ES2334505T3 - Uso de antagonistas o-atp o bbg de p2x7 para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de la esclerosis multiple. - Google Patents

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Maria Domercq Garcia
Alberto Perez Samartin
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Maria Victoria Sanchez Gomez
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Abstract

La presente invención se relaciona con el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes y autoinmunes, muy en especial con el tratamiento de la esclerosis múltiple. El tratamiento consiste en la administración de sustancias antagonistas de los receptores purinérgicos P2X lo que produce una remisión de los síntomas propios de este tipo de enfermedades. Esto se demostró tanto en modelos celulares in vitro, como en modelos animales.

Description

Uso de antagonistas o-ATP o BBG de P2x7 para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de la esclerosis múltiple.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el campo de la esclerosis múltiple, así como con el empleo de sustancias antagonistas de los receptores P2X7, presentes en los oligodendrocitos, para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, y con composiciones que pueden contener dichos antagonistas.
Antecedentes de la invención
La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante más frecuente del sistema nervioso central. Afecta a un millón y medio de personas en el mundo, y sus síntomas aparecen generalmente en adultos jóvenes, por lo que sus consecuencias a nivel personal y socioeconómico son muy graves.
Se piensa que la susceptibilidad a la EM se debe a factores genéticos y ambientales desconocidos. La prevalencia de la enfermedad se sitúa entre 50 a 100 personas por cada 100.000 habitantes en las regiones de alto riesgo, que se localizan principalmente en las zonas septentrionales del hemisferio norte, en Europa y América. El riesgo a padecer EM aumenta 10-20 veces en parientes de pacientes de primer grado, y la concordancia entre gemelos monocigóticos (idénticos genéticamente) se eleva hasta el 30%-50%,mientras que gemelos dicigóticos sólo alcanza el 2%-5%. La susceptibilidad genética no está caracterizada. Hasta el momento se tienen evidencias de que puede residir en algún polimorfismo de los genes que codifican antígenos leucocitarios humanos (HLA), glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) y otros genes de los cromosomas 10 y 15.
Existe un consenso entre los investigadores de la EM según el cual la enfermedad tiene dos fases, una inicial inflamatoria, de naturaleza autoinmune, y otra secundaria, neurodegenerativa progresiva. En la primera, las células T activadas atraviesan la barrera hematoencefálica, y una vez dentro del Sistema Nervioso Central liberan citoquinas proinflamatorias que desencadenan una cascada inmunológica que termina en la destrucción de la mielina y muerte de los oligodendrocitos. El conocimiento con un cierto detalle del proceso autoinmune ha servido para desarrollar agentes de naturaleza inmunomoduladora cuya eficacia terapéutica es muy modesta. Sin embargo, no se ha creado ningún medicamento que retrase o detenga el avance de la fase neurodegenerativa de la enfermedad que cursa con deterioro neurológico progresivo e invalidez, y que se caracteriza por la aparición de lesiones desmielinizantes graves en la sustancia blanca con pérdida masiva de oligodendrocitos, atrofia y daño axonal severo. Hasta ahora se han descrito diversas dianas para la intervención durante la fase inflamatoria de la esclerosis múltiple (Zamvil y Steinman, 2003, Neuron 38, 685-688). Entre ellas se encuentran las que se dirigen a reducir la inflamación del sistema nervioso iniciada por la activación de células T específicas de mielina, que promueven la autoinmunidad en particular contra componentes de la mielina, penetran en el tejido nervioso central y liberan en él citoquinas proinflamatorias tales como el interferón-\gamma y el factor de la necrosis tumoral-\alpha. El inmunomodulador interferón-\beta, aprobado para el tratamiento de la esclerosis múltiple remitente-recurrente, previene también las interacciones celulares que llevan a la penetración de las células T activadas a través del endotelio vascular. Otros tratamientos en fase de ensayo clínico están dirigidos a neutralizar la actividad de las citoquinas pro-inflamatorias y/o a potenciar las anti-inflamatiorias. Un estudio reciente (Youssef y col., 2002, Nature 420, 78-84) ha puesto de manifiesto que el medicamento atorvastatina, empleado en el tratamiento de la hipercolesterolemia, es también un potente inmunomodulador que previene o invierte la EAE crónica mediante la potenciación de la secreción de citoquinas antiinflamatorias y la inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias. Los receptores purinérgicos son un tipo de receptores de membrana activados por purinas extracelulares tales como ADP y ATP y que median diversos efectos biológicos, tales como la modulación de la actividad neuronal, la liberación de neurotransmisores, la glucogenolisis, la contractilidad de la pared vascular o determinados procesos inmunológicos etc. Los receptores purinérgicos se clasifican en dos grandes grupos denominados P1, cuya activación esta mediada por adenosina, y P2 cuyos ligandos endógenos son las purinas ATP y ADP y las pirimidinas UTP y UDP. Los receptores P1 transducen la señal al interior de la célula a través de proteínas G y de acuerdo con sus propiedades moleculares, bioquímicas y farmacológicas se subdividen en cuatro grupos: A1, A2A, A2B y A3. Por su parte, los P2 se dividen en ionotrópicos (P2X) y metabotrópicos (P2Y) (Barnard y col., 1997; Ralevic
y Burnstock, 1998).
En los últimos años se ha puesto de manifiesto que los receptores purinérgicos además de participar en señales propias de la neurotransmisión, también median efectos sobre las células gliales (Rathbone y col., 1999). De hecho, la expresión de receptores purinérgicos en el sistema nervioso central no está limitada solamente a neuronas, sino que afecta también a la glía (Dunn y col., 2001; Franke y col., 2001a; Stevens y col., 2002). En particular, la señalización purinérgica en los astrocitos y la microglía sirve como un medio de comunicación glía-glía y glía-neurona (Fields y Stevens, 2000). Además, algunos estudios muy recientes señalan la presencia de receptores funcionales en oligodendrocitos in vitro (Stevens y col., 2002), que apuntan a una participación relevante en las funciones propias de este tipo celular. En particular, Stevens y col (2002) muestran que la adenosina liberada desde los axones como consecuencia de la actividad eléctrica, inhibe la proliferación de los precursores oligodendrogliales, estimula su diferenciación y promueve la formación de mielina.
\newpage
La señalización a través de receptores purinérgicos tiene también importancia en la viabilidad celular en respuesta a procesos patológicos cerebrales (revisado en Abbracchio y Burnstock, 1998). Así, están implicados en la respuesta gliótica al daño nervioso (Franke y col., 2001b; James y Butt, 2001), y en la respuesta reparadora del sistema nervioso central mediante la producción de factores tróficos en astrocitos (Ciccarelli y col., 2001). A su vez, la presencia de ectonucleotidasas que degradan el ATP hasta adenosina constituye un elemento neuroprotector en la isquemia (Braun y col., 1998), mientras que el ATP produce muerte de células gliales (Honda y Kohsaka, 2001).
El conocimiento sobre la implicación del sistema purinérgico en la esclerosis múltiple es muy escaso. Esa información indica que hay alteraciones en la actividad de la 5'-nucleotidasa, el enzima que degrada ATP hasta adenosina. Esta actividad es más elevada en monocitos sanguíneos de pacientes con esclerosis múltiple cultivados durante varios días (Armstrong y col., 1988). Por su parte, las regiones del sistema nervioso central en las que se producen lesiones propias de la esclerosis múltiple tienen una actividad nucleotidasa más baja (Ansari y col., 1978), lo que puede producir concentraciones más elevadas de ATP extracelular y mayor activación de los receptores purinér-
gicos P2.
Lo novedoso de la presente invención se basa en el descubrimiento por parte de los inventores de que la administración de una determinada cantidad de algún antagonista de receptores P2X7, seleccionado de BBG ó ATP oxidado (en lo sucesivo en este documento o-ATP), un inhibidor selectivo de los receptores P2X7, produce una remisión de los síntomas de la enfermedad.
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Sumario de la invención
El problema a resolver por la presente invención es proporcionar una serie de compuestos para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de la esclerosis múltiple.
La solución presentada en este documento se basa en la capacidad que poseen los receptores purinérgicos P2X7 de frenar el desarrollo de las enfermedades mencionadas anteriormente tanto en ensayos in vitro como in vivo. La invención se ilustra en el ejemplo en el que se describen los ensayos llevados a cabo por los inventores en los que, por un lado, se pone de manifiesto que los oligodendrocitos en cultivo expresan los receptores P2X7 en su superficie y, por otro, que la activación de los mismos con ATP produce un aumento del calcio citosólico y, si el estímulo es prolongado, produce finalmente la muerte de las células. Asimismo, se describen ensayos en los que se demuestra en modelos in vivo e in vitro de esclerosis múltiple, que el tratamiento con antagonistas de receptores purinérgicos P2X7 frena el desarrollo de la enfermedad.
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere al uso de antagonistas de receptores P2X7, seleccionados de BBG ó o-ATP para el tratamiento de la fase degenerativa de la esclerosis múltiple.
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra las propiedades electrofisiológicas de los receptores P2X en oligodendrocitos en cultivo. La activación de los receptores mencionados anteriormente produce una corriente de entrada que puede aumentarse en ausencia de iones divalentes. Las curvas de repuesta a la dosis del antígeno natural endógeno, ATP, y de análogos del mismo, tales como BzATP, indican que las propiedades de las respuestas se asemejan a las de los receptores P2X7 recombinantes expresados en sistemas heterólogos.
La figura 2 pone de manifiesto que, tanto el ATP como el BzATP producen un elevado incremento en la concentración de calcio intracelular que se evita en presencia de PPADS, un antagonista de P2X y P2Y de amplio espectro, y también eliminando el calcio del medio extracelular. Además, se observa que las respuestas aumentan con propofol y se inhiben con o-ATP, un antagonista selectivo de los receptores P2X7.
La figura 3 demuestra que la aplicación durante 15 minutos de ATP o BzATP causa la muerte de los oligodendrocitos en cultivo. La muerte es dependiente de calcio, pues su eliminación del medio de cultivo hace que no se produzca. El antagonista de amplio espectro PPADS es capaz de prevenirla si se aplica a la vez que los agonistas.
La figura 4 demuestra que la muerte oligodendroglial por ATP se puede prevenir mediante el antagonista selectivo de P2X7, o-ATP.
La figura 5 muestra la expresión in situ de receptores P2X en oligodendrocitos del nervio óptico mediante técnicas inmunohistoquímicas utilizando anticuerpos específicos. Se observa que los receptores P2X2, P2X4 y P2X7 (verde) son muy abundantes en oligodendrocitos (rojo) del nervio óptico. El color amarillo indica el solapamiento de ambos colores, por lo que los receptores mencionados anteriormente se expresan abundantemente en oligodendrocitos. Del mismo modo, queda claro que estos no se expresan demasiado en astrocitos.
La figura 6 muestra cómo la infusión lenta (1 \mul/hora) de BzATP (100 mM) produce lesiones en el nervio óptico, en las que se aprecia daño tisular con astrogliosis y microgliosis, así como la desaparición de mielina en el área dañada y rotura de los axones.
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La figura 7 pone de manifiesto que las ratas a las cuales se induce EAE tienen graves síntomas neurológicos que incluyen parálisis de las extremidades e incluso la muerte. Sin embargo, el tratamiento previo a la aparición de los síntomas con o-ATP produce la desaparición virtual de los síntomas.
La figura 8 demuestra cómo, doce días después de la inducción de la EAE, la administración de o-ATP hace desaparecer los síntomas neurológicos causados por la enfermedad.
La figura 9 pone de manifiesto que en la EAE los niveles de receptores P2X2 no se alteran significativamente, sin embargo, los de P2X7 bajan de forma drástica. Esto indica que hay una pérdida de células que lo expresan, principalmente oligodendrocitos.
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Descripción detallada de la invención
El primer aspecto de la invención se refiere al uso de los antagonistas de los receptores purinérgicos P2X7 para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de la esclerosis múltiple. La autoinmunidad requiere la activación de una cascada precisa de procesos en células del sistema inmune. Una parte de esas células, los macrófagos y los linfocitos, expresa receptores P2X1, P2X2, P2X5 y P2X7, y la activación de este último produce la liberación de citoquinas proinflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) e IL-1\beta así como apoptosis por mecanismos que todavía no están caracterizados (Burnstock, 2002, Arteriorscler Thromb Vasc Biol. 22, 364-373). Sin embargo, las funciones precisas que median los receptores P2X en el sistema inmune todavía no se conocen bien. Es esta expresión de receptores P2X en células del sistema inmune la que hace adecuado el uso de los antagonistas de receptores P2X para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes.
Entre los antagonistas de los receptores P2X existen algunos denominados de amplio espectro debido a que son capaces de unirse a varios de los receptores de la familia P2X, aunque con diferente afinidad por cada uno de ellos; y otros que son selectivos para un grupo de receptores de la familia P2X.
Las siguientes fórmulas representan algunos de estos antagonistas de amplio espectro de los receptores P2X. Únicamente los compuestos de fórmula VII y IX forman parte de ésta invención.
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3 
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Las siguientes fórmulas representan los antagonistas selectivos de los receptores P2X:
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4
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Los compuestos anteriormente representados por sus fórmulas estructurales son:
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PPADS (sal tetrasódica del ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2',4'-disulfónico) (I)
\blacksquare
iso-PPADS (sal tetrasódica del ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-1',4'-disulfónico) (II)
\blacksquare
Suramin (sal hexasódica del ácido 8,8'-[carbonilbis[imino-3, 1-fenilencarbonilimino(4-metil-3,1-feni- len)carbonilimino]]bisnaftaleno-1,3,5-trisulfónico (III)
\blacksquare
Evans Blue (sal tetrasódica del ácido 6,6'-[(3,3'-Dimetil[1,1'-bifenil]-4,4'-diil)bis[4-amino-5-hidroxi-1,3-naftalendisulfónico]) (IV)
\blacksquare
NF023 (sal hexasódica del ácido 8,8'-[carbonilbis[imino-3,1-fenilencarbonilimino]bis-1,3,5-naftalen-trisulfónico) (V)
\blacksquare
NF279 (sal hexasódica del ácido 8,8'-[carbonilbis(imino-4,1-fenilencarbonilimino-4,1-fenilencarbonilimino))bis-1,3,5-naftalentrisulfónico)] (VI)
\blacksquare
CBB-G (azul brillante de Coomassie G)(VII)
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NF449 (sal octasódica del ácido 4,4',4'',4'''-(carbonilbis(imino-5,1,3-bencenotriil-bis(carbonilimino)))te- trakis-benceno-1,3-disulfónico) (VIII)
\blacksquare
o-ATP (sal sódica de Adenosina 5-trifosfato, oxidada con periodato) (IX)
\blacksquare
KN-62 (éster del ácido 4-[(2S)-2-[(5-isoquinolinilsulfonil)metilamino]-3-oxo-3-(4-fenil-1-piperacinil)propil]fenil isoquinolinsulfónico) (X)
\blacksquare
PPNDS (sal tetrasódica de piridoxal-5-fosfato-6-(2'-naftilazo-6'-nitro-4',8'-disulfonato) (XI)
\blacksquare
RB2 ácido 1-Amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[[3 (ó 4)-sulfofenil]amino]-1,3,5-triacin-2-il]amino]-3-sulfofenil]amino}-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracensulfónico) (XII).
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Además de los anteriormente mencionados existen otros antagonistas de amplio espectro tales como MRS2220 (piridoxina-\alpha4,5-monofosfato-6-azo-fenil-2',5'-disulfonato ciclico), Ip51 (sal pentapotásica de P^{1},P^{5}-Diinosina-5-pentafosfato) o TNP-ATP (sal monolitio de 2',3'-O-2,4,6-trinitrofeniladenosina 5'-trifosfato), asi como selectivos tales como, por ejemplo, HMA (5-(N,N hexametilen) amilorida).
En la tabla 1 aparecen representados los CI_{50} de algunos de los compuestos anteriores en relación con los diferentes subgrupos de receptores P2X.
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En una realización preferida, uno de los antagonistas mencionados anteriormente es un antagonista selectivo de los receptores P2X7, el o-ATP. En los ensayos llevados a cabo por los inventores (ver ejemplo más adelante) este compuesto ha demostrado ser especialmente adecuado para el tratamiento de la fase neurodegenerativa de la esclerosis múltiple debido a la importancia relativa de la presencia de receptores P2X7 en oligodendrocitos en comparación con otros receptores P2X.
El inhibidor de amplio espectro preferido es BBG. Una realización preferida contempla una composición farmacéutica que contiene al menos o-ATP, un antagonista selectivo de los receptores P2X7.
En el siguiente ejemplo se detallan los ensayos llevados a cabo por los inventores que ilustran el fundamento de la invención.
Ejemplo
I-Procedimientos experimentales Cultivos de oligodendrocitos
Los cultivos celulares se realizaron a partir de nervio óptico de rata perinatal (P12) siguiendo protocolos establecidos, que se adaptaron e introdujeron en el laboratorio de acuerdo con una descripción reciente (Matute y col, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8830-8835).
Registros electrofisiológicos en oligodendrocitos in vitro
Los registros electrofisiológicos se realizaron en cultivos de 2 a 5 días, y siguiendo las pautas indicadas en trabajos previos (Patneau y col, 1994, Neuron12: 357-371). Las células se registraron en una cámara que permite variar la composición del medio extracelular a través de un flujo constante (0,5-1 ml/min). Los electrodos de registro eran capilares de vidrio que contenían soluciones específicas compatibles con las concentraciones iónicas citoplasmáticas. El estudio de las respuestas mediadas por los receptores purinérgicos se realizó mediante la técnica de "pinzamiento zonal de la célula entera" ("whole-cell patch-clamp"), midiendo las corrientes generadas por la aplicación externa de agonistas y antagonistas selectivos de los receptores mencionados anteriormente.
Medición de los niveles de calcio citosólico en cultivos de oligodendrocitos
La concentración de calcio citosólico se determinó mediante el método de Grynkiewikcz y col. (1985; J. Biol. Chem. 260, 3440-3450). Los oligodendrocitos se cargaron con 5 mM de Fura-2/AM, y a continuación se lavaron y se estudiaron en un microscopio invertido Zeiss equipado con un monocromador, objetivo 40x de inmersión, una cámara digital de alta resolución Orca, y un software AquaCosmos (Hamamatsu Photonics). Se ensayaron los cambios en los niveles de calcio citosólico en respuesta a agonistas y antagonistas, en presencia y ausencia de calcio extracelular. La calibración se realizó al final de los ensayos mediante la aplicación sucesiva de ionomicina y EGTA, y la concentración de calcio se calculó usando las mediciones de la relación 340/380 nm.
Experimentos en el nervio óptico aislado
Se aislaron nervios de ratas adultas jóvenes, y se perfundieron durante 30 min en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) saturado en oxígeno mediante burbujeo con oxígeno al 95% y CO2 al 5%, en condiciones comparables a las descritas para oligodendrocitos en cultivo (Fern y Moller, 2000, J. Neurosci. 20: 34-42). A continuación, se incubaron con agonistas y antagonistas purinérgicos durante diversos tiempos. Posteriormente, los nervios se perfundieron durante 1 a 24 horas con LCRa normal saturado de oxígeno. Transcurrido ese tiempo se evaluó el daño histológicamente tal y como se ha descrito in vivo (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10229-10234), y se analizaron los cambios bioquímicos causantes de dicho daño.
Métodos inmunoquímicos en cultivos de oligodendrocitos, nervio óptico y en tejido nervioso de animales experimentales
Se emplearon anticuerpos comerciales para el estudio de la presencia de marcadores del linaje oligodendroglial, componentes de la mielina, astrocitos y microglía. Las técnicas incluyeron la inmunocitoquímica, inmunohistoquímica e inmunotransferencia (transferencia de Western), todas ellas descritas con detalle (véase por ejemplo, Domercq y col, 1999, Eur. J. Neurosci. 11, 2226-2236).
Aplicación de sustancias en el nervio óptico in vivo
Los experimentos en el nervio óptico se realizaron en conejos (New Zealand White) que, por su tamaño, permiten una mejor manipulación quirúrgica experimental. El procedimiento empleado fue el descrito previamente (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 10229-10234). Los agonistas purinérgicos se aplicaron mediante el empleo de micro bombas osmóticas que liberan cantidades pequeñas de soluto durante un tiempo determinado. Posteriormente, se evaluó el efecto de dicha aplicación sobre el nervio con un panel de marcadores de oligodendrocitos y sus progenitores, mielina, integridad axonal, astrogliosis y microgliosis.
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Inducción de encefalomielitis experimental autoinmune (EAE)
Se emplearon ratas Lewis que se inmunizaron subcutáneamente con proteína básica de la mielina inyectada en las patas traseras (100 microgramos/animal en 100 microlitros) y adyuvante de Freund con 5.5 mg/ml de Micobacterium tuberculosis H37Ra. La médula espinal se extrajo cuando los animales tenían los síntomas de la enfermedad (12-14 días tras la inmunización) y se analizó la expresión de los receptores purinérgicos usando técnicas inmunoquímicas (inmunotransferencia e inmunohistoquímica).
II-Resultados Características de las corrientes mediadas por los receptores P2X en oligodendrocitos
El ATP (1 mM) induce una corriente de entrada que no desensibiliza en la mayoría de oligodendrocitos examinados (77,3 \pm 7,9%; n= 47; Fig. 1a). El análogo del ATP, 2',3'-O-(4-benzoil-4-benzoil) (BzATP, 100 \muM), que es un agonista P2X de amplio espectro pero con una afinidad más alta para el receptor P2X7 (Ralevic & Burnstock, 1998), indujo también respuestas similares (Fig. 1a). Por otro lado, \alpha,\beta-metilen-ATP (\alpha,\beta-Me-ATP, 100 \muM), un agonista selectivo de receptores P2X1, P2X3 y heterómeros P2X2/3, no generó corrientes en oligodendrocitos. Se observó que la amplitud de las corrientes generadas por ATP y BzATP depende de la concentración del agonista correspondiente (Fig. 1a) (CE_{50}= 8,77 mM y 0,52 mM respectivamente). Así mismo, se pudo constatar que la ausencia de Mg^{2+} y Ca^{2+}, que incremen-
ta la concentración de ATP^{4-}, la forma activa de los receptores P2X, potencia las respuestas en 4-10 veces (Fig. 1a).
El antagonista de amplio espectro PPADS (100 \muM), por su parte, bloqueó completamente las corrientes inducidas por ATP (Fig. 1). A su vez, el ATP oxidado (o-ATP), un antagonista preferentemente de los receptores P2X7, bloquea parcialmente las corrientes de ATP. A su vez, el Cu^{2+} (1 mM) que es un inhibidor selectivo de los receptores P2X7 (Virginio y col,. 1997), reduce las corrientes de ATP, mientras que el propofol (60 \muM), un potenciador de los receptores P2X4, no altera dichas corrientes. Estos resultados indican que los receptores P2X presentes en oligodendrocitos tienen propiedades electrofisiológicas compatibles con un predominio de la subunidad P2X7.
La activación de los receptores P2X eleva los niveles de Ca^{2+} citosólico
Se monitorizó [Ca^{2+}]_{i} tras aplicar ATP y BzATP con objeto de caracterizar los efectos de la activación de los receptores P2X en oligodendrocitos. Estas células responden a ATP (10 \muM) con un incremento rápido en [Ca^{2+}]_{i} citosólico basal (250 \pm 65 nM) a 1200 \pm 468 nM (Fig. 2a). Estas respuestas se reprimen en presencia de PPADS (50 \muM) y en ausencia de Ca^{2+} en la solución de incubación. Estos resultados indican que los aumentos de [Ca^{2+}]_{i} se deben a la entrada de Ca^{2+} a través de la membrana plasmática y no se deben a la liberación de sus depósitos intracelulares.
El Bz-ATP (0,01-1 mM) también activa la entrada de Ca^{2+} en oligodendrocitos de forma dosis dependiente (Fig. 2b, d). Este efecto desaparece en ausencia de Ca^{2+} extracelular y se bloquea con PPADS (Fig. 2b, d). Estos resultados sugieren que los receptores P2X que contienen la subunidad P2X7 son los principales mediadores de la respuesta a ATP. De acuerdo con esta idea, el o-ATP (1 mM) antagonista selectivo de P2X7 (Fernández y col, 2001), reduce un 63 \pm 8 el incremento de [Ca^{2+}]_{i} inducido por Bz-ATP (Fig. 2d, e). Por su parte, el propofol (60 \muM), que desencadena las respuestas mediadas por P2X4 (Tomioka y col, 2000), promueve el incremento de [Ca^{2+}]_{i} generado por ATP 0,1 y 1 mM un 60% \pm 22 y 77% \pm 34 respectivamente (Fig. 2c, d). Por lo tanto, los receptores nativos P2X que contienen P2X4 también contribuyen a la entrada de Ca^{2+} inducida por ATP en oligodendrocitos.
La activación de los receptores P2X induce la muerte oligodendroglial dependiente de Ca^{2+}
A todas las concentraciones de ATP (0,01-1 mM) ensayadas, se produjo la muerte de un 15-27% de oligodendrocitos que se inhibe en presencia de PPADS 50 \muM y tras eliminar el Ca^{2+} del medio de cultivo (Fig. 3a). Del mismo modo el agonista Bz-ATP causó una toxicidad similar al ATP (Fig. 3b). Otros agonistas purinérgicos tales como ATP-\gamma-S, que es un análogo más estable que el ATP, y \alpha,\beta,-meATP, son también tóxicos para los oligodendrocitos, lo que excluye la posibilidad de que los metabolitos del ATP pudieran ser los agentes causantes de la toxicidad tras activar receptores distintos a los P2X. En su conjunto, los ensayos de toxicidad muestran que los oligodendrocitos son vulnerables a la activación de los receptores P2X por ATP y sus análogos.
Los oligodendrocitos expresan receptores P2X en oligodendrocitos in vitro e in situ
El análisis de la expresión de receptores P2X mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos en cultivos de oligodendrocitos diferenciados (GalC^{+}/MBP^{+}) puso de manifiesto que estas células tienen principalmente las subunidades P2X2, P2X4 y P2X7 (véase la Tabla 2).
TABLA 2 Expresión de receptores P2X en cultivos de oligodendrocitos
8
Este perfil de expresión concuerda con las propiedades electrofisiológicas y características de toxicidad observadas en estos cultivos. Además, el patrón de las subunidades observado in vitro también se corresponde con el observado in situ en el nervio óptico (Tabla 3) por medio de doble marcado de las subunidades y anticuerpos específicos del linaje oligodendroglial y astroglial (Fig.5).
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TABLA 3 Distribución de receptores P2X en oligodendrocitos en el nervio óptico de rata
9
Estos resultados inmunohistoquímicos se confirmaron mediante transferencia de Western (inmunotransferencia).
El ATP destruye oligodendrocitos in situ
Para determinar si el ATP es tóxico para los oligodendrocitos en una preparación de tejido nervioso sin disociación, se prefundieron nervios ópticos enteros aislados de ratas adultas con líquido cefalorraquídeo artificial con ATP (100 \muM) durante 3 h. En estas condiciones se produjo un incremento de > 3 veces el número de células que mostraban condensación nuclear en comparación con los nervios de control perfundidos sin ATP (Fig. 5). Las células dañadas se localizan en el eje longitudinal del nervio y forman parte de hileras de oligodendrocitos interfasciculares. La estimulación con ATP en presencia de PPADS (10 \muM) impide la muerte de los oligodendrocitos.
A continuación, se infundieron los agonistas ATP-\gamma-S y BzATP sobre el nervio óptico in vivo mediante bombas osmóticas que liberan cantidades de soluto muy pequeñas durante 3 días. El examen histológico de los nervios 7 días después del inicio de la aplicación mostró daño tisular en un área restringida próxima a la cánula (Fig. 6). Además, dicha zona presentaba una gliosis intensa, falta de mielina y daño axonal (Fig. 6). En su conjunto estos resultados indican que la activación de los P2X destruye oligodendrocitos in situ y que las lesiones in vivo comparten propiedades propias de las placas de esclerosis múltiple.
El bloqueo de los P2X7 mejora los síntomas motores de la EAE aguda y crónica
Se investigaron los efectos del antagonista de amplio espectro PPADS y del más selectivo o-ATP en el desencadenamiento y durante el transcurso de la EAE inducida por la inmunización de ratas Lewis con proteína básica de la mielina. Las ratas inmunizadas mostraron signos de déficits motores aproximadamente 10 días después de la inyección, y alcanzaron un máximo a los 14 días (Fig. 7). El tratamiento con PPADS (30 mg/kg, dos veces al día) de 7 a 14 días después de la inyección no mejoró los síntomas o durante el transcurso de la enfermedad. En cambio la aplicación de o-ATP (1 y 5 mg/kg, cada 12 h) durante el mismo periodo de tiempo redujo o impidió la aparición de los síntomas propios de la EAE (Fig. 7).
Posteriormente, se evaluó la eficacia del o-ATP para mejorar los síntomas de la EAE en un modelo remitente-recurrente-crónico. Para ello, se inmunizaron ratas DA con médula espinal singénica, observándose la aparición de déficits neurológicos graves a los 7-9 días después de la inyección, y que alcanzaban su primer pico aproximadamente a los 11 días. El tratamiento con o-ATP (2,5 mg/kg, cada 12 h), una vez establecida la intensidad máxima de los síntomas, redujo los síntomas y también eliminó aquellos propios de la fase crónica (Fig. 8).
Con objeto de comprender el mecanismo de acción mediante el cual el o-ATP mejora el pronóstico de la EAE, se evaluaron los niveles del receptor P2X7 sobre el que actúa la forma preferida de este fármaco en la médula espinal lumbosacra, la región más afectada en esta enfermedad experimental, usando transferencia de Western. Se descubrió que los niveles de esta subunidad se reducían a la mitad en los animales sometidos a EAE, y que dichos niveles retornaban a los de los controles en aquellos animales con EAE tratada con o-ATP (Fig. 9). Estos resultados indican que el tratamiento con o-ATP protege de la muerte a las células que expresan P2X7, y por consiguiente a los oligodendrocitos que son el principal tipo celular que expresa dicha subunidad en la médula espinal.
III-Discusión
Los resultados mostrados anteriormente ponen de manifiesto por primera vez que los oligodendrocitos tienen receptores P2X. Del mismo modo, se detallan las propiedades electrofisiológicas, farmacológicas y moleculares de estos receptores, así como su elevada permeabilidad al calcio. Esta última propiedad hace que los oligodendrocitos sean vulnerables a los estímulos intensos y/o prolongados mediados por estos receptores, al igual que se ha demostrado con los receptores glutamatérgicos en esta población celular (Matute y col, 2001, Trends Neurosci 24, 224-230). La vulnerabilidad de los oligodendrocitos a las señales mediadas por los receptores P2X es una de las causas del daño en el tejido nervioso que subyace a la enfermedad experimental EAE, un modelo de esclerosis múltiple. Finalmente, el bloqueo de los receptores P2X hasta el desencadenamiento de la enfermedad reduce drásticamente los síntomas neurológicos en la EAE aguda, y mejora la evolución y pronóstico en la EAE crónica una vez establecida la sintomatología.
La invención descrita en este documento constituye una vía para el tratamiento de la esclerosis múltiple, una enfermedad que carece de tratamientos eficaces que ralenticen o detengan su progresión. Las vías de intervención que han resultado en el desarrollo de fármacos en fase de ensayos clínicos o de uso como fármacos en el tratamiento de la esclerosis múltiple tienen mecanismos de acción que regulan el funcionamiento del sistema inmune. El hecho de que el bloqueo de los P2X7 pueda impedir los síntomas de la EAE aguda, un modelo de EM que mimetiza la fase inflamatoria/autoinmune de la enfermedad, indica que estos fármacos pueden ser de hecho potentes agentes inmunomoduladores que pueden impedir la autoinmunidad que desencadena la EM y otras enfermedades. Finalmente, los antagonistas de los receptores P2X7al ser agentes protectores de la muerte de los oligodendrocitos, la población celular que sufre mayor daño en la EM, tienen un gran potencial terapéutico en la fase neurodegenerativa de esta enfermedad, una fase que se prolonga durante decenios y en la que los pacientes sufren un deterioro progresivo que cursa con trastornos motores y sensitivos que produce invalidez.
Bibliografía
- Abbracchio, M.P. y Burnstock, G. (1998) Purinergic signalling: pathophysiological roles. Jpn. J. Pharmacol. 78: 113-145.
- Ansari KA, Rand A, Loch JA (1978) Biochemical and immunological studies with human optic and olfactory tracts J Neuropathol Exp Neurol 37:756-67.
- Armstrong MA, Shah S, Hawkins SA, Bell AL, Roberts SD (1988) Reduction of monocyte 5'nucleotidase activity by gamma-interferon in multiple Ann Neurol 24:12-6.
- Barnard, E.A., Simon, J. y Webb, T.E. (1997). Nucleotide receptors in the nervous system. An abundant component using diverse signal transduction mechanisms. Mol. Neurobiol. 15: 103-129.
- Braun, N., Zhu, Y., Krieglstein, J., Clumsee, C. y Zimmermann, H. (1998). Upregulation of the enzyme chain hydrolysing extracellular ATP after transient forebrain ischemia in the rat. J. Neurosci. 18: 4891-4900.
- Ciccarelli, R. Ballerini, P., Sabatino, G., Rathbone, M.P., D'Onofrio, M. Caciagli, F. y Iorio, P. (2001). Involvement of astrocytes in purine-mediated reparative processes in the brain. Int. J. Dev. Neurosci. 19: 395-414.
- Dunn, P.M., Zhong, Y. y Burnstock, G. (2001). P2X receptors in peripheral neurons. Prog. Neurobiol. 65:107-134.
- Fields, R.D. y Stevens, B. (2000). ATP: an extracellular signalling molecule between neurons and glia. Trends Neurosci. 23: 625-633.
- Franke, H., Grosche, J., Schädlich, H., Krügel, U., Allgaier, C. e Illes, P. (2001a). P2X receptor expression on astrocytes in the nucleus accumbens of rats. Neuroscience 108: 421-429.
- Franke, H., Krugel, U., Schmidt, R., Grosche, J., Reichenback, A. e Illes, P. (2001b). P2 receptor-types involved in astrogliosis in vivo. Brit. J. Pharmacol. 134: 1180-1189.
- Honda, S. y Kohsaka, S. (2001). Regulation of microglial cell function by ATP. Nihon Shinke 21: 89-93.
- James, G. y Butt, A.M. (2001). Changes in P2Y and P2X purinoceptors in reactive glia following axonal degeneration in the rat optic nerve. Neurosci. Lett. 212: 33-36.
- Matute C, Alberdi E, Domercq M, Pérez-Cerdá F, Pérez-Samartín A and Sánchez-Gómez MV (2001) The link between excitotoxicity and demyelinating diseases. Trends Neurosci. 24, 224-230.
- Matute C, Alberdi E, Ibarretxe G y Sánchez-Gómez MV (2002) Excitotoxicity in glial cells. Eur. J. Pharmacol 447:239-246.
- Queiroz, G., Gebicke-Haerter, P.J., Schobert, A., Starke, K. y von Kugelgen, I. (1997). Release of ATP from cultured rat astrocytes elicited by glutamate receptor activation. Neuroscience 78: 1203-1208.
- Ralevic, V. y Burnstock, G. (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50: 413-492.
- Rathbone, M.P., Meddlemiss, P.J., Gysbers, J.W., Andrew, C., Herman, M.A., Reed, J.K., Ciccarelli, R. Di Iorio, P. y Caciagli, F. (1999). Trophic effects of purines in neurons and glia. Prog. Neurobiol. 59: 663-690.
\newpage
- Stevens, B, Porta, S., Haak, L.L., Gallo, V. y Fields, R.D. (2002) Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron 36: 855-868.
- Zamvil, S.S. y Steinman L. (2003) Diverse targets for intervention during inflammatory and neurodegenerative phases of multiple sclerosis. Neuron 38, 685-688.

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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2717166A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-19 Converge Biotech Inc. Methods of modulating t cell-dependent immune responses
ES2338970B1 (es) * 2008-07-31 2011-03-11 Universidad Complutense De Madrid Uso de antagonistas del receptor p2x7 para favorecer el crecimiento yramificacion axonales.
US20110166223A1 (en) * 2008-08-19 2011-07-07 Cedars-Sinai Medical Center Methods of inhibiting fgfr3 signaling
ITTO20080759A1 (it) * 2008-10-15 2010-04-16 Medestea Res & Production S R L Impiego di oatp come farmaco immunodepressivo
WO2013082565A1 (en) * 2011-12-02 2013-06-06 Michael Kaleko Therapies for disorders of the cornea and conjunctiva
SG11201405559TA (en) * 2012-03-09 2014-11-27 Inst Pasteur Shanghai Cas Component and method for treating viral disease
WO2017070660A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 Baylor College Of Medicine Targeting p2 purinergic receptors to treat hepatocellular carcinoma (hcc)
US10624866B2 (en) * 2018-03-05 2020-04-21 The Industry & Academic Cooperation In Chungnam National University (Iac) Composition for prevention or treatment of chronic pain comprising Evans blue

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589458A (en) * 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same
GB9615202D0 (en) * 1996-07-19 1996-09-04 Smithkline Beecham Plc Pharmaceuticals
US6117445A (en) * 1998-01-28 2000-09-12 Link Technology Inc. Methods for the prevention and treatment of fibrosis and sclerosis
AU2003237460A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Endacea, Inc. Combination treatments for purinoceptor-related disorders

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