ES2333944T3 - Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora. - Google Patents

Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora. Download PDF

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Abstract

El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. Trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.

Description

Procedimiento mejorado de producción de licopeno mediante la fermentación de cepas seleccionadas de Blakeslea trispora.
Campo de la invención
El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.
Estado de la técnica
Los carotenoides están ampliamente distribuidos en la naturaleza, confiriendo su característico color, desde amarillo hasta rojo profundo, a numerosas sustancias naturales como zanahorias, pimientos, tomates, flores o determinados microorganismos entre los que se encuentran ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Los carotenoides pueden clasificarse en dos tipos: (i) hidrocarburos puros denominados carotenos, entre los que se encuentran compuestos como \beta-caroteno, \alpha-caroteno, \gamma-caroteno o licopeno y (ii) moléculas denominadas xantofilas, las cuales contienen oxígeno en diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc.), entre las que se encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteína, etc. Ambos grupos de compuestos presentan un comportamiento diferente en cuanto a sus propiedades físico-químicas y solubilidad en disolventes orgánicos. Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana habiéndose estudiado ampliamente sus propiedades como antioxidantes para la prevención del cáncer y otras enfermedades humanas y como precursores de la vitamina A. Recientemente se ha demostrado en ratas que el licopeno inhibe el efecto dañino del nitriloacetato férrico sobre el ADN y previene la necrosis del hígado [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys. vol. 396]. Adicionalmente, debido a sus coloraciones desde amarilla hasta roja, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2^{nd}. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].
El licopeno (C_{40}H_{56}) es un intermediario de la ruta biosintética de \beta-caroteno y las xantofilas. Posee un peso molecular de 536,85 y la siguiente fórmula molecular:
1
El licopeno, además de actuar como antioxidante, previene enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer y actúa en el control del crecimiento [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cancer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. y Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336: 1-9; Clinton, SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Esto ha dado lugar a un incremento de la demanda por parte de los consumidores. La obtención de licopeno como compuesto de alta pureza ha estado ligada en el pasado a la síntesis química [US 5208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599]. No obstante, actualmente existen vías alternativas basadas en fuentes de licopeno de origen natural y procesos de extracción específicos.
La producción de carotenoides mediante biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Las preparaciones de licopeno de origen biológico se obtienen a partir de tomate [PCT WO 97/48287, EP 608027] o mediante la fermentación de hongos mucorales de los géneros Phycomyces, Blakeslea y Choanephora [GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416, WO 00/77234]. Para conseguir una máxima producción de carotenoides con B. trispora es preciso fermentar conjuntamente las cepas (+) y (-) [Ciegler, A. (1965) Advances in Applied Microbiology 7: 1-34; Plempel, M. (1965) Planta 65: 225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME. (1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. El incremento de producción de carotenoides en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor \beta o ácidos trispóricos [WO 00/77234, Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7: 175-187]. Para biosintetizar ácidos trispóricos, el \beta-caroteno producido por las cepas (+) y (-) es metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4-dihidrotrisporol. La cepa (+) utiliza el 4-dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4-dihidrotrisporato). Por su parte, la cepa(-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol. Finalmente, el metil-4-dihidrotrisporato es convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+). Esta descripción de la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos varían en función de las cepas.
La ruta biosintética de \beta-caroteno (ver esquema 1) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados con B. trispora como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas: (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato para formar fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de \beta-caroteno. El análisis de mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de \beta-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B.J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Para la producción de licopeno es preciso disponer de cepas de B. trispora carentes de actividad licopeno ciclasa o alternativamente adicionar al medio de fermentación compuestos químicos inhibidores de la citada actividad enzimática.
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Esquema 1
2
En las patentes GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 y WO 00/77234 se describe la obtención de licopeno mediante la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora. Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen métodos de fermentación de B. trispora basados en el control del pH entre valores de 7,0 y 9,5, obteniendo producciones de 99,7 mg/l de licopeno tras 7 días de fermentación. Las patentes JP 73016189 Y JP 73016190 describen métodos de producción de licopeno con hongos mucorales basados en la adición aminas terciarias. La patente RU 2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las sustancias descritas en dichas patentes, se ha publicado el uso de otras bases nitrogenadas heterocíclicas para bloquear la síntesis de carotenoides a nivel de licopeno: nicotina [JP 09313167], imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados sustituidos [US 3369974; Ninet L., Renaut J. (1979) En: Peppler HJ, Perlman D (eds). Microbial Technology, 2^{nd}. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544]. Asimismo, se han descrito mutantes de B. trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de adicionar aminas terciarias [Mehta B.J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836-838].
Además de los hongos mucorales anteriormente mencionados, se ha descrito la producción de licopeno con algas [JP 09313167 y JP 2000152778], mediante la fermentación de Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens [US 3467579] y modificando la ruta biosintética de carotenoides de Flavobacterium sp. R1534 [US 6124113].
El licopeno puede ser obtenido a partir de productos vegetales tales como: tomate, zanahoria, pimiento, aceites vegetales, etc. Así, en la patente WO 97/48287 se describe un procedimiento para la preparación de oleorresinas ricas en licopeno a partir de tomates mediante el estrujado del tomate hasta la obtención de la pulpa, extracción del licopeno de la pulpa con disolventes orgánicos y posterior eliminación del solvente mediante evaporación, dando lugar a una oleorresina con un contenido en licopeno entre el 2-10%. Procedimientos similares de obtención de oleorresinas ricas en carotenoides en general y licopeno en particular a partir de vegetales y aceites se describen en diferentes patentes, como en la US 5245095 y la EP 580745, mediante la precipitación con sales de calcio, la US 5019668, utilizando un procedimiento de transesterificación con aceites y posterior destilación, la WO 95/16363, que describe el fraccionamiento del tomate en diferentes fracciones que incluyen una oleorresina rica en carotenoides, y la PCT WO 90/08584, que describe la extracción de licopeno mediante la utilización de fluidos en estado supercrítico, aunque el extracto obtenido es una mezcla de diferentes carotenoides y los rendimientos de extracción son muy bajos debido a su baja solubilidad.
En todos estos casos, debido a la baja concentración de licopeno en estos productos naturales y la disposición intracelular de este compuesto en determinados orgánulos como cloroplastos o cromoplastos, los rendimientos de extracción y la pureza del producto obtenido son bajos, obteniéndose oleorresinas ricas en licopeno o productos crudos deshidratados junto a cantidades variables de otros compuestos, carotenoides o no. En la mayoría de los casos los procedimientos de extracción descritos requieren la preparación del fruto mediante molienda o extrusión para facilitar la extracción del disolvente y así liberar el contenido intracelular rico en licopeno. Por último en la mayoría de los procesos descritos en estas patentes se requiere el uso de disolventes orgánicos que aparecen como trazas en la oleorresina obtenida. Asimismo en la patente IL 107999 se describe la preparación de oleorresinas muy ricas en licopeno a partir de pulpas de tomates, aunque al igual que en los casos anteriores no se obtienen cristales de licopeno de alta pureza sino concentrados lipídicos ricos en licopeno.
Por otro lado, en la patente WO 97/15554 se describe la extracción de carotenoides de origen vegetal a partir de zanahorias y tomates, entre los que se incluyen el licopeno, mediante el aislamiento de cloroplastos y cromoplastos, para proceder a continuación a la digestión de dichos orgánulos con enzimas hidrolíticas de proteínas como pectinas y/o proteasas que permiten la liberación del licopeno unido a diferentes proteínas estructurales. Mediante un tratamiento alcalino posterior y una extracción con mezclas alcohólicas de bajo peso molecular es posible obtener extractos de licopeno con una riqueza y pureza superior a las oleorresinas, aunque sin obtenerse cristales purificados de licopeno sino extractos crudos ricos en licopeno. Igualmente en la patente EP 608027 A2 se obtienen extractos concentrados de licopeno mediante el aislamiento de cromoplastos de tomates en los cuales se encuentra el licopeno en forma cristalina. Dichos extractos de cromoplastos de tomate ricos en licopeno son utilizados directamente como colorantes sin extracción posterior de los cristales de licopeno, evitando el cambio de coloración del licopeno durante la extracción y obviando el uso de solventes orgánicos. De acuerdo al procedimiento descrito en esta patente no es posible obtener licopeno puro en forma cristalina apto para uso en composiciones alimenticias o farmacéuticas, sino únicamente como colorante alimentario en forma deshidratada, liofilizada o congelada.
Otra fuente importante de licopeno son determinadas microalgas ricas en carotenoides del tipo Dunaliella. Existen diferentes procedimientos de extracción de carotenoides, y en particular de licopeno, a partir de estos organismos, tal como se refleja en las patentes US 5378369, US 4713398 y US 4680314, mediante la extracción con disolventes orgánicos (clorocarbonados, hidrocarburos, etc.) o aceites comestibles (DE 4342798). Un proceso diferente aparece descrito en la PCT WO 98/08584 donde la obtención de un extracto de licopeno se realiza utilizando CO_{2} en estado supercrítico, aunque el extracto así obtenido presenta una baja pureza en licopeno.
El licopeno también puede ser obtenido a partir de determinados hongos mucorales como Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor por fermentación en medio líquido, presentando como ventaja frente a la obtención de licopeno a partir de productos vegetales o algas la elevada concentración de este compuesto, en algunos casos superior al 5% en peso respecto a la cantidad de biomasa seca, concentraciones superiores a las obtenidas de las mejores variedades vegetales, así como la posibilidad del desarrollo biotecnológico de cepas superproductoras de estos microorganismos, ya sea mediante técnicas de mutagénesis clásica o bien mediante la aplicación de las nuevas tecnologías de biología molecular que permiten la manipulación genética de estos microorganismos, incrementando la concentración y producción de licopeno, y eliminando la producción de otros carotenoides estructuralmente relacionados.
Como ya se ha comentado, la preparación de licopeno cristalino de elevada pureza a partir de fuentes naturales requiere por lo general una etapa de extracción con disolventes orgánicos o fluidos en estado supercrítico y posteriormente diversas etapas de purificación adicionales como cromatografía, procesos de adsorción y elución y etapas de precipitación o cristalización, como por ejemplo se describe en las patentes US 3369974, EP 818255 y EP 242148. En la mayoría de los casos en los que no se utilizan estas etapas de purificación posterior y la cristalización se realiza directamente a partir de extracto mediante evaporación del disolvente hasta superar la solubilidad, la pureza del producto obtenido es muy baja y es preciso proceder posteriormente a procesos de recristalización del licopeno obtenido, con el agravante de que la baja solubilidad del producto implica el uso de una gran cantidad de disolvente para llevar a cabo la etapa de recristalización, lo que además conduce a un bajo rendimiento (NL 6411184, US 4439629). En ES 2157166 se describe un procedimiento para la obtención de licopeno a partir de fuentes naturales de biosíntesis, tales como Blakeslea.
En la solicitud de patente WO 96/13178 se describe la preparación de concentrados de licopeno cristalino estabilizado en un medio líquido compatible alimentario en el cual el licopeno es insoluble, como etilenglicol, etanol o glicerol, obteniendo mediante molienda cristales pequeños (1-3 micras) de licopeno en suspensión en un medio líquido. Asimismo en la solicitud de patente WO 98/43620 se describe un procedimiento de aislamiento de cristales de licopeno a partir de una oleorresina mediante saponificación de diferentes triglicéridos y fosfonatos a alta temperatura y posterior dilución con agua, obteniendo cristales de licopeno entre el 75 y el 95% de pureza. Un procedimiento similar ha sido descrito recientemente para la preparación de cristales de \beta-caroteno de elevada pureza en la PCT WO 98/03480 por lavado con agua, alcoholes de bajo peso molecular o acetona, aunque no ha sido descrita su aplicación para la obtención de cristales de licopeno de alta pureza.
Es bien conocida la inestabilidad de los carotenoides en forma cristalina, siendo un procedimiento de estabilización de los mismos la preparación de dispersiones oleosas. Además, se cree que los carotenoides dispersados en aceite son absorbidos más fácilmente por el organismo. Un procedimiento alternativo para la estabilización de compuestos inestables es la microencapsulación de los mismos en matrices de almidón. Así en las patentes US 2876160, US 2827452, US 4276312, US 5976575 se describe un aumento considerable en la estabilidad de diversos compuestos, entre ellos los carotenoides, mediante encapsulación de los mismos en matriz de almidón.
Una de las principales dificultades para la utilización de los carotenoides en el campo de los colorantes es su nula solubilidad en agua, ya que muchas de las aplicaciones de los mismos tienen lugar en medios acuosos. Este problema de solubilidad se menciona en el documento US 3998753, y se resolvió preparando disoluciones de carotenoides en disolventes orgánicos volátiles, tales como hidrocarburos halogenados, y emulsionándolas con una solución acuosa de lauril sulfato sódico.
La patente US 5364563 describe un procedimiento para producir una preparación de carotenoides en polvo, que implica formar una suspensión de un carotenoide en aceite de alto punto de ebullición. La suspensión se sobrecalienta con vapor de agua durante un período máximo de 30 segundos para formar una solución de carotenoide en aceite. A continuación esta solución se emulsiona sobre una solución acuosa de un coloide y seguidamente la emulsión se seca mediante pulverización.
Descripción detallada de la invención
La presente invención describe una serie de procedimientos para la obtención de producciones elevadas de licopeno con el hongo B. trispora, así como procedimientos para su recuperación y formulación. La invención consiste en (i) el diseño de métodos para la obtención y selección de mutantes de B. trispora superproductores de licopeno, (ii) el desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación, (iii) el establecimiento de procesos de recuperación de licopeno a partir del micelio y (iv) la consecución de formulaciones que superen los problemas de estabilidad y solubilidad en diferentes medios, presentes en el estado de la técnica. B. trispora es un hongo que posee una gran importancia industrial para la producción biotecnológica de licopeno. De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el procedimiento sintético utilizado industrialmente en la actualidad. Particularmente, la invención se lleva a cabo de acuerdo con la reivindicación 1.
Con la finalidad de obtener cepas superproductoras de licopeno, en primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B. trispora con los agentes mutagénicos etilmetano sulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 ml de una solución de Triton X-100 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de filtro de nylon de 20 \mum de tamaño de poro. La concentración de esporas en la suspensión se ajustó a 10^{6} esporas/ml. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución que contenía 250 \mug/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos. Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Triton X-100 al 0,1% y se incubaron a 25ºC durante 4 días para obtener colonias aisladas.
Las estrategias utilizadas para la selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de licopeno fueron las siguientes: (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. La selección de mutantes productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos consistió en colocar filtros impregnados en ácidos trispóricos sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron a partir de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora. Las colonias con los filtros se incubaron a 25ºC, observándose que los mutantes productores de licopeno adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los productores de \beta-caroteno cuyo color era naranja. Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó el mutante LMA1 (-) (Esquema 2). La selección de mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (-) (productora de \beta-caroteno; ver Esquema 2) y las esporas mutadas se crecieron en placas de medio sólido YEPDA. Seguidamente se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-)).
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Esquema 2
3 
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Filogenia de las cepas de B. trispora (-) obtenidas a partir de B. trispora VKPM F-208 (-) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato.
La selección de mutantes superproductores de licopeno de B. trispora (+) se realizó creciendo esporas mutadas en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1%. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-). El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estimó en función de la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-). De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora CPA1 (+) (Esquema 3), la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-). El nivel de producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio líquido.
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El sistema de siglas empleado para la denominación de las cepas seleccionadas es el siguiente:
CM: Caroteno minus (-).
LM: Licopeno minus (-).
CP: Caroteno plus (+).
LP: Licopeno plus (+).
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La relación entre generaciones parentales sigue el orden del alfabeto: A es parental de B, B es parental de C, etc. El número situado tras las letras se corresponde con el número del mutante. Así por ejemplo, la denominación CMA1(-) significa que se trata de una cepa productora de caroteno (C), menos (M), parental de CMB y mutante número 1. Del mismo modo, CMA1(-), CMA2(-), CMA3(-) y CMA4(-) se corresponden con los mutantes 1, 2, 3 y 4 de una misma generación.
Esquema 3
4
Filogenia de las cepas de B. trispora (+) obtenidas a partir de B. trispora VKPM F-117(+) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato.
Las cepas (+) y (-) de B. trispora seleccionadas en medio sólido se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se sembraron matraces de inóculo independientes con las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora CMB2 (-) y posteriormente se realizó una fermentación mixta de ambas cepas en matraz. Al inicio de la fermentación (0-50 horas) se añadió un inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo imidazol en una concentración de 0.7-0.8 g/l). Una vez concluida la fermentación (alrededor de 6 días), el micelio de B. trispora se lisó mediante agitación en vortex, se extrajo el licopeno con solventes orgánicos (por ejemplo acetona) y se determinó su concentración y pureza mediante HPLC. Los niveles de producción obtenidos fueron de 3,0 g/l. El mismo tipo de fermentación se realizó con las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-), con la diferencia de que en este caso no fue necesario adicionar un inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Los niveles de producción obtenidos con estas cepas en cultivo mixto fueron de 1,2 g/l.
Las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se crecieron separadamente en matraces, se transfirieron separadamente a tanques intermedios de crecimiento y por último se fermentaron conjuntamente. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se incubó durante 100-140 horas. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/l.
Las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se realizó tal y como se ha indicado anteriormente para las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-), pero sin adicionar imidazol. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) fue de 1,6 g/l.
Un mayor rendimiento en esta fase de fermentación se obtiene mediante el control de la edad de las fases vegetativas de crecimiento de las cepas de B. trispora. Así los cultivos utilizados como inóculos tienen una edad de 30-60 horas, preferentemente de 48 horas, tanto para las cepas (+) como las (-), pero variando el número de esporas a sembrar: 800-1.000 esporas/ml y 40.000-60.000 esporas/ml, respectivamente. La incubación se realiza a unos 25ºC con un 0.1% v/v de cada inóculo se siembra en la fase de cultivo primario. La edad de dichos cultivos primarios oscila entre las 30-60 horas, preferentemente 36-48 horas, a temperaturas que oscilan entre 26-28ºC. Posteriormente se mezclan en proporción 1/10 v/v las fases primarias (+)/(-) y se siembran los fermentadores 10-20% v/v con la mezcla de dichas fases.
Dada la característica intracelular del componente carotenoide biosintetizado en la fermentación, el procedimiento de recuperación a partir del medio de cultivo, preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica como primera etapa la separación de la biomasa del medio de cultivo. Esta separación puede hacerse por los procedimientos establecidos de filtración, empleando las tecnologías al uso de filtros, bien sean de bandas, rotatorios, prensa, etc., en los que una barrera constituida por la tela filtrante separa la biomasa y permite pasar la fase líquida sin biomasa, o de centrifugación, en la que haciendo uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa (normalmente mayor) se emplea una máquina del tipo de un separador centrifugo, decanter o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la fase líquida con la menor cantidad posible de biomasa. Uno de los objetivos de esta etapa consiste en reducir pérdidas y optimizar las características de cada fase consiguiendo la mayor cantidad de biomasa con el mayor contenido de residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentación, con la menor cantidad de materia activa.
El micelio húmedo resultante contiene más del 95% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 97% y más preferiblemente más del 99%. El contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5%, preferiblemente inferior al 3% y más preferiblemente inferior al 1%. Con este micelio húmedo sería posible, mediante las etapas ulteriores, la separación de licopeno. Sin embargo se ha comprobado que, relacionado con la fermentación, este micelio mantiene un porcentaje relativamente elevado de componentes lipofílicos, entre 15 y 20% (ácidos grasos y aceites) que en etapas ulteriores plantean problemas de purificación, lo que conduce a introducir, en este punto, una etapa de purificación de la biomasa. Esta etapa de purificación implica una resuspensión de la biomasa en alcohol: metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, en proporción adecuada para conseguir la máxima purificación de los componentes lipídicos. Así, el micelio húmedo se resuspende con una cantidad de alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La temperatura de resuspensión oscila entre 0ºC y la de ebullición del alcohol, preferiblemente entre 10 y 50ºC. El tiempo de contacto oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica así preparada se filtra o centrifuga, de modo que el contenido en sólidos en el filtrado o clarificado sea prácticamente nulo. El micelio húmedo resultante, que contendrá alcohol más agua en diversa proporción, contiene más del 93% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 95% y más preferiblemente más del 97%.
En la fase sobrenadante o filtrada que contiene restos de medio de cultivo y alcohol, el contenido en carotenoides es inferior al 2%, preferiblemente inferior al 1%, referido al medio de cultivo inicial. Este tratamiento con alcohol permite eliminar una serie de sustancias lipofílicas solubles en alcohol, en cantidad variable en función de las características del medio de cultivo utilizado, efectuando una purificación previa que nos va a permitir obtener un producto final cristalino de elevada pureza. Además, al eliminar una proporción variable de agua del micelio húmedo inicial, se facilita considerablemente el posterior proceso de secado. Mezclando directamente el medio de cultivo con el alcohol y manteniendo un tiempo mínimo de contacto se consigue un efecto de purificación equivalente al descrito anteriormente, con lo que se simplifica el proceso al eliminar una operación de separación sólido/liquido. La proporción medio de cultivo/alcohol puede oscilar entre 1/0,5 hasta 1/5, preferiblemente entre 1/1 y 1/3. La temperatura de la mezcla oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición de la mezcla, preferiblemente entre la temperatura ambiente y 60ºC.
El micelio deshidratado/purificado se seca. El secado puede hacerse por los procedimientos habituales en batch o en continuo. La temperatura de secado oscila entre la temperatura ambiente y 150ºC, preferiblemente no debe sobrepasar los 60ºC y más preferiblemente estar por debajo de 50ºC. El tiempo de secado depende de la temperatura empleada, oscilando entre 1 hora y 72 horas. Debido a la posible descomposición de estos carotenoides por oxidación con el oxígeno atmosférico, es conveniente efectuar esta operación de secado en ausencia de oxígeno, bien bajo atmósfera de nitrógeno o al menos a vacío. El hecho de que el producto carotenoide sea intracelular implica un acondicionamiento de la biomasa purificada, bien mediante secado más molienda, secado más disgregación o disgregación de la biomasa, que favorezca la mezcla con disolventes y facilite la extracción a estos. Para conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a extractar es necesaria una operación de ruptura previa del micelio, de modo que la superficie de contacto sea máxima. El tamaño de partícula óptimo del micelio seco y roto debe ser inferior a 3 mm, preferiblemente inferior de 1 mm y más preferiblemente inferior a 0,5 mm.
La molienda puede hacerse sobre el producto seco, mediante sistemas mecánicos con partes giratorias o fijas: mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilindros giratorios presionando uno sobre el otro (compactación o extrusión). También es posible efectuar el secado y molienda en una única etapa mediante un sistema de secado tipo flash (instantáneo) en un equipo jet mill (molino de chorro) donde el producto húmedo se alimenta a una corriente de un gas en recirculación y a temperatura elevada, de manera que el tiempo de residencia sea el mínimo para conseguir vaporizar el contenido de componentes líquidos, y el producto sea transportado, al variar las densidades, hasta un ciclón donde se recupera. Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lugar asimismo un efecto de homogeneización al chocar las partículas con las paredes.
Para la extracción del licopeno a partir de un micelio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear diversos disolventes orgánicos. Esta invención se referirá al uso de disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel nacional como comunitario, en los ámbitos tanto farmacéutico como alimentario (RDL12/04/90 y RDL16/10/96) El contenido de disolventes residuales debe ser, según el ICH, inferior a 5000 ppm, preferentemente inferior a 1000 ppm y más preferentemente inferior a 100 ppm, siempre referido a la materia seca de la mezcla líquida. La temperatura de extracción oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 50ºC y 80ºC. El tiempo de extracción será el mínimo necesario para conseguir la solubilización, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre 1 minuto y 15 minutos. La cantidad de disolvente empleada depende de la temperatura y de la riqueza del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 30 ml/g de biomasa. El número de extracciones varía desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides extractados es superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y más preferiblemente superior al 95%.
Una vez obtenido, el extracto rico en carotenoides debe ser concentrado hasta un determinado volumen. La concentración final de carotenoides en el disolvente tras concentrar oscila preferentemente entre 10 y 50 g/l. La temperatura de concentración debe ser inferior a 80ºC, preferiblemente inferior a 70ºC y más preferiblemente inferior a 50ºC. Una vez concentrado el extracto al volumen requerido se hace necesario añadir un insolubilizante de los carotenoides, concretamente un alcohol y más concretamente metanol, etanol, propanol, isopropanol o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, con lo cual el rendimiento en licopeno cristalino aumenta considerablemente. La adición del alcohol ejerce también un efecto purificante. El tiempo de cristalización oscila entre 15 min y 24 horas, preferiblemente entre 1 h y 12 h y 12 h y más preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización debe ser inferior a 25ºC, preferiblemente inferior a 5ºC.
La separación de los cristales de las aguas de cristalización se puede efectuar mediante filtración o centrifugación, desplazando las aguas de cristalización que bañan los cristales mediante un lavado con el mismo alcohol empleado para insolubilizar. Los cristales obtenidos se secan a vacío y temperatura ambiente durante al menos 1 h hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones establecidas por la legislación anteriormente mencionada y que, en el caso del licopeno, se establece una pérdida por secado inferior al 0,5%.
La pureza de los cristales obtenidos corresponde a un título superior a 95%, determinado mediante espectrofotometría mediante lectura de la absorción a 472 nm de una disolución de los cristales en n-hexano (E1% 1cm = 3450), con un contenido en otros carotenoides inferior al 3%. El contenido en cis licopeno es inferior al 3%.
El método de esta invención es especialmente aplicable para la recuperación de licopeno cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, más preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y más preferiblemente B. trispora. La extrema pureza conseguida en los cristales obtenidos por la presente metodología y el empleo de disolventes considerados como naturales hace que estos cristales sean aplicables en la industria alimentaria, farmacéutica o de cosméticos.
El producto cristalino obtenido mediante la metodología descrita en esta invención se puede envasar en recipientes opacos que impidan la fotodegradación del producto, en ausencia de oxígeno (atmósfera inerte o vacío) para evitar la oxidación y a temperaturas entre 0 y 5ºC. El producto adecuadamente envasado puede manejarse y comercializarse como tal. No obstante es conveniente incrementar la estabilidad del mismo mediante etapas ulteriores de formulación o acabado, que implican adición de antioxidantes que permiten obtener un producto acabado con una estabilidad superior a 6 meses en condiciones adecuadas de envasado.
Objeto fundamental también de esta invención es un procedimiento de preparación de licopeno que incluye su formulación en diferentes presentaciones en función de las características de la aplicación para la cual se desee emplear el licopeno. Una primera aplicación, denominada suspensión microcristalina de licopeno en aceite vegetal, consiste en la premezcla del licopeno cristalino anterior con una cantidad variable de aceite vegetal. El tipo de aceite vegetal puede ser muy variado, siendo los más habituales, aunque no los únicos, aceites de girasol, de oliva, de maíz, de soja, de algodón, etc. La dosificación del licopeno será función de la riqueza final que se desee alcanzar, siendo los valores más habituales suspensiones con un contenido en licopeno entre el 5 y el 60%, preferiblemente entre el 10 y el 30%. Para incrementar la estabilidad de la mezcla se adicionan antioxidantes liposolubles al uso, como los tocoferoles naturales, y preferentemente el D,L-alfa-tocoferol. La proporción de este compuesto oscila entre el 0,2 y el 15% respecto al peso del licopeno, preferiblemente entre el 0,5 y el 5%. Para que las formulaciones que contienen licopeno presenten una actividad fisiológica satisfactoria es necesario reducir el tamaño del cristal de licopeno. Esto se consigue con los sistemas habituales de molienda aplicables a mezclas líquidas. Objeto preferente de esta invención son los molinos de bolas que permiten una reducción del tamaño del cristal por debajo de 10 micras, preferiblemente por debajo de 5 micras, y aún preferiblemente por debajo de 2 micras, empleando microesferas de diámetro comprendido 0,5 y 0,75 mm. No obstante el tamaño de cristal puede variar en función de la aplicación particular de la suspensión, empleando en cada caso las esferas y las condiciones de molienda adecuadas. Este tamaño de cristal también condicionará las propiedades reológicas de la mezcla, en especial la viscosidad de la misma, que también se podrá adaptar en función de los requerimientos. Estas suspensiones micro-cristalinas de licopeno en aceite son adecuadas para aplicaciones del licopeno en entornos lipofílicos: margarinas, mantequillas, cremas, etc.
Una segunda aplicación, denominada formulación de licopeno dispersable en agua fría (CWD), se basa en la disolución del licopeno en un disolvente orgánico y su posterior microencapsulación en almidones modificados. Los disolventes más adecuados para efectuar esta disolución, por presentar esta molécula una elevada solubilidad, son cloroformo, benceno, tolueno, etc. Especialmente adecuado es el cloruro de metileno. No obstante debido al carácter halogenado de este último se pueden utilizar disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, etc. que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. La concentración de licopeno en el disolvente orgánico puede oscilar ente 1 y 50 g/l, preferiblemente entre 10 y 30 g/l. La temperatura de disolución puede oscilar entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 20 y 130ºC. El hecho de que el porcentaje de cis licopeno sea función de la relación temperatura/tiempo en la operación de disolución del licopeno en el disolvente orgánico implica que si se pretende obtener un producto con un bajo contenido en este isómero, o bien se emplea una temperatura de disolución baja o en caso contrario un tiempo de disolución muy corto. Así, para conseguir bajos niveles de cis, si el disolvente empleado es cloruro de metileno, metileno, la disolución se puede efectuar a 20-35ºC durante un tiempo comprendido entre 1 y 15 minutos. Por el contrario si el disolvente es acetato de isobutilo la disolución se efectuará preferentemente entre 70 y 130ºC durante unos segundos. Por el contrario, si los niveles de isómero cis no son relevantes la disolución se puede llevar a cabo sin res-tricción en las condiciones de la misma más que la consecución de la solubilidad total a nivel molecular del licopeno en el disolvente empleado. Para incrementar la estabilidad de la formulación final se disuelve conjuntamente con el licopeno en el disolvente orgánico uno o una mezcla de varios antioxidantes, preferiblemente de tipo tocoferol, palmitato de ascorbilo, etc., cada uno de ellos en proporción entre 1 y el 30%, preferiblemente entre el 10 y el 20%, respecto al peso del licopeno. También es posible incorporar en la mezcla aceite vegetal, bien de girasol, oliva, maíz, soja, algodón, etc. con objeto de favorecer la disolución del licopeno, y aportar una estabilidad adicional a la preparación. La relación licopeno/aceite puede oscilar entre 10/1 y 1/10.
La disolución de licopeno así obtenida se mezcla y emulsiona con una disolución acuosa que contiene un agente emulsionante, como por ejemplo almidón modificado, más concretamente ésteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato derivados de almidón de diversos pesos moleculares, y especialmente, aunque no exclusivamente, el Purity Gum 2000® de National Starch o el Cleargum CO 01® de Roquette, y un agente microencapsulante, consistente por ejemplo en almidón modificado, más concretamente ésteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinatos derivados de almidón de diversos pesos moleculares, y especialmente, aunque no exclusivamente, el Hi Cap 100® o el Capsul® de National Starch. Las proporciones en las que se mezclan el agente emulsionante y el agente microencapsulante pueden oscilar entre 5/95 y 95/5, preferiblemente entre 25/75 y 75/25, más preferiblemente entre 40/60 y 60/40. La concentración en agua de cada uno de los componentes de la mezcla de agente emulsionante y agente microencapsulante es variable, pudiendo ser entre el 1 y el 30%, preferentemente entre el 5 y el 20%, y más preferentemente del 10%. La mezcla de fases acuosa y orgánica se emulsiona y la emulsión obtenida se homogeneiza empleando sistemas de homogenización por diferencial de presión tipo Mantón Gaulin o Microfluidizer, habituales al uso, y preferiblemente mediante homogenización mediante fricción tangencial, como por ejemplo con un emulsionador tipo Ultraturrax durante un tiempo variable en función de la energía proporcionada por el equipo y el volumen de mezcla a emulsionar, con objeto de obtener un tamaño medio de micela inferior a 10 micras, preferiblemente inferior a 2 micras y más preferiblemente entre 0,1 y 1 micra.
Una vez formada la emulsión se efectúa la evaporación del disolvente orgánico, preferentemente por destilación a vacío a temperatura inferior a 50ºC. A medida que tiene lugar la evaporación del disolvente se produce la micro-cristalización del licopeno en la matriz de almidones. Una vez evaporado el disolvente se continúa la evaporación, con adiciones sucesivas de agua hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones de concentración máxima establecidas por la legislación y un residuo seco idóneo para el tipo de secado que se vaya a aplicar a esta mezcla líquida. Valores adecuados de materia seca de la suspensión de licopeno microencapsulado están comprendidos entre el 1 y el 30%, preferentemente entre el 10 y el 20%.
De acuerdo con la presente invención se encuentra que para secar la suspensión acuosa de licopeno obtenida son adecuados tanto el método de secado mediante pulverización a alta temperatura (atomización) como el método de pulverización sobre lecho fluidizado (granulación). Otra alternativa sería el secado mediante liofilización. De acuerdo con el método de secado mediante atomización, temperaturas adecuadas de entrada del aire de secado estarían comprendidas entre 100 y 200ºC mientras que las de salida entre 60 y 120ºC. El producto atomizado tiene un tamaño de partícula comprendido entre ente 10 y 100 micras. Con objeto de aumentar el tamaño de partícula y con ello disminuir la superficie disponible, y de esta forma aumentar la estabilidad del producto frente a la oxidación, el producto atomizado puede ser aglomerado mediante pulverización de una disolución de uno de los almidones modificados utilizados en la formulación, o la propia suspensión de licopeno microencapsulado en el seno de un lecho fluidizado del propio producto atomizado, permitiendo alcanzar tamaños de partícula que oscilan entre 50 y 500 micras, preferiblemente entre 200 y 300 micras.
El método de granulación implica el uso de un granulador de lecho fluidizado en el que se pone material de siembra, que puede ser material inerte típico, tal como partículas de azúcar, o polvo fino del mismo material a secar obtenido en procedimientos de granulación previos o en un procedimiento de secado mediante pulverización. Las partículas se mantienen en movimiento por medio de aire, y la temperatura del lecho se mantiene entre 30 y 90ºC, preferiblemente entre 50 y 80ºC. La suspensión de licopeno microencapsulado se pulveriza mediante aire precalentado a una temperatura entre 20 y 140ºC en el seno del lecho fluido, a una velocidad que asegure que las partículas que se van a revestir no se mojan demasiado ni se aglomeran. El producto granulado tiene un tamaño de partícula comprendido entre 100 y 2000 micras, preferiblemente entre 100 y 800 micras y aún preferiblemente entre 100 y 300 micras. Una vez terminada la pulverización por uno u otro método las partículas se pueden revestir. Este revestimiento se puede efectuar con aproximadamente 0,5-10% en peso seco de soluciones acuosas de diversos azúcares o incluso de alguno o una mezcla de los almidones que constituyen la fórmula objeto de la presente invención.
Deposito de microorganismos de acuerdo con el tratado de budapest
Las cepas de Blakeslea trispora han sido depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscú 113545, (Rusia), con los siguientes números y fechas: VKPM F-117 el 21-12-1979, VKPM F-208 el 20-12-1979, VKPM F-551 el 19-11-1992, VKPM F-674 el 19-11-1992, VKPM F-726 el 21-01-1997, VKPM F-727 el 21-01-1997, VKPM F-736 el 07-10-1997, VKPM F-741 el 28-01-1998, VKPM F-744 el 28-01-1998 y VKPM F-816 el 13-12-2000.
Los siguientes ejemplos describen en detalle y sin limitación la presente invención.
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Ejemplo 1
Estrategias de mutación de las cepas (+) y (-) de B. trispora
En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B. trispora, para lo cual se analizaron: (i) diferentes tipos de agentes mutagénicos, (ii) concentración del mutágeno, (iii) concentración de esporas, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs, cuya composición es la siguiente: extracto de levadura 4 g/l, almidón soluble 15 g/l, K_{2}HPO_{4} 1 g/l, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,5 g/l y agar 15 g/l, a un pH final de 5,8. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 ml de una solución de Triton X-100 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de nylon de 20 \mum de poro. La concentración de esporas en la suspensión fue alrededor de 10^{6} esporas/ml.
El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos.
El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución que contenía 250 \mug/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos.
Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Triton X100 al 0,1%. La composición por litro del medio Sutter IV es la siguiente: 40 g de glucosa, 4 g de L-asparragina, 10 g de KH_{2}PO_{4}, 40 ml de solución de microelementos 50x, y 30 g de Agar. La solución de microelementos 50x está compuesta por: 25 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,82 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O, 0,05 g/l de tiamina, 0,1 g/l de ácido cítrico, 0,075 g/l de Fe(NO_{3})_{3}.9H_{2}O, 0,05 g/l de ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0,17 g/l de MnSO_{4}.H_{2}O, 0,025g/l de CuSO_{4}.5H_{2}O y 0,025 g/l de NaMoO_{4}.2H_{2}O. Las placas sembradas se incubaron a 25ºC durante 4 días para obtener colonias aisladas.
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Ejemplo 2
Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (-) superproductores de licopeno
En este ejemplo se describen estrategias de selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de licopeno basadas en (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. En la Figura 1 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (-) utilizadas en la presente invención.
La selección de mutantes productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos se realizó colocando filtros estériles de unos 0,6 mm de diámetro, impregnados en ácidos trispóricos, sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron mediante la extracción del sobrenadante de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora con un volumen de cloroformo después de acidificar la muestra a pH 2. La fracción orgánica se extrajo con un volumen de una solución de bicarbonato sódico al 4% y se recogió la fase acuosa, la cual se acidificó para extraerla nuevamente con cloroformo. Posteriormente el cloroformo se evaporó hasta sequedad y el residuo enriquecido en ácidos trispóricos se disolvió en etanol. Los ácidos trispóricos se cuantificaron midiendo la absorbancia a 325 nm y asumiendo un coeficiente de absortividad de 70 ml x mg^{-1} x cm^{-1} (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114:1074-1082).
Los filtros estériles se incubaron en una solución de 1,2 mg/ml de ácidos trispóricos en etanol y seguidamente se dejaron secar a temperatura ambiente en condiciones estériles. Posteriormente, los filtros se colocaron sobre las colonias mutantes previamente crecidas durante 4 días a 25ºC. Las placas se incubaron a 25ºC durante 3 días adicionales, observándose que los mutantes productores de licopeno adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los productores de \beta-caroteno cuyo color era naranja.
Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se obtuvo el mutante LMA1 (-) (Figura 1), el cual podría presentar alguna mutación en el gen caRP, el cual codifica para la actividad enzimática licopeno ciclasa y, por tanto, en lugar de producir \beta-caroteno, acumularía el licopeno intermediario durante el proceso de fermentación de carotenoides. Por lo tanto, la cepa LMA1 es capaz de producir licopeno sin necesidad de adicionar inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (Ejemplo 5).
La selección de mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (productora de \beta-caroteno; ver Figura 1) tal y como se indica en el ejemplo 1. Las esporas mutadas se sembraron en placas de medio sólido YEPDA (bacto-peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l, glucosa 20 g/l y agar 20 g/l, a un pH final de 6,0), se incubaron a 25ºC durante 24 horas y seguidamente a 20ºC durante 48-72 horas. Por último, se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-)). Las cepas CMB1 y CMB2 podrían ser superproductoras de licopeno en fermentaciones mixtas con adición de inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (por ejemplo, imidazol; ejemplo 4).
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Ejemplo 3
Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (+) superproductores de licopeno
La selección de mutantes superproductores de licopeno de B. trispora (+) se realizó a partir de esporas mutadas tal y como se indica en el ejemplo 1. Dichas esporas se sembraron en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1% y se incubaron a 25ºC durante 7 días para obtener colonias aisladas. Seguida-mente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-). La distancia entre los puntos de siembra de las cepas (+) y (-) debe ser de aproximadamente 2 cm. El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estima mediante la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-). De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora CPA1 (+), la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-). El nivel de producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio líquido tal y como se describe en los ejemplos 4 y 5. En el Esquema 3 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (+) utilizadas en la presente invención.
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Ejemplo 4
Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante el cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas (+) y (-) de B. trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y pH ajustado a 6,3. La cepa B. trispora CPA1 (+) se sembró en matraces de 500 ml con 67 ml de medio a razón de 10^{3} esporas por ml. La cepa B. trispora CMB2 (-) se sembró en matraces de 500 ml con 100 ml de medio a razón de 10^{4} esporas por ml. Ambos tipos de inóculos se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 44 horas.
Una vez finalizada la incubación, se mezclaron los inóculos de las cepas (+) y (-) en una relación 1/10 (v/v), y con la mezcla se inocularon matraces de 250 ml con 20 ml de medio de fermentación a razón de 4 ml de la mezcla de cepas por matraz. Estos matraces se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 5-6 días. El medio de fermentación utilizado posee la siguiente composición por litro: 44 g de harina de soja, 19 g de harina de maíz, 5,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina, 100 ml de aceite vegetal y pH ajustado a 7,5. El medio se repartió en matraces de 250 ml, los cuales se inocularon con el 20% de una mezcla de las cepas (+) y (-) de B. trispora. Entre las 0 y las 36 horas de fermentación se añadió un inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo, 0,75 mg/ml de imidazol). Los matraces se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 6 días. Una vez concluida la fermentación, se preparó una mezcla de caldo de fermentación, perlas de vidrio y cloruro de metileno/metanol (1/1). El micelio de B. trispora se lisó mediante agitación en vortex, liberando el licopeno intracelular. El licopeno extraído con la mezcla de cloruro de metileno: metanol (proporción 1:1) fue diluido en acetona. La concentración y pureza del licopeno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida HPLC en fase reversa.
El nivel de producción obtenido en fermentaciones mixtas de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora CMB2 (-) fue de 3 g/l de licopeno en presencia de imidazol (figura 1).
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Ejemplo 5
Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-) sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas de B. trispora LMA1 (-) y CPA1 (+) seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se prepararon inóculos de las cepas (+) y (-) y se realizó la fermentación en matraz tal y como se indica en el ejemplo 4. La diferencia es que en este caso no se adicionó el compuesto químico inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Una vez concluida la fermentación se realizó la valoración del licopeno producido tal y como se describe en el ejemplo 4.
Los niveles de producción obtenidos mediante fermentación mixta de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-) fueron de 1,2 g/l de licopeno en ausencia de imidazol (figura 2).
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Ejemplo 6
Procedimiento de producción de licopeno en fermentador pre-industrial mediante cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) de B. trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. Las cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 ml con 500 ml de medio y se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 44-48 horas.
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una proporción 1/10 y con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de KH_{2}PO_{4}, 3,36 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,184 g de NaH_{2}PO_{4,} 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas a una temperatura de 25-28ºC con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol estéril a una concentración final del 0,75 g/l.
La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/l (figura 2).
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Ejemplo 7
Procedimiento de producción de licopeno en fermentador pre-industrial mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-) sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) de B. trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. La cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 ml con 500 ml de medio y se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 44-48 horas.
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una proporción 1/10 y, con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de KH_{2}PO_{4}, 3,36 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,184 g de NaH_{2}PO_{4,} 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas a una temperatura de 25-28ºC con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m.
La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno obtenido sin adición de imidazol en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) fue de 1,6 g/l (figura 2).
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Ejemplo 8
Procedimiento de recuperación de licopeno por resuspensión de la biomasa en alcohol
Se cosecharon 3 litros de caldo fermentación correspondiente a un proceso de biosíntesis en el cual la ruta biosintética estaba interrumpida a nivel de licopeno. La concentración del caldo fue de 3 g de licopeno por litro. La biomasa de este caldo se recuperó mediante filtración por buchner (filtro-embudo de porcelana que soporta un disco de papel o cartulina que ejerce de lámina filtrante), obteniendo 750 g de biomasa húmeda. La biomasa húmeda se resuspendió en 5,2 l de isopropanol aceótropo 85/15 y se agitó durante 30 minutos a 45+5ºC. La biomasa purificada se volvió a recuperar mediante buchner. Esta biomasa se secó en estufa bajo vacío a temperatura inferior a 45\pm5ºC y en un tiempo de 18 horas, hasta que el contenido en disolventes residuales/agua fue inferior al 8%. Se obtuvieron 150 g de biomasa seca y purificada con un contenido de licopeno equivalente a una riqueza del 5,5%. La biomasa seca se molió en molino de martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma riqueza específica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 150 g de biomasa molida con 2500 ml de acetato de isobutilo a 70\pm5ºC, manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno filtrando por placa filtrante. La biomasa agotada se lavó con 300 ml de acetato de isobutilo caliente sobre el propio filtro, mezclando el disolvente de lavado con el filtrado. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se concentró bajo vacío y manteniéndose la temperatura por debajo de 45\pm5ºC hasta reducir el volumen a 300 ml, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización y obtener un licopeno más puro, se añadieron 900 ml de isopropanol. La mezcla se mantuvo en agitación entre 0-5ºC y bajo nitrógeno durante 3 horas. Se filtró por buchner, lavando los cristales con 25 ml de isopropanol sobre el buchner. Se recogieron los cristales y se secaron a vacío, obteniéndose 6,5 g de cristales de licopeno con una pureza espectrofotométrica del 95%. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de cis licopeno.
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Ejemplo 9
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de formulación de licopeno en suspensión oleosa
En un molino de bolas de laboratorio tipo Minizeta 003 de Netzsch se cargaron, por este orden, microesferas de 0,5-0,75 mm de diámetro, 23,5 g de aceite de girasol (Koipe), 0,065 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck) y los 6,5 g de licopeno cristalino obtenidos según se describe en el ejemplo 8. La mezcla se molió a 3000 rpm durante 5 minutos, obteniendo 25 g un líquido viscoso de color rojo púrpura intenso. El análisis espectrofotométrico de la suspensión oleosa puso de manifiesto un contenido en licopeno del 21%. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis de licopeno. El tamaño del cristal fue inferior a 10 micras.
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Ejemplo 10
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de recuperación de licopeno por tratamiento directo con alcohol del caldo de fermentación
Se mezclaron directamente 1500 l de caldo de fermentación de licopeno (potencia en licopeno 2,3 g/l) con 4500 litros de aceótropo isopropanol/agua 85/15. Después de mantener en agitación durante 30 min a 45\pm5ºC se procedió a separar la biomasa del líquido empleando un decanter centrífugo. Se recogieron del orden de 250 Kg de biomasa húmeda purificada.
Esta biomasa empapada de agua e isopropanol se secó en secadero rotativo bajo vacío hasta un contenido en disolventes residuales/agua inferior al 8%. La temperatura de secado fue 45\pm5ºC, y el tiempo medio de residencia en el secadero de 14 horas. Se obtuvieron 85 Kg de biomasa seca con un contenido en licopeno equivalente a una riqueza específica del 3,75%.
La biomasa seca se extrusionó en un compactador Hutt-Compacktor de BEPEX, obteniendo un sólido con la misma riqueza específica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 85 Kg de sólido molido con 1650 l de acetato de isobutilo. La mezcla se calentó en línea a 60\pm5ºC durante un tiempo medio aproximado de contacto de 2 minutos y se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno mediante un decanter centrífugo. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se concentró bajo vacío y manteniendo la temperatura por debajo de 45\pm5ºC hasta reducir el volumen a 100 l, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización del licopeno se añadieron 300 l de isopropanol. Se mantuvo la mezcla en agitación durante 3 h a 0-5ºC. Se filtró por un Buchner, recogiendo los cristales de licopeno, que se secaron a vacío y temperatura ambiente. Se obtuvieron 2 Kg de producto con una pureza de 96% por espectrometría. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis.
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Ejemplo 11
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 ml de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck). La mezcla se calentó a ebullición (114ºC) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se disolvieron 12 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 12 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 ml de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,2 micras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con lo que se evaporaron los 410 ml de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 ml de agua. Se obtuvieron 203 g de formulación líquida (12,75% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,25% (9,8% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 23,3%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190ºC y a la salida de 90ºC, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,4% y una humedad del 6,5%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 23%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
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Ejemplo 12
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 ml de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck), 0,7 g de palmitato de ascorbilo (Merck) y 3,5 g de aceite de girasol (Koipe). La mezcla se calentó a ebullición (114ºC) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Al mismo tiempo se disolvieron 10 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 10 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 ml de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,4 micras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con lo que se evaporaron los 410 ml de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 ml de agua. Se obtuvieron 195 g de formulación líquida (13,25% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,3% (9,8% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 25%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190ºC y a la salida de 90ºC, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,5% y una humedad del 6,0%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 24,5%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
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Ejemplo 13
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente
7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 ml de diclorometano, adicionando 0,75 g de D,L-alfa-Tocoferol (Merck), calentando la mezcla a 35ºC durante 5 minutos. Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 ml de agua destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 15 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,4 micras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con lo que se evaporaron los 500 ml de diclorometano con aproximadamente 600 ml de agua. Se obtuvieron 400 g de formulación líquida (13,1% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,5% (11,5% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,5%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190ºC y a la salida de 90ºC, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,6% y con una humedad del 5,3%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,4%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
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Ejemplo 14
(No forma parte de la invención)
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente
7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 ml de diclorometano, adicionando 0,75 g de D,L-alfa-Tocoferol (Merck), calentando la mezcla a 35ºC durante 5 minutos Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 ml de agua destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 60 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,23 micras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con lo que se evaporaron los 500 ml de diclorometano con aproximadamente 650 ml de agua. Se obtuvieron 350 g de formulación líquida (14,4% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,6% (11,4% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 20%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación líquida se liofilizó en un equipo de laboratorio durante 24 horas, obteniendo un polvo esponjoso de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,7% y con una humedad del 7,4%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 15%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
Descripción detallada de las figuras
Figura 1. Producción de licopeno mediante fermentación mixta en matraz de la cepa B. trispora CPA1(+) con cada una de las siguientes cepas de B. trispora (-): L25, CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMB1, CMB2 y LMA1. Salvo en la fermentación mixta CPA1 (+)/LMA1 (-), en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas: % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F-744).
Figura 2. Producción de licopeno mediante fermentación mixta en fermentador de la cepa B. trispora CPA1(+) con cada una de las siguientes cepas de B. trispora (-): L25, CMA1, CMA2, CMA3, CMB1, CMB2 y LMA1. Salvo en la fermentación mixta CPA1 (+)/LMA1 (-), en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas: % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F-744).
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Referencias citadas en la descripción
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Claims (28)

1. Proceso de producción de formulaciones de licopeno a partir de fuentes biosintéticas, que comprende las siguientes etapas en sucesión:
a.
Mezclar, en un medio de cultivo para la producción de licopeno, cepas de superproducción de licopeno (+) y (-) de Blakeslea trispora que consisten, en cepas CPA 1(+) y LMA 1(-) respectivamente, donde LMA 1 (-) se obtiene por mutación de la cepa VKPM F-744 (-) con etilmetano sulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) en sucesión, además de la adición de ácidos trispóricos a los mutantes obtenidos y selección de las colonias de color rojo; y CPA 1 (+) se obtiene por mutación de VKPM F-816 (+) con etilmetano sulfonato (EMS) y selección de mutantes cultivándolos en medio sólido complementado con imidazol, transferencia a una placa en la que se ha sembrado previamente B. trispora (-) y selección mediante la intensidad de la coloración de la colonia en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-).
b.
Tratamiento de la biomasa del medio de cultivo de la etapa a) con un alcohol seleccionado entre: metanol, etanol, propanol o isopropanol y separación de una biomasa húmeda purificada.
c.
Acondicionamiento de biomasa húmeda purificada mediante secado y disgregación o ruptura.
d.
Extracción en sólido-líquido del licopeno contenido en la biomasa purificada con un disolvente orgánico de calidad alimentaria.
e.
Concentración del extracto de licopeno enriquecido.
f.
Precipitación/cristalización del licopeno a partir del extracto concentrado mediante la adición de un alcohol, seleccionado entre: metanol, etanol, propanol o isopropanol.
g.
Filtración de los cristales de las aguas de cristalización y secado, dando lugar a cristales de licopeno.
h.
Formulación de licopeno.
2. Proceso, según la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa b) se realiza separando previamente la biomasa del medio de cultivo y resuspendiendo de nuevo dicha biomasa en el alcohol, con una proporción de alcohol/biomasa de 1 ml/g a 10 ml/g.
3. Proceso, según la reivindicación 1, caracterizado por que el alcohol utilizado en la etapa b. se usa a una temperatura entre 0ºC y la correspondiente a su punto de ebullición respectivo en dicha etapa b.
4. Proceso, según la reivindicación 3, caracterizado por que el alcohol se usa a una temperatura entre 10ºC y 50ºC.
5. Proceso, según la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa b) se realiza directamente mezclando el medio de cultivo de fermentación que contiene la biomasa sin separar previamente, en el alcohol, con una proporción de medio de cultivo/alcohol entre 1/0,5 y 1/5 y a una temperatura entre la temperatura ambiente y el punto de ebullición correspondiente de la mezcla.
6. Proceso, según la reivindicación 5, caracterizado por que la proporción entre medio de cultivo/alcohol está entre 1/1 y 1/3.
7. Proceso, según la reivindicación 5, caracterizado por que la temperatura está entre la temperatura ambiente y 60ºC.
8. Proceso, según la reivindicación 1, caracterizado por que el disolvente usado en la etapa d) es un éster.
9. Proceso, según la reivindicación 8, caracterizado por que el disolvente de tipo éster se selecciona entre: acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo o acetato de isobutilo.
10. Proceso, según la reivindicación 9, caracterizado por que la cantidad de disolvente añadida en la etapa d) varía de 5 a 30 ml por g de la biomasa resultante en la etapa c.
11. Proceso, según la reivindicación 1, caracterizado por que la precipitación/cristalización del licopeno se realiza añadiendo un alcohol en el que la solubilidad del licopeno es muy baja, y que garantiza que las sustancias de carácter lipófilo adjuntas al licopeno permanezcan disueltas, tal como metanol, etanol, propanol o isopropanol.
12. Proceso, según la reivindicación 1, en el que la etapa de formulación h) comprende la preparación de licopeno dispersable en agua fría (CWD), por medio de un proceso que comprende las siguientes etapas:
i)
Se disuelven cristales de licopeno de la etapa g) en disolventes orgánicos, junto con un antioxidante, ajustando la relación temperatura/tiempo con el fin de controlar el porcentaje de licopeno cis en la formulación de licopeno CWD final.
ii)
La disolución del licopeno de la etapa i) se emulsiona o micro-encapsula en una solución acuosa de almidones modificados.
iii)
Los disolventes y parte del agua se eliminan por evaporación, obteniendo la formulación líquida.
iv)
Secado y terminación.
13. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que cuando el disolvente empleado en la etapa i) es cloruro de metileno, la temperatura varía entre 20-35ºC durante un tiempo comprendido entre 1 y 15 minutos.
14. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que cuando el disolvente empleado en la etapa i) es acetato de isobutilo, la temperatura utilizada es de 114ºC durante un tiempo de 5 minutos.
15. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que uno o una mezcla de antioxidantes son usados en la etapa i), en una proporción entre el 1-30% con respecto al peso del licopeno.
16. Proceso, según la reivindicación 15, caracterizado por que el antioxidante usado es de tipo tocoferol o palmitato de ascorbilo.
17. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que un aceite vegetal puede ser también añadido en la etapa i).
18. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que los almidones modificados usados en la etapa ii) están en forma de ésteres.
19. Proceso, según la reivindicación 18, caracterizado por que los almidones modificados usados en la etapa ii) están en forma de ésteres de octenil succinato.
20. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que el secado de la formulación líquida realizado en la etapa iv) se somete a un proceso seleccionado entre: atomización mediante pulverización a alta temperatura, granulación mediante pulverización sobre un lecho fluidizado a temperatura relativamente baja o secado mediante congelación.
21. Proceso, según la reivindicación 20, caracterizado por que el proceso de atomización mediante pulverización a alta temperatura comprende además una etapa de aglomeración mediante pulverización de una solución de uno de los almidones modificados usados en la formulación, o la propia suspensión de licopeno microencapsulado, dentro de un lecho fluidizado de dicho producto atomizado con el fin de aumentar el tamaño de las partículas, reducir el área disponible y aumentar la resistencia a oxidación del producto.
22. Proceso, según la reivindicación 20, caracterizado por que el proceso de granulación mediante pulverización sobre un lecho fluidizado comprende pulverizar una suspensión de licopeno microencapsulado sobre un material de siembra.
23. Proceso, según la reivindicación 22, caracterizado por que el material de siembra es un material inerte.
24. Proceso, según la reivindicación 22, caracterizado por que el material de siembra son partículas de azúcar o polvo fino de material granulado previamente.
25. Proceso, según la reivindicación 12, caracterizado por que la terminación realizada en la etapa iv) consiste en revestir las partículas con soluciones acuosas de azúcares o almidones modificados en una proporción del 0,5-10%.
26. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que la etapa de formulación h. consiste en la formación de una suspensión micro-cristalina de licopeno premezclando cristales de licopeno obtenidos en la etapa g. con antioxidantes y aceites vegetales en proporciones adecuadas, seguido de molienda.
27. Proceso según la reivindicación 26, en el que el aceite usado es de origen vegetal, preferiblemente seleccionado entre aceite de girasol, oliva, maíz, semilla de algodón o soja.
28. Proceso según las reivindicaciones 26 a 27, caracterizado por que se usan antioxidantes liposolubles, preferiblemente tocoferoles naturales, en una proporción del 0,2 al 15%, preferiblemente del 0,5-5% con respecto al peso del licopeno en la mezcla.
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