ES2335668T3 - Vacuna de sub-unidad de lawsonia intracellularis. - Google Patents
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Abstract
Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis inmunogénica o una parte de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 90%, preferiblemente el 92%, más preferiblemente el 94% y aún más preferiblemente el 96% con la secuencia de ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1
Description
Vacuna de sub-unidad de
Lawsonia intracellularis.
La presente invención se refiere, entre otros, a
secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de Lawsonia
intracellularis novedosas, a fragmentos de ADN, moléculas de ADN
recombinante y portadores recombinantes vivos que comprenden estas
secuencias, a células hospedadoras que comprenden tales secuencias
de ácido nucleico, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante
y portadores recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas
secuencias de nucleótidos y a su uso para la preparación de vacunas,
a vacunas para combatir infecciones por Lawsonia
intracellularis y métodos para la preparación de las mismas y a
ensayos de diagnóstico para la detección de ADN de Lawsonia
intracellularis, para la detección de antígenos de Lawsonia
intracellularis y para la detección de anticuerpos frente a
Lawsonia intracellularis.
La enteropatía proliferativa porcina (PPE o PE)
se ha vuelto una enfermedad importante de la industria porcina
moderna en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15% al 50% de las
piaras en crecimiento y hasta el 30% de los animales individuales
en piaras problema establecidas. Actualmente las pérdidas económicas
anuales se han estimado en US\textdollar 5-10 en
costes de alimentación y de mantenimiento adicionales por cerdo
afectado. PPE es un grupo de afecciones crónicas y agudas de signos
clínicos ampliamente diferentes (muerte, animales pálidos y
anémicos, diarrea acuosa, oscura o rojo brillante, depresión,
apetito reducido y renuencia a moverse, crecimiento retardado y FCR
aumentado). Sin embargo, existen dos características constantes. La
primera, un cambio patológico sólo visible a la necropsia, es un
engrosamiento de la mucosa del intestino delgado y el colon. La
segunda es la aparición de bacterias pequeñas curvas
intracitoplasmáticas en los enterocitos del intestino afectado.
Estas bacterias actualmente se han establecido como el agente
etiológico de PPE y se han denominado Lawsonia
intracellularis.
A través de los años se ha observado que
Lawsonia intracellularis afecta virtualmente a todos los
animales incluyendo monos, conejos, hurones, hámsteres, zorros,
caballos y otros animales tan diversos como avestruz y emú.
Lawsonia intracellularis es una bacteria gram negativa
flagelada que se multiplica sólo en enterocitos eucariota y no se
ha descrito cultivo libre de células. Para persistir y multiplicarse
en la célula, Lawsonia intracellularis tiene que penetrar
células de las criptas en división. La bacteria se asocia con la
membrana celular y rápidamente entra en el enterocito a través de
una vacuola de entrada. Después ésta se degrada rápidamente (en las
3 horas siguientes) y las bacterias crecen y se multiplican
libremente en el citoplasma. El mecanismo mediante el cual las
bacterias provocan que las células infectadas no maduren, continúen
experimentando la mitosis y formen células de las criptas
hipoplásicas aún no se comprende.
La compresión actual de la infección, el
tratamiento y el control de la enfermedad por Lawsonia
intracellularis ha estado impedida por el hecho de que
Lawsonia intracellularis no se puede cultivar en medios
libres de células. Aunque existen informes de
co-cultivo satisfactorio de Lawsonia
intracellularis en enterocitos de rata, esto no ha conducido al
desarrollo de vacunas inactivadas para combatir Lawsonia
intracellularis, aunque claramente existe una necesidad de
tales vacunas.
El documento EP 1 219 711 (cedido a AKZO NOBEL
NV) describe secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas
de membrana exterior de Lawsonia intracellularis y fragmentos
inmunogénicos para uso como vacunas frente a Lawsonia
intracellularis. El documento WO0226250 (cedido a la Universidad
de Arizona) describe vacunas frente a ileitis proliferativa que
contienen sub-unidades inmunogénicas protectoras de
Lawsonia intracellularis.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una vacuna novedosa para combatir la infección por
Lawsonia intracellularis.
Actualmente se ha observado de forma
sorprendente, que Lawsonia intracellularis produce una
proteína novedosa que es capaz de inducir inmunidad protectora
frente a Lawsonia intracellularis. Esta proteína se
denominará la proteína de 31,0 kD. Las secuencias de aminoácidos de
estas proteínas se presenta en el identificador de secuencia SEC ID
Nº: 2. El gen que codifica esta proteína se ha secuenciado y su
secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEC ID Nº: 1.
Otras proteínas encontradas se denominarán la
proteína de 24,8 kD, de 76,7 D, de 56,8 kD, de 28,8 kD y de 31,4
kD. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se presentan en
los identificadores de secuencia SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10 y 12. Los
genes que codifican estas proteínas se han secuenciado y su
secuencia de ácido nucleico se muestra en los identificadores de
secuencia SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9 y 11.
En la técnica se conoce que muchas secuencias de
ácido nucleico diferentes pueden codificar la misma proteína. Este
fenómeno se conoce comúnmente como titubeo en la segunda y
especialmente en la tercera base de cada triplete que codifica un
aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología
de aproximadamente el 30% para dos secuencias de ácido nucleico que
todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos secuencias
de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de
aproximadamente el 70% todavía pueden codificar la misma
proteína.
Por tanto, una realización se refiere a
secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de
Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de
ácido nucleico que codifican un fragmento inmunogénico de esa
proteína, donde esas secuencias de ácido nucleico o partes de las
mismas tienen un nivel de homología con la secuencia del ácido
nucleico de SEC ID Nº: 1 de al menos el 90%.
Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
que codifica esta proteína de Lawsonia intracellularis o la
parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene una homología de al
menos el 92%, preferiblemente el 94% y más preferiblemente el 95%
con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1. Un nivel de
homología del 98% o incluso del 100% es aún más preferido.
El nivel de homología de nucleótidos se puede
determinar con el programa informático "BLAST 2 SECUENCES"
seleccionando el sub-programa: "BLASTN" que se
puede encontrar en
www.ncbi.nlm.nih.gov/?blast/b12seq/b12.html.
Una referencia de este programa es Tatiana A.
Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:
247-250 (1999). Los parámetros usados son los
parámetros por defecto: Recompensa por una coincidencia: + 1.
Penalización por una falta de coincidencia: -2. Hueco abierto: 5.
Extensión de hueco: 2. disminución_x de Hueco 50.
Otro enfoque para decidir si determinada
secuencia de ácido nucleico es o no una secuencia de ácido nucleico
de acuerdo la invención se refiere a la cuestión de si esa
determinada secuencia de ácido nucleico se hibrida en condiciones
rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID Nº:
1.
Si una secuencia de ácido nucleico se hibrida en
condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos representada en
SEC ID Nº: 1, se considera que es una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la invención.
La definición de condiciones rigurosas se deduce
a partir de la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hybridization of
nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138:
267-284.)
Tm = [81,5ºC +
16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61(% formamida) -
500/L-1ºC/1% de falta de
coincidencia
En esta fórmula, M es molaridad de cationes
monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y
citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares de
bases.
Las condiciones rigurosas son aquellas
condiciones en las cuales las secuencias de ácido nucleico o
fragmentos de las mismas aún se hibridan, si tienen una falta de
coincidencia de un máximo del 10%, a la secuencia de ácido nucleico
representada en SEC ID Nº: 1.
Ya que la presente invención describe secuencias
de ácido nucleico que codifican proteínas de Lawsonia
intracellularis novedosas, actualmente es posible obtener por
primera vez estas proteínas en cantidades suficientes. Esto se
puede realizar, por ejemplo, usando sistemas de expresión para
expresar los genes que codifican las proteínas.
Por lo tanto, en una realización más preferida,
la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tales
fragmentos de ADN pueden ser, por ejemplo, plásmidos, en los que se
clona una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Tales fragmentos de ADN son, por ejemplo, útiles para potenciar la
cantidad de ADN para uso como un cebador, como se describe más
adelante.
Un requisito esencial para la expresión de la
secuencia de ácido nucleico es un promotor adecuado unido
funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico, de forma que la
secuencia de ácido nucleico esté bajo el control del promotor. Es
obvio para los especialistas en la técnica que la elección de un
promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o
viral capaz de dirigir la transcripción génica en células usadas
como células hospedadoras para expresión de proteína.
Por lo tanto, una forma aún más preferida de
esta realización se refiere a una molécula de ADN recombinante que
comprende un fragmento de ADN o una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la invención que se coloca bajo el control de un
promotor unido funcionalmente. Esto se puede obtener por medio de,
por ejemplo, técnicas de biología molecular convencionales.
(Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory
manual, 1989. ISBN
0-87969-309-6). Los
promotores unidos funcionalmente son promotores que son capaces de
controlar la transcripción de las secuencias de ácido nucleico a
las que los mismos están unidos.
Un promotor de este tipo puede ser un promotor
de Lawsonia, por ejemplo, el promotor implicado en la
expresión in vivo del gen que codifica la proteína de 31,0
kD, de 24,8 kD, de 76,7 D, de 56,8 kD, de 28,8 kD o de 31,4 kD, con
la condición de que ese promotor sea funcional en la célula usada
para la expresión. También puede ser un promotor heterólogo. Cuando
las células hospedadoras son bacterias, las secuencias de control de
expresión que se pueden usar incluyen el promotor y operador Trp
(Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); el
promotor y operador lac (Chang, et al., Nature, 275, 615,
1978), el promotor de proteína de membrana exterior (Nakamura, K. e
Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); los
promotores y operadores de bacteriófago lambda (Remaut, E. et
al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); el
promotor y operador de \alpha-amilasa (B.
subtilis), secuencias de terminación y otras secuencias de
potenciación y control de la expresión compatibles con la célula
hospedadora seleccionada.
Cuando la célula hospedadora es levadura, las
secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo,
factor de acoplamiento \alpha. Para células de insecto se pueden
usar los promotores de polihedrina o p10 de baculovirus (Smith, GE,
et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983).
Cuando la célula hospedadora es de origen mamífero las secuencias
de control de expresión útiles ilustrativas incluyen el promotor
SV-40 (Berman, P.W., et al., Science, 222,
524-527, 1983) o el promotor de metalotioneína
(Brinster, RL, Nature, 296, 39-42, 1982) o un
promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl..
Acad. Sci. EE.UU., 82, 4949-53, 1985).
Los sistemas de expresión de células
bacterianas, de levadura, fúngicas, de insecto y de mamífero son
sistemas usados con mucha frecuencia. Tales sistemas se conocen
bien en la técnica y generalmente están disponibles en el mercado,
por ejemplo, a través de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian
Way, Palo Alto, California 94303-4607, EE.UU. A
continuación de estos sistemas de expresión, los sistemas de
expresión basados en parásitos son sistemas de expresión muy
atractivos. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en la
Solicitud de Patente Francesa con Número de Publicación 2 714 074 y
en la Publicación US NTIS Nº US 08/043109 (Hoffman, S. y Rogers,
W.: Fecha de Publicación 1 de diciembre de 1993).
Una forma aún más preferida de esta realización
de la invención se refiere a un Portador Recombinante Vivo (LRC)
que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la
proteína de 31,0 kD o un fragmento inmunogénico de la misma de
acuerdo con la invención, un fragmento de ADN de acuerdo con la
invención o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la
invención. Tales portadores son, por ejemplo, bacterias y virus.
Estos LRC son micro-organismos o virus en los que
se ha clonado información genética adicional, en este caso una
secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de 31,0 kD o un
fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con la invención. Los
animales infectados con tales LRC producirán una respuesta inmune no
sólo frente a los inmunógenos del portador, sino también frente a
las partes inmunogénicas de la proteína o las proteínas para las
cuales el código genético se clona adicionalmente en el LRC, por
ejemplo, la proteína de 31,0 kD.
Como un ejemplo de LRC bacterianos, se pueden
usar de forma muy atractiva cepas de Salmonella atenuadas
conocidas en la técnica.
Los parásitos portadores recombinantes vivos se
han descrito, entre otros, por Vermeulen, A. N. (Int. Journ.
Parasitol. 28: 1121-1130 (1998)).
También, se pueden usar virus LRC como una forma
de transportar la secuencia de ácido nucleico a una célula diana.
Los virus portadores recombinantes vivos también se denominan virus
vectores. Los virus usados con frecuencia como vectores son virus
Vaccinia (Panicali et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 79: 4927 (1982)), Herpesvirus (E.P.A. 0473210A2) y
Retrovirus (Valerio, D. et al, en Baum, S. J., Dicke, K. A.,
Lotzova, E. y Pluznik, D H (Eds.), Experimental Haematology today -
1988. Springer Verlag, Nueva York, págs. 92-99
(1989)).
La técnica de recombinación homóloga in
vivo, bien conocida en el campo, se puede usar para introducir
una secuencia de ácido nucleico recombinante en el genoma de una
bacteria, parásito o virus de elección, capaz de inducir la
expresión de la secuencia de ácido nucleico insertada de acuerdo con
la invención en el animal hospedador.
Finalmente, otra forma de esta realización de la
invención se refiere a una célula hospedadora que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con
la invención, un fragmento de ADN que comprende una secuencia de
ácido nucleico de este tipo o una molécula de ADN recombinante que
comprende una secuencia de ácido nucleico de este tipo bajo el
control de un promotor unido funcionalmente. Esta forma también se
refiere a una célula hospedadora que contiene un portador
recombinante vivo que contiene una molécula de ácido nucleico que
codifica una proteína de 31,0 kD o un fragmento de la misma de
acuerdo con la invención.
Una célula hospedadora puede ser una célula de
origen bacteriano, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus
subtilis y especies de Lactobacillus, en combinación con
plásmidos basados en bacterias como pBR322 o vectores de expresión
bacteriana como pGEX o con bacteriófagos. La célula hospedadora
también puede ser de origen eucariota, por ejemplo, células de
levadura en combinación con moléculas de vector específicas de
levadura o células eucariotas superiores como células de insecto
(Luckow et al; Biotechnology 6: 47-55 (1988))
en combinación con vectores o baculovirus recombinantes, células de
plantas en combinación con, por ejemplo, vectores basados en
plásmido Ti o vectores virales de planta (Barton, KA, et al;
Cell 32: 1033 (1983), células de mamífero como células Hela,
células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de Riñón Felino
de Crandell, también con vectores o virus recombinantes
apropiados.
Otra realización de la invención se refiere a
las proteínas novedosas y a fragmentos inmunogénicos de las mismas
de acuerdo con la invención.
El concepto de fragmentos inmunogénicos se
definirá más adelante.
Una forma de esta realización se refiere, entre
otros, a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen
una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% homóloga a la
secuencia de aminoácidos representada en SEC ID Nº: 2 y a
fragmentos inmunogénicos de dicha proteína.
\newpage
En una forma preferida, la realización se
refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que
tienen una homología de secuencia de al menos el 92%,
preferiblemente el 94% y más preferiblemente 96% con la secuencia
de aminoácidos representada en SEC ID Nº: 2 y con fragmentos
inmunogénicos de tales proteínas.
Un nivel de homología del 98% o incluso del 100%
es aún más preferido.
El nivel de homología de proteínas se puede
determinar con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES"
seleccionando el sub-programa: "BLASTP", que
se puede encontrar en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.
Una referencia de este programa es Tatiana A.
Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:
247-250 (1999). Matriz usada: "blosum62". Los
parámetros usados son los parámetros por defecto:
Hueco abierto: 11. Extensión de hueco: 1.
x_disminución de Hueco: 50.
Se apreciará que, para las proteínas
particulares incluidas en este documento, pueden existir variaciones
naturales entre cepas individuales de Lawsonia
intracellularis. Estas variaciones se pueden demostrar mediante
una o varias diferencias de aminoácidos en la secuencia global o
mediante supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o
adiciones de un o unos aminoácidos en dicha secuencia. Las
sustituciones de aminoácidos que no alteran básicamente las
actividades biológicas e inmunológicas, se han descrito, por
ejemplo, por Neurath et al en "The Proteins", Academic
Press, Nueva York (1979). Los reemplazos de aminoácidos entre
aminoácidos relacionados o reemplazos que han ocurrido con
frecuencia en la evolución son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly,
Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof, M. D., Atlas of protein
sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.,
1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos incluyen
Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe,
Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu. Basándose en esta
información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la
comparación de proteína rápida y sensible (Science, 227,
1435-1441, 1985) y la determinación de la similitud
funcional entre proteínas homólogas. Tales sustituciones de
aminoácido de las realizaciones ilustrativas de esta invención, así
como las variaciones que tienen supresiones y/o inserciones están
dentro del alcance de la invención, siempre y cuando las proteínas
resultantes conserven su reactividad inmune. Esto explica por qué
las proteínas de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la
invención, cuando se aíslan a partir de aislados de campo
diferentes, pueden tener niveles de homología de aproximadamente el
90%, mientras que continúan representando la misma proteína con las
mismas características inmunológicas. Esas variaciones en la
secuencia de aminoácidos de una proteína determinada de acuerdo con
la invención que proporcionan una proteína aún capaz de inducir una
respuesta inmune frente a infección con Lawsonia
intracellularis o al menos frente a las manifestaciones
clínicas de la infección, se considera que "no influyen
básicamente en la inmunogenicidad".
Sin embargo, cuando se usa una proteína, por
ejemplo, con propósitos de vacunación o para generar anticuerpos,
no es necesario usar la proteína completa. También es posible usar
un fragmento de esa proteína que sea capaz, por sí mismo o acoplado
a un vehículo tal como, por ejemplo, KLH, de inducir una respuesta
inmune frente a esa proteína, un fragmento denominado inmunogénico.
Se aprecia que un "fragmento inmunogénico" es un fragmento de
la proteína de longitud completa que todavía ha conservado su
capacidad de inducir una respuesta inmune en el hospedador, es
decir, comprende un epítopo de célula B o T. En este momento, está
disponible una diversidad de técnicas para identificar fácilmente
fragmentos de ADN que codifican fragmentos antigénicos
(determinantes). El método descrito por Geysen et al
(Solicitud de Patente WO 84/03564, Solicitud de Patente WO 86/06487,
Patente de Estados Unidos NR. 4.833.092, Proc. Natl. Acad. 81:
3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102,
259-274 (1987), el método denominado PEPSCAN es un
método fácil de realizar, rápido y bien establecido para la
detección de epítopos; las regiones inmunológicamente importantes
de la proteína. El método se usa en todo el mundo y, por lo tanto,
es bien conocido para especialistas en la técnica. Este método
(empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopos
de células B. También, dada la secuencia del gen que codifica
cualquier proteína, los algoritmos informáticos son capaces de
diseñar fragmentos de proteína específicos como los epítopos
inmunológicamente importantes en base a su concordancia secuencial
y/o estructural con epítopos conocidos.
La determinación de estas regiones se basa en
una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo con
Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828
(1981)) y los aspectos de estructura secundaria de acuerdo con Chou
y Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) y
Patente de Estados Unidos 4.554.101). Análogamente, los epítopos de
células T se pueden predecir a partir de la secuencia mediante
ordenador con la ayuda del criterio de anfifilicidad de Berzofsky
(Science 235, 1059-1062 (1987) y Solicitud de
Patente de Estados Unidos NTIS US 07/005.885). Una visión de
conjunto resumida se encuentra en: Shan Lu sobre common principles:
Tibetch 9: 238- 242 (1991), Good et al sobre Malaria
epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu para
una revisión; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzowsky para
HIV-epitopes; The FASEB Journal 5:
2412-2418 (1991).
Por lo tanto, una forma de todavía otra
realización de la invención se refiere a vacunas capaces de proteger
a los cerdos frente a infección por Lawsonia
intracellularis, que comprenden una o más proteínas o fragmentos
inmunogénicos de las mismas, de acuerdo con la invención como se ha
descrito anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Todavía otra realización de la presente
invención se refiere a las proteínas de acuerdo con la invención
para uso en una vacuna.
Todavía otra realización se refiere al uso de
una proteína de acuerdo con la invención para la preparación de una
vacuna para combatir infecciones por Lawsonia
intracellularis.
Una manera de preparar una vacuna de acuerdo con
la invención es mediante purificación bioquímica de las proteínas o
fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención a
partir de bacterias obtenidas a través de raspados de mucosa
tomados de la pared intestinal infectada. Sin embargo, esta es una
manera de preparar la vacuna que requiere mucho tiempo.
Por lo tanto, es mucho más conveniente usar los
productos de expresión de los genes que codifican las proteínas o
fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención
en vacunas. Las secuencias de ácido nucleico de los genes que
codifican la proteína de 31,0 kD se presentan en la presente
invención.
Tales vacunas basadas en los productos de
expresión de estos genes se pueden preparar fácilmente mezclando
una o más proteínas de acuerdo con la invención o fragmentos
inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención con un
vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe más
adelante.
Como alternativa, una vacuna de acuerdo con la
invención puede comprender portadores recombinantes vivos como se
ha descrito anteriormente, capaces de expresar las proteínas de
acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas
de acuerdo con la invención. Tales vacunas, por ejemplo, basadas en
un vehículo de Salmonella o en un vehículo viral que infecta
el epitelio entérico o, por ejemplo, el epitelio respiratorio tienen
la ventaja sobre las vacunas de sub-unidad de que
las mismas mimetizan mejor la forma natural de infección de
Lawsonia intracellularis. Además, su
auto-propagación es una ventaja, ya que sólo son
necesarias cantidades bajas del portador recombinante para la
inmunización.
Las vacunas descritas por encima de todo
contribuyen a la vacunación activa, es decir, una o más proteínas
de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas
desencadenan el sistema inmune del hospedador, para preparar
anticuerpos frente a estas proteínas.
Como alternativa, tales anticuerpos se pueden
generar en, por ejemplo, conejos o se pueden obtener a partir de
líneas celulares productoras de anticuerpo como se ha descrito más
adelante. Tales anticuerpos después se pueden administrar al animal
hospedador. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la
vacunación de elección cuando un animal ya está infectado y no hay
tiempo para permitir que se desencadene la respuesta inmune
natural. También es el método preferido para vacunar animales
inmunodeprimidos. Los anticuerpos administrados frente a
Lawsonia intracellularis en estos casos se pueden unir
directamente a las bacterias. Esto tiene la ventaja de que
disminuye o detiene inmediatamente el crecimiento de Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, otra forma de esta realización de
la invención se refiere a vacunas que comprenden anticuerpos frente
a cualquiera de las seis proteínas de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la invención.
Las vacunas también se pueden basar en células
hospedadoras como se ha descrito anteriormente, que comprenden las
proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la
invención.
Una manera alternativa y eficaz de vacunación es
la vacunación directa con ADN que codifica el antígeno pertinente.
La vacunación directa con ADN que codifica proteínas ha sido
satisfactoria para muchas proteínas diferentes. (Como se revisa en,
por ejemplo, Donnelly et al., The immunologist 2:
20-26 (1993)).
Esta forma de vacunación es muy atractiva para
la vacunación de cerdos frente a la infección por Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, todavía otras formas de esta
realización de la invención se refieren a vacunas que comprenden
secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de acuerdo
con la invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas de
acuerdo con la invención y a vacunas que comprenden fragmentos de
ADN que comprenden tales secuencias de ácido nucleico.
Otras formas de esta realización se refieren a
vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinante de acuerdo con
la invención. Las vacunas de ADN se pueden administrar fácilmente a
través de aplicación intradérmica, por ejemplo, usando un inyector
sin aguja. Esta forma de administración administra el ADN
directamente a las células del animal que se tiene que vacunar. Las
cantidades de ADN en el intervalo de microgramos entre 1 y 100
\mug proporcionan resultados muy buenos.
En una realización adicional, la vacuna de
acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente uno o
más antígenos obtenidos a partir de otros organismos y virus
patógenos de cerdo o información genética que codifica tales
antígenos.
Tales organismos y virus se seleccionan
preferiblemente entre el grupo de virus de Pseudorrabia, virus de
Influenza Porcina, parvo virus Porcino, virus de gastroenteritis
Transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix
rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella
multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma
hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
Todas las vacunas de acuerdo con la presente
invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un
vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua
estéril o solución salina fisiológica estéril. En una forma más
compleja el vehículo puede ser, por ejemplo, un tampón.
Los métodos para la preparación de una vacuna
comprenden la mezcla de una proteína de acuerdo con la invención o
un fragmento inmunogénico de la misma y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Las vacunas de acuerdo con la presente invención
pueden contener también en una presentación preferida un adyuvante.
Los adyuvantes en general comprenden sustancias que estimulan la
respuesta inmune del hospedador de una manera inespecífica. En la
técnica se conocen varios adyuvantes diferentes. Los ejemplos de
adyuvantes son adyuvante Completo e Incompleto de Freund, vitamina
E, polímeros de bloque no iónicos, muramildipéptidos, Quill
A^{(R)}, aceite mineral, por ejemplo, Bayol^{(R)} o
Markol^{(R)}, aceite vegetal y Carbopol^{(R)} (un homopolímero)
o Diluvac^{(R)} Forte. La vacuna también puede comprender un
denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual se
adhiere el polipéptido, sin unirse al mismo de forma covalente. Los
compuestos de vehículo usados son frecuencia son, por ejemplo,
hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, sílice, caolín y
bentonita.
Una forma especial de un vehículo de este tipo,
en la que el antígeno está incrustado parcialmente en el vehículo,
es el denominado ISCOM (documentos EP 109.942, EP 180.564 y EP
242.380). Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos
tensioactivos o emulsificantes adecuados, por ejemplo, Span o
Tween.
Con frecuencia, la vacuna se mezcla con
estabilizantes, por ejemplo, para proteger de la degradación a los
polipéptidos propensos a degradación, para potenciar la semivida de
la vacuna o para mejorar la eficacia de liofilización. Los
estabilizantes útiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik et al,
J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos, por ejemplo,
sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa,
proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación
de las mismas y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos.
Adicionalmente, la vacuna se puede suspender en un diluyente
fisiológicamente aceptable.
Está de más decir, que también se incluyen en la
presente invención otras formas de auxiliar, añadir compuestos de
vehículo o diluyentes, emulsificar o estabilizar a un
polipéptido.
Las vacunas de acuerdo con la invención se
pueden administrar de forma muy adecuada en cantidades que varían
entre 1 y 100 microgramos, aunque en principio se pueden usar dosis
más pequeñas. Una dosis de más de 100 microgramos será, aunque
inmunológicamente muy adecuada, menos atractiva por razones
comerciales.
Las vacunas basadas en portadores recombinantes
atenuados vivos, tales como los virus y bacterias LRC descritos
anteriormente se pueden administrar en dosis mucho menores, debido a
que los mismos se multiplican durante la infección. Por lo tanto,
cantidades muy adecuadas variarían entre 10^{3} y 10^{9} UFC/UFP
para bacterias y virus respectivamente.
Se pueden aplicar muchas formas de
administración. La aplicación oral es una forma de administración
muy atractiva, debido a que la infección es una infección del
tracto digestivo. Una forma preferida de administración oral es el
envasado de la vacuna en cápsulas, conocidas y usadas frecuentemente
en la técnica, que sólo se disgregan después de que han pasado el
entorno altamente ácido del estómago. También, la vacuna se podría
mezclar con compuestos conocidos en la técnica por mejorar
temporalmente el pH del estómago.
La aplicación sistémica también es adecuada, por
ejemplo, mediante aplicación intramuscular de la vacuna. Si se
sigue esta vía, los procedimientos convencionales conocidos en la
técnica para aplicación sistémica son adecuados.
Desde un punto de vista de la protección frente
a la enfermedad, un diagnóstico rápido y correcto de la infección
por Lawsonia intracellularis es importante.
Por lo tanto, es otro objeto de esta invención
proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la
detección de infección por Lawsonia intracellularis.
Un ensayo de diagnóstico para la detección de
Lawsonia intracellularis se basa, por ejemplo, en la reacción
de ADN bacteriano aislado a partir de un animal que se tiene que
ensayar, con sondas específicas o cebadores de PCR basándose en la
secuencia codificante del gen que codifica la proteína de 31,0
kD.
Si está presente ADN de Lawsonia
intracellularis en el animal, el mismo se unirá específicamente,
por ejemplo, a cebadores de PCR específicos y posteriormente se
amplificará en una reacción por PCR. El producto de la reacción por
PCR después se puede detectar fácilmente en electroforesis en gel de
ADN.
El ADN se puede aislar fácilmente en su mayoría
a partir de los microorganismos presentes en frotis tomados del
tracto digestivo del animal que se tiene que ensayar. Los libros de
texto de PCR convencionales proporcionan métodos para determinar la
longitud de los cebadores para reacciones de PCR selectivas con ADN
de Lawsonia intracellularis. Los cebadores con una secuencia
de nucleótidos de al menos 12 nucleótidos se usan frecuentemente,
pero los cebadores de más de 15 y más preferiblemente de 18
nucleótidos son un tanto más selectivos. Especialmente, los
cebadores con una longitud de al menos 20 y preferiblemente al menos
30 nucleótidos son generalmente muy aplicables. Las técnicas de PCR
se describen exhaustivamente en (Dieffenbach & Dreksler; PCR
primers, a laboratory manual. ISBN
0-87969-447-5
(1995)).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
una proteína de Lawsonia intracellularis o partes de esas
secuencias de ácido nucleico que tienen una longitud de al menos
12, preferiblemente 15, más preferiblemente 18, y aún más
preferiblemente 20, 22, 25, 30, 35 ó 40 nucleótidos en ese orden de
preferencia, donde las secuencias de ácido nucleico o partes de las
mismas tienen una homología de al menos el 90% con la secuencia de
ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1 son también, por lo
tanto, parte de la invención. Tales secuencias de ácido nucleico se
pueden usar como cebadores en reacciones de PCR para potenciar la
cantidad de ADN que las mismas codifican. Esto permite la
amplificación rápida de secuencias de nucleótido específicas para
uso como una herramienta de diagnóstico para, por ejemplo, la
detección de Lawsonia en tejido como se ha indicado
anteriormente.
Otro ensayo basado en ADN se basa en el
crecimiento de material bacteriano obtenido a partir del frotis,
seguido por purificación de ADN clásica seguida por hibridación
clásica con fragmentos de ADN específicos de proteína de 31,0 kD
marcados radiactivamente o con color. Tanto las reacciones de PCR
como las de hibridación se conocen bien en la técnica y se
describen, entre otros, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et
al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN
0-87969-309-6).
Por tanto, una realización de la invención se
refiere a un ensayo de diagnóstico para la detección de ADN de
Lawsonia intracellularis. Un ensayo de este tipo comprende
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un
fragmento de la misma que es específica para el ADN que codifica la
proteína de 31,0 kD. Un fragmento que es específico para ese ADN se
entiende que es un fragmento que, en condiciones comparables, se
une mejor al ADN de Lawsonia intracellularis que al ADN de
otras bacterias, debido a homología mayor con el ADN de Lawsonia
intracellularis, por ejemplo, un cebador de al menos 12
nucleótidos como se ha descrito anteriormente.
Un ensayo de diagnóstico para la detección de
anticuerpos de Lawsonia intracellularis en sueros puede ser,
por ejemplo, un ensayo de sándwich de ELISA convencional sencillo en
el que la proteína de 31,0 kD o fragmentos antigénicos de la misma
de acuerdo con la invención se aplican como recubrimiento a la
pared de los pocillos de una placa de ELISA. Un método para la
detección de tales anticuerpos es, por ejemplo, incubación de la
proteína de 31,0 kD o fragmentos antigénicos de la misma con suero
de mamíferos que se tienen que ensayar, seguido de, por ejemplo,
incubación con un anticuerpo marcado frente al anticuerpo de
mamífero pertinente. Una reacción de color puede poner de
manifiesto la presencia o ausencia de anticuerpos frente a
Lawsonia intracellularis. Otro ejemplo de un sistema de
ensayo de diagnóstico es, por ejemplo, la incubación de una
transferencia de Western que comprende la proteína de 31,0 kD o un
fragmento antigénico de la misma de acuerdo con la invención, con
suero de mamíferos que se tienen que ensayar, seguido por análisis
de la transferencia.
Por tanto, otra realización de la presente
invención se refiere a ensayos de diagnóstico para la detección de
anticuerpos frente a Lawsonia intracellularis. Tales ensayos
comprenden una proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con
la invención.
También, la invención se refiere a métodos para
la detección en suero de anticuerpos frente a Lawsonia
intracellularis, donde el método comprende la incubación de
suero con la proteína de 31,0 kD o fragmentos antigénicos de la
misma de acuerdo con la invención.
Un ensayo de diagnóstico basado en la detección
de material antigénico de la proteína de 31,0 kD específica de
antígenos de Lawsonia intracellularis y, por lo tanto,
adecuado para la detección de infección por Lawsonia
intracellularis también puede ser, por ejemplo, un ensayo de
ELISA convencional. En un ejemplo de un ensayo de este tipo las
paredes de los pocillos de una placa de ELISA se recubren con
anticuerpos dirigidos frente a la proteína 31,0 kD. Después de la
incubación con el material que se tiene que ensayar, se añaden a los
pocillos anticuerpos anti-Lawsonia intracellularis marcados.
Después, una relación de color pone de manifiesto la presencia de
material antigénico de Lawsonia intracellularis.
Por lo tanto, todavía otra realización de la
presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para la
detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis.
Tales ensayos comprenden anticuerpos frente a una proteína o un
fragmento de la misma de acuerdo con la invención.
Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de
los mismos de acuerdo con la invención expresado como se ha
caracterizado anteriormente se pueden usar para producir
anticuerpos, que pueden ser policlonales, monoespecíficos o
monoclonales (o derivados de los mismos). Si se desean anticuerpos
policlonales, las técnicas para producir y procesar sueros
policlonales se conocen bien en la técnica (por ejemplo, Mayer y
Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology,
Academic Press, Londres, 1987). Los anticuerpos monoclonales,
reactivos frente al polipéptido de acuerdo con la invención (o
variantes o fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente
invención), se pueden preparar inmunizando ratones endogámicos
mediante técnicas también conocidas en el campo. (Kohler y
Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
También se conocen en la técnica métodos para
producción a gran escala de anticuerpos de acuerdo con la invención.
Tales métodos dependen de la clonación de (fragmentos de) la
información genética que codifica la proteína de acuerdo con la
invención en un fago filamentoso para presentación en fago. Tales
técnicas se describen, entre otros, en "Antibody Engineering
Page" bajo "filamentous phage display" en
http://aximt1.imt.unimarburg.de/\simrek/
epphage.html., y en artículos de revisión por Cortese, R. et al., (1994) en Trends Biotechn. 12: 262-267., por Clackson, T. y Wells, J. A. (1994) en Trends Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J. D. et al., (1992), en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. et al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Posteriormente, los fagos se usan para explorar bibliotecas de expresión de camélidos que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélidos. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M. A. et al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados se pueden replicar y, posteriormente, usarse para expresión a gran escala de anticuerpos.
epphage.html., y en artículos de revisión por Cortese, R. et al., (1994) en Trends Biotechn. 12: 262-267., por Clackson, T. y Wells, J. A. (1994) en Trends Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J. D. et al., (1992), en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. et al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Posteriormente, los fagos se usan para explorar bibliotecas de expresión de camélidos que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélidos. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M. A. et al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados se pueden replicar y, posteriormente, usarse para expresión a gran escala de anticuerpos.
Aún otra realización de la invención se refiere
a métodos para la detección de material antigénico a partir de
Lawsonia intracellularis en la que el método comprende la
incubación de suero, tejido o fluidos corporales con anticuerpos
frente a la proteína de 31,0 kD o un fragmento antigénico de la
misma de acuerdo con la invención.
Finalmente, una realización de la invención se
refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína
de Lawsonia intracellularis o partes de esas secuencias de
ácido nucleico que tienen una longitud de al menos 20 y
preferiblemente 25, 30, 35 ó 40 nucleótidos en ese orden de
preferencia, donde las secuencias de ácido nucleico o partes de las
mismas tienen una homología de al menos el 90% con la secuencia de
ácido nucleico representada en SEC ID Nº: 1. Tales secuencias de
ácido nucleico se pueden usar como cebadores en reacciones de PCR
para potenciar la cantidad de ADN que las mismas codifican. Esto
permite la amplificación rápida de secuencias de nucleótidos
específicas para uso como una herramienta de diagnóstico para, por
ejemplo, la detección de Lawsonia en tejidos como se ha
indicado anteriormente.
Se recogieron íleon infectados por L.
intracellularis, confirmado mediante histopatología y tinción
rápida con ácido de Ziehl-Neelsen, a partir de
cerdos que murieron con PE y se almacenaron a -80ºC. Después de la
descongelación, se aislaron bacterias de L. intracellularis a
partir de los raspados de mucosa tomados de la pared intestinal
infectada. Los raspados ileales se homogeneizaron repetidamente en
PBS en un omnimixer para liberar las bacterias intracelulares como
se ha descrito por Lawson et al. (Vet. Microbiol. 10:
303-323 (1985)). El sobrenadante obtenido después
de centrifugación a velocidad baja para retirar detritus celulares
se filtró a través de filtros de 5,0, 3,0, 1,2 y 0,8 \mum
(Millipore). El filtrado se centrifugó posteriormente a 8000 g
durante 30 min, dando un sedimento pequeño de bacterias de L.
intracellularis. Estas bacterias se purificaron adicionalmente
usando un gradiente de Percoll. La identidad de las bacterias
purificadas se evaluó mediante PCR (Jones, et al., J. Clin.
Microbiol. 31: 2611-2615 (1993)), mientras que la
pureza de las bacterias aisladas (> 95%) se evaluó mediante
microscopía de contraste de fase para poner de manifiesto cualquier
bacteria o detritus intestinales contaminantes presentes.
La cepa de E. coli hospedadora
BL21star(DE3) que contiene vector pLysSrare y plásmido pET22b
se adquirieron en Novagen (Madison, Wisconsin, EE.UU.
PET-HIS1 (1) se construyó como se ha descrito en
Schaller et al., Microbiology 145: 2105-2116
(1999). La cepa de E. coli TOP10F' se adquirió en Invitrogen
(Groningen, Países Bajos). Las reservas de todas las cepas
bacterianas, que contenían glicerol al 30%, se almacenaron a
-70ºC.
Las células de Lawsonia intracellularis
se aislaron a partir de material ileal infectado como se ha descrito
anteriormente.
Se preparó caldo de Luria Bertani (LB) de
acuerdo con procedimientos convencionales. Las placas de LB se
prepararon fundiendo medio LB + agar al 1,5% en un horno de
microondas de acuerdo con procedimientos convencionales. Las placas
se vertieron después de enfriar la solución hasta 45ºC y, si fuera
necesario, adición de ampicilina (ACS-Dophar,
Raamsdonksveer, Países Bajos). Se adquirió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) en Biosynth Ag (Staad, Suiza).
Se realizó amplificación por PCR usando un
sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, California,
EE.UU.). La PCR se realizó con el Sistema de PCR de Expand High
Fidelity (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). La mezcla de
PCR contenía 52 U/ml de Mezcla de Enzima Expand High Fidelity,
tampón Expand HF con MgCl_{2} 2,5 mM, de dNTPs 16 mM (Promega,
Wisconsin, EE.UU.), 20 pmoles de cebadores y 15 ng de ADN
cromosómico de Lawsonia intracellularis como molde. Todos
los cebadores usados para amplificación de ADN se enumeran en la
Tabla 1.
Para obtener ADN cromosómico de Lawsonia
altamente purificado, se preparó ADN usando un kit de aislamiento
de ADN cromosómico Biorad (Biorad, Veenendaal, Países Bajos) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se secuenció ADN en un secuenciador automatizado
ABI 310 (Perkin Elmer, California, EE.UU.). La mezcla de secuencia
contenía: 100 ng de producto de PCR, 2 \mul de mezcla de reacción
terminator ready reaction mix (Perkin Elmer, California, EE.UU.),
2,4 pmoles de cebador, 6 \mul de tampón (Tris-HCl
200 mM, pH 8,5; MgCl_{2} 5 mM) y agua destilada hasta 20 \mul.
Esta mezcla se cicló en un Geneamp 9700. El programa estaba
compuesto por 25 ciclos con 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC y
2 minutos a 60ºC. Los productos de secuencia de ciclo se
purificaron con columnas Dye-Ex (Qiagen Inc.,
California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
y se desarrollaron en el secuenciador automatizado ABI 310. Los
resultados de secuencia se recogieron usando ABI 310 Collection
Software versión 1.0.4 (Perkin Elmer, California, EE.UU.) y se
analizaron con Sequence Analysis versión 3.1 (Perkin Elmer,
California, EE.UU.). Las alineaciones se realizaron usando Sequence
Navigator versión 1.0.1 (Perkin Elmer, California, EE.UU.). El
análisis de secuencia se realizó usando el Sequencer 4.1.4
(GeneCodes Ann Arbor, CA, EE.UU.).
Los ligamientos se realizaron en un tampón de
ligamiento 1 x con 1 unidad de enzima de ligamiento (Gibco BRL Life
Technologies Inc., EE.UU.) a 16ºC durante una noche. 1 \mul de la
reacción de ligamiento se transformó en células competentes de
E. coli mediante choque térmico. Las células competentes de
E. coli BL21star(DE3) y las células competentes de
E. coli TOP10F' se volvieron competentes mediante un método
de Maniatis/Sambrook usando tampones TFB1 (KOAc 30 mM, RbCl 100 mM,
CaCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 50 mM y glicerol al 15%) y TFB2 (RbCl
10 mM, CaCl_{2} 75 mM, MES 10 mM y glicerol al 15%). Después de 1
hora de recuperación en medio SOC complementado con MgSO_{4} 10
mM y glucosa 20 mM a 37ºC, las células se sembraron en placas de LB
con los antibióticos apropiados.
La cepa de E. coli BL21 star(DE3)
que contenía pLysSrare y el vector de expresión se cultivó durante
una noche a 37ºC a 200 rpm en 5 ml de LB con ampicilina. El cultivo
durante la noche se diluyó 1:100 en 50 ml de LB con ampicilina.
Este cultivo se desarrolló en las mismas condiciones hasta que la
DO_{600} alcanzó 0,5, medida en un espectrofotómetro NovaspecII
(Pharmacia, Woerden, Países Bajos). En este punto (t=0) el cultivo
se indujo con IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se
continuó el cultivo durante 3 horas posteriores (t = 3). Se tomaron
muestras de 100 \mul para análisis. La cepa de E. coli
BL21star(DE3) que contenía pLysSrare se cultivó y se indujo
en las mismas condiciones y se tomaron muestras como un control
negativo. Las muestras se analizaron mediante SDS page, seguido por
una tinción de Azul Brillante de Coomassie como se ha descrito más
adelante. El cultivo restante se centrifugó a 5.000 rpm y el
sedimento se almacenó a -20ºC hasta uso posterior.
Se realizó SDS-PAGE usando geles
Bis-Tris al 4-12% del sistema de
electroforesis NuPAGE (Novex, San Diego, EE.UU.). Antes de la
separación las muestras se hirvieron durante 5 minutos con tampón de
muestra (muestra:tampón = 2:1) en presencia de
\beta-mercapto etanol. Los geles se tiñeron con
Azul Brillante de Coomassie o se transfirieron a membrana
Immobulon-P-membrane (Millipore,
Bedford, EE.UU.) mediante procedimientos de transferencia de
Western semi secos convencionales.
Se generó suero policlonal anti-Lawsonia
de pollo frente a una preparación de células enteras en
n-GNE (agua:
aceite = 45:55). Se obtuvo suero E2-839 a partir de un cerdo que había desarrollado signos clínicos y lesiones post-mortem típicas de infección por L. intracellularis. Los sueros se pre-adsorbieron usando un volumen igual de extractos de células crudas a partir de BL21star(DE3) que contenía vector pLysSrare a 4ºC durante 4 horas.
aceite = 45:55). Se obtuvo suero E2-839 a partir de un cerdo que había desarrollado signos clínicos y lesiones post-mortem típicas de infección por L. intracellularis. Los sueros se pre-adsorbieron usando un volumen igual de extractos de células crudas a partir de BL21star(DE3) que contenía vector pLysSrare a 4ºC durante 4 horas.
Los genes de Lawsonia se amplificaron
mediante PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla 1. Los
productos de PCR obtenidos se digirieron usando enzimas de
restricción NcoI y BamHI. Los productos de PCR digeridos se ligaron
posteriormente a pET22b o pET-HIS1 que se habían
cortado con las mismas dos enzimas de restricción como se ha
indicado en la Tabla 2. Las mezclas de ligamiento se transformaron
en E. coli TOP10F y se incubaron durante una noche a 37ºC.
Los transformantes supuestos se comprobaron para el plásmido
correcto usando PCR de colonia. Esto dio como resultado 6 plásmidos
de expresión diferentes. Estos plásmidos se comprobaron mediante
análisis de secuencia de nucleótidos y las secuencias fueron como se
esperaba en base a la estrategia de clonación.
Todos los plásmidos enumerados en la Tabla 2 se
ensayaron para determinar producción de proteína recombinante.
BL21star(DE3) pLysSrare se transformaron con plásmidos y se
realizó una inducción. Los cultivos de inducción se analizaron
mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE y tinción
CBB (figura 1). Los seis genes dieron expresión suficiente en E.
coli BL21star(DE3) pLysSrare. Se alcanzaron niveles de
expresión de 150 \mug/ml.
Los productos de expresión se analizaron
mediante transferencia de western usando suero de pollos vacunados
con células de Lawsonia enteras y suero de un cerdo que
presentaba signos clínicos y lesiones
post-mortem que son típicas para L.
intracellularis (figura 2). Las proteínas de Lawsonia
recombinantes se identificaron positivamente mediante los sueros de
pollo y cerdo.
Figura 1. Análisis de
sobre-expresión de genes de Lawsonia
intracellularis en Escherichia coli BL21STAR/
pLysSRARE mediante NuPAGE.
pLysSRARE mediante NuPAGE.
Carril 1, marcador de peso molecular; carril 2,
pET76.7 T = 0; carril 3, pET76.7 T = 3; carril 4, pET56.8 T = 0;
carril 5, pET56.8 T = 3; carril 6, pET24.8 T = 0; carril 7, pET24.8
T = 3; carril 8, pET28.8 T = 0; carril 9, pET28.8 T = 3; carril 10,
pET31.0 T = 0; carril 11, pET31.0 T = 3; carril 12, pET31.4 T = 0;
carril 13, pET31.4 T = 3; carril 14, T = 3 sin vector de
expresión.
Las flechas indican el emplazamiento de los
productos de expresión.
Figura 2. Transferencia de Western de productos
de expresión de genes de Lawsonia intracellularis en
Escherichia coli BL21STAR/pLysSRARE.
Carril 1, pET31.4; carril 2, pET28.8; carril 3,
pET31.0, carril 4, pET24.8; carril 5, el 76,7 PET; carril 6,
pET56.8; carril 7, sin vector de expresión.
Las flechas indican el emplazamiento de los
productos de expresión.
<110> AZKO Nobel N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna de sub-unidad
de Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2003.xxx
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1004
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(939)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 764
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (25)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(2164)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia Intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)..(1631)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
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<212> PRT
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<213> Lawsonia Intracellularis
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 902
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<212> ADN
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<213> Lawsonia Intracellularis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (63)..(842)
\newpage
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 259
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<212> PRT
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<213> Lawsonia Intracellularis
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<400> 10
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<211> 951
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<212> ADN
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<213> Lawsonia Intracellularis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (50)..(877)
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<400> 11
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<211> 275
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<212> PRT
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<213> Lawsonia Intracellularis
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<400> 12
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Claims (17)
1. Secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína de Lawsonia intracellularis inmunogénica o una parte
de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento
inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha secuencia de ácido
nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 90%,
preferiblemente el 92%, más preferiblemente el 94% y aún más
preferiblemente el 96% con la secuencia de ácido nucleico
representada en SEC ID Nº: 1
2. Fragmento de ADN que comprende una secuencia
de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Molécula de ADN recombinante que comprende
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1
o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, bajo el
control de un promotor unido funcionalmente.
4. Portador recombinante vivo que comprende una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un
fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o una molécula
de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Célula hospedadora que comprende una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un
fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de
ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3 o un portador
recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Proteína de Lawsonia intracellularis,
comprendiendo dicha proteína inmunogénica una secuencia de
aminoácidos que es al menos el 90%, preferiblemente el 92%, más
preferiblemente el 94% y aún más preferiblemente el 96% homóloga a
la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID Nº: 2 o un
fragmento inmunogénico de dicha proteína.
7. Proteína de Lawsonia intracellularis
de acuerdo con la reivindicación 6 para uso en una vacuna.
8. Uso de una proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para la
preparación de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia
intracellularis.
9. Vacuna para combatir infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada por que la
misma comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la
reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 3, un portador recombinante vivo de acuerdo con la
reivindicación 4, una célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 5 o una proteína de acuerdo con la reivindicación 6
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizada por que la misma comprende un adyuvante.
11. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 ó
10, caracterizada por que la misma comprende un antígeno
adicional obtenido a partir de un virus o
micro-organismo patógeno para cerdos o información
genética que codifica dicho antígeno.
12. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizada por que dicho virus o
micro-organismo patógeno para los cerdos se
selecciona entre el grupo de virus de Pseudorrabia, virus de
influenza Porcina, parvo virus Porcino, virus de gastroenteritis
Transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix
rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella
multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma
hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
13. Vacuna para combatir infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada por que la
misma comprende anticuerpos frente a una proteína de acuerdo con la
reivindicación 6.
14. Método para la preparación de una vacuna de
acuerdo con las reivindicaciones 9-13, comprendiendo
dicho método la mezcla de una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con
la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con
la reivindicación 3, un portador recombinante vivo de acuerdo con
la reivindicación 4, una célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 5, una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 o
anticuerpos frente a una proteína de acuerdo con la reivindicación
6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Ensayo de diagnóstico para la detección de
ADN específico de Lawsonia intracellularis
caracterizado por que el ensayo comprende una secuencia de
ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento de
la misma que tiene una longitud de al menos 12, preferiblemente 15 y
más preferiblemente 18 nucleótidos.
16. Ensayo de diagnóstico para la detección de
anticuerpos frente a Lawsonia intracellularis,
caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína o
un fragmento de la misma como se define en la reivindicación 6.
17. Ensayo de diagnóstico para la detección de
material antigénico de Lawsonia intracellularis,
caracterizado por que dicho ensayo comprende anticuerpos
frente a una proteína o un fragmento de la misma como se define en
la reivindicación 6.
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