ES2331633T3 - Antagonistas de lipidos a con actividad antichoque septico, antiinflamatoria, antiisquemica y analgesica. - Google Patents
Antagonistas de lipidos a con actividad antichoque septico, antiinflamatoria, antiisquemica y analgesica. Download PDFInfo
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Abstract
Compuestos de fórmula general (I) ** ver fórmula** en la que: Q representa oxígeno; Y representa oxígeno; R1 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-C10 y fenilo; R2 son ambos cadenas de alquilo C14; R3 es tetrahidrofuran-1-ilo o ciclopentilo; R4 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-C10 o un grupo R4''X, en el que R4 es alquilo C1-C10 y X es un átomo de oxígeno o azufre; y sus sales de ácidos fisiológicamente aceptables o sus sales de amonio cuaternario.
Description
Antagonistas de lípidos A con actividad
antichoque séptico, antiinflamatoria, antiisquémica y
analgésica.
La presente invención se refiere a compuestos
capaces de inhibir el efecto tóxico del lípido A, la actividad
inflamatoria del \lambda-carragenano y para
prevenir patologías mediadas por el receptor
TLR-4.
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La sepsis y el choque séptico son síndromes
clínicos graves relacionados con unas altas tasas de mortalidad
provocadas por una respuesta inflamatoria sistémica descontrolada a
lipopolisacáridos (LPS) bacterianos en la sangre del paciente
afectado. Los LPS son componentes de la pared celular de bacterias
Gram-negativas, que consisten en una cadena de
oligosacárido hidrófila unida covalentemente a un lipodisacárido
denominado lipido A. El lípido A es el resto de anclaje a la
membrana del LPS y se cree que es la porción biológicamente activa
(principio tóxico) del
LPS.
LPS.
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El lípido A activa la producción de una serie de
moléculas antiinflamatorias endógenas, principalmente citoquinas
(en particular TNF\alpha) y quimioquinas, que son mediadores
importantes de la inmunidad innata. La cascada de reacciones que
conduce a la producción de estos mediadores comienza con la
formación de un complejo entre el LPS y una proteína plasmática, la
proteína de unión a LPS (LBP); después, el complejo LPS:LBP se une a
la proteína CD14, que está libre y también unida a la membrana,
para formar un complejo trimolecular CD14:LBP:LPS. En esta etapa el
receptor de tipo Toll-4 (TLR-4) se
asocia al complejo trimolecular CD14:LBP:LPS y la posterior unión a
la proteína MD-2 activa la cascada de señalización
que conduce a la activación del factor de transcripción NF\kappaB
y a la expresión de citoquinas y genes de quimioquina. Además, la
activación de TLR-4 provoca la producción de
glutamato, prostaglandinas y óxido nítrico desde las células
gliales. Estos agentes entonces son capaces de potenciar aún más la
activación glial y la producción de mediadores inflamatorios que
sensibilizan las neuronas del cuerno dorsal contribuyendo con ello
al dolor neuropático. El papel clave del TLR-4 en la
activación de la microglía y, por consiguiente, en la etiología del
dolor neuropático se ha demostrado muy recientemente [F.Y. Tanga
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2005, 102,
5856-5861]. Además, las reacciones inflamatorias
mediadas por TLR-4 desempeñan un papel importante en
las lesiones por reperfusión en la isquemia cerebral [C.X. Cao
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 353,
509-514].
509-514].
Debido a su papel en el mecanismo molecular
descrito anteriormente, se ha invertido una considerable atención
al lípido A en farmacología, puesto que es una de las sustancias
conocidas con la mayor actividad proinflamatoria. Durante algún
tiempo se han empleado lípidos A de diferentes orígenes bacterianos,
o sus agonistas sintéticos, que inducen una actividad
coestimuladora, mezclados con proteínas antigénicas (u otros
antígenos sintéticos con estructura de azúcar) para aumentar la
inmunogenicidad de estas últimas para el desarrollo de vacunas. Los
primeros se conocen como adyuvantes y son necesarios para inducir la
producción de anticuerpos con una valoración suficientemente alta y
dirigidos contra el antígeno implicado. Por el contrario, se han
empleado compuestos sintéticos capaces de inhibir el LPS y el
lípido A (antagonistas) como compuestos de partida para el
desarrollo de fármacos contra el choque séptico.
La estructura química de los lípidos A de
diverso origen bacteriano se diferencia en el número de
ramificaciones y de insaturaciones en las cadenas lipófilas. Sin
embargo, estudios sistemáticos han demostrado que algunas
características estructurales son comunes a todas las variantes de
lípido A [Rietschel, E.T. et al., The FASEB J., 1994, 8,
217-225]. Según su estructura tridimensional, los
lípidos A interaccionan de diferentes formas con
TLR-4. La estructura esencial responsable del efecto
inflamatorio y endotóxico del lípido A comprende un disacárido
GlcNAc\beta(1-6)GlcNAc, dos ésteres
fosfóricos en las posiciones C-1 y
C-4', y un número apropiado de cadenas lipófilas
unidas a las posiciones C-2, C-3,
C-2' y C-3'. Basándose en esta
relación entre estructura y actividad se han preparado análogos de
lípidos A sintéticos que han demostrado ser activos como agonistas
o antagonistas. Estos compuestos comparten una estructura
disacárida, con la única excepción del compuesto
ER-112022,
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que es un dímero fosfolipídico en
el que dos grupos fosfato están unidos mediante un espaciador lineal
supuestamente dotado con una alta movilidad conformacional. Aunque
este compuesto carece de un núcleo disacárido posee una fuerte
actividad proinflamatoria, similar a la del lípido A. La actividad
biológica del lípido A también se correlaciona con su forma
tridimensional. Este forma está determinada principalmente por el
número, la longitud y la disposición de las cadenas lipófilas, así
como por el número y la distribución de las cargas negativas sobre
los grupos fosfato. Los lípidos A con una distribución asimétrica de
las cadenas (de tipo 4+2) tienen una forma tridimensional
troncocónica y tienen actividad inflamatoria (agonistas), mientras
que los variantes con una distribución simétrica (de tipo 2+2)
tienen una forma cilíndrica y propiedades antagonistas. Los lípidos
A con forma cónica interaccionan con TLR-4 e inducen
un cambio conformacional que activa la transmisión de señales
dentro de las células, mientras que los lípidos A con forma
cilíndrica se unen al mismo receptor sin inducir ningún cambio
conformacional y, por tanto, sin activar ninguna señal. Por último,
los lípidos A con una forma intermedia ligeramente cónica, debido a
una disposición (3+2) de las cadenas, como el lípido A de P.
gingivalis, tienen una débil actividad proinflamatoria debida a
la activación de otro TLR (TLR-2) y, en algunos
casos, por ejemplo en el caso del lípido A de R. sphaeroides
y R. capsulatus, tienen propiedades antagonistas. Estos
variantes de lípidos A, denominados habitualmente variantes de
lípidos A no tóxicos, están exentos de actividad proinflamatoria y
son capaces de inhibir el lípido A de E. coli in vitro e
in vivo. La estructura química de ambos compuestos conduce
al diseño de antagonistas de lípidos A con una disposición de las
cadenas simétrica (2+2), entre ellos el compuesto E5564
(2)
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que muestra una potente actividad
antagonista y que en la actualidad está en fase clínica. En fechas
recientes, se ha descubierto que un análogo sintético del lípido A
de la bacteria fijadora de nitrógeno R.
sin-1, de fórmula
(3)
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en capaz de antagonizar el efecto
del lípido A de E. coli en experimentos in vitro con
líneas celulares humanas [A.V. Demchenko et al., J. Am.
Chem. Soc., 2003, 125, 6103-6112]. Merece la pena
advertir que el disacárido presente en la estructura de este
compuesto tiene características exclusivas, es decir, no contiene
grupos fosfato y contiene el resto monosacárido
2-aminogluconolactona. Por último, una publicación
reciente indica que un disacárido con un enlace N(OMe)
\beta-glicosídico no natural y que tiene una
disposición simétrica (2+2) de las cadenas lipófilas C14 unidas a
través de enlaces éter a los grupos hidroxi del disacárido
Glc-Glc es capaz de inhibir, de una manera
dependiente de la dosis, la acción inflamatoria del lípido A de
E. coli en macrófagos murinos de la línea celular MT2 [F.
Peri et al., Bioorg. Med. Chem., 2008, 14(1),
190-199].
Se ha indicado que el lípido X, un monosacárido
precursor del lípido A, antagoniza el efecto celular del lípido A
(B.L. Ray et al., J. Biol. Chem., 1984, 259,
4852-4859). Sin embargo, una publicación posterior
indica que la actividad observada no era debida al lípido X en la
forma de monosacárido sino a trazas de disacáridos derivadas de su
condensación espontánea [H. Aschauer et al., J. Biol. Chem.,
1990, 265, 9159- 9164].
Se conocen muy pocos compuestos que carezcan de
las actividades de mantenimiento de la estructura de disacáridos
como antagonistas o agonistas del lípido A. Los análogos del lípido
A de tipo monosacárido, entre ellos el compuesto
GLA-58, a pesar de la ausencia del segundo resto
monosacárido no reductor, conservan actividades miméticas de LPS
[R. Tamai, Y. Asai, M. Hashimoto, K. Fukase, S. Kusumoto, H. Ispida,
M. Kiso, T. Ogawa, Immunology, 2003, 110,
66-72].
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Un panel de glucosilaminas
N-aciladas reductoras que portan un grupo fosfato en
C4 y cadenas de amida y éster de ácido
3-hidroxitetradecanoico lineal o ramificado en C2 y
C3 fue reconocido por macrófagos murinos como agonistas y
antagonistas de LPS. Además, el compuesto GLA-58
demuestra ser activo como antagonista de LPS en células
humanas.
También se ha indicado recientemente [R.F. Tsuji
et al., Clin. Exp. Allergy, 2003, 33,
249-258] que unos poligalactanos conocidos como
carragenanos (\kappa,l,\lambda), que son capaces de inducir una
inflamación no específica en el ser humano y en animales, inducen
la producción de citoquinas en macrófagos que actúan sobre
TLR-4, el mismo receptor implicado en la vía
inflamatoria del LPS y del lípido A. Las sustancias capaces de
inhibir la acción inflamatoria y tóxica del lípido A también son,
por tanto, inhibidores potenciales de la acción inflamatoria de los
carragenanos.
La presente invención se refiere a compuestos de
fórmula general (I)
en la
que:
Q representa oxígeno;
Y representa oxígeno;
R_{1} se selecciona de hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10} y fenilo;
R_{2} son ambos cadenas de alquilo
C_{14};
R_{3} es
tetrahidrofuran-1-ilo o
ciclopentilo;
R_{4} se selecciona de hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10} o un grupo R_{4}'X, en el que
R_{4} es alquilo
C_{1}-C_{10} y X es un átomo de oxígeno o
azufre;
y sus sales de ácidos
fisiológicamente aceptables o sus sales de amonio
cuaternario.
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También se prefieren particularmente los
siguientes compuestos: metil
6-desoxi-6-[N-(1'-tetrahidrofuranil)-N'-metoxiamino)-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido
(Ia)
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metil
6-desoxi-6-[N-(ciclopentil)-N'-metoxiamino)-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido
(Ib)
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metil
6-desoxi-6-ciclopentilamino-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido
(Ic)
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\newpage
metil
6-desoxi-6-N,N',N''-dimetilciclopentilamonio-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido
(Id)
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Estos compuestos pueden prepararse como se
ilustra en el siguiente esquema 1, mediante la conversión del metil
\alpha-D-glucopiranósido
disponible en el mercado en metil
4,6-O-(4-metoxibenciliden)-\alpha-D-glucopiranósido
4 (rendimiento de 94%) mediante un tratamiento con anisaldehído
dimetilacetal (ADMA) y ácido canforsulfónico (CSA). La alquilación
de 4 con bromuro de tetradecilo en presencia de NaH produce 5
(rendimiento de 74%), cuyo anillo de bencilideno es abierto
regioselectivamente mediante un tratamiento con LiAlH_{4} y
AlCl_{3} obteniendo con ello 6 (rendimiento de 86%). La oxidación
con peryodinano de Dess-Martin del grupo hidroxilo
libre sobre C6 de 6 produce el correspondiente aldehído 7 que puede
convertirse directamente sin aislamiento en 8 mediante aminación
reductora utilizando ciclopentilamina y NaBH_{3}CN (rendimiento de
75% a lo largo de dos etapas). La eliminación del grupo C4
p-metoxibencilo (PMB) de 8 en condiciones ácidas (TFA)
produce (Ic) (rendimiento de 80%), que puede convertirse en la
correspondiente sal de amonio cuaternario mediante una reacción con
un yoduro de alquilo; un tratamiento con yoduro de metilo en
presencia de carbonato de sodio produce el compuesto (Id) con un
rendimiento de 94%. Como alternativa, el aldehído 7 puede hacerse
reaccionar con hidrocloruro de O-metilhidroxilamina en
piridina, produciendo la correspondiente C6 O-metil oxima
con un rendimiento de 65% a lo largo de dos etapas. La metiloxima
entonces se reduce a metilhidroxilamina 9 mediante un tratamiento
con cianoborohidruro de sodio en ácido acético glacial (rendimiento
de 92%). El grupo éter de PMB puede escindirse con
TFA/CH_{2}Cl_{2} para producir 10 (rendimiento de 90%) que, por
último, se hace reaccionar con dihidrofurano (DHF) en presencia del
catalizador ácido suave p-toluensulfonato de piridinio
(PPTS) para producir (Ia) con un rendimiento de 65%. Como
alternativa, el compuesto 10 puede hacerse reaccionar con
bromociclopentano en presencia de una base, como
diisopropiletilamina (DIPEA) para obtener el compuesto (Ib).
El compuesto (Ia) es químicamente inestable
debido a la presencia del grupo N,O-acetal en C6 y se obtiene
como una mezcla de dos diastereoisómeros con estereoquímica opuesta
del átomo de carbono en la posición \alpha del anillo de
tetrahidrofurano. El compuesto (Ib) es más estable que el compuesto
(Ia) y se obtiene en forma de un isómero
puro.
puro.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema
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Esquema 1. Reactivos y condiciones: a) ADMA,
CSA, DMF, 94%; b) C_{14}H_{29}Br, NaH, DMF, 74%; c) LiAlH_{4},
AlCl_{3}, CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O, 86%; d) peryodinano de
Dess-Martin, CH_{2}Cl_{2}; e) ciclopentilamina,
NaBH_{3}CN, AcOH, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, 75% a lo largo de dos
etapas; f) TFA, CH_{2}Cl_{2}, 80%; g) CH_{3}I,
Na_{2}CO_{3}, DMF, 94%; h) hidrocloruro de
O-metilhidroxilamina, piridina, 65% de 6; i) NaBH_{3}CN,
AcOH glacial, 92%; l) TFA, CH_{2}Cl_{2}, 90%; m) DHF, PPTS,
CH_{2}Cl_{2}, 65%; n) bromociclopentano, DIPEA.
Otros compuestos de fórmula (I) pueden obtenerse
de una manera similar comenzando a partir de glucopiranosa mediante
reacciones adecuadas de funcionalización y de
protección-desprotección, que son muy conocidos por
los químicos expertos.
Los compuestos de fórmula (I) se comportan como
inhibidores del lípido A y de
\lambda-carragenanos, y han demostrado ser
capaces de ejercer efectos antiinflamatorios, antiisquémicos y
analgésicos. Por tanto, los compuestos de la invención pueden
utilizarse para la preparación de composiciones farmacéuticas para
el tratamiento de estados inflamatorios, isquemia y dolor, en
particular dolor neuropático. Estas composiciones pueden prepararse
con técnicas y excipientes convencionales, como aquellas descritas
en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed. Mack
Pub., N.Y., EEUU.
La invención a continuación se ilustrará con más
detalle en la siguiente sección experimental.
Figura 1. Actividad antagonista de los
compuestos Ia, Ic y Id sobre la producción de citoquinas estimulada
por lípido A en células BMDC, BMØ y D1. La producción de TNF\alpha
se midió en los sobrenadantes 24 h después. Desde la derecha:
lípido A (0,5 \muM), células tratadas sólo con lípido A; DMSO:
células incubadas en presencia de medio completo más DMSO;
inhibidor 50 \muM, células tratadas sólo con los monosacáridos
Ia, Ic y Id; otras columnas, lípido A + compuestos Ia, Ic y Id en
dosis crecientes. Los datos representan las medias y las
desviaciones estándar de pocillos por triplicado. Esto es una
representación de tres experimentos independientes. *, p<0,05;
**, p<0,01; ***, p<0,001.
Figura 2. Selectividad por TLR-4
del monosacárido Id. En los paneles superiores, la actividad
antagonista del compuesto Id se investigó ensayando su capacidad
para interferir con la producción de IL-1\beta 24
h después de la estimulación con lípido A. La
IL-1\beta se midió en los sobrenadantes mediante
ELISA. Lípido A (0,5 \muM), células tratadas sólo con lípido A;
NT: células incubadas en presencia de medio completo; DMSO: células
incubadas en presencia de medio completo más DMSO; inhibidor 50
\muM, células tratadas sólo con el monosacárido Id; otras
columnas: lípido A + compuesto Id en dosis crecientes. Los datos
representan las medias y las desviaciones estándar de pocillos por
triplicado. Esto es una representación de tres experimentos
independientes. En los paneles inferiores, la producción de
TNF\alpha se mide mediante ELISA 24 h después de la estimulación
con CpG (selectivo para TLR-9) o
PAM_{3}Cys-SK_{4} (selectivo para
TLR-2) en presencia de compuesto Id. NT: células
incubadas en presencia de medio completo más DMSO; otras columnas:
células tratadas con CpG o o PAM_{3}Cys-SK_{4}
en presencia o en ausencia del compuesto Id a la concentración
indicada. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
Figura 3. El compuesto Id no induce la muerte de
M\Phi y DC. Células DC y M\Phi se dejaron sin tratar o se
trataron durante 24 h con el compuesto Id a las concentraciones
indicadas. Las células entonces se analizaron mediante FACS para la
presencia de células doble positivo para anexina V y yoduro de
propidio (PI). Panel superior, porcentaje de células doble positivo
para anexina V y PI. Panel inferior, porcentaje de células doble
negativo para anexina V y
PI.
PI.
Figura 4. Actividad antagonista selectiva de Id
sobre el receptor TLR-4. Células
HEK-293 transfectadas de forma estable con el gen
humano TLR-4A (izquierda) o TRL9 (derecha) se
trataron respectivamente con lípido A solo o con lípido A en
presencia del monosacárido Id o con CpG sólo o con CpG en presencia
de monosacárido Id. La activación de NF-\kappaB
se evaluó en el extracto nuclear 2 h después y se expresa como
densidad óptica (OD) a 450 nm. NT: células no tratadas. Los datos
representan las medias y las desviaciones estándar de pocillos por
triplicado. Esto es una representación de tres experimentos
independientes. *, p<0,001 frente a células NT; º, p<0,001
frente a lípido A solo (ANOVA; ensayo de Tukey).
Figura 5. Efecto del compuesto Id administrado a
diario en ratones CCI durante 1 semana desde el día después de la
cirugía sobre la hiperalgesia térmica (A) y la alodinia mecánica
(B). *, P\leq0,001 frente a CCI (ANOVA; ensayo de Tukey).
Figura 6. Efecto del compuesto Id (10 mg/kg)
administrado i.p., 30 min antes de la oclusión de la carótida
bilateral sobre la potencia espectral total media de EEG de la
corteza evaluado como la diferencia (\Delta%) desde el valor
preisquémico en jerbos. ***, P<0,001 comparado con el grupo de
simulación, el mismo tiempo;
\textdollar\textdollar\textdollar, P<0,001 comparado con el
grupo con vehículo, mismo tiempo (ANOVA de dos vías, seguido de un
ensayo de Bonferroni).
Figura 7. Efecto de diferentes dosis del
compuesto Id sobre el edema inducido por carragenano en ratones
medido 4 h después de la exposición y expresado como diferencia
entre el volumen de la pata tratada frente a la pata contralateral.
El tratamiento con indometacina (fármaco antiinflamatorio no
esteroideo) representa el control positivo.
Figura 8. Efecto del tratamiento con el
compuesto Id en ratones sobre la producción de óxido nítrico medida
en un homogeneizado de pata 4 h después de la exposición y expresado
como contenido en nitrito/nitrato, los productos finales del
metabolismo del óxido nítrico.
Todos los disolventes se secaron sobre tamices
moleculares (4 A, Fluka) durante al menos 24 h antes del uso.
Cuando se requirieron condiciones secas, las reacciones se
realizaron bajo una atmósfera de argón. Una cromatografía en capa
fina (TLC) se realizó en placas de gel de sílice 60 F254 (Merck) con
detección de UV, o utilizando una disolución de revelado de
H_{2}SO_{4} conc./EtOH/H_{2}O (5:45:45), seguido de un
calentamiento a 180ºC. La cromatografía en columna de resolución
rápida se realizó sobre gel de sílice de malla
230-400 (Merck). Se utiliza como eluyente mezclas
de éter de petróleo (intervalo de punto de ebullición
40-60ºC) y acetato de etilo. Los espectros de RMN
de ^{1}H y ^{13}C se registraron en un instrumento MERCURY 400
MHz Varian a 300 K. Los desplazamientos químicos se han indicado en
ppm campo abajo del TMS como patrón interno; las señales de carbono
de las cadenas C_{14} lineales en C-2 y
C-3 se han omitido en la asignación de los espectros
de carbono.
Los espectros de masas se registraron en un
instrumento de resonancia ciclotrónica de iones con transformada de
Fourier (FT-ICR) (modelo APEXII, Bruker Daltonics),
equipado con un imán 4,7 T (Magnex).
Las rotaciones ópticas se midieron a temperatura
ambiente, utiizando la línea D de sodio, en un polarímetro
electrónico P3002 (A. Krüss, Alemania).
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Etapa
a)
Una disolución de metil
\alpha-D-glucopiranósido (10 g,
51,5 mmol) en dimetilformamida (DMF, 50 ml) se añadió a una
cantidad catalítica de ácido canforsulfónico (CSA) y anisaldehído
dimetilacetal (ADMA, 10 ml, 51,5 mmol) y la mezcla se mantuvo bajo
agitación magnética y a un vacío bajo para eliminar el metanol
formado durante la reacción de condensación. Después de 40 min el
disolvente se eliminó mediante evaporación. El residuo se añadió a
una disolución saturada de NaHCO_{3} y la mezcla difásica
resultante se mantuvo bajo agitación vigorosa durante una hora. El
precipitado resultante se filtró y se lavó con una disolución de
bicarbonato enfriada en hielo (100 ml). El residuo se trituró con
hexano para producir el compuesto 4 como un sólido blanco (15 g,
94%). 4: R_{f} = 0,31 (EtOAc/MeOH/H_{2}O 7:2:1).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
b)
Una disolución de 4 (8 g, 25,6 mmol) en DMF (80
ml) se añadió con agitación a hidruro de sodio en porciones
(suspensión al 60% en aceite mineral, 6,4 g, 160 mmol). Después se
añadió bromuro de tetradecilo (38 ml, 128 mmol) gota a gota y se
continuó la agitación a 60ºC durante al menos 12 horas, después la
mezcla se enfrió y se añadió a metanol (20 ml), y la disolución
resultante se mantuvo en agitación durante 20 minutos más para
hidrolizar el exceso de hidruro de sodio. Los disolventes se
retiraron mediante evaporación y el residuo se disolvió en
diclorometano (500 ml), y después se añadió a una disolución acuosa
de ácido cítrico (400 ml). Después de la separación de la fase
acuosa, la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y
se evaporó. Después de la purificación del residuo mediante una
cromatografía de resolución rápida (eluyente: éter de
petróleo/AcOEt 85:15) se obtuvo el compuesto 5 como un sólido oleoso
incoloro (13,3 g, 74%). 5: R_{f} = 0,32 (éter de
petróleo/AcOEt 9:1); [\alpha]_{D} = +23º (c = 1 en
CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) =
7,40-6,85 (A_{2}X_{2}q, 4H, aromático), 5,48 (s,
1H, OCH_{3}), 4,77 (d, J = 3,7 Hz, H-1),
4,24 (dd, J = 9,7, 4,4 Hz, 1H, H-6a), 3,80
(s, 3H, OCH_{3}), 3,77-3,60 (m, 8H), 3,47 (t,
J = 9,3 Hz, 1H), 3,42 (s, 3H, OCH_{3}), 3,34 (dd, J
= 9,3, 3,7 Hz, 1H, H-2), 1,5-1,6 (m,
4H, H-\beta), 1,22 (sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t,
J = 5,8 Hz, 6H, CH_{3}); RMN de ^{13}C (400 MHz,
CDCl_{3}): \delta (ppm) = 161,2 (C_{ar}), 127,4 (C_{ar}),
128,4 (C_{ar}), 114,0 (C_{ar}), 105,1, 98,4
(C-1), 83,4, 80,8, 74,5 (OCH_{2}), 73,5
(OCH_{2}), 71,6 (OCH_{2}), 71,2, 70,2 (C-6),
69,6, 57,7 (OCH_{3}), 55,6 (OCH_{3}), 32,4, 30,8, 30,5, 30,1,
30,1, 30,0, 29,9, 29,8, 26,4, 23,1, 14,6; MS
(MALDI-TOF): m/z: 705,6 [M+H]^{+},
727,5 [M+Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
c)
El compuesto 5 (1,0 g, 1,41 mmol) se disolvió en
Et_{2}O/CH_{2}Cl_{2} 2:1 (70 ml) bajo una atmósfera de argón,
después se añadió gota a gota con LiAlH_{4} (1 M en THF, 7,2 ml) y
AlCl_{3} (1,16 g, 8,72 mmol) en éter etílico (25 ml) y la mezcla
resultante se agitó a reflujo durante 4 horas. Después de enfriar la
mezcla hasta la temperatura ambiente, el residuo se diluyó con
AcOEt (300 ml) y agua (300 ml). La fase orgánica se separó de la
fase acuosa, se lavó con salmuera (3 x 200 ml), se secó sobre
sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó a
través de una cromatografía de resolución rápida (eluyente: éter de
petróleo/AcOEt 7:3) para obtener el compuesto 6 puro (860 mg, 86%);
6: R_{f} = 0,25 (éter de petróleo/AcOEt 8,5:1,5);
[\alpha]_{D} = +46º (c = 1 en CHCl_{3}); RMN de ^{1}H
(400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) = 7,36 (m, 2H, aromático),
6,92 (m, 2H, aromático), 4,86-4,57 (ABq, 2H,
J = 10,6 Hz, CH_{2}-(4-OMePh)), 4,75 (d, 1H,
J = 3,5 Hz, H-1), 3,90-3,54
(m, 11H, H-3, H-5,
H-6a, H-6b,
H-\alpha), 3,41 (dd, 1H, J = 9,8, 9,0 Hz,
H-4), 3,37 (s, 3H, OCH_{3}), 3,27 (dd, 1H,
J = 3,6, 9,7 Hz, H-2),
1,5-1,6 (m, 4H, H-\beta), 1,22
(sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t, 6H, J = 5,8 Hz, CH_{3}). RMN
de ^{13}C (400 MHz, CCl_{3}): \delta (ppm) = 159,2
(C_{ar}), 130,2 (C_{ar}), 129,47 (C_{ar}), 113,9 (C_{ar}),
98,3 (C-1), 81,3, 80,7, 73,9 (OCH_{2}), 73,5
(OCH_{2}), 71,6 (OCH_{2}), 71,1, 70,2 (C-6),
69,6, 55,6 (OCH_{3}), 55,6 (OCH_{3}), 32,4, 30,8, 30,5, 30,1,
30,1, 30,1, 30,0, 29,9, 29,8, 26,4, 23,2, 14,6 (CH_{2}); MS
(MALDI-TOF): m/z: 707,4 [M+H]^{+},
729,4 [M+Na]^{+}, 745,3 [M+K]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
d)
Una disolución del compuesto 6 (800 mg, 1,13
mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (35 ml) se añadió a peryodinano
de Dess-Martin (720 mg, 1,70 mmol) bajo una
atmósfera de argón. Después de una hora, el producto bruto se
diluyó con diclorometano (200 ml) y se añadió a una disolución
saturada de NaHCO_{3}/Na_{2}S_{2}O_{3} 1/1 (v/v) (200 ml).
Después de una agitación vigorosa, las dos fases se separaron y la
fase orgánica se lavó con agua (200 ml), después se secó con
sulfato de sodio y el residuo se retiró mediante evaporación. El
residuo oleoso (aldehído) se utilizó tal cual sin purificación para
la siguiente reacción. 7: R_{f} = 0,30 (petróleo/AcOEt
7,5:2,5).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
e)
Una disolución agitada del compuesto 7 (1,690 g,
2,4 mmol), ciclopentilamina (970 \mul, 9,7 mmol), NaCNBH_{3}
(640 mg, 9,7 mmol) y AcOH (500 \mul) en CH_{2}Cl_{2}/MeOH (2:1
v/v, 30 ml) se calentó a 60ºC durante 2 h bajo una atmósfera de
argón; después de esto un análisis de TLC (tolueno/EtOAc 7:3) reveló
que la reacción se hubo completado. Los disolventes entonces se
evaporaron al vacío, el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (50
ml) y se lavó con bicarbonato acuoso saturado y salmuera. La fase
orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y el disolvente
se retiró mediante evaporación. El residuo se purificó mediante una
cromatografía en columna de resolución rápida sobre gel de sílice
(EtOAc/MeOH 9,5:0,5) para producir 8 (1,392 g, rendimiento de 75%)
como un polvo amarillo pálido. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta
= 0,95 (m, 6H), 1,21 (m, 44H), 1,40-1,60 (m, 12H),
2,62 (dd, 1H, J = 12,1, 6,8 Hz), 2,84 (dd, 1H, J =
12,1, 2,8 Hz), 3,00 (quintete, 1H, J = 6,8 Hz), 3,26 (dd,
1H, J = 9,6, 3,4 Hz), 3,31 (t, 1H, J = 9,3 Hz), 3,37
(s, 3H), 3,50-4,0 (m, 6H), 3,79 (s, 3H),
4,55-4,80 (ABq, 2H), 4,71 (d, 1H, J = 3,5
Hz), 6,80-7,20 (A_{2}X_{2}, 4H); RMN de
^{13}C (CDCl_{3}) \delta = 14,6, 23,1, 24,4, 26,4, 26,7, 29,8,
29,9-30,1 (señales de CH_{2} de la cadena lineal
C_{14}), 31,0, 32,4, 49,5, 55,59, 55,64, 59,9, 69,6, 72,0, 74,0,
74,8, 79,4, 81,1, 81,9, 98,1, 114,0, 129,9, 130,8, 159,4; HRMS
(FT-ICR): calc. para C_{48}H_{88}NO_{6}:
774,6612 [M+1]; encontrado: 774,6604.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
h)
El aldehído 7 (800 mg, 1,13 mmol) se disolvió en
piridina (12 ml) y se añadió a hidrocloruro de
O-metilhidroxila-
mina (142 mg, 1,7 mmol). Después de 1,5 h el disolvente se retiró mediante evaporación al vacío y el residuo se purificó mediante una cromatografía de resolución rápida (eluyente: éter de petróleo/AcOEt 9:1), para obtener el compuesto del título (540 mg, 65%). R_{f} = 0,70 (éter de petróleo/AcOEt 7,5:2,5); RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm) = 7,17 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,13-6,77 (A_{2}X_{2}q, 4H, J = 8,6 Hz, aromático), 4,71 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-1), 4,65, 4,44 (ABq, 2H, J = 10,6 Hz, CH_{2}-(4-OMePh)), 4,10 (dd, 1H, J = 9,9, 6,3 Hz, H-3), 3,82 (s, 3H, OCH_{3}), 3,72 (s, 3H, OCH_{3}), 3,33 (s, 3H, OCH_{3}), 3,45-3,78 (m, 5H), 3,20-3,28 (m, 2H), 1,50-1,60 (m, 4H, H-\beta), 1,22 (sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t, 6H, J = 5,8 Hz, CH_{3}); RMN de ^{13}C (400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) = 159,4 (C_{ar}), 147,3 (C_{ar}), 130,3 (C_{ar}), 129,9 (C_{ar}), 113,9 (C6), 98,4 (Cl), 81,4, 80,4, 79,7, 76,0, 76,5, 72,1, 68,5, 62,1 (NOCH_{3}), 55,9 (OCH_{3}), 55,9 (OCH_{3}), 32,3, 31,0, 30,4, 30,1, 30,1, 30,1, 30,0, 30,0, 29,9, 29,8, 26,7, 26,4, 23,1, 14,6 (O(CH_{2})_{13}CH_{3}); MALDI-TOF (DHB): m/z: 757,1 [M+Na]^{+}, 773,3 [M+K]^{+}.
mina (142 mg, 1,7 mmol). Después de 1,5 h el disolvente se retiró mediante evaporación al vacío y el residuo se purificó mediante una cromatografía de resolución rápida (eluyente: éter de petróleo/AcOEt 9:1), para obtener el compuesto del título (540 mg, 65%). R_{f} = 0,70 (éter de petróleo/AcOEt 7,5:2,5); RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm) = 7,17 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,13-6,77 (A_{2}X_{2}q, 4H, J = 8,6 Hz, aromático), 4,71 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-1), 4,65, 4,44 (ABq, 2H, J = 10,6 Hz, CH_{2}-(4-OMePh)), 4,10 (dd, 1H, J = 9,9, 6,3 Hz, H-3), 3,82 (s, 3H, OCH_{3}), 3,72 (s, 3H, OCH_{3}), 3,33 (s, 3H, OCH_{3}), 3,45-3,78 (m, 5H), 3,20-3,28 (m, 2H), 1,50-1,60 (m, 4H, H-\beta), 1,22 (sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t, 6H, J = 5,8 Hz, CH_{3}); RMN de ^{13}C (400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) = 159,4 (C_{ar}), 147,3 (C_{ar}), 130,3 (C_{ar}), 129,9 (C_{ar}), 113,9 (C6), 98,4 (Cl), 81,4, 80,4, 79,7, 76,0, 76,5, 72,1, 68,5, 62,1 (NOCH_{3}), 55,9 (OCH_{3}), 55,9 (OCH_{3}), 32,3, 31,0, 30,4, 30,1, 30,1, 30,1, 30,0, 30,0, 29,9, 29,8, 26,7, 26,4, 23,1, 14,6 (O(CH_{2})_{13}CH_{3}); MALDI-TOF (DHB): m/z: 757,1 [M+Na]^{+}, 773,3 [M+K]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
i)
Una disolución del compuesto de la etapa h) (500
mg, 0,68 mmol) en ácido acético glacial (35 ml) se añadió a
cianoborohidruro de sodio (214 mg, 3,4 mmol) y la disolución
resultante se agitó durante 4 horas. El disolvente entonces se
retiró mediante evaporación y el residuo se purificó mediante una
cromatografía de resolución rápida (eluyente: éter de
petróleo/AcOEt 8:2) para obtener el compuesto 9 (460 mg, 92%). 9:
R_{f} = 0,42 (éter de petróleo/AcOEt 7,5:2,5); RMN de
^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm) = 7,25 (m, 2H,
aromático), 6,83 (m, 2H, aromático), 5,60 (sa, 1H, NH), 4,82, 4,55
(ABq, 2H, J = 10,6 Hz, CH_{2}-(4-OMePh)),
4,72 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1),
3,90-3,55 (m, 5H, 4H-\alpha,
H-3), 3,80 (s, 3H, OCH_{3}), 3,49 (s, 3H,
OCH_{3}), 3,38 (s, 3H, OCH_{3}), 3,30-3,20 (m,
4H, H-2, H-4, H-5,
H-6a), 2,84 (dd, 1H, J = 13,2, 7,7 Hz,
H-6b); RMN de ^{13}C (400 MHz, CDCl_{3}):
\delta (ppm) = 159,4, 130,7, 129,8, 114,5, 98,0, 97,9, 82,0,
81,3, 79,9, 74,9, 74,1, 72,1, 67,1, 61,6, 61,6, 55,6, 55,6, 55,4,
55,4, 52,7, 32,3, 31,0, 30,5, 30,1, 30,1, 29,9, 29,7, 26,46, 23,15,
14,6; MALDI-TOF: m/z: 758,1
[M+Na]^{+}, 774,1 [M+K]^{+}.
\newpage
Etapa
l)
El compuesto 9 (200 mg, 0,27 mmol) se disolvió
en ácido trifluoroacético (TFA), después se añadió a
CH_{2}Cl_{2} (1/1, 20 ml) a 0ºC y la disolución resultante se
agitó durante una hora a esta temperatura. Los disolventes se
retiraron mediante evaporación al vacío y el residuo se purificó
mediante una cromatografía de resolución rápida (eluyente: AcOEt al
35% en éter de petróleo) obteniendo con ello el compuesto 10 puro
(150 mg, 90%). 10: R_{f} = 0,42 (éter de petróleo/AcOEt
7,5:2,5); RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm) =
4,76 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-1), 3,89 (m, 1H,
H-\alpha), 3,82 (m, 1H, H-5), 3,63
(m, 1H, H-\alpha), 3,60-3,50 (m,
2, H-3, H-4), 3,54 (s, 1H,
OCH_{3}), 3,32 (dd, 1H, J = 3,1, 13,5 Hz,
H-6a), 3,27 (dd, 1H. J = 3,5, 9,5 Hz,
H-2), 3,00 (dd, 1H, J = 7,2, 13,5 Hz,
H-6b), 1,5-1,6 (m, 4H,
H-\beta), 1,22 (sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t, 6H,
J = 5,8 Hz, CH_{3}); RMN de ^{13}C (400 MHz, CDCl_{3}):
\delta (ppm) = 98,2 (C-1), 81,2, 80,9, 74,9,
73,4, 72,1, 67,3, 61,8, 55,5, 53,7, 32,3, 31,0, 30,5, 30,1, 30,1,
29,9, 29,7, 26,46, 23,15, 14,6; MALDI-TOF (DHB):
m/z: 639,4 [M+Na]^{+}, 655,1 [M+K]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
m)
A una disolución del monosacárido 10 (174 mg,
0,28 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco se le añadieron
p-toluensulfonato de piridinio (7 mg, 0,028 mmol) y
dihidrofurano (64 \mul, 0,42 mmol) bajo una atmósfera de argón y
la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de
este tiempo, el reactivo de partida se convirtió completamente en
el aducto de N,O-bis-THF según se evaluó
mediante un análisis de TLC (tolueno/EtOAc 7:3). El disolvente se
retiró mediante evaporación y el residuo se disolvió en
AcOH/THF/H_{2}O 4:4:1 (9 ml). La conversión del aducto de
bis-THF en (Ia) fue seguida por TLC y se completó después de
6 h. Los disolventes entonces se retiraron mediante evaporación al
vacío y el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna
de resolución rápida sobre gel de sílice (AcOEt/éter de petróleo,
gradiente de polaridad que comienza en 2,5:7,5) produciendo (Ia)
como un polvo blanco (129 mg, rendimiento 68%). RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm) = 0,85 (t, 6H, J = 5,8 Hz),
1,22 (m, 44H), 1,50-1,60 (m, 4H), 1,72 (m, 2H), 1,91
(m, 2H), 2,78 (ta, 1H, H-6), 3,11 (ta, 1H,
H-4), 3,23 (dd, 1H, J = 9,4, 3,6 Hz,
H-6), 3,40 (s, 3H, NOCH_{3}),
3,50-3,70 (m, 3H), 3,90 (ma, 2H,
H-4'), 4,20 (ma, 1H, H-1'), 4,73 (d,
1H, J = 3,6 Hz, H-1); RMN de ^{13}C (400
MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) = 97,5, 92,03, 80,65, 79,20,
76,42, 72,08, 70,84, 61,27, 59,92, 58,71, 53,89, 30,60,
29,0-28,0 (conjunto de señales de CH_{2}), 21,39,
12,84; [\alpha]^{20}_{D} = + 42,45º (c = 0,5, MeOH);
HRMS (FT-ICR): calc. para C_{40}H_{79}NO_{7}:
685,5857; encontrado: 708,5710 [M+Na]^{+}; Análisis
elemental calc. (%) para C_{40}H_{79}NO_{7}: C 70,03, H 11,61,
N 2,04; encontrado: C 70,07, H 11,57, N 2,01.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
n)
El compuesto 10 (25 mg, 0,04 mmol) se disolvió
en DMF anhidra (1 ml) bajo una atmósfera de argón y se añadió a
ciclopentilbromuro (45 \mul, 0,4 mmol) y diisopropiletilamina
(DIPEA, 70 \mul, 0,4 mmol). La mezcla se agitó durante 20 horas a
70ºC, después el disolvente se retiró mediante evaporación al vacío
y el residuo se diluyó con diclorometano (10 ml) y se lavó tres
veces con salmuera. La fase orgánica entonces se secó sobre sulfato
de sodio, se filtró y el disolvente se retiró mediante evaporación.
El residuo se purificó mediante una cromatografía en columna de
resolución rápida utilizando éter de petróleo/acetato de etilo 9/1
como eluyente. Rendimiento: 10%; RMN de ^{1}H (400 MHz,
CDCl_{3}): \delta (ppm) = 4,72 (d, 1H, J = 3,5 Hz,
H-1), 4,10 (dd, 1H, J = 9,0, 5,0 Hz), 3,81
(s, 3H, OCH_{3}), 3,70-3,50 (m, 7H), 3,44 (s, 3H,
NOCH_{3}), 3,41 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 3,22 (dd, 1H,
J = 9,1, 3,5 Hz, H-2),
1,5-1,6 (m, 4H, H-\beta), 1,22
(sa, 44H, CH_{2}), 0,85 (t, 6H, J = 5,8 Hz, CH_{3}).
Masas (ESI): m/z = 684,61 [M+H]^{+}, 706,59
[M+Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
f)
El compuesto 8 (1,400 g, 1,9 mmol) se disolvió
en TFA/CH_{2}Cl_{2} (1:1 v/v, 20 ml) y se agitó durante 1 hora.
Después de esto la hidrólisis de PMB se completó, según se evaluó
mediante un análisis de TLC (EtOAc/MeOH, 9:1). Los disolventes se
retiraron mediante evaporación al vacío, el residuo se disolvió en
CH_{2}Cl_{2} (50 ml) y se lavó con bicarbonato acuoso saturado
y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se
filtró y el disolvente se retiró mediante evaporación. El residuo se
purificó mediante una cromatografía en columna de resolución rápida
sobre gel de sílice (EtOAc/MeOH 9,5:0,5) para producir (Ic) (0,993
g, rendimiento 80%) como un polvo amarillo. RMN de ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta (ppm) = 0,95 (m, 6H), 1,21 (m, 44H),
1,40-1,60 (m, 12H), 2,59 (sa, 1H), 2,81 (dd, 1H,
J = 11,9, 7,6 Hz), 2,97 (dd, 1H, J = 11,9, 4,9 Hz),
3,09 (quintete, 1H, J = 6,6 Hz), 3,26 (dd, 1H, J =
9,3, 3,5 Hz), 3,40 (s, 3H), 3,40-3,60 (m, 5H), 3,71
(m, 1H), 3,81 (m, 1H), 4,72 (d, 1H, J = 3,6 Hz); RMN de
^{13}C (CDCl_{3}) \delta = 14,6, 23,1, 24,33, 24,37, 26,4,
26,5, 29,8, 29,9-30,1 (señales de CH_{2} de la
cadena lineal C_{14}), 30,8, 32,3, 33,1, 33,4, 51,7, 55,6, 60,3,
68,6, 71,9, 74,0, 75,6, 80,5, 81,2, 98,5;
[\alpha]^{20}_{D}: +18,4 (c 0,5, CHCl_{3}); HRMS
(FT-ICR): calc. para C_{40}H_{80}NO_{5}
[M+H]^{+}: 654,6031 [M+Na]^{+}: 676,5850;
encontrado: 654,6009; 676,5872.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
g)
Una disolución del compuesto (Ic) (250 mg, 0,38
mmol), yoduro de metilo (50 \mul, 0,76 mmol) y carbonato de sodio
(120 mg) en DMF seca (7 ml) se agitó bajo una atmósfera de argón a
temperatura ambiente durante 12 h. Después de esto la reacción se
completó (TLC, EtOAc/MeOH 7:3). El disolvente se retiró mediante
evaporación al vació, el residuo se disolvió en cloroformo (15 ml)
y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de
sodio, se filtró y el disolvente se retiró mediante evaporación. Se
obtuvo el compuesto puro (Id) (241 mg, rendimiento 93%) como un
polvo blanco. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta = 0,80 (ta, 6H,
J = 6,8 Hz), 1,21 (m, 44H), 1,51 (m, 4H), 1,66 (m, 1H), 1,80
(m, 2H), 2,15 (m, 1H), 3,13 (dd, 1H, J = 9,8, 3,5 Hz), 3,21
(s, 3H), 3,23 (s, 3H), 3,32 (ta, 1H, J = 9,2 Hz), 3,42 (s,
3H), 3,40-3,55 (m, 4H), 3,68 (ta, 1H, J =
6,9 Hz), 3,91 (sa, 1H), 4,05 (ta, 1H, J = 9,0 Hz), 4,13 (ta,
1H, J = 8,5 Hz), 4,19 (d, 1H, J = 14,1 Hz), 4,66 (d,
1H, J = 3,5 Hz); RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta =
14,6, 23,1, 24,33, 24,37, 26,4, 26,5, 29,8,
29,9-30,1 (señales de CH_{2} de la cadena lineal
C_{14}), 30,8, 32,3, 50,5, 57,8, 66,1, 67,3, 71,7, 72,3, 74,0,
76,7, 79,7, 80,2, 99,6; [\alpha]^{20}_{D}: +21,6 (c
0,5, CHCl_{3}); HRMS (FT-ICR): calc. para
C_{42}H_{85}NO_{5}^{+}: [M+H]^{+}: 682,6344;
encontrado: 682,6354. Análisis elemental calc. (%) para
C_{42}H_{84}NO_{5}^{+}: C 73,84, H 12,39, N 2,05;
encontrado: C 73,78, H 12,11, N 1,99.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células BM\Phi y DC de células
de médula ósea y se dividieron en dos cultivos separados. Para la
preparación de DC se cultivaron células de médula ósea en IMDM
completo suplementado con 10% de sobrenadante de células tumorales
B16 transducidas con GM-CSF [R. Soiffer, T. Lynch,
M. Mihm, K. Jung, C. Rhuda, J.C. Schmollinger, F.S. Hodi, L.
Liebster, P. Lam, S. Mentzer, S. Singer, K.K. Tanabe, A.B. Cosimi,
R. Duda, A. Sober, A. Bhan, J. Daley, D. Neuberg, G. Parry, J.
Rokovich, L. Richards, J. Drayer, A. Berns, S. Clift, L.K. Cohen,
R.C. Mulligan, G. Dranoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,
95(22), 13141-13146]. Se añadió medio fresco
cada 2 días. Después de 7-10 días de cultivo las
células se analizaron para la expresión de CD11c y se emplearon en
ensayos en los que 90% fueron CD11c positivo. Para la preparación de
BM\Phi se cultivaron células de médula ósea en IMDM completo
suplementado con 10% de sobrenadante de células NIH3T3 transducidas
con M-CSF. También en este caso se añadió medio
fresco cada 2 días. Después de 7-10 días de cultivo
las células se analizaron para la expresión de Mac1 y se emplearon
en ensayos en los que al menos 90% fueron Mac1 positivo. Se
cultivaron las células D1 en IMDM suplementado con 10% de
sobrenadante de células tumorales B16 transducidas con
GM-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células D1, BMDC y M\Phi se cultivaron en
placas de 48 pocillos a una concentración de 200000 células/pocillo
en 200 \mul de medio. Una o dos horas después de haberlas
introducido en las placas se trataron con diferentes cantidades de
compuestos Ic y Id durante 30 min y después se estimularon con
lípido A de Escherichia coli (F583, mutante Rd Sigma, 0,5
\muM) durante 18 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron en placa células (InvivoGen, San
Diego, CA, EEUU) en placas de 5 pocillos a una concentración de
9x10^{6} células/pocillo en 5 ml de medio. Entonces se añadió el
monosacárido Id al medio y después de 2 horas se añadió el lípido A
de Escherichia coli o CpG (0,5 \muM) a células
transfectadas con TLR-4 o TLR9, respectivamente.
Después de 2 h las células se recogieron para la medida de
NF-\kappaB.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del factor de transcripción se
realizó con un kit de ELISA (Active Motif, Rixensart, Bélgica) que
permite la detección de la activación de
NF-\kappaB mediante una combinación de la unión de
un oligonucleótido específico de NF-\kappaB y la
posterior detección de la subunidad p65 de
NF-\kappaB con un anticuerpo específico, según
las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se anestesiaron ratones macho C57BL/6J con
pentobarbital sodio (65 mg/kg, i.p.) y se sometieron a cirugía para
inducir un dolor neuropático. Brevemente, el nervio ciático común se
expuso a nivel del muslo medio y, próximas a la trifurcación de los
nervios ciáticos, se ataron tres ligaduras hasta que se observó una
breve contracción en la pata trasera respectiva. Se emplearon
animales de simulación (exposición del nervio ciático pero sin
ligadura) como controles. La respuesta al dolor del animal se
controló antes de la cirugía, en el día 7 (24 h después de la
última administración). El compuesto (Id) se administró i.p. a 5
mg/kg una vez diaria comenzando el día después de la cirugía. Se
ensayó la hipersensibilidad al calor según el procedimiento de
Hargreaves utilizando el ensayo plantar (Ugo Basile, Varese,
Italia). Se midió la alodinia mecánica utilizando el ensayo de Von
Frey.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de implantar electrodos de EEG, los
jerbos se dividieron en diferentes grupos basándose en el
tratamiento asignado. Se registró su electroencefalograma (EEG)
durante 1 h al día, durante 3 días, para determinar la potencia
espectral relativa y total basal. Las señales se registraron y se
procesaron para el análisis espectral de la transformada de Fourier
rápida mediante un programa informático para PC (PowerLab, AD
Instruments, Pty, Ltd., Australia). También se realizaron registros
de EEG durante 7 días después de la isquemia. Después de los
registros de EEG basales, cada jerbo de nuevo se anestesió
ligeramente y se indujo una isquemia de 10 min mediante la oclusión
de las arterias carótidas comunes bilaterales. La isquemia se
verificó cualitativamente sobre el papel mediante el alisamiento
completo del EEG. Un grupo de animales (operados de modo simulado)
se sometió al mismo procedimiento quirúrgico excepto que las
arterias carótidas no se cerraron. El compuesto (Id) se administró
i.p. a los animales a la dosis de 10 mg/kg 30 minutos antes de la
inducción de la isquemia.
\vskip1.000000\baselineskip
Tres compuestos representativos de la invención,
los compuestos Ia, Ic y Id, se ensayaron para su capacidad para
interferir con la activación de células dendríticas (DC) y
macrófagos (M\Phi) inducida por el lípido A. Estas dos clases de
leucocitos están directamente implicados en el refuerzo y el control
de las respuestas inflamatorias y, tras su interacción con
productos microbianos, como LPS, producen grandes cantidades de
TNF\alpha, uno de los principales mediadores de la inflamación y
el choque séptico. En este contexto, la activación de
TLR-4 por LPS es uno de los estímulos más potentes
para el cebado de DC.
En vista del papel principal de la activación
temprana de DC y M\Phi para dirigir las reacciones inflamatorias,
los compuestos Ia, Ic y Id se ensayaron para su capacidad para
antagonizar la actividad estimuladora del lípido A en macrófagos
derivados de médula ósea (BM\Phi) y DC derivadas de médula ósea
(BMDC) interfiriendo con su capacidad para inducir la producción de
TNF\alpha. Como fuente de DC también se utilizaron células D1,
una línea celular DC dependiente del factor del crecimiento a largo
plazo (GM-CSF) [C. Winzler et al., J. Exp.
Med., 1997, 185, 317-327]. Las células BM\Phi,
BMDC y D1 se estimularon con lípido A (0,5 \muM) después de una
preexposición a los compuestos Ia, Ic y Id, y la cantidad de
TNF\alpha liberada en el sobrenadante se midió mediante ELISA.
Como se muestra en la figura 1, los monosácaridos Ic y Id
interfieren con la acción del lípido A de una manera dependiente de
la dosis. El compuesto Id muestra una menor actividad mientras que
el monosacárido 10, que carece del anillo de tetrahidrofuranilo, es
totalmente inactivo (los datos no se muestran). En general, los
compuestos Ia, Ic y Id no muestran ninguna función inflamatoria
directa, puesto que no son capaces de estimular la producción de
citoquinas. El compuesto Id es más potente que Ic que, a su vez, es
mejor inhibidor que el compuesto Ia. Además, el compuesto Id muestra
la mayor solubilidad en el medio acuoso utilizado en los
ensayos.
El compuesto Id entonces se estudió con más
detalle controlando la producción de una segunda citoquina
inflamatoria, IL-1\beta. La síntesis de
IL-1\beta y TNF\alpha fue inhibida en células
BM\Phi y D1, y el efecto fue proporcional a la concentración de
Id. Para evaluar la selectividad por TLR-4 se
investigó la producción de TNF\alpha en presencia del compuesto
Id en respuesta a la estimulación a través del motivo CpG del ADN
bacteriano reconocido por TLR2 [H. Hemmi et al., Nature,
2000, 408, 740-745] y tripalmitoil cisteína
(Pam_{3}Cys-SK_{4}), que es específica para
TLR2 [S. Agrawal et al., J. Immunol., 2003, 171(10),
4984-4989]. La producción de TNF\alpha no fue
inhibida por Id en las cascadas inflamatorias mediadas por TLR9 y
TLR2 (figura 2), lo cual indica un nivel pertinente de
selectividad.
El potencial citotóxico de los compuestos Ia, Ib
y Ib también se investigó. Los compuestos de la invención contienen
una parte polar (el resto de azúcar) unido a cadenas lipófilas y,
por tanto, puede actuar como detergente y destruir a las células
generando poros en las membranas plasmáticas. La toxicidad de los
compuestos Ia, Ib y Id se investigó con el ensayo de PI y se
investigó el potencial apoptótico con el ensayo de anexina V. Tanto
DC como M\Phi no mostraron un porcentaje apreciable de células
muertas después de 48 h de incubación con Id a unas concentraciones
que varían de 10 a 100 \muM (figura 3).
Otra prueba directa de que el compuesto Id
ejerce su acción de forma selectiva sobre el receptor
TLR-4 se obtiene con experimentos con un sistema de
células HEK 293 transfectadas con TLR-4 y TLR9 [J.C.
Chow, J. Biol. Chem., 1999, 274(16),
10689-10692]. En estas células, la activación de
NF-\kappaB dependiente de TLR puede medirse con
facilidad después de la estimulación. La activación de la vía de
señalización de TLR-4 conduce a la translocación
nuclear de NF-\kappaB y a la producción de
citoquinas inflamatorias. Las células HEK 293 transfectadas con
TLR-4 y TLR9 se incubaron, respectivamente, con
lípido A (0,5 \muM) o CpG (0,5 \muM), después de una
preexposición al compuesto Id, y la activación de
NF-\kappaB se midió 2 h después. Como se muestra
en la figura 4, el monosacárido Id es capaz de contrarrestar, de
forma significativa, el efecto del lípido A en células
transfectadas con TLR-4, mientras que es inactivo a
la dosis máxima de 50 \muM para contrarrestar el efecto de CpG
sobre TLR9 HEK 293.
La administración repetida del compuesto Id a
ratones neuropáticos una vez diaria durante una semana, comenzando
el día después de la lesión del nervio ciático, indujo un alivio
significativo de ambas señales de dolor neuropático: hiperalgesia
térmica (una menor latencia a la retirada frente a un estímulo
térmico) y alodinia mecánica (percepción del dolor después de la
aplicación de un estímulo mecánico que normalmente es inocuo), como
se muestra en la figura 5.
El compuesto Id también es capaz de antagonizar
significativamente el alisamiento de EEG inducido por isquemia,
comenzando desde el día 1 después de la recirculación. En la figura
6 se muestra un análisis de EEG cuantitativo de jerbos tratados con
el compuesto Id. Un ANOVA de dos vías reveló un efecto significativo
de dosis, tiempo e interacción entre los grupos evaluados durante
la isquemia y 1 hora, 1 día, 3 días y 7 días después de la
recirculación. El grupo con vehículo presentó una disminución
significativa en la potencia de EEG en todos los intervalos
ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antiinflamatoria del compuesto Ia
se evaluó con el ensayo de edema de carragenano en ratos macho
C57BL/6J (Harlan, Italia) de 9 semanas de edad, mantenidos bajo
condiciones convencionales de temperatura, humedad y ciclo de
luz/oscuridad y se dejó que se aclimatasen durante al menos una
semana antes del ensayo. Los ratones se anestesiaron con
pentobarbital sodio (60 mg/kg, i.p.) y se indujo una inflamación
aguda mediante la administración intraplanar de 20 \mul de
\lambda-carragenano (disolución fisiológica al
2%). Los animales control recibieron una administración intraplanar
de disolución fisiológica. El compuesto Ia (disuelto en etanol al
10% en disolución fisiológica) se administró por vía intraperitoneal
30 minutos antes del carragenano a dosis diferentes (3, 10 y 30
mg/kg, 100 \mul/10 g de peso corporal). Los animales control
recibieron una administración análoga de vehículo. Un grupo de
animales recibieron indometacina (5 mg/kg, i.p.) como compuesto
antiinflamatorio conocido para la comparación de la eficacia.
Se midió el volumen de la pata con un
pletismómetro antes y 2 horas después de la administración de
carragenano. La diferencia entre el volumen de la pata ipsilateral
y contralateral representa el edema antiinflamatorio expresado como
\mul. Los resultados se indican en la figura 7.
Se midió la producción de óxido nítrico ex
vivo en homogeneizado de pata como un marcador significativo de
la inflamación, mediante un procedimiento fluorimétrico basado en la
determinación del nivel de nitritos/nitratos, que son los productos
finales del metabolismo de NO [Misko et al., Anal. Biochem.,
1993, 214, 11-16]. Los resultados se indican en la
figura 8.
Claims (7)
-
\global\parskip0.990000\baselineskip
1. Compuestos de fórmula general (I)12 en la que:Q representa oxígeno;Y representa oxígeno;R_{1} se selecciona de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} y fenilo;R_{2} son ambos cadenas de alquilo C_{14};R_{3} es tetrahidrofuran-1-ilo o ciclopentilo;R_{4} se selecciona de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} o un grupo R_{4}'X, en el queR_{4} es alquilo C_{1}-C_{10} y X es un átomo de oxígeno o azufre;y sus sales de ácidos fisiológicamente aceptables o sus sales de amonio cuaternario. - 2. Un compuesto seleccionado de: metil 6-desoxi-6-[N-(1'-tetrahidrofuranil)-N'-metoxiamino)-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido (Ia)
13 metil 6-desoxi-6-[N-(ciclopentil)-N'-metoxiamino)-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido (Ib)14 \newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
metil 6-desoxi-6-ciclopentilamino-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido (Ic)15 metil 6-desoxi-6-N,N',N''-dimetilciclopentilamonio-2,3-di-O-tetradecil-\alpha-D-glucopiranósido (Id)16 - 3. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para su uso como medicamentos.
- 4. El uso de los compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos inflamatorios.
- 5. El uso de los compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para la preparación de composiciones farmacéuticas analgésicas.
- 6. El uso de los compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la isquemia cerebral.
- 7. Composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, mezclado con excipientes y/o vehículos adecuados.
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