ES2337260T3 - Metodos de induccion de la produccion de il-10. - Google Patents
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Abstract
Método ex vivo para inducir la producción de IL-10 en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con una composición que comprende un polipéptido galectina-1 multimérico, en el que dicha célula es un linfocito, una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
Description
Métodos de inducción de la producción de
IL-10.
La invención se refiere a métodos de inducción
de la producción de interleuquina-10 en una
célula.
LGALS1 pertenece a la familia de las
lectinas animales, las cuales se encuentran altamente conservadas
evolutivamente. Las galectinas comparten similitudes de secuencia
notables en el dominio de reconocimiento de carbohidrato y
presentan afinidad para los glucoconjugados enriquecidos en
polilactosamina (1, 2). LGALS1 codifica una proteína ligante
de \beta-galactósido (\beta-GBP)
y es conocida su unión a antígenos membranales de leucocitos como
CD45, CD43 y CD7 (3-5). La proteína puede
encontrarse tanto en forma de un monómero (\sim14,5 kDa,
\beta-GBP) como de un homodímero (\sim29 kDa,
galectina-1) (2,6). En su forma monomérica, la
\beta-GBP inhibe la proliferación de las células
T bloqueando a las células en las etapas S y G2/M (7). Como
homodímero, la galectina-1 presenta diversos
efectos sobre las interacciones célula-célula y
célula-matriz (8, 9). Mediante el entrecruzamiento
de las proteínas de superficie de las células T, la galectina 1
induce la apoptosis de células T activadas pero no de las células T
en reposo (10). Este proceso está mediado por la activación de los
factores de transcripción NFAT y AP-1 y mediante la
regulación negativa de la proteína Bcl-2 (11, 12).
La susceptibilidad de los timocitos inmaduros frente a la apoptosis
inducida por galectina-1 sugiere un papel para la
proteína durante la selección tímica (13).
Una de las funciones más intrigantes de la
proteína galectina-1 es su papel en la
inmunomodulación. La investigación durante las últimas décadas ha
identificado un papel beneficioso para la
galectina-1 en varios modelos de enfermedad
autoinmunológica (14-16). Recientemente se ha
demostrado que la galectina-1 inhibe la respuesta
de células T alogénicas de una manera dependiente de la dosis y de
los carbohidratos. La regulación negativa de la respuesta
inmunológica aparentemente incluía tanto la apoptosis de las células
T activadas como mecanismos no apoptóticos (17). La
galectina-1 puede desempeñar un papel en la
regulación negativa de la respuesta inmunológica mediante la
modulación de la producción de citoquinas. En un modelo de ratón de
la artritis reumatoide, el tratamiento con proteína
galectina-1 resultó en un cambio de una respuesta de
células T ayudante 1 (TH1) a una de células T ayudante 2 (TH2), que
se vio acompañada por la regulación negativa del interferón
(IFN)-\gamma y la regulación positiva de la
interleuquina (IL)-5 en el drenaje de los nódulos
linfáticos (16). Además, el tratamiento de
galectina-1 indujo una reducción de la producción de
IFN-\gamma y de factor de necrosis tumoral
(TNF)-\alpha en hepatitis inducida por
con-A en ratones (18) y en células T activadas por
IL-2 (9). Recientemente, se ha descrito que la
galectina-1 también suprime la colitis experimental
en ratones (19). En este modelo, se observó una reducción de la
producción de citoquinas inflamatorias, conjuntamente con apoptosis
de células mononucleares.
La invención se basa en el descubrimiento de que
la galectina-1 homodimérica induce niveles elevados
de producción de IL-10 y de IL-1
\beta en células T tanto activadas como en reposo. De acuerdo con
ello, la invención proporciona métodos para inducir la producción
de IL-10 en una célula o en un tejido corporal. La
producción de IL-10 resulta inducida por el
contacto de una célula o de un tejido con un polipéptido
galectina-1 multimérica. El polipéptido
galectina-1 multimérica es un dímero. El polipéptido
galectina-1 multimérico es estable. El término
"estable" se refiere a que el multímero no se disocia en la
forma monomérica a concentraciones bajas (por ejemplo inferiores a
7 \muM). Entre los polipéptidos galectina-1
ejemplares se incluyen la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 o
SEC ID nº 2. La célula es cualquier célula que resulte capaz de
expresar IL-10, por ejemplo, un linfocito tal como
una célula T, una célula B o un monocito. La célula T se encuentra
activada. Alternativamente, la célula T no se encuentra activada.
Opcionalmente la célula T es CD4 y/o CD8-positiva.
La célula establece contacto in vitro o ex vivo.
La invención también proporciona el polipéptido
galectina-1 multimérico estable para la utilización
como medicamento. La invención también proporciona la utilización
de un polipéptido galectina-1 multimérico estable en
la preparación de un medicamento para prevenir o aliviar un síntoma
de un trastorno mediado inmunológicamente en un sujeto. El
trastorno mediado inmunológicamente es, por ejemplo, asma, una
enfermedad intestinal inflamatoria tal como la enfermedad de Crohn
o la colitis ulcerosa o una enfermedad autoinmunológica tal como la
esclerosis múltiple, la diabetes, la artritis reumatoide o el lupus
eritematoso sistémico, el rechazo del trasplante o las alergias de
tipo alimentario.
La inflamación resulta inhibida mediante la
administración en un tejido inflamado (o en un tejido que presenta
un riesgo de inflamación) de un polipéptido
galectina-1 multimérico. Un tejido inflamado se
caracteriza por enrojecimiento, dolor e hinchazón del tejido. Entre
los tejidos se incluyen tejido epitelial, tejido pulmonar, tejido
nervioso, tejido pancreático o tejido hepático. Por ejemplo, el
tejido epitelial es tejido intestinal o piel.
El sujeto sufre o presenta un riesgo de
desarrollar un trastorno inflamatorio. Entre los trastornos
inflamatorios se incluyen, por ejemplo, la inflamación
cardiovascular, la inflamación gastrointestinal, la inflamación
hepática, la inflamación pulmonar, los trastornos
autoinmunológicos, la alergia o la inflamación esquelética. Un
sujeto que sufre o que presenta un riesgo de desarrollar un
trastorno inflamatorio se identifica mediante métodos conocidos de
la técnica, por ejemplo el examen macroscópico de tejido o la
detección de marcadores asociados a inflamación en tejido o sangre.
Entre los síntomas de la inflamación se incluyen dolor,
enrojecimiento e hinchazón del tejido afectado. Un sujeto que sufre
de inflamación gastrointestinal, tal como colitis, se identifica
histológicamente a partir de la presencia de necrosis mucosal o
lesiones hemorrágicas en el colon, diarrea frecuente o sangre y pus
en las heces.
La invención proporciona además la utilización
de un polipéptido galectina-1 multimérico estable en
la preparación de un medicamento para incrementar la supervivencia
de un injerto, por ejemplo un aloinjerto. La composición se
administra en el sujeto antes, concomitantemente o después de que el
sujeto reciba el trasplante. Opcionalmente la composición se
administra durante un periodo de tiempo preseleccionado, tal como 1
a 2 semanas.
También se encuentra comprendida en la invención
una composición purificada de vacuna que contiene un polipéptido
galectina-1 y un antígeno. También se proporciona la
utilización de las composiciones de vacuna de la invención en la
preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de
una enfermedad infecciosa o cáncer. Se vacuna un sujeto mediante la
administración en el sujeto de una primera composición que contiene
un polipéptido galectina-1 y una segunda
composición que contiene un antígeno. La primera composición se
administra concomitantemente a la segunda composición.
Alternativamente, la primera composición se administra antes o
después de la segunda composición.
El sujeto es un mamífero, tal como un ser
humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca,
un caballo o un cerdo.
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención
presentan el mismo significado entendido comúnmente por un experto
ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención.
Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o
equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica
o el ensayo de la presente invención, se describen posteriormente
métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá
la presente memoria, incluyendo las definiciones en la misma.
Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente
ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente
y de las reivindicaciones.
La figura 1 son gráficos de columnas que
ilustran que la estimulación por galectina-1 induce
fuertemente la producción de IL-10 y reduce la
producción de IFN-\gamma en células mononucleares
sanguíneas periféricas humanas y en linfocitos T CD4^{+} y
CD8^{+}. A, producción de proteína IL-10 en PBMCs
activadas anti-CD3 utilizando diferentes
concentraciones de proteína galectina-1 (20 \muM,
2 \muM y 0,2 \muM) y efecto de inhibidores (lactosa 0,1 M o
anticuerpos anti-galectina-1). B,
producción de proteína IL-10 en linfocitos T
CD4^{+} y CD8^{+}. Se muestra el resultado de un donante
representativo (donante nº 1) de entre cuatro. C, producción de
proteína IFN-\gamma en linfocitos T CD4^{+} y
CD8^{+}. Se muestra la producción relativa de
IFN-\gamma (anti-CD3/CD28 frente a
anti-CD3/CD28 más galectina-1) como
media \pm S.D. de cuatro donantes independientes. D, producción
de ARNm de IL-10 en linfocitos T CD4^{+} y CD8+
según mediciones mediante análisis de PCR en tiempo real. Se
muestra el resultado de uno de entre cuatro donantes (donante nº 1)
como el factor de diferencia respecto a un calibrador común, tras
la normalización respecto a un gen control endógeno. Se
proporcionan los resultados de los cuatro donantes en la Tabla 1. E,
expresión de CD25 y de CD69 según determinación mediante análisis
FACS. Las PBMCs totales se dejaron en reposo o se estimularon
durante 24 horas tal como se indica, antes de analizar la expresión
de CD25 y de CD69.
La figura 2A es una fotografía de un gel que
muestra el análisis de RT-PCR semicuantitativa para
LGALS1, IL-10, IFN-\gamma y
GAPDH. Los números de caso son los informados anteriormente (21) y
el número de ciclos de PCR utilizados para la amplificación se
muestra entre paréntesis.
La figura 2B es un gráfico de columnas que
muestra el análisis de PCR en tiempo real para LGALS1,
IL-10 e IFN-\gamma. Los números
de casos son los mismos mostrados en la Tabla 1. Eje y izquierdo:
cantidad relativa de ARNm de LGALS1; eje y derecho: cantidad
relativa de ARNm de IL10 y de IFN-\gamma.
La figura 3 son fotografías que muestran la
expresión de proteína galectina-1 en aloinjertos de
riñón rechazados y en tejido de control normal. En el riñón normal,
se encuentra galectina-1 en células epiteliales
mesangiales glomerulares (A), las células musculares lisas de vasos
grandes (B) y ocasionalmente las células en el intersticio son
positivas para galectina-1 (C), mientras que no se
observa galectina-1 en células endoteliales de
capilares peritubulares (C). En aloinjertos de riñón rechazados
(D-F), la galectina-1 se encuentra
fuertemente regulada positivamente en células endoteliales de vasos
grandes (D, E) y en células endoteliales de capilares peritubulares
en el intersticio (F). Magnificaciones originales
A-D: 400x, E: 630x, F: 400x.
La figura 4 es un gráfico de columnas que
compara la inducción de IL-10 por parte de dímeros
estables de galectina-1 en comparación con
galectina-1 de tipo salvaje. Las concentraciones
bajas de homodímeros estables de galectina-1
inducen fuertemente la producción de IL-10 en PBMCs
totales. Se sometió a ensayo la galectina-1 de tipo
salvaje a cuatro concentraciones diferentes (20, 10, 1 y 0,1
\muM). Se sometieron a ensayo homodímeros estables de
galectina-1 (constructos 1 y 2) a concentraciones
bajas (1 \muM y 0,1 \muM), que no resultaban efectivas para la
galectina-1 de tipo salvaje. Los homodímeros
estables de galectina-1 inducían una producción
elevada de IL-10 a concentraciones hasta 200 veces
inferiores a las de la galectina de tipo salvaje.
La figura 5 es un gráfico de columnas que
muestra una comparación entre la producción de IL-10
por parte de una galectina-1 de tipo salvaje (mGal)
a 3 concentraciones (20, 2 y 0,2 \muM) y una
galectina-1 dimérica (dGal) a 3 concentraciones (2,
1 y 0,2 \muM) en linfocitos activados por CD3 de un donante
representativo.
La figura 6 es un gráfico de columnas que
muestra que la producción de IL-10 por parte de
linfocitos tras la incubación con galectina-1
dimérica (1 \muM) resulta bloqueada mediante la preincubación con
lactosa (0,1 M).
La figura 7 es un gráfico de columnas que
muestra el efecto de la galectina-1 de tipo salvaje
y de homodímeros estables de galectina-1 sobre la
inducción de la apoptosis en células T MOLT-4. Los
resultados se muestran como porcentaje de las células positivas
para anexina V menos el porcentaje de células positivas para anexina
V en células de control no estimuladas. Las barras de error
representan desviaciones estándar de cuatro experimentos
independientes.
La figura 8 es un gráfico de columnas que
muestra la producción de IL-10 por parte de
linfocitos de 5 voluntarios diferentes tras 24 horas de incubación
con CD3 (1 ng/ml) y 3 concentraciones diferentes de
galectina-1 dimérica (2, 1, 0,2 \muM).
La figura 9 es un gráfico de columnas que
muestra que el ARNm de IL-10 se expresa en los
linfocitos de 5 voluntarios diferentes tras 24 horas. Los
linfocitos se incubaron con CD3 (1 ng/ml) y bajo 3 concentraciones
de galectina-1 dimérica (2, 1 y 0,2 \muM).
La figura 10 es un gráfico de columnas que
muestra una comparación entre la producción de
IL-1\beta por parte de
galectina-1 de tipo salvaje (mGal) a 3
concentraciones (20, 2 y 0,2 \muM) y de
galectina-1 dimérica (dGal) a 3 concentraciones (2,
1 y 0,2 \muM) en linfocitos activados por CD3 de un donante
representativo.
La figura 11 es un gráfico de columnas que
muestra la producción de IL-1\beta por parte de
linfocitos en 5 voluntarios diferentes tras 24 horas de incubación
con CD3 (1 ng/ml) y bajo 3 concentraciones diferentes de
galectina-1 dimérica (2, 1 y 0,2 \muM).
La figura 12 es un gráfico de columnas que
muestra que la producción de IL-1 beta por parte de
linfocitos tras la incubación con galectina-1
dimérica (1 \muM) resulta bloqueada específicamente mediante la
preincubación con lactosa (0,1 M).
La figura 13 es un gráfico de columnas que
muestra el ARNm de IL-10 expresado en biopsias de un
paciente con colitis. Las biopsias se obtuvieron de 2
localizaciones, tejido de control (no inflamado) y tejido inflamado
se incubaron en medio de cultivo de tejido durante 8 horas con o sin
2 concentraciones diferentes de galectina-1
dimérica (2,5 y 0,5 \muM).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se basa en parte en el inesperado
descubrimiento de que una galectina-1 homodimérica
estable induce niveles elevados de producción de
IL-10 en células T tanto activadas como en reposo.
En contraste, la galectina-1 monomérica (es decir,
la proteína ligante de B-galactósido) no induce la
producción de IL-10.
Las galectinas se definen como lectinas que
presentan tanto capacidad de unión a galactósido como una secuencia
de aminoácidos característica. La galectina-1 es una
lectina homodimérica con especificidad para los
beta-galactósidos. La lectina se sintetiza en el
citosol de las células de mamífero, donde se acumula en forma
monomérica, secretándose hacia el exterior de la célula, donde
forma homodímeros. Típicamente, las lectinas funcionales existen en
equilibrio monómero-dímero con una K de 7 \muM y
la tasa de equilibrio es bastante lenta (t_{1/2}=10 horas).
La presente invención proporciona multímeros de
galactina-1 (por ejemplo dímeros, trímeros, etc.).
Preferentemente, el multímero galectina-1 es un
homodímero. Los multímeros de galectina-1 son más
estables que la galectina-1 de tipo salvaje e
inducen la producción de IL-10. El multímero de
galectina-1 además induce la producción de
IL-1\beta. El término "estable" se refiere a
que los multímeros de galectina-1 no se disocian
para formar monómeros a concentraciones bajas. Por ejemplo, los
polipéptidos de galectina-1 de la invención son
multímeros a concentraciones inferiores a 7 \muM, 6 \muM, 5
\muM, 4 \muM, 3 \muM, 2 \muM, 1 \muM, 0,1 \muM ó 0,001
\muM. Los multímeros de galectina resultan eficaces en la
inducción de la producción de IL-10 y de
IL-1\beta a concentraciones más bajas que la
galectina de tipo salvaje. Los dímeros estables de galectina
inducen la producción de IL-10 a concentraciones 10,
50, 100, 150, 200, 250 ó 300 veces inferiores que la galectina de
tipo salvaje. De esta manera, los polipéptidos de
galectina-1 de la invención presentan ventajas
sobre la galectina de tipo salvaje debido a que pueden administrarse
a concentración más baja y por lo tanto evitan el desarrollo de
efectos secundarios no deseados. Los multímeros de
galectina-1 también inducen la apoptosis, es decir,
la muerte celular programada. En comparación con los tratamientos
directos con IL-10 y con monómero de
galectina-1, los homodímeros estables de
galectina-1 presentan la ventaja de eliminar
efectivamente las células T activadas mediante inducción de
apoptosis. Los multímeros de galectina-1 también
regulan negativamente, es decir, inhiben la producción de
IFN\gamma.
Los multímeros estables de
galectina-1 se producen mediante la construcción de
un monómero recombinante de galectina-1 con un
grupo cremallera de leucinas en el extremo
N-terminal y/o C-terminal de un
polipéptido galectina de tipo salvaje (normal), o una variante o
fragmento del mismo. Opcionalmente, una región bisagra une el grupo
galactina-1 de tipo salvaje y el grupo cremallera de
leucinas. Los multímeros estables de galectina se preparan
fácilmente mediante técnicas de clonación modernas, o pueden
sintetizarse mediante métodos de estado sólido. Alternativamente a
la expresión recombinante, los péptidos multímeros de galectina
pueden sintetizarse químicamente mediante técnicas estándares de
síntesis de péptidos. Los dímeros estables también se construyen
mediante técnicas conocidas de manipulación de proteínas, tales como
el diseño racional asistido por ordenador.
Entre las fuentes adecuadas de ácidos nucleicos
codificantes de polipéptido galectina-1 de tipo
salvaje se incluyen, por ejemplo, los ácidos nucleicos de
galectina-1 humana (y las secuencias proteicas
codificadas), disponible de GenBank nº de acceso BT006775 y
AAP35421, respectivamente, y de GenBank nº de acceso BT007914 y
AAP36586, respectivamente.
Entre los monómeros de
galectina-1 recombinante ejemplares que resultan
útiles para producir el multímero estable se incluyen la secuencia
de aminoácidos SEC ID nº 1 ó 2, o variantes o fragmentos de la
misma, tal como se muestra posteriormente. La SEC ID nº 1 se
construyó con un grupo cremallera de leucinas (en cursiva)
etiquetado con histidinas unido al extremo
amino-terminal de un grupo
galectina-1 de tipo salvaje (subrayado) mediante un
grupo espaciador bisagra (en negrita). Los residuos de leucina en la
cremallera FOS se indican en negrita, la SEC ID nº 2 se construyó
con un grupo cremallera de leucinas (en cursiva) etiquetado con
histidinas unido al extremo carboxilo-terminal de
un grupo galectina-1 de tipo salvaje (subrayado)
mediante un grupo espaciador bisagra (en negrita).
El multímero de galectina-1 son
polímeros de L-aminoácidos,
D-aminoácidos o una combinación de ambos tipos. Por
ejemplo, en diversas realizaciones, los péptidos son péptidos D
retro-inversos. El término "isómero
retro-inverso" se refiere a un isómero de un
péptido lineal en el que la orientación de la secuencia se encuentra
invertida, y la quiralidad de cada residuo aminoácido se encuentra
invertida (ver, por ejemplo, Jameson et al., Nature
368:744-746, 1994; Brady et al., Nature
368:692-693, 1994). El resultado neto de combinar
enantiómeros D y la síntesis inversa es que las posiciones de los
grupos carbonilo y amino en cada enlace amida se encuentran
intercambiados, mientras que la posición de los grupos de cadena
lateral en cada carbono alfa se conservan. A menos que se indique
específicamente lo contrario, se supone que cualquier secuencia de
L-aminoácido dado del a invención puede convertirse
en un péptido D retro-inverso mediante la síntesis
de un inverso de la secuencia para la secuencia de
L-aminoácido nativo correspondiente.
Los monómeros de galectina-1
recombinante o las variantes de galectina-1 se
utilizan para producir proteínas quiméricas o de fusión. Tal como
se utiliza en la presente memoria, una galectina-1
"proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende un
monómero de galectina-1 recombinante (por ejemplo
SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2) operablemente ligado a un segundo
polipéptido. Opcionalmente, las proteínas de fusión se utilizan para
formar multímeros estables, tales como dímeros.
Por ejemplo, en la presente invención se
describe un péptido quimérico que incluye un primer dominio que
contiene monómero de galectina-1 recombinante
operablemente unido a un segundo dominio que contiene una secuencia
de traslocación.
Una "secuencia de traslocación" se refiere
a cualquier secuencia de aminoácidos que dirige un péptido en el
que se encuentra presente hasta una destinación celular deseada. Por
ejemplo, la secuencia de traslocación es poliarginina. De esta
manera, la secuencia de traslocación puede dirigir o facilitar la
penetración del péptido en una membrana biológica, por ejemplo una
membrana fosfolipídica, una membrana mitocondrial o una membrana
nuclear. Por ejemplo, la secuencia de traslocación dirige el péptido
desde el exterior de la célula a través de la membrana plasmática y
hacia el interior del citoplasma o hasta una localización deseada
dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, el ribosoma, la
mitocondria, el RE, un lisosoma o un peroxisoma. Alternativamente,
o adicionalmente, la secuencia de traslocación puede dirigir el
péptido a través de una barrera fisiológica, tal como la barrera
hematocefálica, la barrera transmucosal o las barreras
hematoencefálica, hematoretinal, gastrointestinal y pulmonar.
La proteína de fusión puede ser una proteína de
fusión de GST-péptido monómero de
galectina-1 recombinante, en la que la secuencia
del monómero de galectina-1 recombinante se fusiona
con el extremo C-terminal de la secuencia de la GST
(es decir, la
glutatión-S-transferasa). Estas
proteínas de fusión pueden facilitar la purificación del péptido
galectina-1 recombinante.
La proteína de fusión también puede ser una
proteína de fusión de monómero de galectina-1
recombinante-inmunoglobulina, en la que las
secuencias de monómero de galectina-1 recombinante
se fusionan con secuencias derivadas de un miembro de la familia de
proteínas inmunoglobulinas.
También se dan a conocer derivados, fragmentos,
homólogos, análogos y variantes del polipéptido multímero de
galectina-1 y de los ácidos nucleicos codificantes
de dichos polipéptidos. Para los ácidos nucleicos, los derivados,
fragmentos y análogos indicados en la presente invención se definen
como secuencias de por lo menos 6 ácidos nucleicos (contiguos), y
que presentan una longitud suficiente para permitir la hibridación
específica. Para los aminoácidos, los derivados, fragmentos y
análogos descritos en la presente invención se definen como
secuencias de por lo menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud
suficiente para permitir el reconocimiento específico de un
epítopo.
La longitud de los fragmentos es inferior a la
longitud del ácido nucleico o del polipéptido de longitud completa
correspondiente a partir del que se deriva el polipéptido multímero
de galectina-1 o el ácido nucleico codificante del
mismo. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o de
una longitud diferente de la completa, en el caso de que el
derivado o análogo contenga un ácido nucleico o aminoácido
modificado. Entre los derivados o análogos del polipéptido
multímero de galectina-1 se incluyen, por ejemplo,
moléculas que incluyen regiones que son sustancialmente homólogas a
los péptidos, en diversas realizaciones, que presentan una identidad
de por lo menos aproximadamente 30%, 50%, 70%, 80% o 95%, o incluso
99%, respecto a una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico, o
en comparación con una secuencia alineada en la que la alineación se
lleva a cabo utilizando un programa informático de homologías
conocido de la técnica. Por ejemplo, la identidad de secuencias
puede medirse utilizando software de análisis de secuencias
(paquete informático de análisis de secuencias del Genetics
Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710
University Avenue, Madison, Wis. 53705), con los parámetros por
defecto del mismo.
En el caso de secuencias polipeptídicas, que
presentan una identidad inferior al 100% respecto a una secuencia
de referencia, las posiciones no idénticas preferentemente, aunque
no necesariamente, son sustituciones conservadoras para la
secuencia de referencia. Las sustituciones conservadoras típicamente
incluyen sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina y
alanina, valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido
glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y
arginina; y fenilalanina y tirosina. En la presente invención se
dan a conocer péptidos que presentan secuencias mutadas de manera
que siguen siendo homólogos, por ejemplo en la secuencia, en la
función y en el carácter antigénico u otra función, con una proteína
que presenta la secuencia parental correspondiente. Estas
mutaciones pueden ser, por ejemplo, mutaciones que implican cambios
conservadores de aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos
de propiedades moleculares globalmente similares. Por ejemplo, los
intercambios en el grupo alifático alanina, valina, leucina e
isoleucina pueden considerarse conservadores. En ocasiones, la
sustitución de la glicina por uno de dichos grupos puede
considerarse conservadora. Entre otros intercambios conservadores
se incluyen aquellos dentro del grupo alifático aspartato y
glutamato; dentro del grupo amida asparagina y glutamina; dentro del
grupo hidroxilo serina y treonina; dentro del grupo aromático
fenilalanina, tirosina y triptófano; dentro del grupo básico lisina,
arginina e histidina; y dentro del grupo que contiene azufre,
metionina y cisteína. En ocasiones la sustitución dentro del grupo
metionina y leucina también puede considerarse conservadora. Los
grupos de sustitución conservadora preferentes son
aspartato-glutamato,
asparagina-glutamina,
valina-leucina-isoleucina,
alanina-valina,
fenilalanina-tirosina y
lisina-arginina.
En el caso de que se haga referencia a que un
polipéptido particular presenta una identidad de secuencia
específica respecto a un polipéptido de referencia de una longitud
definida, el porcentaje de identidad se refiere al péptido de
referencia. De esta manera, un péptido que es idéntico al 50%
respecto a un polipéptido de referencia que presenta una longitud
de 100 aminoácido puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es
completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de longitud
del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de
100 aminoácidos de longitud que es idéntico al 50% respecto al
polipéptido de referencia a lo largo de su longitud completa.
Evidentemente otros polipéptidos satisfarán los mismos
criterios.
También se dan a conocer variantes alélicas de
los polipéptidos o péptidos dados a conocer; es decir, formas
alternativas naturales del polinucleótido aislado que también
codifican péptidos que son idénticos, homólogos o relacionados con
el codificado por los polinucleótidos. Alternativamente, pueden
producirse variantes no naturales mediante técnicas de mutagénesis
o mediante síntesis directa.
También se describen en la presente memoria
especies homólogas de los polinucleótidos y péptidos dados a
conocer. El término "variante" se refiere a un polinucleótido
o polipéptido diferente del polinucleótido o polipéptido descrito
en la presente memoria, pero que conserva propiedades esenciales de
los mismos. Generalmente, las variantes globalmente son muy
similares, y en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o
polipéptido descritos en la presente invención. Las variantes
pueden contener alteraciones de las regiones codificantes, regiones
no codificantes, o ambas.
Entre las secuencias alteradas se incluyen
inserciones de manera que la secuencia de aminoácidos global se
alargue, conservando la proteína las propiedades de inducción de
IL-10. Además, las secuencias alteradas pueden
incluir deleciones internas aleatorias o diseñadas que acortan la
secuencia de aminoácidos global, conservando la proteína las
propiedades de transporte. Las secuencias alteradas adicional o
alternativamente pueden encontrarse codificadas por polinucleótidos
que se hibridan bajo condiciones astringentes con la cadena
apropiadas del polinucleótido natural codificante de un polipéptido
o péptido a partir del que se deriva el multímero de
galectina-1. El péptido variante puede someterse a
ensayo para la inducción de IL-10 utilizando los
ensayos descritos en la presente invención. Las "condiciones
astringentes" dependen de la secuencia y serán diferentes bajo
circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones
astringentes pueden seleccionarse que sean aproximadamente 5ºC
menos que el punto de fusión térmica (T_{M}) para la secuencia
específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{M} es la
temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que 50% de
la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente
correspondiente. Típicamente, las condiciones astringentes serán
aquéllas en las que la concentración salina es por lo menos
aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea de por lo
menos aproximadamente 60ºC. Debido a que otros factores pueden
afectar a la astringencia de la hibridación (incluyendo, entre
otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas
complementarias), la presencia de solventes orgánicos y el grado de
desapareamiento de las bases, es más importante la combinación de
los parámetros que la magnitud absoluta de cualquiera de los
mismos.
La astringencia elevada puede incluir, por
ejemplo, lo siguiente. Etapa 1: los filtros que contienen ADN se
pretratan durante un periodo de entre 8 horas y toda la noche, a
65ºC en tampón compuesto de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM
(pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y
500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2:
los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en la mezcla de
prehibridación anterior a la que se añaden 100 mg/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y 5-20x10^{6}
cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: los filtros se lavan
durante 1 hora a 37ºC en una solución que contiene 2X SSC, PVP al
0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. A continuación, se realiza un
lavado en 0,1XSSC a 50ºC durante 45 minutos. Etapa 4: se
autorradiografían los filtros. Otras condiciones de elevada
astringencia que pueden utilizarse son bien conocidas de la técnica
(ver, por ejemplo, Ausubel et al. (editores), 1993, CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler,
1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, John Wiley
and Sons, Stockton Press, NY.
Entre las condiciones de astringencia moderadas
se incluyen las siguientes: etapa 1: los filtros que contienen ADN
se pretratan durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene 6X
SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: los filtros se hibridan
durante 18 a 20 horas a 55ºC en la misma solución, añadiendo
5-20x10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P.
Etapa 3: los filtros se lavan a 37ºC durante 1 hora en una solución
que contiene 2X SSC, SDS al 0,1%, después se lavan dos veces
durante 30 minutos a 60ºC en una solución que contiene 1X SSC y SDS
al 0,1%. Etapa 4: los filtros se secan con papel de filtro y se
exponen para la autorradiografía. Otras condiciones de astringencia
moderada que pueden utilizarse son bien conocidas de la técnica
(ver, por ejemplo, Ausubel et al. (editores), 1993, CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler,
1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton
Press, NY.
La astringencia baja puede incluir: etapa 1: los
filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 horas a 40ºC en
una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%,
Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Etapa 2: los filtros se hibridan durante 18
a 20 horas a 40ºC en la misma solución con la adición de PVP al
0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón, dextrán sulfato al 10% (p/v) y
5-20x10^{6} cpm de sonda marcada con 32P. Etapa
3: los filtros se lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que
contiene 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM
y SDS al 0,1%. La solución de lavado se sustituye con solución
fresca y se incuba durante 1,5 horas adicionales a 60ºC. Etapa 4:
los filtros se secan con papel de filtro y se exponen para la
autorradiografía. En caso necesario, los filtros se lavan una
tercera vez a una temperatura de entre 65ºC y 68ºC y se reexponen a
película. Otras condiciones de astringencia reducida que pueden
utilizarse son bien conocidas de la técnica (por ejemplo las
utilizadas para las hibridaciones entre especies) (ver, por
ejemplo, Ausubel et al., editores, 1993, CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE
TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press,
NY.
La interleuquina-10
(IL-10) es un regulador negativo esencial de la
respuesta inflamatoria. IL-10 inhibe la activación
y la función efectora de las células T, monocitos y macrófagos.
IL-10 es una citoquina multifuncional con diversos
efectos sobre la mayoría de tipos celulares hematopoyéticos. La
función principal de IL-10 es limitar y en última
instancia terminar las respuestas inflamatorias. Además de dichas
actividades, IL-10 regula el crecimiento y/o la
diferenciación de las células B, células NK, células T citotóxicas y
ayudantes, mastocitos, granulocitos, células dendríticas,
queratinocitos y células endoteliales. IL-10
desempeña un papel crucial en la diferenciación y funcionamiento de
un tipo nuevamente apreciado de célula T, la célula T reguladora,
que puede controlar las respuestas inmunológicas y la tolerancia
in vivo.
La invención proporciona métodos para inducir o
intensificar la producción de IL-10. Se pone en
contacto una célula o tejido con un polipéptido
galectina-1 en una cantidad suficiente para inducir
la producción de IL-10. Un tejido es, por ejemplo,
un tejido del sistema inmunológico, tal como el tejido de nódulo
linfático. Opcionalmente, el tejido se encuentra inflamado. La
célula es cualquier célula capaz de producir IL-10.
La célula es una célula no cancerosa. Alternativamente, la célula
es una célula cancerosa. Preferentemente, la célula es una célula
inmunológica. Por ejemplo, la célula es un linfocito, tal como una
célula B, o una célula T, una célula dendríticas, un monocito o un
macrófago. La célula se encuentra activada. Alternativamente, la
célula no se encuentra activada. La célula es CD4 y/o
CD8-positiva. La célula se pone en contacto in
vitro o ex vivo.
La célula que entra en contacto con las
composiciones incrementa la producción de IL-10 en
comparación con una célula de referencia. La célula o población
celular de referencia no ha sido expuesta a la composición.
Preferentemente, la célula de referencia es similar a la célula
expuesta a la composición. Por ejemplo, en el caso de que la célula
expuesta a la composición sea una célula T no activada, la población
celular de referencia comprende células T no activadas.
Alternativamente, la población celular de referencia se deriva de
una base de datos de información molecular derivada de células para
las que el parámetro o condición sometida a ensayo es conocida.
Se define la inducción de la producción de
IL-10 a partir de un incremento de la expresión o
actividad de IL-10. La intensificación de la
producción de IL-10 se refiere a un incremento de la
producción de IL-10 en comparación con los niveles
normales de producción de IL-10. La expresión de
IL-10 se determina al nivel del ARN mediante
cualquier método conocido de la técnica. Por ejemplo, el análisis de
hibridación northern utilizando sondas que reconocen
específicamente un gel IL-10 puede utilizarse para
determinar la expresión génica.
Alternativamente, la expresión se mide
utilizando un ensayo de PCR cuantitativa basada en la transcripción
inversa, por ejemplo utilizando cebadores específicos para
IL-10. La expresión de IL-10 también
se determina al nivel de las proteínas, es decir, mediante la
medición de los niveles de proteína IL-10. Estos
métodos son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen,
por ejemplo, los inmunoensayos basados en anticuerpos contra
IL-10 y los ensayos de cribado de
IL-10 disponibles comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
La inflamación se inhibe mediante la
administración en el tejido de polipéptido
galectina-1. Entre los tejidos que pueden tratarse
se incluyen un tejido intestinal, un tejido cardiaco, un tejido
pulmonar, un tejido dérmico o un tejido hepático. Por ejemplo, el
tejido es un tejido epitelial, tal como un tejido epitelial
intestinal, tejido epitelial pulmonar, tejido dérmico (es decir,
piel) o tejido epitelial hepático.
La inflamación resulta inhibida al reducir uno o
más indicios o síntomas de la inflamación en comparación con un
tejido que no ha entrado en contacto con un polipéptido
galectina-1. Entre los indicios y síntomas de la
inflamación se incluye, por ejemplo enrojecimiento, dolor, calor
local y/o hinchazón del tejido tratado. Los tejidos se ponen en
contacto directo con los polipéptidos. Alternativamente, el
polipéptido se administra sistémicamente. Los polipéptidos
galectina-1 se administran en una cantidad
suficiente para reducir (por ejemplo inhibir) la producción de
citoquina inmunosupresora. Una citoquina inmunosupresora es una
citoquina que reduce una respuesta inflamatoria. Por ejemplo, la
citoquina inmunosupresora es IL-10. Una respuesta
inflamatoria se evalúa morfológicamente mediante la observación del
daño a los tejidos, el enrojecimiento localizado, la temperatura
incrementa y el hinchazón del área afectada. Alternativamente, se
evalúa una respuesta inflamatoria mediante la medición de las
proteínas c-reactivas, diversas citoquinas (por
ejemplo IL-1 en el tejido o en el suero o plasma) o
la presencia de células inflamatorias. Una reducción del recuento de
glóbulos blancos generalmente indica una reducción de la
inflamación.
La eficacia del tratamiento se determina en
relación a cualquier método conocido para el diagnóstico o
tratamiento del trastorno de tipo inmunológico. El alivio de uno o
más síntomas del trastorno de tipo inmunológico indica que el
compuesto proporciona un beneficio clínico.
Los métodos resultan útiles para aliviar los
síntomas de una diversidad de trastornos de tipo inmunológico,
tales como un trastorno inflamatorio. El trastorno inflamatorio es
agudo o crónico. Entre los trastornos inflamatorios se incluyen la
inflamación cardiovascular, la inflamación gastrointestinal, los
trastornos inflamatorios hepáticos, la inflamación pulmonar, la
enfermedad autoinmunológica (por ejemplo el lupus eritematoso
sistémico, la esclerosis múltiple, la diabetes, la dermatomiositis,
la polimiositis, las neuropatías inflamatorias (Guillain Barré,
polineuropatías inflamatorias), la vasculitis (granulomatosis de
Wegener, poliarteritis nodosa), la polimialgia reumática, la
artritis temporal, el síndrome de Sjögren, la enfermedad de Bechet,
el síndrome de Churg-Strauss, la arteritis de
Takayasu), los trastornos neuroinflamatorios (por ejemplo la
esclerosis múltiple), la alergia (por ejemplo la rinitis
alérgica/sinusitis, las alergias y trastornos de la piel (por
ejemplo la urticaria y el prurito, el angioedema, la dermatitis
atópica, la dermatitis por contacto, la soriasis), las alergias
alimentarias, las alergias farmacológicas, las alergias a insectos,
la mastocitosis, la inflamación esquelética (por ejemplo la
artritis, la osteoartritis, la artritis reumatoide, la
espondiloartropatías) y el rechazo crónico o agudo del
trasplante.
Los métodos descritos en la presente memoria
conducen a una reducción de la severidad o el alivio de uno o más
síntomas de un trastorno inflamatorio tal como los indicados en la
presente memoria. Los trastornos inflamatorios son diagnosticados
y/o monitorizados por un médico mediante metodologías
estándares.
Entre los trastornos inflamatorios
gastrointestinales se incluyen, por ejemplo, la enfermedad
intestinal inflamatoria, la enfermedad de Crohn, la colitis
(ulcerosa, ileitis o proctitis).
La colitis ulcerosa es una enfermedad intestinal
inflamatoria que causa inflamación y lesiones, denominadas úlceras,
en las capas superiores del revestimiento del intestino grueso. La
inflamación habitualmente se produce en el recto y parte inferior
del colon, pero puede afectar a la totalidad del colon. La colitis
ulcerosa raramente afecta al intestino delgado, excepto en su
sección inferior, denominada ileo. La colitis ulcerosa aparece más
frecuentemente en personas de edades comprendidas entre 15 y 40,
aunque niños y personas de mayor edad pueden desarrollar la
enfermedad. La colitis ulcerosa afecta a hombres y mujeres
igualmente y aparentemente es hereditaria. La enfermedad de Crohn
causa inflamación más profundamente dentro de la pared intestinal.
La enfermedad de Crohn habitualmente aparece en el intestino
delgado, pero también puede aparecer en la boca, esófago, estómago,
duodeno, intestino grueso, apéndice y ano.
Los síntomas de un trastorno inflamatorio
gastrointestinal son el dolor abdominal y la diarrea sanguinolenta.
Entre otros síntomas se incluyen fatiga, pérdida de peso, pérdida
del apetito, sangrado rectal y pérdida de líquidos y nutrientes
corporales. La inflamación gastrointestinal también puede provocar
problemas tales como artritis, inflamación ocular, enfermedad
hepática (hígado graso, hepatitis, cirrosis y colangitis
esclerosante primaria), osteoporosis, erupciones en la piel, anemia
y cálculos renales.
La inflamación gastrointestinal se diagnostica
utilizando ensayos para comprobar la existencia de anemia, que
puede indicar sangrado en el colon o el recto. Además, puede
obtenerse una muestra de las heces para determinar la existencia de
sangrado o infección en el colon o el recto. Alternativamente, se
lleva a cabo una colonoscopia para detectar inflamación, sangrado o
úlceras en la pared del colon.
Entre los trastornos inflamatorios pulmonares se
incluye, por ejemplo, la sinusitis, el síndrome del distrés
respiratorio agudo, el asma, la displasia broncopulmonar (BPD), el
enfisema, las enfermedades pulmonares intersticiales, el daño
pulmonar y la hipertensión pulmonar.
El asma es una condición pulmonar crónica que
puede desarrollarse a cualquier edad. Es más común en la infancia y
se presenta en aproximadamente 7% a 10% de la población pediátrica.
El asma afecta a dos veces más niños que niñas durante la infancia;
más niñas que niños desarrollan asma durante la adolescencia, y en
la adultez, la proporción de varones a hembras se convierte en 1:1.
Entre los síntomas del asma se incluyen la falta de aliento, la
respiración ruidosa, la constricción de los músculos pectorales, la
tos, la producción de esputo, la respiración/jadeo rápida excesiva,
la taquicardia y la fatiga extrema. El asma se diagnostica mediante
el examen físico, es decir escuchando los pulmones con un
estetoscopio, examinando las vías nasales, rayos X del pecho,
análisis sanguíneos o espirometría.
Entre los trastornos neuroinflamatorios se
incluyen, por ejemplo, la esclerosis múltiple, la enfermedad de
Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el ictus isquémico.
La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad
desmielinizante inflamatoria del sistema nervioso central que se
cree que presenta una patogénesis autoinmunológica. La MS se
clasifica según su curso clínico en varias categorías: benigna,
recidivante-remitente (la variante más común),
progresiva-recidivante, progresiva primaria y
progresiva secundaria.
Patológicamente, la MS se caracteriza por la
presencia de áreas de desmielinización e inflamación perivascular
con predominio de células T en la materia blanca del cerebro.
Algunos axones pueden salvarse de estos procesos patológicos. La
enfermedad se inicia más comúnmente con la aparición aguda o
subaguda de anormalidades neurológicas. Los síntomas iniciales y
posteriores pueden variar drásticamente en su expresión y severidad
durante el curso de la enfermedad, que habitualmente se prolonga
durante muchos años. Entre los síntomas tempranos pueden incluirse
la insensibilidad y/o parestesia, la monoparesis o paraparesis, la
visión doble, la neuritis óptica, la ataxia y problemas con el
control de la vejiga. Entre los síntomas posteriores también se
incluyen indicios más prominentes en las neuronas motoras
superiores, es decir espasticidad incrementada, paraparesis o
cuadriparesis creciente, vértigo, descoordinación y otros problemas
cerebelares, depresión, inestabilidad emocional, anormalidades de
la marcha, disartria, fatiga y dolor.
La base del diagnóstico está constituida por la
observación clínica, los resultados de la obtención de imágenes de
resonancia magnética (presencia de áreas de desmielinización en el
SNC), examen del líquido espinal (presencia de bandas oligoclonales
y/o un índice IgG incrementado) y en ocasiones ensayos de
potenciales inducidos. El diagnóstico diferencial de la MS incluye
otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso, con
frecuencia de un origen vírico o postinfeccioso. Entre ellas se
encuentran la encefalomielitis, la mielitis transversa, así como
otras condiciones de tipo inmunológico que afectan al SNC, tales
como la sarcoidosis, el lupus eritematoso sistémico, la deficiencia
de vitamina B-12, etc.
Entre los trastornos inflamatorios esqueléticos
se incluyen, por ejemplo, la artritis, la osteoartritis, la
artritis reumatoide y las espondiloartropatías. La artritis es la
inflamación de una o más articulaciones, caracterizada por
hinchazón, calor y enrojecimiento de la piel contigua, dolor y
restricción del movimiento. Existen más de 200 enfermedades que
pueden causar artritis. La artritis puede dividirse en dos
categorías principales: (1) artritis no inflamatoria, y (2)
artritis inflamatoria. La artritis puede desarrollarse como
resultado de una infección, tal como la gonorrea o la enfermedad de
Lyme.
La artritis osteoartritis (OA), también
denominada artritis degenerativa, se produce al descomponerse el
cartílago amortiguador en una articulación. Las articulaciones que
soportan peso, incluyendo la zona lumbar, las caderas, las rodillas
y los pies, son las afectadas más comúnmente. Entre los síntomas se
incluyen dolor y rigidez que resultan influenciados por los cambios
meteorológicos, habitualmente empeorando en tiempo húmedo, frío y
lluvioso, e inestabilidad o combamiento de las rodillas,
especialmente al bajar escaleras. La OA se diagnostica mediante
examen físico, análisis de sangre y rayos X.
La artritis espondilitis anquilosante es una
enfermedad inflamatoria crónica de la columna que puede resultar en
la fusión de vértebras y en una columna rígida. Los síntomas de la
espondilitis anquilosante generalmente aparecen en adultos jóvenes
como hinchazón y dolor en la zona lumbar. Los niños, generalmente de
sexo masculino, ocasionalmente también desarrollan síntomas en
caderas y rodillas. Aunque se inicia en la zona lumbar, el dolor y
la rigidez sube gradualmente por la columna, entrando en el cuello.
Los pacientes con espondilitis anquilosante típicamente muestran
cinco de entre los seis síntomas siguientes, aunque la severidad de
los síntomas varía mucho entre pacientes: aparición de dolor antes
de los 35 años de edad, dolor y rigidez matutina de la columna,
mejora con el movimiento, aparición gradual de los síntomas, los
síntomas se prolongan durante más de tres meses, la respiración
profunda puede encontrarse restringida. Además, la mayor parte de
las personas con esta enfermedad también presenta un marcador
genético conocido como HLA-B27.
La expresión "enfermedad autoinmunológica"
se refiere a un grupo variado de más de 80 enfermedades crónicas
que implican prácticamente todos los sistemas orgánicos del ser
humano. En todas estas enfermedades, el problema subyacente es
similar: el sistema inmunológico del cuerpo se desorienta, atacando
los órganos mismos para cuya protección estaba diseñada. Las
enfermedades autoinmunológicas afectan a tejido conectivo, nervios,
músculos, el sistema endocrino, y el sistema gastrointestinal.
Entre los trastornos autoinmunológicos se incluyen, por ejemplo, el
lupus, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la miastenia
gravis y la diabetes de tipo 1.
La diabetes de tipo 1 (también denominada
"diabetes mellitus insulino-dependiente" o
"diabetes juvenil") es la forma severa que requiere insulina
de la diabetes. Habitualmente afecta a adolescentes y adultos
jóvenes, de menos de 30 años, aunque puede afectar a bebés o a
niños). Los síntomas de la diabetes de tipo 1 habitualmente son
bastante severos, y surgen rápidamente, en semanas o meses. Entre
los síntomas comunes se incluyen sed, micción excesiva, hambre,
pérdida de peso e irritabilidad.
El lupus incluye el lupus eritematoso sistémico
(SLE), el lupus eritematoso discoide (DLE), el lupus inducido
farmacológicamente y el lupus neonatal.
El SLE es el tipo más común de lupus y afecta a
muchas partes del cuerpo, incluyendo articulaciones, piel, riñones,
pulmones, corazón, vasos sanguíneos, sistema nervioso, sangre y
cerebro. El SLE habitualmente se desarrolla en personas de entre 15
y 44 años de edad, puede aparecer en la infancia o más tarde. Los
indicios de SLE varían y habitualmente hay periodos de tanto
enfermedad como de salud (también denominada remisión o carencia de
síntomas). Algunas personas sólo presentan algunos indicios de la
enfermedad, mientras que otros presentan más. Entre los síntomas
pueden incluirse, la erupción "de mariposa" en nariz y
mejillas, erupciones en la piel en partes del cuerpo expuestas al
sol, úlceras en boca o nariz, articulaciones dolorosas o hinchadas,
fiebre, pérdida de peso, pérdida de pelo, fatiga, dolor pectoral al
respirar profundamente, dedos de manos o pies de color violeta o
pálido debido al frío o al estrés, dolor abdominal, inflamación
renal, cefaleas y paranoia.
El lupus se diagnostica a partir del historial
médico, conjuntamente con un examen físico y ensayos especiales que
ayudan al médico a descartar otras enfermedades que pueden
confundirse con el lupus, que presentan 4 (o más) de los 11
síntomas del lupus, según la definición de la American College of
Rheumatology y mediante ensayos de laboratorio tales como el del
anticuerpo antinuclear (ANA).
El DLE únicamente afecta a la piel. Entre los
síntomas del mismo se incluyen una erupción roja elevada en la
cara, cuero cabelludo u otras partes del cuerpo y úlceras en boca o
nariz. La erupción puede presentar una apariencia gruesa y escamosa
y puede durar días o años. El DLE se diagnostica mediante el examen
histológico de biopsias de la piel. El lupus inducido
farmacológicamente es una reacción contra algunos medicamentos de
prescripción. Los síntomas del DLE son similares a los del SLE,
excepto en que no se presentan problemas renales ni del sistema
nervioso central. Los síntomas pueden no aparecer hasta
transcurridos meses o años de administración del medicamento. Tras
detener la administración del fármaco, puede tardar días, semanas o
meses antes de que desaparezcan los síntomas.
El lupus neonatal, aunque raro, afecta a algunos
bebés neonatos de mujeres que presentan SLE u otros trastornos del
sistema inmunológico. Los bebés con lupus neonatal pueden presentar
un defecto cardíaco grave. Aproximadamente la mitad de los bebés
con lupus neonatal nacen con una enfermedad cardiaca.
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad
crónica que causa dolor, rigidez, hinchazón y limitaciones del
movimiento y de la función de múltiples articulaciones. Si se deja
sin tratar, o se trata incorrectamente, la RA puede producir una
destrucción grave de una o más articulaciones, conduciendo con
frecuencia a una discapacidad permanente. Aunque las articulaciones
son las partes corporales principales afectadas por la RA, también
pueden inflamarse otros órganos corporales.
Entre los síntomas de la RA se incluyen dolor,
rigidez, hinchazón, enrojecimiento y dificultad para mover las
articulaciones en el rango completo de movimientos. La rigidez
observada en la RA activa típicamente es mayor por la mañana y dura
entre 1-2 horas y todo el día. Aunque la RA puede
afectar a cualquier articulación, algunas articulaciones,
especialmente aquéllas de las manos y pies, tienden a resultar
afectadas más frecuentemente que otras. Entre otros síntomas que
pueden producirse en la RA se incluyen la pérdida de energía, la
fiebre leve, la pérdida del apetito, la sequedad de ojos y boca,
produciendo una condición conocida como de Sjögren y bultos blandos
en la piel en áreas tales como el codo y las manos denominados
nódulos reumatoides.
La RA es difícil de diagnosticar debido a que
puede iniciarse gradualmente con síntomas sutiles. Muchas
enfermedades, especialmente al inicio, pueden manifestarse de
manera similar a la RA. El diagnóstico de la RA se basa en los
síntomas descritos y en los resultados del examen físico típico,
caracterizados por calor, hinchazón y dolor en las articulaciones.
Además, en la RA comúnmente se observan determinadas anormalidades
en laboratorio, tales como la anemia (recuento bajo de glóbulos
rojos), un factor reumatoide positivo (un anticuerpo presente en
aproximadamente 80% de los pacientes de RA) y una tasa de
sedimentación de eritrocitos elevada o "tasa de sed." (un
análisis de sangre que en la mayoría de pacientes con RA tiende a
correlacionarse con la magnitud de la inflamación de las
articulaciones).
Entre los trastornos inflamatorios hepáticos se
incluyen, por ejemplo, la hepatitis, tal como la hepatitis vírica,
la hepatitis bacteriana, la hepatitis autoinmunológica, la hepatitis
inducida farmacológicamente o la hepatitis alcohólica. La
incidencia y severidad de la hepatitis varía dependiendo de muchos
factores, incluyendo la causa del daño hepático y cualquier
enfermedad subyacente en el paciente. Entre los factores de riesgo
comunes se incluyen la utilización de fármacos por vía intravenosa,
la sobredosis de tilenol (la dosis necesaria para causar un daño es
bastante próxima a la dosis eficaz, de manera que debe procurarse la
utilización del tilenol únicamente según las instrucciones), los
comportamientos sexuales de riesgo, la ingestión de alimentos
contaminados y el abuso del alcohol.
Entre los síntomas de la hepatitis se incluyen
la orina oscura, la pérdida de apetito, la fatiga, la ictericia, el
dolor abdominal y las heces negras. La hepatitis se diagnostica
mediante un examen físico, el ensayo de la función hepática, un
marcador autoinmunológico y la serología.
Entre los trastornos inflamatorios cardíacos se
incluyen, por ejemplo, la pericarditis, la endocarditis y la
miocarditis. La inflamación cardiaca también incluye una inflamación
que resulta de un suceso cardiaco agudo, tal como un infarto de
miocardio. La inflamación cardiaca se distingue de otros trastornos
cardíacos en que la inflamación típicamente es aguda, mientras que
otros trastornos tales como las inflamaciones por ateroesclerosis
son crónicas. La ateroesclerosis resulta en la acumulación de
depósitos de sustancias grasas, colesterol, productos residuales
celulares y calcio en el revestimiento interno de una arteria (es
decir, una placa). En contraste, la inflamación cardiaca afecta al
tejido muscular del corazón.
La pericarditis es la inflamación del pericardio
y se caracteriza por dolor pectoral. Los pacientes que han sufrido
un infarto de miocardio con frecuencia desarrollan pericarditis
durante los días o semanas posteriores. La pericarditis se
diagnostica a partir de segmentos ST elevados en un
electrocardiograma.
La endocarditis es la inflamación del endocardio
y causa una amplia diversidad de síntomas, particularmente en las
etapas tempranas de la infección. Entre los síntomas se incluyen
fiebres, escalofríos, fatiga, pérdida de peso, dolores musculares y
sudoración. La endocarditis se diagnostica a partir de la presencia
de un murmullo cardiaco o un ecocardiograma.
La miocarditis es la inflamación del músculo
cardíaco. Entre los síntomas de la miocarditis se incluyen fiebre,
dolor pectoral, latidos cardíacos anormales, fatiga y falta de
aliento. La miocarditis típicamente se diagnostica mediante una
biopsia endomiocárdica.
Entre las alergias alimentarias se incluyen, por
ejemplo, las de los cacahuetes, nueces, leche de vaca y productos
lácteos, pescado y marisco, determinadas frutas y hortalizas,
chocolate, cerveza o vino, níquel y trigo, y también la alergia
alimentaria asociada al polen. Una categoría especial es la alergia
al huevo, debido a que los efectos de esta alergia alimentaria
específica se extienden a la vacunación en el caso de que se
apliquen vacunas cultivadas en huevos de pollo en personas
alérgicas al huevo o al pollo.
Los síntomas de la alergia alimentaria incluyen
manifestaciones en la piel (por ejemplo dermatitis atópica,
dermatitis alérgica por contacto, eccema), gastrointestinales y
respiratorias, y también la anafilaxis. La medicación con
frecuencia incluye antihistamínicos, corticoesteroides sistémicos,
epinefrina o tratamientos respiratorios tales como el albuterol
inhalado.
Los síntomas con frecuencia se asocian a
incrementos de IgE específicos de alérgeno. Está creciendo la
incidencia y severidad de los incidentes informados, al igual que
el número de alimentos implicados.
El sistema inmunológico responde a un trasplante
con anticuerpos de células B y linfocitos células T que pueden
atacar al nuevo órgano. Además, las quimoquinas desempeñan un papel
esencial en la regulación y coordinación de la infiltración de los
leucocitos en los injertos. Las quimoquinas se expresan en injertos
de piel, hígado, corazón y riñón tras la injertación inicial, daño
isquémico, infección vírica y rechazo agudo o crónico.
La supervivencia del trasplante (es decir, del
injerto) se incrementa mediante la administración en el sujeto de
una composición que comprende un polipéptido
galectina-1. Opcionalmente se administra además una
composición que incluye otros compuestos inmunosupresores tales
como, por ejemplo, azatioprina, corticoesteroides, ciclosporina (y
ciclosporina A) y FK506, o una combinación de cualquiera de los
anteriores. Alternativamente, la supervivencia del trasplante se
incrementa mediante el contacto de un órgano con una composición que
comprende un polipéptido galectina-1. Por ejemplo,
antes del trasplante el órgano se perfunde con un polipéptido
galectina-1.
El trasplante es un aloinjerto.
Alternativamente, el trasplante es un xenoinjerto. Entre estos
trasplantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, riñón,
hígado, piel, páncreas, córnea o corazón. El sujeto puede ser
cualquier animal, por ejemplo un ser humano, un primate, ratón,
rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo.
Se administra un polipéptido
galectina-1 en un régimen de dosificación
terapéuticamente eficaz con el fin de reducir, prevenir o retrasar
la incidencia del rechazo del injerto tras el trasplante. El
tratamiento se administra antes de que el sujeto reciba un
trasplante. Alternativamente, el tratamiento se administra tras
recibir el sujeto un trasplante. Opcionalmente, el tratamiento se
administra concomitantemente en el sujeto que recibe el trasplante.
El tratamiento se administra durante un periodo de tiempo
seleccionado. Por ejemplo, el tratamiento se administra 1, 2, 3, 4,
5, 6 ó más días. Preferentemente el tratamiento se administra
durante 1, 2, 3, 4 ó más semanas. En algunos métodos se administra
una única dosis de aproximadamente 1 mg/kg de un polipéptido
galectina-1 aproximadamente cada dos semanas,
iniciándose inmediatamente antes del trasplante, y continuado hasta
por lo menos 8 semanas después del mismo. En otros métodos, la dosis
es de entre 0,25 y 0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg o una dosis unitaria fija
de, por ejemplo, 5 mg, 10 mg o 20 mg. Habitualmente se administran
entre 2 y 5 dosis (por ejemplo 2, 3, 4 ó 5) durante un periodo de
aproximadamente 2 semanas a 2 meses con el fin de evitar (es decir,
reducir la incidencia de episodios de rechazo durante un periodo de
por lo menos 2 ó 3, aunque preferentemente 6 ó 12, meses tras el
trasplante). Alternativamente puede administrarse el polipéptido
galectina-1 diariamente, dos veces por semana,
semanalmente, quincenalmente, mensualmente o en algún otro
intervalo durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3 a 6
meses o más. Opcionalmente, el polipéptido
galectina-1 se administra tras la sospecha del
médico de rechazo del órgano. El rechazo del órgano se determina
mediante métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, se sugiere
rechazo del órgano en el caso de que la creatinina sanguínea del
sujeto empiece a incrementarse lentamente tras un cierto periodo de
estabilidad.
La supervivencia del trasplante se incrementa
mediante la reducción, prevención o retraso del rechazo del órgano.
El rechazo se refiere a que el sistema inmunológico del sujeto
reconoce el trasplante como foráneo. El rechazo es agudo, por
ejemplo un rechazo hiperagudo. Alternativamente el rechazo es
crónico. El rechazo agudo de un órgano trasplantado puede
producirse tras segundos o minutos de exponer el órgano a la
circulación del receptor. El rechazo agudo se produce en los
primeros pocos días (particularmente en las primeras pocas semanas)
posteriores al trasplante. En contraste, el rechazo crónico se
produce a largo plazo y se inicia lentamente. El sistema
inmunológico del paciente ataca y rechaza el trasplante, pero de una
manera diferente que en el rechazo agudo. El rechazo crónico se
asemeja a un envejecimiento lento del órgano trasplantado. El
rechazo crónico habitualmente se produce más de un año después de la
operación de trasplante.
La expresión "tasa de supervivencia" del
trasplante se refiere al periodo anterior al rechazo del trasplante
por parte del sujeto. Por ejemplo, la supervivencia se incrementa
cuando el trasplante sobrevive por lo menos 1, 2, 4 ó 8 semanas al
trasplante. Preferentemente el trasplante sobrevive, por ejemplo, 3,
6 ó 13 meses. Más preferentemente el trasplante sobrevive 2, 3, 5 ó
más años.
La invención proporciona una composición
purificada de vacuna que comprende el multímero estable de
galectina-1 y un antígeno. Específicamente, la
respuesta inmunológica frente a un antígeno mejora tras la
vacunación de un sujeto con una composición que contiene un
polipéptido galectina-1. El tratamiento con
galectina-1 proporciona un estímulo positivo para
una reacción inmunológica. Se inmuniza un sujeto mediante la
administración en el sujeto de una composición que contiene un
polipéptido galectina-1. El tratamiento de
galectina-1 proporciona un estímulo positivo a una
reacción inmunológica. Se inmuniza un sujeto mediante la
administración en el sujeto de una composición que contiene un
polipéptido galectina-1 y una composición que
contiene un antígeno. Un antígeno es cualquier compuesto contra el
que se desea una respuesta inmunológica. Por ejemplo, un antígeno
es una proteína, una glucoproteína, una lipoproteína, un
polisacárido, un lipopolisacárido, un lípido, un glucolípido, un
polinucleótido o una molécula pequeña (por ejemplo un hapteno).
Opcionalmente, el antígeno se une, por ejemplo covalentemente, a
una proteína portadora. El sujeto presenta un riesgo de desarrollar
o sufrir una infección, por ejemplo bacteriana, vírica o fúngica.
Entre las infecciones se incluyen la hepatitis C, el VIH, la
hepatitis B, el virus del papiloma, la malaria, la tuberculosis, el
virus del herpes simplex, el virus Epstein-Barr, la
clamidia o la influenza. Alternativamente, el sujeto presenta un
riesgo de desarrollar o sufrir un cáncer. El cáncer es de, por
ejemplo, mama, pulmón, colon, próstata, páncreas, cérvix, linfoma o
melanoma.
La vacuna se lleva a cabo mediante métodos
convencionales. Por ejemplo, la composición puede utilizarse en un
diluyente adecuado, tal como solución salina o agua, o adyuvantes
completos o incompletos. La vacuna puede administrarse por
cualquier vía apropiada para inducir una respuesta inmunológica, tal
como una vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular,
subcutánea o similar. La vacuna puede administrarse una vez o a
intervalos periódicos hasta la inducción de una respuesta
inmunológica. Puede detectarse una respuesta inmunológica mediante
una diversidad de métodos conocidos por el experto en la materia,
incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la detección de
anticuerpos específicos de antígeno, el ensayo de citotoxicidad, el
ensayo de proliferación y los ensayos de liberación de
citoquinas.
La dosis exacta que debe utilizarse en la
formulación también dependerá de la vía de administración y la
gravedad global de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de
acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada
paciente. En última instancia el médico responsable decidirá la
cantidad de proteína de la presente invención con la que tratar
cada paciente individual.
También se dan a conocer métodos para inducir
apoptosis. Puede inducirse apoptosis en un sujeto que lo necesita
mediante la administración de un polipéptido
galectina-1 multimérico en una cantidad suficiente
para inducir apoptosis. El sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier
mamífero, por ejemplo un ser humano, un primate, ratón, rata,
perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El sujeto puede ser susceptible
al cáncer o a un trastorno autoinmunológico.
La apoptosis, también conocida como muerte
celular programada, desempeña un papel en el desarrollo, el
envejecimiento y en diversas condiciones patológicas. En los
organismos en desarrollo, tanto vertebrados como invertebrados, las
células mueren en posiciones particulares en tiempos particulares
como parte del proceso morfogenético normal. El proceso de la
apoptosis se caracteriza, aunque sin limitarse a los mismos, por
varios sucesos. Las células pierden sus uniones celulares y
microvilli, el citoplasma se condensa y la cromatina nuclear se
agrega en varias masas discretas. A medida que se fragmenta el
núcleo, el citoplasma se contrae y las mitocondrias y los ribosomas
se compactan densamente. Tras la dilatación del retículo
endoplasmático y su fusión con la membrana plasmática, la célula se
rompe en varias vesículas unidas a membrana, los cuerpos
apoptóticos, que habitualmente resultan fagocitados por cuerpos
vecinos. Debido a que la fragmentación de la cromatina en fragmentos
oligonucleótidos es característica de las etapas finales de la
apoptosis, los patrones de corte del ADN pueden utilizarse en
ensayo in vitro para la detección de su aparición (Cory,
Nature 367:317-18, 1994).
Puede administrarse un polipéptido
galectina-1 multimérico con un compuesto
antiangiogénico. Entre los ejemplos de un compuesto antiangiogénico
se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un inhibidor de tirosina
quinasa, un inhibidor del factor de crecimiento derivado de la
epidermis, un inhibidor de factor de crecimiento derivado de
fibroblastos, un inhibidor de factor de crecimiento derivado de
plaquetas, un inhibidor de metaloproteasa matricial (MMP), un
bloqueante de integrina, interferón alfa, proteína 10 inducible con
interferón, interleuquina 12, polisulfato de pentosán, un inhibidor
de ciclooxigenasa, un antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un
inhibidor de ciclooxigenasa 2, carboxiamidotriazol,
tetrahidrocortizol, combretastatina A-4,
escualamina,
6-O-cloroacetil-carbonil)-fumagilol,
talidomida, angiostatina, endostatina, troponina-1,
un anticuerpo contra VEGF, factor plaquetario 4 ó
tromboespondina.
El polipéptido galectina-1
multimérico puede administrarse además con un compuesto
quimioterapéutico. Entre los ejemplos de compuestos
quimioterapéuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,
paclitaxel, taxol, lovastatina, minosina, tamoxifeno, gemcitabina,
5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato
(MTX), docetaxel, vincristina, vinblastina, nocodazol, tenipósido,
etopósido, adriamicina, epotilón, navelbina, camptotecina,
daunonibicina, dactinomicina, mitoxantrona, amsacrina, epirubicina
o idarubicina.
La apoptosis puede inducirse en una célula
poniendo en contacto la célula con un polipéptido
galectina-1 multimérico en una cantidad suficiente
para inducir apoptosis. El polipéptido galectina-1
multimérico es estable. La población celular que se expone, es
decir, que se ponen en contacto con el polipéptido
galectina-1 multimérico puede presentar cualquier
número de células, es decir una o más células, y puede
proporcionarse in vitro, in vivo o ex
vivo.
La cantidad del polipéptido
galectina-1 multimérico para inducir apoptosis se
encuentra en una cantidad inferior a la del polipéptido de tipo
salvaje, por ejemplo polipéptido galectina monomérico. Por ejemplo,
la célula se pone en contacto con el polipéptido
galectina-1 multimérico estable, o se administra en
el sujeto, a una concentración inferior a 20 \muM, 15 mM, 10
\muM, 5 \muM, 1 mM, 0,1 \muM ó 0,001 \muM.
Algunas condiciones de enfermedad se relacionan
con el desarrollo de una regulación negativa defectuosa de la
apoptosis en las células afectadas. Por ejemplo, las neoplasias
resultan, por lo menos en parte, de un estado resistente a la
apoptosis en el que las señales de la proliferación celular exceden
inapropiadamente las señales de muerte celular. Además, algunos
virus ADN, tales como el virus Epstein-Barr, el
virus de la fiebre porcina africana y los adenovirus, parasitan la
maquinaria celular del huésped para llevar a cabo su propia
replicación. Simultáneamente, modulan la apoptosis para reprimir la
muerte celular y permitir que la célula diana reproduzca el virus.
Además, determinadas condiciones de enfermedad, tales como las
condiciones linfoproliferativas, el cáncer, incluyendo el cáncer
resistente a fármacos, la artritis, la inflamación, las
enfermedades autoinmunológicas y similares, pueden resultar de una
regulación negativa de la regulación de la muerte celular. En este
tipo de condiciones de enfermedad resultaría deseable estimular los
mecanismos apoptóticos.
La invención incluye un polipéptido
galectina-1 multimérico estable (denominado en la
presente invención "compuesto terapéutico") para el uso
médico.
Una cantidad eficaz de un compuesto terapéutico
preferentemente se encuentra comprendida entre aproximadamente 0,1
mg/kg y aproximadamente 150 mg/kg. Las dosis eficaces varían, según
reconocerá el experto en la materia, dependiendo de la vía de
administración, el uso de excipientes y la coadministración con
otros tratamientos terapéuticos, incluyendo la utilización de otros
agentes antiinflamatorios o agentes terapéuticos para tratar,
prevenir o aliviar un síntoma de un trastorno inflamatorio
particular. Se lleva a cabo un régimen terapéutico a partir de la
identificación de un mamífero, por ejemplo un ser humano, que sufre
un trastorno inflamatorio (o presenta el riesgo de desarrollarlo),
utilizando métodos estándares.
El compuesto farmacéutico se administra a dicho
individuo utilizando métodos conocidos de la técnica.
Preferentemente el compuesto se administra por vía oral, rectal,
nasal, tópica o parenteral, por ejemplo subcutáneamente,
intraperitonealmente, intramuscularmente e intravenosamente. El
compuesto se administra profilácticamente, o tras la detección de
un suceso inflamatorio, tal como un ataque de asma o una reacción
alérgica. El compuesto opcionalmente se formula como componente de
una combinación de fármacos terapéuticos para tratar trastornos
inflamatorios. Entre los ejemplos de formulaciones adecuadas para la
administración parenteral se incluyen soluciones acuosas del agente
activo en una solución salina isotónica, en una solución de glucosa
al 5% o en otro excipiente estándar farmacéuticamente aceptable.
Los agentes solubilizantes estándares, tales como PVP o
ciclodextrinas, también se utilizan como excipientes farmacéuticos
para la administración de los compuestos terapéuticos.
Los compuestos terapéuticos indicados en la
presente invención se formulan en composiciones para otras vías de
administración mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se
formula un polipéptido galectina multimérico en una cápsula o una
tableta para la administración oral. Las cápsulas pueden contener
cualquier material estándar farmacéuticamente aceptable, tal como
gelatina o celulosa. Las tabletas pueden formularse según
procedimientos convencionales mediante la compresión de mezclas de
un compuesto terapéutico con un portador sólido y un lubricante.
Entre los ejemplos de portadores sólidos se incluyen almidón y
bentonita sacárida. El compuesto se administra en forma de una
tableta de cubierta dura o de una cápsula que contiene un ligante,
por ejemplo lactosa o manitol, un relleno convencional y un agente
de tableteo. Entre otras formulaciones se incluyen una pomada, un
supositorio, una pasta, un pulverizador, un parche, una crema, un
gel, una esponja reabsorbible o una espuma. Dichas formulaciones se
producen mediante métodos bien conocidos de la técnica.
Los compuestos terapéuticos resultan eficaces al
entrar en contacto directo el compuesto con el tejido afectado. Por
consiguiente, el compuesto se administra tópicamente. Por ejemplo,
para tratar la dermatitis por contacto, el compuesto se aplica en
el área de piel afectada. Alternativamente, los compuestos
terapéuticos se administran sistémicamente. Además, los compuestos
se administran mediante la implantación (directamente en un órgano
tal como el intestino o el hígado, o subcutáneamente) de una matriz
sólida o reabsorbible que libera lentamente el compuesto en tejidos
contiguos y circundantes del sujeto.
Por ejemplo, para el tratamiento de los
trastornos inflamatorios gastrointestinales, el compuesto se
administra sistémicamente o localmente directamente en el tejido
gástrico. Par ala administración sistémica, el compuesto se
administra por vía intravenosa, rectal u oral. Para la
administración local, se pone en contacto directo con el tejido
gástrico una oblea o esponja reabsorbible impregnada con el
compuesto. El compuesto o mezcla de compuestos se liberan
lentamente in vivo mediante difusión del fármaco a partir de
la oblea y por la erosión de la matriz de polímero.
La inflamación del hígado (es decir, la
hepatitis) se trata, por ejemplo, mediante la infusión en la
vasculatura hepática de una solución que contiene el compuesto. La
infusión o lavado intraperitoneal resulta útil para reducir la
inflamación intraperitoneal generalizada o para prevenir la
inflamación posteriores a una operación quirúrgica.
Para el tratamiento de la inflamación
neurológica, el compuesto se administra por vía intravenosa o
intratecal (es decir, mediante infusión directa en el líquido
cerebroespinal). Para la administración local, se pone en contacto
directo con el tejido del SNC una oblea o esponja reabsorbible
impregnada con el compuesto. El compuesto o mezcla de compuestos se
liberan lentamente in vivo mediante difusión del fármaco a
partir de la oblea y por la erosión de la matriz de polímero.
Alternativamente, el compuesto se infusiona en el cerebro o en el
líquido cerebroespinal mediante métodos conocidos. Por ejemplo, un
anillo de catéter en un orificio de trépano para la utilización
como puerto de inyección se sitúa para que se fije al cráneo en el
orificio de trépano perforado en el cráneo. Se accede a un
reservorio de fluido conectado al catéter mediante una aguja o
estilete insertado a través de un septo situado en la parte superior
del anillo del orificio de trépano. Un conjunto de catéter (por
ejemplo un conjunto descrito en la patente US nº 5.954.687)
proporciona un paso de flujo de fluido adecuado para la
transferencia de fluidos hacia o desde la localización deseada en,
cerca o dentro del cerebro, para permitir la administración del
fármaco durante un periodo de tiempo.
Para el tratamiento de la inflamación cardiaca,
el compuesto se administra por ejemplo en el tejido cardiaco (es
decir, el miocardio, el pericardio o el endocardio) mediante
inyección intracoronaria directa a través de la pared torácica o
utilizando métodos basados en un catéter percutáneo estándar con
guía fluoroscópica para la inyección directa en un tejido, tal como
el miocardio, o la infusión de un inhibidor a partir de un stent o
catéter que se inserta en un lumen corporal. Para administrar el
compuesto se utiliza cualquiera de entre una diversidad de
catéteres coronarios , o un catéter de perfusión. Alternativamente
se recubre o se impregna con el compuesto un stent que se coloca en
un vaso coronario.
La inflamación pulmonar se trata, por ejemplo,
mediante la administración del compuesto mediante inhalación. Los
compuestos se administran en forma de una pulverización de aerosol a
partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un
propelente adecuado, por ejemplo un gas, tal como dióxido de
carbono, o de un nebulizador.
A continuación se ilustra la invención mediante
los ejemplos no limitativos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de cultivo utilizado durante los
experimentos fue RPMI 1640 suplementado con
L-glutamina 2 mM, FCS al 10% inactivado por calor,
100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. En
experimentos de cultivo con la proteína
galectina-1, el medio de cultivo se suplementó
adicionalmente con DTT 1,2 mM.
Se preparó proteína galectina-1
humana recombinante de la manera siguiente. Se amplificó ADN de
LGALS1 humano a partir de ADNc de sangre humana, utilizando
cebadores que contenían el sitio de restricción NdeI o BamHI
(GAL-1F:
5'-ggcatatggcttgtggtctggtcg-3' (SEC
ID nº 3), GAL-1R:
5'-ggggatcctcatcagtcaaaggcc-3' (SEC
ID nº 4)). Tras la amplificación, el producto de PCR se digirió y
se ligó en los sitios NdeI y BamHI del vector plásmido pET15b
(Novagen, Madison, USA). La mezcla de ligación se transformó en
células de Escherichia coli (E. coli) JM101 siguiendo
las instrucciones del fabricante. El plásmido de ADN procedente de
un clon que contenía una inserción del tamaño esperado según se
determinó mediante análisis de restricción se aisló, se secuenció y
se transformó en células de E. coli competentes para BL21
Star (DE3) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Para la construcción de homodímeros estables de
galectina-1, los presentes inventores decidieron
utilizar un constructo basado en una cremallera de leucinas FOS.
Entre la cremallera de leucinas FOS y la galectina-1
se introdujo una región bisagra que funcionaba como línker
flexible. La cremallera de leucinas FOS se encontraba flanqueada
por los aminoácidos CGG y GGC en los extremos
N-terminal y C-terminal,
respectivamente, para unir covalentemente las cremalleras mediante
enlaces disulfuro entre los residuos cisteína (ver anteriormente,
SEC ID nº 1).
Para la producción de
galectina-1, las células transfectadas de E.
coli se cultivaron en medio 2xTY que contenía ampicilina en un
incubador bajo agitación a 37ºC hasta alcanzar una
DO_{600}\sim0,8-1,0. Se añadió IPTG (1 mM) y se
indujo la producción de galectina-1 durante 3 horas.
Se recogieron las células (15 minutos a 7.500xg a 4ºC), se lisaron
con tampón de extracción que contenía 1 mg/ml de lisozima y se
sonicaron extensivamente. Se centrifugó el lisado y se purificó la
proteína galectina-1 recombinante que contenía una
etiqueta His, utilizando perlas TALON (Clontech, Becton Dickinson
Biosciences, Heidelberg, Alemania) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se almacenó la proteína galectina-1 en
tampón que contenía Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, glicerol al
10% a -80ºC, y se utilizó en todos los experimentos de cultivo en
medio RPMI suplementado con DTT 1,2 mM. La proteína
galectina-1 humana recombinante se sometió a ensayo
rutinario para micoplasmas y endotoxinas y estos ensayos fueron
consistentemente negativos.
Se aisló el ARN total de pellets celulares o de
secciones congeladas de tejido utilizando los kits Absolutely RNA
RT-PCR o Microprep (Stratagene, La Jolla, CA)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transcribieron
inversamente 1 a 3 \mug de ARN en volumen de 20 \mul utilizando
hexámeros aleatorios (300 ng) y transcriptasa inversa Superscript
II (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó
a cabo PCR en 60 \mul con 1 unidad de ADN polimerasa Taq
(Amersham Pharmacia Biotech), el tampón de reacción proporcionado
por el fabricante y 1 \mul de ADNc. La PCR consistía de 20 a 40
ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 30 s a 72ºC. La etapa de
extensión final consistía de 7 minutos a 72ºC. Se analizaron
muestras de PCR en un gel de 1,5% de agarosa tras un número
creciente de ciclos de PCR. El cebador utilizado fue: LGALS1F
5'-cttgtggtctggtcgcca-3' (SEC ID nº
5), LGALS1R
5'-tcgaaggtgatgcacacctc-3' (SEC ID
nº 6); GAPDHF
5'-ccatcactgccactcagaagact-3' (SEC
ID nº 7), GAPDH R
5'-ttactccttggaggccatgtagg-3' (SEC
ID nº 8). Se utilizó GAPDH como control de la carga de ARN.
En cada experimento, se incluyeron controles positivos y negativos.
Se prepararon imágenes utilizando el programa Geldoc
(Bio-Rad, Veenendall, Países Bajos) y en cada caso
se muestran imágenes invertidas.
Los cebadores (Invitrogen, Paisley, Reino Unido)
y sondas (Eurogentec, Seraing, Bélgica) utilizados para el análisis
de PCR en tiempo real se desarrollaron utilizando software de diseño
de cebadores. Los cebadores (5' a 3') utilizados fueron:
IL-10F
5'-atgaaggatcagctggacaactt-3' (SEC
ID nº 9), IL-10R
5'-ccttgatgtctgggtcttggt-3' (SEC ID
nº 10), IFN-\gammaF
5'-gaaacgagatgacttcgaaaagc-3' (SEC
ID nº 11), IFN-\gamma R
5'-cgacctcgaaacagcatctg-3' (SEC ID
nº 12), HPRTF
5'-ggcagtataatccaaagatggtcaa-3' (SEC
ID nº 13), HPRT R
5'-gtctggcttatatccaacacttcgt-3'
(SEC ID nº 14). Las secuencias de las sondas marcadas en 5' con el
pigmento informador FAM y en 3' con las moléculas de pigmento
aceptor ("quencher") fueron: IL-10
5'-acctgggttgccaagccttgtctg-3',
IFN-\gamma
5'-CCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCC-3',
HPRT
5'-caagcttgctggtgaaaaggacccc-3' (SEC
ID nº 15). Se llevaron a cabo reacciones en placas de 384 pocillos
(Applied Biosystems, Países Bajos) en un volumen de 20 \mul que
contenía mezcla madre de PCR en tiempo real (Eurogentec), 900 nM de
cada cebador y 200 nM de una sonda individual. Se llevaron a cabo
amplificaciones por PCR utilizando el sistema de detección de
secuencias ABI prism 7900HT (Applied Biosystems). Se utilizaron
condiciones de ciclado estándares, incluyendo una etapa de
preamplificación de 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10
minutos, seguido de una amplificación de 45 ciclos de 95ºC durante
15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Todas las muestras se
analizaron por triplicado. Se calcularon los valores umbral de
ciclo medios (Ct) y las desviaciones estándar (SD) para los genes de
citoquina y de control interno ("housekeeping")
(\DeltaCt=Ct_{gen} - Ct_{HPRT}) y se calcularon las SD de
\DeltaCt(SD(\DeltaCt)),
(SD(\DeltaCt)=\surd((SD_{gen})^{2}+(SD_{HPRT})^{2}).
Se midió la cantidad relativa de citoquinas mediante la
determinación de
\Delta\DeltaCt(\Delta\DeltaCt=\DeltaCt_{muestra \
de \ ensayo} - \DeltaCt_{calibrador}) y se calculó el factor
de diferencia (2^{-\Delta\Delta Ct}). Se proporciona el intervalo
como 2^{-(\Delta\Delta Ct+SD\Delta Ct)} y 2^{-(\Delta\Delta
Ct-SD\Delta Ct)}.
Se seleccionó material de injertación renal de
pacientes con rechazo crónico (n=8) y agudo (n=7) del banco de
tejidos del Department of Pathology (Groningen, Países Bajos) (21).
Se obtuvo tejido de control de la parte no afectada de riñones
nefrectomizados de pacientes que presentaban carcinoma de células
renales (n=4) y de riñones de donante no utilizados (n=2).
Se llevó a cabo inmunohistoquímica según
procedimientos estándares en secciones de tejido de 4 \mum
incluidas en parafina utilizando un anticuerpo monoclonal contra
galectina-1 (cln 25C1, Novocastra, Newcastle upon
Tyne, Reino Unido).
Se obtuvieron células mononucleares sanguíneas
periféricas (PBMC) de voluntarios sanos y se utilizaron directamente
para los experimentos de galectina-1 o se
utilizaron para el aislamiento de células CD4^{+} y CD8^{+}. Se
aislaron linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} mediante tinción con
anticuerpos marcados con fluorocromo contra CD3
(anti-CD3-CyQ), CD4
(anti-CD4-F) y CD8
(anti-CD8-PE) (IQP, Groningen,
Países Bajos) y las células se separaron en el citómetro MoFlo
(Cytomation, Fort Collins, CO). Las PBMC y las células T separadas
se estimularon durante 24 horas (1x10^{6} células/ml) con
anti-CD3 (10 ng/ml) o anti-CD3 más
anti-CD28, con o sin concentraciones diferentes de
proteína galectina-1 o con proteína
galectina-1 sola. Para los ensayos de inhibición, se
preincubó proteína galectina-1 durante 30 minutos a
temperatura ambiente con lactona 0,1 M o con suero policlonal
anti-galectina-1 de conejo (IQP,
Groningen, Países Bajos) antes de la adición a las células. Se
determinaron las producciones de proteína IL-10 e
IFN-\gamma en sobrenadantes de cultivo libres de
células recogidos tras la estimulación durante 24 horas utilizando
ELISA (R&D Systems, Oxon, Reino Unido) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se analizaron múltiples donantes para
confirmar los resultados.
Alternativamente, se obtuvieron células
mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de voluntarios sanos y
se aislaron células mediante centrifugación
Ficoll-Hypaque. Las PBMC aisladas se estimularon
durante 6 ó 24 horas en presencia o en ausencia de proteína
galectina-1, con o sin activación con \alphaCD3.
Para los ensayos de inhibición, se preincubó proteína
galectina-1 durante 30 minutos a temperatura
ambiente con lactosa 0,1 M antes de la adición de las células. Se
determinaron las producciones de proteínas IL-10 e
IL-1\beta en sobrenadantes de cultivo libres de
células tras estimular durante 24 horas, utilizando kits ELISA
disponibles comercialmente (R&D Systems, Oxon, Reino Unido)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo una
ELISA multiplex para 6 citoquinas (IFN-\gamma,
IL-1\beta, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-10,
IL-12 e IL-13) siguiendo las
instrucciones del fabricante (Biosource, Etten-Leur,
Países Bajos). Se utilizó el ensayo de rangos con signo de Wilcoxon
para determinar la significancia de las diferencias.
Se midió la apoptosis utilizando el kit de
detección de fosfatidilserina (IQP, Groningen, Países Bajos). Se
cultivaron células T MOLT-4 durante 3 horas a 37ºC
(1x10^{6}/ml en RPMI/FCS al 10%/DTT 1,2 mM) en presencia o en
ausencia de proteína galectina-1. A continuación, se
ajustaron las células a lactosa 0,1 M/PBS y se agitaron suavemente
durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar la
galectina-1 de la membrana celular. Las células se
lavaron con PBS y se resuspendieron en 110 \mul de tampón de
calcio (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, pH 7,4) que
contenía 2,5 \mul de anexina V-FITC. Las células
se incubaron durante 20 minutos sobre hielo y se lavaron una vez
con tampón de calcio. Las células se suspendieron en 160 \mul de
tampón de calcio que contenía 1 \mul de yoduro de propidio (PI),
se incubaron durante 10 minutos sobre hielo y se analizaron
inmediatamente mediante citometría de flujo. Para cada muestra se
analizaron 10.000 sucesos en un citómetro de flujo Coulter
Epics-Elite (Coulter Corporation, Hialeah, FL, USA).
Los datos se analizaron utilizando el programa WinList 4.0 (Verity
Software House Inc., Topsham, ME, USA).
Se obtuvieron biopsias según procedimientos
estándares del colon de un paciente con colitis en 2 localizaciones
diferentes (control (no inflamado) y tejido inflamado). Las biopsias
se incubaron en medio de cultivo y se incubaron durante 8 horas a
37ºC con (0,5 y 2,5 \muM) o sin proteína
galectina-1 estable. Las biopsias se congelaron
instantáneamente en nitrógeno líquido tras 8 horas y se almacenaron
a -80ºC. Se utilizaron secciones congeladas para aislar ARN para
medir los niveles de IL-10 mediante
qRT-PCR, y para inmunohistología para células T
(CD3) y receptor IL2 (activación de células T) según procedimientos
estándares. Se midió la apoptosis mediante el método TUNEL
siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics,
Almere, Países Bajos).
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Para estudiar los efectos inmunomoduladores de
la galectina-1, se produjo
galectina-1 recombinante en E. coli y se
utilizó en experimentos in vitro. La
galectina-1 existe en un equilibrio reversible de
monómero-dímero y, basándose en la constante de
disociación, de 7 \muM [6], la proteína se encuentra
predominantemente presente en forma de un monómero a una
concentración <7 \muM, o en forma de un dímero a
concentraciones >7 \muM. Debido a que es conocido que la forma
de la proteína resulta importante para su función, se estudió el
efecto de diferentes concentraciones de proteína
galectina-1 sobre la producción de diferentes
citoquinas. En cultivos de PBMCs totales, el tratamiento de
galectina-1 causó una regulación negativa
dosis-dependiente de la producción de
IFN-\gamma inducida por \alphaCD3 (figura 1A).
La regulación negativa más fuerte de la producción de
IFN-\gamma se observó utilizando las
concentraciones más altas de galectina-1, que
contiene la concentración más alta de proteína dimérica. Aparte de
la regulación negativa de IFN-\gamma, se observó
un incremento marcado y dependiente de la dosis de la producción de
IL-10 al cultivar las PBMCs en presencia de
concentraciones altas de proteína galectina-1
(figura 1B). Esta producción de IL-10 inducida por
galectina-1 pudo inhibirse mediante la
preincubación con lactosa o con anticuerpos
anti-galectina-1 (policlonal de
conejo, IQP), con niveles de inhibición de 62% y 41%,
respectivamente (figura 1C).
La galectina-1 puede unirse a
diversas glucoproteínas de superficie de las células T, tales como
CD2, CD3, CD7, CD45 y CD43 [3-5,21]. Para estudiar
si subconjuntos específicos de células T eran responsables de la
producción de la IL-10 tras el tratamiento de
galectina-1, se estimularon células T CD4^{+} y
CD8^{+} separadas mediante FACS procedentes de cinco donantes
independientes con anticuerpos \alphaCD3/\alphaCD28, con
\alphaCD3/\alphaCD28 en combinación con 20 \muM de proteína
galectina-1, o con galectina-1 (20
\muM) sola. Tal como se muestra en la figura 1D, las células T
CD4^{+} y CD8^{+} indujeron fuertemente la producción de
IL-10 tras la estimulación con
\alphaCD3/\alphaCD28 en combinación con la forma dimérica (20
\muM) de la proteína galectina-1. No se detectó
IL-10 en células T CD4^{+} y CD8^{+} no
activadas (no mostradas), mientras que la incubación de las células
con galectina-1 sola también resultó en la
regulación positiva de la producción de IL-10
(figura 1D y Tabla 2). En general, la producción de
IL-10 inducida por galectina-1 fue
menor en células no activadas que en células activadas por
\alphaCD3/\alphaCD28, aunque no significativamente. En los
linfocitos T CD8^{+}, el tratamiento con
galectina-1 también resultó en la regulación
positiva de la proteína IL-10, aunque los niveles
eran inferiores que en los linfocitos T CD4^{+}. El análisis de la
producción de IL-10 inducida por
galectina-1 en células T CD4^{+}/CD25^{+}
separadas reveló que estas células únicamente explicaban 0,15% de
la producción de IL-10 observada en las PBMCs
totales.
Aparte de la regulación positiva consistente de
IL-10 tras el tratamiento con
galectina-1 dimérica, la producción de
IFN-\gamma resultó regulada negativamente en
subconjuntos de células T CD4^{+} y CD8^{+} tras la
estimulación con \alphaCD3/\alphaCD28 en presencia de
concentraciones elevadas de galectina-1 en
comparación con la estimulación con únicamente
\alphaCD3/\alphaCD28 (p=0,043, figura 1E). La reducción media de
la producción de IFN-\gamma fue de 36% en células
T CD4^{+} y de 49% en las células T CD8^{+}.
Debido a que el tratamiento de
galectina-1 sola resultó en la regulación positiva
de la producción de IL-10, se investigó la
expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 mediante FACS.
Tal como se muestra en la figura 1F, el tratamiento de
galectina-1 resultó en una fuerte reducción de los
leucocitos positivos para CD25 y CD69.
La Tabla 3 resume los resultados obtenidos para
los niveles de ARNm de IL-10 e
IFN-\gamma para cinco donantes independientes. En
general, se observó la regulación positiva de los niveles de ARNm de
IL-10 y niveles variables de ARNm de
IFN-\gamma. El ARNm de IL-10
resultó regulado positivamente en células T tanto CD4^{+} como
CD8^{+} tras el tratamiento con galectina-1, lo
que es consistente con los resultados del ensayo ELISA. Los niveles
de ARNm de IFN-\gamma fueron similares o
resultaron regulados negativamente en células T CD4^{+} y fueron
similares o resultaron regulados positivamente en células T
CD8^{+}. Las inconsistencias entre la proteína
IFN-\gamma y los niveles de ARN (Tablas 2 y 3)
pueden ser causadas por la medición de proteína y ARNm en el mismo
punto temporal.
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Durante el rechazo del aloinjerto, las
respuestas de células T desempeñan un papel importante. Para someter
a ensayo que LGALS1 desempeña un papel en la regulación de la
respuesta inmunológica durante el rechazo del aloinjerto, los
presentes inventores sometieron a ensayo la expresión de LGALS1 en
muestras de rechazo agudo y crónico del aloinjerto renal. En todos
los riñones de control excepto en uno la expresión del ARNm de
LGALS1 era muy débil o se encontraba ausente, mientras que en la
mayoría de los riñones con rechazo crónico o agudo del aloinjerto,
la expresión del ARNm de LGALS1 se encontraba altamente regulada
positivamente (figura 2). El ARNm de IL-10 se
encontraba presente en 3/8 casos de rechazo crónico y no en los
otros casos de rechazo del aloinjerto renal. Se observó la
expresión de ARNm de IFN-\gamma en tres casos con
rechazo crónico y se observó una señal débil en tres otros casos de
rechazo crónico. No se observó expresión de ARNm de
IFN-\gamma en los casos con rechazo agudo y en
los casos de riñón normal (figura 2). Sin embargo, la abundancia
relativa de ambas citoquinas era muy baja en comparación con los
niveles de ARNm de LGALS1 (figura 2B).
La tinción inmunohistoquímica para la
galectina-1 en muestras de riñón normal demostró que
la expresión se encontraba principalmente confinada a las células
epiteliales mesangiales glomerulares y a células de músculo liso de
vasos grandes (figuras 3A-3B). Ocasionalmente,
células en el intersticio mostraban tinción positiva para la
galectina-1 (figura 3C), mientras que en general no
se observó expresión en células endoteliales de riñones de control.
Durante el rechazo del aloinjerto, la expresión en células
epiteliales mesangiales glomerulares y en células de músculo liso
era similar a la de los riñones de control (no mostrados). Además,
la expresión de proteína galectina-1 presentaba una
regulación fuertemente positiva en células endoteliales de los
capilares peritubulares en el intersticio y en células endoteliales
de vasos grandes en regiones inflamadas (figuras
3D-F).
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Para someter a ensayo la eficiencia de la
inducción de IL-10 de los homodímeros estables de
galectina-1 (dGAL) en comparación con la proteína
galectina-1 de tipo salvaje (mGAL), los presentes
inventores incubaron PBMCs con diversas concentraciones de ambas
proteínas. La figura 5 demuestra que los dímeros estables de
galectina-1 pueden inducir la producción de
IL-10 en células activadas a una concentración hasta
100 veces inferior a la de la proteína galectina-1
de tipo salvaje. Se obtuvieron los mismos resultados con PBMCs en
reposo (resultados no mostrados). La preincubación de la proteína
galectina-1 con lactosa (inhibidor de la
galectina-1) en efecto resultó en niveles
fuertemente reducidos de producción de IL-10 (figura
6). Estos datos demuestran que los dímeros estables de
galectina-1 muestran una actividad incrementada en
100 veces en la inducción de la producción de
IL-10.
Para someter a ensayo la eficiencia de la
inducción de apoptosis de dímeros estables de
galectina-1 (dGAL) en comparación con proteína
galectina-1 de tipo salvaje (mGAL) los presentes
inventores trataron células T MOLT-4 con diversas
concentraciones comprendidas entre 0,1 y 20 \muM para mGAL y
concentraciones comprendidas entre 0,1 y 5 \muM para dGAL. La
figura 7 muestra que mGAL indujo apoptosis únicamente a la
concentración más alta, de 20 \muM, tal como demuestra el
porcentaje de células positivas para anexina V en comparación con
las células de control sin tratar. dGAL resultó 4 a 8 veces más
eficaz en la inducción de la apoptosis que mGAL. Estos datos
demuestran que los homodímeros estables de
galectina-1 también presentan una actividad
incrementada con respecto a la inducción de la apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de someter a ensayo el potencial de
los homodímeros estables de galectina-1 de
modulación de la producción de otras citoquinas, se llevó a cabo un
ensayo ELISA multiplex en células tratadas con
galectina-1 (24 horas) de 5 donantes independientes
para citoquinas que se ha informado que son moduladas por el
tratamiento de galectina-1. Estos análisis no
revelaron para dGAL cambios consistentes para
IFN-\gamma e IL-2 y la falta de
inducción de IL-4, IL-5,
IL-12 e IL-13. Estos resultados
fueron similares a los efectos observados con concentraciones altas
de tratamiento de mGAL. Para IL-10, se observó una
inducción fuerte en los cinco donantes (figura 8). El análisis de
los niveles de ARNm de IL-10 confirmó la inducción
de niveles elevados de ARNm de IL-10 a las tres
concentraciones de dGAL sometidas a ensayo (figura 9). Para
IL-1\beta se observó una fuerte inducción que
resultó más pronunciada a la concentración más alta de dGAL,
mientras que sólo se detectó una inducción débil a la concentración
de 20 mM de la proteína mGAL (figura 10). Esta inducción de
IL-1\beta se encontraba consistentemente presente
en los 5 donantes (figura 11). La preincubación con lactosa podría
bloquear eficientemente la inducción de la producción de
IL-1\beta (figura 12). Estos demuestran que puede
conseguirse una inducción más eficaz de IL-1\beta
con 0,2 mM de dGAL, en comparación con la concentración más alta de
mGAL (20 mM). Estos datos indican que los homodímeros estables de
galectina-1 son mucho más potentes que la proteína
galectina-1 de tipo salvaje.
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Se trataron ex vivo biopsias de un
paciente con IBD con dos concentraciones de dGAL. El efecto de la
galectina-1 sobre las biopsias de control no
inflamadas fue mínimo respecto a los niveles de ARNm de
IL-10 (figura 13), mientras que el efecto sobre el
tejido inflamado fue más pronunciado. Una observación notable fue
que el efecto de dGAL fue más pronunciado a la concentración más
baja, indicando que resulta esencial optimizar la concentración de
dGAL más eficaz.
La inmunohistoquímica no reveló cambios de la
cantidad de células T infiltrantes y su patrón de activación en las
biopsias tratadas y no tratadas (resultados no mostrados). La figura
11 muestra una imagen representativa de una tinción TUNEL en
biopsias de tejido inflamado tratado y no tratado. No se produjo
ningún incremento significativo de la cantidad de células
apoptóticas en las biopsias inflamadas tras la incubación con la
galectina-1 dimérica. En los tejidos de control no
se produjo ningún incremento de la cantidad de células apoptóticas
en comparación con los tejidos no tratados (resultados no
mostrados).
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Se determinó el efecto de diferentes
concentraciones de homodímero estable de galectina-1
intravenosa en ratones sanos (se utilizaron las mismas cepas de
ratón que para los modelos de enfermedad). Se analizaron la
composición y activación de suspensiones de células sanguíneas
periféricas y células de bazo para determinar el efecto del
tratamiento de galectina-1. Se utilizaron tres
sistemas modelo de ratón: los modelos de IBD, de soriasis y de
asma.
Para los tres modelos, se administraron
homodímeros estables de galectina-1 en dos puntos
temporales, es decir, durante la inducción de la enfermedad y al
presentarse los primeros síntomas de enfermedad establecida. En los
primeros experimentos animales, se administraron por vía intravenosa
dos concentraciones diferentes de galectina-1
estable. Se comparó la eficiencia del tratamiento con animales
tratados con solución salina y animales tratados con
IL-10. Esto reveló los efectos favorables
adicionales del tratamiento de galectina-1 en
comparación con el tratamiento de IL-10. Para
corroborar los efectos adicionales de los homodímeros estables de
galectina-1, se llevó a cabo el tratamiento de
galectina-1 con y sin anticuerpos neutralizadores
anti-IL-10. La comparación de estos
dos grupos de animales proporcionó información sobre los efectos de
la galectina-1 misma y sobre los efectos
secundarios inducidos por las grandes cantidades de
IL-10 presentes en el tejido afectado.
Los experimentos finales se centraron en la
comparación entre la administración intravenosa de homodímeros
estables de galectina-1 y la administración local de
homodímeros estables de galectina-1. Esto se
consiguió, para el modelo de IBD, con tabletas de
galectina-1 que se disuelven en el intestino
delgado; con crema de galectina-1 para el modelo de
soriasis; y con un aerosol de galectina-1 para el
modelo de asma. Nuevamente se administraron dos concentraciones
diferentes en dos puntos temporales diferentes para someter a ensayo
la eficiencia en los puntos temporales de inducción de la
enfermedad y de enfermedad establecida.
La transferencia adoptiva de células CD4^{+}
CD45RB^{hi} no expuestas a ratones inmunodeficientes condujo al
desarrollo de una enfermedad debilitante letal en los receptores,
con infiltración severa de leucocitos en el colon, acompañada de
hiperplasia epitelial marcada (Powrie). El tratamiento de los
ratones con células CD4^{+} CD45RB^{low} puede inhibir la
enfermedad e IL-10 desempeña un papel esencial en
este proceso (Asseman).
Se inyectaron por vía intravenosa (4x10^{5}
células por ratón) células de bazo CD4+ CD45RB^{hi} separadas
procedentes de ratones BALB/C en ratones C.B.-17 scid y se
evaluaron ratones regularmente para la pérdida de peso y condición
de las heces. Tres a cinco semanas después de la transferencia de
las células T, los ratones empezaron a perder peso y las heces
adquirieron una consistencia blanda. Tras 10 a 12 semanas habían
perdido 15% a 20% de su peso corporal y algunos animales debieron
sacrificarse debido a su mala condición. En el modelo de los
presentes inventores, los animales se sacrificaron a las 8 semanas.
Se midieron los colones y se llevó a cabo un estudio histológico
para evaluar el grado de la colitis y el efecto del tratamiento
(Leach). Se aislaron linfocitos de la lámina propia y se sometieron
a ensayo para la producción de citoquinas (IL-2,
IFN-\gamma, TNF-\alpha,
IL-4 e IL-10) en ensayos ELISA,
subpoblaciones mediante citometría de flujo, y ARNm para citoquinas
y factores de transcripción mediante PCR cuantitativa (Davenport).
Se utilizaron técnicas inmunohistológicas y moleculares para
evaluar el grado de apoptosis.
Se administró tratamiento de
galectina-1 diariamente desde el día 0 para someter
a ensayo la eficiencia de los homodímeros estables de
galectina-1 para evitar la enfermedad o, desde las 3
semanas, para someter a ensayo la eficiencia del tratamiento de
homodímero de galectina-1 para reducir los síntomas
de la enfermedad establecida.
El modelo de IBD puede expandirse a un modelo de
soriasis si el día 1 después de la transferencia de células T, los
ratones reciben inyecciones de enterotoxina B estafilocócica
(Davenport). Éste es un modelo animal de soriasis de tipo Th1
comparable a las células T de tipo Th1 que se encuentran en los
pacientes de soriasis (Schlaak).
Se inyectaron en ratones C.B.-17 scid por
vía intravenosa células de bazo CD4^{+}CD45RBhi separadas
(4x10^{5} células por ratón) procedentes de ratones BALB/C. Tras 1
día, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales con 10
\mug de enterotoxina B estafilocócica. Se evaluaron los ratones
para la presencia y severidad de las lesiones en la piel, además
del peso y las heces. Las lesiones en la piel empezaron a
desarrollarse tras 3 a 4 semanas, y tras 7 semanas los ratones
presentaban un 100% de incidencia de lesiones en la piel. Tras 8
semanas, se sacrificaron los animales y se llevaron a cabo estudios
histológicos. Se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico para
detectar células apoptóticas y otros cambios en el tejido afectado.
Se aislaron linfocitos que infiltraban la piel mediante digestión
enzimática. Los linfocitos aislados se estimularon in vitro
y se midieron las producciones de citoquinas (IL-2,
IFN-\gamma, TNF-\alpha,
IL-4 e IL-10) (Davenport).
El tratamiento de galectina-1 se
proporcionó el día 0 para someter a ensayo la eficiencia de los
homodímeros estables de galectina-1 para prevenir
la enfermedad, y tras 3 semanas, para someter a ensayo la eficiencia
del tratamiento de homodímero de galectina-1 para
reducir los síntomas de la enfermedad establecida.
Se estudiaron los efectos in vivo del
tratamiento de galectina-1 en un modelo de ratón en
el que se han descrito efectos de regulación negativa de la
IL-10 endógena sobre la inflamación alérgica de las
vías respiratorias (mr Stampfli, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,
1999). Se indujo asma en ratones Balb/c hembra, de 8 a 10 semanas
de edad, mediante la exposición diaria a ovoalbúmina aerosolizada
(al 1% p/v en solución salina al 0,9%) durante 20 minutos durante
un periodo de 10 días consecutivos. A modo de control se utilizó
solución salina tamponada con fosfato (PBS). El aerosol se
administró en una cámara de exposición de pérspex (9 litros) con un
"nebulizador De Vilbiss" (tipo 646, De Vilbiss, Somerset, PA,
USA) controlado por un flujo de aire de 8 litros/min, proporcionando
aerosol con una salida de 0,33 ml/minuto.
Veinticuatro horas después del último aerosol,
se evaluó la obstrucción aguda de las vías respiratorias tras el
aerosol OVA o PBS y la hipersensibilidad de las vías respiratorias a
la metacolina, en animales conscientes con respiración espontánea,
utilizando un sistema pletismográfico de cuerpo completo (Buxco
Electronics, Petersfield, Reino Unido). Veinticuatro horas después
de la evaluación de la hiperreactividad bronquial y la obstrucción
de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina, se sacrificaron
los ratones. Se utilizó el líquido de lavado broncoalveolar para la
evaluación de las citoquinas (IL-4,
IL-5, IL-10 e IL-13)
y se aislaron del tejido pulmonar las células inflamatorias
infiltrantes para determinar la inflamación de las vías
respiratorias mediante citometría de flujo (células T, células B,
neutrófilos, eosinófilos y macrófagos). Además, se sacrificó un
grupo de ratones para el análisis inmunohistoquímico de la
inflamación de las vías respiratorias en el pulmón. Se evaluó el
porcentaje de células apoptóticas en el tejido pulmonar. Durante el
procedimiento de inducción de asma, se administró suero los días 0,
5 y 11 para la determinación de los niveles de IgE específicos para
OVA o totales séricos.
Se administró tratamiento de
galectina-1 el día 0 para someter a ensayo la
eficiencia de los homodímeros estables de
galectina-1 para prevenir la enfermedad, y el día 4
para someter a ensayo la eficiencia del tratamiento de homodímero
de galectina-1 para reducir los síntomas de la
enfermedad establecida. La eficiencia del tratamiento de
galectina-1 se basa en la reducción de la
obstrucción aguda de las vías respiratorias, de la hiperreactividad
bronquial y de los niveles séricos de IgE. Además, los presentes
inventores estudiaron la inducción de la producción de
IL-10 en las células infiltrantes y el porcentaje de
células apoptóticas en el tejido afectado.
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Otras realizaciones se encuentran comprendidas
en las reivindicaciones siguientes.
Claims (32)
1. Método ex vivo para inducir la
producción de IL-10 en una célula, que comprende
poner en contacto dicha célula con una composición que comprende un
polipéptido galectina-1 multimérico, en el que dicha
célula es un linfocito, una célula dendrítica, un monocito o un
macrófago.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido galectina-1 es un dímero.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho dímero es estable.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido galectina-1 es un dímero estable a
una concentración inferior a 7 \muM.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha célula es una célula T, una célula B o un monocito.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicha célula T es CD4 y CD8 positiva.
7. Método según la reivindicación 5, en el que
dicha célula T es una célula T activada o una célula T no
activada.
8. Método según la reivindicación 5, en el que
dicho polipéptido galectina-1 induce la producción
de IL-10 a una concentración inferior a la de la
galectina de tipo salvaje.
9. Polipéptido galectina-1
multimérico estable que no se disocia en monómeros a una
concentración inferior a 7 \muM.
10. Polipéptido galectina-1
según la reivindicación 9, en el que el polipéptido es un
dímero.
11. Polipéptido galectina-1
según la reivindicación 9 ó 10 para la utilización como
medicamento.
12. Utilización del polipéptido
galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la
preparación de un medicamento para prevenir o aliviar un síntoma de
un trastorno de tipo inmunológico.
13. Utilización según la reivindicación 12, en
la que dicho trastorno de tipo inmunológico es una enfermedad
intestinal inflamatoria, una enfermedad autoinmunológica, alergias
alimentarias o asma.
14. Utilización según la reivindicación 13, en
la que dicha enfermedad intestinal inflamatoria es la enfermedad de
Crohn o la colitis ulcerosa.
15. Utilización según la reivindicación 13, en
la que dicha enfermedad autoinmunológica es la esclerosis múltiple,
la diabetes, la artritis reumatoide o el lupus eritematoso
sistémico.
16. Utilización del polipéptido
galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la
preparación de un medicamento para reducir la inflamación de un
tejido.
17. Utilización según la reivindicación 16, en
la que dicha inflamación es crónica o aguda.
18. Utilización según la reivindicación 16, en
la que dicho tejido es tejido pulmonar, tejido hepático, tejido
intestinal, tejido pancreático, tejido linfoide o tejido
dérmico.
19. Utilización según la reivindicación 16, en
la que dicho tejido intestinal es tejido intestinal epitelial.
20. Utilización según la reivindicación 16, en
la que dicha inflamación es inflamación esquelética, inflamación
gastrointestinal, inflamación cardiovascular, inflamación pulmonar o
inflamación neurológica.
21. Utilización según la reivindicación 20, en
la que dicha inflamación gastrointestinal es colitis.
22. Utilización del polipéptido
galectina-1 según la reivindicación 9 ó 10 para la
preparación de un medicamento para incrementar la supervivencia del
aloinjerto.
23. Utilización según la reivindicación 22, en
la que dicho medicamento se administra antes, simultáneamente o
después de que un sujeto reciba un trasplante.
24. Utilización según la reivindicación 22, en
la que dicho medicamento se administra durante un periodo
preseleccionado de tiempo.
25. Utilización según la reivindicación 24, en
la que dicho periodo preseleccionado de tiempo es de entre
aproximadamente 1 y 2 semanas.
26. Utilización según la reivindicación 22, en
la que dicho medicamento está destinado a ponerse en contacto con
un órgano antes del trasplante con el fin de incrementar la
supervivencia del aloinjerto.
27. Composición de vacuna purificada que
comprende el polipéptido galectina-1 según la
reivindicación 9 ó 10 y un antígeno.
28. Vacuna que comprende una primera composición
que comprende el polipéptido galectina-1 según la
reivindicación 9 ó 10, y una segunda composición que comprende un
antígeno.
29. Utilización de la vacuna según la
reivindicación 28 en la preparación de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o de
cáncer.
30. Utilización según la reivindicación 29, en
la que dicha primera composición se administra conjuntamente con
dicha segunda composición.
31. Utilización según la reivindicación 29, en
la que dicha primera composición se administra antes que dicha
segunda composición.
32. Utilización según la reivindicación 29, en
la que dicha primera composición se administra después de dicha
segunda composición.
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