ES2330709B1 - Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la produccion de bebidas alcoholicas/vino. - Google Patents
Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la produccion de bebidas alcoholicas/vino. Download PDFInfo
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Abstract
Microorganismo fermentador productor de altas
concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la producción de
bebidas alcohólicas/vino.
La presente invención describe dos cepas de
levadura, BM58 (CECT13003) y BM60 (CECT13004), pertenecientes a las
especies Saccharomyces bayanus (var. uvarum) y S.
cerevisiae respectivamente, no manipuladas genéticamente,
seleccionadas de fermentaciones vínicas naturales con buena
capacidad fermentativa de mostos para la obtención de bebidas
alcohólicas, preferentemente vino. Los vinos obtenidos con dicha
levadura se caracterizan por tener elevadas concentraciones de
glicerol sin incrementar el ácido acético y un aumento en la
producción de ciertos aromas secundarios. Ambas levaduras producen
mayoritariamente aromas del tipo ésteres etílicos como el caproato
de etilo, caprilato de etilo, succinato de dietilo y caprato de
etilo. Por último, cabe destacar la elevada capacidad de
implantación en fermentaciones vínicas y la capacidad de crecer a
bajas temperaturas (10°C) de estas levaduras.
Description
Microorganismo fermentador productor de altas
concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la producción de
bebidas alcohólicas/vino.
La presente invención se encuadra en el área
Agroalimentaria y en concreto en el sector de la enología. Se trata
de dos cepas de levadura de origen vínico, pertenecientes a la
especie Saccharomyces bayanus var. uvarum (BM58) y
Saccharomyces cerevisiae (BM60), que tienen la capacidad de
producir un aumento de la concentración de glicerol en vino de
aproximadamente 100%, variando la concentración entre 9 y 22 g/L
dependiendo de la temperatura de fermentación e incrementar la
producción de aromas secundarios, aumentando la calidad
organoléptica del vino.
La composición química del vino está determinada
por varios factores, entre los que se incluyen la variedad de la
uva, las condiciones geográficas, la ecología microbiana de la uva,
los procesos fermentativos y las prácticas de vinificación (Cole
and Noble, 1997). Los microorganismos, especialmente las levaduras,
juegan un papel importante en la composición química del vino y,
por tanto, en el aroma final del mismo.
Durante la fermentación alcohólica llevada a
cabo por las levaduras, se producen diversos mecanismos que
contribuyen a la calidad organoléptica del vino: (i) utilización de
los constituyentes del zumo de uva, (ii) producción de etanol y
otros solventes que ayudan a extraer los componentes aromáticos de
las uvas, (iii) producción de enzimas que dan lugar a componentes
aromáticos, (iv) producción de cientos de metabolitos secundarios
(ácidos, alcoholes, ésteres, polialcoholes, aldehídos, cetonas,
compuestos azufrados), y (v) degradación autolítica de células
muertas de levadura (Cole and Noble, 1997; Lambrechts and
Pretorius, 2000).
El glicerol, es un triol incoloro, inodoro y con
elevada viscosidad, comercialmente conocido como glicerina. Es el
componente más abundante en el vino después del etanol y se forma
durante la fermentación alcohólica como consecuencia de la oxidación
de los azúcares llevada a cabo por las levaduras (Scanes y
colaboradores, 1998).
Análisis sensoriales han mostrado que el
glicerol proporciona dulzor por encima de unos 5,2 g/L en vino
blanco seco. Las concentraciones de glicerol en vinos secos y
semi-dulces varían entre 5 y 14 g/L, aunque pueden
encontrarse concentraciones superiores (hasta 21 g/L) en vinos
blancos elaborados con mosto cuyas uvas han sido infectadas por el
hongo Botrytis cinerea (Calderone et al., J. Agric. Food
Chem., 52 (19), 5902-5906, 2004).
El aroma de los vinos es una de las
características más importantes en la valoración de su calidad. Se
puede dividir en tres grandes grupos: (i) los aromas procedentes de
la variedad de la uva o aromas primarios, producidos por sustancias
volátiles, transferidas por los granos de la uva al mosto; (ii) los
aromas producidos durante la fermentación o aromas secundarios,
entre los que se incluyen dos tipos de compuestos aromáticos
mayoritarios, alcoholes superiores y ésteres; y (iii) el
"bouquet", también conocido como aroma terciario, producido
por la transformación final de los anteriores durante el
envejecimiento. De esta manera, una forma de mejorar el contenido
aromático de los vinos contribuyendo a la mejora de su calidad, y
que en la actualidad se ha traducido en una tendencia de la
industria vinícola, es desarrollar la etapa de fermentación a bajas
temperaturas. En estas condiciones se ralentiza la producción de
etanol por parte de la levadura y se ven favorecidas otras rutas
metabólicas responsables de la generación de aromas secundarios.
Aunque el glicerol no tiene un impacto directo
en las características aromáticas del vino, sí que contribuye al
sabor y cuerpo final del vino, proporcionando dulzor, de ahí que en
algunos países europeos se utilice como indicador de calidad en el
vino. Por estas razones, el glicerol es añadido en ocasiones de
forma fraudulenta en el vino disminuyendo así su calidad. Teniendo
en cuenta que la adición de glicerol al vino es una práctica no
permitida por las regulaciones de la Comisión Europea (EC Regulation
822/87, appendix IV), resulta de gran interés utilizar una cepa de
levadura que, tras su adición al mosto de uva, produzca un
incremento de la concentración de glicerol durante la fermentación
alcohólica.
Hasta el momento, se conoce la existencia de
cepas de Saccharomyces cerevisiae, cuya sobreexpresión en
los genes GPD1 y GPD2, da lugar a una sobreproducción de glicerol
(de Barros Lopes y col., 2000). Sin embargo, estas cepas también
incrementan las concentraciones de ácido acético a niveles
inaceptables. Por otra parte estas cepas son microorganismos
modificados genéticamente (GMO) lo que supone un rechazo por parte
de los consumidores y por tanto las empresas de alimentos son
reacias a utilizar GMO. Además, los alimentos que contienen
organismos modificados genéticamente fueron regulados en 1997 por
la Unión Europea, y exige el etiquetado de los productos destinados
a la alimentación cuando contenían organismos modificados
genéticamente legalmente autorizados que representen al menos el 1%
del producto.
En el mosto están presentes distintos géneros y
especies de levaduras, pero el género Saccharomyces, y
principalmente la especie S. cerevisiae, es responsable de
la fermentación alcohólica (Pretorius, 2000). Sin embargo, existen
otras especies del complejo Saccharomyces "sensu
stricto" que también se han encontrado en procesos
fermentativos. En concreto, S. bayanus, es típica de
fermentaciones vínicas realizadas a bajas temperaturas, y algunas
cepas presentan propiedades fermentativas mejores que algunas cepas
de S. cerevisiae como incremento en la concentración de
glicerol (S.S. González 2006. Tesis doctoral).
Por tanto, la utilización de cepas de S.
cerevisie o S. bayanus aisladas de vino, y que durante
la fermentación alcohólica produzcan un incremento de la
concentración de glicerol, resulta muy interesante para su
aplicación en la industria vínica.
De entre las herramientas fundamentales que hoy
posee la industria vinícola para ser competitiva en el mercado es
poseer vinos de alta calidad. Una de esas herramientas consiste en
mejorar la composición del vino, y por tanto su calidad,
seleccionando los microorganismos utilizados en la
fermentación.
De esta manera, el objeto de la presente
invención es un microorganismo útil para la fermentación de bebidas
alcohólicas, preferentemente vino, caracterizado por ser un
microorganismo no modificado genéticamente, aislado y seleccionado
de fermentaciones naturales, que produce altas concentraciones de
glicerol y que genera una serie de aromas secundarios, mejorando
las cualidades organolépticas del producto de la fermentación.
Asimismo, objetos particulares de la presente
invención consisten esencialmente en que el microorganismo objeto
de la presente invención es una levadura del género
Saccharomyces que comprende las especies S.
cerevisiae ó S. bayanus, y más concretamente las cepas de
levadura S. bayanus var. uvarum (BM58) (CECT 13003) ó S.
cerevisiae (BM60) (CECT . 13004).
Por otra parte, el microorganismo objeto de la
presente invención se caracteriza por ser aislado y seleccionado de
fermentaciones naturales de vinos de áreas de producción
(denominación de origen D.O.) controlada
Utiel-Requena, Valencia y Alicante, por presentar
una implantación mayoritaria en fermentación vínica, de hasta el
100% con cualquier tipo de variedad de uva y que se caracteriza por
tolerar: pH bajos, de hasta 2,8; temperatura de crecimiento y
fermentación tanto alta como baja, entre 10 y 30ºC; presión
osmótica de hasta 300 g/l de azúcares; y altas concentraciones de
alcohol en el medio, hasta 15%.
Otro objeto de la invención consiste
esencialmente en que el microorganismo de la presente invención
produce un aumento de la concentración de glicerol superior a 9 g/L
alcanzando incluso hasta 22,27 g/L, lo que equivale hasta un 150%
más de glicerol.
En otra realización particular de la invención
el microorganismo objeto de la presente invención se caracteriza
por producir un aumento de la producción de aromas secundarios
respecto a una levadura comercial que se caracteriza por ser una
levadura muy aromática que se ha usado como control. Estos aromas
secundarios pueden pertenecer al grupo de los acetatos, ésteres
etílicos, y/o alcoholes.
Un último objeto de la presente invención
consiste en el uso del microorganismo objeto de la presente
invención para la elaboración de bebidas alcohólicas fermentadas, y
de forma particular en la elaboración de cualquier tipo de vino a
partir de mostos de uva de cualquier variedad.
Hoy en día, una de las herramientas
fundamentales de la industria vinícola para ser competitiva en el
mercado es poseer vinos de alta calidad. Ello lleva a una búsqueda
continua de mejoras en todas aquellas variables que condicionen la
calidad del vino. Dado que la calidad de las bebidas alcohólicas,
concretamente del vino, depende fundamentalmente de su composición
química conseguir mejorar sus procesos de forma natural, sin
recurrir a microorganismos modificados genéticamente o aditivos,
cumpliendo la normativa legal, supone una clara ventaja en el
mercado.
Una de las formas de mejorar la composición, y
por tanto la calidad del vino, radica en los microorganismos
utilizados en la fermentación, lo que se pone de manifiesto en el
amplio número de investigaciones que se realizan en esta área. En
el mercado hay un gran número de levaduras. La selección de
levaduras se realiza teniendo en cuenta una serie de características
enológicas generales tales como un elevado poder fermentativo, baja
acidez volátil, regularidad en la fermentación, ausencia de efectos
olfativos, la no formación de espuma y que la viabilidad de las
levaduras no disminuya tras el proceso de producción de levadura
seca activa e incluso que no sean muy exigentes nutricionalmente
(Querol et al., 1992a y Suárez e Iñigo, 2004). También
podemos hablar de otros criterios más específicos tales como
levaduras productoras de aromas, que degraden el ácido málico o
incluso que incremente la concentración de glicerol (Pretorius,
2000).
Por lo tanto, el objeto de la presente invención
es un microorganismo útil para la fermentación de bebidas
alcohólicas, preferentemente vino, caracterizado por ser un
microorganismo no modificado genéticamente, aislado y seleccionado
de fermentaciones naturales, que produce altas concentraciones de
glicerol y que genera otros aromas secundarios, mejorando las
cualidades organolépticas del producto de la fermentación.
En un trabajo previo (S. S. González 2006. Tesis
doctoral), se comprobó que especies del género Saccharomyces
distintas a S. cerevisiae tales como S. bayanus,
producían una mayor cantidad de glicerol que las cepas de S.
cerevisiae. Teniendo en cuenta este dato, y puesto que esta
especie crece mejor a bajas temperaturas, se procedió al
aislamiento de estas levaduras en bodega (ver ejemplo 1).
Posteriormente, fueron seleccionadas dos cepas, BM58 y BM60,
teniendo en cuenta una serie de criterios de interés enológico
tales como capacidad fermentativa, capacidad de fermentar distintas
concentraciones de azúcar, buena tasa fermentativa, buen rendimiento
de etanol, producción elevada de glicerol y baja de ácido acético,
etc. En la Tabla 1 se muestra la analítica resultante de los vinos
obtenidos tras fermentar con mosto de la variedad Tempranillo de
las cepas, BM58 y BM60, y se compara con la levadura comercial T73
(cepa vínica S. cerevisiae aislada en Alicante, España,
comercializada por Lalvin, Lallemand y seleccionada por A. Querol y
bajo depósito de patente CECT 1894). Esta cepa comercial fue
seleccionada como una cepa que produce altas concentraciones de
glicerol (ver descripción de características técnicas en
http://www.lallemandwine.us/cellar/zinfandel.php. Tal y como
se puede observar en la tabla, la cepa BM58 produce 22,27 g/L, la
BM60 12 g/L y la cepa T73 9,62 g/L fermentando a 28ºC y a 12ºC la
producción de glicerol es de 12 g/L BM58, 9,5 BM60 y de 5,65 T73,
indicando estos valores que la producción de glicerol en las cepas
BM58 y BM60 superior al producido por T73 fermentando a 28ºC y
12ºC.
Un objeto particular de la presente invención
consiste en que el microorganismo objeto de la presente invención
es una levadura del género Saccharomyces que comprende las
especies S. cerevisiae ó S. bayanus.
Con el objetivo de caracterizar genéticamente
las cepas aisladas se utilizaron distintas técnicas moleculares
cuyos resultados mostraron para la cepa BM58 los patrones típicos
de S. bayanus y para la cepa BM60 los patrones típicos de
S. cerevisiae (ver Figuras 1 y 2).
Tradicionalmente, varias especies del género
Saccharomyces han estado relacionadas con la producción de
bebidas alcohólicas, dentro de las que destacan: S. cerevisiae,
S. bayanus (var. bayanus y var. uvarum) y S.
pastorianus, entre otras. La taxonomía clásica de las levaduras
se basa en características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas, criterios con los que surgieron todos estos nombres de
levaduras relacionados con la fermentación alcohólica, aunque a
menudo sean insuficientes para establecer con precisión la
filogenia (relación de microorganismos en diferentes linajes o
estirpes) de las levaduras. En los últimos años, la biología
molecular ha aportado valiosas herramientas para establecer con
mucha mayor precisión la clasificación de las levaduras
(Fernández-Espinar et al., 2003). De esta
manera, diferencias funcionales entre cepas del género
Saccahromyes que resultan de gran importancia para los
procesos de producción de bebidas alcohólicas, y aunque
aparentemente muy significativas, no son sino el resultado de
pequeñas mutaciones en su material genético (García Garibay y col,
1993).
En la actualidad, la especie S. bayanus
incluye dos variedades, S. bayanus var. bayanus y
S. bayanus var. uvarum. Se ha sugerido que la cepa
tipo de S. bayanus (aislada de cerveza) pudiera tratarse de
un híbrido entre S. uvarum (levaduras vínicas incluidas en
el taxón S. bayanus) y S. cerevisiae, con lo que se
ha propuesto recuperar el nombre específico S. uvarum para
las cepas no híbridas incluidas en el taxón S. bayanus y
aisladas mayoritariamente de vinos (Nguyen y col., 2000).
Otra realización particular de la invención
consiste en que el microorganismo objeto de la presente invención
es la cepa de levadura S. bayanus var. uvarum (BM58) (CECT
13003) ó S. cerevisiae (BM60) (CECT 13004). Dicha
identificación se ha realizado mediante la amplificación por PCR
de la región ribosomal 5,8S-ITS utilizando los
cebadores universales ITS1 e ITS4 y su posterior digestión con el
enzima de restricción HaeIII siguiendo la metodología
desarrollada por Fernández-Espinar et al.
(2000) y comparando con los patrones de especie ya obtenidos por
nuestro grupo y disponibles en una base de datos accesible a través
de la hoja webb del IATA (http://yeast-id.com/).
Los resultados se muestran en la Figura 1 donde se puede observar
que la cepa BM60 corresponde a la especie S. cerevisiae al
dar un patrón de restricción de de 325, 230, 170, 125 pb y la cepa
BM 58 es S. bayanus var. uvarum al dar el patrón típico de
esta especie, 495, 230, 125 pb con el enzima HaeIII.
Para la caracterización a nivel molecular de
clon o cepa se hizo uso de la técnica rápida de análisis de
restricción del mtDNA. El análisis de polimorfismos mediante
restricción del DNA mitocondrial ha sido ampliamente utilizado como
método de caracterización de cepas de levadura de origen vínico.
Esta técnica permite determinar el perfil molecular de cada cepa de
una forma precisa y muy reproducible. Para realizar esta
caracterización en la presente invención, se utilizó el DNA
extraído según el protocolo descrito por Querol et al.
(1992). El patrón de las cepas, BM58 y BM60 se muestra en la Figura
2 donde se puede observar un patrón de bandas totalmente distinto
entre ambas cepas indicando que son distintas cepas. Estos patrones
se han comparado con el de otras levaduras comerciales
(Fernández-Espinar et al., 2001), donde hemos
podido comprobar que el patón presente de las levaduras BM58 y BM60
no corresponden con el de ninguna de las levaduras habitualmente
utilizadas por las bodegas Españolas.
Una realización particular de la invención
consiste esencialmente en que el microorganismo objeto de la
presente invención se caracteriza por ser aislado y seleccionado de
fermentaciones naturales de vinos de áreas de producción
(denominación de origen D.O.) controlada
Utiel-Requena, Valencia y Alicante, por presentar
una implantación mayoritaria en fermentación Mica, de hasta el
100% con cualquier tipo de variedad de uva y que se caracteriza por
tolerar: pH bajos, de hasta 2,8; temperatura de crecimiento y
fermentación tanto alta como baja, entre 10 y 30ºC; presión
osmótica de hasta 300 g/l de azúcares; y altas concentraciones de
alcohol en el medio, hasta 15%.
\newpage
Durante la vinificación se producen una serie de
estreses y no todas las cepas de levaduras se adaptan bien a estas
condiciones de crecimiento afectando negativamente tanto a la
capacidad de crecer en estas condiciones, a la capacidad
fermentativa de las levaduras y a las características enológicas de
los vinos obtenidos. Dichos estreses son, de manera ilustrativa y
sin que limite el alcance de la invención: bajos pH, estrés
osmótico debido a altas concentraciones de azúcares y de alcohol.
En el ejemplo 2 se expone el estudio realizado con las cepas BM58 y
BM60 a distintos estreses y en la Tabla 2 se muestran los datos de
crecimiento de la cepa BM58 y de las cepas control tanto de vino
como de cerveza en distintas condiciones de estrés.
Las altas concentraciones de alcohol en el medio
también tienen un efecto negativo para el crecimiento de las
levaduras. Las levaduras tolerantes a altas concentraciones de
alcohol, son de gran interés para la industria vínica en general, y
más concretamente en la elaboración de espumosos, donde las
levaduras tienen que fermentar azúcar en presencia de altas
concentraciones de alcohol (\sim11% de alcohol) y pocas levaduras
se adaptan a estas condiciones y se producen paradas de
fermentación.
En la tabla 2 se aprecia como en presencia de 5,
10, 12 y 15% de alcohol las cepas cerveceras pertenecientes a la
especie S. cerevisiae son más sensibles al crecimiento en
presencia de alcohol, y tan sólo crecen bien en presencia de 5% de
alcohol, y no observándose crecimiento en presencia de 10, 12 6 15%
de alcohol. Las cepas vínicas pertenecientes a esta especie son
más resistentes al alcohol observándose crecimiento tanto en
presencia de 10 y 12% de alcohol; sin embargo, no todas son capaces
de crecer en presencia de 15% de alcohol. Respecto a la capacidad
de crecer en presencia de alcohol las cepas pertenecientes a S.
bayanus especie a la que pertenece la cepa BM58, las
diferencias son más significativas en presencia de 12 y 15% de
alcohol, siendo la cepa BM58 la que crece sin ningún problema en
presencia de 12 y 15% de alcohol y cabe destacar que a esta última
concentración de alcohol mostró crecimiento hasta la quinta
dilución y el resto de cepas de esta especie no crecieron a ninguna
dilución excepto la cepa de cerveza CECT 1991 que solo creció hasta
la tercera dilución, indicando estos datos unas características
fisiológicas especiales no presentes en otras cepas de levaduras de
la misma especie.
Por otra parte, se ha podido comprobar que las
cepas descritas en la presente invención son capaces de crecer a
temperaturas más bajas que las cepas vínicas. La cepa BM60 mostró
buena capacidad de crecer a temperaturas bajas de 10 y 16ºC e
incluso una adaptación a fermentar a bajas temperaturas mejor que
la mostrada por el resto de cepas pertenecientes a la especie S.
cerevisiae analizadas y es más sensible a crecer a 37ºC que
otras levaduras vínicas pertenecientes a las especies S.
cerevisiae analizadas (ver Tabla 2). También cabe destacar que
la cepa BM58 perteneciente a S. bayanus (var. uvarum)
también creció a 10ºC.
Al igual que ocurre con la temperatura, ambas
cepas, no se vieron afectadas por los estreses por bajos pH y altas
concentraciones de azúcar (hasta 300 mg/L). Respecto al resto de
estreses se puede concluir que todas las levaduras son capaces de
crecer a bajos pH y no les afecta altas concentraciones de
azúcar.
Por otra parte, se ha averiguado que la cepa
BM58 se implanta en las fermentaciones llevadas a cabo en bodega
(ver ejemplo 3). La cepa S. bayanus var uvarum
(BM58), está presente de forma mayoritaria durante los primeros
días de fermentación (hasta el 6ª día), detectando entre un 40 y un
70% de implantación. Este elevado grado de implantación, de manera
ilustrativa y sin que limite el alcance de la invención, se observó
tanto en vinos blancos elaborados con variedad de uva Merseguera
(fermentadores V22, V34-17 y V35), vinos rosados
elaborados con uva Tempranillo (fermentadores V29, V30 y V31) y
Monastrell, y vinos tintos elaborados con uva Bobal y Tempranillo
(Tabla 3 y Figura 3).
En cuanto a la adaptación a fermentar diversas
variedades de uva no se han detectado diferencias fermentativas en
cuanto a velocidad de fermentación y azúcares residuales entre las
variedades tempranillo y bobal.
Otro objeto de la invención consiste
esencialmente en que el microorganismo de la presente invención
produce un aumento de la concentración de glicerol superior a 9
g/L alcanzando incluso hasta 22,27 g/L, lo que equivale hasta un
150% más de glicerol.
Una levadura comercial habitual produce como
máximo 9 g/L de glicerol a 28ºC, temperatura normal de fermentación
(ver tabla 1). Sin embargo, tanto BM58 como BM60 producen niveles
de glicerol superiores a los de una levadura comercial tanto a
bajas temperaturas como a temperaturas óptimas de fermentación,
alcanzando hasta los 22,27 g/L a 28ºC.
El glicerol contribuye al sabor y cuerpo final
del vino, proporcionando dulzor tanto en vinos blancos, rosados y
tintos, de ahí que en algunos países europeos se utilice como
indicador de calidad en el vino. Además, en el caso de vinos
tintos, el glicerol interviene en suavizar el carácter astringente
de los polifenoles tales como los taninos, típicos en vinos tintos,
consiguiendo de esta forma vinos más suaves al paladar y
facilitando la obtención de vinos tintos envejecidos en barricas.
Otra de las necesidades del sector es la obtención de levaduras
cuyo rendimiento en alcohol durante la fermentación alcohólica sea
vinos con alto grado alcohólico, necesidad que se hace en la
actualidad más crucial con el cambio climático, ya que se obtienen
mostos con mayor grado de madurez. Las levaduras que son capaces de
desviar el consumo de azúcar para producir glicerol durante la
glicolisis, también tiene como característica que disminuye el
rendimiento en la obtención de alcohol (Pretorius, 2000). Por lo
tanto, la selección de levaduras que además de cumplir los criterios
generales sean capaces de incrementar la concentración de glicerol
en los vinos es de gran interés para las industrias.
Hasta ahora no se ha obtenido ninguna levadura
comercial que tenga la capacidad de incrementar la síntesis de
glicerol y disminuya el rendimiento en alcohol con la posibilidad
de disponer de este tipo de levaduras con todas las ventajas que
conlleva su utilización o bien la única posibilidad de ello era
recurriendo a GMO. En la presente invención, se presenta la
selección de dos levaduras naturales no recombinantes que tienen la
capacidad de producir entre un 40 a un 60% más de glicerol,
dependiendo de las condiciones de fermentación y una disminución de
0,5 g/L de alcohol que otras levaduras comerciales analizadas en la
bodega (datos de la bodega).
En otra realización particular de la invención
el microorganismo objeto de la presente invención se caracteriza
por producir un aumento de la producción de aromas secundarios
respecto un mismo producto control. Estos aromas secundarios pueden
pertenecer al grupo de los acetatos, ésteres etílicos, y/o
alcoholes. A modo ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, se muestra en las tablas 4, 5 y 6 las concentraciones de
los compuestos aromáticos analizados obtenidos con la cepa BM58, y
en su caso con BM60, en vinos blancos, tintos y espumosos,
respectivamente.
Una vez realizadas la fermentaciones con la cepa
S. bayanus BM58 se cuantificó un conjunto de compuestos
volátiles que se forman durante la fermentación: ésteres y
alcoholes superiores en dos vinos donde se implantó la levadura en
porcentajes altos (ver Tabla 3 y Ejemplo 3). La contribución de
todos estos compuestos en el aroma final del vino fue muy variable.
Para alguno de ellos, se encontró correlaciones positivas entre su
concentración y la calidad del aroma final. Un ejemplo son los
ésteres etílicos, cuya presencia es muy importante, sobretodo en
vinos blancos jóvenes. Sin embargo, para otros parece existir un
umbral superior por encima del cual la calidad de vino disminuye.
Este es el caso de los alcoholes superiores y el acetato de etilo,
aunque en este último compuesto se ha correlacionado con algunas
prácticas enológicas no adecuadas. Las concentraciones de los
distintos compuestos obtenidos en la elaboración de vinos blancos
se muestran en la Tabla 4 y vinos tintos Tabla 5.
En otra realización particular de la invención
el microorganismo objeto de la presente invención se caracteriza
por producir un aumento en la producción de aromas secundarios del
grupo de los acetatos, y más concretamente el acetato de etilo,
acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, acetato de acetato de
hexilo, acetato de bencilo y acetato de fenil etanol (ver tablas 4,
5 y 6).
En general, en el estudio de la producción de
aromas secundarios del grupo de los acetatos obtenidos en los vinos
analizados utilizando las cepas BM58 y BM60, se presentaron
elevados niveles de acetato de etilo, el principal éster formado a
partir del etanol durante la fermentación. Las concentraciones
estuvieron entre 20,5-37,7 mg/L, siendo más elevadas
en vinos blancos y rosados. Los niveles encontrados en las
fermentaciones con la cepa BM58 se encontraron dentro de los
límites establecidos como concentraciones normales en vinos que es
de 50 mg/L (Scanes et al., 1998). El acetato de etilo,
produce un aroma afrutado (piña).
De los ésteres de acetato que se encontraron en
mayor concentración cabe destacar el acetato de isoamilo. Este
compuesto se caracteriza por un aroma a plátano. Los niveles
cuantificados en los vinos, entre 0,16 y 2,52 mg/L, superan el
umbral de detección y se consideran como concentraciones habituales
descritas en vinos. En general se han determinado concentraciones
mayores en los vinos rosados, aunque este acetato se encontró en
menor concentración en el caso del vino elaborado con la cepa
Noblesse, los vinos fermentados con BM58 tuvieron las
concentraciones más elevadas de acetato de isoamilo.
Finalmente, se cuantificó la concentración de
acetato 2 feniletanol, que se caracteriza por proporcionar aromas a
rosa, miel y tabaco. Todos los vinos presentaron niveles de entre
0,69 y 3 mg/L, que se encuentran en los límites habituales en vinos
y por encima del umbral de percepción (0,25 mg/L). Sin embargo, el
grupo de vinos R-120 Merseguera,
R-120 Tempranillo y V44 (todos obtenidos en el
ensayo 1 donde se impuso la cepa BM58), presentaron concentraciones
muy elevadas (108-199,4 mg/L), por encima de los
límites descritos.
En otra realización particular de la invención
el microorganismo objeto de la presente invención se caracteriza
por producir un aumento en la producción de aromas secundarios del
grupo de los ésteres etílicos, y más concretamente el caproato de
etilo, caprilato de etilo, succinato de dietilo, lactato de etilo y
caprato de etilo (ver tablas 4, 5
y 6).
y 6).
El caproato de etilo y caprilato de etilo son
ésteres relacionados con descriptores de aromas afrutados de
manzana y piña. Son compuestos que se encuentran comúnmente en los
vinos tintos como base del aroma. En el estudio de la producción de
aromas secundarios del grupo de los ésteres etílicos obtenidos en
los vinos analizados utilizando las cepas BM58 y BM60, se ha
observado que todos los vinos se caracterizan por presentar
concentraciones muy elevadas de caproato de etilo (hexanoato de
etilo), que proporciona aromas afrutados, a piel de manzana. Así,
en vinos tintos se han cuantificado valores entre
0,6-1,16 mg/L, que son niveles superiores a los
descritos para un vino tinto joven. Se observó que los vinos
elaborados con BM58 presentan mayor concentración de caproato de
etilo que el vino control (V17), siendo los tintos Bobal de Los
Marcos donde se impone la BM58 los de mayor contenido en este
compuesto. En los vinos blancos se han determinado
1,48-2,52 mg/L y en rosados
1,27-3,47 mg/L, niveles bastante más elevados de lo
habitual (como máximo 1,02 mg/L en blancos y 0,542 mg/L en
rosados).
El caprilato de etilo (octanoato de etilo) que
da lugar a aromas afrutados, se ha encontrado en elevadas
concentraciones en los vinos blancos y rosados. En los blancos,
valores entre 6,87-12,24 mg/L, y en rosados entre
5,20-11,30 mg/L, superan la concentración normal
descrita (0,82 mg/L y 0,20 mg/L respectivamente). Los vinos tintos
presentan entre 2,1 y 4,45 mg/, que también son concentraciones más
elevadas de lo habitual (0,78 mg/L). Cabe destacar que en los vinos
tintos bobal de Los Marcos elaborados con la BM58 se observó mayor
producción de este
compuesto.
compuesto.
El succinato de etilo y el lactato de etilo
están relacionados con aromas lácteos y de café. En particular el
lactato de etilo contribuye a amortiguar las aristas amargas y
ácidas en el gusto y según algunos autores contribuye a enriquecer
el volumen y redondez en boca. Los vinos analizados presentaron una
extraordinaria producción de succinato de dietilo, siendo ésta mayor
en los vinos tintos (8,8-26,5 mg/L). En estos
casos, se apreció además que los vinos elaborados con BM58
contenían más succinato de dietilo que el control V17. Los vinos
blancos y rosados también tienen concentraciones elevadas
(0,8-35,8 mg/L). En el caso del lactato de etilo,
se han determinado concentraciones de entre 6,8 y 38,80 mg/L.
El caprato de etilo (decanoato de etilo) tiene
también una importancia significativa en la calidad del aroma final
del vino, proporcionando un aroma a fruta, uva y dulzón. El umbral
de detección de este compuesto es de 0,2 mg/L, por lo que las
concentraciones que se han cuantificado en los vinos, exceden este
umbral (entre 0,8 y 5,23 mg/L). Los vinos elaborados con BM58
presentan en general mayor concentración de caprato de etilo que
los vinos control. Algunos vinos, tienen un contenido mucho mayor
al descrito hasta el momento (0,21 mg/L en vinos blancos y 0,42
mg/L en tintos). Cabe destacar la elevada concentración de caprato
de etilo en los vinos R-120 Tempranillo y SAUT26
San Antonio bobal y V44 todos elaborados con la BM58.
En otra realización particular de la presente
invención el microorganismo objeto de la presente invención se
caracteriza por producir un aumento en la producción de aromas
secundarios del grupo de los alcoholes, y más concretamente del
isobutanol, alcohol isoamílico, 1-hexanol y
2-feniletanol (ver tablas 4, 5 y 6).
El isobutanol es un compuesto que da lugar a
aromas que recuerdan a vino, solvente o amargo. En el estudio de la
producción de aromas secundarios del grupo de los alcoholes
obtenidos en los vinos analizados utilizando las cepas BM58 y BM60,
se han podido determinar concentraciones entre 1,3 y 6,8 mg/L de
isobutanol, que están por debajo de la concentración umbral de
detección (40 mg/L). Estos valores observados son mucho más bajos
que los niveles descritos en vinos y que están entre 25,7 y 103
mg/L.
Los vinos analizados se caracterizan por
presentar también elevadas concentraciones de alcohol isoamílico,
que proporciona aromas a whiskey, malta. Se cuantificaron
concentraciones entre 143,41 y 347,16 mg/L, que superan los niveles
habituales en vinos. El umbral de detección es de 30 mg/L.
Los alcoholes 1-hexanol y el
2-feniletanol se relacionan con descriptores que
recuerdan a la hierba y a las rosas respectivamente. Sin embargo,
los niveles de 1-hexanol en los vinos analizados,
entre 0,8 y 2,36 mg/L, están por debajo del umbral de detección (8
mg/L). Por otra parte, cabe destacar la elevada concentración de 2
feniletanol observada. En concreto, los vinos blancos y rosados
elaborados con BM58 tienen incrementada la concentración de este
compuesto (hasta 28,79 mg/L). Según datos bibliográficos, la
percepción del aroma del 2 feniletanol (a miel, picante, rosas), se
produce cuando se superan los 10-14 mg/L en el
vino. En nuestro caso, los niveles de 2 feniletanol están dentro
de las concentraciones habituales, aunque en el límite inferior.
(De 6 a 166 mg/L, dependiendo del tipo de vino).
Otro objeto de la presente invención consiste en
el uso del microorganismo objeto de la presente invención para la
elaboración de bebidas alcohólicas fermentadas, y de forma
particular en la elaboración de cualquier tipo de vino a partir de
mostos de uva de cualquier variedad.
Además de comprobar la capacidad a nivel
industrial para elaborar vinos de primera fermentación, también se
probó su capacidad para realizar la , segunda fermentación en la
elaboración de vinos espumosos. A partir de vinos blancos y rosados
se realizó una segunda fermentación (ver ejemplos 4 y 5).
Ambas levaduras fueron capaces de fermentar en
estas condiciones y los aromas producidos durante este proceso se
detallan en la Tabla 6 y se compararon con una fermentación
control. Cabe destacar que las características observadas
previamente respecto a la BM58 se repiten en estos vinos, en
general altas concentraciones de ésteres etílicos como el caproato
de etilo, caprilato de etilo, succinato de dietilo y caprato de
etilo. En el caso de la BM60 podemos analizar con detalle el perfil
aromático de estos vinos y cabe destacar que los vinos elaborados
con la cepa BM60 al igual que en la BM58 son mayoritariamente
ésteres etílicos como caproato de etilo, caprilato de etilo,
succinato de dietilo y caprato de etilo y acetato de isoamílico.
En el estudio realizado con las levaduras BM58 y
BM60 en la elaboración de vinos blancos, rosados y tintos, a partir
de mostos de uva de diferentes variedades, así como de la
elaboración de vinos espumosos (ver tablas 4, 5 y 6, ejemplos 4 y
5. y figura 3), se pudo concluir que el microorganismo objeto de la
presente invención resulta idóneo para la producción de bebidas
alcohólicas fermentadas, preferentemente vino. Por otro lado, tanto
S. cerevisiae como S. bayanus son especies que
desarrollan la fermentación alcohólica en procesos industriales que
dan lugar a otros tipos de bebidas alcohólicas distintas al vino, a
modo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención en
cerveza y sidra (ver tabla 2).
Figura 1. Análisis mediante RFLP's con el enzima
HaeIII de la región ribosomal ITS-5,8S
amplificada mediante PCR de DNA de colonias aisladas de las cepas
BM60 que corresponde a la especie S. cerevisiae, obteniendo
un patrón de restricción de 325, 230, 170, 125 pb, y de la cepa BM
58 que es S. bayanus var. uvarum al obtener el patrón
de 495, 230, 125 pb.
1: banda de DNA de 325 pb
2: banda de DNA de 230 pb
3: banda de DNA de 170 pb
4: banda de DNA de 125 pb
5: banda de DNA de 495 pb
6: banda de DNA de 230 pb
7: banda de DNA de 125 pb
Figura 2. Patrón molecular correspondiente a las
cepas S. bayanus var. uvarum BM58 y S.
cerevisiae BM60, obtenido mediante restricción del DNA
mitocondrial con HinfI. M, corresponde al marcador de peso
molecular de lambda digerido con el enzima PstI.
A: Banda de DNA típica de BM60 por debajo de
5000 pb
B: banda de DNA típica de BM58 de 5000 pb
Figura 3. Ejemplo de los patrones moleculares
obtenidos mediante restricción del DNA mitocondrial con el enzima
HinfI en cepas de levadura aisladas durante las
fermentaciones en vino rosado (Tempranillo).
A la vista de los resultados de un trabajo
previo del grupo (S. S. González 2006. Tesis doctoral) se procedió
a aislamiento de levaduras de fermentaciones llevadas a cabo a
menos de 22ºC en la bodega Murviedro. Las levaduras aisladas a lo
largo de distintas fermentaciones fueron identificadas por técnicas
moleculares (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Se
aislaron mayoritariamente cepas pertenecientes a S.
cerevisiae, ningún aislado de S. kudriavzevii, y tan
sólo 5 aislados de S. bayanus. Dicha identificación se
realizó según el protocolo descrito por
Fernández-Espinar (2000).
Teniendo en cuenta una serie de criterios de
interés enológico tales como capacidad fermentativa a 12 y 28ºC se
procedió a la selección de la cepa BM58 puesto que era la cepa que
crecía más rápidamente a las 2 temperaturas ensayadas y a las dos
concentraciones de azúcar. Además también se tuvieron en cuenta
otros criterios tales como buena tasa fermentativa; buen rendimiento
de etanol; producción elevada de glicerol y baja de ácido acético.
Del total de 5 cepas aisladas previamente se seleccionó la cepa
BM58 al ser también la que presentó los valores más apropiados para
la fermentación alcohólica cuyos resultados se muestran en la Tabla
1. En dicha Tabla se muestra la concentración de azúcar residual,
glicerol, ácido acético y alcohol de los vinos obtenidos tras
fermentar mosto de la variedad Tempranillo. En dicha tabla se
observa que a 28ºC BM58 fermenta bien aunque se obtiene 2,8 g/L de
azúcar residual y lo más interesante es que la concentración de
glicerol es muy alta, de 22,27 g/L. A 12ºC la levadura fermenta
mejor, obteniendo solo 1,8 g/l de azucares residuales y la
concentración de glicerol es de 12 g/L mientras que el de la cepa
T73 es de 5,65. El resto de parámetros se encuentran dentro de los
rangos normales en vinos.
Al realizar los estudios de implantación de la
cepa BM58 en las bodegas Murviedro, se aisló una cepa denominada
BM60 e identificada como S. cerevisiae dominante en un gran
número de depósitos de la bodega donde se elaboran vinos blancos y
rosados y que se caracterizaban por tener un elevado aroma
afrutado. En la Tabla 1 se muestran la concentración de azúcar
residual, glicerol, ácido acético y alcohol de los vinos obtenidos
tras fermentar mosto de la variedad Tempranillo. Respecto al tiempo
de fermentación la cepa BM60 tarda menos días en fermentar a ambas
temperaturas que la BM58 y la concentración de glicerol también es
alta de 12 g/L y 9,5 a 28ºC y 12ºC respectivamente, siendo en
ambas temperaturas al igual que ocurre con la cepa BM58 superiores
a lo normal en levaduras vínicas (7-9 g/L). El resto
de parámetros se encuentran dentro de los rangos normales en
vinos.
Tabla 1. Analítica de los vinos
obtenidos con las cepas BM58, BM60 y el control T73. Tiempo de
fermentación, azúcares reductores, alcohol, glicerol y ácido acético
producido por las levaduras BM58 y BM60 comparado con la cepa
comercial de S. cerevisiae
(T73).
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Para conocer si la cepa BM58 se adapta bien a
estos estreses se realizó un estudio comparativo creciendo la cepa
BM58, así como otras cepas vínicas usadas como controles
pertenecientes a las especies S. cerevisiae y S.
bayanus (ver tabla 2). Los distintos estreses analizados son
bajos pH (2,8; 3,0; 3,2), temperatura tanto alta como baja (10, 16,
30, 37ºC), osmótico (200, 250, 300 g/l de azúcares), altas
concentraciones de alcohol en el medio (5, 10, 12
y 15%).
y 15%).
Del mismo modo, realizó un estudio similar al
descrito para la cepa BM58 de adaptación a distintos estreses (pH,
osmótico, temperatura y etanol). En la tabla 2 se muestran todos
los resultados obtenidos.
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Tabla 2. Crecimiento de las
cepas BM58 y BM60 a distintos
estreses.
Cepas de S. cerevisiae:
- C1:
- CECT 1942^{T}=CBS 1171^{T}; Origen: Cerveza ale (Holanda)
- C2:
- CECT 11001=NCYC 2340; Origen: Cerveza lager (Bélgica)
- C3:
- Lalvin T73, Lallemand; Origen: Vino (Alicante, España)
- C4:
- Uvaferm CEG, Danstar; Origen: Vino (Eppernay, Francia)
- C5:
- Fermiblanc Arom DSM-Gist Broc.; Origen: Vino (Cognac, Francia)
- C6:
- Fermicru Primeur DSM-Gist Broc.; Vino (Beaujolais, Francia)
- C7:
- UCLM S-377, Springer Oenologie; Origen: Vino, La Mancha, España)
- C8:
- BM-60
\newpage
Cepas de S. bayanus:
- B1:
- CECT 11035^{T}=CBS 380^{T}; Origen: Cerveza
- B2:
- 1991=DSM 70411; Origen: Cerveza
- B3:
- CECT 12627; Origen: Vino (Valladolid, España)
- B4:
- CECT 12629, Origen: Mosto (Zaragoza, España)
- B5:
- CECT 12638; Origen: Mosto (Cádiz, España)
- B6:
- CECT 12669; Uva (La Rioja, España)
- B7:
- BM-58; Vino (Requena, España)
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\newpage
Para determinar si la cepa BM58 estaba presente
de forma mayoritaria en los cultivos obtenidos durante el escalado
y en el pie de cuba, así como el grado de implantación durante las
distintas fermentaciones vínicas, se aplicó la técnica de mtDNA con
HinfI, ya que permite analizar el patrón molecular de cada
una de las cepas aisladas del vino. El análisis de polimorfismos
mediante restricción del DNA mitocondrial ha sido ampliamente
utilizado como método de caracterización de cepas de levadura de
origen vínico (Querol et al., 1992). Esta técnica permite
determinar el perfil molecular de cada cepa de una forma precisa y
muy reproducible. Sin embargo, la obtención de resultados precisa de
mayor tiempo que la técnica de PCR, ya que previamente es necesario
aislar las levaduras del vino utilizando un medio de cultivo
adecuado.
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\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 3. Porcentajes de
implantación de la cepa BM58 en las fermentaciones realizadas en
bodega mediante la aplicación de distintas técnicas moleculares (PCR
de la región ribosomal PCR del gen COX1 y RFLPs del
mtDNA).
\newpage
Una vez realizadas la fermentaciones con la cepa
S. bayanus BM58, interesa conocer la contribución de dicha
cepa en el aroma final del vino. Para ello se cuantificó, mediante
cromatografía de gases, un conjunto de compuestos volátiles que se
forman durante la fermentación: ésteres y alcoholes superiores en
dos vinos donde se implantó la levadura en porcentajes altos, en el
depósito V35 y en el depósito V31-16 (ver Tabla
3).
\newpage
Los resultados obtenidos en el caso de los vinos
fermentados con la cepa S. bayanus BM58, se compararon con
los obtenidos en vinos fermentados con otras cepas comerciales de
levaduras (vino blanco elaborado con la variedad merseguera y con
la cepa 18-2.007, y vino tinto con la variedad
Tempranillo mediante una fermentación espontánea). Las
concentraciones de los distintos compuestos obtenidos en la
elaboración de vinos blancos se muestran en la Tabla 4 y vinos
tintos Tabla 5.
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Tabla 4. Concentraciones de los
compuestos aromáticos presentes en los vinos blancos analizados y
umbral
olfatorio.
Tabla 5. Concentraciones de los
compuestos aromáticos presentes en los vinos tintos analizados y
umbral
olfatorio.
\newpage
Además de comprobar la capacidad a nivel
industrial para elaborar vinos de primera fermentación, también se
han probado para realizar la segunda fermentación en la elaboración
de vinos espumosos. A partir de vinos blancos y rosados se ha
realizado una segunda fermentación en fermentadores adicionando 24
g/l de sacarosa y 1x10^{6} ufc/ml de cada levadura.
Ambas levaduras fueron capaces de fermentar en
estas condiciones y los aromas producidos durante este proceso se
detallan en la Tabla 6 y se comparan con una fermentación
control.
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\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 6. Concentraciones de los
compuestos aromáticos presentes en vinos espumosos analizados y
obtenidos mediante fermentación con las cepas BM58 y BM60, así como
el umbral
olfatorio.
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Claims (12)
1. Microorganismo que puede ser clasificado
taxonómicamente como perteneciente a la cepa BM58 de la especie
Saccharomyces bayanus, depositada en la Colección Española
de Cultivos Tipo (CECT), con el número de depósito CECT 13003.
2. Cepa de Saccharomyces bayanus (BM58)
depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con el
número de depósito CECT 13003.
3. Uso de un microorganismo según la
reivindicación 1, o de la cepa según la reivindicación 2, para
llevar a cabo la fermentación alcohólica.
4. Uso de un microorganismo según la
reivindicación 1, o de la cepa según la reivindicación 2, para
elaboración de bebidas alcohólicas fermentadas.
5. Uso de un microorganismo o de la cepa según
la reivindicación 4, donde las bebidas alcohólicas fermentadas
presentan concentraciones de glicerol superiores a 9 g/L.
6. Uso de un microorganismo o de la cepa según
la reivindicación 5, donde las concentraciones de glicerol son de
hasta 22,27 g/L.
7. Uso de un microorganismo o de la cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde las
bebidas alcohólicas fermentadas presentan un aumento en la
producción de aromas secundarios del grupo de los: acetatos,
ésteres etílicos, ó alcoholes.
8. Uso de un microorganismo o de la cepa según
la reivindicación 7, donde los acetatos se seleccionan del grupo
que comprende: el acetato de etilo, acetato de isoamilo, acetato de
isobutilo, acetato de acetato de hexilo, acetato de bencilo, el
acetato de fenil etanol, o cualquiera de sus combinaciones.
9. Uso de un microorganismo o de la cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde los
ésteres etílicos se seleccionan del grupo que comprende: el caproato
de etilo, caprilato de etilo, succinato de dietilo, lactato de
etilo, caprato de etilo, o cualquiera de sus combinaciones.
10. Uso de un microorganismo o de la cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde los
alcoholes se seleccionan del grupo que comprende: el isobutanol,
alcohol isoamílico, 1-hexanol,
2-feniletanol, o cualquiera de sus
combinaciones.
11. Uso de un microorganismo o de la cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la
bebida alcohólica fermentada es el vino.
12. Uso de un microorganismo según la
reivindicación 11, donde el vino es un vino blanco, un vino rosados
o un vino tinto.
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|---|---|---|---|
| ES200800286A ES2330709B1 (es) | 2008-02-04 | 2008-02-04 | Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la produccion de bebidas alcoholicas/vino. |
| PCT/ES2009/070008 WO2009098342A1 (es) | 2008-02-04 | 2009-01-27 | Microorganismo fermentador productor de altas concentraciones de glicerol y sus aplicaciones en la producción de bebidas alcohólicas/vino |
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| TOSI, E. et al; I lieviti ibridi impiegati in enologia: l'esempio del ceppo industriale S6U, ibrido naturale Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces uvarum, nella produzione di vino amarone della Valpolicella. Rivista Internet di Viticoltura ed Enologia 2005, N.11/2 (en línea) recuperado de internet en <URL: http://www.dalcin.com/ita/news/ita/S6Uvinidea. pdf>. En particular página 3 párrafo 3, figura 1; página 5 figura 3. * |
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