ES2332993T3 - STABILIZATION OF LONG CHAIN CAMELID ANTIBODIES WITH POTASSIUM SALTS. - Google Patents

Abstract

Gránulo anticuerpo que consiste esencialmente en uno o más anticuerpos de cadena pesada como los encontrados en los Camélidos, o en fragmentos derivados de los mismos, granulados con una sal de potasio, en el que el gránulo consiste en más del 80%, con preferencia más del 90%, de la sal de potasio.Antibody granule consisting essentially of one or more heavy chain antibodies such as those found in Camelids, or fragments derived therefrom, granulated with a potassium salt, in which the granule consists of more than 80%, preferably more 90% of the potassium salt.

Description

Estabilización de anticuerpos camélidos de cadena larga con sales de potasio.Stabilization of camelid antibodies from long chain with potassium salts.

Campo técnicoTechnical field

La presente invención se refiere en general a la estabilización de anticuerpos, o de fragmentos derivados de los mismos, en composiciones detergentes, en particular en composiciones detergentes blanqueadoras.The present invention relates generally to the  stabilization of antibodies, or fragments derived from themselves, in detergent compositions, particularly in bleaching detergent compositions.

Antecedentes y técnica anteriorBackground and prior art

Los anticuerpos son polipéptidos que son capaces de enlazar específicamente con compuestos contra los que fueron cultivados. Los anticuerpos se utilizan para una diversidad de propósitos, tal como inmuno ensayos. Más recientemente, se ha propuesto su replicación en aplicaciones detergentes y de limpieza. El documento WO-A-98/56885 (Unilever) revela una enzima blanqueadora que es susceptible de generar una química blanqueadora, y que tiene una alta afinidad enlazadora con las manchas presentes en los tejidos, así como una composición blanqueadora enzimática que comprende la citada enzima blanqueadora, y un procedimiento para blanquear manchas en los tejidos. La afinidad enlazadora puede estar formada por una parte de la cadena de polipéptido de la enzima blanqueadora, o la enzima puede comprender una parte de enzima que sea capaz de generar una química de blanqueo que se acopla a un reactivo que tiene una alta afinidad enlazadora respecto a las manchas presentes en los tejidos. En este último caso, el reactivo puede ser bi-específico, comprendiendo una especificidad respecto a la mancha y una respecto a la enzima. Ejemplos de tales reactivos bi-específicos mencionados en la descripción son los anticuerpos, especialmente los derivados de lo Camélidos que tienen solamente una región variable de la cadena pesada de polipéptido (V_{HH}), los péptidos, peptidomímicos, y otras moléculas orgánicas. La enzima es normalmente una oxidasa, tal como la oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y alcohol oxidasa, que sea capaz de formar peróxido de hidrógeno u otro agente blanqueador. De ese modo, si el reactivo multiespecífico es un anticuerpo, la enzima forma un conjugado enzima/anticuerpo que constituye un ingrediente de una composición detergente. Durante el lavado, dicho conjugado enzima/anticuerpo de la composición detergente es objetivado por otro sitio funcional del anticuerpo, mientras que la enzima conjugada cataliza la formación de un agente blanqueador en las proximidades de la mancha, y la mancha se verá sometida al blanqueador.Antibodies are polypeptides that are capable of specifically binding with compounds against which they were cultivated Antibodies are used for a variety of purposes, such as immuno assays. More recently, it has proposed its replication in detergent and cleaning applications. WO-A-98/56885 (Unilever) reveals a bleaching enzyme that is susceptible to generate a bleaching chemistry, and that has a high affinity linker with the stains present in the tissues, as well as a enzymatic bleaching composition comprising said enzyme bleach, and a procedure for bleaching spots on the tissues. The binding affinity can be formed by one part of the bleach enzyme polypeptide chain, or enzyme may comprise a part of enzyme that is capable of generating a bleaching chemistry that is coupled to a reagent that has a high binding affinity with respect to the spots present in the tissues. In the latter case, the reagent can be bi-specific, understanding a specificity respect to the stain and an respect to the enzyme. Examples of such bi-specific reagents mentioned in the description are the antibodies, especially those derived from Camelids that have only one variable region of the chain heavy polypeptide (VHH), peptides, peptidomimics, and other organic molecules The enzyme is normally an oxidase, such as glucose oxidase, galactose oxidase and alcohol oxidase, which is capable of forming hydrogen peroxide or other bleaching agent Thus, if the multi-specific reagent is an antibody, the enzyme forms an enzyme / antibody conjugate that It constitutes an ingredient of a detergent composition. During the washing, said enzyme / antibody conjugate of the composition detergent is objectified by another functional site of the antibody, while the conjugated enzyme catalyzes the formation of an agent bleach in the vicinity of the stain, and the stain will look subjected to bleach.

Se ha prestado poca atención con respecto a la manera en la que tales anticuerpos son añadidos a la composición detergente con el fin de conseguir el efecto blanqueador deseado del complejo enzima-anticuerpo. Se ha encontrado que la estabilidad de almacenamiento de los anticuerpos en cuanto a ese problema de las composiciones de limpieza, no es siempre satisfactoria. Existe una amplia técnica anterior con respecto a la granulación de enzimas para su uso en detergentes, pero esta tecnología no puede ser transferida directamente a los anticuerpos.Little attention has been paid regarding the manner in which such antibodies are added to the composition detergent in order to achieve the desired bleaching effect of the enzyme-antibody complex. Has been found that the storage stability of antibodies in terms of that problem of cleaning compositions is not always satisfactory There is a wide prior technique regarding the Enzyme granulation for use in detergents, but this technology cannot be transferred directly to antibodies

El objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento mediante el que los anticuerpos puedan ser incorporados en composiciones detergentes (blanqueadoras) de una manera estable.The object of the present invention is to provide a procedure whereby antibodies can be incorporated into detergent compositions (bleaches) in a stable way.

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que es posible incorporar anticuerpos en composiciones detergentes de una manera estable si los anticuerpos están granulados con sales de potasio. Esto es la inversa de la granulación de enzimas, por lo que han de tomarse medidas complicadas en la tecnología de granulación con el fin de proporcionar la estabilidad y la duración requeridas para la enzima.Now it has been surprisingly found that it is possible to incorporate antibodies into detergent compositions of a stably if antibodies are granulated with salts of potassium. This is the inverse of enzyme granulation, so that complicated measures have to be taken in the technology of granulation in order to provide stability and durability  required for the enzyme.

Además, se ha encontrado sorprendentemente que la actividad del anticuerpo fue mejorada cuando se almacenó en forma granulada, en comparación con los métodos de almacenaje de la proteína común. Esto imparte, por lo tanto, una duración sustancialmente mejorada del anticuerpo y de su comportamiento asociado en forma de polvo o en forma de producto.In addition, it has been surprisingly found that antibody activity was improved when stored in granulated form, compared to the storage methods of the  common protein This imparts, therefore, a duration substantially improved antibody and its behavior associated in powder form or in product form.

Definición de la invenciónDefinition of the invention

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un gránulo de anticuerpo que consiste esencialmente en uno o más anticuerpos de cadena pesada encontrados en los Camélidos, o en fragmentos derivados de los mismos, granulados con una sal de potasio, en el que el gránulo consiste en más de un 80%, con preferencia más de un 90%, de sal de potasio.According to a first aspect of the invention, an antibody granule is provided consisting essentially in one or more heavy chain antibodies found in Camelids, or in fragments derived therefrom, granulated with a potassium salt, in which the granule consists of more than 80%, preferably more than 90%, of salt potassium.

De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona una composición enzimática blanqueadora de manchas o anti transferencia de tinte, que comprende el gránulo de anticuerpo de la invención.According to a second aspect, it provides an enzymatic bleaching composition of stains or anti dye transfer, comprising the antibody granule of the invention.

De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un procedimiento para preparar los citados gránulos de anticuerpo de la invención.According to a third aspect, it is provided a procedure for preparing said antibody granules of the invention.

Descripción de la invenciónDescription of the invention

En su primer aspecto, la invención se refiere a un gránulo de anticuerpo según se define en la reivindicación 1. Según se ha expuesto en lo que antecede, los anticuerpos de cadena pesada son polipéptidos que son susceptibles de enlazar específicamente con compuestos contra los que fueron cultivados.In its first aspect, the invention relates to an antibody granule as defined in claim 1. As discussed above, chain antibodies heavy are polypeptides that are susceptible to binding specifically with compounds against which they were cultivated

El grado de enlace de un compuesto A con otra molécula B, puede ser expresado en general por la constante K_{d} de equilibrio químico que resulta de la siguiente reacción de enlace:The degree of bonding of a compound A with another molecule B, can be expressed in general by the constant K d of chemical equilibrium that results from the following reaction of link:

1one

La constante K_{d} de equilibrio químico viene dada por:The chemical equilibrium constant K_ {d} comes given by:

22

Se puede determinar si el ligante con la sustancia es específico o no a partir de la diferencia entre [valor K_{d}] del ligante del compuesto para esa sustancia, respecto al ligante para el material al que se aplica la sustancia, o respecto a otras sustancias que no se desea oxidizar. Para sustancias que se producen en las manchas, se puede prever que el último material sea el tejido en el que la mancha está presente, o las moléculas de tinte sobre prendas de vestir coloreadas. La diferencia entre las dos contantes de enlace debe ser mínimamente 100, y con preferencia más de 1000. Típicamente, el compuesto deberá enlazar con la sustancia coloreada con un valor K_{d} de 1*10^{-4} a 1*10^{-6}, con un enlace de fondo con el tejido con una K_{d} de 1*10^{-2} a 1*10^{-3}. Afinidades de enlace más altas (K_{d} menor de 1*10^{-3}) y/o una diferencia más grande entre el enlace de la sustancia coloreada y el fondo, podrían incrementar la selectividad del proceso de oxidación. También, la eficacia de peso del compuesto en la composición detergente total podría ser incrementada, y se necesitarían cantidades más pequeñas del compuesto.It can be determined whether the binder with the substance is specific or not from the difference between [value K d of the compound binder for that substance, with respect to binder for the material to which the substance is applied, or with respect to other substances that you don't want to oxidize. For substances that are  produced in stains, it can be expected that the latest material be the tissue in which the stain is present, or the molecules of dye on colored clothing. The difference between two link counters must be minimally 100, and preferably more than 1000. Typically, the compound should bind with the colored substance with a Kd value of 1 * 10-4 to 1 * 10-6, with a background bond with the tissue with a K_ {d} from 1 * 10-2 to 1 * 10-3. Higher Link Affinities (K_d less than 1 * 10 <3>) and / or a larger difference between the bond of the colored substance and the background could increase the selectivity of the oxidation process. Also, the effectiveness of Weight of the compound in the total detergent composition could be increased, and smaller amounts of the compound.

Los anticuerpos pueden ser extraídos a partir de varias fuentes. A partir de los ratones, se pueden obtener anticuerpos monoclonales que posean afinidades de enlace muy altas. A partir de tales anticuerpos, se pueden preparar los fragmentos Fab, Fv o scFv, que conserven sus propiedades de enlace. Tales anticuerpos o fragmentos pueden ser producidos a través de tecnología de ADN recombinante, por fermentación microbiana. Huéspedes bien conocidos de producción de anticuerpos y de sus fragmentos son la levadura, los hongos o las bacterias.Antibodies can be extracted from Various sources From the mice, they can be obtained monoclonal antibodies that have very high binding affinities. From such antibodies, fragments can be prepared Fab, Fv or scFv, which retain their binding properties. Such antibodies or fragments can be produced through recombinant DNA technology, by microbial fermentation. Well-known guests of antibody production and their Fragments are yeast, fungi or bacteria.

Una clase de anticuerpos de particular interés está formada por los anticuerpos de cadena pesada según se encuentran en Camélidos tales como el camello o la llama. Los dominios de enlace de estos anticuerpos consisten en un fragmento de polipéptido simple, en particular la región variable del polipéptido de cadena pesada (HC-V). Por el contrario, en los anticuerpos clásicos (murina, humano, etc.), el dominio de enlace consiste en dos cadenas de polipéptido (las regiones variables de de la cadena pesada (V_{h}) y de la cadena ligera (V_{1}). Procedimientos para obtener inmunoglobulinas de cadena pesada a partir de los Camélidos, o fragmentos (funcionalizados) de los mismos, han sido descritos en el documento WO-A-94/04678 (Casterman y Hamers) y en el documento WO-A-94/25591 (Unilever y Free University of Brussels).A class of antibodies of particular interest it is formed by heavy chain antibodies as found in Camelids such as camel or llama. The binding domains of these antibodies consist of a fragment of simple polypeptide, in particular the variable region of the heavy chain polypeptide (HC-V). For him on the contrary, in classical antibodies (murine, human, etc.), the binding domain consists of two polypeptide chains (the variable regions of the heavy chain (V_ {h}) and the chain light (V1). Procedures for obtaining immunoglobulins from heavy chain from Camelids, or fragments (functionalized) of them, have been described in the document WO-A-94/04678 (Casterman and Hamers) and in WO-A-94/25591 (Unilever and Free University of Brussels).

Alternativamente, los dominios de enlace pueden ser obtenidos a partir de los fragmentos V_{h} de anticuerpos clásicos por medio de un procedimiento conocido como "camelización". Con ello, el fragmento clásico V_{h} se transforma por sustitución de un número de aminoácidos, en un fragmento de tipo HC-V, con lo que se mantienen sus propiedades de enlace. Este procedimiento ha sido descrito por Riechmann y cols., en un número de publicaciones (J. Mol. Biol. (1996) 259, 957-969; Protein. Eng. (1996) 9, 531-537, Bio/Technology (1995) 13, 475-479). También, los fragmentos HC-V pueden ser producidos mediante tecnología de ADN recombinante en un número de huéspedes microbianos (bacteriano, levadura, hongo), según se describe en el documento WO-A-94/19457 (Unilever).Alternatively, link domains can be obtained from the Vh antibody fragments classics through a procedure known as "camelization." With this, the classic fragment V_ {h} is transformed by substituting a number of amino acids, into a HC-V type fragment, with which its link properties. This procedure has been described by Riechmann et al., In a number of publications (J. Mol. Biol. (1996) 259, 957-969; Protein Eng. (1996) 9, 531-537, Bio / Technology (1995) 13, 475-479). Also, the fragments HC-V can be produced using technology Recombinant DNA in a number of microbial hosts (bacterial, yeast, fungus), as described in the document WO-A-94/19457 (Unilever).

Procedimientos para producir proteínas de fusión que comprenden una enzima y un anticuerpo, o que comprenden una enzima y un fragmento de anticuerpo, son ya conocidos en el estado de la técnica. Una alternativa ha sido descrita por Neuberger y Rabbits (EP-A-194 276). Un procedimiento para producir una proteína de fusión que comprende una enzima y un fragmento de anticuerpo que fue extraído a partir de un anticuerpo con origen en Camélidos, se encuentra descrito en el documento WO-A-94/25591. Un procedimiento para producir fragmentos de anticuerpo bi-específicos ha sido descrito por Holiger y cols. (1993) PNAS 90, 6444-6448.Procedures for producing fusion proteins which comprise an enzyme and an antibody, or which comprise a enzyme and an antibody fragment, are already known in the state of technique An alternative has been described by Neuberger and Rabbits (EP-A-194 276). A process for producing a fusion protein comprising an enzyme and an antibody fragment that was extracted from of an antibody originating in Camelids, is described in WO-A-94/25591. A procedure to produce antibody fragments Bi-specific has been described by Holiger et al. (1993) PNAS 90, 6444-6448.

Una característica particularmente atractiva del comportamiento de enlace del anticuerpo, consiste en su capacidad reconocida para enlazar con una "familia" de moléculas estructuralmente relacionadas. Por ejemplo, en Gani y cols. (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 48, 277-282), se describe un anticuerpo que fue cultivado contra la progesterona, pero que también enlaza con los esteroides estructuralmente relacionados, la pregnanodiona, la pregnanolona y la 6-hidroxi-progesterona. Por lo tanto, utilizando la misma alternativa, se podrían aislar anticuerpos que enlacen con una "familia" completa de cromóforos de la mancha (tales como los polifenoles, las porfirinas, o los carotenoides según se describe más adelante). Un anticuerpo de amplia acción tal como éste, podría ser utilizado para tratar diversas manchas diferentes cuando se acopla con una enzima blanqueadora.A particularly attractive feature of  antibody binding behavior, consists of its ability recognized to link with a "family" of molecules structurally related. For example, in Gani et al. (J. Steroid Biochem. Molec Biol. 48, 277-282), is describes an antibody that was cultured against progesterone, but that also binds with steroids structurally related, pregnanodione, pregnanolone and 6-hydroxy-progesterone. For the both, using the same alternative, could be isolated antibodies that bind to a complete "family" of stain chromophores (such as polyphenols, porphyrins, or carotenoids as described below). A broad-acting antibody such as this one could be used to treat various different spots when coupled with a bleaching enzyme

Se pueden prever diversas clases de otros compuestos que suministren la capacidad de enlace específica. En lo que sigue, vamos a proporcionar un número de ejemplos de esos otros compuestos que tienen tales capacidades de enlace, sin pretender ser exhaustivos.Various kinds of others can be foreseen compounds that provide the specific binding capacity. In Following, we will provide a number of examples of those others  compounds that have such binding capabilities, without intending be exhaustive

1. Péptidos1. Peptides

Los péptidos tienen normalmente afinidades de enlace más bajas con las sustancias de interés que los anticuerpos. Sin embargo, las propiedades de enlace de los péptidos pueden ser suficientes para proporcionar el efecto de enlace deseado. Un péptido que es susceptible de enlazar selectivamente con otra sustancia, puede ser obtenido, por ejemplo, a partir de una proteína que se sepa que enlaza con esa sustancia específica. Un ejemplo de péptido de ese tipo podría ser una región de enlace extraída de un anticuerpo cultivado contra esa sustancia.Peptides normally have affinities of lower bond with the substances of interest than antibodies. However, the binding properties of the peptides can be sufficient to provide the desired bonding effect. A peptide that is capable of selectively binding with another substance, can be obtained, for example, from a protein that is known to bind with that specific substance. A example of such a peptide could be a binding region extracted from an antibody cultured against that substance.

Alternativamente, los péptidos que enlazan con esa sustancia pueden ser obtenidos mediante el uso de librerías combinatorias de péptidos. Una librería de ese tipo puede contener hasta 10^{10} péptidos, entro los que se puede aislar el péptido con las propiedades de enlace deseadas. (R.A. Houghten, Trends in Genetics, Vol. 9, núm. 7, 235-239). Se han descrito varias realizaciones para este procedimiento (J. Scott y cols., Science (1990), Vol. 249, 386-390; Fodor y cols., Science (1991), Vol. 251, 767-773; K. Lam y cols., Nature (1991), Vol. 354, 82-84; R.A. Houghten y cols., Nature (1991), Vol. 354, 84-86).Alternatively, the peptides that bind with that substance can be obtained through the use of libraries peptide combinatorics. Such a library can contain up to 10 10 peptides, among which the peptide can be isolated with the desired link properties. (R.A. Houghten, Trends in Genetics, Vol. 9, no. 7, 235-239). Have been described several embodiments for this procedure (J. Scott et al., Science (1990), Vol. 249, 386-390; Fodor et al., Science (1991), Vol. 251, 767-773; K. Lam et al., Nature (1991), Vol. 354, 82-84; R.A. Houghten and cols., Nature (1991), Vol. 354, 84-86).

Se pueden producir péptidos adecuados mediante síntesis orgánica, utilizando por ejemplo el procedimiento Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154). Alternativamente, los péptidos pueden ser producidos mediante tecnología de ADN recombinante en huéspedes microbianos (levadura, mohos, bacterias), (K.N. Faber y cols., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 45, 72-79).Suitable peptides can be produced by organic synthesis, using for example the procedure Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154). Alternatively, the peptides can be produced by recombinant DNA technology in hosts microbials (yeast, molds, bacteria), (K.N. Faber et al., Appl. Microbiol Biotechnol (1996) 45, 72-79).

2. Peptidomímicos2. Peptidomimics

Con el fin de mejorar la estabilidad y las propiedades de enlace de un péptido, la molécula puede ser modificada mediante la incorporación de aminoácidos no naturales y/o de enlaces químicos no naturales entre los aminoácidos. Tales moléculas se denominan peptidomímicos (H.U. Saragovi y cols., Bio/Technology (1992), Vol. 10, 773-778; S. Chen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), Vol. 89, 5872-5876). La producción de tales compuestos está restringida a la síntesis química.In order to improve stability and binding properties of a peptide, the molecule can be modified by incorporating unnatural amino acids and / or unnatural chemical bonds between amino acids. Such molecules are called peptidomimics (H.U. Saragovi et al., Bio / Technology (1992), Vol. 10, 773-778; S. Chen and cols., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1992), Vol. 89, 5872-5876). The production of such compounds is Restricted to chemical synthesis.

3. Otras moléculas orgánicas3. Other organic molecules

Se puede prever fácilmente que se puedan encontrar otras estructuras moleculares, que no necesiten ser relacionadas con las proteínas, los péptidos o los derivados de los mismos, que enlacen selectivamente con las sustancias. Por ejemplo, algunas moléculas de ARN polimérico que hayan demostrado que enlazan con pequeñas moléculas de tinte sintético (A. Ellington y cols., Nature (1990), vol. 346, 818-822). Tales compuestos de enlace pueden ser obtenidos por aproximación combinatoria, según se describe para los péptidos (L.B. McGown y cols., Analytical Chemistry, 1 de Noviembre de 1995, 663A-668A).You can easily anticipate that they can find other molecular structures, which do not need to be related to proteins, peptides or derivatives of themselves, which selectively bond with substances. For example, some polymeric RNA molecules that have shown that bind with small molecules of synthetic dye (A. Ellington and cols., Nature (1990), vol. 346, 818-822). Such binding compounds can be obtained by approximation combinatorial, as described for peptides (L.B. McGown and cols., Analytical Chemistry, November 1, 1995, 663A-668A).

Se puede aplicar también esta aproximación para compuestos puramente orgánicos que no son poliméricos. Se han descrito procedimientos combinatorios para la síntesis y selección de las propiedades de enlace deseadas para tales compuestos (Weber y cols., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1995), 34, 2280-2282; G. Lowe, Chemical Society Reviews (1995), Vol. 24, 309-317; L.A. Thompson y cols., Chem. Rev. (1996), Vol. 96, 550-600). Una vez que se han identificado los compuestos de enlace adecuados, éstos pueden ser producidos a gran escala por medio de síntesis orgánica.This approach can also be applied to purely organic compounds that are not polymeric. They have described combinatorial procedures for synthesis and selection of the desired binding properties for such compounds (Weber et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1995), 34, 2280-2282; G. Lowe, Chemical Society Reviews (1995), Vol. 24, 309-317; THE. Thompson et al., Chem. Rev. (1996), Vol. 96, 550-600). Once suitable binding compounds have been identified, these can be produced on a large scale through synthesis organic

Cuando se utiliza la aproximación descrita en el documento WO-A-98/56885 (Unilever), los anticuerpos son dirigidos a manchas presentes en los tejidos. Se puede prever que se desee oxidar varias clases de sustancias: para aplicaciones detergentes, las sustancias coloreadas o no coloreadas que puedan ocurrir a modo de manchas en los tejidos, pueden ser un objetivo. Se pueden prever varios tipos o clases de sustancias coloreadas que se pueden producir en las manchas:When the approximation described in the WO-A-98/56885 (Unilever), The antibodies are directed to stains present in the tissues. It is possible to provide that it is desired to oxidize several classes of substances: for detergent applications, colored substances or not colored that may occur as tissue stains, They can be a goal. Several types or classes of Colored substances that can be produced in stains:

1. Estructuras derivadas de la porfirina1. Structures derived from porphyrin

Las estructuras de porfirina, coordinadas con frecuencia con un metal, forman una clase de sustancias coloreadas que se producen en las manchas. Ejemplos son el hemo o la hematina de la mancha de sangre, la clorofila como sustancia verde en las plantas, por ejemplo en la hierba o la espinaca. Otro ejemplo de una sustancia libre de metal es la bilirrubina, un producto de descomposición del hemo.Porphyrin structures, coordinated with often with a metal, they form a class of colored substances They occur in spots. Examples are heme or hematine of the blood stain, chlorophyll as a green substance in the plants, for example in grass or spinach. Another example of a metal-free substance is bilirubin, a product of heme decomposition

2. Taninos, polifenoles2. Tannins, polyphenols

Los taninos son formas polimerizadas de ciertas clases de polifenoles. Tales polifenoles son las catequinas, leuantocianinas, etc. (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edimburgo, 1972, pp. 169-198). Estas sustancias pueden ser conjugadas con fenoles simples como, por ejemplo, ácidos gálicos. Estas sustancias polifenólicas se producen en las manchas de té, manchas de vino, manchas de plátano, manchas de melocotón, etc., y son notoriamente difíciles de eliminar.Tannins are polymerized forms of certain classes of polyphenols. Such polyphenols are catechins, leuantocyanines, etc. (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edinburgh, 1972, pp. 169-198). These substances can be conjugated with simple phenols such as gallic acids. These substances Polyphenolic occur in tea stains, wine stains, Banana spots, peach spots, etc., and are notoriously hard to remove

       \newpage\ newpage
    

3. Carotenoides3. Carotenoids

(G.E. Bartley y cols., The Plant Cell (1995), Vol. 7, 1027-1038). Los carotenoides son las sustancias coloreadas que se producen en el tomate (licopeno, rojo), el mango (\beta-caroteno, amarillo-naranja). Éstos se producen en manchas de alimentos (tomate) que son también claramente difíciles de eliminar, especialmente en tejidos de color, cuando no se prevé el uso de agentes blanqueadores químicos.(G.E. Bartley et al., The Plant Cell (1995), Vol. 7, 1027-1038). The carotenoids are the colored substances that are produced in tomato (lycopene, red), mango (β-carotene, yellow orange). These occur in spots of foods (tomato) that are also clearly difficult to remove, especially in colored fabrics, when the use of chemical bleaching agents.

4. Antocianinas4. Anthocyanins

(P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edimburgo, 1972, 135-169). Estas sustancias son las moléculas altamente coloreadas que se producen en muchas frutas y flores. Ejemplos típicos, relevantes para las manchas, son las bayas, pero también el vino. Las antocianinas tienen una amplia diversidad de patrones de glicosidación.(P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edinburgh, 1972, 135-169). These substances are the molecules highly colored that occur in many fruits and flowers. Typical examples, relevant to stains, are berries, but Also the wine. Anthocyanins have a wide diversity of glycosidation patterns

5. Productos de reacción de Maillard5. Maillard reaction products

Con el calentamiento de mezclas de moléculas de carbohidratos en presencia de estructuras de proteína/péptido, se produce una sustancia típica de color amarillo/marrón. Estas sustancias se producen, por ejemplo, en el aceite de cocinar, y son difíciles de eliminar de los tejidos.With the heating of mixtures of molecules of carbohydrates in the presence of protein / peptide structures, it It produces a typical yellow / brown substance. These substances are produced, for example, in cooking oil, and are difficult to remove from tissues.

6. Tintes en solución6. Dyes in solution

Para la prevención de transferencia de tinte desde una pieza coloreada de tejido a otras prendas de vestir durante el lavado, es válido blanquear específicamente las moléculas de tinte presentes en la solución de lavado. Se utilizan varios tipos de tintes para tejidos, y se puede prever por lo tanto que sean un objetivo con respecto a los procesos de oxidación: por ejemplos, tintes de azufre, colorantes de cuba, tinte directo, tintes reactivos y tintes azoicos.For the prevention of dye transfer from a colored piece of fabric to other clothing during washing, it is valid to specifically bleach the dye molecules present in the wash solution. Are used various types of dyes for fabrics, and can therefore be foreseen that are an objective with respect to oxidation processes: by examples, sulfur dyes, Cuba dyes, direct dye, reactive dyes and azo dyes.

El gránulo de anticuerpo de la invención contiene sal de potasio. Los gránulos se fabrican utilizando tecnología de granulación estándar, por ejemplo mezclando los ingredientes en un aparato mezclador, con preferencia en presencia de un ligante.The antibody granule of the invention Contains potassium salt The granules are manufactured using standard granulation technology, for example mixing the ingredients in a mixing apparatus, preferably in the presence of a binder.

(a) La enzima(a) The enzyme

Los gránulos de anticuerpo conforme a la invención pueden ser utilizados en una composición detergente blanqueadora. Tales composiciones detergentes enzimáticas comprenden una enzima de oxidación o blanqueadora. La enzima puede, o bien ser una enzima que muestre actividad peroxidasa (que se utiliza después junto con una fuente de peróxido de hidrógeno), o bien una enzima que presente actividad oxidasa sobre compuestos fenólicos, tal como un fenol oxidasa o una laccasa. Se han descrito enzimas adecuadas en el documento EP-A-495 835 (Novo Nordisk). Por ejemplo, se pueden aislar peroxidasas adecuadas a partir de, y son reproducibles por medio de, plantas o microorganismos tales como bacterias u hongos. Los hongos preferidos son las cepas pertenecientes a la clase de la Basidiomycetes, en particular Coprinus, o a la clase de la Hyphomycetes, en particular Arthromyces, especialmente Arthromyces ramosus. Otras fuentes preferidas son Hormographiella sp., Myxococcus sp., Corallococcus sp. (documento WO-A-95/11964), o peroxidasa de semilla de soja. Ejemplos de enzimas adecuadas que muestran actividad peroxidasa sobre los compuestos fenólicos, son la catecol oxidasa y la laccasa, y la oxidasa de bilirrubina. La laccasa puede ser extraída de hongos tales como Trametes sp., Collybio sp., Fomes sp., Lentinus sp., Pleurotus sp., Rhizoctonia sp., Aspergillus sp., Neurospora sp., Podospora sp., Phlebia sp., Coriolus sp., Myceliophtora sp., Coprinus sp., Panaeolus sp., Psathyrella sp. (documento WO-A-96/06930). La oxidasa de bilirrubina puede ser obtenida a partir de Myrothecium sp., o de Stachibotrys sp.The antibody granules according to the invention can be used in a bleaching detergent composition. Such enzymatic detergent compositions comprise an oxidation or bleaching enzyme. The enzyme can either be an enzyme that shows peroxidase activity (which is then used together with a source of hydrogen peroxide), or an enzyme that exhibits oxidase activity on phenolic compounds, such as a phenol oxidase or a laccase. Suitable enzymes have been described in EP-A-495 835 (Novo Nordisk). For example, suitable peroxidases can be isolated from, and are reproducible by, plants or microorganisms such as bacteria or fungi. Preferred fungi are strains belonging to the Basidiomycetes class, in particular Coprinus , or to the Hyphomycetes class, in particular Arthromyces , especially Arthromyces ramosus . Other preferred sources are Hormographiella sp., Myxococcus sp., Corallococcus sp. (WO-A-95/11964), or soybean peroxidase. Examples of suitable enzymes that show peroxidase activity on phenolic compounds are catechol oxidase and laccase, and bilirubin oxidase. Laccasa can be extracted from fungi such as Trametes sp., Collybio sp., Fomes sp., Lentinus sp., Pleurotus sp., Rhizoctonia sp., Aspergillus sp., Neurospora sp., Podospora sp., Phlebia sp., Coriolus sp., Myceliophtora sp., Coprinus sp., Panaeolus sp., Psathyrella sp. (WO-A-96/06930). Bilirubin oxidase can be obtained from Myrothecium sp., Or from Stachibotrys sp.

Las composiciones de oxidación enzimática de la invención comprenden alrededor de 0,001 a 10 miligramos de enzima activa por litro. Una composición detergente comprenderá alrededor de un 0,001% a un 1% de enzima activa (p/p). La actividad enzimática puede ser expresada como unidades de ABTS (ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzenotiazolina-6-sulfónico). Una unidad ABTS representa la cantidad de enzima que oxidiza el ABTS, dando como resultado un incremento de 1 densidad óptica a 418 nm en un minuto. Las condiciones para el ensayo de actividad son 2 mM de ABTS, 1 mM de H_{2}O_{2}, 20 mM de Tris, pH 9. La actividad enzimática que se añade a la composición de oxidación enzimática será de alrededor de 10 a 10^{6} unidades ABTS por litro, con preferencia 10^{3} a 10^{5} unidades ABTS por litro.The enzymatic oxidation compositions of the invention comprise about 0.001 to 10 milligrams of enzyme active per liter. A detergent composition will comprise about from 0.001% to 1% active enzyme (w / w). Activity Enzymatic can be expressed as units of ABTS (acid 2,2'-azinobis (3-ethylbenzenothiazoline-6-sulfonic acid). An ABTS unit represents the amount of enzyme that oxidizes the ABTS, resulting in an increase of 1 optical density to 418 nm in a minute. The conditions for the activity test are 2 mM ABTS, 1 mM H2O2, 20 mM Tris, pH 9. The enzymatic activity that is added to the oxidation composition Enzymatic will be around 10 to 10 6 ABTS units per liter, preferably 10 3 to 10 5 ABTS units per liter.

Las enzimas oxidantes pueden ser normalmente añadidas a la composición detergente de cualquier forma adecuada, es decir, en forma de una composición granular, de un líquido o de una lechada de la enzima, o con material portador (por ejemplo, como en el documento EP-A-258 068 y en los productos Savinase® y Lipolase® de Novozymes). Una buena forma de añadir la enzima a un producto detergente líquido es en forma de una lechada que contenga un 0,5 a 50% en peso de la enzima en un tensoactivo no iónico de alcohol etoxilado, tal como se describe en el documento EP-A-450 702 (Unilever).The oxidizing enzymes can normally be added to the detergent composition in any suitable manner, that is, in the form of a granular composition, of a liquid or of a grout of the enzyme, or with carrier material (for example, as in EP-A-258 068 and in the Savinase® and Lipolase® products of Novozymes). A good one way to add the enzyme to a liquid detergent product is in form of a slurry containing 0.5 to 50% by weight of the enzyme in a nonionic ethoxylated alcohol surfactant, as described in document EP-A-450 702 (Unilever).

(b) Fuente de peróxido de hidrógeno(b) Source of hydrogen peroxide

Si contienen una peroxidasa, las composiciones blanqueadoras enzimáticas o de anti transferencia de tinte conforme a la invención, contendrán también una fuente de peróxido de hidrógeno. Ésta puede ser peróxido de hidrógeno en sí mismo, pero se prefieren formas estabilizadas de peróxido de hidrógeno, tal como perborato o percarborato. Especialmente preferido es el percarborato de sodio.If they contain a peroxidase, the compositions Enzymatic or anti-dye transfer bleaches compliant to the invention, they will also contain a source of peroxide of hydrogen. This may be hydrogen peroxide in itself, but stabilized forms of hydrogen peroxide are preferred, such as perborate or percarborate. Especially preferred is the sodium percarborate

Alternativamente, se puede emplear un sistema de generación de peróxido de hidrógeno enzimático. El sistema de generación de peróxido de hidrógeno enzimático puede ser elegido, en principio, a partir de los diversos sistemas de generación de peróxido de hidrógeno enzimático que han sido descritos en el estado de la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar una amino oxidasa y una amina, un aminoácido oxidasa y un aminoácido, colesterol oxidasa y colesterol, ácido úrico oxidasa y ácido úrico, o una xantina oxidasa con xantina. Con preferencia, sin embargo, se utiliza la combinación de C_{1}-C_{4} alcanol oxidasa y C_{1}-C_{4} alcanol, y especialmente preferida es la combinación de metanol oxidasa y etanol. El metanol oxidasa se aísla preferentemente a partir de una cepa polimorfa de Hansenula catalasa-negativa. (véase por ejemplo el documento EP-A-244 920) (Unilever)).Alternatively, a system of Generation of enzymatic hydrogen peroxide. System Generation of enzymatic hydrogen peroxide can be chosen, in principle, from the various generation systems of enzymatic hydrogen peroxide that have been described in the state of the art For example, an amino can be used oxidase and an amine, an amino acid oxidase and an amino acid, cholesterol oxidase and cholesterol, uric acid oxidase and uric acid, or a xanthine oxidase with xanthine. Preferably, however, it use the combination of C_ {1} -C4 {alkanol oxidase and C 1 -C 4 alkanol, and especially Preferred is the combination of methanol oxidase and ethanol. Methanol oxidase is preferably isolated from a polymorphic strain of Hansenula catalase-negative. (see for example the EP-A-244 920) (Unilever)).

Un tercer aspecto de la invención consiste en un procedimiento para preparar gránulos de anticuerpo según la invención, en el que un anticuerpo se granula con sal de potasio. Se prefiere que el pH se mantenga en un valor de 6,0 a 10,0, más preferiblemente de 7 a 9. El proceso se lleva preferentemente a cabo a una temperatura de 30ºC o más alta, más preferentemente de 30ºC a 80ºC, incluso más preferentemente de 30ºC a 65ºC. La invención va a ser ahora mejor ilustrada en los ejemplos no limitativos que siguen.A third aspect of the invention consists of a  procedure for preparing antibody granules according to the invention, in which an antibody is granulated with potassium salt. It is preferred that the pH is maintained at a value of 6.0 to 10.0, more preferably from 7 to 9. The process is preferably carried conducted at a temperature of 30 ° C or higher, more preferably of 30 ° C to 80 ° C, even more preferably from 30 ° C to 65 ° C. The invention will now be better illustrated in the examples not Limitations that follow.

En las Figuras:In the Figures:

Figura 1 - Actividad de varios gránulos 1249 de doble cabeza después de su almacenamiento a temperatura ambiente;Figure 1 - Activity of several granules 1249 of double head after storage at temperature ambient;

Figura 2 - Actividad de los mismos gránulos después de su almacenamiento a 37ºC/77% H;Figure 2 - Activity of the same granules after storage at 37 ° C / 77% H;

Figura 3 - Actividad de otros varios gránulos 1249 después de su almacenamiento a temperatura ambiente;Figure 3 - Activity of several other granules 1249 after storage at room temperature;

Figura 4 - Actividad de gránulos 1249 a varios valores de pH;Figure 4 - Activity of granules 1249 to various pH values;

Figura 5 - Actividad de gránulos 1249 después de su almacenamiento a temperatura ambiente;Figure 5 - Activity of granules 1249 after storage at room temperature;

Figura 6 - Actividad de gránulos 1249 después de su almacenamiento a 37ºC/77% H;Figure 6 - 1249 granule activity after its storage at 37 ° C / 77% H;

Figura 7 - Ensayo de gránulos 1249 procesados con calor.Figure 7 - Test of granules 1249 processed with heat.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Ejemplo 1Example 1

Se construyó un anticuerpo (1249) de doble cabeza (anti Glucosa Oxidasa-anti polifenoles/Vino tinto (vino Côtes du Rhône (Co-op, UK)), de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO-A99/23221 (Unilever). Los gránulos se prepararon con el anticuerpo 1249 liofilizado para investigar las propiedades de almacenamiento conferidas por la utilización de diferentes materiales. La doble cabeza (que contenía Bicina y NaCl del proceso de purificación de intercambio iónico) fue combinado con Na_{2}SO_{4}. La mezcla fue a continuación mezclada uniformemente y ligeramente molida en un mortero. A continuación se añadieron 2,23 g de una solución a un 40% en peso de copolímero CP5 acrilato-maleato (ex BASF), gota a gota, a la mezcla sólida con mezclado frecuente. Los gránulos resultantes fueron transferidos a continuación a una bandeja plana y se dejaron secar en flujo de aire a temperatura ambiente. Los gránulos perdieron un 4,5% en peso durante el secado. Los gránulos secos fueron después molidos hasta un tamaño menor de 1000 micras.A double antibody (1249) was constructed head (anti Glucose Oxidase-anti polyphenols / Wine red wine (Côtes du Rhône wine (Co-op, UK)), according with the procedure described in the document WO-A99 / 23221 (Unilever). The granules were prepared with lyophilized 1249 antibody to investigate the properties of storage conferred by the use of different materials. The double head (which contained Bicin and NaCl of the process ion exchange purification) was combined with Na_ {2} SO_ {4}. The mixture was then mixed. evenly and lightly ground in a mortar. Then you added 2.23 g of a solution at 40% by weight of copolymer CP5 acrylate-maleate (ex BASF), drop by drop, solid mix with frequent mixing. The resulting granules they were then transferred to a flat tray and left Dry in air flow at room temperature. Granules They lost 4.5% by weight during drying. Dried granules They were then ground to a size smaller than 1000 microns.

Composición del gránuloGranule Composition

33

Los gránulos fueron realizados con glucosa en vez de con Na_{2}SO_{4}, o en los que el 50% del Na_{2}SO_{4} fue sustituido por glucosa.The granules were made with glucose in instead of with Na_ {SO} {4}, or in which 50% of the Na2SO4 was replaced by glucose.

Prueba de almacenamientoStorage test

Ésta se estableció en polvo OMO MA completamente formulado, que fue dispensado en cantidades de 1 g/vial de vidrio. Los gránulos fueron dosificados a 50 miligramos por vial. Esto se calculó de modo que proporcionara aproximadamente 1 mg/ml de doble cabeza cuando el contenido de un vial fuera disuelto en 500 ml de agua. Los viales etiquetados fueron colocados en cámaras húmedas, por muestras almacenadas a temperatura ambiente (20ºC \pm 2) cuya cámara contenía una solución saturada de carbonato potásico para proporcionar alrededor de un 44% de humedad. Para las muestras almacenadas a 37ºC \pm 1, se utilizó una solución saturada de NaCl para obtener una humedad de alrededor de un 7%. Las muestras fueron retiradas a intervalos regulares, y ensayadas en cuanto a actividad bi-específica.This was set to OMO MA powder completely formulated, which was dispensed in amounts of 1 g / glass vial. The granules were dosed at 50 milligrams per vial. This is calculated to provide approximately 1 mg / ml of double head when the contents of a vial were dissolved in 500 ml of Water. The labeled vials were placed in wet chambers, by samples stored at room temperature (20 ° C ± 2) whose chamber contained a saturated solution of potassium carbonate to provide about 44% humidity. For samples stored at 37 ° C ± 1, a saturated solution of NaCl to obtain a humidity of about 7%. The samples were removed at regular intervals, and tested for bi-specific activity

Ensayo respecto a actividad bi-específicaTest regarding bi-specific activity

Placas Microtitre Nunc Maxisorb fueron sensibilizadas durante la noche a 37ºC con 200 \mul/pocillo de vino tinto (Coop, Côtes du Rhône). Se extrajeron seis viales desde cada cámara húmeda utilizando 2 de cada tipo de gránulo, y los contenidos de cada vial fueron añadidos a 500 ml de agua desmineralizada. Para un control, se pesaron los gránulos frescos y se añadieron a 1 g de OMO MA, de los que cada uno fue añadido a frascos separados que contenían 500 ml de agua desmineralizada. Los contenidos de cada frasco fueron agitados durante 5 minutos antes de que se extrajera una cantidad alícuota de 250 \mul desde cada uno, y se diluyeran en PBST, pH 7,4, para obtener 250 ng/ml de

\hbox{doble  cabeza.}

Microtiter Nunc Maxisorb plates were sensitized overnight at 37 ° C with 200 µl / well of red wine (Coop, Côtes du Rhône). Six vials were extracted from each wet chamber using 2 of each type of granule, and the contents of each vial were added to 500 ml of demineralized water. For a control, the fresh granules were weighed and added to 1 g of OMO MA, of which each was added to separate bottles containing 500 ml of demineralized water. The contents of each bottle were shaken for 5 minutes before an aliquot of 250 µl was extracted from each one, and diluted in PBST, pH 7.4, to obtain 250 ng / ml of

 \ hbox {double head.} 

Las diluciones de control y de muestra, fueron dispensadas a razón de 200 \mul por pocillo, por duplicado, en los pocillos de las placas de vino tinto lavadas. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se retiraron las muestras sin enlazar mediante tres lavados en PBST. Se dispensó glucosa oxidasa (Gox), a 25 \mug/ml en PBST, a todos los pocillos que contenían muestra y a los pocillos adicionales que habían sido previamente incubados solamente con PBST; esto se hizo para comprobar el enlace no específico de la enzima con la placa sensibilizada. La incubación se llevó a cabo durante 1 hora, y la Gox sin enlazar fue extraída mediante lavado con PBST. Se dispensó a cada pocillo substrato que contenía TBM, 10 mM de glucosa y 2 \mug/ml, y se dejó evolucionar durante 20 minutos antes de que la reacción fuera interrumpida con la adición de 100 \mul/pocillo de HCl 1M. Las placas fueron leídas utilizando un lector de placa Dynatech a 450 nm. Las lecturas duplicadas de cada dilución fueron promediadas y representadas como porcen-
taje del control apropiado. Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2. Éstos pueden ser resumidos como sigue:Control and sample dilutions were dispensed at a rate of 200 µl per well, in duplicate, in the wells of the washed red wine plates. After a 30 minute incubation at room temperature, unbound samples were removed by three washes in PBST. Glucose oxidase (Gox), at 25 µg / ml in PBST, was dispensed to all wells containing sample and to additional wells that had previously been incubated only with PBST; This was done to check the non-specific binding of the enzyme with the sensitized plaque. Incubation was carried out for 1 hour, and the unbound Gox was extracted by washing with PBST. Each substrate well containing TBM, 10 mM glucose and 2 µg / ml was dispensed and allowed to evolve for 20 minutes before the reaction was interrupted with the addition of 100 µl / well 1M HCl. The plates were read using a Dynatech plate reader at 450 nm. Duplicate readings of each dilution were averaged and represented as percentage.
appropriate control rate. The results are shown in Figures 1 and 2. These can be summarized as follows:

Los gránulos almacenados a temperatura ambiente y que contenían sulfato de sodio, mostraron entre un 100 y un 170% de actividad de la que se vio en las muestras de control. Los gránulos de glucosa mostraron una variabilidad con una muestra que tenía una actividad de un 100% y otra con una actividad de un 80%. En ensayos posteriores, se apreció un nivel más alto de actividad que en la muestra de control hasta el día 33. Todos los gránulos probados mostraron una caída de actividad de entre un 50 y un 80% del control.The granules stored at room temperature and containing sodium sulfate, showed between 100 and 170% of activity that was seen in the control samples. The glucose granules showed variability with a sample that It had an activity of 100% and another with an activity of 80%. In subsequent trials, a higher level of activity was appreciated than in the control sample until day 33. All granules tested showed a 50 to 80% drop in activity of control

Todas las muestras almacenadas a 37ºC mostraron una actividad por encima del 100% de las muestras de control. En el día 7, la doble cabeza granulada con sulfato de sodio mostró todavía niveles de enlace por encima de los gránulos de control. Las restantes muestras mostraron un descenso significativo en la actividad bi-específica cuando se compararon con los controles apropiados. En el ensayo del día 15, no se detectó ninguna actividad en ninguna de las muestras almacenadas.All samples stored at 37 ° C showed an activity above 100% of the control samples. At day 7, the double head granulated with sodium sulfate showed still bond levels above the control granules. The remaining samples showed a significant decrease in bi-specific activity when compared to appropriate controls. In the trial on day 15, it was not detected No activity in any of the stored samples.

Las condiciones de almacenamiento elegidas fueron muy diferentes, y los resultados obtenidos así lo reflejan; a temperatura ambiente, los niveles de actividad están todavía por encima del 55% después de 33 días. A 37ºC existe una caída drástica de la actividad entre los días 7 y 15. El efecto de los ingredientes después del almacenaje, es variable, a 37ºC/77% H, con lo que la presencia de glucosa tuvo un efecto significativo adverso sobre la actividad del anticuerpo (estos gránulos mostraron una reducción de actividad de hasta un 60%). Los gránulos que contenían tanto sulfato de sodio como glucosa, mostraron una tendencia similar. Sin embargo, se detectó aún una buena actividad en el día 7 en los gránulos de sulfato de sodio, y los mismos gránulos almacenados a temperatura ambiente/40% H, tuvieron una alta actividad anticuerpo.The storage conditions chosen they were very different, and the results obtained reflect this; at room temperature, activity levels are still around Above 55% after 33 days. At 37 ° C there is a drastic fall of the activity between days 7 and 15. The effect of ingredients after storage, it is variable, at 37ºC / 77% H, with what the presence of glucose had a significant adverse effect on antibody activity (these granules showed a activity reduction of up to 60%). The granules that contained both sodium sulfate and glucose showed a tendency Similary. However, a good activity was still detected on the day 7 in the sodium sulfate granules, and the same granules stored at room temperature / 40% H, had a high antibody activity

Se deduce como conclusión que el proceso de granulación con una sal simple no afectó negativamente a la actividad de la doble cabeza. También, el almacenaje de anticuerpos en forma granulada tiene una actividad de anticuerpo superior en comparación con los métodos convencionales de almacenaje de proteínas.It follows that the process of granulation with a simple salt did not adversely affect the double head activity. Also, antibody storage in granulated form it has a superior antibody activity in comparison with conventional storage methods of proteins

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Ejemplo 2Example 2

En este ejemplo, se investigó la actividad de doble cabeza 1249 tras la granulación a diferentes valores de pH. Los gránulos de doble cabeza 1249 fueron preparados como en el Ejemplo 1. La actividad de doble cabeza de los gránulos fue evaluada con EIA. La placa Nunc maxisorb microtitre fue sensibilizada durante la noche con vino tinto, mediante dispensación de 200 \mul de vino a cada uno de los 96 pocillos, e incubación a 37ºC. Los gránulos testados incorporaban Doble cabeza 1249 y una de las siguientes sales:In this example, the activity of double head 1249 after granulation at different pH values. The 1249 double head granules were prepared as in the Example 1. The double head activity of the granules was evaluated with EIA. The Nunc maxisorb microtiter plate was sensitized overnight with red wine, by dispensing 200 µl of wine to each of the 96 wells, and incubation at 37 ° C. The tested granules incorporated double head 1249 and one of the following salts:

carbonato de sodio, pH 10,4carbonate sodium, pH 10.4

bicarbonato de sodio, pH 8,9baking soda sodium, pH 8.9

sulfato de sodio, pH 7,2sulfate sodium, pH 7.2

sulfato de potasio, pH 6sulfate potassium, pH 6

fosfato de potasio, pH 5,8.phosphate of potassium, pH 5.8.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Las muestras de gránulos fueron diluidas para obtener una curva de dilución con la siguiente gama: 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,57, 0,785, 0,39, 0,196, 0,098 \mug/ml en PBST. Cada dilución fue dispensada por duplicado en pocillos lavados y sensibilizados, e incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de que la muestra sin enlazar fuera retirada mediante lavado.The granule samples were diluted to obtain a dilution curve with the following range: 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.57, 0.785, 0.39, 0.196, 0.098 µg / ml in PBST. Each dilution was dispensed in duplicate in washed wells and sensitized, and incubated for 30 minutes at temperature environment before the unbound sample was removed by washing.

Se dispensó glucosa oxidasa a 25 \mug/ml en PBST en los pocillos, y la incubación se llevó a cabo durante 30 minutos adicionales. La placa fue lavada de nuevo con tres cambios de PBST antes de que se añadiera el regulador de substrato, el cual comprendía 10 mM de glucosa, TMB y 2 \mug/ml de HRP. La reacción fue interrumpida después de 20 minutos con la adición de 100 \mul/pocillo de HCl 1M. La placa fue leída a 450 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4. La Figura 3 muestra la pérdida de actividad a un % con relación a los gránulos de sulfato de sodio, y la Figura 4 muestra la pérdida de actividad a varios valores de pH.Glucose oxidase was dispensed at 25 µg / ml in PBST in the wells, and incubation was carried out for 30 additional minutes The plate was washed again with three changes PBST before the substrate regulator was added, which  it comprised 10 mM glucose, TMB and 2 µg / ml HRP. The reaction was interrupted after 20 minutes with the addition of 100 µl / well of 1M HCl. The plate was read at 450 nm. The results are shown in Figures 3 and 4. Figure 3 shows the loss of activity at% in relation to sulfate granules of sodium, and Figure 4 shows the loss of activity to several pH values

La mayor pérdida se atribuye a los gránulos con los pHs más alto y más bajo, aunque la actividad restante es todavía muy buena en estas circunstancias. A un pH de 6,5 existe muy poca diferencia en comparación con el control, siendo éste un resultado esperado debido a que el pH de los gránulos es muy similar. A un pH de 8,9, sorprendentemente, se perdió poca actividad.The greatest loss is attributed to the granules with the highest and lowest pHs, although the remaining activity is Still very good in these circumstances. At a pH of 6.5 there is very little difference compared to the control, this being a expected result because the pH of the granules is very Similary. At a pH of 8.9, surprisingly, little was lost activity.

Ejemplo 3Example 3

Se investigó el comportamiento al almacenaje del granulado de doble cabeza a valores diferentes de pH. Se prepararon cabezas dobles 1249 que contenían Na_{2}SO_{4} como en el Ejemplo 1. La concentración de doble cabeza en gránulo seco fue del 1,94%. Utilizando el mismo procedimiento, se prepararon las siguientes variantes:The storage behavior of the double head granules at different pH values. They prepared 1249 double heads containing Na 2 SO 4 as in the Example 1. The concentration of double head in dry granule was of 1.94%. Using the same procedure, the following variants:

100100

Prueba de almacenamientoStorage test

Ésta fue establecida en polvo de base OMO, que fue dispensado en cantidades de 0,25 g/vial de vidrio. Los gránulos fueron dosificados a 50 mg por vial. Esto fue calculado de modo que se proporcionaran 4 mg de doble cabeza cuando el contenido de un vial fuera disuelto en 125 ml de agua. Se colocaron viales etiquetados en cámaras de humedad; para las muestras almacenadas a temperatura ambiente, la cámara contenía una solución de carbonato de potasio para proporcionar \sim44% de humedad. Las lecturas de temperatura y de humedad fueron monitorizadas con higrómetros. Para las muestras almacenadas a 37ºC \pm 1, se utilizó una solución saturada de NaCl para proporcionar \sim75% de humedad. Las muestras fueron retiradas a intervalos regulares y testadas en cuanto a actividad bi-específica.This was established in OMO base powder, which It was dispensed in amounts of 0.25 g / glass vial. Granules  They were dosed at 50 mg per vial. This was calculated so that 4 mg of double head be provided when the content of a vial was dissolved in 125 ml of water. Vials were placed labeled in humidity chambers; for samples stored at room temperature, the chamber contained a carbonate solution of potassium to provide ~ 44% moisture. The readings of Temperature and humidity were monitored with hygrometers. For the samples stored at 37 ° C ± 1, a solution was used saturated NaCl to provide ~ 75% moisture. The samples were taken at regular intervals and tested in As for bi-specific activity.

Procedimiento de ensayoTest procedure

Placas Microtitre Nunc Maxisorb fueron sensibilizadas durante la noche a 37ºC con 200 \mul/pocillo de vino tinto (Coop, Côtes du Rhône). Se extrajeron diez viales desde cada cámara de humedad utilizando 2 de cada tipo de gránulo. Como control, se extrajo mediante pesado base de Omo fresco y se añadió a 125 ml de agua desmineralizada, a lo que se añadieron 4 mg de extracto de doble cabeza que no había sido secado por congelación. Los contenidos de los viales almacenados fueron añadidos, cada uno de ellos, a 125 ml de agua desmineralizada en frascos cónicos de 250 ml. Las soluciones fueron agitadas durante 5 minutos antes de que se extrajera una cantidad alícuota de 250 \mul desde cada uno, y se diluyeran en PBST, pH 7,4, para obtener 1 mg/ml de doble cabeza. Las diluciones de control y de muestra fueron dispensadas a 200 \mul por pocillo, por duplicado, en los pocillos de las placas de vino tinto lavadas, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de que la proteína sin enlazar fuera retirada mediante tres lavados en PBST. Se dispensó glucosa oxidasa (Gox) a razón de 25 \mug/ml en PBST a todos los pocillos que contenían muestras y a pocillos adicionales que habían sido previamente incubados solamente con PBST; esto se hizo para comprobar el enlace no específico de la enzima con la placa sensibilizada. La incubación se llevó a cabo durante 1 hora; la Gox sin enlazar fue extraída mediante lavado con PBST. Se dispensó substrato que contenía TMB, 10 mM de glucosa y 2 \mug/ml de HRP, a cada pocillo, y se permitió su desarrollo durante 20 minutos antes de que la reacción fuera interrumpida con la adición de 100 \mul/pocillo de HCl 1M. Las placas fueron leídas a 450 nm utilizando un lector de placa Dynatech. Las muestras fueron ensayadas a diferentes intervalos durante un período de 60 días.Microtiter Nunc Maxisorb plates were sensitized overnight at 37 ° C with 200 µl / well of red wine (Coop, Côtes du Rhône). Ten vials were extracted from each humidity chamber using 2 of each type of granule. How control, was extracted by heavy fresh Omo base and added to 125 ml of demineralized water, to which 4 mg of double head extract that had not been freeze dried. The contents of the stored vials were added, each of them, to 125 ml of demineralized water in conical bottles of 250 ml The solutions were stirred for 5 minutes before an aliquot amount of 250 µl was extracted from each one, and diluted in PBST, pH 7.4, to obtain 1 mg / ml double head. Control and sample dilutions were dispensed to 200 µl per well, in duplicate, in the wells of the red wine plates washed, and incubated for 30 minutes at room temperature before unbound protein was removal by three washes in PBST. Glucose oxidase was dispensed (Gox) at a rate of 25 µg / ml in PBST to all wells that they contained samples and additional wells that had been previously incubated only with PBST; this was done to check the non-specific binding of the enzyme with the plate sensitized The incubation was carried out for 1 hour; the Gox unbound was extracted by washing with PBST. It was dispensed substrate containing TMB, 10 mM glucose and 2 µg / ml HRP, to each well, and its development was allowed for 20 minutes before the reaction was interrupted with the addition of 100 µl / well of 1M HCl. The plates were read at 450 nm using a Dynatech plate reader. The samples were tested at different intervals over a period of 60 days.

Para cada muestra, se promediaron los puntos duplicados y se determinó la desviación estándar. Para comparar la actividad de los diferentes tipos de gránulos, las lecturas de las muestras duplicadas fueron promediadas y comparadas con el control húmedo en cuanto a actividad. Las Figuras 5 y 6 muestran el % de actividad después de 60 días para las muestras almacenadas a 22ºC y 37ºC.For each sample, the points were averaged duplicates and the standard deviation was determined. To compare the activity of the different types of granules, the readings of the duplicate samples were averaged and compared to the control wet in activity. Figures 5 and 6 show the% of activity after 60 days for samples stored at 22 ° C and 37 ° C

La actividad de la doble cabeza se mantuvo durante el período de almacenamiento cuando se incluyeron sales de potasio en el proceso de granulación. Existen algunas incidencias de actividad mayor del 100% del control, pero éstas no son significativas. La actividad de doble cabeza fue también mantenida a un nivel alto cuando se incorporaron sales bicarbonato en el gránulo. En la muestra ensayada el día 60 detectamos un descenso del 30% en la actividad de doble cabeza de los gránulos de bicarbonato. El mantenimiento de la actividad de doble cabeza en presencia de carbonato, es muy diferente comparativamente. La actividad en estos gránulos fue medida el día 0, siendo del 9,1% del control. Este bajo nivel de actividad se debe probablemente al ambiente muy básico del gránulo, que provoca cambios conformacionales en primera instancia, y rotura de proteína a largo plazo.The double head activity remained during the storage period when salts of Potassium in the granulation process. There are some incidents of activity greater than 100% of the control, but these are not significant. The double headed activity was also maintained. at a high level when bicarbonate salts were incorporated into the granule. In the sample tested on day 60 we detected a decrease 30% in the double head activity of the granules of baking soda. The maintenance of double head activity in presence of carbonate, is very different comparatively. The activity in these granules was measured on day 0, being 9.1% of control This low level of activity is probably due to very basic granule environment, which causes changes conformational in the first instance, and long protein breakage term.

También se estudió en el Ejemplo 1 el efecto del sulfato de sodio en los gránulos de doble cabeza, en los que se midieron concentraciones más bajas de doble cabeza después de un período de almacenamiento de 33 días. Esta prueba produjo resultados similares, la actividad de doble cabeza estuvo entre 60-80% entre los días 1-28, pero inició una caída por debajo del 50% a partir del día 46. En estas condiciones, los componentes preferidos podían ser tanto las sales de potasio como el bicarbonato. Los resultados del almacenamiento a 37ºC varían enormemente y se han resumido en la Figura 7. A partir de estos datos, resulta evidente que los gránulos de carbonato tienen una actividad muy baja el día 0, y por lo tanto no fueron testados después del día 1. Las variantes de potasio muestran, de nuevo, una notable actividad de doble cabeza, siendo estas condiciones susceptibles de determinar que los gránulos de sulfato de potasio muestran una reducción en la actividad de doble cabeza a partir del día 14, y que a partir del día 21 existe un descenso significativo (\sim90%) en la actividad detectada, pudiéndose medir a partir del día 28 menos del 10% de la actividad de control. Por el contrario, los gránulos de fosfato de potasio mantienen la actividad de doble cabeza al 100% del control hasta el día 46, cuando se produce un descenso de \sim40%. La última medición realizada el día 60, detectó todavía un 40% de actividad de doble cabeza en esos gránulos. El uso del adyuvante acídico CP45 puede ser contributivo a la falta de estabilidad en este caso. La doble cabeza mostró menos estabilidad en los gránulos de bicarbonato en esas condiciones, conservando una actividad muy pequeña el día 14. Con el sulfato de sodio, la pérdida de actividad fue también completa para el día 14, pero la pérdida fue más gradual que con la caída severa observada con el bicarbonato. En esas condiciones, el fosfato de potasio mantiene la actividad de doble cabeza más tiempo que cualquiera de los otros componentes testados.The effect of sodium sulfate in double headed granules, in which measured lower concentrations of double head after a 33 day storage period. This test produced similar results, double head activity was between 60-80% between days 1-28, but began a fall below 50% from day 46. In these conditions, the preferred components could be both salts of potassium such as bicarbonate. Storage results to 37ºC vary greatly and have been summarized in Figure 7. From From these data, it is clear that carbonate granules they have a very low activity on day 0, and therefore they were not tested after day 1. Potassium variants show, from again, a remarkable double-headed activity, these being conditions likely to determine that sulfate granules of potassium show a reduction in double head activity at from day 14, and that from day 21 there is a decrease significant (sim90%) in the detected activity, being able to measure from day 28 less than 10% of the control activity. On the contrary, potassium phosphate granules maintain the double head activity at 100% control until day 46, when a decrease of sim40% occurs. The last measurement performed on day 60, it still detected a 40% double activity head on those granules. The use of CP45 acidic adjuvant can be contributory to the lack of stability in this case. The double head showed less stability in bicarbonate granules in those conditions, keeping a very small activity on day 14. With sodium sulfate, the loss of activity was also complete for day 14, but the loss was more gradual than with the severe fall observed with bicarbonate. Under those conditions, the potassium phosphate keeps double head activity longer than any of the other components tested.

A 37ºC, los gránulos de fosfato de potasio absorbieron humedad del entorno de almacenamiento. Sin embargo, esto no pareció afectar a la actividad de la doble cabeza. El alto pH del gránulo de carbonato desactivó la doble cabeza durante el almacenamiento normal a bajo nivel de humedad, y por lo tanto resulta totalmente inapropiado para su uso durante la granulación de la doble cabeza.At 37 ° C, potassium phosphate granules absorbed moisture from the storage environment. But nevertheless, This did not seem to affect the activity of the double head. The tall Carbonate granule pH deactivated the double head during normal storage at low humidity, and therefore It is totally inappropriate for use during granulation of the double head.

Ejemplo 4Example 4 Comparación de gránulos procesados a diferentes temperaturasComparison of processed granules to different temperatures

Se prepararon gránulos de doble cabeza 1249 con el objetivo de ver el efecto de varios procedimientos de procesamiento, y para ver si se puede mantener el tiempo de secado en un mínimo con el uso de temperaturas incrementadas. Esto podría ser ventajoso debido a que el uso de calor en la preparación de enzimas es normalmente perjudicial para la actividad de la enzima. Se prepararon los siguientes gránulos de doble cabeza 1249:1249 double head granules were prepared with the objective of seeing the effect of various procedures of processing, and to see if drying time can be maintained at a minimum with the use of increased temperatures. This could be advantageous because the use of heat in the preparation of Enzymes is normally harmful to the activity of the enzyme. The following 1249 double head granules were prepared:

44

La concentración de doble cabeza en el gránulo seco fue del 2,22%. Los gránulos sulfato fueron divididos en 4 fracciones separadas, cada una de las cuales fue secada bajo condiciones diferentes. Estas fueron:The double head concentration in the granule Dry was 2.22%. The sulfate granules were divided into 4 separate fractions, each of which was dried under different conditions. These were:

a) Durante la noche, a temperatura ambiente en flujo de airea) During the night, at room temperature in air flow

b) 10 minutos a 65ºC en un hornob) 10 minutes at 65 ° C in an oven

c) 30 minutos a 65ºC en un hornoc) 30 minutes at 65 ° C in an oven

d) 60 minutos a 65ºC en un horno.d) 60 minutes at 65 ° C in an oven.

Se midió la actividad utilizando el mismo método que el dado en el Ejemplo 2. Las muestras fueron diluidas para proporcionar 11 \mug/ml en PBST, siendo éste un diluido doble para obtener una gama de ensayo. Los resultados se dan en la Figura 7. Se encontró que la temperatura usada para el secado no afectó significativamente a la actividad de la doble cabeza. Las muestras secadas durante 10 minutos dieron el mismo resultado de ensayo que las secadas durante una hora. La muestra secada durante la noche a temperatura ambiente, dio una lectura ligeramente más alta, pero esto no es estadísticamente significativo.Activity was measured using the same method. than the one given in Example 2. The samples were diluted to provide 11 µg / ml in PBST, this being a double dilute to get a test range. The results are given in the Figure 7. It was found that the temperature used for drying did not affect significantly to double head activity. The samples dried for 10 minutes gave the same test result as dried for an hour. The dried sample overnight room temperature, gave a slightly higher reading, but This is not statistically significant.

Claims (10)

1. Gránulo anticuerpo que consiste esencialmente en uno o más anticuerpos de cadena pesada como los encontrados en los Camélidos, o en fragmentos derivados de los mismos, granulados con una sal de potasio, en el que el gránulo consiste en más del 80%, con preferencia más del 90%, de la sal de potasio.1. Antibody granule consisting essentially in one or more heavy chain antibodies such as those found in Camelids, or in fragments derived therefrom, granulated with a potassium salt, in which the granule consists of more than 80%, preferably more than 90%, of the potassium salt. 2. Gránulo anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un ligante polimérico.2. Antibody granule according to the claim 1, further comprising a polymeric binder. 3. Gránulo anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo tiene una constante K_{d} de equilibrio químico para su antígeno de menos de 1*10^{-4}, con preferencia menos de 1*10^{-6}.3. Antibody granule according to a any of the preceding claims, wherein the antibody has a constant chemical equilibrium K d for its antigen of less than 1 * 10-4, preferably less than 1 * 10-6. 4. Gránulo anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la constante K_{d} de equilibrio químico para el antígeno es menor de 1*10^{-7}.4. Antibody granule according to a any of the preceding claims, wherein the chemical equilibrium constant K d for the antigen is lower of 1 * 10-7. 5. Una composición detergente que comprende el gránulo anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.5. A detergent composition comprising the antibody granule of any one of the claims previous. 6. Una composición enzimática blanqueadora de manchas, que comprende el gránulo anticuerpo de las reivindicaciones 1-5.6. A bleaching enzymatic composition of spots, which comprises the antibody granule of the claims 1-5. 7. Una composición enzimática anti transferencia de tinte, que comprende el gránulo anticuerpo de las reivindicaciones 1-5.7. An anti-transfer enzyme composition dye, which comprises the antibody granule of the claims 1-5. 8. Procedimiento de preparación de un gránulo anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo está granulado con una sal de potasio.8. Procedure for preparing a granule antibody according to claims 1-5, in which the antibody is granulated with a potassium salt. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la temperatura es de 30ºC o mayor, con preferencia de 30ºC a 80ºC.9. Procedure in accordance with the claim 8, wherein the temperature is 30 ° C or higher, with Preference from 30ºC to 80ºC. 10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el pH se mantiene en un valor desde 6,0 hasta 10,0, con preferencia desde 7,0 hasta 9,0.10. Procedure in accordance with the claim 8, wherein the pH is maintained at a value from 6.0 up to 10.0, preferably from 7.0 to 9.0.