, es utilizado en la determinación del número de monocitos presentes en una mezcla de células, por ejemplo PBMCs, células adherentes, etc. El agente de unión es también utilizado para el análisis histológico de muestras de tejido, frescas o fijadas, para analizar la infiltración de monocitos. Diversas poblaciones celulares pueden ser también evaluadas, ya sea en un ensayo en el que se destruyen las células o en ciertos ensayos en los que las células conservan la viabilidad.

El análisis de la presencia de moléculas intracelulares solubles se lleva a cabo, por ejemplo, con un agente de unión fluorescente específico para un monocito según está descrito en Openshaw y col. (1995), J. Exp. Med. 182:1357-1367. Alternativamente, pueden utilizarse métodos de fijación de tejidos o células.

Los niveles de transcritos de monocitos son cuantificados utilizando, por ejemplo, PCR semicuantitativa según está descrito en Murphy y col. (1993), J. Immunol. Methods 162:211-223. Se diseñan cebadores de tal manera que no se detecte el ADN genómico.

La distribución de la realización YE01 ha sido también evaluada. El mensaje parece ser específico de monocitos y es un mensaje de abundancia baja. Es detectable en transferencias Southern de ADNc en monocitos en reposo y en monocitos activados. Su expresión más elevada se encontró en monocitos estimulados con LPS durante 6 horas. Es también detectable en PBMC activadas con anti-CD3 y PMA. Puede ser débilmente detectable en células dendríticas, pero esto puede ser debido a contaminación de la población de células dendríticas con monocitos residuales. A ese nivel de sensibilidad, es indetectable en células NK, en células B o en células T, o en cualquier célula fetal examinada. Sin embargo, el producto del gen YE01 es reconocido específicamente por el anticuerpo monoclonal DX2 6. Este anticuerpo, cuando se une de manera cruzada, puede inhibir la destrucción de ciertas dianas mediada por células NK. El anticuerpo reconoce la proteína expresada en células T, en células B, en células NK y en monocitos. El gen que codifica el antígeno reconocido por DX26, que es aparentemente una variante polimórfica del aislado YE01, ha sido clonado.

XIII. Aislamiento de un Homólogo de Unión

Puede utilizarse una proteína monocítica como reactivo de unión específica, aprovechando su especificidad de unión, de manera muy similar a la que se utilizaría un anticuerpo. Un reactivo de unión es marcado según se describió anteriormente, por ejemplo con fluorescencia o de otro modo, o inmovilizado en un sustrato para métodos de cribado en fase sólida ("panning").

La proteína monocítica es utilizada para seleccionar una línea celular que presente unión. Se utilizan técnicas de tinción estándar para detecta o clasificar un ligando intracelular o expresado en la superficie, o bien células transformadas con expresión en la superficie son sometidas a selección mediante cribado en fase sólida ("panning"). La selección de la expresión intracelular se lleva a cabo mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Ver también McMahan y col. (1991), EMBO J. 10:2821-2832.

Por ejemplo, el día 0, pre-revestir portas permanox de 2 cámaras con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS. Posteriormente sembrar células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Incubar durante una noche a 37ºC.

El día 1 de cada muestra, preparar 0,5 ml de una solución de 66 mg/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 66 mM y 4 mg de ADN en DME sin suero. Para cada grupo se prepara un control positivo, por ejemplo de ADNc de receptor humano-FLAG a una dilución 1 y 1/200 y un control ficticio negativo. Lavar las células con DME sin suero. Añadir la solución de ADN e incubar 5 horas a 37ºC. Retirar el medio y añadir 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 minutos. Retirar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento e incubar durante una noche.

El día 2, cambiar el medio. Los días 3 ó 4, las células son fijadas y teñidas. Lavar las células dos veces con Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y fijarlas en paraformaldehído (PFA) al 4%/glucosa durante 5 minutos. Lavar 3X con HBSS. Los portas pueden ser almacenados a -80ºC una vez que se haya eliminado todo el líquido. Para cada cámara, se llevan a cabo incubaciones de 0,5 ml según sigue. Añadir HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de NaN_{3} 1 M durante 20 minutos. Las células son posteriormente lavadas con HBSS/saponina 1X. Añadir a las células la proteína o el complejo proteína/anticuerpo e incubar durante 30 minutos. Lavar las células 2 veces con HBSS/saponina. Si es apropiado, añadir el primer anticuerpo durante 30 minutos. Añadir el segundo anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo anti-ratón de Vector a una dilución 1/200 e incubar durante 30 minutos. Preparar la solución para el ELISA, por ejemplo una solución de peroxidasa de rábano picante Elite ABC de Vector, y preincubar durante 30 minutos. Utilizar, por ejemplo, 1 gota de solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina) por cada 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir la solución de HRP ABC e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS, segundo lavado durante 2 minutos, que cierra las células. Posteriormente añadir ácido diaminobenzoico (DAB) de Vector de 5 a 10 minutos. Utilizar 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada en vidrio. Retirar cuidadosamente la cámara y lavar el portaobjetos en agua. Secar al aire durante unos cuantos minutos, añadir posteriormente 1 gota de Crystal Mount y colocar un cubreobjetos. Calentar en estufa durante 5 minutos a 85-90ºC.

Alternativamente, se utilizan otros reactivos de unión específica de las proteínas monocíticas para purificar por afinidad o seleccionar las células que expresen un receptor. Ver, por ejemplo, Sambrook y col. o Ausubel y col.

Otra estrategia es someter a selección por un receptor unido a la membrana mediante cribado en fase sólida ("panning"). El ADNc del receptor es construido según se describió anteriormente. El ligando puede ser inmovilizado y utilizado para inmovilizar las células que expresen. La inmovilización puede ser conseguida mediante la utilización de anticuerpos apropiados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de la proteína monocítica, o mediante la utilización de anticuerpos producidos contra los primeros anticuerpos. Ciclos repetitivos de selección y amplificación dan lugar al enriquecimiento de clones apropiados y al aislamiento final de los clones que expresen el ligando.

Pueden someterse a selección bibliotecas de expresión de fagos por la proteína monocítica. Técnicas de marcaje apropiadas, por ejemplo anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcaje específico de los clones apropiados.

XIV. Aislamiento de YE01 Soluble

Un miembro adicional de la familia de YE01 previamente descrita, denominado también Receptor Similar a Inmunoglobulinas Asociado a Leucocitos DNAX (DLAIR; y denominado actualmente DLAIR-1) fue clonado sometiendo a selección una biblioteca de ADNc de una línea tumoral de células T humanas (TcT). Membranas con transferencias de colonias bacterianas fueron hibridadas con una sonda de DLAIR-1 que contenía un fragmento de digestión BglII-SphI, que abarcaba el bucle de Ig en el dominio extracelular. Se aislaron y secuenciaron dos positivos. El análisis de la secuencia reveló que ambos clones contenían marcos de lectura abiertos idénticos de 414 pares de bases, que codificaban una proteína de 131 aminoácidos con una secuencia líder pronosticada de 21 aminoácidos y un peso molecular pronosticado de 14,7 kDa. Esta molécula, referida ahora como DLAIR-2, contiene un bucle de Ig. El bucle de Ig tiene un 84% de homología con DLAIR-1, indicando que pertenece a la misma familia, pero que está codificado por un gen separado. DLAIR-2 carece de una región transmembranal, lo cual sugiere que es una proteína secretada.

DLAIR-2, como molécula soluble similar a DLAIR-1, puede ser utilizada como antagonista de este receptor inhibidor.

XV. Preparación del Anticuerpo Monoclonal DX26

Se inmunizaron ratones con un clon de células NK humanas y los anticuerpos fueron sometidos a selección por su capacidad para inhibir la lisis mediada por células NK de dianas portadoras de FcR. Alternativamente, se producirán anticuerpos hacia la proteína purificada.

XVI. La Unión Cruzada de DLAIR-1 con el mAb Inhibe la Destrucción Mediada por Células NK

El mAb DX26 no inhibía la destrucción por el clon de NK de la línea de células B transformadas con EBV, negativa para HLA, 721.221. Sin embargo, cuando 721.221 fue transfectada con el FcgR-II (CD32) humano y utilizada como diana, la citolisis mediada por células NK fue inhibida por el mAb DX26. Esto indica que la producción de señales a través de la molécula reconocida por el mAb DX2 6 (denominada Receptor Similar a Inmunoglobulinas Asociado a Leucocitos DNAX (DLAIR)), transmite una señal negativa a los clones de células NK que impide que destruyan células diana específicas. De acuerdo con esto, la citotoxicidad mediada por células NK frente a Colo-205, PA-1 o FO-1, cada una de ellas una línea celular humana negativa para FcR, no fue inhibida por la adición del mAb DX26. Además, la lisis de células P815, una línea celular de mastocitoma de ratón que expresa FcR, que es destruida in vitro por clones de células NK humanas tras el entrecruzamiento simultáneo de CD2, CD16, CD69 o el antígeno DNAM-1, fue también inhibida por el mAb DX2 6. Estos resultados llevan a la conclusión de que DLAIR transmite una potente señal inhibidora a las células NK, ya que la señal positiva producida por inductores potentes de citotoxicidad de células NK fue anulada por el mAb DX26.

\newpage

XVII. DLAIR-1 es un Receptor Inhibidor en Células NK en Reposo

Los clones de células NK constan de poblaciones derivadas clonalmente de células NK activadas. Estas células son potencialmente inhibidas por las señales producidas por DLAIR. Nosotros apostamos por estudiar si DLAIR funcionaba también como un receptor inhibidor en células NK que no habían sido previamente activadas. Células NK en reposo, preparadas a partir de sangre periférica mediante reducción negativa utilizando esferas magnéticas, fueron capaces de lisar las células diana P815 cuando eran activadas simultáneamente a través de CD16. Esta citotoxidad mediada por células NK fue inhibida por la adición del mAb DX26. Por tanto, DLAIR es funcional como receptor inhibidor en células NK activadas y en reposo.

XVIII. DLAIR es un Antígeno Ampliamente Expresado

El análisis fenotípico de linfocitos de sangre periférica humana demostró que DLAIR es una molécula ampliamente distribuida. En PBMC de donantes sanos, células T CD3+CD4+ (70-80%), células T CD3+CD8+ (80-90%), células NK CD3-CD56+ (95-100%), células B CD3-CD19+ (80-90%) y monocitos CD3-CD14+ (99-100%) expresaban todas la molécula de DLAIR. Timocitos fetales humanos, tanto las células inmaduras CD4+CD8+ como las células maduras positivas sencillas CD4+CD8- o CD4-CD8+ expresaban también DLAIR. Granulocitos de sangre periférica, plaquetas y eritrocitos no expresaban DLAIR.

Clones de células NK humanas y clones de células T humanas expresaban todos DLAIR, con la excepción de los clones de NK cultivados a largo plazo NKL y NK92 (ver la Tabla 2). Líneas de células B transformadas con EBV, el tumor de células B Daudi, la línea celular tumoral de NK YT y varias líneas celulares no hematopoyéticas no expresaban DLAIR, mientras que líneas de células T humanas mostraban expresión de DLAIR.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Expresión de DLAIR en Líneas de Células Tumorales Humanas^{1}

1

XIX. Clonaje por Expresión del Antígeno de DX26

El anticuerpo DX26 fue utilizado para el clonaje por expresión del antígeno que reconoce el anticuerpo. El clonaje por expresión fue realizado utilizando métodos estándar. Ver, por ejemplo, Sambrook y col. o Coligan y col.

El antígeno de DX2 6 es clonado por expresión a partir de, por ejemplo, una biblioteca de ADNc de células NK activadas humanas policlonales en el vector de expresión pJFE14. Células COS7 son transfectadas con la biblioteca y las células positivas para el antígeno fueron seleccionadas utilizando el mAb anti-DX26 marcado con Ficoeritrina. La secuencia de ADNc fue determinada y se encontró que coincidía mucho con la secuencia de YE01. El anticuerpo DX26 se une específicamente al producto del gen YE01.

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En otro método, se utilizan oligonucleótidos para someter a selección una biblioteca. En combinación con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizan oligonucleótidos sintéticos en orientaciones apropiadas como cebadores para seleccionar los clones correctos de una biblioteca.

Además, el producto del gen YE01 es reconocido específicamente por el anticuerpo monoclonal DX2 6. Este anticuerpo, cuando se entrecruza, puede inhibir la destrucción mediada por células NK de ciertas dianas. El anticuerpo reconoce la proteína expresada en células T, en células B, en células NK y en monocitos. El gen que codifica el antígeno reconocido por DX26, que es aparentemente una variante polimórfica del aislado YE01, ha sido clonado y tiene esencialmente la secuencia (ver la SEC ID Nº: 7). Este aislado tiene una secuencia 3' no traducida diferente de la del transcrito de YE01 original, debido aparentemente a la utilización de un lugar de poliadenilación alternativo. Se ha detectado también una forma soluble de DLAIR (ver la SEC ID Nº: 9).

El análisis de la distribución del aislado DX26 ha determinado, análisis de transferencia Northern, la distribución según sigue. El sondaje de ARNm de clones de células NK humanas con ADNc de DLAIR, PBMC, la línea de células T humanas Jurkat y la línea de células mieloides humanas Jurkat, tiene como resultado dos bandas de 1800 pb y 3000-4000 pb aproximadamente. Esto indica que en estas líneas celulares, además del ADNc clonado, existe otro transcrito con similitud de secuencia a DLAIR. Actualmente se desconoce si éste contiene el mismo marco de lectura abierto, pero se determinará después del clonaje y del análisis de la secuencia de ese transcrito. La línea de células B humanas transformadas con EBV JY no mostró transcritos que sondaran con ADNc de DLAIR. XX. DLAIR se une a SHY-1 y SHP-2.

La existencia de dos secuencias consenso para ITIMs dentro del dominio citoplásmico de DLAIR-1, sugería que la generación de una señal inhibidora en las células NK se ponía de manifiesto por el reclutamiento de SHP-1 y/o SHP-2. Con el fin de determinar si DLAIR-1 era capaz de unirse a tirosina fosfatasas de proteínas, un clon de células NK fue estimulado con pervanadato (un inhibidor de tirosina fosfatasas de proteínas que induce fosforilación de tirosina (O'Shea y col. (1992), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:10306-10310)), lisado e inmunoprecipitado con el mAb DX2 6. Los inmunoprecipitados fueron posteriormente analizados mediante transferencia Western utilizando anticuerpos específicos para SHP-1 y SHP-2. SHP-1 y SHP-2 se asociaban ambos con DLAIR-1 fosforilado en las tirosinas. Estos resultados sugieren que el reclutamiento de SHP-1 y SHP-2 puede estar implicado en la mediación de la señal negativa transmitida a través del acoplamiento de la molécula de DLAIR-1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Schering Corp.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

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(C)

CIUDAD: Kenilworth

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(D)

ESTADO: New Jersey

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(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 07033

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Genes Aislados de Células Monocíticas de Mamífero; Reactivos Relacionados

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Apple MacIntosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MacIntosh 7.1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Microsoft Word 5.1a

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/032.252

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 09-DIC-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/762.187

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 09-DIC-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/033.181

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 16-DIC-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/041.279

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 21-MAR-1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1249 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 154..1062

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido_maduro

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 211..1062

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

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2

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 303 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

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5

6

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 376 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

POSICIÓN: 78..374

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

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7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 99 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

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9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1279 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 155..1015

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1247

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(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = Y en el nucleótido 1247 puede ser C o T

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido_maduro

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 218..1015

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

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11

12

13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 287 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:

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14

15

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1728 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

POSICIÓN: 69..929

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido_maduro

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(B)

POSICIÓN: 132..929

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:

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16

17

18

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 287 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:

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19

20

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 568 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 24..428

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido_maduro

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 87..428

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 135 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1620 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 81..1397

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 439 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2197 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 191..1483

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 431 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2271 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 191..2035

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:

35

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 615 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2388 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 180..2024

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 615 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 174..1466

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 431 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2790 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 177..2132

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1722

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = N en el nucleótido 1722 puede ser A, C, G o T

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

60

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 652 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

65

66

Claims (27)

1. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEC ID Nº: 6 o en la SEC ID Nº: 10, que se caracteriza porque comparte similitud inmunogénica o antigénica o reactividad cruzada con una secuencia correspondiente en la SEC ID Nº: 6 o en la SEC ID Nº: 10.

2. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos madura de la SEC ID Nº: 6.

3. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos madura de la SEC ID Nº: 10.

4. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 6.

5. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 10.

6. Una proteína de fusión que contiene el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y una proteína heteróloga.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que la proteína heteróloga es una marca para detección o purificación.

8. Una composición que contiene la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Un ácido nucleico de la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de:

nucleótidos 155-1015 de la SEC ID Nº: 5;

nucleótidos 69-929 de la SEC ID Nº: 7;

nucleótidos 24-428 de la SEC ID Nº: 9; y

nucleótidos 87-428 de la SEC ID Nº: 9.

11. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de las SEC ID N^{os}: 5, 7 y 9.

12. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 9 y un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga.

13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, en el que la proteína heteróloga es una marca para detección o una marca para purificación.

14. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 9.

15. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 14.

16. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une especificamente a un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

17. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 16, el cual es un anticuerpo monoclonal que se une especificamente a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID N^{os}: 6 y 10.

18. Un anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 17, que se une especificamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 6.

19. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

\newpage

20. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, que comprende un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2} o un anticuerpo de una sola cadena.

21. Una composición que contiene:

(a)

un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 en forma estéril; o

(b)

un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 y un vehículo, donde dicho vehículo es agua, solución salina o tampón.

\vskip1.000000\baselineskip

22. Un kit que comprende:

(a)

un compartimento que contiene el anticuerpo de cualquiera de las reivindicación 16 ó 17; y

(b)

instrucciones para la utilización o la eliminación de los reactivos.

\vskip1.000000\baselineskip

23. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une especificamente a un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para el tratamiento de una enfermedad o condición médica seleccionada de una respuesta autoinmune, el rechazo de un trasplante y una condición inflamatoria.

24. Utilización de un anticuerpo aislado o de un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o condición médica seleccionada de una respuesta autoinmune, el rechazo de un trasplante y una condición inflamatoria.

25. Un proceso para producir recombinantemente un polipéptido que comprende el cultivo de la células huésped de la reivindicación 15 bajo condiciones en las cuales el polipéptido es expresado.

26. Un método para inhibir la destrucción celular por una célula NK in vitro, que comprende la puesta en contacto de la célula NK con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde dicho anticuerpo o fragmento inhibe YE01 (DLAIR-1).

27. Un método para obtener un anticuerpo que se una especificamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos un 80% de identidad de secuencias con la SEC ID Nº: 6 ó 10, que comprende la inmunización de un animal capaz de producir dicho anticuerpo con dicho polipéptido y el aislamiento del anticuerpo del animal.