ES2330211T3 - Metodo para modular los receptores cd200. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo agonista que se une de manera específica al CD200Ra de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de alergia o asma.

Description

Métodos para modular los receptores CD200.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para modular la fisiología de un mamífero, incluyendo la función del sistema inmune. En particular, proporciona métodos para modular el metabolismo y actividad de los mastocitos. Se describen usos para diagnóstico y terapéuticos.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune, compuesto por células de la médula ósea, el bazo y células hematopoyéticas, incluyendo, de manera no exclusiva, las células de linaje linfoide y mieloide, es responsable de defender contra las bacterias, virus y organismos multicelulares extraños, así como las células cancerosas. La regulación inadecuada del sistema inmune puede resultar en varios trastornos o condiciones patológicas, por ejemplo, inflamación crónica, enfermedades y trastornos autoinmunes y reacciones alérgicas no deseadas a las partículas extrañas o los tejidos extraños.

Los mastocitos, una célula inmune del linaje mieloide, secretan una variedad de citocinas y enzimas que dan como resultado la inflamación. Puesto que algunas de estas sustancias aparecen en las vesículas secretoras que parecen granulares, el proceso de secreción es algunas veces llamado desgranulación. La rápida desgranulación por los mastocitos, contribuye a la patología del asma, la anafilaxis y otras respuestas alérgicas, mientras que una desgranulación más lenta por los mastocitos contribuye a la artritis y otros tipos de inflamación crónica. La liberación de citocinas y enzimas inflamatorias por los mastocitos, puede dar como resultado el daño del tejido, una atracción adicional de los mastocitos, dando como resultado un daño adicional al tejido.

Las células del sistema inmune poseen muchos tipos de proteínas unidas a la membrana que pueden servir como receptores. Los ligandos para estos receptores pueden ser moléculas pequeñas, proteínas, por ejemplo, citocinas o quimiocinas, o proteínas que se unen a la membrana que residen en una célula separada. Los cambios en la actividad de una célula o tejido, pueden resultar de la ocupación de un receptor por su ligando fisiológico, por un análogo del ligando fisiológico, por un anticuerpo, por agentes que reticulan receptores similares unos con otros, y por agentes que reticulan receptores no idénticos unos con otros.

Los mastocitos contienen varios receptores que retransmiten una señal inhibidora a la célula. Estos incluyen al receptor a CD200 (conocido como CD200Ra; OX2Ra), así como varios receptores que portan a Ig-ITIM, por ejemplo, el receptor Fc\gammaRIIB de IgG de baja afinidad, el receptor de la glucoproteína transmembrana gp49B1, la proteína que regula la señal (SIRP), Ag asociado con la función del mastocito y la molécula 1 de adhesión a las células endoteliales-plaquetas (PECAM-1)/(CD31) (Wong, et al. (2002) J. Immunol. 168:6455-6462). El documento WO 00/70045 proporciona receptores OX2 de mamífero, anticuerpos para tales receptores y usos de los mismos.

El CD200 (conocido como OX2), es una proteína que se une a la membrana ampliamente distribuida que aparece en las células linfoides, neuronales, endoteliales, dendríticas, y en las células B (Wright, et al. (2000) Immunity 13, 233-242; Wright, et al. (2001) Immunology 102:173-179; Hoek, et al. (2000) Science 290:1768-1771; Barclay, et al. (2001) Immunol. 102:173-179; McCaughan, et al. (1987) Immunogenetics 25:329-335). El CD200, el ligando del CD200R, puede unirse al CD200R, el cual se expresa en una célula separada. En los humanos, se han identificado dos subtipos de CD200R, hCD200Ra (SEC ID Nº: 2) y hCD200Rb (SEC ID Nº: 4). Los homólogos murinos del CD200R consisten en cuatro subtipos de receptores, CD200Ra (SEC ID Nº: 6), CD200Rb (SEC ID Nº: 8), CD200Rc (SEC ID Nº: 10) y CD200Rd (SEC ID Nº: 12). El CD200Ra aparece, por ejemplo, en los macrófagos, las células dendríticas y la microglía de la rata (Wright, et al. (2000) anteriormente; Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol.
27:1911-1918.

Se han identificado varias trayectorias reguladoras que involucran las proteínas que se unen a la membrana para varias células inmunes. Sin embargo, las moléculas responsables de la regulación de los mastocitos son entendidas de manera deficiente. La presente invención cumple esta necesidad, proporcionando métodos de diagnóstico y tratamiento de los trastornos de los mastocitos, seleccionando como objetivo las moléculas receptoras de los mastocitos, por ejemplo, los CD200R.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secreción de la \beta-hexosaminidasa frente a la concentración de la señal de desgranulación.

La Figura 2 muestra la liberación de la citocina frente a la concentración de la señal de desgranulación.

Breve descripción de la invención

La invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que la unión de un anticuerpo a un receptor inhibidor, por ejemplo, el CD200Ra, inactiva una célula.

La invención proporciona un método para modular la actividad de una célula, que comprende poner en contacto la célula con una composición de unión, derivada del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6), o a un fragmento antigénico del mismo. También se proporciona el método anterior, en el que la célula es un mastocito; en el que la modulación inhibe la actividad de la célula o estimula la actividad de la célula; en el que la modulación inhibe la actividad de la célula y la composición de unión comprende un agonista del CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6); o en el que la modulación incrementa la actividad de la célula y la composición de unión comprende un antagonista del CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6). En otra realización, la invención proporciona el método anterior, en el que la composición de unión comprende un anticuerpo humanizado; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo policlonal; un fragmento Fab; un fragmento F(ab')_{2}; un péptido mimético de un anticuerpo; o una marca detectable. Aún otro aspecto de la invención es el método anterior, que comprende además, poner en contacto la célula con un agente que mejora de manera específica la expresión del CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6).

También está abarcado un método para tratar a un sujeto que sufre una condición inmune, que comprende tratar con, o administrar la composición de unión derivada del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, que se une de manera específica al CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6), o a un fragmento antigénico del mismo. También se proporciona el método anterior, en el que la composición de unión comprende un agonista o un antagonista del CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6); en el que la condición inmune es una condición inflamatoria o una condición autoinmune. También está contemplado el método anterior, en el que la condición inmune es artritis reumatoide; endotoxemia; psoriasis o alergia; o en el que la condición inmune es una infección o una condición cancerosa. Además, está contemplado el método anterior, en el que la composición de unión se administra junto con un agente que mejora de manera específica la expresión del CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6), o un fragmento antigénico del mismo.

Descripción detallada

Como se utiliza en este documento, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singular de palabras tales como "un, una" y "el, la", incluyen sus referencias en plural correspondientes, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.

I. Definiciones

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula a un ligando o a un receptor, a la actividad catalítica, a la capacidad de estimular la expresión del gen, a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas y similares. La "actividad" de una molécula puede referirse también a la actividad en la modulación o mantenimiento de las interacciones célula a célula, por ejemplo, adhesión, o a la actividad en el mantenimiento de la estructura de una célula, por ejemplo, las membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad", también puede significar una actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunológica]/[mg de proteína] o similares.

"Aminoácidos", se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, incluyendo la selenometionina, así como los aminoácidos que son modificados después de la incorporación a un polipéptido, por ejemplo, hidroxiprolina, O-fosfoserina, O-fosfotirosina, \gamma-carboxiglutamato y cistina. Los análogos de los aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono \alpha que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas peptídicas modificadas, pero mantienen la misma estructura básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de los aminoácidos se refieren a un compuesto químico que tiene una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos pueden referirse en este documento por sus símbolos de tres letras o por sus símbolos de una letra comúnmente conocidos.

"Composición de unión" abarca, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo diseñado, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión derivado de un anticuerpo, un mimético peptídico de un anticuerpo, un reactivo bifuncional o multifuncional. La composición de unión puede comprender además, por ejemplo, un ligador, un oligosacárido o una marca. "Derivado de un anticuerpo" se refiere, por ejemplo, al tratamiento o manipulación de un anticuerpo para producir un fragmento o complejo, por ejemplo, un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, o el uso de ingeniería genética para producir una molécula o complejo que imite características predeterminadas del anticuerpo, por ejemplo, el sitio de unión al antígeno.

"Anticuerpo biespecífico", se refiere generalmente a un complejo covalente, pero puede referirse a un complejo no covalente estable, de fragmentos de unión de dos anticuerpos diferentes, fragmentos de unión humanizados de dos anticuerpos diferentes, o miméticos peptídicos de fragmentos de unión de dos anticuerpos diferentes. Cada fragmento de unión reconoce un objetivo diferente o epítopo, por ejemplo, un receptor diferente, por ejemplo, un receptor inhibidor y un receptor activante. Los anticuerpos biespecíficos exhiben normalmente una unión específica a dos diferentes antígenos.

"Variantes modificadas de manera conservadora", se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias particulares de ácidos nucleicos, una variante modificada de manera conservadora se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Un ejemplo de una sustitución conservadora es el intercambio de un aminoácido en uno de los siguientes grupos por otro aminoácido del mismo grupo (Patente de Estados Unidos Nº 5.767.063, expedida a Lee, et al.; Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132).

(1)

Hidrófobo: Norleucina, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, Met;

(2)

Hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr;

(3)

Ácido: Asp, Glu;

(4)

Básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

Residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6)

Aromático: Trp, Tyr, Phe; y

(7)

Aminoácidos pequeños: Gly, Ala, Ser.

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Los métodos que se relacionan con las moléculas polipeptídicas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el CD200 o el CD200R (SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12), pero que poseen sustituciones, truncamientos o deleciones menores de aminoácidos, que no afectan sustancialmente a los aspectos funcionales, están dentro de la definición de la invención contemplada. Las variantes que contienen una o más escisiones del enlace peptídico, donde los polipéptidos secundarios permanecen en asociación uno con otro, están dentro de la definición de la invención contemplada.

"ITIM" e "ITAM", son dos motivos encontrados en algunos receptores inhibidores y activantes, respectivamente. El motivo ITIM se define por la secuencia consenso I/V/LxYxxL/V en el dominio citoplásmico, donde (Y) puede fosforilarse, dando como resultando la capacidad del polipéptido que porta el motivo ITIM de reclutar varias enzimas, donde las enzimas ayudan a retransmitir una señal inhibidora a la célula (Sathish, et al., (2001) J. Immunol. 166:1763-1770). La secuencia consenso del ITAM es YxxL/Ix_{6-8}YxxL/I, donde (Y) puede fosforilarse, dando como resultado un cambio en las propiedades de señalización del receptor activante o una proteína accesoria. El motivo ITAM puede ocurrir dentro del receptor activante mismo, o dentro de una proteína accesoria que se une al receptor activante, confiriendo por lo tanto, propiedades activadoras al receptor activante.

"Reactivo monofuncional" se refiere, por ejemplo, a un anticuerpo, una composición de unión derivada del sitio de unión de un anticuerpo, un mimético de un anticuerpo, un receptor soluble, derivados diseñados, recombinantes o modificados químicamente de los mismos, que se unen de manera específica a un solo tipo de objetivo. Por ejemplo, un reactivo monofuncional puede contener uno o más sitios de unión que funcionan para un receptor CD200. "Reactivo monofuncional" también se refiere a un polipéptido, anticuerpo, u otro reactivo que contenga uno o más sitios de unión que funcionan para, por ejemplo, el receptor CD200, y uno o más sitios de unión que no funcionan para el receptor Fc. Por ejemplo, un reactivo monofuncional puede comprender un sitio de unión del anticuerpo para el receptor CD200 más un fragmento Fc, que se ha diseñado de manera que el fragmento Fc no se una de manera específica al receptor Fc.

"Reactivo bifuncional" se refiere, por ejemplo, a un anticuerpo, a una composición de unión derivada del sitio de unión de un anticuerpo, un mimético de un anticuerpo, un receptor soluble, derivados diseñados, recombinantes o modificados químicamente de los mismos, que se unen de manera específica a dos objetivos diferentes, por ejemplo, a un receptor CD200 inhibidor y un receptor activante. De manera general, el reactivo bifuncional comprenderá sitios de unión de, por ejemplo, dos anticuerpos diferentes, dos receptores solubles diferentes o un anticuerpo y un receptor soluble.

"Ácido nucleico" se refiere a los desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de una sola hebra o de doble hebra. El término ácido nucleico puede utilizarse de manera indistinta con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido. Una secuencia de ácido nucleico particular también abarca de manera implícita las "variantes alélicas" y las "variantes de corte y empalme".

"Unión específica" de una composición de unión significa que la composición de unión se une a un antígeno específico, por ejemplo, CD200Ra (SEC ID Nº: 2), con una constante de unión, que es de manera ordinaria aproximadamente 2 veces mayor que a otro antígeno, de manera típica aproximadamente 4 veces mayor que a otro antígeno, de manera más típica, al menos aproximadamente 10 veces mayor que a otro antígeno, con frecuencia, al menos aproximadamente 40 veces mayor que a otro antígeno; y de manera aún más frecuente al menos aproximadamente 100 veces mayor que a otro antígeno.

"Ligando" se refiere a moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos y moléculas que se unen a la membrana o asociadas a la membrana que actúan como agonistas o antagonistas de un receptor, así como las versiones solubles de las moléculas que se unen a la membrana o asociadas a la membrana anteriores. Cuando el ligando se une a la membrana en una primera célula, el receptor habitualmente aparece en una segunda célula. La segunda célula puede tener la misma identidad o una diferente que la primera célula. Un ligando o receptor puede ser completamente intracelular, esto es, puede residir en el citosol, el núcleo o algún otro compartimento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su ubicación, por ejemplo, de un compartimento intracelular a la cara externa de la membrana plasmática. El complejo de un ligando y un receptor se denomina un "complejo de ligando-receptor". Cuando un ligando y un receptor están involucrados en una ruta de señalización, el ligando aparece en una posición cadena arriba y el receptor aparece en una posición cadena abajo de la ruta de señalización.

"Anticuerpo humanizado", significa un anticuerpo que comprende una región que se une al antígeno de origen no humano, por ejemplo, de roedor, y al menos una porción de una inmunoglobina de origen humano, por ejemplo, una región de estructura humana, una región constante humana o una porción de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.352.832.

"Condición inmune" significa, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno inflamatorio, o una enfermedad o trastorno autoinmune. "Condición inmune" también se refiere a infecciones y condiciones cancerosas, por ejemplo, estados patológicos, en los que el sistema inmune intenta reducir la infección o reducir la condición cancerosa. "Condición cancerosa" incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y condiciones precancerosas tales como displasia.

"Muestra" se refiere a una muestra de un humano, animal o a una muestra de investigación, por ejemplo, una célula, un tejido, un órgano, un fluido, un gas, un aerosol, una suspensión, un coloide o un material coagulado. La "muestra" puede probarse in vivo, por ejemplo, sin la remoción del humano o el animal, o puede probarse in vitro. La muestra puede probarse después del procesamiento, por ejemplo, mediante métodos histológicos. "Muestra" también se refiere, por ejemplo, a una célula que comprende una muestra de fluido o tejido o a una célula separada de una muestra de un fluido o tejido. "Muestra" también se refiere a una célula, tejido, órgano o fluido que se ha tomado recientemente de un humano o un animal, o a una célula, tejido, órgano o fluido que está procesado o almacenado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico se define como una cantidad de cada componente activo de la formulación farmacéutica, que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, es decir, causar una disminución o una atenuación de los síntomas de la condición siendo tratada. Cuando la formulación farmacéutica comprende un agente de diagnóstico, "una cantidad terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad que es suficiente para producir una señal, imagen u otro parámetro de diagnóstico. Las cantidades efectivas de la formulación farmacéutica variarán de acuerdo con factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, el género y el peso del individuo, y las respuestas idiosincrásicas del individuo. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.888.530.

II. General

La invención proporciona métodos para el tratamiento y diagnóstico de condiciones inmunes, condiciones inflamatorias y trastornos autoinmunes que involucran células que portan al CD200R, por ejemplo, mastocitos, células que presentan el antígeno (APC), células dendríticas, neutrófilos, linfocitos T, monocitos y macrófagos. Las células dendríticas son APC profesionales. Estas condiciones incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, hiperreactividad bronquial, asma, condiciones alérgicas, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple y respuesta patológica innata, por ejemplo, endotoxemia, sepsis y choque séptico. La invención contempla métodos para modular un CD200R utilizando, por ejemplo, un agonista o un antagonista del CD200Ra o el CD200Rb.

La invención contempla el uso de composiciones de unión al CD200Ra, por ejemplo, para inhibir los mastocitos en el tratamiento de condiciones patológicas que dependen de los mastocitos. Los mastocitos están implicados en el inicio y prolongación de la artritis reumatoide (RA) (Lee, et al. (2002) Science 297:1689-1692; Vastag (2002) J. Am. Med. Assoc. 288:1457-1458; Woolley y Tetlow (2000) Arthritis Res. 2:65-74; Olsson, et al. (2001) Ann. Rheum. Dis. 60:187-193). La artritis inducida por colágeno (CIA), es un modelo animal experimental para la RA. La RA y la CIA involucran, por ejemplo, deposición de fibrina, hiperplasia de las células sinoviales, formación periosteal ósea, infiltrados mononucleares, formación de cartílagos articulares y anquilosis de las articulaciones (Luross y Willians (2001) Immunology 103:407-416). Las células inmunes, tales como los linfocitos T y las células B, infiltran las articulaciones e inducen la patología, por ejemplo, inflamación, edema o destrucción del hueso y el cartílago. La RA es, en parte, un trastorno autoinmune, donde la autoinmunidad aparece contra varias proteínas, incluyendo las proteínas estructurales del cartílago (Griffiths y Remmers (2001) Immunol. Revs. 184:172-183). La CIA abarca muchas características comunes a varias enfermedades autoinmunes humanas, por ejemplo, RA, diabetes, esclerosis múltiple, y tiroiditis autoinmune (Griffiths y Remmers, anteriormente).

Los mastocitos también contribuyen a la endotoxemia, la cual puede inducirse por la administración de LPS a ratones y condiciones relacionadas (Tuncel, et al. (2000) Peptides 21:81-89; Muchamuel, et al. (1997) J. Immunol. 158:2898-2903; Howard, et al. (1993) J. Exp. Med. 177:1205-1208). La endotoxemia se correlaciona con la sepsis, el choque séptico, la infección con bacterias Gram negativas y otras bacterias, y con reacciones adversas en la inmunidad innata (Cohen (2000) Intensive Care Med., 26 Supl. 1: S51-56; Freise, et al. (2001) J. Invest. Sur. 14:195-212).

Los mastocitos y las APC se han implicado en la patología de trastornos de la piel, por ejemplo, psoriasis y dermatitis atópica. La psoriasis ocurre en más del 4% de la población de los países Occidentales. La psoriasis, la cual puede amenazar la vida en algunos casos, está caracterizada por recaídas frecuentes. También se ha asociado con una forma de artritis conocida como artritis psoriásica (Ackermann y Harvima (1998) Arch. Dermatol. Res. 290:353-359; Yamamoto, et al. (2000) J. Dermatol. Sci. 24:171-176; Ackerman, et al. (1999) Br. J. Dermatol. 140:624-633; Schopf (2002) Curr. Opin. Invest. Drugs 3:720-724; Granstein (1996) J. Clin. Invest. 98:1695- 1696; Christophers (2001) Clin. Exp. Dermatol. 26:314-320; Greaves y Weinstein (1995) New Engl. J. Med. 332:581-588; Robert y Kupper (1999) New Engl. J. Med. 341:1817-1828; Fearon y Veale (2001 Clin. Exp. Dermatol. 26:333-337; Mrowietz, et al. (2001) Exp. Dermatol. 10:238-245; Ackermann, et al. (1999) Br. J. Dermatol. 140:624-633).

El asma es otro trastorno que involucra los mastocitos, las APC, y otras células inmunes (Black (2002) New Engl. J. Med. 346:1742-1743; Brightling, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1699-1705; Carroll, et al. (2002) Eur. Respir. J. 19:1-7; Xiang y Nilsson (2000) Clin. Exp. Allergy 30:1379-1386; Woodruff y Fahy (2001) J. Am. Med. Assoc. 286:395-398). El asma es un trastorno crónico caracterizado por hiperreactividad bronquial, la cual es una manifestación de trastornos inflamatorios pulmonares, incluyendo el asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (conocida también como EPOC; trastorno pulmonar obstructivo crónico), bronquitis crónica, bronquitis eosinofílica, bronquiolitis y bronquiolitis viral (Riffo-Vasquez y Spina (2002) Pharmacol. Therapeutics 94:185-211). El asma es el resultado de una cascada de eventos inmunes, incluyendo la liberación de IgE. (Véase, por ejemplo, Marone (1998) Immunol. Today 19:5-9; Bames y Lemanske (2001) New Engl. J. Med. 344:350-362).

Los mastocitos contribuyen a la patología de la enfermedad inflamatoria del intestino, por ejemplo, la enfermedad de Crohn y la colitis (Raithel, et al. (2001) Scand. J. Gastroenterol. 36:174-179; Nishida, et al. (2002) Hepatogastroenterol. 49:678-682; Gelbmann, et al. (1999) Gut 45:210-217; Nolte, et al. (1990) Gut 31:791-794; Jeziorska, et al. (2001) J. Pathol. 194:484-492). La IgE activa los mastocitos, dando como resultado la constricción de las vías aéreas y el daño por los eosinófilos de las vías aéreas.

Los mastocitos también contribuyen a la patología de condiciones inflamatorias del sistema nervioso, por ejemplo, esclerosis múltiple (Robbie-Ryan, et al. (2003) J. Immunol. 170:1630-1634; Dines y Powell (1997) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56:627-640). Estas células también juegan un papel en el rechazo a los aloinjertos, por ejemplo, del hígado, riñón y pulmón y enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD), y la glomerulonefritis (O'Keefe, et al. (2002) Liver Transpl. 8:50-57; Lajoie, et al. (1996) Mod. Pathol. 9:1118-1125; Yousem (1997) Hum. Pathol. 28:179-182; Levi-Schaffer y Weg (1997) Clin. Exp. Allergy, 27 Supl. 1:64-70; Hiromura, et al. (1998) Am. J. Kidney Dis. 32:593-599). Los mastocitos también se han implicado en la enfermedad cardiovascular (Hara, et al. (2002) J. Exp. Med. 195:375-381).

Además de los mastocitos, las APC también se han implicado en los mecanismos de trastornos, tales como condiciones de artritis reumatoide, alergias, asma, endotoxemia, choque séptico, y de la piel, por ejemplo, psoriasis (Santiago-Schwarz, et al. (2001) J. Immunol. 167:1758-1768; Lambrecht y Hammad (2003) Curr. Opin. Pulm. Med. 9:34-41; Eigenmann (2002) Pediatr. Allergy Immunol. 13:162-167; Curry, et al. (2003) Arch. Pathol. Lab. Med. 127:178-186; Supajatura, et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:1351-1359; Koga, et al. (2002) Dermatol. 204:100- 103).

La invención también contempla un método para modular un CD200R utilizando, por ejemplo, un antagonista del CD200Ra o un agonista del CD200Rb, en el tratamiento de infecciones o condiciones proliferativas, tales como cáncer y tumores. Los mastocitos, las APC, y otras células del sistema inmune juegan un papel para prevenir o combatir infecciones, por ejemplo, infecciones bacterianas, virales y protozoarias. Véase, por ejemplo, Marshall, et al. (2003) Curr. Pharm. Dis. 9:11-24; Malaviya y Georges (2002) Clin. Rev. Allergy Immunol. 22:189-204; Mekori y Metcalfe (2000) Immunol. Rev. 173:131-140; Galli, et al. (1999) Curr. Opinion Immunol. 11:53-59; Miles y Mamlok (1992) J. Allergy Clin. Immunol. 89:638-639; Sacks y Sher (2002) Nature Immunol. 3:1041-1047; Eigenmann (2002) Pediatr. Allergy Immunol. 13:162-171). Se ha encontrado también que los mastocitos, las APC u otras células del sistema inmune participan en la prevención y el combate de condiciones proliferativas, por ejemplo, cáncer y tumores. Véase, por ejemplo, Reay (2001) Expert Opin. Ther. Targets 5:491-506; Heckelsmiller, et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:3235-3245; Stift, et al. (2003) Int. J. Oncol. 22:651-656; Vermorken y Van Tendeloo (2003) Expert Rev. Anticancer Ther. 3:1-3.

III. Receptores del CD200

El CD200Ra murino (conocido también como muCD200Ra; SEC ID Nº: 6), tiene una cola citoplásmica relativamente larga. De los estudios in vivo, se cree que el muCD200Ra es un receptor inhibidor, aunque carece de una secuencia ITIM clásica. El MuCD200Rb (SEC ID Nº: 8), el muCD200Rc (SEC ID Nº: 10) y el muCD200Rd (SEC ID Nº: 12), tienen colas citoplásmicas cortas, aminoácidos cargados en sus regiones transmembrana y han demostrado aparearse con una molécula adaptadora activante celular, la Dap12 (Lanier y Bakker (2000) Immunol. Today 21:611-614). El CD200Ra humano es homólogo al CD200Ra murino. El CD200Rb humano (SEC ID Nº: 4), es más homólogo al muCD200Rb/d y es también un compañero que se aparea con la Dap12.

IV. Purificación y modificación de los polipéptidos

Los polipéptidos, por ejemplo, antígenos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, para utilizarse en el método contemplado, pueden purificarse mediante métodos que están establecidos en la técnica. La purificación puede involucrar la homogeneización de las células o tejidos, la inmunoprecipitación y la cromatografía. La estabilidad durante la purificación o el almacenamiento puede mejorarse, por ejemplo, mediante agentes antiproteasa, antioxidantes, detergentes iónicos y no iónicos y solventes, tales como glicerol o sulfóxido de dimetilo.

La modificación a las proteínas y los péptidos incluye etiquetas de epítopo, grupos fluorescentes o radioactivos, monosacáridos u oligosacáridos, grupos sulfato o fosfato, amidas C terminales, grupos N acetilados y esterificados, acilación, por ejemplo, ácido graso, enlaces peptídicos intracadena escindidos y productos de la desamidación (Johnson, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:14262-14271; Young, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:37161-37165). La glucosilación depende de la naturaleza del organismo hospedador recombinante empleado o el estado fisiológico (Jefferis (2001) BioPharm 14:19- 27; Mimura, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:45539-45547; Axford (1999) Biochim. Biophys. Acta 1:219-229; Malhotra, et al. (1995) Nature Medicine 1:237-243).

Los derivados de polipéptidos también incluyen la modificación mediante un compañero de una proteína de fusión (Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N. J., págs. 384-391).

V. Composiciones de Unión

Los anticuerpos pueden derivarse de fuentes humanas y no humanas. Pueden utilizarse para la inmunización la proteína intacta, proteína desnaturalizada o un fragmento peptídico de la proteína (Harlow y Lane, anteriormente, págs. 139-243). Las regiones de antigenicidad incrementada pueden utilizarse para la inmunización con un fragmento peptídico. El CD200Ra humano (SEC ID Nº: 2), tiene regiones de antigenicidad incrementada, por ejemplo, en los aminoácidos 43-47, 62-66, 109-114, 165-174, 187-199, 210-214, 239-244, 260-267 y 293-300 de la SEC ID Nº: 2 (Vector NTI® Suite, InforMax, Inc., Bethesda, MD). El CD200Rb humano (SEC ID Nº: 4), es inusualmente antigénico en los aminoácidos 55-75 de la SEC ID Nº: 4. El CD200Ra de ratón (SEC ID Nº: 6) tiene regiones de antigenicidad incrementada en los aminoácidos 25-40 y en los aminoácidos 85-95 de la SEC ID Nº: 6. El CD200Rb de ratón (SEC ID Nº: 8), tiene regiones de antigenicidad incrementada en los aminoácidos 10-22, 85-90 y 105-120 de la SEC ID Nº: 8. El CD200Rc de ratón (SEC ID Nº: 10) tiene regiones de antigenicidad incrementada en los aminoácidos 20-40, 115-130 y 190-220 de la SEC ID Nº: 10. El CD200Rd de ratón tiene regiones de antigenicidad incrementada en los aminoácidos 20-50, 90-120, 155-175 y 180-200 de la SEC ID Nº: 12 (MacVector 6.5®, Accelrys, San Diego, CA). Esta lista de fragmentos y regiones antigénicos no pretende limitar las regiones de los polipéptidos que pueden utilizarse para crear anticuerpos o que pueden unirse por los anticuerpos.

Las composiciones de unión que comprenden un dominio extracelular del CD200, o fragmentos antigénicos del mismo, están contempladas, por ejemplo, en agentes mono y bifuncionales. Se describe el dominio extracelular del CD200 humano, de ratón y de rata (Chen, et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1362:6-10).

Los anticuerpos derivados de fuentes murinas u otras que no son humanas pueden provocar una respuesta inmune, proporcionar un reclutamiento débil de la función efectora o mostrar una rápida eliminación de la corriente sanguínea (Baca, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684). Por estas razones, puede desearse preparar anticuerpos terapéuticos mediante humanización. Un anticuerpo humanizado contiene las secuencias de aminoácidos de seis regiones que determinan la complementaridad (CDR) del anticuerpo original de ratón, que están injertadas en la estructura de un anticuerpo humano. El contenido de la secuencia que no es humana en los anticuerpos humanizados es de manera preferida baja, es decir, aproximadamente 5% (Baca, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684). Para lograr la unión óptima, el anticuerpo humanizado puede necesitar una puesta a punto fina, cambiando ciertos aminoácidos de la estructura, involucrados habitualmente en el soporte de la conformación de las CDR, nuevamente al aminoácido correspondiente encontrado en el anticuerpo original de ratón. Los aminoácidos de la estructura que se cambian generalmente a aquéllos de los originales, son los involucrados en el soporte de la conformación de los bucles de la CDR (Chothia, et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499). Los residuos de la estructura que influencian con más frecuencia la unión al antígeno son relativamente pequeños y pueden ser de tan solo once residuos (Baca, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684).

Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cuando se desea que el anticuerpo humanizado exhiba una actividad citotóxica, el dominio constante es habitualmente un dominio constante que se fija al complemento y la clase es típicamente IgG1. Cuando tal actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo (Patente de Estados Unidos Nº 6.329.511, expedida a Vasquez, et al.).

Una alternativa a la humanización es el uso de bibliotecas de anticuerpos humanos mostradas en bibliotecas de anticuerpos humanos o de fago en ratones transgénicos (Vaughan, et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas, et al. (2001) Phase Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin, et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-
399).

Se proporcionan anticuerpos bifuncionales. Véase, por ejemplo, Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al (1985) Science 229:81; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655; y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.932.448, 5.532.210 y 6.129.914. Se describen anticuerpos y diacuerpos de una sola cadena. Véase, por ejemplo, Malecki, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson y Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; y la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778.

La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden inmunizarse con células que portan el antígeno de interés. A continuación, los esplenocitos pueden aislarse de los animales inmunizados, y los esplenocitos pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma (Meyaard, et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston, et al., anteriormente; Kaithamana, et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

Los anticuerpos terapéuticos pueden conjugarse, por ejemplo, a anticuerpos de moléculas pequeñas de fármacos, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG) o proteína de fusión. Véase, por ejemplo, van Oosterhout, et al. (2001) Int. J. Pharm. 221:175-186; Marsh y Klinman (1990) 144:1046-1051; Kreitman (2001) Curr. Pharm. Biotechnol. 2:313-325; Dinndorf, et al. (2001) J. Immunother. 24:511- 516; Wahl, et al. (2001) Int. J. Cancer 93:540-600; Garber (2000) J. Nat. Cancer Instit. 92:1462-1464; Everts, et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889; Chen, et al. (2001) Int. J. Cancer 94:850-858; Shaik, et al. (2001) J. Control. Release 76:285-295; Park, et al. (2001) J. Control. Release 74:95-113; Solorzano, et al. (1998) J. Appl. Physiol. 84:1119-1130; Rosenberg, et al. (2001) J. Appl. Physio. 91:2213-2223; Bendele, et al. (2000) Arthritis Rheum. 43:2648-2659; Trakas y Tzartos (2001) J. Neurochem. 120:42-49; Chapman, et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:780-783; Gaidamakova, et al. (2001) J. Control. Release 74:341-347; Coiffer, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:235-242.

Los anticuerpos son útiles para propósitos de diagnóstico o de un equipo, e incluyen anticuerpos acoplados, por ejemplo, a tintes, radioisótopos, enzimas o metales, por ejemplo, oro coloidal (Le Doussal, et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini, et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts, et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

VI. Receptores inhibidores y activantes

La invención proporciona métodos para reticular dos receptores diferentes, por ejemplo, un receptor inhibidor y un receptor activante, para modular la actividad celular.

Los ejemplos de receptores inhibidores incluyen, por ejemplo, Fc\gammaRIIB, LAIR, FDF03, KIR, gp49B, ILT25, PIR-B, Ly49, CTLA-4, CD200Ra (SEC ID Nº: 2), CD94/NKG2A, NKG2B-E, PECAM-1, CD5, CD22, CD72, PIRI, SIRP\alpha, HM18, LRC, ILT, KIR, LIR, MIR y MAFA. Véase, por ejemplo, Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875-904; Lanier (1997) Immunity 6:371-378; Sinclair (1999) Scan. J. Immunol. 50:10-13; Pan, et al. (1999) Immunity 11:495-506). Los receptores inhibidores también incluyen Proteína de Superficie 1 DNAX (conocida como DSP-1) (Cantoni, et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:3148-3159.

Los receptores activantes incluyen, por ejemplo, CD3, CD2, CD10, CD161, Dap12, KAR, KARAP, Fc\varepsilonRI, Fc\varepsilonRII, Fc\gammaRIIA, Fc\gammaRIIC, Fc\gammaRIII/CD16, Trem-1, Trem-2, CD28, p44, p46, receptor de células B, LMP2A, STAM, STAM-2, GPVI y CD40. Véase, por ejemplo, Azzoni, et al. (1998) J. Immunol. 161:3493-3500; Kita, et al. (1999) J. Immunol. 162:6901-6911; Merchant, et al. (2000) J. Virol. 74:9115-9124; Pandey, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633-38639; Zheng, et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999-13006; Propst, et al. (2000) J. Immunol. 165:2214-2221.

La invención proporciona métodos para inhibir, por ejemplo, células linfoides, células mieloides y células endoteliales. La inhibición celular se logra, por ejemplo, tratando una célula, tejido, órgano, fluido extracelular, animal, sujeto humano o células o tejidos ex vivo, con un reactivo mono, bi o multifuncional o una composición de
unión.

Se describen los agentes que modulan la expresión de los receptores, por ejemplo, sobre una superficie celular. Véase, por ejemplo, van de Winkel, et al. (1991) J. Leukocyte Biol. 49:511-524; van de Winkel, et al. (1993) Immunol. Today 14:215-221; Heijnen, et al. (1997) Intern. Rev. Immunol. 16:29-55; Fridman y Sautes (1996) Cell-Mediated Effects of Immunoglobins, Chapman and Hall, New York, NY, págs. 39-40). La invención abarca el uso de un agente para incrementar la expresión de un receptor inhibidor, tal como el CD200Ra (SEC ID Nº: 2), con el fin de incrementar la eficiencia de la interacción de una composición de unión específica para el CD200Ra con CD200Ra, por ejemplo, asociada con mastocitos, APC, neutrófilos, células T, células B, basófilos, eosinófilos o células epiteliales. También se contempla el uso de un agente para incrementar la expresión de un receptor activante, tal como CD200Rb (SEC ID Nº: 4). El agente puede comprender, por ejemplo, una citocina tal como el interferón o IL-10, un factor de crecimiento, un reactivo bifuncional, una enzima, o una molécula pequeña tal como la adenosina. El agente puede comprender un factor que promueve la maduración de, por ejemplo, los mastocitos, las células dendríticas u otras APC o neutrófilos, tales como el factor de las células madre, el factor que estimula colonia de granulocito-macrófago, factor de necrosis del tumor, o IL-6 (Hjertson, et al. (1999) Brit. J. Haematol. 104:516-522; Austen y Boyce (2001) Leuk. Res. 25:511-518; Vandenabeele y Wu (1999) Immunol. Cell Biol. 77:411-419; Santiago-Schwarz (1999) J. Leuk. Biol. 66:209-216; Liu, et al. (2001) Nat. Immunol. 2:585-589; Kondo, et al. (2003 Ann. Rev. Immunol.; Dumortier, et al. (2003) Blood 101: 2219-2226).

VII. Selección

Los ensayos que comprenden animales, células o reactivos tales como perlas o pocillos, están contemplados para la selección del CD200, CD200R, y para los agentes que modulan las interacciones entre el CD200 y el CD200R. Véase, por ejemplo, Steinitz (2000) Analyt. Biochem. 232-238; Gast, et al. (1999) Analyt. Biochem. 276:227-241; Kaiser, et al. (2000) Analyt. Biochem. 282:173-185; y las Patentes de Estados Unidos Nº 6.176.962 y 6.517.234.

Las células o los animales pueden diseñarse, por ejemplo, para expresar un CD200R, con el fin de facilitar su uso en la selección. La expresión puede medirse mediante, por ejemplo, técnicas basadas en la hibridación (Ausubel, et al. (2001) Curr. Protocols Mol. Biol., Vol. 4, John Wiley and Sons, New York, NY, págs. 25.0.1-25B.2.20; Ausubel, et al. (2001) Curr. Protocols Mol. Biol., Vol. 3, John Wiley and Sons, New York, NY, págs. 14.0.1-14.14.8; Liu, et al. (2002) Analyt. Biochem. 300:40-45; Huang, et al. (2000) Cancer Res. 60:6868-6874; Wittwer, et al. (1997) Biotechniques 22:130-138; Schmittgen, et al. (2000) Analyt. Biochem. 285:194-204; Heid, et al. (1996) Genome Res. 6:989-994). Los polipéptidos pueden detectarse, por ejemplo, mediante técnicas basadas en anticuerpos. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, anteriormente, págs. 553-612; Sims, et al. (2000) Analyt. Biochem. 281:230-232.

VIII. Composiciones terapéuticas

Las formulaciones de, por ejemplo, composiciones de unión, compuestos de unión o anticuerpos, se preparan mezclando, por ejemplo, el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables, en la forma de una torta liofilizada o soluciones acuosas. Véase, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; y Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La composición terapéutica o farmacéutica de esta invención puede combinarse con o utilizarse en asociación con, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, quimioterapéuticos o quimiopreventivos.

Se describen los portadores, excipientes, amortiguadores, estabilizantes y tensioactivos aceptables. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.342.220; 5.440.021; 6.096.728; y Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

Las composiciones terapéuticas de anticuerpos generalmente se colocan en un recipiente que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración del anticuerpo es, por ejemplo, inyección o infusión por ruta intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional o pulmonar, o mediante sistemas de liberación sostenida. Se describen los sistemas de liberación sostenida. Véase, por ejemplo; Sidman et al. (1983) Biopolymers, 22:547- 556; Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; Patentes de Estados Unidos Nº 6.350.466 y 6.316.024.

Una "cantidad efectiva" de anticuerpo a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, el tipo de anticuerpo empleado, y el estado del paciente. En consecuencia, será necesario que el terapista titule la dosificación y modifique la ruta de administración conforme se requiera, para obtener el efecto terapéutico óptimo. De manera típica, el clínico administrará el anticuerpo hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se verifica fácilmente mediante ensayos convencionales.

En el tratamiento o prevención de, por ejemplo, un trastorno inflamatorio o proliferativo, mediante el método contemplado, la composición de unión se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores para considerarse en este contexto incluyen el trastorno particular siendo tratado, el mamífero particular siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el método de administración, el programa de la administración y otros factores conocidos por los facultativos médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo a ser administrada, estará gobernada por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aminorar o tratar el trastorno proliferativo. Tal cantidad, de manera preferida, está por debajo de la cantidad que es tóxica para el hospedador.

Como una proposición general, la cantidad farmacéuticamente efectiva inicial del anticuerpo administrado por vía parenteral, estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente por día, de manera ordinaria de 0,1 \mug/kg/día a 1,0 mg/kg/día, de manera preferida de 0,1 \mug/kg/día a 0,1 mg/kg/día, de manera más preferida de 0,1 \mug/kg/día a 0,01 mg/kg/día, y de manera mucho más preferida de 0,1 \mug/kg/día o menos. La dosificación deseada puede suministrarse por una sola administración en embolada, por múltiples administraciones en embolada o por una administración por infusión continua del anticuerpo, dependiendo del patrón de la farmacocinética que el facultativo desea alcanzar. Como se indicó anteriormente, sin embargo, estas cantidades sugeridas de anticuerpo, están sometidas a una buena cantidad de criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis y programa apropiados, es el resultado obtenido.

IX. Terapéuticos secundarios

La invención contempla el uso de combinaciones de un agonista o antagonista del CD200R con un segundo agente, por ejemplo, un agente antiinflamatorio, inmunosupresor o antineoplásico. Los agentes antiinflamatorios incluyen, por ejemplo, esteroides y antiinflamatorios no esteroideos (Patente de Estados Unidos Nº 6.294.170, expedida a Boone, et al.; Patente de Estados Unidos Nº 6.096.728, expedida a Collins, et al.; Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY). Los agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, azotioprina, mercaptopurina y metotrexato. Los agentes antineoplásicos incluyen, por ejemplo, 5-fluorouracilo, metotrexato, cis-platina y doxorrubicina (Patente de Estados Unidos Nº 6.066.668, expedida a Hausheer, et al.).

X. Equipos

El método contemplado está adaptado para utilizarse en equipos, es decir, para propósitos de selección o diagnóstico. El equipo puede adaptarse para utilizarse en la detección o cuantificación de una composición de unión al CD200R, por ejemplo, en una composición farmacéutica o en una muestra biológica. El equipo contemplado está adaptado para utilizarse con, por ejemplo, mastocitos de un sujeto o paciente. De manera típica, el equipo tendrá un compartimento, un reactivo o direcciones para el uso o desecho, o cualquier combinación de los mismos. Los equipos adaptados para los ensayos de unión se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.306.608; 6.150.122; 6.083.760; y 5.863.739.

XI. Usos

La presente invención contempla métodos para utilizar una composición de unión específica para el CD200R para modular los trastornos asociados con la función inadecuada de células del sistema inmune, por ejemplo, mastocitos, APC, tales como células dendríticas, células T, neutrófilos, monocitos o macrófagos. La composición de unión puede comprender un agonista o antagonista de un CD200R. Los agonistas de un receptor inhibidor, por ejemplo, el CD200Ra (SEC ID Nº: 2 ó 6), serán útiles para inhibir la actividad de los mastocitos, las APC, tales como las células dendríticas, las células T, los neutrófilos, los monocitos o los macrófagos. Los antagonistas de un receptor activante, por ejemplo, el CD200Rb (SEC ID Nº: 4, 6, 10 ó 12), serán también útiles para inhibir la actividad de, por ejemplo, los mastocitos, las APC, tales como células dendríticas, células T, neutrófilos, monocitos o macrófagos. Los antagonistas del CD200Ra y los agonistas del CD200Rb serán útiles para estimular, por ejemplo, los mastocitos y las APC, tales como las células dendríticas, células T, neutrófilos, monocitos o macrófagos, para el tratamiento de infecciones y condiciones proliferativas.

Los métodos de la presente invención contemplan el uso de, por ejemplo, péptidos, moléculas pequeñas, anticuerpos y composiciones de unión derivadas del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, para tratar o diagnosticar una variedad de trastornos inmunes, por ejemplo, hiperreactividad bronquial, rinitis alérgica, asma, bronquitis y anafilaxis. Véase, por ejemplo, Woodruff y Fahy, anteriormente; Plaut (2001) J. Am. Med. Assoc. 286:3005-3006; y Marshall y Bienenstock (1994) Curr. Op. Immunol. 6:853-859; Luskin y Luskin (1996) Am. J. Ther. 3:515-520.

Los métodos de la presente invención también pueden utilizarse para tratar o diagnosticar la artritis reumatoide, y los trastornos de la piel, incluyendo la psoriasis y la dermatitis atópica. Véase, por ejemplo, Mican y Metcalfe (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 86:677-683; Malone, et al. (1987) Arthritis Rheum. 30:130-137; Malfait, et al. (1999) J. Immunol. 162:6278-6280; Ackermann y Harvima (1998) Arch. Dermatol. Res. 290:353-359; Ackermann, et al. (1999) Brit. J. Dermatol. 140:624-633; Askenase, et al. (1983) J. Immunol. 131:2687-2694. El método también contempla el tratamiento o diagnóstico de enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y el síndrome del intestino irritable. Véase, por ejemplo, Malaviya, et al. (1995) Am. J. Ther. 2:787-792; Jeziorska, et al. (2001) J. Pathol. 194:484-492; Sullivan, et al (2000) Neurogastroenterol. Motility 12:449; Nolte, et al. (1990) Gut 31:791-794; Raithel, et al. (2001) Scand. J. Gastroenterol. 36:174-179. El método también está contemplado para utilizarse en el tratamiento de la enfermedad crónica del hígado e insuficiencia cardiaca congestiva (O'Keefe, et al. (2002) Liver Transpl. 8:50-57; Hara, et al. (2002) J. Exp. Med. 195:375-381).

La invención también abarca métodos de tratamiento o diagnóstico de la desmielinación o neurodegeneración, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y epilepsia (Purcell y Atterwill (1995) Neurochem. Res. 20:521-532; Secor, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:813-822; Dines y Powell (1997) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56:627-640; Purcell y Atterwill (1995) Neurochem. Res. 20:521-532; Dietsch y Hinrichs (1989) J. Immunol. 142:1476-1481).

Además, la invención abarca un método para tratar o diagnosticar el síndrome de Sjogren, el rechazo a transplantes e injertos, la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), mastocitosis y métodos para prevenir la angiogénesis (Pedersen y Nauntofte (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2:1415-1436; Konttinen, et al. (2000) Rheumatol. Int. 19:141-147; Moutsopoulos y Youinou (1991) Curr. Opin. Rheumatol. 3:815-822, Gorczynski, et al. (2000) Clin. Immunol. 95:182-189; Koskinen, et al. (2001) Transplantation 71:174-1747; O'Keefe, et al. (2002) Liver Transpl. 8:50-57; Lajoie, et al. (1996) Mod. Pathol. 9:1118-1125; Pardo, et al. (2000) Virchows Arch. 437:167-172; Yousem (1997) Hum. Pathol. 28:179-182; y Levi-Schaffer y Wej (1997) Clin. Exp. Allergy 27 Supl. 1:64-70; Tomita, et al. (2000) Ann. Thorac. Surg. 69:1686-1690; Brockow y Metcalfe (2001) Curr. Opin. Allergy Clin Immunol. 1:449-454; Hiromatsu y Toda (2003) Microsc. Res. Tech. 60:64-69).

Aún otro aspecto de la invención proporciona métodos para modular la actividad de un CD200R, por ejemplo, la SEC ID Nº: 2, para el tratamiento o prevención de la enfermedad cardiovascular, por ejemplo, aterosclerosis. Las células inmunes, por ejemplo, los mastocitos, las células dendríticas, los neutrófilos, los monocitos y los macrófagos, contribuyen a la patología de la aterosclerosis. Véase, por ejemplo, Huang, et al. (2002) Cardiovasc. Res. 55:150-160; Kelley, et al. (2000) Mol. Med. Today 6:304-308; Aicher, et al. (2003) Circulation 107:604-611; Ozmen, et al. (2002) Histol. Histopathol. 17:223-237; Wanders, et al. (1994) Transpl. Int. 7 Supl. 1:S371-S375.

También están abarcados los métodos para proporcionar un antagonista del CD200Ra (SEC ID Nº: 2) o un agonista del CD200Rb (SEC ID Nº: 4), para estimular la actividad celular, por ejemplo, para combatir infecciones bacterianas, infecciones virales, infecciones persistentes, infecciones por organismos multicelulares extraños, condiciones y tumores cancerosos y para promover la curación de las heridas.

El amplio alcance de esta invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden limitar la invención a las realizaciones específicas.

Ejemplos I. Métodos Generales

Se describen métodos para el diagnóstico y el tratamiento de condiciones inflamatorias en animales y en humanos. Véase, por ejemplo, Ackerman (1997) Histological Diagnosis of Inflammatory Skin Disease, 2a ed., Lippincott, Williams y Wilkins, New York, NY; Gallin, et al. (1999) Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, 3a ed., Lippincott, Williams y Wilkins, New York, NY; Geppetti y Holzer (1996) Neurogenic Inflammation, CRC Press, Boca Raton, FL; Nelson, et al. (2000) Cytokines in Pulmonary Disease: Infection and Inflammation, Marcel Dekker, Inc., New York, NY; O'Byrne (1990) Asthma as an Inflammatory Disease, Marcel Dekker, Inc., New York, NY., Parnham, et al. (1991) Drugs in Inflammation (Agents and Actions Supl. Vol. 32), Springer Verlag, Inc., New York, NY; Benezra (1999) Ocular Inflammation: Basic and Clinical Concepts, Blackwell Science, Ltd., Oxford, RU.

Se describen métodos estándar en biología molecular (Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Los métodos estándar también aparecen en Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que describen la clonación en células bacterianas y mutagénesis del ADN (Vol. 1), clonación en células de mamífero y levadura (Vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteína (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4).

Se describen métodos para la purificación de la proteína, incluyendo inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science. Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Se describen análisis químicos, modificación química, modificación postraducción y glucosilación de proteínas (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science. Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York). Se describen la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, anteriormente).

Están disponibles técnicas estándar para caracterizar las interacciones ligando/receptor. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology. Vol. 4, John Wiley and Sons, Inc., New York.

Se describen técnicas estándar en el cultivo de células y tejidos. Véase, por ejemplo, Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a ed., Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Masters (ed.) (2000) Animal Cell Culture: A Practical Approach, 3a ed., Oxford Univ. Press, Oxford, RU; Doyle, et al. (eds.) (1994) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley and Sons, NY; Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

Están disponibles modelos animales para la artritis, esclerosis múltiple, psoriasis e inflamación inducida por lipopolisacárido (LPS). Véase, por ejemplo, Luross y Williams (2001) Immunology 103: 407-416; Griffiths y Remmers (2001) Immunol. Rev. 184:172-183; Beurler (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:20-26; Campbell, et al. (1998) J. Immunol. 161:3639-3644; Tompkins, et al. (2002) J. Immunol. 168:4173-4183; Hong, et al. (1999) J. Immunol. 162:7480-7491.

Están disponibles paquetes de programas para determinar, por ejemplo, los fragmentos antigénicos, las secuencias señal y líder, el plegamiento de la proteína y los dominios funcionales. Véase, por ejemplo, Vector NTI® Suite (Informax, Inc., Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA), y DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16:741-742. También se utilizaron bases de datos públicas de las secuencias, por ejemplo, de GenBank y otros.

II. Preparación de los mastocitos

Los cultivos de los mastocitos murinos se establecieron de ratones C57BL/6 de 2-3 semanas de edad. La médula ósea se lavó abundantemente de los fémures de 2-3 ratones, y posteriormente se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se resuspendieron en 15 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (MEM), suplementado con piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol, ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N'-2-etanosulfónico (HEPES), glutamina, suero de ternero fetal al 10-15% (Hyclone, Inc., Logan, UT), 100 ng/mg de rSCF, y 100 ng/ml de rIL-3. Las células se incubaron en matraces T25 a 37ºC. A intervalos semanales, las células no adherentes se realimentaron con medio fresco y se transfirieron a un nuevo matraz. A las dos semanas, el medio de cultivo se suplementó con 5,0 ng/ml de IL-4. A las cuatro semanas, se espera que la mayoría de las células no adherentes sean mastocitos murinos típicos que expresen FcR de IgE. De las cuatro semanas en adelante, las células se mantuvieron con suplementos de únicamente rIL-3 y rIL-4.

III. Distribución del CD200R

El ARN total de aisló de una variedad de tipos celulares y tejidos utilizando el equipo de aislamiento del ARN RNAEASY® (Qiagen, Inc., Valencia, CA). El ARN se transcribió de manera inversa utilizando cebadores oligo dT y transcriptasa inversa Multiscribe® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). El ADNc se analizó para la expresión de los receptores CD200 y la ubiquitina mediante ensayos de PCR Taqman®, utilizando un sistema de detección de la secuencia ABI Prism 5700® de Perkin Elmer (Perkin Elmer, Inc., Wellesley, MA). La cuantificación de la expresión del gen objetivo se calculó normalizando los valores con relación a la expresión de la ubiquitina.

Los resultados del análisis Taqman® se presentan en la Tabla 1. La expresión más alta se representa por (+++), la expresión moderada es (++) o (+), mientras que los niveles de expresión limite a no detectables es (-). ND significa no determinado.

TABLA 1

1

2

3

IV. Asociación del CD200R con Dap12

Para verificar la asociación de los receptores CD200 con la Dap12, los receptores CD200 se introdujeron mediante vectores retrovirales en líneas celulares Baf que se habían transfectado previamente con una de las siguientes moléculas marcadas con FLAG: Dap12, Dap10, Fc\varepsilonR\gamma o CD3-\zeta. Las moléculas marcadas con FLAG se expresan únicamente en la superficie celular cuando se asocian de manera estable con la molécula apropiada compañera del apareamiento. Cuando el CD200Rc murino (SEC ID Nº: 10) o el CD200Rd murino (SEC ID Nº: 12), se introdujo en estos transfectantes, únicamente se rescató la DAP12 marcada con FLAG, indicando que estos receptores CD200 se aparean de manera específica con la Dap12.

V. Anticuerpos agonistas del CD200R

Las moléculas de CD200R marcadas con el epítopo se introdujeron de manera estable en los mastocitos normales de ratón. A continuación, estos CD200R se acoplaron directamente con anticuerpos monoclonales específicos para varias marcas del epítopo. La desgranulación de los mastocitos, la secreción de citocina y la proliferación, se verificaron con y sin la reticulación posterior de los anticuerpos antimarca. La activación del CD200Ra no tuvo efectos en los mastocitos restantes, sin embargo, la activación de los receptores del CD200 que se aparean con la Dap12, es decir, los CD200R activantes, causó una desgranulación de los mastocitos, secreción de citocina y proliferación dependiente del sistema autocrino significativas.

Los CD200Ra marcados con epítopo se introdujeron de manera estable en los mastocitos normales. El CD200Ra (SEC ID Nº: 6) que comprende además una marca del epítopo se acopló por una proteína de fusión CD200 Ig por anticuerpos monoclonales contra las marcas del epítopo, mientras que activan simultáneamente el Fc\varepsilonRI con los anticuerpos IgE. Los mastocitos se verificaron a continuación para las respuestas a la desgranulación, la secreción de citocina y proliferativas. En algunos experimentos, el CD200Ra y el Fc\varepsilonRI se coligaron mediante un anticuerpo secundario. Los resultados demostraron que el CD200Ra es un receptor inhibidor capaz de inhibir las respuestas dependientes de Fc\varepsilonRI en los mastocitos.

En estudios relacionados, los anticuerpos monoclonales específicos para el CD200Ra murino (SEC ID Nº: 6), se utilizaron en lugar de los anticuerpos antimarca. En estos estudios con mastocitos murinos, los resultados demostraron nuevamente que el CD200Ra es un receptor inhibidor.

Se probaron los anticuerpos monoclonales específicos para el CD200Ra humano para la actividad agonista utilizando mastocitos activados. Se encontró que los anticuerpos anti-huCD200Ra, es decir, DX136 (rIgG2a) y DX139 (rIgM), son agonistas del CD200Ra, como se mide valorando los cambios en la desgranulación y secreción, utilizando mastocitos murinos que expresan al CD200Ra humano. La actividad agonista se expresa por la CI50.

Las proteínas de fusión, que comprenden dos dominios extracelulares del CD200 fusionados a una región Fc, también se probaron para la actividad agonista (huCD200-Ig; muCD200-Ig). Estas proteínas de fusión contenían una mutación (D265A en las regiones constantes del Fc utilizado para crear tanto al huCD200-Ig como al muCD200-Ig), para evitar la unión al receptor Fc (FcR) y al complemento (Idusogie, et al. (2000) J. Immunol. 164:4178-4184). Estas proteínas de fusión también suministraron una señal que inhibió la desgranulación y la secreción de citocina de los mastocitos.

El análisis FACS de las células sanguíneas, reveló los tipos de leucocitos que expresan CD200R, donde las células se marcaron por el anticuerpo indicado (Tabla 2). La internalización del receptor se midió mediante microscopia confocal (Liu, et al. (1998) Cancer Res. 58:4055-4060; Lee, et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 292:1048-1052) (Tabla 2). ND significa no determinado. Inmunohistoquímica (IHC), se refiere a la capacidad del mAb indicado para teñir las células en el tejido congelado, fijado con acetona, de humano o de ratón, o tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina de humano o de ratón.

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4

5

Los mastocitos de ratón que expresan la molécula de CD200Ra humana, se estimularon con 25 \mug/ml de anticuerpo monoclonal para activar el receptor activante enlazado a la Dap12 del CD200Rd de ratón, seguido por la medición de la \beta-hexosaminidasa secretada a 1,0 horas (Tabla 2). La actividad agonista del anticuerpo anti-CD200Ra o la proteína de fusión CD200-Ig se valoró agregando anticuerpo anti-CD200Ra o proteína de fusión CD200-Ig a las mezclas de incubación de las células, y determinando la inhibición de la secreción. Las incubaciones se realizaron con anticuerpos o con proteína de fusión CD200-Ig a concentraciones de 0, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, y 9,0 \mug/ml. Las incubaciones de las células control se realizaron con el mAb de control del isotipo de rata.

Los resultados demostraron que el tratamiento con cada uno de los anticuerpos anti-CD200R y con la proteína de fusión CD200-Ig, inhibió la desgranulación de los mastocitos. Los anticuerpos del isotipo de control no influenciaron de manera detectable la secreción. Sin embargo, cada uno de los compuestos probados se inhibieron con diferentes eficiencias, como se determina por la CI50 (Tabla 2). Además de tener un mejor efecto agonista, el efecto de los anticuerpos también fue de mayor duración que el de la proteína de fusión de Ig.

Los mastocitos de ratón se estimularon con IgE anti-TNP con antígeno (TNP-hemocianina de lapa californiana; KLH), seguido por el ensayo de la \beta-hexosaminidasa liberada (desgranulación; Abs_{405-650}) y citocina (secreción) (Figuras 1-2). La señal de la desgranulación, IgE anti-TNP, se utilizó a las concentraciones indicadas. El anticuerpo anti-CD200R monoclonal DX109 (mAb) y el mAb de IgG1 de rata de control, se probaron por su efecto para inhibir la actividad de los mastocitos. El mAb de DX109 o el mAb de IgG1 de rata, se agregaron a una concentración constante de 13 nM. Las citocinas ensayadas fueron la IL-13 y el factor de necrosis del tumor (TNF) (Figuras 1-2). Se estudió la desgranulación, valorada por la liberación de hexosaminidasa, (Figura 1). Los incrementos en la concentración estimulante se siguieron por incrementos en la liberación de hexosaminidasa, donde se agregó IgG1 de rata de control (curva superior, cuadrados cerrados, Figura 1), mientras que las incubaciones que contienen mAb de DX109 agregado, tuvieron niveles relativamente bajos de liberación de hexosaminidasa, excepto al nivel más alto de estimulante (curva inferior, triángulos cerrados, Figura 1). Una concentración estimulante que se incrementa, dio como resultado incrementos en la secreción de IL-13 (círculos cerrados, Figura 2) y el TNF (cuadrados cerrados, Figura 2), donde la secreción de ambas citocinas se inhibió por el anticuerpo monoclonal DX109. Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CD200R es efectivo para inhibir la desgranulación y la secreción de citocina.

VI. Reticulación de un receptor inhibidor con un receptor activante

La desgranulación y la secreción por los mastocitos humanos se midió mediante un protocolo que involucra la adición de un anticuerpo receptor anti-IgE, el cual se une al receptor de IgE, la adición de un anticuerpo anti-CD200R, el cual se une al CD200Ra (SEC ID Nº: 2), y la adición de F(ab')_{2} antirratón de cabra, el cual se une simultáneamente con el anticuerpo anti-IgE (que se adhiere al receptor de IgE) y a un anticuerpo anti-CD200R (que se adhiere a CD200R). Los experimentos de control involucraron variaciones de este protocolo.

Las células sanguíneas de la médula completa se cultivaron en medio de Yssels suplementado con factor de células madre (SCF) e IL-6 durante 4-6 semanas para producir mastocitos humanos. Se agregaron IL-4 e IgE al cultivo durante 2 semanas adicionales. A continuación, las células se cultivaron en placas a 10^{6} células/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos. Se agregó a continuación un anticuerpo inhibidor (anticuerpo anti-CD200Ra) o un anticuerpo de control (Ig de ratón). Después de 20 minutos de incubación, se agregó el anticuerpo del receptor anti-IgE a una concentración de 20 ng/ml. Después de 20 minutos de incubación adicional, los pocillos se lavaron y se agregó el reticulador (anticuerpo antirratón de cabra). La mezcla se incubó durante 1 hora, y el sobrenadante se extrajo y se utilizó para los ensayos de desgranulación, como se valora mediante la liberación de triptasa. Los ensayos de triptasa se realizaron con el sustrato de clorhidrato de N-alfa-bencil-DL-arginin p-nitroanilida (BAPNA) con medición del color a 405-570 nm.

La desgranulación (liberación de triptasa) fue máxima con la adición del anticuerpo del receptor anti-IgE y el anticuerpo de control (Ig de ratón). La máxima liberación de triptasa en estas condiciones, resultó en Abs._{405-570} = 0,44-0,51. En las incubaciones con anticuerpo anti-CD200Ra, se utilizaron niveles de titulación del anticuerpo anti-CD200Ra (0-1000 ng/ml de anticuerpo anti-CD200Ra). Se utilizaron diferentes niveles de anticuerpo en mezclas de incubación separadas. El anticuerpo anti-CD200Ra a niveles que se incrementan, dio como resultado la inhibición progresiva de la liberación de la triptasa, donde la inhibición máxima (Abs._{405-570} = 0.05), ocurrió con aproximadamente 1000 ng/ml de anticuerpo anti-CD200Ra. Los niveles intermedios de anticuerpo anti-CD200Ra (200 ng/ml), inhibieron la liberación de la triptasa a aproximadamente 25% del nivel máximo de liberación de la triptasa. Los resultados demuestran que la reticulación de CD200Ra con el receptor de IgE evita la desgranulación dependiente del receptor de IgE en los mastocitos humanos.

La reticulación de varios receptores inhibidores, diferentes al CD200Ra (SEC ID Nº: 2), con Fc\varepsilonRI también inhibió la actividad de los mastocitos. Los receptores inhibidores estudiados fueron DSP-1 y LAIR-1. El anticuerpo anti-DSP-1 o el anticuerpo anti-LAIR-1 se utilizaron como agonistas para el DSP-1 o el LAIR-1, respectivamente. La desgranulación (liberación de la triptasa), fue máxima con la adición del anticuerpo anti-receptor de IgE más el anticuerpo de control (Ig de ratón). La máxima liberación de triptasa, en estas condiciones, resultó en Abs._{405-570} = 0,44-0,51. Se utilizaron niveles de titulación del anticuerpo anti-DSP-1 (0-1000 ng/ml de anticuerpo anti-DSP-1), con diferentes niveles de anticuerpo anti-DSP-1 en mezclas de incubación separadas. Las concentraciones que se incrementan del anticuerpo anti-DSP-1 dieron como resultado en una inhibición progresiva de la liberación de la triptasa, donde la inhibición máxima (Abs_{405-570} = 0,08), ocurrió a aproximadamente 40 ng/ml del anticuerpo anti-DSP-1, así como a concentraciones mayores del anticuerpo anti-DSP-1. Las concentraciones intermedias del anticuerpo anti-DSP-1 (aproximadamente 8 ng/ml), resultaron en un 25% de la liberación máxima de la triptasa. Los resultados demuestran que la reticulación del DSP-1 con el receptor de IgE evita la desgranulación dependiente del receptor de IgE.

En estudios que involucran al receptor inhibidor LAIR-1, se utilizó el anticuerpo anti-LAIR-1 a 0 ó 50 ng/ml. Cuando las incubaciones contuvieron únicamente anticuerpo activante (anticuerpo del receptor anti-IgE), la liberación de la triptasa fue aproximadamente Abs_{405-570} = 0,69 (definida como máxima). Cuando las incubaciones contuvieron anticuerpo activante (receptor anti-IgE), el anticuerpo anti-LAIR-1 (50 ng/ml), y el reticulador, se inhibió la liberación de la triptasa, y cuando la liberación de la triptasa al nivel inhibido fue de aproximadamente 10% del máximo (Abs_{405-570} = 0,07). Las incubaciones de control que no contienen anticuerpo activante, resultaron en muy poca liberación de la triptasa (Abs_{405-570} = 0,06). Los resultados demuestran que la reticulación de la LAIR-1 con el receptor de IgE previene la desgranulación dependiente del receptor de IgE.

VII. Prevención de la desgranulación de los mastocitos in vivo

Para determinar si el agonismo de la molécula de CD200Ra podría prevenir también la desgranulación de los mastocitos in vivo, se empleó la anafilaxis cutánea pasiva (PCA). Cada ratón en un grupo de cinco ratones CD1 de 30 g, se inyectó i. v. con 100 \mug de DX109 (mAb anti-muCD200Ra de rata). Cada ratón en un segundo grupo de cinco ratones CD1 de 30 g, se inyectó i. v. con 100 \mug de mAb de control de IgG1 de rata. Una hora más tarde, las espaldas de los diez ratones se afeitaron y se inyectó mAb anti-DNP de IgE de ratón por vía intradérmica (i. d.) a un volumen de 20 \mul en 3 sitios por ratón, respectivamente 10, 20 ó 40 ng de IgE por sitio. Veinticuatro horas más tarde, todos los ratones recibieron i. v. una mezcla de antígeno (DNP-HSA) y el tinte azul de Evans. Cuando el antígeno inyectado se une y retícula la IgE unida a los mastocitos de la piel, ocurre la desgranulación, conduciendo a la liberación de mediadores tales como histamina que causan edema vascular, permitiendo el movimiento del tinte azul de la sangre hacia la piel, y la aparición de manchas azules en la piel. El tamaño de la mancha azul es proporcional a la cantidad de IgE inyectada a la piel en ese sitio. En los ratones que reciben 100 \mug del mAb de IgG1 control, procedió la reacción de PCA, y las manchas azules aparecieron en los cinco ratones, la mancha de tamaño más grande en el sitio donde se inyectaron 40 ng de IgE, la mancha azul más pequeña donde se inyectaron 10 ng de IgE. En los ratones que reciben el mAb anti-CD200Ra de DX109, no aparecieron manchas azules a ninguna concentración de IgE inyectada. Así, como en los estudios in vitro, el mAb de DX109 suministró una señal inhibidora a los mastocitos de la piel in vivo, previniendo la desgranulación.

VIII. Tratamiento de la artritis inducida por colágeno (CIA) con el anticuerpo anti-CD200Ra

La CIA se indujo en ratones después del tratamiento con el anticuerpo anti-CD200Ra (mAb de DX109) o con el anticuerpo de IgG control. Ratones B10-RIII hembra, de 8-10 semanas de edad, se trataron con colágeno de bovino del tipo II en adyuvante completo de Freund (CFA) (Jirholt, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:3321-3328). En el día 0, los ratones se trataron con una dosis de colágeno bovino del Tipo II en CFA. Iniciando en el día 7, el anticuerpo se administró a intervalos semanales. Las dosis del anticuerpo DX109 y la IgG de control fueron de 1 mg, i. p., en los días 7 y 14, y 1 mg, s. c., en los días 21 y 28. La calificación de la enfermedad comenzó en el día 14 y continuó al día 45. Los ratones experimentales recibieron DX109, mientras que los ratones de control recibieron IgG de control.

La CIA se calificó por incidencia acumulativa en unidades de porcentaje. El grupo de control mostró una calificación de 0% a t = 14-18 días; una calificación de 40% a t = 19-20 días; una calificación de 60% a t = 21-30 días; y una calificación de 80% a t = 31-44 días. El grupo tratado con DX109 mostró una calificación de 0% de t = 14-24 días, y una calificación de 20% de t = 25-44 días. Por lo tanto, el tratamiento con DX109 resulta en calificaciones más bajas y en el alivio de la CIA.

La CIA también se calificó por una Calificación Media Clínica (MCS) (Hoek, et al, anteriormente). El grupo de control mostró una MCS = 0 a 14-19 días; una MCS = 1 a 20-21 días; una MCS = \sim2 a 22-31 días, seguido por un incremento progresivo de la MCS = \sim4.5, donde una calificación de la MCS = \sim4.5 ocurrió a los 39-44 días. El grupo tratado con DX109 demostró una MCS = 0 a los 14-24 días, una MCS = 0,2 a los 25-26 días, una MCS = 0,5 a los 27-34 días, una MCS = 0,2 a los 35-42 días, y una MCS = 0,5 a los 43-44 días. Nuevamente, los resultados demostraron que el tratamiento con DX109 resultó en calificaciones más bajas y el alivio de la CIA.

IX. Efectos de un anticuerpo anti-CD200R en la endotoxemia inducida por el LPS

Se indujo la endotoxemia en ratones mediante el tratamiento con LPS, seguido por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD200R (DX109) o el anticuerpo de control y la valoración de la proporción de supervivencia. La dosis de LPS se ajustó para proporcionar suficiente toxicidad para provocar toxicidad y muerte de los ratones, mientras que se evitan los niveles de saturación que evitarían que el anticuerpo mejorara la supervivencia. Los ratones fueron de la raza C57BL/6. Los ratones recibieron 0,5 mg de anticuerpo (i. p.) en dos puntos de tiempo, es decir, 1 hora antes y también simultáneamente con LPS. Los ratones tratados con el anticuerpo anti-CD200R mostraron una proporción de supervivencia mayor en varios puntos de tiempo, cuando se comparan con el grupo de control. Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CD200R protege a los ratones de la toxicidad inducida por el LPS.

X. Distribución del CD200Ra en la piel humana

El CD200Ra se visualizó en verde por el anti-CD200Ra de rata y se marcó con antirrata de cabra que contiene Alexa Fluor®-488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Los mastocitos se visualizaron en rojo con anti-CD117 de ratón (un marcador para los mastocitos), y el marcado con antirratón de cabra que contiene Alexa Fluor®-594 (Molecular Probes, Eugene, OR). La tinción con anti-CD117 reveló una serie de manchas rojas discretas. La tinción con ambos anticuerpos, indicó que aproximadamente un tercio de las células que portan CD200Ra fueron mastocitos.

La piel humana normal también se probó para la localización del CD200Ra (SEC ID Nº: 2) en los macrófagos. El CD200Ra se localizó tiñendo con anti-CD200Ra marcado con verde. Los macrófagos se localizaron con el anticuerpo anti-CD11b marcado con rojo. La tinción con el anticuerpo solo o con ambos anticuerpos juntos, demostró que la mayoría de macrófagos expresó al CD200Ra.

La piel humana normal y psoriática, se sondó con anti-CD200Ra (DX136), teñido con peroxidasa de rábano picante (HRP), y se examinó bajo luz visible. Los resultados mostraron que la piel psoriática estaba teñida profusamente tanto en la dermis como en la epidermis, cuando se compara con la piel normal. La piel psoriática contiene grandes agrupaciones de células CD200Ra^{+}, donde estas células parecieron consistir en linfocitos T y células mieloides.

Identificadores de las secuencias

La SEC ID Nº: 1 es un ácido nucleico de CD200Ra humano.

La SEC ID Nº: 2 es un polipéptido de CD200Ra humano.

La SEC ID Nº: 3 es un ácido nucleico de CD200Rb humano.

La SEC ID Nº: 4 es un polipéptido de CD200Rb humano.

La SEC ID Nº: 5 es un ácido nucleico de CD200Ra murino.

La SEC ID Nº: 6 es un polipéptido de CD200Ra murino.

La SEC ID Nº: 7 es un ácido nucleico de CD200Rb murino.

La SEC ID Nº: 8 es un polipéptido de CD200Rb murino.

La SEC ID Nº: 9 es un ácido nucleico de CD200Rc murino.

La SEC ID Nº: 10 es un polipéptido de CD200Rc murino.

La SEC ID Nº: 11 es un ácido nucleico de CD200Rd murino.

La SEC ID Nº: 12 es un polipéptido de CD200Rd murino.

La SEC ID Nº: 13 es un ácido nucleico de CD200R de rata.

La SEC ID Nº: 14 es un polipéptido de CD200R de rata.

<210> Schering Corporation

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<120> Métodos para modular los receptores CD200

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<130> DX01550K WI

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<150> 60/364,513

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<151> 2002-03-15

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<160> 14

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 2255

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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6

7

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<210> 2

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<211> 348

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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8

9

10

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<210> 3

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<211> 1010

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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11

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<210> 4

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<211> 250

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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12

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<210> 5

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<211> 1624

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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14

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<210> 6

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<211> 326

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 6

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15

16

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<210> 7

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<211> 1386

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 7

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17

18

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<210> 8

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<211> 194

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

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19

20

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<210> 9

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<211> 1354

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 9

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21

22

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<210> 10

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<211> 278

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 10

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23

24

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<210> 11

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<211> 813

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 11

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25

26

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<210> 12

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<211> 270

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 12

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27

28

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<210> 13

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<211> 2358

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<212> ADN

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<213> Rattus sp

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<400> 13

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29

30

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<210> 14

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<211> 327

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 14

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31

32

33

Claims (8)

1. Uso de un anticuerpo agonista que se une de manera específica al CD200Ra de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de alergia o asma.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:

a)

un anticuerpo humanizado;

b)

un anticuerpo monoclonal;

c)

un anticuerpo policlonal;

d)

un fragmento Fab; o

e)

un fragmento F(ab')_{2}.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento es para la administración junto con un agente que mejora de manera específica la expresión del CD200Ra.

4. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que el CD200Ra es como se expresa en mastocitos.

5. Un anticuerpo agonista que se une de manera específica al CD200Ra de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para el uso en el tratamiento de alergia o asma.

6. El anticuerpo agonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:

a)

un anticuerpo humanizado;

b)

un anticuerpo monoclonal;

c)

un anticuerpo policlonal;

d)

un fragmento Fab; o

e)

un fragmento F(ab')_{2}.

7. El anticuerpo agonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento es para la administración junto con un agente que mejora de manera específica la expresión del CD200Ra.

8. El anticuerpo agonista o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en el que el CD200Ra es como se expresa en mastocitos.