ES2330594T3 - Preparados de enzimas. - Google Patents
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Abstract
Preparados enzimáticos, que pueden obtenerse de tal manera que inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o microorganismos que contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte inerte, se proveen de un recubrimiento de silicona obtenido por hidrosililación.
Description
Preparados de enzimas.
La invención se refiere a preparados de enzimas
de nueva clase para aplicación como biocatalizadores.
Microorganismos y enzimas aisladas encuentran
utilización extendida como catalizador en la industria química o en
la producción de alimentos. Una reseña ofrece por ejemplo: A. Liese,
K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations,
Wiley-VCH: 2000, Weinheim, Alemania.
Para garantizar la utilización económica de
tales biocatalizadores, deben cumplirse varias condiciones: el
biocatalizador tiene que ser activo en las condiciones de reacción
durante un tiempo suficientemente largo, debería separarse
fácilmente una vez terminada la reacción y poder reutilizarse el
mayor número de veces posible. Idealmente, estas condiciones
deberían cumplirse en un campo lo más amplio posible de condiciones
de reacción (p.ej. campo de temperatura, clase de los disolventes
empleados, presiones, etc), a fin de proporcionar un catalizador lo
más universal posible.
A fin de cumplir estas condiciones, es
habitualmente necesario inmovilizar las enzimas o microorganismos
que contienen enzimas empleados.
En muchos casos, las enzimas o los
microorganismos que contienen enzimas se inmovilizan sobre soportes
de modo no covalente, empleándose a menudo como soportes resinas
cambiadoras de iones o partículas de polímeros, que poseen
distribuciones granulométricas apropiadas. Ejemplos de éstos son los
productos comerciales Novozym 435, Lipozym RM IM o Lipozym TL IM de
la firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, o Amano PS, de la
firma Amano, Japón. En estos ejemplos se trata de lipasas
inmovilizadas, que encuentran aplicación extendida, dado que tales
inmovilizados exhiben también actividades técnicamente útiles en
sistemas no acuosos, es decir sistemas que no contienen disolvente
alguno o contienen únicamente disolventes orgánicos, como se
describe p.ej. en J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1989,
934-935. Inconveniente respecto a la utilización de
tales inmovilizados es, sin embargo, por una parte la desorción de
la enzima o de los microorganismos que contienen enzimas que tiene
lugar dependiendo del sistema de reacción empleado, por ejemplo en
el caso del empleo de componentes tensioactivos. La pérdida de
actividad asociada con dicha desorción se muestra en el Ejemplo
Comparativo 1. Adicionalmente, tales preparados exhiben una
estabilidad mecánica insuficiente, por lo cual no es posible el
empleo en reactores simples provistos de agitación o lo es sólo
aceptando una reutilizabilidad claramente limitada. La inestabilidad
mecánica de tales preparados se muestra en el Ejemplo Comparativo
2.
A fin de hacer posible el empleo repetido de
tales preparados enzimáticos, tienen que emplearse por tanto otros
conceptos de reactor. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2003, 105,
601-607 describe por ejemplo el empleo de un
reactor de lecho fijo para la realización de esterificaciones
catalizadas por lipasas. El inconveniente de este proceso es sin
embargo la limitación a mezclas de reacción homogéneas de baja
viscosidad, dado que las mezclas o suspensiones muy viscosas no
pueden ser transportadas a través de un lecho fijo.
K. Faber "Biotransformations in Organic
Chemistry", Springer: 2000, Berlín, Alemania, describe en la
página 384 y siguientes la utilización de enzimas incluidas en
alginatos. Sin embargo, los preparados así obtenidos exhiben una
estabilidad mecánica extraordinariamente pequeña y exhiben sólo una
actividad muy reducida en sistemas no acuosos.
Adicionalmente, se describe la reticulación
transversal ulterior de las enzimas inmovilizadas con sustancias
reactivas como p.ej. dialdehído glutárico. Por otra parte, es un
inconveniente la actividad específica claramente reducida en la
mayor parte de los casos de los preparados reticulados
transversalmente en comparación con la actividad antes de la
modificación. Adicionalmente, este proceso no proporciona aportación
alguna a la mejora de la estabilidad mecánica.
Se describe también en dicho documento la
inmovilización covalente de enzimas sobre soportes reactivos. En
este caso es inconveniente el hecho de que tienen que estar
presentes en la superficie de la enzima grupos funcionales
apropiados que puedan reaccionar con el soporte, produciéndose
adicionalmente con ello en muchos casos una pérdida de actividad
enzimática.
J. Am. Chem. Soc. 1999, 121,
9487-9496 describe la inclusión de enzimas en
matrices de siloxano, denominadas sol-geles. El
inconveniente en las preparaciones sol-gel es la
reducida distribución granulométrica, que dificulta una filtración
eficiente, la insuficiente estabilidad mecánica, la desorción que
tiene lugar, el empleo de sustancias reaccionantes tóxicas
(respecto a la toxicidad de TEOS véase p.ej. Nippon Sanso Giho 1990,
9, 68-72 y Archives of Toxicology 1994, 68,
277-283; para la toxicidad de TMOS véase p.ej.
Fundamental and Applied Toxicology 1989, 13,
285-295; para la producción de
sol-geles no tóxicos son necesarios pasos costosos,
p.ej. almacenamiento durante 6 meses o tratamiento térmico a 350ºC,
como se describe en Polimery w Medycynie 2000, 30,
45-54, así como el comportamiento de hinchamiento
que depende muy acusadamente del disolvente empleado, lo que no
permite una utilización universal en diferentes sistemas de reacción
(acuosos y no acuosos). J. Sol Gel Sci. Technol. 2003, 26,
1183-1187 demuestra por ejemplo la dependencia de
disolvente de la actividad enzimática observada y con ello el
incumplimiento de la exigencia de utilizabilidad amplia.
\newpage
Landbauforschung Völkenrode, 2002, Sonderheft
241, 41-46 describe preparados
sol-gel, en los cuales las enzimas se inmovilizan
primeramente sobre partículas de silicona "finas" y a
continuación se encapsulan en un sol-gel. De este
modo se resuelve parcialmente el problema de la estabilidad
mecánica, pero los experimentos descritos demuestran que se
obtienen actividades suficientes solamente en disolventes
seleccionados, no describiéndose en absoluto la utilización en
sistemas exentos de disolvente. Adicionalmente, las preparaciones se
obtienen en una forma no utilizable directamente, sino que deben
fraccionarse en primer lugar en tamaños ajustados, lo cual es
difícilmente realizable en escala industrial.
J. Mol. Catal. B, 2005, 35,
93-99 describe la inmovilización de enzimas por
inclusión de soluciones enzimáticas acuosas en esferas de silicona
mecánicamente estables, denominadas emulsiones estáticas. Sin
embargo, las actividades específicas obtenidas de los preparados,
con hasta 33 U/g, son evidentemente demasiado pequeñas en
comparación con los inmovilizados sobre soportes inertes descritos
anteriormente, en los que pueden alcanzarse fácilmente actividades
específicas superiores a 1000 U/g (U = unidad o \mumol/min).
WO 03/106607 A1 describe asimismo emulsiones
estáticas de este tipo, pero se describe únicamente la utilización
en sistemas acuosos, al ser la aplicación una formulación de
detergente, es decir que no se trata de una biocatálisis, y las
granulometrías obtenidas son, con aprox. 10 \mum, demasiado
pequeñas para una filtración eficiente de mezclas de reacción
orgánicas.
Persiste por tanto adicionalmente necesidad de
métodos para la inmovilización de enzimas, que resuelvan los
inconvenientes de la técnica actual, para llevar a la práctica
procesos biocatalíticos no realizables hasta ahora.
Objeto de la presente invención ha sido por
tanto la puesta a disposición de preparaciones enzimáticas, que no
presentan uno o varios de los inconvenientes de los preparados de la
técnica anterior. Particularmente, deberían proporcionarse
preparados enzimáticos que exhiban una alta estabilidad frente a los
esfuerzos mecánicos y frente a la desorción y posean con
preferencia en este contexto actividades específicas en mezclas de
reacción diferentes acuosas y no acuosas, que sean suficientemente
altas para hacer posible una aplicación industrial. Con
preferencia, los preparados enzimáticos deberían ser apropiados por
su distribución granulométrica para poder separarse fácilmente del
sistema de reacción y reutilizarse.
Otros objetos no mencionados explícitamente se
deducen del contexto de la descripción que sigue, de los ejemplos y
de las reivindicaciones.
Sorprendentemente, se ha encontrado que estos
objetos son resueltos por preparados enzimáticos, que se obtienen
por inmovilización de enzimas o microorganismos que contienen
enzimas sobre un soporte inerte y revestimiento subsiguiente con un
recubrimiento de silicona obtenido por hidrosililación.
Objeto de la presente invención son por tanto
preparados enzimáticos, que se obtienen de tal manera que
inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o microorganismos que
contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte inerte, se proveen
de un recubrimiento de silicona obtenido por hidrosililación, así
como su utilización como biocatalizador industrial.
Adicionalmente, es objeto de la presente
invención un proceso para la producción de los preparados
enzimáticos correspondientes a la invención, que se caracteriza
porque inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o
microorganismos que contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte
inerte, se proveen de un recubrimiento de silicona obtenido por
hidrosililación.
Los preparados enzimáticos correspondientes a la
invención presentan la ventaja de que exhiben una alta estabilidad
frente a los esfuerzos mecánicos y frente a la desorción. A pesar de
estas propiedades mejoradas, los preparados enzimáticos
correspondientes a la invención exhiben actividades específicas en
diversas mezclas de reacción acuosas (p.ej. en la hidrólisis de
tributirina) o no acuosas (p.ej. en la síntesis de laurato de
propilo exenta de disolvente), que son lo bastante altas para hacer
posible una utilización industrial. Los preparados enzimáticos
correspondientes a la invención presentan adicionalmente la ventaja
de que, por la elección del material soporte y de la distribución
granulométrica inherente a ello, el tamaño de partícula puede
ajustarse de tal manera que se hace posible una separación fácil de
los preparados enzimáticos del sistema de reacción y por
consiguiente también la reutilización de los preparados
enzimáticos.
Los preparados enzimáticos correspondientes a la
invención, así como un proceso para su producción se describen a
continuación a modo de ejemplo, sin que la invención deba
considerarse limitada a estas formas de realización ilustrativas.
En los casos en que se indican a continuación campos, fórmulas
generales o clases de compuestos, éstos no deben abarcar sólo los
campos o grupos de compuestos respectivos que se mencionan
explícitamente, sino también todos los campos parciales y grupos
parciales de compuestos, que se pueden obtener por extracción de
los valores (campos) o compuestos individuales.
Cuando en el marco de la presente invención se
describen compuestos, como p.ej. polisiloxanos organomodificados,
que pueden exhibir repetidamente unidades diferentes, éstas pueden
estar presentes distribuidas estadísticamente (oligómero
estadístico) u ordenadas (oligómero de bloques) en dichos
compuestos. Los datos referidos al número de unidades en tales
compuestos deben entenderse como valor medio, ponderado para todos
los compuestos respectivos.
Así pues, los preparados enzimáticos
correspondientes a la invención se caracterizan porque inmovilizados
enzimáticos que exhiben enzimas o microorganismos que contienen
enzimas inmovilizados sobre un soporte inerte, están provistos de
un recubrimiento de silicona, que se obtiene por
hidrosililación.
Para la producción de los inmovilizados
enzimáticos pueden emplearse células enteras, células en reposo,
enzimas purificadas o extractos de células que contienen las
enzimas respectivas, o mezclas de los mismos. Se emplean con
preferencia enzimas hidrolíticas, p.ej. lipasas, esterasas o
proteasas, como por ejemplo lipasas de Candida rugosa, Candida
antarctica, Pseudomonas sp., Thermomyces langosiosus, páncreas
de cerdo, Mucor miehei, Alcaligines sp., colesterolesterasas
de Candida rugosa, esterasas de hígado de cerdo, de modo
particularmente preferido lipasas. Por consiguiente, los
inmovilizados enzimáticos contienen con preferencia enzimas de la
clase de las hidrolasas, con preferencia lipasas.
Como soporte inerte pueden emplearse soportes
orgánicos o inorgánicos. Con preferencia se emplean o se encuentran
en el inmovilizado enzimático como soporte inerte soportes
particulados de este tipo que exhiben una distribución de tamaños
de partícula en la cual al menos 90% de las partículas tienen un
tamaño de partícula de 10 a 5000 \mum, con preferencia de 50
\mum a 2000 \mum. Como soporte orgánico pueden emplearse
particularmente materiales de esta clase que contienen
poliacrilato, polimetacrilato, polivinilestireno, copolímeros
estireno-divinilbenceno, polipropileno,
polietileno, poli(tereftalato de etileno), PTFE y/u otros
polímeros, o que están constituidos por éstos. Como material
soporte pueden emplearse, dependiendo de la enzima a inmovilizar,
particularmente resinas cambiadoras de iones ácidas o básicas, por
ejemplo Duolite A568, Duolite XAD 761, Duolite XAD 1180, Duolite
XAD 7HP, Amberlite IR 120, Amberlite IR 400, Amberlite CG 50,
Amberlyst 15 (todos ellos productos de la firma Rohm und Haas) o
Lewatit CNP 105 y Lewatit VP OC 1600 (productos de la firma Lanxess,
Leverkusen, Alemania). Como soportes inorgánicos pueden emplearse
soportes de tipo óxido y/o cerámicos conocidos en la técnica. Como
soportes inorgánicos pueden emplearse particularmente por ejemplo
celita, zeolitas, sílice, vidrio de poro controlado (CPG) u otros
soportes, como se describen por ejemplo en L. Cao,
"Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles,
Application and Design", Wiley-VCH: 2005,
Weinheim, Alemania. De modo particularmente preferido, los soportes
inertes inherentes presentes en el inmovilizado enzimático o los
soportes inertes empleados para la producción de los inmovilizados
enzimáticos están constituidos por polivinilestireno,
polimetacrilato o poliacrilato.
La inmovilización en las partículas puede
realizarse de acuerdo con la invención de modo covalente o no
covalente, con preferencia de modo no covalente. Para la
inmovilización no covalente, el soporte puede incubarse o
impregnarse p.ej. con una solución enzimática acuosa, que puede
contener opcionalmente otros ingredientes, como p.ej. sales
inorgánicas o detergentes. Esta incubación/impregnación puede
realizarse p.ej. a temperaturas comprendidas entre 0ºC y 50ºC, de
modo particularmente preferible entre 0ºC y 40ºC. Con preferencia,
la incubación/impregnación tiene lugar en un periodo de varios
minutos hasta varias horas. El avance de la incubación puede
seguirse por determinación de la concentración de enzima en la
solución con el proceso usual para la determinación de proteínas.
Una vez alcanzado el grado de inmovilización deseado, el soporte
puede lavarse con preferencia con agua y, en caso deseado, secarse.
Un inmovilizado enzimático así obtenido puede proveerse a
continuación de acuerdo con la invención de un recubrimiento de
silicona.
De acuerdo con la invención pueden emplearse
también sin embargo inmovilizados enzimáticos que se pueden obtener
en el comercio, por ejemplo Novozym 435, Lipozym RM IM o Lipozym TL
IM, de la firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, o Amano PS, de
la firma Amano, Japón.
El recubrimiento de silicona se obtiene de
acuerdo con la invención por hidrosililación. Para ello se hacen
reaccionar con preferencia polisiloxanos con funcionalidad
Si-H en presencia de catalizadores, con preferencia
catalizadores de metales de transición, con polisiloxanos
organomodificados que tienen al menos un enlace doble
carbono-carbono en posición terminal, con
preferencia al menos dos enlaces dobles de este tipo.
Como polisiloxanos con funcionalidad
Si-H se emplean con preferencia
SiH-polisiloxanos de la fórmula general I,
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 3 a 850, con preferencia 6 a
160,
a = 1 a 800, con preferencia 2 a 150,
b = 0 a 400, con preferencia 2 a 75,
c = 0 a 10, con preferencia 0,
d = 0 a 10, con preferencia 0,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, especialmente metilo;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{3},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general (Ia)
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 3 a 850, con preferencia 6 a
160,
a = 1 a 800, con preferencia 2 a 150,
b = 0 a 400, con preferencia 2 a 75,
c = 0 a 10, con preferencia 0,
d = 0 a 10, con preferencia 0,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, particularmente metilo;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{3},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general Ia o un resto R_{1}.
Con preferencia, se emplea como polisiloxano con
funcionalidad SiH un polisiloxano de la fórmula general (I)
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 6 a 160,
a = 2 a 150,
b = 2 a 75,
c = 0,
d = 0,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, particularmente metilo;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1}.
Es habitual para los expertos, que los
compuestos están presentes o pueden estar presentes en forma de una
mezcla con una distribución regulada esencialmente por leyes
estadísticas. Los valores para los índices a, b, c y d representan
por tanto habitualmente valores medios.
De acuerdo con la invención, como pareja de
reacción olefínica, es decir como polisiloxanos que contienen
enlaces dobles carbono-carbono en posición terminal,
se emplean con preferencia polisiloxanos de la fórmula general
II:
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 3 a 1000, con preferencia 10 a
600,
m = 1 a 800, con preferencia 2 a 600,
n = 0 a 20, con preferencia 0 a 10, más con
preferencia 0,
o = 0 a 10, con preferencia 0,
p = 0 a 10, con preferencia 0,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, particularmente metilo;
- R_{5},
- independientemente unos de otros, un resto alquilo insaturado terminal, con preferencia vinilo, o un resto alcoxilo, con preferencia con 3 a 20 átomos C, o R_{4};
- R_{6},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general IIa
\vskip1.000000\baselineskip
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 3 a 1000, con preferencia 10 a
600,
m = 1 a 800, con preferencia 2 a 600,
n = 0 a 20, con preferencia 0 a 10, con
preferencia 0,
o = 0 a 10, con preferencia 0,
p = 0 a 10, con preferencia 0,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, particularmente metilo;
- R_{5},
- independientemente unos de otros, un resto alquilo insaturado terminal, con preferencia vinilo, o un resto alcoxilo, con preferencia con 3 a 20 átomos C, o R_{4};
- R_{6},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general IIa o restos R_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
Como polisiloxanos que contienen enlace doble
carbono-carbono en posición terminal se utilizan con
preferencia polisiloxanos de la fórmula general II:
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 10 a 600,
m = 2 a 600,
n = 0,
o = 0,
p = 0,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C, con preferencia grupos alquilo con 1 a 4 átomos C o fenilo, particularmente metilo;
- R_{5}
- independientemente unos de otros, un resto alquilo insaturado terminal, con preferencia vinilo, o un resto alcoxilo, con preferencia con 3 a 20 átomos C.
\vskip1.000000\baselineskip
Es habitual para el experto, que los compuestos
de la fórmula II están presentes o pueden estar presentes en forma
de una mezcla con una distribución regulada esencialmente por leyes
estadísticas. Los valores para los índices m, n, o, y p representan
por tanto habitualmente valores medios.
La hidrosililación puede realizarse según
métodos establecidos en presencia de un catalizador. Para ello
pueden utilizarse por ejemplo los catalizadores que se emplean para
hidrosililaciones, como por ejemplo complejos de platino, rodio,
osmio, rutenio, paladio o iridio o compuestos análogos, o los
elementos respectivos puros o sus derivados inmovilizados sobre
sílice, óxido de aluminio o carbón activo o materiales soporte
análogos. Con preferencia, la hidrosililación se realiza en
presencia de catalizadores de platino como cisplatino o el
catalizador de Karstedt
[Tris(diviniltetrametildisiloxano)bis-platino].
Con preferencia, la cantidad empleada de
catalizador es 10^{-7} hasta 10^{-1} mol por mol de olefina o
por mol de enlace doble carbono-carbono en posición
terminal, con preferencia 1 a 100 ppm. La hidrosililación se
realiza con preferencia a temperaturas comprendidas entre 0 y 200ºC,
con preferencia de 0 a 120ºC.
La hidrosililación puede realizarse en presencia
o en ausencia de disolvente. Por regla general no son necesarios
disolventes para la realización de la reacción. Sin embargo, la
reacción puede realizarse en disolventes apropiados, como por
ejemplo hidrocarburos alifáticos o aromáticos, oligosiloxanos
cíclicos, alcoholes o ésteres. Disolventes apropiados son
particularmente ciclohexano o tolueno.
De acuerdo con la invención, se utiliza con
preferencia, referido al peso de soporte empleado, 1 a 500% en
peso, con preferencia 10 a 200% en peso, y de modo particularmente
preferible 20 a 150% en peso de componentes siloxano. Los
componentes siloxano están integrados particularmente por la suma de
los compuestos de la fórmula I y II o de sus productos de
reacción.
La hidrosililación puede realizarse con empleo
de las relaciones más diversas de los compuestos de las fórmulas I
a compuestos de las fórmulas II. Con preferencia, la hidrosililación
se realiza con una relación molar referida a los grupos reactivos
de 1:10 hasta 10:1, con preferencia de 1:5 a 5:1, de modo
particularmente preferible desde 1:1,1 a 1,1:1, y de modo muy
particularmente preferible de 1:1. Por elección de los compuestos
empleados de la fórmula general I y II y modificación de sus
relaciones de mezcla pueden adaptarse las propiedades del
recubrimiento de silicona a la medida en lo que respecta a la
permeabilidad para los sustratos y otras propiedades de reacción.
Por elección de la relación en peso de componentes de silicona a
inmovilizados enzimáticos pueden modificarse los espesores de capa
del recubrimiento de silicona y ajustarse a los requerimientos
respectivos.
El recubrimiento de silicona correspondiente a
la invención, producido por hidrosililación, puede obtenerse
realizando la hidrosililación en presencia del inmovilizado
enzimático. Sin embargo, es posible también obtener los
revestimientos aplicando subsiguientemente sobre los inmovilizados
enzimáticos un siloxano obtenido por hidrosililación. Esto puede
realizarse p.ej. por tratamiento del inmovilizado enzimático con una
solución del siloxano, p.ej. una solución de siloxano en un
disolvente orgánico, particularmente ciclohexano o tolueno. A
continuación puede separarse el disolvente p.ej. por vaporización.
La concentración de siloxano en una solución de este tipo es
preferentemente 10 a 100% en peso, con preferencia 30 a 100% en
peso. Con preferencia, el recubrimiento de silicona correspondiente
a la invención se obtiene sin embargo de tal manera que la
hidrosililación se realiza en presencia del inmovilizado
enzimático.
Los preparados enzimáticos correspondientes a la
invención se producen con preferencia por el proceso correspondiente
a la invención que se describe a continuación. Este proceso para la
producción de preparados enzimáticos se caracteriza porque
inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o microorganismos que
contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte inerte se proveen
de un recubrimiento de silicona obtenido por hidrosililación.
Con preferencia, el proceso correspondiente a la
invención se realiza de tal manera que los inmovilizados
enzimáticos se proveen de un recubrimiento de silicona de tal modo
que los inmovilizados enzimáticos se ponen en contacto en
condiciones de hidrosililación con una mezcla de reacción, que
exhibe polisiloxanos con funcionalidad SiH, polisiloxanos que
contienen enlaces dobles carbono-carbono en posición
terminal y un catalizador que cataliza la hidrosililación. El
proceso puede realizarse particularmente de tal manera que se
realiza una reacción de hidrosililación en presencia de
inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o microorganismos que
contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte inerte. Debido a la
silicona que se forma durante la hidrosililación, el inmovilizado
enzimático puede proveerse de un recubrimiento de silicona.
La hidrosililación puede realizarse de una
manera conocida por los expertos. Con preferencia, la
hidrosililación se realiza con empleo de los parámetros/materias
primas/catalizadores arriba mencionados.
En una forma de realización preferida del
proceso correspondiente a la invención, una cantidad determinada de
inmovilizado enzimático se trata con una mezcla (mezcla de reacción)
de los reactivos de silicona (compuestos de las fórmulas I y II más
catalizador) se trata, por ejemplo por adición de una mezcla que
contiene compuestos de la fórmula general I y de la fórmula general
II y catalizador de Karstedt. Así, puede p.ej. añadirse a 1 g de un
inmovilizado enzimático una mezcla de compuestos de las fórmulas I y
II en la relación molar de 10:1 a 1:10, así como catalizador de
Karstedt, p.ej. 50 ppm referido a la cantidad presente de
componentes de silicona. Con objeto de optimizar las propiedades
del recubrimiento puede ser ventajoso disolver los componentes de
silicona con inclusión del catalizador antes de la adición en un
disolvente, por ejemplo ciclohexano, tolueno o cualquier otro
disolvente orgánico, y añadir luego la solución al inmovilizado
enzimático. Si se emplea por ejemplo ciclohexano como disolvente,
se ha comprobado que es ventajoso, después de la adición de la
solución a los inmovilizados enzimáticos dispersar concienzudamente
esta mezcla durante aprox. 15 a 30 min, p.ej. por medio de un
agitador turbulento (Ika, etapa 9), hasta que se ha evaporado una
mayor parte del ciclohexano.
A continuación, los preparados enzimáticos
obtenidos se secan o se curan en el armario secador a 50ºC por
ejemplo durante 12 horas. Por variación de las relaciones de mezcla
de los compuestos de la fórmula general I y II, pueden modificarse
sin problema alguno las propiedades del recubrimiento de silicona y
ajustarse a los requerimientos respectivos.
Otra forma de realización del proceso
correspondiente a la invención se diferencia de la forma de
realización mencionada anteriormente en que los inmovilizados
enzimáticos a revestir se sumergen en la mezcla de reacción
deseada, se retiran subsiguientemente de la mezcla de reacción y se
secan. La retirada puede realizarse p.ej. con empleo de un tamiz,
que retiene las partículas del inmovilizado enzimático. La duración
de inmersión es preferiblemente de 1 a 10 minutos. El secado puede
realizarse en un armario secador convencional. Preferiblemente, el
secado/curado se realiza a una temperatura de 20ºC a 80ºC,
preferiblemente a 40ºC hasta 60ºC, y de modo particularmente
preferible a aprox. 50ºC.
En otra forma de realización del proceso
correspondiente a la invención, que es particularmente apropiada
para la realización a escala industrial, la hidrosililación se
realiza con empleo de una unidad de "plato de peletización"
(p.ej. de la firmas Erweka o Eirich). Para ello, se pone una
cantidad definida de partículas de inmovilizado enzimático en la
citada unidad de plato, y se agita. A continuación se añade la
mezcla, que contiene los compuestos de las fórmulas I y II,
catalizador y eventualmente disolvente o bien, preferiblemente, con
empleo de una tobera de dos materiales (p.ej. de la firma Schlick u
otras), en la cual se aplica a presión sobre las partículas (p.ej.
con nitrógeno o aire sintético) la mezcla o los componentes en forma
de una niebla fina de gotitas, a fin de garantizar una distribución
lo más homogénea posible. Las partículas se retiran después de un
tiempo de revestimiento prolongado, como se ha descrito arriba y se
secan o se curan durante varias horas a una temperatura de 20ºC
hasta 80ºC, preferiblemente de 40ºC hasta 60ºC, de modo
particularmente preferible a 50ºC en el armario secador, y pueden
almacenarse a continuación a la temperatura ambiente hasta su
utilización ulterior.
En otra forma de realización adicional, las
partículas pueden generarse en un reactor de lecho fluidizado
(p.ej. de la firma Erwerka), en el cual las partículas y la mezcla
de reacción se aplican bajo dispersión intensa en relaciones de
mezcla apropiadas.
Los preparados enzimáticos correspondientes a la
invención pueden emplearse p.ej. como biocatalizadores,
particularmente como biocatalizadores industriales.
La presente invención se ilustra más
detalladamente con ayuda de las imágenes, sin limitarse a ellas. Las
imágenes Fig. 1 y Fig. 2 muestran fotografías de suspensiones
agitadas en un vaso de precipitados de 100 ml con un diámetro del
fondo de 4 cm. Las suspensiones se han producido como se describe en
el Ejemplo 2. De la imagen de Fig. 1 puede deducirse que la
suspensión agitada basada en NZ435 sin tratar está enturbiada por
partículas finas. Por el contrario, la suspensión agitada basada en
NZ435 tratado de acuerdo con la invención es transparente, es decir
que no exhibe partícula alguna o al menos no exhibe partícula alguna
apreciable a simple vista (Fig. 2).
Los ejemplos que siguen deben ilustrar más
detalladamente la presente invención, sin limitar el campo de
protección de la misma, que se deduce de la descripción y las
reivindicaciones de patente.
Novozym 435 (NZ435) es un inmovilizado
enzimático comercial de la firma Novozymes A/S,
Bagsvaerd/Dinamar-
ca, una lipasa B de C. antarctica inmovilizada sobre un polimetacrilato por adsorción.
ca, una lipasa B de C. antarctica inmovilizada sobre un polimetacrilato por adsorción.
La actividad hidrolítica se determinó con el
denominado método de pH estático, en el cual el ácido liberado
durante la hidrólisis se titula contra una base, de tal modo que el
valor de pH de la solución se mantiene constante. Por la
dependencia respecto al tiempo del consumo de base puede
cuantificarse el ácido liberado, y con ello la actividad
enzimática. Realización ilustrativa: se añadieron
10-20 mg de partículas catalíticamente activas a 25
ml de tampón Tris-HCl (1 mM, pH 7,5; contiene
adicionalmente NaCl y CaCl_{2} 0,1 mM) y 500 \mul de
tributirina. La actividad hidrolítica se cuantificó con el
Autotitulador (Tritroline alfa, de la firma Schott) por la cantidad
de la base de titulación (NaOH 50 mM) consumida.
Análogamente a la determinación de la actividad
hidrolítica en el ejemplo de la tributirina, puede utilizarse éster
etílico del ácido valeriánico. Realización ilustrativa: se añadieron
10-20 mg de partículas catalíticamente activas a 25
ml de tampón de fosfato (1 mM, pH 8,0) y 500 \mul de éster etílico
del ácido valeriánico. La actividad hidrolítica se cuantificó con
el Autotitulador (Tritroline alfa, de la firma Schott) por la
cantidad de la base de titulación (NaOH 10 mM) consumida.
Se introdujeron 10 mg de partículas
catalíticamente activas en 5 ml de solución equimolar de sustrato
(ácido láurico y 1-propanol) y se incubaron a 60ºC
con vibración y agitación. Se tomaron muestras (V_{muestra}: 50
\mul) cada 5 min durante 25 min y se añadieron a 950 \mul de
decano (patrón interno: dodecano (sic) 4 mM). La determinación de
las PLUs se realizó con ayuda de las velocidades iniciales de
formación de producto. La detección del laurato de propilo (tiempo
de retención: 9,791 min) se realizó por cromatografía de gases
(Shimadzu 2010, columna BTX de la firma SGE; longitud 25 m, diámetro
interior 0,22 \mum; película: 0,25 \mum; tipo de detector: FID
a 300ºC; temperatura del inyector 275ºC y volumen de inyección 1
\mul, relación de división 35,0; presión del gas portador (helio)
150 kpa; programa de temperatura: temperatura inicial 60ºC
mantenida durante 1,5 min, aumento de temperatura 20ºC/min,
temperatura final 250ºC mantenida durante 2,5 min).
Para la determinación de la actividad de lacasa,
se ponen partículas catalíticamente activas (lacasa nativa o
inmovilizada) en 19 ml de tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH
6, 37ºC) con 1 ml de solución ABTS (solución lista para ser
utilizada, 1,8 mM, que puede obtenerse de
Sigma-Aldrich) y se mide fotoespectrométricamente
el aumento de la extinción a 405 nm. La actividad de lacasa debe
seguirse durante un lapso de tiempo de 20 min. Las muestras se
toman a intervalos de 5 min.
La actividad puede determinarse como sigue:
- \DeltaExt._{405}:
- variación de la extinción en función del tiempo
- V_{total}:
- volumen total en la mezcla de reacción [20 ml]
- V_{muestra}:
- volumen de la muestra [2 ml]
- \Deltat:
- variación del tiempo [min]
- \varepsilon:
- coeficiente de extinción para ABTS a 405 nm [43,2 ml \mumol^{-1} cm^{-1}]
- d:
- espesor de capa de la cubeta [1 cm]
La actividad se expresa en unidades (U/ml o
U/g), definidas como 1 \mumol de conversión de sustrato por
minuto.
La determinación del contenido de proteína en el
sobrenadante se realizó según el método de Bradford (Anal. Chem.
1976, 72, 248-254), que está basado en la fijación
del colorante de triarilmetano Azul Brillante Coomassie
G-250 a los restos de aminoácidos básicos y
aromáticos contenidos en la proteína. Esta fijación provoca un
desplazamiento del máximo de absorción desde 465 nm a 595 nm. Para
la construcción de la curva de calibración se determinaron las
extinciones de BSA en las concentraciones de 5-20
\mug/l. Para ello se completaron las muestras respectivas con
H_{2}O hasta 800 \mul y se añadieron 200 \mul del reactivo de
Bradford (Bio Rad, Munich) y se midieron a 595 nm.
Para la determinación del comportamiento de
lixiviación de las partículas catalíticamente activas en condiciones
de reacción severas se amplió el protocolo en los pasos
siguientes:
La determinación del contenido de proteína de
Novozym 435 (NZ435) se realizó según el esquema siguiente. Las
partículas de NZ435 se incubaron durante 30 min en
acetonitrilo/H_{2}O (1:1, v/v) a 45ºC con vibración y a
continuación se tomaron muestras del sobrenadante (p.ej. 1 ml), se
liofilizaron y se suspendieron de nuevo en agua (asimismo 1 ml). A
continuación pudo determinarse el contenido de proteína como se ha
descrito arriba. Los resultados pueden observarse en la Tabla
1.
Ejemplo comparativo
1
Para la determinación de las estabilidades
mecánicas de las partículas se incubaron éstas en diferentes
soluciones sustrato equimolares de alta viscosidad (por ejemplo
polietilenglicol (peso molecular aprox. 2400) y ácido oleico) con
aportes de potencia altos y a temperaturas > 60ºC y se investigó
a continuación la integridad de las partículas. Con empleo de NZ435
(5% en peso en polietilenglicol (peso molecular aprox. 2400) y ácido
oleico) pudo observarse al cabo de 24 horas a simple vista la
formación de partículas finas, por ejemplo por una turbidez
claramente apreciable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
2
Para la determinación de la estabilidad de
desorción de las partículas en condiciones de reacción severas se
sometieron a vibración fracciones de 50 mg de NZ435 en 20 ml de
solución MeCN/H_{2}O (1:1, v/v) a 45ºC durante 30 min. Se tomaron
muestras definidas del sobrenadante (p.ej. de 1 ml) y se determinó
el contenido de proteína en el sobrenadante como se ha descrito
arriba. Las partículas se recuperaron en un filtro de pliegues, se
lavaron con 100 ml de agua y se secaron durante 12 horas a 50ºC,
para determinar seguidamente según el esquema arriba descrito la
actividad hidrolítica y la actividad de síntesis en PLU. Los
resultados pueden deducirse de la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* En el contexto del test de actividad arriba
descrito ya no era cuantificable actividad alguna.
\vskip1.000000\baselineskip
1 g de partículas de NZ435 se trataron en una
cubeta metálica con 1 ml de mezcla de reacción, constituida por
composiciones diversas de compuestos de las fórmulas generales I y
II (para la composición véase la Tabla 3, los componentes de las
fórmulas generales I y II se produjeron según un proceso habitual
para los expertos, como se describe por ejemplo en US 7.196.163 B2,
por equilibración), y catalizador de Karstedt (Syloff 4000,
producto de Dow Corning, EE.UU.). Los componentes de silicona, con
inclusión del catalizador, se disolvieron en cada caso antes de la
aplicación en 3 ml de ciclohexano y se añadieron luego a las
partículas en la cubeta metálica. Inmediatamente después de la
adición se dispersaron intensamente por medio de un agitador
turbulento (Ika, etapa 9) durante 15-30 min hasta
que se hubo evaporado una mayor parte del ciclohexano. A
continuación se secaron las partículas durante aprox 12 h en el
armario secador a 50ºC.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr \cr}
\newpage
Las partículas producidas según este proceso
exhiben frente al inmovilizado sin tratar rendimientos de actividad
en la hidrólisis de hasta 73% (Ejemplos 1 i y 1 iii, 0,77 U/mg NZ435
en comparación con 1,05 U/mg para NZ435 sin tratar, como se
describe en el Ejemplo Comparativo 1), o 65% (Ejemplo 1 i, 0,68 U/mg
NZ435). En la síntesis pudieron alcanzarse rendimientos de
actividad de 94% (Ejemplo 1 i), 84% (Ejemplo 1 iii) o 68% (Ejemplo 1
ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron enérgicamente en cada caso 300 mg de
partículas (NZ435 nativo sin tratar o NZ435 revestido según iii en
la Tabla 3) durante 90 min en 5 ml de ácido láurico a 60ºC (placa de
agitación magnética de la firma Ika modelo RT, potencia etapa 5,
barra agitadora: longitud 3,1 cm, anchura 0,6 cm). Después de la
retirada del agitador se tomaron fotografías de las suspensiones
agitadas (Fig. 1 y 2).
De la imagen de Fig. 1, puede deducirse
claramente que la suspensión agitada basada en NZ435 sin tratar está
enturbiada por partículas finas. Por el contrario, la suspensión
agitada basada en NZ435 tratado de acuerdo con la invención es
transparente, y no exhibe por tanto partícula alguna o al menos
ninguna partícula de tamaño visible (Fig. 2).
A continuación se separaron las partículas de
las suspensiones por medio de un filtro de pliegues, se lavaron con
aprox. 10 ml de acetona y se secaron durante 12 horas a 50ºC.
Para la determinación de la estabilidad mecánica
de las partículas se realizó una determinación de la distribución
granulométrica. Las porciones de tamizado utilizadas en este caso
tenían los tamaños de exclusión siguientes: 800 \mum, 500 \mum,
300 \mum, 150 \mum y 75 \mum.
Se determinaron por tamizado las distribuciones
granulométricas antes y después de la agitación. Los resultados
pueden deducirse de la Tabla 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Análogamente al Ejemplo Comparativo 2, las
partículas recuperadas del Ejemplo 1 se trataron con
agua/acetonitrilo y se determinaron a continuación la actividad de
hidrólisis, la actividad de síntesis y la cantidad de proteína
liberada. El resultado de esta determinación puede deducirse de la
Tabla 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mientras que el inmovilizado enzimático nativo
sin tratar después de la incubación no exhibe actividad de
hidrólisis alguna y pueden comprobarse 56 \mug/mg de inmovilizado
como proteína libre, las partículas recubiertas de silicona exhiben
actividades de hidrólisis de hasta 75% de la actividad inicial
(muestra ii, 0,51 U/mg de NZ435 frente a 0,77 U/mg de NZ435 antes
de la lixiviación), actividades de síntesis de hasta 55% de la
actividad inicial (muestra iii, 2980 U/g de NZ435 frente a 5400 U/g
de NZ435 antes de la lixiviación), y una desorción de enzima
reducida de hasta 86% (muestra ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó 1 g de Lewatit VPOC1600 (firma Lanxess)
durante aprox. 18 h a la temperatura ambiente en 5 ml de solución
de CALB (Lipozym CALB L, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca,
actividad hidrolítica: 2700 U/ml), se separó en un filtro de
pliegues, se lavó con 250 ml de agua destilada, se secó a
continuación durante 3 horas al aire, se lavó con 1 ml de
isopropanol y se secó una vez más al aire durante 1 hora. Los
inmovilizados así producidos se almacenaron en recipientes de
reacción provistos de tapa a 4ºC hasta su utilización ulterior.
Según el proceso arriba descrito, se midieron
las actividades de los inmovilizados enzimáticos (actividad
hidrolítica de 1,04 U/mg y una actividad de síntesis de 6000 PLU/g).
La densidad de carga se determinó por el test de Bradford,
encontrándose un resultado de aproximadamente 30
\mug_{proteína}/mg_{VPOC1600}.
Los inmovilizados enzimáticos así generados se
revistieron con silicona en un segundo paso según el proceso arriba
descrito (formulación como en el ensayo i de la Tabla 3). La
proporción en peso de inmovilizado enzimático en el preparado
corresponde a 63%. La actividad hidrolítica de los preparados
revestidos es 0,43 U/mg, y la actividad de síntesis 2927 PLU/g.
Análogamente al Ejemplo Comparativo 2, se
trataron con agua/acetonitrilo las partículas sin revestir y las
partículas revestidas con silicona y se determinaron a continuación
la actividad de hidrólisis, la actividad de síntesis y la cantidad
de proteína liberada. El resultado puede deducirse de la Tabla
6.
Como puede deducirse de la Tabla 6, en el caso
del inmovilizado sin tratar se desorbe una cantidad nueve veces
mayor de proteína. Al mismo tiempo, pueden alcanzarse rendimientos
de actividad de 54% (actividad de hidrólisis), o 60% (actividad de
síntesis). La idoneidad ya demostrada con ayuda de NZ435 para los
preparados comerciales acabados del método arriba descrito para el
recubrimiento de inmovilizados enzimáticos con siliconas pudo
comprobarse también por tanto para los inmovilizados enzimáticos
autocargados.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de los preparados enzimáticos de
los Ejemplos 1 y 4, así como de los inmovilizados nativos
correspondientes, se determina por realización de una síntesis de
laurato de propilo en metilciclohexano (concentración inicial de
los sustratos = 10 mM, T = 25ºC).
La Tabla 7 muestra claramente que el rendimiento
de actividad de los preparados enzimáticos en el caso del empleo en
disolvente orgánico es excelente y que la estabilidad de desorción
es también evidente.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogamente al Ejemplo 1, se provee Lipozym RM
IM (Lipasa de M. miehei, inmovilizada en Duolite A568 de la
firma Lanxess, obtenida de Novozymes A/S) con un revestimiento de
siloxano y se determina el rendimiento de actividad análogamente al
Ejemplo 5 en disolvente orgánico.
La Tabla 8 muestra claramente que, referido a la
cantidad empleada de lipozima RM IM se alcanza, dentro del margen
de inexactitud de la medida, un rendimiento de actividad
cuantitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogamente al Ejemplo 4, se inmoviliza una
lipasa de T. lanuginosa (que puede obtenerse como
"esterasa" TL01 de la firma Asa Spezialenzyme, y que se trata
de una lipasa con función esterasa adicional) sobre Lewatit
VPOC1600 y se provee de un revestimiento de siloxano. Para la
determinación de la actividad se determina la hidrólisis del éster
etílico del ácido valeriánico.
La Tabla 9 muestra que el preparado nativo
exhibe una actividad de 261 U/g, mientras que el preparado revestido
muestra una actividad de 157 U/g. Referido al contenido de
inmovilizado nativo, significa que una actividad de 285 U/g, es
decir dentro del margen de error de exactitud, puede alcanzarse un
rendimiento de actividad cuantitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogamente al Ejemplo 7, se inmoviliza una
esterasa de R. oryzeae sobre Lewatit VPOC1600, se reviste y
se determina la actividad en la hidrólisis del éster etílico del
ácido valeriánico.
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También en este caso se aprecia, dentro del
margen de inexactitud de la medida, un rendimiento de actividad
cuantitativo.
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Análogamente al Ejemplo 4, se inmovilizó una
lacasa (EC 1.10.3.2) de Myceliophthora thermophilia (que
puede obtenerse como "Flavorstar" de la firma Novozymes A/S)
sobre Lewatit VPOC1600 (4,5 mg de proteína en 1 g de Lewatit
VPOC1600), se proveyó de un revestimiento de siloxano y se determinó
la actividad en el ensayo ABTS.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (12)
1. Preparados enzimáticos, que pueden obtenerse
de tal manera que inmovilizados enzimáticos que exhiben enzimas o
microorganismos que contienen enzimas inmovilizados sobre un soporte
inerte, se proveen de un recubrimiento de silicona obtenido por
hidrosililación.
2. Preparados enzimáticos según la
reivindicación 1, caracterizados porque las enzimas son de la
clase de las hidrolasas, preferiblemente lipasas.
3. Preparados enzimáticos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2, caracterizados porque los
soportes inertes tienen una distribución granulométrica, en la cual
el 90% de las partículas exhiben un tamaño de partícula de 10 a
5000 \mum.
4. Preparados enzimáticos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque los
soportes inertes empleados están constituidos por
polivinilestireno, polimetacrilato o poliacrilato.
5. Preparados enzimáticos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque el
recubrimiento de silicona se obtiene por hidrosililación de
polisiloxanos con funcionalidad SiH con polisiloxanos que contienen
enlaces dobles carbono-carbono en posición
terminal.
6. Preparados enzimáticos según la
reivindicación 5, caracterizados porque como componente SiH
se emplean polisiloxanos de la fórmula general I
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 3 a 850,
a = 1 a 800,
b = 0 a 400,
c = 0 a 10,
d = 0 a 10,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{3},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general (Ia)
\vskip1.000000\baselineskip
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 3 a 850, con preferencia 6 a
160,
a = 1 a 800,
b = 0 a 400,
c = 0 a 10,
d = 0 a 10,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{3},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general Ia o un resto R_{1}.
7. Preparados enzimáticos según la
reivindicación 6, caracterizados porque, como componente SiH
se emplean polisiloxanos de la fórmula general I
donde
son:
N = a+b+c+d+2 = 6 a 160,
a = 2 a 150,
b = 2 a 75,
c = 0,
d = 0,
- R_{1},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes, seleccionados del grupo que comprende: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C;
- R_{2a},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1};
- R_{2b},
- independientemente unos de otros, hidrógeno o R_{1}.
8. Preparados enzimáticos según al menos una de
las reivindicaciones 5 a 7, caracterizados porque como
polisiloxanos que contienen enlaces dobles
carbono-carbono en posición terminal se emplean
polisiloxanos de la fórmula general II:
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 3 a 1000,
m = 1 a 800,
n = 0 a 20,
o = 0 a 10,
p = 0 a 10,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C,
- R_{5},
- independientemente unos de otros, un resto alquilo insaturado terminal, o resto alcoxilo, o R_{4};
- R_{6},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general IIa:
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 3 a 1000,
m = 1 a 800,
n = 0 a 20,
o = 0 a 10,
p = 0 a 10,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C,
- R_{5},
- independientemente unos de otros, un resto alquilo insaturado terminal, o resto alcoxilo, o R_{4};
- R_{6},
- independientemente unos de otros, restos iguales o diferentes de la fórmula general IIa o restos R_{4}.
9. Preparados enzimáticos según al menos una de
las reivindicaciones 5 a 8, caracterizados porque como
polisiloxanos que contienen enlaces dobles
carbono-carbono en posición terminal se emplean
polisiloxanos de la fórmula general II:
donde
son:
N = m+n+o+p+2 = 10 a 600,
m = 2 a 600,
n = 0 a 10,
o = 0,
p = 0,
- R_{4},
- independientemente unos de otros, iguales o diferentes y son del grupo siguiente: grupos alquilo saturados o insaturados, opcionalmente ramificados con 1 a 30 átomos C, restos alcarilo con 7 a 30 átomos C, restos arilo con 6 a 30 átomos C;
- R_{5}
- independientemente unos de otros, un resto alquilo o resto alcoxilo insaturado terminal.
10. Proceso para la producción de preparados
enzimáticos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado porque inmovilizados enzimáticos, que exhiben
enzimas o microorganismos que contienen enzimas inmovilizados sobre
un soporte inerte, se proveen de un recubrimiento de silicona
obtenido por hidrosililación.
11. Proceso según la reivindicación 10,
caracterizado porque los inmovilizados enzimáticos se proveen
de un recubrimiento de silicona de tal manera que los inmovilizados
enzimáticos se ponen en contacto con una mezcla de reacción que
contiene polisiloxanos con funcionalidad SiH, polisiloxanos que
contienen enlaces dobles carbono-carbono en
posición terminal y un catalizador que cataliza la hidrosililación,
en condiciones de hidrosililación.
12. Utilización de los preparados enzimáticos
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como biocatalizador
industrial.
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