ES2329666T3 - Proteinas fluorescentes de maduracion rapida y procedimientos de uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

Polinucleótido que codifica un mutante cromo- o fluorescente de DsRed de tipo silvestre, en el que el mutante comprende una mutación en N42 de DsRed de tipo silvestre y en el que el mutante madura más rápidamente que la DsRed de tipo silvestre.

Description

Proteínas fluorescentes de maduración rápida y procedimientos de uso de las mismas.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Conforme al apartado 119(e) del título 35 del U.S.C., esta solicitud reivindica prioridad de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos nº de serie 60/341.723, presentada el 21 de junio de 2001.

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Introducción Campo de la invención

El campo de esta invención es las proteínas fluorescentes.

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Antecedentes de la invención

El marcado es una herramienta para preparar una proteína, célula u organismo de interés y desempeña un papel destacado en muchas aplicaciones de bioquímica, biología molecular y diagnóstico médico. Se han desarrollado una variedad de marcadores, incluyendo radiomarcadores, cromomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, etc. Sin embargo, hay un continuo interés en el desarrollo de nuevos marcadores. Es de particular interés el desarrollo de nuevos marcadores de proteína, incluyendo marcadores de proteína cromo- y/o fluorescentes.

Son una importante nueva clase de proteínas fluorescentes que se han desarrollado recientemente las proteínas fluorescentes de arrecife de coral, como se describen en Matz, M.V., y col. (1999) Nature Biotechnol., 17: 969-973. Aunque estas proteínas fluorescentes exhiben muchos atributos positivos, hay un fuerte interés en el desarrollo de versiones de esta importante nueva clase de proteínas fluorescentes que exhiban rasgos deseables adicionales, por ejemplo, una maduración rápida. La presente invención satisface esta necesidad.

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Bibliografía relevante

Las patentes de EE.UU. de interés incluyen: 6.066.476, 6.020.192, 5.985.577, 5.976.796, 5.968.750, 5.968.738, 5.958.713, 5.919.445, 5.874.304 y 5.491.084. Las publicaciones de patente internacional de interés incluyen: WO 00/46233, WO 99/49019 y DE 19.718.640 A. Son también de interés: Anderluh y col., Biochemical and Biophysical Research Communications (1996) 220: 437-442; Dove y col., Biological Bulletin (1995) 189: 288-297; Fradkov y col., FEBS Lett. (2000) 479 (3): 127-30; Gurskaya y col., FEBS Lett., (2001) 507 (1): 16-20; Gurskaya y col., BMC Biochem. (2001) 2: 6; Lukyanov, K. y col. (2000) J. Biol. Chemistry 275 (34): 25879-25882; Macek y col., Eur. J. Biochem. (1995) 234: 329-335; Martynov y col., J. Biol. Chem. (2001) 276: 21012-6; Matz, M.V. y col. (1999) Nature Biotechnol., 17: 969-973; Terskikh y col., Science (2000) 290: 1585-8; Tsien, Annual Rev. of Biochemistry (1998) 67: 509-544; Tsien, Nat. Biotech. (1999) 17: 956-957; Ward y col., J. Biol. Chem. (1979) 254: 781-788; Wiedermann y col., Jarhrestagung der Deutschen Gesellschaft für Tropenokologie (gto) Ulm. 17-19-02-1999. Poster P-4.20; Yarbrough y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98: 462-7.

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Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones de ácido nucleico que codifican proteínas fluorescentes de maduración rápida, así como versiones no agregantes de las mismas (y mutantes de las mismas) y las proteínas codificadas por los mismos. Las proteínas de interés son proteínas que son fluorescentes, surgiendo este rasgo de la interacción de dos o más residuos de la proteína. Las proteínas en cuestión son mutantes de la proteína fluorescente "roja" de Discosoma sp. de tipo silvestre vendida comercialmente como "DsRed". Son también de interés proteínas que son sustancialmente similares a, o mutantes de, las proteínas específicas anteriores. Se proporcionan también fragmentos de los ácidos nucleicos y péptidos codificados por los mismos, así como anticuerpos de las proteínas en cuestión y células y organismos transgénicos. Las composiciones de proteína y ácido nucleico en cuestión encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones. Finalmente, se proporcionan kits para uso en dichas aplicaciones, por ejemplo, que incluyen las composiciones de ácido nucleico en cuestión.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Espectros normalizados de excitación y emisión de variantes representativas de DsRed. (A) Mutar el residuo N42 altera las propiedades espectrales de DsRed. Se muestran los espectros de DsRed1 y las variantes N42H y N42Q. Las tres proteínas estaban totalmente maduras. (B) Espectros de las variantes DsRed.T3 y DsRed.T4 optimizadas.

Figura 2. Cinética de maduración de variantes de DsRed. Se trataron cultivos de E. coli de crecimiento logarítmico con el inductor \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) durante 30 minutos para generar un pulso de expresión para cada variante. Se inició entonces un seguimiento (a tiempo 0 en las gráficas) añadiendo inhibidores de la síntesis de proteína y continuando la incubación a 37ºC. Se retiraron alícuotas de los cultivos en los tiempos indicados y se analizaron posteriormente mediante citometría de flujo para determinar la intensidad medida de fluorescencia roja por célula. Se midió la fluorescencia de fondo (línea de trazos) usando células que portaban el plásmido pQE81 vacío. Se representan en las dos gráficas (A) los valores brutos de fluorescencia o (B) los valores obtenidos restando la fluorescencia presente a tiempo 0 y normalizando a una señal máxima de 100% para cada variante de DsRed. Una ligera bajada en puntos temporales posteriores de los valores medios de fluorescencia para DsRed.T3 y DsRed.T4 refleja probablemente lisis celular. En un cultivo de control, se añadieron inhibidores de la síntesis de proteína simultáneamente con IPTG a células que portaban el plásmido de expresión DsRed.T3; como se esperaba, esas células permanecieron no fluorescentes (datos no mostrados). La inmunotransferencia indicó que, durante el periodo de seguimiento, la cantidad de proteína DsRed2, DsRed.T3 y DsRed.T4 en los cultivos permaneció esencialmente constante, mientras que la cantidad de proteína DsRed1 bajó progresivamente hasta aproximadamente la mitad de su nivel inicial (datos no mostrados).

Figura 3. Visualización simultánea de DsRed.T4 y EGFP en levadura. Se orientó DsRed.T4 a la matriz mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae mediante fusión con la presecuencia de Cox4p. Se produjo la proteína de fusión pCox4-DsRed.T4 en una cepa que contenía también Sec7p-eGFP, un marcador de cisternas de Golgi. Se tomaron imágenes de un cultivo en crecimiento logarítmico usando un juego de filtros rojo Tejas (rojo) o un juego de filtros EGFP (verde). Además, se visualizaron las células mediante microscopia de contraste por interferencia diferencial (DIC). Como se muestra en la imagen adjunta, las señales de DsRed.T4 y EGFP se resuelven fácilmente. Barra de escala 2 \mum.

Figura 4. La reducción de la carga neta cerca del extremo N de DsRed reduce la agregación de la proteína. (A) PAGE-SDS no desnaturalizante de DsRed1 purificada (WT), la variante de primera ronda (R1), la variante de tercera ronda (R3), la variante de cuarta ronda (R4), DsRed.T1 (T1), DsRed.T3 (T3) y DsRed.T4 (T4). Se mezcló 1 \mug de cada variante de DsRed purificada con tampón de muestra que contenía SDS en hielo y se sometió inmediatamente a electroforesis a 4ºC en un gel de poliacrilamida al 10%, seguido de tinción con azul de Coomasie. WT* y T4*: Se desnaturalizaron alícuotas adicionales de DsRed1 y DsRed.T4 mediante cocción antes de la electroforesis. MW: patrón de proteína preteñido de amplio intervalo (Bio-Rad). (B) Para medir las solubilidades de las proteínas fluorescentes en E. coli, se cultivaron células que portaban vectores de expresión basados en pREP4 más pQE31 que codificaban DsRed1, DsRed2, la variante de tercera ronda, la variante de cuarta ronda o EGFP hasta una DO_{600} de 0,5, se indujeron con IPTG durante 7 h, se lisaron después con B-PER II y se centrifugaron durante 20 minutos a 27.000 x g. Se sometieron cantidades equivalentes de fracciones de sedimento y sobrenadante a PAGE-SDS seguido de inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal antihexahistidina (Qiagen). Se detectó el anticuerpo unido usando el kit ECL-Plus (Amersham) y un Phosphorimager Storm 860 de Molecular Dynamics. Para cada proteína fluorescente, se analizó una serie de dilución del extracto bacteriano y se eligió una muestra en el intervalo lineal para el sistema de detección. Se cuantificó entonces el porcentaje de cada proteína en la fracción sobrenadante. Se representan los valores medios de dos experimentos separados, para cada proteína fluorescente, los números obtenidos en los dos experimentos estaban en el intervalo de un 10% entre sí.

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Definiciones

Según la presente invención, pueden emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Síntesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins ed. (1985)); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. (1986)); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede fijarse otro segmento de ADN causando la replicación del segmento fijado.

Una "molécula de ADN" designa la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en forma monocatenaria o de hélice bicatenaria. Este término designa sólo la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Por tanto, este término incluye ADN bicatenario encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas.

Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se dispone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos) y secuencias de ADN sintético. Pueden localizarse una secuencia señal de poliadenilación y terminación de la transcripción 3' de la secuencia de codificación.

Como se usa en la presente memoria, el término "hibridación" designa el proceso de asociación de dos cadenas de ácido nucleico para formar un dúplex antiparalelo mediante enlaces de hidrógeno entre residuos de las cadenas de ácido nucleico opuestas.

El término "oligonucleótido" designa una molécula de ácido nucleico corta (de menos de 100 bases de lon-
gitud).

Las "secuencias reguladoras del ADN", como se usan en la presente memoria, son secuencias de control transcripcional y traduccional, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia de codificación en una célula hospedadora.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación cadena abajo (dirección 3'). Con fines de definir la presente invención, se une la secuencia promotora a su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora, se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a proteína responsables de la unión de ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán a menudo, pero no siempre, secuencias "TATA" y secuencias "CAT". Pueden usarse diversos promotores, incluyendo promotores inducibles, para activar los diversos vectores de la presente
invención.

Como se usan en la presente memoria, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" designan enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN bicatenario en o cerca de una secuencia nucleotídica específica.

Una célula se ha "transformado" o "transfectado" con ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede estar o no integrado (ligado covalentemente) en el genoma de la célula. En procariotas, levaduras y células de mamífero, por ejemplo, una célula transformada establemente es aquella en que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es heredado por las células hija mediante replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hija que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas
generaciones.

Una región "heteróloga" del constructo de ADN es un segmento identificable de ADN en una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará habitualmente flanqueado por ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, el ADN heterólogo incluye la secuencia de codificación de un constructo en que se han puesto juntas porciones de genes de dos fuentes diferentes de modo que se produjera un producto de proteína de fusión. Las variaciones alélicas o eventos mutacionales de origen natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "gen indicador" designa una secuencia de codificación fijada a un promotor heterólogo o elementos potenciadores y cuyo producto puede ensayarse fácil y cuantificablemente cuando el constructo se introduce en tejidos o células.

Los aminoácidos descritos en la presente memoria se prefiere que estén en la forma isomérica "L". Las secuencias aminoacídicas se dan en el código de una letra (A: alanina; C: cisteína; D: ácido aspártico; E: ácido glutámico; F: fenilalanina; G: glicina; H: histidina; I: isoleucina; K: lisina; L: leucina; M: metionina; N: asparagina; P: prolina; Q: glutamina; R: arginina; S: serina; T: treonina; V: valina; W: triptófano; Y: tirosina; X: cualquier residuo). NH_{2} designa el grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH designa el grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. Para mantener la nomenclatura de polipéptidos estándar, se usa el documento J. Biol. Chem., 243 (1969), 3552-59.

El término "inmunológicamente activo" define la capacidad de la proteína cromo/fluorescente natural, recombinante o sintética, o cualquier oligopéptido de la misma, de inducir una respuesta inmunitaria específica en animales o células apropiados, y de unirse a anticuerpos específicos. Como se usa en la presente memoria, "secuencia aminoacídica antigénica" significa una secuencia aminoacídica que, sola o en asociación con una molécula vehículo, puede desencadenar una respuesta de anticuerpo en un mamífero. El término "unión específica", en el contexto de unión de anticuerpo a un antígeno, es un término bien entendido en la técnica y designa la unión de un anticuerpo al antígeno con el que se creó el anticuerpo, pero no a otros antígenos no relacionados.

Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" pretende describir un polinucleótido, un polipéptido, un anticuerpo o una célula hospedadora en un entorno diferente del que aparece naturalmente el polinucleótido, polipéptido, anticuerpo o célula hospedadora.

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La bioluminiscencia (BL) se define como la emisión de luz por organismos vivos que es bien visible en la oscuridad y afecta al comportamiento visual de animales (véanse, por ejemplo, Harvey, E. N. (1952). "Bioluminescence". New York: Academic Press; Hastings, J. W. (1995). "Bioluminescence". En: "Cell Physiology" (ed. por N. Speralakis). pág. 651-681. Nueva York: Academic Press.; Wilson, T. y Hastings, J. W. (1998). "Bioluminescence". Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 14, 197-230.). La bioluminiscencia no incluye la denominada emisión de luz ultradébil, que puede detectarse virtualmente en todas las estructuras vivas usando un equipo luminométrico sensible (Murphy, M. E. y Sies, H. (1990). "Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems". Meth. Enzymol. 86, 595-610; Radotic, K, Radenovic, C, Jeremic, M. (1998). "Spontaneous ultra-weak bioluminescence in plants: origin, mechanisms and properties". Gen. Physiol. Biophys. 17, 289-308), y la emisión de luz débil que lo más probablemente no desempeña ningún papel ecológico, tal como el brillo del cono de crecimiento del bambú (Totsune, H., Nakano, M., Inaba, H. (1993). "Chemiluminescence from bamboo shoot cut". Biochem. Biophys. Res Comm. 194, 1025-1029) o la emisión de luz durante la fertilización de huevos animales (Klebanoff, S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M., Shapiro, B. M. (1979). "Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism". J. Exp. Med. 149, 938-953; Schomer, B. y Epel, D. (1998). "Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs". Dev. Biol. 203, 1-11).

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Descripción de realizaciones específicas

Se proporcionan composiciones de ácido nucleico que codifican proteínas fluorescentes de maduración rápida, así como versiones no agregantes de las mismas (y mutantes de las mismas) y las proteínas codificadas por los mismos. Las proteínas de interés son proteínas que son fluorescentes, surgiendo este rasgo de la interacción de dos o más residuos de la proteína. Las proteínas en cuestión son mutantes de la proteína fluorescente "roja" de Discosoma sp. de tipo silvestre. Son también de interés proteínas que son sustancialmente similares a, o mutantes de, las proteínas específicas anteriores. Se proporcionan también fragmentos de ácidos nucleicos y los péptidos codificados por los mismos, así como anticuerpos de las proteínas en cuestión y células y organismos transgénicos. Las composiciones de proteína y ácido nucleico en cuestión encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones. Finalmente, se proporcionan kits para uso en dichas aplicaciones, por ejemplo, que incluyen las composiciones de ácido nucleico en cuestión.

Antes de describir adicionalmente la invención en cuestión, ha de entenderse que la invención no está limitada a las realizaciones particulares de la invención descritas a continuación, ya que pueden hacerse variaciones de las realizaciones particulares y seguir entrando dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Ha de entenderse también que la terminología empleada es con fines de describir realizaciones particulares, y que no se pretende que sea limitante. En lugar de ello, el alcance de la presente invención se establecerá por las reivindicaciones adjuntas.

En esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta un décimo de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden incluirse independientemente en los intervalos menores, y están también comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos están también incluidos en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse cualquier procedimiento, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la invención, se describen ahora los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos.

Al describir adicionalmente la invención en cuestión, se describirán las composiciones de ácido nucleico en cuestión en primer lugar, seguido de una discusión sobre las composiciones de proteína, composiciones de anticuerpo y células/organismos transgénicos en cuestión. A continuación, se proporciona una revisión de los procedimientos representativos en los que encuentran uso las proteínas en cuestión.

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Composiciones de ácido nucleico

Como se resume anteriormente, la invención en cuestión proporciona composiciones de ácido nucleico que codifican cromo/fluoroproteínas de maduración rápida y mutantes de las mismas, así como fragmentos y homólogos de estas proteínas. Por proteína cromo/fluorescente de maduración rápida se entiende una proteína que es coloreada y/o fluorescente, por ejemplo, puede exhibir una fluorescencia baja, media o alta tras irradiación con luz de una longitud de onda de excitación. Además, puesto que la proteína es de maduración rápida, consigue sus propiedades cromo/fluorescentes finales en menos de aproximadamente 72 horas, a veces menos de 48 horas y a veces menos de 24 horas. En ciertas realizaciones, la proteína puede madurar en un periodo de menos de 20 horas, por ejemplo, 18 horas, 16 horas, 14 horas, 12 horas, 10 horas, 8 horas, etc.

En cualquier caso, las proteínas de interés en cuestión son aquellas en que la característica coloreada, concretamente la característica cromo- y/o fluorescente, es aquella que surge de la interacción de dos o más residuos de la proteína, y no de un solo residuo, más específicamente una sola cadena lateral de un solo residuo, de la proteína. Como tales, las proteínas fluorescentes de la invención en cuestión no incluyen proteína que exhiben fluorescencia sólo de residuos que actúan por sí mismos con fluoróforos intrínsecos, concretamente, triptófano, tirosina y fenilalanina. Como tales, las proteínas fluorescentes de la invención en cuestión son proteínas fluorescentes cuya fluorescencia surge de alguna estructura de la proteína que es distinta de los residuos individuales anteriormente especificados, por ejemplo, surge de la interacción de dos o más residuos.

Por composición de ácido nucleico se entiende una composición que comprende una secuencia de ADN que tiene un marco abierto de lectura que codifica un cromo/fluoropolipéptido de la invención en cuestión, concretamente, un gen de cromo/fluoroproteína, y es capaz, en condiciones apropiadas, de expresarse como una cromo/fluoroproteína según la invención en cuestión. Están también comprendidos en este término los ácidos nucleicos que son homólogos, sustancialmente similares o idénticos a los ácidos nucleicos de la presente invención. Por tanto, la invención en cuestión proporciona genes y secuencias de codificación de los mismos que codifican las proteínas de la invención en cuestión, así como homólogos de los mismos. Los ácidos nucleicos en cuestión, cuando son de origen natural, están presentes en un entorno distinto del suyo natural, por ejemplo, están aislados, presentes en cantidades enriquecidas, etc., de su entorno de origen natural, por ejemplo, el organismo del que se obtienen.

Las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos en cuestión son mutantes de la proteína fluorescente "roja" de Discosoma sp. de tipo silvestre (drFP585), dándose a conocer las que la secuencia de codificación de ácido nucleico y la secuencia aminoacídica de esta proteína en la solicitud nº de serie 10/006.922. La DsRED de tipo silvestre está codificada por un ácido nucleico que tiene la secuencia:

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y que tiene la secuencia aminoacídica:

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Los mutantes de maduración rápida representativos de "DsRed" incluyen, pero sin limitación: mutaciones puntuales en posición 42 respecto al residuo de inicio, por ejemplo, N42Q, etc.; mutaciones puntuales en posición 41 respecto al residuo de inicio, por ejemplo, H41L, H41T, etc.; mutaciones puntuales en posición 44 respecto al residuo de inicio, por ejemplo, V44A, etc.; mutaciones puntuales en posición 21 respecto al residuo de inicio, por ejemplo, T21S, etc. y similares.

Un ácido nucleico de interés representativo que codifica el mutante DsRed.T1 descrito con más detalle a continuación incluye la secuencia de codificación encontrada en la siguiente secuencia:

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en la que el codón ATG en negrita/subrayado es el codón de inicio y el TAG en negrita/subrayado es el codón de terminación.

Además de las composiciones de ácido nucleico específicas descritas anteriormente, son también de interés los homólogos de las secuencias anteriores. Con respecto a los homólogos de los ácidos nucleicos en cuestión, la fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie de planta o animal o la secuencia puede ser total o parcialmente sintética. En ciertas realizaciones, la similitud de secuencia entre homólogos es de al menos aproximadamente un 20%, a veces de al menos aproximadamente un 25%, y puede ser de un 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% o mayor, incluyendo 75%, 80%, 85%, 90% y 95% o mayor. La similitud de secuencia se calcula basándose en una secuencia de referencia, que puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como un motivo conservado, región de codificación, región flanqueante, etc. Una secuencia de referencia será habitualmente de al menos aproximadamente 18 nt de largo, más habitualmente de al menos aproximadamente 30 nt de largo, y puede extenderse a la secuencia completa que se está comparando. Son conocidos algoritmos para el análisis de secuencia en la técnica tales como BLAST, descrito en Altschul y col. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10 (usando los ajustes por defecto, concretamente, los parámetros w=4 y T=17). Las secuencias proporcionadas en la presente memoria son esenciales para reconocer ácidos nucleicos relacionados y homólogos en búsquedas en bases de datos.

Son de particular interés en ciertas realizaciones los ácidos nucleicos de sustancialmente la misma longitud que el ácido nucleico identificado como SEQ ID NO 1 ó 2, significando sustancialmente la misma longitud que cualquier diferencia en longitud no supera aproximadamente un 20% en número, habitualmente no supera aproximadamente un 10% en número, y más habitualmente no supera aproximadamente un 5% en número; y tiene una identidad de secuencia con cualquiera de estas secuencias de al menos aproximadamente un 90%, habitualmente al menos aproximadamente un 95% y más habitualmente al menos aproximadamente un 99% frente a la toda la longitud del ácido nucleico. En muchas realizaciones, los ácidos nucleicos tienen una secuencia que es sustancialmente similar (concretamente, la misma) o idéntica a la secuencia de SEQ ID NO 1 ó 2. Por sustancialmente similar, se entiende que la identidad de secuencia será generalmente de al menos aproximadamente un 60%, habitualmente al menos aproximadamente un 75%, y a menudo al menos aproximadamente un 80, 85, 90 o incluso un 95%.

Se proporcionan también ácidos nucleicos que codifican las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos anteriormente descritos, pero que difieren en secuencia de los ácidos nucleicos anteriormente descritos debido a la degeneración del código genético.

Se proporcionan también ácidos nucleicos que hibridan con el ácido nucleico anteriormente descrito en condiciones rigurosas. Es un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas la hibridación a 50ºC o más y con 0,1 x SSC (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Es otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas la incubación durante una noche a 42ºC en una disolución de 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento, seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC aproximadamente a 65ºC. Las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, considerándose que las condiciones son al menos tan rigurosas si son al menos aproximadamente un 80% tan rigurosas, típicamente al menos aproximadamente un 90% tan rigurosas, como las condiciones rigurosas específicas anteriores. Son conocidas otras condiciones de hibridación rigurosas en la técnica, y pueden emplearse también para identificar ácidos nucleicos de esta realización particular de la invención.

Se proporcionan también ácidos nucleicos que codifican mutantes de las proteínas de la invención. Los ácidos nucleicos mutantes pueden generarse mediante mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida, usando técnicas bien conocidas que son rutinarias en la técnica. En algunas realizaciones, las proteínas cromo- o fluorescentes codificadas por los ácidos nucleicos que codifican homólogos o mutantes tienen las mismas propiedades fluorescentes que la proteína fluorescente de tipo silvestre. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos homólogos o mutantes codifican proteínas cromo- o fluorescentes con propiedades espectrales alteradas, como se describe con más detalle en la presente memoria.

Una categoría de mutante que es de particular interés es el mutante no agregante. En muchas realizaciones, el mutante no agregante difiere de la secuencia de tipo silvestre por una mutación en el extremo N que modula la carga que aparece en los grupos laterales de los residuos del extremo N, por ejemplo, para invertir o neutralizar la carga, de manera suficiente para producir un mutante no agregante de la proteína o mutante de origen natural, considerándose que una proteína particular es no agregante si se determina que es no agregante usando el ensayo reseñado en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/081.864, cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia y se publica en la publicación PCT nº WO 02/068459.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de esta realización codifican polipéptidos no agregantes que exhiben una agregación in vivo reducida. "Agregación in vivo reducida" designa una agregación reducida en una célula. En algunas realizaciones, el polipéptido no agregante muestra menos de aproximadamente un 90%, menos de aproximadamente un 80%, menos de aproximadamente un 70%, menos de aproximadamente un 60%, menos de aproximadamente un 50%, menos de aproximadamente un 40%, menos de aproximadamente un 30%, menos de aproximadamente un 25%, menos de aproximadamente un 20%, menos de aproximadamente un 15%, menos de aproximadamente un 10% o menos de aproximadamente un 5% de la agregación mostrada por su correspondiente análogo agregante en las mismas condiciones in vivo, por ejemplo, en otra célula eucariótica de la misma línea celular, en una célula procariótica idéntica o en una célula eucariótica o población celular del mismo tipo celular. En general, agrega menos de aproximadamente un 60%, menos de aproximadamente un 50%, menos de aproximadamente un 40%, menos de aproximadamente un 30%, menos de aproximadamente un 20%, menos de aproximadamente un 10% o menos de aproximadamente un 5% del polipéptido no agregante en cuestión presente en una célula o población
celular.

Los procedimientos de medida del grado de agregación son conocidos en la técnica; puede usarse cualquier procedimiento conocido para determinar si un mutante dado muestra una reducción en la agregación en comparación con el correspondiente análogo agregante, por ejemplo, cuando se compara con un correspondiente polipéptido de tipo silvestre agregante. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, electroforesis en gel de proteína "seudonativa", filtración en gel, ultracentrifugación, dicroísmo circular y dispersión de luz. La agregación puede medirse mediante dispersión de luz. Para proteínas no agregadas, la relación de absorción a una longitud de onda más corta a absorción a una longitud de onda más larga es cercana a cero. En algunas realizaciones, la relación de absorción a 400 nm a absorción a 566 nm de un polipéptido no agregante está en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 0,09, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,08, de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 0,07, o de aproximadamente 0,03 a aproximadamente
0,06.

En muchas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican polipéptidos de maduración rápida no agregantes que tienen secuencias aminoacídicas que difieren de sus correspondientes secuencias de tipo silvestre por una mutación en el extremo N que modula las cargas que aparecen en los grupos laterales de los residuos del extremo N, por ejemplo, para invertir o neutralizar la carga, de manera suficiente para producir un mutante no agregante de la proteína de origen natural o mutante agregante de la misma. Más específicamente, los residuos básicos localizados cerca de los extremos N de las proteínas están sustituidos, por ejemplo, los residuos Lys y Arg cercanos al extremo N están sustituidos por residuos cargados negativamente o neutros. Por extremo N, se entiende dentro de aproximadamente 50 residuos desde el extremo N, a menudo dentro de aproximadamente 25 residuos del extremo N y más a menudo dentro de aproximadamente 15 residuos del extremo N, apareciendo modificaciones de residuo en muchas realizaciones dentro de aproximadamente 10 residuos del extremo N. Los residuos específicos de interés en muchas realizaciones incluyen: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Cuando la proteína codificada por el ácido nucleico es un mutante de DsRed, como se describe anteriormente, las mutaciones puntuales no agregantes específicas de interés incluyen, pero sin limitación: mutaciones en la posición 2, por ejemplo, R2H, R2L, R2A, etc.; mutaciones en la posición 5, por ejemplo, K5E, K5Q, K5M, etc.; mutaciones en la posición 6, por ejemplo, N6D, etc. y similares.

Es otra categoría de mutante de interés particular el mutante de oligomerización modulada. Un mutante se considera que es un mutante de oligomerización modulada si sus propiedades de oligomerización son diferentes en comparación con la proteína de tipo silvestre. Por ejemplo, si un mutante particular oligomeriza en una mayor o menor extensión que el tipo silvestre, se considera que es un mutante de oligomerización. Son de particular interés los mutantes de oligomerización que no oligomerizan, concretamente, son monómeros en condiciones fisiológicas (por ejemplo, intracelulares), u oligomerizan en menor extensión que el tipo silvestre, por ejemplo, sin dímeros o trímeros en condiciones intracelulares. Como tales, son de particular interés los ácidos nucleicos que codifican versiones monoméricas de las proteínas de maduración rápida en cuestión. Es una variante monomérica representativa de las proteínas DsRed de maduración rápida descritas en la presente memoria el mutante denominado mRFP1 (proteína fluorescente roja monomérica) y descrito en Campbell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 11 de junio de 2002; 99 (12): 7877-7882. Este mutante específico contiene un total de 33 mutaciones respecto a DsRed, de las cuales 13 son internas del barril \beta (N42Q, V44A, V71A, K83L, F124L, L150M, K163M, V175A, F177V, S179T, V195T, S197I y T217A); 3 son mutaciones reductoras de la agregación de T1 (R2A, K5E y N6D), 3 son mutaciones de la interfase AB (1125R, V127T y I180T), 10 son mutaciones de la interfase AC (R153E, H162K, A164R, L174D, Y192A, Y194K, H222S, L223T, F224G y L225A), y 4 son mutaciones beneficiosas adicionales (T21S, H41T, C117E y V156A). Las secuencias de ácido nucleico y aminoacídica de esta proteína se han depositado en GENBANK y se les ha asignado el número de acceso AF506027.

Los ácidos nucleicos de la invención en cuestión pueden ser ADNc o ADN genómico o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención en cuestión incluyen uno o más de los marcos abiertos de lectura que codifican proteínas y polipéptidos fluorescentes específicos e intrones, así como secuencias nucleotídicas no codificantes 5' y 3' adyacentes implicadas en la regulación de la expresión, hasta aproximadamente 20 kb más allá de la región de codificación, pero posiblemente más en cualquier dirección. Los ácidos nucleicos en cuestión pueden introducirse en un vector apropiado para mantenimiento extracromosómico o para integración en un genoma hospedador, como se describe con más detalle a continuación.

El término "ADNc" como se usa en la presente memoria se pretende que incluya todos los ácidos nucleicos que comparten la disposición de elementos de secuencia encontrada en especies de ARNm maduro nativo, siendo los elementos de secuencia exones y regiones no codificantes 5' y 3'. Normalmente, las especies de ARNm tienen exones contiguos, con los intrones intermedios, cuando están presentes, eliminados mediante corte y empalme de ARN nuclear, creando un marco abierto de lectura continuo que codifica la proteína.

Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico presente entre el codón de inicio y el codón de terminación, como se define en las secuencias enumeradas, incluyendo todos los intrones que están normalmente presentes en un cromosoma nativo. Puede incluir adicionalmente regiones no traducidas 5' y 3' encontradas en ARNm maduro. Puede incluir adicionalmente secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales específicas tales como promotores, potenciadores, etc., incluyendo aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, ADN genómico flanqueante en el extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN genómico puede aislarse en forma de un fragmento de 100 kb o menos, y sustancialmente exento de secuencia cromosómica flanqueante. El ADN genómico que flanquea la región de codificación, 3' o 5', o las secuencias reguladoras internas como se encuentran a veces en intrones, contiene secuencias necesarias para una expresión específica de tejido y etapa apropiada.

Las composiciones de ácido nucleico de la invención en cuestión pueden codificar toda o parte de las proteínas en cuestión. Pueden obtenerse fragmentos bi- o monocatenarios a partir de la secuencia de ADN sintetizando químicamente oligonucleótidos según procedimientos convencionales, mediante digestión con enzima de restricción, amplificación por PCR, etc. Para la mayor parte, los fragmentos de ADN serán de al menos aproximadamente 15 nt, habitualmente al menos aproximadamente 18 nt o aproximadamente 25 nt, y pueden ser de al menos aproximadamente 50 nt. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico en cuestión pueden ser de aproximadamente 100 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 300 nt, aproximadamente 400 nt, aproximadamente 500 nt, aproximadamente 600 nt, aproximadamente 700 nt, o aproximadamente 720 nt de longitud. Los ácidos nucleicos en cuestión pueden codificar fragmentos de las proteínas en cuestión o las proteínas completas, por ejemplo, las proteínas en cuestión pueden codificar polipéptidos de aproximadamente 25 aa, aproximadamente 50 aa, aproximadamente 75 aa, aproximadamente 100 aa, aproximadamente 125 aa, aproximadamente 150 aa, aproximadamente 200 aa, aproximadamente 210 aa, aproximadamente 220 aa, aproximadamente 230 aa, o aproximadamente 240 aa, hasta la proteína completa.

Los ácidos nucleicos en cuestión se aíslan y obtienen con pureza sustancial, generalmente de forma distinta de un cromosoma intacto. Habitualmente, los ADN se obtendrán sustancialmente exentos de otras secuencias de ácido nucleico que no incluyan el ácido nucleico de la invención en cuestión o fragmento del mismo, generalmente siendo al menos aproximadamente un 50%, habitualmente al menos aproximadamente un 90% puros, y son típicamente "recombinantes", concretamente, flanqueados por uno o más nucleótidos con los que no están asociados normalmente en un cromosoma de origen natural.

Se proporcionan los polinucleótidos en cuestión (por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO 1), el correspondiente ADNc, el gen completo y constructos de los polinucleótidos en cuestión. Estas moléculas pueden generarse sintéticamente mediante una serie de diferentes protocolos conocidos por los expertos en la técnica. Se purifican constructos polinucleotídicos apropiados usando técnicas de ADN recombinante estándar como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, y según las regulaciones actuales descritas en United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) "Guidelines for Recombinant DNA Research".

Se proporcionan también ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de las proteínas en cuestión, o fragmentos de los mismos, que se fusionan con una segunda proteína, por ejemplo una secuencia de degradación, un péptido señal, etc. Por ejemplo, son de interés fusiones de las presentes proteínas con secuencias de degradación rápida, tales como las descritas en la patente de EE.UU. nº 6.306.600 (cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia), el dominio de degradación de ornitina descarboxilasa de ratón (MODC), que contiene una secuencia PEST. Se comercializa una proteína de fusión representativa de esta realización con el nombre "Destabilized DsRed-Express" por BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA). Las proteínas de fusión pueden comprender un polipéptido en cuestión, o fragmento del mismo, y un polipéptido no antozoario ("la pareja de fusión") fusionado en fase en el extremo N y/o extremo C del polipéptido en cuestión. Las parejas de fusión incluyen, pero sin limitación, polipéptidos que pueden unirse a un anticuerpo específico de la pareja de fusión (por ejemplo, marcadores epitópicos), anticuerpos o fragmentos de unión a los mismos, polipéptidos que proporcionan una función catalítica o inducen una respuesta celular, ligandos o receptores o miméticos de los mismos y similares. En dichas proteínas de fusión, la pareja de fusión no está generalmente asociada naturalmente con la porción antozoaria en cuestión de la proteína de fusión y típicamente no es una proteína antozoaria o derivado/fragmento de la misma, concretamente, no se encuentra en especies antozoarias.

Se proporcionan también constructos que comprenden los ácidos nucleicos en cuestión insertados en un vector, pudiendo usarse dichos constructos para una serie de diferentes aplicaciones, incluyendo propagación, producción de proteína, etc. Pueden prepararse y usarse vectores víricos y no víricos, incluyendo plásmidos. La elección del vector dependerá del tipo de célula en que se desee la propagación y del fin de la propagación. Ciertos vectores son útiles para amplificar y preparar grandes cantidades de la secuencia de ADN deseada. Otros vectores son adecuados para expresión en células en cultivo. Aún otros vectores son adecuados para transferencia y expresión en células en un animal o persona completo. La elección del vector apropiado está bien dentro de la experiencia de la técnica. Están disponibles comercialmente muchos de dichos vectores. Para preparar estos constructos, se inserta el polinucleótido parcial o completo en un vector típicamente mediante fijación por ADN ligasa a un sitio de enzima de restricción escindido en el vector. Como alternativa, la secuencia nucleotídica deseada puede insertarse mediante recombinación homóloga in vivo. Típicamente, esto se consigue fijando regiones de homología al vector en los flancos de la secuencia nucleotídica deseada. Se añaden regiones de homología mediante el ligamiento de oligonucleótidos, o mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores que comprenden tanto la región de homología como una porción de la secuencia nucleotídica deseada, por ejemplo. Los vectores específicos representativos de interés incluyen, pero sin limitación: vector pCMV-DsRed-Express; vector pDsRED-Express y vector pDsRed-Express-1, todos los cuales son comercializados por BD Biosciences Clontech (Palo Alto,
CA).

Se proporcionan también módulos o sistemas de expresión que encuentran uso, entre otras aplicaciones, en la síntesis de las proteínas en cuestión. Para la expresión, se expresa el producto génico codificado por un polinucleótido de la invención en cualquier sistema de expresión conveniente incluyendo, por ejemplo, sistemas bacterianos, de levadura, de insecto, de anfibio y mamífero. Se describen vectores y células hospedadoras adecuados en la patente de EE.UU. nº 5.654.173. En el vector de expresión, se liga un polinucleótido en cuestión, por ejemplo como se expone en la SEQ ID NO 1 ó 2, con una secuencia reguladora según sea apropiado para obtener las propiedades de expresión deseadas. Estas secuencias reguladoras pueden incluir promotores (fijados en el extremo 5' de la cadena codificante o en el extremo 3' de la cadena no codificante), potenciadores, terminadores, operadores, represores e inductores. Los promotores pueden ser regulados o constitutivos. En algunas situaciones, puede ser deseable usar promotores condicionalmente activos tales como promotores específicos de tejido o específicos de etapa de desarrollo. Esto se ligan a la secuencia nucleotídica deseada usando las técnicas descritas anteriormente para ligamiento a vectores. Puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica. En otras palabras, el vector de expresión proporcionará una región de inicio transcripcional y traduccional que puede ser inducible o constitutiva, estando la región de codificación ligada operativamente bajo el control transcripcional de la región de inicio transcripcional y una región de terminación transcripcional y traduccional. Estas regiones de control pueden ser nativas de la especie en cuestión de la que se obtiene el ácido nucleico en cuestión o pueden derivar de fuentes exógenas.

Los vectores de expresión tienen generalmente sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador seleccionable operativo en el hospedador de expresión. Los vectores de expresión pueden usarse, entre otras cosas, para la producción de proteínas de fusión como se describe anteriormente.

Pueden prepararse módulos de expresión que comprenden una región de inicio de la transcripción, el gen o fragmento del mismo, y una región de terminación transcripcional. Es de particular interés el uso de secuencias que permitan la expresión de epítopos o dominios funcionales, habitualmente de al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, más habitualmente de al menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, hasta aproximadamente 25 aminoácidos, y hasta el marco abierto de lectura completo del gen. Después de la introducción del ADN, pueden seleccionarse las células que contienen el constructo mediante un marcador seleccionable, expandirse las células y usarse entonces para expresión.

Los sistemas de expresión descritos anteriormente pueden emplearse con procariotas o eucariotas según modos convencionales, dependiendo del fin de la expresión. Para la producción a gran escala de la proteína, puede usarse un organismo unicelular tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores de baculovirus o células de un organismo superior tal como vertebrados, por ejemplo, células COS 7, HEK 293, CHO, ovocitos de Xenopus, etc., como células hospedadoras de expresión. En algunas situaciones, es deseable expresar el gen en células eucarióticas, beneficiándose la proteína expresada del plegamiento y modificaciones postraduccionales nativos. Pueden sintetizarse también péptidos pequeños en el laboratorio. Los polipéptidos que son subconjuntos de la secuencia proteica completa pueden usarse para identificar e investigar partes de la proteína importantes para la función.

Los sistemas de expresión específicos de interés incluyen sistemas de expresión derivados de células bacterianas, de levadura, de insecto y mamífero. Se proporcionan a continuación sistemas representativos de cada una de estas categorías:

Bacterias. Los sistemas de expresión en bacterias incluyen aquellos descritos en: Chang y col., Nature (1978) 275: 615; Goeddel y col., Nature (1979) 281: 544; Goeddel y col., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057; EP 0.036.776; patente de EE.UU. nº 4.551.433; DeBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80: 21-25 y Siebenlist y col., Cell (1980) 20: 269.

Levaduras. Los sistemas de expresión en levadura incluyen aquellos descritos en Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75: 1929; Ito y col., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz y col., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze y col., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp y col., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 302; Das y col., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt y col., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg y col., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze y col., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg y col., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; patentes de EE.UU. nº 4.837.148 y 4.929.555; Beach y Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow y col., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin y col., Curr. Genet. (1985) 10: 49; Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284-289; Tilburn y col., Gene (1983) 26: 205-221; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81: 1470-1474; Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479; EP 0.244.234 y WO 91/00357.

Células de insecto. La expresión de genes heterólogos en insectos se consigue como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.745.051; Friesen y col., "The Regulation of Baculovirus Gene expresión", en: "The Molecular Biology Of Baculoviruses" (1986) (W. Doerfler, ed.); EP 0.127.839; EP 0.155.476 y Vlak y col., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765-776; Miller y col., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell y col., Gene (1988) 73: 409; Maeda y col., Nature (1985) 315: 592-594; Lebacq-Verheyden y col., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82: 8844; Miyajima y col., Gene (1987) 58: 273 y Martin y col., DNA (1988) 7: 99. Se describen numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras de insecto permisivas de hospedadores en Luckow y col., Bio/Technology (1988) 6: 47-55, Miller y col., Generic Engineering (1986) 8: 277-279 y Maeda y col., Nature (1985) 315: 592-594.

Células de mamífero. Se consigue la expresión de mamífero como se describe en Dijkema y col., EMBO J. (1985) 4: 761, Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79: 6777, Boshart y col., Cell (1985) 41: 521 y la patente de EE.UU. nº 4.399.216. Se facilitan otros rasgos de expresión de mamífero como se describe en Ham y Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes y Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255, patentes de EE.UU. nº 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.4560.655, WO 90/103430, WO 87/00195 y U.S. RE 30.985.

Cuando cualquiera de las células hospedadoras anteriores, u otras células u organismos hospedadores apropiados, se usan para replicar y/o expresar los polinucleótidos o ácidos nucleicos de la invención, el ácido nucleico replicado resultante, ARN, proteína o polipéptido expresado, está dentro del alcance de la invención como producto de la célula u organismo hospedador. El producto se recupera mediante cualquier medio apropiado conocido en la
técnica.

Una vez se identifica el gen correspondiente a un polinucleótido seleccionado, puede regularse su expresión en la célula de la que el gen es nativo. Por ejemplo, un gen endógeno de una célula puede regularse mediante una secuencia reguladora exógena insertada en el genoma de la célula en una localización suficiente para potenciar al menos la expresión del gen en la célula. La secuencia reguladora puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación homóloga, como se da a conocer en las patentes de EE.UU. nº 5.641.670 y 5.733.761, o puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación no homóloga, como se describe en el documento WO 99/15650, cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia. Como tal, se comprende también en la invención en cuestión la producción de proteínas en cuestión sin manipulación del ácido nucleico codificante mismo, sino en lugar de ello mediante integración de una secuencia reguladora en el genoma de célula que ya incluye un gen que codifica la proteína deseada, como se describe en los documentos de patente incorporados anteriormente.

Se proporcionan también homólogos de los ácidos nucleicos en cuestión. Los homólogos se identifican mediante cualquiera de una serie de procedimientos. Puede usarse un fragmento del ADNc proporcionado como sonda de hibridación frente a una colección de ADNc del organismo diana de interés, usando condiciones de bajo rigor. La sonda puede ser un fragmento grande o uno o más cebadores degenerados cortos. Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan mediante hibridación en condiciones de bajo rigor, por ejemplo, a 50ºC y 6 x SSC (cloruro de sodio 0,9 M/citrato de sodio 0,09 M) y permanecen unidos cuando se someten a lavado a 55ºC en 1 x SSC (cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,015 M). La identidad de secuencia puede determinarse mediante hibridación en condiciones rigurosas, por ejemplo a 50ºC o más y con 0,1 x SSC (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Los ácidos nucleicos que tienen una región de identidad sustancial con las secuencias proporcionadas, por ejemplo, variantes alélicas, versiones alteradas genéticamente del gen, etc., se unen a las secuencias proporcionadas en condiciones de hibridación rigurosas. Usando sondas, particularmente sondas marcadas de secuencias de ADN, se pueden aislar homólogos o genes relacionados.

Son también de interés los elementos promotores de las secuencias genómicas en cuestión, pudiendo utilizarse la secuencia de la región 5' flanqueante para elementos promotores, incluyendo sitios de unión potenciadores, por ejemplo, que proporcionan la regulación de la expresión en células/tejidos cuando se expresan los genes de las proteínas en cuestión en células/tejido.

Se proporcionan también fragmentos de ADN pequeños de los ácidos nucleicos en cuestión, siendo útiles dichos fragmentos como cebadores para PCR, sondas de cribado de hibridación, etc. Los fragmentos de ADN más grandes, concretamente mayores de 100 nt, son útiles para la producción del polipéptido codificado, como se describe en la sección anterior. Para uso en reacciones de amplificación geométrica, tales como PCR geométrica, se usará un par de cebadores. La composición exacta de las secuencias cebadoras no es crítica para la invención, pero para la mayoría de aplicaciones los cebadores hibridarán con la secuencia en cuestión en condiciones rigurosas, como es conocido en la técnica. Es preferible elegir un par de cebadores que generarán un producto de amplificación de al menos aproximadamente 50 nt, preferiblemente al menos aproximadamente 100 nt. Los algoritmos para la selección de secuencias cebadoras son generalmente conocidos, y están disponibles en paquetes de software comercial. Los cebadores de amplificación hibridan con cadenas complementarias de ADN y se cebarán entre sí.

El ADN puede usarse también para identificar la expresión del gen en un espécimen biológico. La manera en que se sondea en células la presencia de secuencias nucleotídicas particulares, como ADN genómico o ARN, está bien establecida en la bibliografía. Brevemente, se aísla ADN o ARNm de una muestra celular. El ARNm puede amplificarse mediante PCR-FI, usando transcriptasa inversa para formar una cadena de ADN complementaria, seguido de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos de las secuencias de ADN en cuestión. Como alternativa, se separa la muestra de ARNm mediante electroforesis en gel, se transfiere a un soporte adecuado, por ejemplo nitrocelulosa, nailon, etc., y se sondea después con un fragmento del ADN en cuestión como sonda. Otras técnicas, tales como ensayos de ligamiento de oligonucleótido, hibridaciones in situ e hibridación con sondas de ADN dispuestas sobre un chip sólido, pueden encontrar también uso. La detección de hibridación de ARNm con la secuencia en cuestión es indicativa de expresión de gen de proteína antozoaria en la muestra.

Los ácidos nucleicos en cuestión, incluyendo regiones promotoras flanqueantes y regiones de codificación, pueden mutarse de diversos modos conocidos en la técnica, generando cambios orientados en la fuerza del promotor, la secuencia de la proteína codificada, las propiedades de la proteína codificada, incluyendo propiedades fluorescentes de la proteína codificada, etc. La secuencia de ADN o producto proteico de dicha mutación será habitualmente sustancialmente similar a las secuencias proporcionadas en la presente memoria, por ejemplo, diferirá en al menos un nucleótido o aminoácido, respectivamente, y puede diferir en al menos 2 pero no más de aproximadamente 10 nucleótidos o aminoácidos. Los cambios de secuencia pueden ser sustituciones, inserciones, deleciones o una combinación de las mismas. Las deleciones pueden incluir adicionalmente cambios mayores tales como deleciones de un dominio o exón, por ejemplo, de extensiones de 10, 20, 50, 75, 100, 150 o más residuos aminoacídicos. Son conocidas las técnicas para mutagénesis in vitro de genes clonados. Pueden encontrarse ejemplos de protocolos de mutagénesis específica de sitio en Gustin y col. (1993), Biotechniques 14: 22; Barany (1985), Gene 37: 111-23; Colicelli y col. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 537-9 y Prentki y col. (1984), Gene 29: 303-13. Pueden encontrarse procedimientos para mutagénesis específica de sitio en Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSH Press 1989, pág. 15.3-15.108; Weiner y col. (1993), Gene 126: 35-41; Sayers y col. (1992), Biotechniques 13: 592-6; Jones y Winistorfer (1992), Biotechniques 12: 528-30; Barton y col. (1990), Nucleic Acids Res. 18: 7349-55; Marotti y Tomich (1989), Gene Anal. Tech. 6: 67-70 y Zhu (1989), Anal. Biochem. 177: 120-4. Dichos derivados de ácido nucleico mutados pueden usarse para estudiar las relaciones de estructura-función de una proteína cromo/fluorescente particular o para alterar las propiedades de la proteína que afectan a su función o regulación.

Son también de interés versiones humanizadas de los ácidos nucleicos en cuestión. Como se usa en la presente memoria, el término "humanizado" designa cambios realizados en la secuencia de ácido nucleico para optimizar los codones de expresión de la proteína en células humanas (Yang y col., Nucleic Acids Research 24 (1996), 4592-4593). Véase también la patente de EE.UU. nº 5.795.737, que describe la humanización de proteínas.

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Composiciones de proteína/polipéptido

Se proporcionan también por la invención en cuestión proteínas cromo- y/o fluorescentes de maduración rápida y mutantes de las mismas, así como composiciones polipeptídicas relacionadas con las mismas. Cuando las proteínas en cuestión son cromoproteínas, son proteínas coloreadas, que pueden ser fluorescentes, poco fluorescentes o no fluorescentes. Como se usan en la presente memoria, los términos cromoproteína y proteína fluorescente no incluyen luciferasas tales como luciferasa de Renilla y designan cualquier proteína que esté pigmentada o coloreada y/o que tenga fluorescencia cuando se irradia con luz, por ejemplo, luz blanca o luz de una longitud de onda específica (o banda estrecha de longitudes de onda tal como una longitud de onda de excitación). El término composición polipeptídica como se usa en la presente memoria designa tanto la proteína completa como porciones o fragmento de la misma. Se incluyen también en este término variaciones de la proteína de origen natural, siendo dichas variaciones homólogas o sustancialmente similares a la proteína de origen natural, y mutantes de las proteínas de origen natural, como se describe con más detalle a continuación. Los polipéptidos en cuestión están presentes en un entorno diferente del suyo natural.

En muchas realizaciones, los espectros de excitación de las proteínas en cuestión están típicamente en el intervalo de aproximadamente 300 a 700, habitualmente de aproximadamente 350 a 650 y más habitualmente de aproximadamente 400 a 600 nm, mientras que los espectros de emisión de las proteínas en cuestión están típicamente en el intervalo de aproximadamente 400 a 800, habitualmente de aproximadamente 425 a 775 y más habitualmente de aproximadamente 450 a 750 nm. Las proteínas en cuestión tienen generalmente un coeficiente de extinción máximo que está en el intervalo de aproximadamente 10.000 a 55.000 y habitualmente de aproximadamente 15.000 a 55.000. Las proteínas en cuestión están típicamente en el intervalo de longitud de aproximadamente 150 a 300 y habitualmente de aproximadamente 200 a 300 residuos aminoacídicos, y generalmente tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15 a 35 kDa, habitualmente de aproximadamente 17,5 a 32,5 kDa.

En ciertas realizaciones, las proteínas en cuestión son brillantes, entendiéndose por brillante que las cromoproteínas y sus mutantes fluorescentes puedan detectarse mediante procedimientos comunes (por ejemplo, cribado visual, espectrofotometría, espectrofluorometría, microscopia fluorescente, máquinas de FACS, etc.). El brillo de fluorescencia de proteínas fluorescentes particulares se determina mediante su rendimiento cuántico multiplicado por el coeficiente de extinción máximo. El brillo de la cromoproteína puede expresarse por su coeficiente de extinción máximo.

En ciertas realizaciones, las proteínas en cuestión se pliegan rápidamente después de la expresión en la célula hospedadora. Por plegamiento rápido se entiende que las proteínas alcanzan su estructura terciaria que da lugar a su calidad cromo- o fluorescente en un periodo corto de tiempo. En estas realizaciones, las proteínas se pliegan en un periodo de tiempo que generalmente no supera aproximadamente 3 días, habitualmente no supera aproximadamente 2 días y más habitualmente no supera aproximadamente 1 día. Las proteínas específicas de interés incluyen variantes de maduración rápida de DsRed, que maduran al menos aproximadamente 5 veces más rápido, a veces al menos aproximadamente 10 veces más rápido, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 veces más rápido que la correspondiente proteína DsRed de tipo silvestre. Las proteínas ejemplares de esta realización específica incluyen aquellas descritas en la sección experimental a continuación, por ejemplo, DsRed.T1, DsRed.T3 y DsRedT4.

Se proporcionan también homólogos o proteínas (o fragmentos de las mismas) que varían en secuencia de las secuencias aminoacídicas específicas anteriormente proporcionadas de la invención en cuestión. Por homólogo, se entiende una proteína que tiene al menos aproximadamente un 10%, habitualmente al menos aproximadamente un 20% y más habitualmente al menos aproximadamente un 30%, y en muchas realizaciones al menos aproximadamente un 35%, habitualmente al menos aproximadamente un 40%, y más habitualmente al menos aproximadamente un 60% de identidad de secuencia aminoacídica con la proteína de la invención en cuestión, como se determina usando MegAlign, algoritmo Clustal de DNAstar (1998) como se describe en D. G. Higgins y P.M. Sharp, "Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer", (1989) CABIOS, 5: 151-153. (Los parámetros usados son ktuple 1, penalización de hueco 3, ventana 5 y diagonales evitadas 5). En muchas realizaciones, los homólogos de interés tienen una identidad de secuencia mucho mayor, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o mayor.

Se proporcionan también proteínas que son sustancialmente idénticas a las proteínas descritas específicamente en la presente memoria, entendiéndose por sustancialmente idéntico que la proteína tiene una identidad de secuencia aminoacídica con la proteína de referencia de al menos aproximadamente un 60%, habitualmente al menos aproximadamente un 65% y más habitualmente al menos aproximadamente un 70%, pudiendo ser en algunos casos la identidad mucho mayor, por ejemplo, de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor.

En muchas realizaciones, los homólogos en cuestión tienen rasgos estructurales encontrados en las secuencias específicas proporcionadas anteriormente, incluyendo dichos rasgos estructurales el plegamiento de barril \beta.

Se proporcionan también proteínas que son mutantes de las proteínas descritas específicamente en la presente memoria. Los mutantes pueden retener las propiedades biológicas de las proteínas de tipo silvestre (por ejemplo, de origen natural) o pueden tener propiedades biológicas que difieren de las proteínas de tipo silvestre. El término "propiedad biológica" de las proteínas en cuestión incluye, pero sin limitación, propiedades espectrales tales como máximo de absorbancia, máximo de emisión, coeficiente de extinción máximo, brillo (por ejemplo, en comparación con la proteína de tipo silvestre u otra proteína de referencia tal como proteína fluorescente verde de A. victoria) y similares, estabilidad in vivo y/o in vitro (por ejemplo, semivida), etc. Los mutantes incluyen cambios aminoacídicos individuales, deleciones de uno o más aminoácidos, truncamientos N-terminales, truncamientos C-terminales, inserciones, etc.

Los mutantes pueden generarse usando técnicas estándar de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis aleatoria y mutagénesis dirigida. Se describen varios mutantes en la presente memoria. Dada la guía proporcionada en los ejemplos, y usando técnicas estándar, los expertos en la técnica pueden generar fácilmente una amplia variedad de mutantes adicionales y ensayar si se ha alterado una propiedad biológica. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia puede medirse usando un espectrofotómetro a diversas longitudes de onda de excitación.

Aquellas proteínas de la invención en cuestión que son proteínas de origen natural están presentes en un entorno de origen no natural, por ejemplo, están separadas de su entorno de origen natural. En ciertas realizaciones, las proteínas en cuestión están presentes en una composición que está enriquecida en la proteína en cuestión en comparación con su entorno de origen natural. Por ejemplo, se proporciona proteína purificada, entendiéndose por purificada que la proteína está presente en una composición que está sustancialmente exenta de proteínas no cromo/fluoroproteínas de interés, entendiéndose por sustancialmente exenta que menos de un 90%, habitualmente menos de un 60% y más habitualmente menos de un 50% de la composición está compuesta por no cromoproteínas o mutantes de las mismas de interés. Las proteínas de la invención en cuestión pueden estar también presentes en forma de aislamiento, por el que se entiende que la proteína está sustancialmente exenta de otras proteínas y otras moléculas biológicas de origen natural tales como oligosacáridos, polinucleótidos y fragmentos de los mismos y similares, significando el término "sustancialmente exento" en este caso que menos de un 70%, habitualmente menos de un 60% y más habitualmente menos de un 50% de la composición que contiene la proteína aislada es alguna otra molécula biológica de origen natural. En ciertas realizaciones, las proteínas están presentes en forma sustancialmente pura, entendiéndose por "forma sustancialmente pura" al menos un 95%, habitualmente al menos un 97% y más habitualmente al menos un 99% pura.

Además de las proteínas específicamente descritas en la presente memoria, se proporcionan también polipéptidos que varían a partir de estas proteínas, por ejemplo, las proteínas mutantes descritas anteriormente. Generalmente, dichos polipéptidos incluyen una secuencia aminoacídica codificada por un marco abierto de lectura (ORF) del gen que codifica la proteína de tipo silvestre en cuestión, incluyendo la proteína completa y fragmentos de la misma, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales y similares; e incluyendo fusiones de los polipéptidos en cuestión con otras proteínas o partes de las mismas. Los fragmentos de interés serán típicamente de al menos aproximadamente 10 aa de longitud, habitualmente de al menos aproximadamente 50 aa de longitud, y pueden ser del orden de 300 aa de longitud o mayores, pero habitualmente no superarán aproximadamente 1000 aa de longitud, en los que el fragmento tendrá una extensión de aminoácidos que es idéntica a la proteína en cuestión de al menos aproximadamente 10 aa, y habitualmente al menos aproximadamente 15 aa y en muchas realizaciones de al menos aproximadamente 50 aa de longitud. En algunas realizaciones, los polipéptidos en cuestión son de aproximadamente 25 aa, aproximadamente 50 aa, aproximadamente 75 aa, aproximadamente 100 aa, aproximadamente 125 aa, aproximadamente 150 aa, aproximadamente 200 aa, aproximadamente 210 aa, aproximadamente 220 aa, aproximadamente 230 aa o aproximadamente 240 aa de longitud, hasta la proteína entera. En algunas realizaciones, un fragmento de proteína retiene toda o sustancialmente toda la propiedad biológica de la proteína de tipo silvestre.

Las proteínas y polipéptidos en cuestión pueden obtenerse a partir de fuentes de origen natural o producirse sintéticamente. Por ejemplo, las proteínas de tipo silvestre pueden derivar de fuentes biológicas que expresan las proteínas, por ejemplo, especies de cnidarios no bioluminiscentes, por ejemplo, antozoarios, tales como las específicas enumeradas anteriormente. Las proteínas en cuestión pueden derivarse también por medios sintéticos, por ejemplo, expresando un gen recombinante o secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés en un hospedador adecuado, como se describe anteriormente. Puede emplearse cualquier procedimiento de purificación de proteína conveniente, describiéndose las metodologías de purificación de proteína adecuadas en "Guide to Protein Purification" (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Por ejemplo, puede prepararse un lisado a partir de la fuente original y purificarse usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel y similares.

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Composiciones de anticuerpo

Se proporcionan también anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas fluorescentes en cuestión. Los anticuerpos adecuados se obtienen inmunizando un animal hospedador con péptidos que comprenden toda o una porción de la proteína en cuestión. Los animales hospedadores adecuados incluyen ratón, rata, oveja, cabra, hámster, conejo, etc. El origen del inmunógeno proteico será generalmente una especie de cnidario, específicamente una especie de cnidario no bioluminiscente, tal como una especie antozoaria o una especie antozoaria no penatulácea. El animal hospedador será generalmente de una especie diferente del inmunógeno, por ejemplo, ratón, etc.

El inmunógeno puede comprender la proteína completa o fragmentos o derivados de la misma. Los inmunógenos preferidos comprenden toda o parte de la proteína, conteniendo estos residuos las modificaciones postraduccionales encontradas en la proteína diana nativa. Los inmunógenos se producen en una variedad de modos conocidos en la técnica, por ejemplo, expresión de genes clonados usando procedimientos recombinantes convencionales, aislamiento de especies de origen antozoario, etc.

Para la preparación de anticuerpos policlonales, la primera etapa es la inmunización del animal hospedador con la proteína diana, en la que la proteína diana estará preferiblemente en forma sustancialmente pura, que comprende menos de aproximadamente un 1% de contaminantes. El inmunógeno puede comprender la proteína diana completa, fragmentos o derivados de la misma. Para aumentar la respuesta inmunitaria del animal hospedador, la proteína diana puede combinarse con un coadyuvante, incluyendo los coadyuvantes adecuados alúmina, dextrano, sulfato, aniones poliméricos grandes, emulsiones de aceite y agua, por ejemplo, coadyuvante de Freund, coadyuvante completo de Freund y similares. La proteína diana puede conjugarse también con proteínas vehículo sintéticas o antígenos sintéticos. Puede inmunizarse una variedad de hospedadores para producir los anticuerpos policlonales: dichos hospedadores incluyen conejos, conejillos de Indias, roedores, por ejemplo ratones y ratas, ovejas, cabras y similares. La proteína diana se administra al hospedador, habitualmente por vía intradérmica, a una dosificación inicial seguida de una o más, habitualmente al menos dos, dosificaciones de recuerdo adicionales. Después de la inmunización, se recogerá la sangre del hospedador, seguido de separación del suero de las células sanguíneas. La Ig presente en el antisuero resultante puede fraccionarse adicionalmente usando procedimientos conocidos tales como fraccionamiento con sal de amonio, cromatografía en DEAE y similares.

Los anticuerpos monoclonales se producen mediante técnicas convencionales. Generalmente, el bazo y/o los nódulos linfáticos de un animal hospedador inmunizado proporcionan una fuente de células plasmáticas. Se inmortalizan las células plasmáticas mediante fusión con células de mieloma para producir células de hibridoma. Se criba el sobrenadante de cultivo de hibridomas individuales usando técnicas estándar para producir células de hibridoma. Se criba el sobrenadante de cultivo de hibridomas individuales usando técnicas estándar para identificar a aquellos que producen anticuerpos con la especificidad deseada. Los animales adecuados para la producción de anticuerpos monoclonales de proteína humana incluyen ratón, rata, hámster, etc. Para crear anticuerpos contra proteína de ratón, el animal será generalmente un hámster, conejillo de Indias, conejo, etc. El anticuerpo puede purificarse de los sobrenadantes de célula de hibridoma o fluido ascítico mediante técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando proteína unida a un soporte insoluble, Sepharose de proteína A, etc.

El anticuerpo puede producirse en forma monocatenaria, en lugar de la estructura multimérica normal. Se describen anticuerpos monocatenarios en Jost y col. (1994) J.B.C. 269: 26267-73 y otros. Las secuencias de ADN que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están ligados a un espaciador que codifica al menos aproximadamente 4 aminoácidos de aminoácidos neutros pequeños, incluyendo glicina y/o serina. La proteína codificada por esta fusión permite el ensamblado de una región variable funcional que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo original.

Son también de interés en ciertas realizaciones anticuerpos humanizados. Los procedimientos de humanización de anticuerpos son conocidos en la técnica. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un animal que tiene genes de región constante de inmunoglobulina humana transgénica (véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional WO 90/10077 y WO 90/04036). Como alternativa, el anticuerpo de interés puede modificarse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1, CDH2, CH3, bisagra y/o el dominio de marco estructural por la correspondiente secuencia humana (véase el documento WO 92/02190).

Es conocido en la técnica el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quimérica (Liu y col. (1987) P.N.A.S. 84: 3439 y (1987) J. Immunol. 139: 3521). Se aísla ARNm de un hibridoma u otra célula productora del anticuerpo y se usa para producir ADNc. El ADNc de interés puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202). Como alternativa, se prepara una colección y se criba para aislar la secuencia de interés. Se fusiona entonces la secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo con secuencias de región constante humana. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat y col. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", publicación N.I.H. nº 91-3242. Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles a partir de clones conocidos. La elección del isotipo estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación del complemento o actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgG1, IgG3 e IgG4. Puede usarse cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humana, kappa o lambda. Se expresa entonces el anticuerpo humanizado quimérico mediante procedimientos convencionales.

Pueden prepararse fragmentos de anticuerpo tales como Fv, F(ab')_{2} y Fab mediante escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante escisión con proteasa o química. Como alternativa, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab')_{2} incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región de bisagra de la cadena H, seguidas de un codón de terminación traduccional para proporcionar la molécula truncada.

Las secuencias consenso de regiones H, L y J pueden usarse para diseñar oligonucleótidos para uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para ligamiento posterior de segmentos de la región V con segmentos de la región C humana. El ADNc de la región C puede modificarse mediante mutagénesis dirigida a sitio para disponer un sitio de restricción en la posición análoga de la secuencia humana.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YAC, episomas derivados de EBV y similares. Es un vector conveniente aquel que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados modificados por ingeniería genética de tal modo que pueda insertarse y expresarse fácilmente cualquier secuencia de VH o VL: en dichos vectores aparece habitualmente corte y empalme entre el sitio donante de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que aparecen en los exones de CH humana. La poliadenilación y terminación de la transcripción aparecen en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones de codificación. El anticuerpo quimérico resultante puede unirse a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTR retrovíricos, por ejemplo, el promotor temprano de SV-40 (Okayama y col. (1983) Mol. Cell. Bio. 3: 280), LTR de virus del sarcoma de Rous (Gorman y col. (1982) P.N.A.S. 79: 6777) y LTR de virus de leucemia de murino de Moloney (Grosschedl y col. (1985) Cell 41: 885), promotores de Ig nativos, etc.

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Transgénicos

Los ácidos nucleicos en cuestión pueden usarse para generar plantas o animales no humanos transgénicos o modificaciones génicas específicas de sitio en líneas celulares. Las células transgénicas de la invención en cuestión incluyen uno o más ácidos nucleicos según la invención en cuestión presentes en forma de un transgén, incluyéndose en esta definición las células originales transformadas para incluir el transgén y la progenie del mismo. En muchas realizaciones, las células transgénicas son células que normalmente no albergan ni contienen un ácido nucleico según la invención en cuestión. En aquellas realizaciones en que las células transgénicas contienen naturalmente los ácidos nucleicos en cuestión, el ácido nucleico estará presente en una posición distinta de su localización natural, concretamente, integrado en el material genómico de la célula en una localización no natural. Pueden prepararse animales transgénicos mediante recombinación homóloga, alterándose el locus endógeno. Como alternativa, se integra aleatoriamente un constructo de ácido nucleico en el genoma. Los vectores para integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YAC y similares.

Los organismos transgénicos de la invención en cuestión incluyen células y organismos multicelulares, por ejemplo, plantas y animales, que son inactivaciones génicas endógenas en las que la expresión del gen endógeno está al menos reducida si no eliminada. Los organismos transgénicos de interés incluyen también células y organismos multicelulares, por ejemplo, plantas y animales, en los que se expresa la proteína o variantes de la misma en células o tejidos en que normalmente no se expresa y/o a niveles normalmente no presentes en dichas células o tejidos.

Los constructos de ADN para recombinación homóloga comprenderán al menos una porción del gen de la invención en cuestión, teniendo el gen la(s) modificación(es) genética(s) deseada(s) e incluyendo regiones de homología con el locus diana. Los constructos de ADN para integración aleatoria no tienen que incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Convenientemente, se incluyen marcadores para selección positiva y negativa. Los procedimientos para generar células que tienen modificaciones génicas orientadas mediante recombinación homóloga son conocidos en la técnica. Para diversas técnicas para transfectar células de mamífero, véase Keown y col. (1990), Meth. Enzymol. 185: 527-537.

Para embriocitoblastos (ES), puede emplearse una línea celular de ES o pueden obtenerse células embrionarias recientes de un hospedador, por ejemplo, ratón, rata, conejillo de Indias, etc. Dichas células se cultivan en una capa de alimentación de fibroblastos apropiada o se cultivan en presencia de factor inhibidor de la leucemia (LIF). Cuando se han transformado ES o células embrionarias, pueden usarse para producir animales transgénicos. Después de la transformación, se siembran las células en una capa de alimentación en un medio apropiado. Las células que contienen el constructo pueden detectarse empleando un medio selectivo. Después de un tiempo suficiente para que crezcan colonias, se toman y se analiza la aparición de recombinación homóloga o integración del constructo. Aquellas colonias que son positivas pueden usarse entonces para manipulación embrionaria e inyección de blastoquiste. Los blastoquistes se obtienen a partir de hembras superovuladas de 4 a 6 semanas de edad. Se tripsinizan las células ES y se inyectan las células modificadas en el blastocele del blastoquiste. Después de la inyección, se devuelven los blastoquistes a cada cuerno uterino de hembras seudopreñadas. Se dejan llegar a término entonces las hembras y se criba en la descendencia resultante el constructo. Al proporcionar un diferente fenotipo del blastoquiste y las células modificadas genéticamente, la progenie quimérica puede detectarse fácilmente.

Se criba en los animales quiméricos la presencia del gen modificado y se emparejan los machos y hembras que tienen la modificación para producir progenie homocigótica. Si las alteraciones génicas causan letalidad en algún punto del desarrollo, los tejidos u órganos pueden mantenerse como injertos alogénicos o congénicos o transplantes, o cultivo in vitro. Los animales transgénicos pueden ser cualquier mamífero no humano, tal como animales de laboratorio, animales domésticos, etc. Los animales transgénicos pueden usarse en estudios funcionales, cribado de medicamentos, etc. Los ejemplos representativos del uso de animales transgénicos incluyen aquellos descritos a continuación.

Las plantas transgénicas pueden producirse de manera similar. Se describen procedimientos de preparación de células de planta y plantas transgénicas en las patentes de EE.UU. nº 5.767.367, 5.750.870, 5.739.409, 5.689.049, 5.689.045, 5.674.731, 5.656.466, 5.633.155, 5.629.470, 5.595.896, 5.576.198, 5.538.879, 5.484.956. Se revisan también procedimientos de producción de plantas transgénicas en "Plant Biochemistry and Molecular Biology" (ed. Lea & Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pág. 275-295. Brevemente, se recoge una célula o tejido de planta adecuado, dependiendo de la naturaleza de la especie de planta. Como tal, en ciertos casos, se aislarán protoplastos, pudiendo aislarse dichos protoplastos de una variedad de tejidos de planta diferentes, por ejemplo, hoja, hipocotilo, raíz, etc. Para el aislamiento de protoplastos, se incuban las células recogidas en presencia de celulasas para retirar la pared celular, variando las condiciones exactas de incubación dependiendo del tipo de planta y/o tejido del que deriva la célula. Se separan entonces los protoplastos resultantes del desecho celular resultante mediante tamizado y centrifugación. En lugar de usar protoplastos, pueden usarse explantes embriogénicos que comprenden células somáticas para la preparación del hospedador transgénico. Después de la recogida de célula o tejido, se introduce ADN exógeno de interés en las células de planta, estando disponible una variedad de técnicas diferentes para dicha introducción. Con protoplastos aislados, surge la oportunidad de introducción mediante protocolos de transferencia génica mediada por ADN incluyendo: incubación de protoplastos con ADN desnudo, por ejemplo, plásmidos que comprenden la secuencia de codificación exógena de interés en presencia de cationes polivalentes, por ejemplo, PEG o PLO; y electroporación de los protoplastos en presencia de ADN desnudo que comprende la secuencia exógena de interés. Se seleccionan entonces los protoplastos que han incorporado exitosamente el ADN exógeno, se cultivan en un tejido calloso y por último en una planta transgénica mediante contacto con las cantidades y relaciones apropiadas de factores estimulantes, por ejemplo, auxinas y citocininas. Con explantes embriogénicos, es un procedimiento conveniente de introducción del ADN exógeno en las células somáticas diana mediante el uso de aceleración de partículas o "pistola génica". Se dejan cultivar entonces los explantes resultantes en plantas quiméricas, se cruzan y se obtiene la progenie transgénica. En lugar de los enfoques de ADN desnudo descritos anteriormente, es otro procedimiento conveniente de producción de plantas transgénicas la transformación mediada por Agrobacterium. Con la transformación mediada por Agrobacterium, se preparan vectores cointegrativos o binarios que comprenden el ADN exógeno y se introducen entonces en una cepa de Agrobacterium apropiada, por ejemplo, A. tumefaciens. Se incuban entonces las bacterias resultantes con protoplastos preparados o explantes de tejido, por ejemplo, discos de hoja, y se produce un tejido calloso. Se cultiva entonces un tejido calloso en condiciones selectivas, se selecciona y se somete a medio de crecimiento para inducir el crecimiento de raíz y brotes para producir por último una planta transgénica.

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Utilidad

Las cromoproteínas y mutantes fluorescentes de las mismas en cuestión encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones, difiriendo las aplicaciones necesariamente dependiendo de si la proteína es una cromoproteína o una proteína fluorescente. Se describirán a continuación los usos representativos para cada uno de estos tipos, siendo los usos descritos a continuación meramente representativos y no significando en modo alguno que limitan el uso de las proteínas en cuestión a las descritas a continuación.

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Chromoproteínas

Las cromoproteínas en cuestión de la presente invención encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones. Es una aplicación de interés el uso de las proteínas en cuestión como agentes colorantes que son capaces de conferir color o pigmento a una composición de materia particular. Son de interés particular en ciertas realizaciones las cromoproteínas no tóxicas. Las cromoproteínas en cuestión pueden incorporarse a una variedad de diferentes composiciones de materia, incluyendo las composiciones de materia representativas: composiciones alimentarias, productos farmacéuticos, cosméticos, organismos vivos, por ejemplo, animales y plantas, y similares. Cuando se usa como agente colorante o pigmento, se incorpora una cantidad suficiente de cromoproteína a la composición de materia para conferirle el color o pigmento deseado a la misma. La cromoproteína puede incorporarse a la composición de materia usando cualquier protocolo conveniente, en el que el protocolo particular empleado dependerá necesariamente, al menos en parte, de la naturaleza de la composición de materia a colorear. Los protocolos que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación: mezclado, difusión, fricción, pulverización, inyección, tatuado y
similares.

Las cromoproteínas pueden encontrar uso como marcadores en ensayos de detección de analitos, por ejemplo, ensayos para analitos biológicos de interés. Por ejemplo, las cromoproteínas pueden incorporarse a aductos con anticuerpos específicos de analito o fragmentos de unión de los mismos, y emplearse posteriormente en inmunoensayos para analitos de interés en una muestra compleja, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.302.536, cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia. En lugar de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, las cromoproteínas o fragmentos cromogénicos de los mismos pueden conjugarse con ligandos que se unen específicamente a un analito de interés, u otros restos, factores de crecimiento, hormonas y similares; como es fácilmente evidente para los expertos en la técnica.

En aún otras realizaciones, las cromoproteínas en cuestión pueden usarse como marcadores seleccionables en aplicaciones de ADN recombinante, por ejemplo, en la producción de células y organismos transgénicos como se describen anteriormente. Como tales, puede modificarse por ingeniería genética un protocolo de producción transgénica particular para emplear la expresión de cromoproteínas en cuestión como marcador seleccionable, para un protocolo exitoso o no exitoso. Por tanto, la apariencia del color de la cromoproteína en cuestión en el fenotipo del organismo transgénico producido mediante un proceso particular puede usarse para indicar que el organismo particular alberga exitosamente el transgén de interés, a menudo integrado de manera que proporcione la expresión del transgén en el organismo. Cuando se usa un marcador seleccionable, puede emplearse un ácido nucleico que codifica la cromoproteína en cuestión en el proceso de generación del transgénico, describiéndose este proceso con más detalle anteriormente. Los organismos transgénicos particulares de interés, en los que pueden emplearse las proteínas en cuestión como marcadores seleccionables, incluyen plantas, animales, bacterias, hongos y similares
transgénicos.

En aún otras realizaciones, las cromoproteínas de la invención en cuestión (y proteínas fluorescentes) encuentran uso en filtros solares como filtros selectivos, etc., de manera similar a los usos de las proteínas descritos en el documento WO 00/46233.

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Proteínas fluorescentes

Las proteínas fluorescentes en cuestión de la presente invención (así como otros componentes de la invención en cuestión descritos anteriormente) encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo dichas aplicaciones, pero sin limitación, las siguientes. La primera aplicación de interés es el uso de las proteínas en cuestión en aplicaciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En estas aplicaciones, las proteínas en cuestión sirven como donantes y/o aceptores en combinación con una segunda proteína fluorescente o tinte, por ejemplo, una proteína fluorescente como se describe en Matz y col., Nature Biotechnology (octubre de 1999) 17: 969-973, una proteína fluorescente verde de Aequoria victoria o mutante fluorescente de la misma, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. nº 6.066.476, 6.020.192, 5.985.577, 5.976.796, 5.968.750, 5.968.738, 5.958.713, 5.919.445, 5.874.304, otros tintes fluorescentes, por ejemplo cumarina y sus derivados, por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina, tintes de Bodipy tales como Bodipy FL, azul de cascada, fluoresceína y sus derivados, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, verde Oregón, tintes de rodamina, por ejemplo, rojo Tejas, tetrametilrodamina, eosinas y eritrosinas, tintes de cianina, por ejemplo, Cy3 y Cy5, quelatos macrocíclicos de iones lantánidos, por ejemplo, tinte Quantum, etc., tintes quimioluminiscentes, por ejemplo luciferasas, incluyendo aquellas descritas en las patentes de EE.UU. nº 5.843.746, 5.700.673, 5.674.713, 5.618.722, 5.418.155, 5.330.906, 5.229.285, 5.221.623, 5.182.202. Los ejemplos específicos en los que pueden usarse ensayos FRET que emplean las proteínas fluorescentes en cuestión incluyen, pero sin limitación: la detección de interacciones proteína-proteína, por ejemplo, sistema de dos híbridos de mamífero, dimerización del factor de transcripción, multimerización de la proteína de membrana, formación de complejo de multiproteína, etc., como biosensor de una serie de eventos diferentes, incluyendo un péptido o proteína que se liga covalentemente a una combinación de FRET-fluorescente las proteínas fluorescentes en cuestión y siendo el péptido o proteína de ligamiento, por ejemplo, un sustrato específico de proteasa, por ejemplo, para escisión mediada por caspasa, un ligador que experimenta un cambio conformacional tras recibir una señal que aumenta o reduce la FRET, por ejemplo del dominio regulador PKA (sensor de AMPc), fosforilación, por ejemplo, cuando hay un sitio de fosforilación en el ligador o el ligador tiene especificidad de unión por el dominio fosforilado/desfosforilado de otra proteína, o el ligador tiene un dominio de unión a Ca^{2+}. Las aplicaciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o FRET representativas en las que las proteínas en cuestión encuentran uso incluyen, pero sin limitación, aquellas descritas en: las patentes de EE.UU. nº 6.008.373, 5.998.146, 5.981.200, 5.945.526, 5.945.283, 5.911.952, 5.869.255, 5.866.336, 5.863.727, 5.728.528, 5.707.804, 5.688.648, 5.439.797.

Las proteínas fluorescentes en cuestión encuentran uso también como biosensores en células procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, como indicador de ión de Ca^{2+}, como indicador de pH, como indicador de fosforilación, como indicador de otros iones, por ejemplo, magnesio, sodio, potasio, cloruro y haluros. Por ejemplo, para la detección del ión de Ca, es conocido que las proteínas que contienen un motivo de mano EF se translocan del citosol a membranas tras la unión a Ca^{2+}. Estas proteínas contienen un grupo miristoílo que está enterrado en la molécula por interacciones hidrófobas con otras regiones de la proteína. La unión de Ca^{2+} induce un cambio conformacional que expone el grupo miristoílo, que está entonces disponible para inserción en la bicapa lipídica (denominado un "paso de Ca^{2+}-miristoílo"). La fusión de dicha mano de EF que contiene proteína con proteínas fluorescentes (FP) podría hacerla un indicador del Ca^{2+} intracelular al controlar la translocación desde el citosol a la membrana plasmática mediante microscopia confocal. Las proteínas de mano EF adecuadas para uso en este sistema incluyen, pero sin limitación: recoverina (1-3), calcineurina B, troponina C, visinina, neurocalcina, calmodulina, parválbumina y similares. Para el pH, puede emplearse un sistema basado en hisactofilinas. Las hisactofilinas son proteínas ricas en histidina miristoiladas conocidas por existir en Dictyostelium. Su unión a actina y lípidos ácidos es agudamente dependiente del pH dentro del intervalo de variaciones del pH citoplasmático. En células vivas, la unión a membrana parece anular la interacción de las hisactofilinas con filamentos de actina. A pH \leq 6,5, se localizan en la membrana plasmática y el núcleo. En contraposición, a pH 7,5 se distribuyen uniformemente por el espacio citoplásmico. Este cambio de distribución es reversible y es atribuido a agrupaciones de histidina expuestas en bucles sobre la superficie de la molécula. La inversión de la distribución intracelular en el intervalo de variaciones del pH citoplásmico está de acuerdo con un pK de 6,5 de residuos de histidina. La distribución celular es independiente de la miristoilación de la proteína. Al fusionar FP (proteínas fluorescentes) con hisactofilina, puede seguirse la distribución intracelular de la proteína de fusión mediante barrido láser, microscopia confocal o microscopia de fluorescencia estándar. El análisis de fluorescencia cuantitativo puede hacerse efectuando barridos en línea a través de las células (microscopia confocal de barrido láser) u otros análisis de datos electrónicos (por ejemplo, usando software Metamorph (Universal Imaging Corp) y promediando los datos recogidos en una población de células). Aparece al cabo de 1-2 min una redistribución dependiente del pH sustancial de hisactofilina-FP del citosol a la membrana plasmática, y alcanza un nivel de estado estacionario después de 5-10 min. La reacción inversa tiene lugar a una escala temporal similar. Como tal, puede usarse la proteína de fusión de hisactofilina-proteína fluorescente que actúa de forma análoga para controlar cambios del pH citosólicos inmediatos en células de mamífero vivas. Dichos procedimientos tienen uso en aplicaciones de alto rendimiento, por ejemplo, en la medida de cambios de pH como consecuencia de la activación de receptor de factor de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epitelial o derivado de plaquetas), estimulación quimiotáctica/locomoción celular, en la detección de cambios del pH intracelular como segundo mensajero, en el control del pH intracelular en experimentos de manipulación del pH y similares. Para la detección de la actividad de PKC, el sistema indicador explota el hecho de que una molécula llamada MARCKS (sustrato de cinasa C rico en alanina miristoilado) es un sustrato de PKC. Está anclado a la membrana plasmática mediante miristoilación y una extensión de aminoácidos cargados positivamente (dominio ED) que se unen a la membrana plasmática cargada negativamente mediante interacciones electrostáticas. Tras la activación de PKC, el dominio ED se fosforila por PKC, volviéndose así cargado negativamente, y como consecuencia de una repulsión electrostática MARCKS se transloca de la membrana plasmática al citoplasma (llamado "el paso de miristoílo electrostático"). La fusión del extremo N de MARCKS en el intervalo desde el motivo de miristoilación al dominio ED de MARCKS con proteínas fluorescentes de la presente invención hace al anterior un sistema de detección de la actividad de PKC. Cuando se fosforila por PKC, la proteína de fusión se transloca de la membrana plasmática al citosol. Esta translocación es seguida por microscopia de fluorescencia estándar o microscopia confocal, por ejemplo, usando la tecnología Cellomics u otros sistemas de cribado de altos contenidos (por ejemplo, Universal Imaging Corp./Becton Dickinson). El sistema indicador anterior tiene aplicación en cribados de altos contenidos, por ejemplo, cribado de inhibidores de PKC, y como indicador de la actividad de PKC en muchas situaciones de cribado para reactivos potenciales que interfieren con esta ruta de transducción de señal. Los procedimientos de uso de proteínas fluorescentes como biosensores incluyen también los descritos en las patentes de EE.UU. nº 972.638, 5.824.485 y 5.650.135, así como las referencias citadas en las
mismas.

Las proteínas fluorescentes en cuestión encuentran también uso en aplicaciones que implican el cribado automatizado de matrices de células que expresan grupos indicadores fluorescentes usando la formación de imágenes microscópicas y análisis electrónico. El cribado puede usarse para el descubrimiento de medicamentos y en el campo de la genómica funcional, por ejemplo, cuando las proteínas en cuestión se usan como marcadores de células enteras para detectar cambios en la reorganización multicelular y migración, por ejemplo, la formación de túbulos multicelulares (formación de vasos sanguíneos) por células endoteliales, la migración de células a través un sistema de inserción Fluoroblok (Becton Dickinson Co.), la curación de heridas, la excrecencia de neuritas, etc., usándose las proteínas como marcadores fusionados con péptidos (por ejemplo, secuencias orientadoras) y proteínas que permiten la detección del cambio de localización intracelular como indicador de la actividad celular, por ejemplo: transducción de señal, tal como cinasa, y translocación de factor de transcripción tras estímulos, tal como proteína cinasa C, proteína cinasa A, factor de transcripción NFkB y NFAT; proteínas del ciclo celular tales como ciclina A, ciclina B y ciclina E, escisión de proteasa con posterior movimiento del sustrato escindido, fosfolípidos con marcadores para estructuras intracelulares tales como retículo endoplásmico, aparato de Golgi, mitocondria, peroxisomas, núcleo, nucleolos, membrana plasmática, histonas, endosomas, lisosomas, microtúbulos, actina; como herramientas para cribado de altos contenidos: la colocalización de otras proteínas de fusión fluorescentes con estos marcadores de localización como indicadores de movimientos de proteínas/péptidos de fusión fluorescentes intracelulares o como marcador solo y similares. Los ejemplos de aplicaciones que implican un cribado automatizado de matrices de células en que encuentran uso las proteínas fluorescentes en cuestión incluyen: patente de EE.UU. nº 5.989.835, así como los documentos WO/0017624, WO 00126408, WO 00/17643 y WO 00/03246.

Las proteínas fluorescentes en cuestión encuentran uso también en ensayos de cribado de alto rendimiento. Las proteínas fluorescentes en cuestión son proteínas estables con semividas de más de 24 h. Se proporcionan también versiones desestabilizadas de las proteínas fluorescentes en cuestión con semividas más cortas que pueden usarse como indicadores de transcripción para el descubrimiento de medicamentos. Por ejemplo, puede fusionarse una proteína según la invención en cuestión con una supuesta secuencia señal proteolítica derivada de una proteína con una semivida más corta, por ejemplo, una secuencia PEST del gen de ornitina descarboxilasa de ratón, la secuencia de destrucción B1 de ciclina de ratón y ubiquitina, etc. Para una descripción de proteínas desestabilizadas y vectores que pueden emplearse para producir las mismas véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.130.313, cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia. Los promotores en rutas de transducción de señal pueden detectarse usando versiones desestabilizadas de las proteínas fluorescentes en cuestión para cribado de medicamentos, por ejemplo, AP1, NFAT, NFkB, Smad, STAT, p53, E2F, Rb, myc, CRE, ER, GR y TRE y
similares.

Las proteínas en cuestión pueden usarse como detectores de segundo mensajero, por ejemplo, fusionando las proteínas en cuestión con dominios específicos: por ejemplo, el dominio de unión a Ca de PKCgamma, el dominio de unión a DAG de PKCgamma, el dominio SH2, el dominio SH3, etc.

Pueden prepararse formas secretadas de las proteínas en cuestión, por ejemplo, fusionando secuencias conductoras secretadas con las proteínas en cuestión para construir formas secretadas de las proteínas en cuestión, que a su vez pueden usarse en una variedad de aplicaciones diferentes.

Las proteínas en cuestión pueden encontrar también uso en aplicaciones de clasificación celular activada por fluorescencia. En dichas aplicaciones, la proteína fluorescente en cuestión se usa como marcador para marcar una población de células y se clasifica entonces la población de células marcada resultante con un dispositivo de clasificación de células activado por fluorescencia, como es conocido en la técnica. Se describen procedimientos de FACS en las patentes de EE.UU. nº 5.968.738 y 5.804.387.

Las proteínas en cuestión encuentran también uso como marcador in vivo en animales (por ejemplo, animales transgénicos). Por ejemplo, la expresión de la proteína en cuestión puede activarse por promotores específicos de tejido, encontrando dichos procedimientos uso en la investigación para terapia génica, por ejemplo, ensayando la eficacia de la expresión transgénica, entre otras aplicaciones. Se encuentra una aplicación representativa de proteínas fluorescentes en animales transgénicos que ilustra esta clase de aplicaciones de las proteínas en cuestión en el documento WO 00/02997.

Las aplicaciones adicionales de las proteínas en cuestión incluyen: como marcadores después de la inyección en células o animales y en la calibración para medidas cuantitativas (fluorescencia y proteína); como marcadores o indicadores en dispositivos de biosensor de oxígeno para controlar la viabilidad celular; como marcadores o marcajes para animales, mascotas, juguetes, comida, etc., y similares.

Las proteínas fluorescentes en cuestión encuentran también uso en ensayos de escisión de proteasa. Por ejemplo, pueden desarrollarse ensayos de fluorescencia inactivada por escisión usando las proteínas en cuestión, estando modificadas las proteínas en cuestión para incluir una secuencia de escisión específica de proteasa sin destruir el carácter fluorescente de la proteína. Tras la escisión de la proteína fluorescente por una proteasa activada, la fluorescencia se reduciría bruscamente debido a la destrucción del cromóforo funcional. Como alternativa, puede desarrollarse una fluorescencia activada por la escisión usando las proteínas en cuestión, modificándose las proteínas en cuestión para contener una secuencia espaciadora adicional en estrecha proximidad o dentro del cromóforo. Esta variante reduciría significativamente su actividad fluorescente porque partes del cromóforo funcional estarían divididas por el espaciador. El espaciador estaría en fase con dos sitios de escisión específicos de proteasa idénticos. Tras la escisión mediante la proteasa activada, se cortaría el espaciador y las dos "subunidades" residuales de la proteína fluorescente serían capaces de reunirse generando una proteína fluorescente funcional. Ambos de los tipos anteriores de aplicación podrían desarrollarse en ensayos para una variedad de diferentes tipos de proteasas, por ejemplo, caspasas,
etc.

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Las proteínas en cuestión pueden usarse también en ensayos para determinar la composición de fosfolípidos de membranas biológicas. Por ejemplo, las proteínas de fusión de las proteínas en cuestión (o cualquier otra clase de modificación covalente o no covalente de las proteínas en cuestión) que permiten la unión a fosfolípidos específicos para localizar/visualizar patrones de distribución de injerto de fosfolípido en membranas biológicas y permiten también la colocalización de proteínas de membrana en injertos de fosfolípido específicos, pueden conseguirse con las proteínas en cuestión. Por ejemplo, el dominio PH de GRP1 tiene una alta afinidad por trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3) pero no por PIP2. Como tal, puede construirse una proteína de fusión entre el dominio PH de GRP1 y las proteínas en cuestión para marcar específicamente zonas ricas en PIP3 en membranas biológicas.

Es aún otra aplicación de las proteínas en cuestión como reloj de fluorescencia, en el que el paso de un color fluorescente a otro (por ejemplo, verde a rojo) concomitante con el envejecimiento de la proteína fluorescente se usa para determinar la activación/desactivación de la expresión génica, por ejemplo, la expresión de genes en desarrollo, la expresión génica dependiente del ciclo celular, la expresión génica específica del ritmo circadiano y simila-
res.

Los anticuerpos de la invención en cuestión, descritos anteriormente, encuentran también uso en una serie de aplicaciones, incluyendo la diferenciación de las proteínas en cuestión de otras proteínas fluorescentes.

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Kits

Se proporcionan también por la invención en cuestión kits para uso en la práctica de una o más de las aplicaciones anteriormente descritas, incluyendo los kits en cuestión típicamente elementos para preparar las proteínas en cuestión, por ejemplo, un constructo que comprende un vector que incluye una región de codificación de la proteína en cuestión. Los componentes del kit en cuestión están típicamente presentes en un medio de almacenamiento adecuado, por ejemplo, disolución tamponada, típicamente en un envase adecuado. Pueden estar presentes también en los kits en cuestión anticuerpos de la proteína proporcionada. En ciertas realizaciones, el kit comprende una pluralidad de diferentes vectores que codifican cada uno la proteína en cuestión, estando diseñados los vectores para expresión en diferentes entornos y/o en diferentes condiciones, por ejemplo, expresión constitutiva en que el vector incluye un promotor fuerte para expresión en células de mamífero, un vector sin promotor con un sitio de clonación múltiple para inserción a voluntad de un promotor y expresión a medida, etc.

Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión incluirán adicionalmente instrucciones para la práctica de los procedimientos en cuestión. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa sobre un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, un trozo o trozos de papel sobre los que se imprime la información, en el envase del kit, en un inserto de envasado, etc. Aún otro medio sería un medio legible informáticamente, por ejemplo, disquete, CD, etc., sobre el que se ha grabado la información. Aún otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede usarse por Internet para acceder a información en un sitio remoto. Puede estar presente cualquier medio conveniente en los kits.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a modo de limitación.

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Parte experimental I. Introducción

La proteína fluorescente roja DsRed tiene propiedades espectrales que son ideales para experimentos de dos colores con proteína fluorescente verde (GFP). Pero la DsRed de tipo silvestre tiene varios inconvenientes, incluyendo una maduración de cromóforo lenta y una mala solubilidad. Para superar la maduración lenta, se usaron mutagénesis aleatoria y dirigida para crear variantes de DsRed que maduran 10-15 más rápido que la proteína de tipo silvestre. Una sustitución de asparagina por glutamina en posición 42 acelera en gran medida la maduración de DsRed, pero aumenta también el nivel de emisión verde. Sustituciones aminoacídicas adicionales suprimen esta emisión verde mientras que aceleran adicionalmente la maduración. Para potenciar la solubilidad de DsRed, se redujo la carga neta cerca del extremo N de la proteína. Las variantes de DsRed resultantes proporcionan una fluorescencia brillante incluso en organismos de crecimiento rápido tales como levaduras.

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II. Protocolo experimental A. Mutagénesis y cribado

Para la mutagénesis, se cortó un gen de DsRed de tipo silvestre o mutante presente en el vector pDsRed1-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) con Nhel y Hpal y se usó como molde para una PCR con tendencia al error (Cadwell, R.C. y Joyce, G.F. En "PCR Primer. A laboratory manual". (ed. Dieffenbach, C.W. & Dveksler, G.S.) 583-589 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1995)). Se digirió el producto amplificado con BamHl y BsaBl, se purificó en gel y se ligó entre los sitios BamHl y Ecl136II del vector de expresión pQE31 (Qiagen, Valencia, CA), que codifica un marcaje de hexahistidina N-terminal. Se transformó la colección de genes de DsRed en la cepa DH10B de E. coli. Para las 1-3ª rondas de la mutagénesis, se cribó en 50.000-100.000 colonias la fluorescencia brillante usando el ensayo de retroproyector descrito en el texto. Para la cuarta ronda, se tomaron 4.000 colonias fluorescentes brillantes en pocillos de placas de 96 pocillos, se cultivaron entonces hasta saturación, se lisaron con reactivo B-PER II (Pierce, Rockford, IL) y se centrifugaron durante 5 min a 2.500 g. Se transfirieron los sobrenadantes a un segundo conjunto de placas de 96 pocillos y se compararon visualmente las señales de fluorescencia de los sedimentos y sobrenadantes usando el ensayo de retroproyector. Los clones que mostraron una relación elevada de fluorescencia soluble a insoluble se analizaron adicionalmente. Para la quinta ronda, se recuperaron 10 conjuntos de 10.000 clones mutantes cada uno de las placas de transformación y se sometieron a clasificación celular usando un citómetro de flujo FACStarPlus de Becton Dickinson. Se midieron las señales de fluorescencia simultáneamente en los canales verde (FL-1) y rojo (FL-2), y se recogieron las células si mostraban una fluorescencia roja fuerte pero una fluorescencia verde
reducida.

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B. Purificación y análisis espectral de las variantes de DsRed

Para purificar las proteínas marcadas con hexahistidina, se transformó un gen de proteína fluorescente en el vector pQE31 en células de E. coli que portaban el plásmido represor pREP4 (Qiagen). Se cultivó un cultivo de 250 ml hasta una DO_{600} de 0,5 y se indujo después con \beta-D-tiogalactósido de isopropilo 1 mM (IPTG) durante 6-8 h a 37ºC. Se lisaron las células con 10 ml de BPER II y se centrifugaron durante 20 min a 27.000 g. Se retiró el detergente del sobrenadante añadiendo NaCl 300 mM y centrifugando durante 10 min a 2.500 g. Después de añadir 1 ml de perlas de agarosa de Ni^{2+}-NTA (Qiagen), se mezcló el tubo de lado a lado durante 1 hora. Se lavaron las perlas tres veces con 10 ml de NaCl 300 mM, imidazol-HCl 20 mM, pH 7,4, 0,5% de Triton X-100 y después tres veces con el mismo tampón sin Triton X-100. Se eluyó la proteína fluorescente con 2,5 ml de imidazol-HCl 300 mM, pH 7,4, y se dializó con Na^{+}-HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM.

Se adquirieron los espectros de excitación y emisión corregidos de variantes de DsRed purificadas, diluidas a una A_{558} de <0,04 en Na^{+}-HEPES, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, con un espectrofluorómetro FluoroMax-3 de Horiba. Las ventanas de barrido eran de 1 nm. Se midió la emisión a 600 nm para los espectros de excitación, y la excitación fue de 470 nm para los espectros de emisión. Para determinar los coeficientes de extinción, se ensayaron las concentraciones de proteína fluorescente usando el procedimiento BCA (Pierce), y se midieron las absorbancias de las proteínas en sus máximos de excitación usando un espectrofotómetro GENESYS 10 UV de Spectronic Unicam. Los rendimientos cuánticos se determinaron como se describe (Baird, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11984-11989 (2000); Lakowicz, J.R. "Principles of fluorescence spectroscopy", Ed. 2. (Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York, NY; 1999)) usando rodamina 101 etanólica como referencia; para estas medidas, la longitud de onda de excitación era de 535 nm y la emisión de fluorescencia integrada de 550-800 nm.

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C. Medida de la cinética de maduración

Se clonaron genes que codifican las variantes de DsRed en el vector de expresión pQE81 (Qiagen) y se transformaron en E. coli. Se indujeron cultivos bacterianos con aireamiento a 37ºC con IPTG 1 mM durante 30 min para generar un pulso de expresión para cada variante de DsRed. Se inició entonces un seguimiento inhibiendo la síntesis de proteína con una mezcla de cloranfenicol 170 \mug/ml, kanamicina 30 \mug/ml y tetraciclina 50 \mug/ml. En los puntos temporales designados, se retiraron alícuotas de los cultivos, se ajustaron a 15% de glicerol y se congelaron a -80ºC. Se descongelaron después rápidamente estas alícuotas y se evaluaron usando un citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson para determinar la intensidad media de fluorescencia roja (canal FL-2) por célula. Se precipitó una porción de cada alícuota con ácido tricloroacético, se sometió después a PAGE-SDS e inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-hexahistidina (Qiagen) para medir la cantidad total de polipéptido DsRed en los cultivos. Microscopia de fluorescencia de levadura. Se usó un plásmido CEN derivado de pRS315 (Sikorski, Genetics 122, 19-27 (1989)) y que portaba un gen de fusión pCox4-DsRed1 bajo el control del promotor ADH1. Se crearon derivados de este plásmido reemplazando la secuencia de codificación de DsRed1 por la secuencia de codificación de DsRed.T3 o DsRed.T4. Se introdujeron estos plásmidos en la cepa BGY101 de S. cerevisiae, que porta un gen 20 de SEC7-EGFPx3 cromosómico. Se cultivaron células de las cepas de levadura resultantes en medio mínimo de glucosa y se fijaron, y se adquirieron las imágenes de fluorescencia proyectadas como se describe por Rossanese y col., J. Cell Biol. 145, 69-81
(1999).

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III. Resultados y discusión

Se ha descrito recientemente una familia de proteínas fluorescentes. La más útil de estas proteínas recién descubiertas es DsRed, que deriva del coral Discosoma. La DsRed tiene una fluorescencia naranja-roja con un máximo de emisión a 583 nm. Los estudios biofísicos y cristalográficos de rayos X revelaron que la DsRed forma un tetrámero estable, y que cada monómero es estructuralmente muy similar a GFP. La fluorescencia desplazada al rojo de DsRed respecto a GFP es el resultado de un cromóforo con un sistema \pi conjugado más extenso. La fluorescencia de DsRed se excita óptimamente a 558 nm, pero puede excitarse también por un láser de 488 nm estándar, permitiendo a la DsRed usarse con microscopios confocales basados en láser y citómetros de flujo. La DsRed tiene un alto rendimiento cuántico y es fotoestable. Estas características hacen de la DsRed un candidato ideal para la formación de imágenes por fluorescencia, particularmente para experimentos multicolores que implican a GFP y sus variantes. Está ahora disponible una versión optimizada de codón de DsRed con el nombre
DsRed1.

A pesar de estas ventajas, la DsRed de tipo silvestre tiene varios problemas para uso como indicador fluorescente. Cuando se fusiona DsRed con otra proteína, la tetramerización del dominio DsRed puede perturbar la función y localización de la proteína. El tetrámero de DsRed se autoasocia también, formando agregados de orden superior. Quizás el problema más grave con la DsRed es que la maduración del cromóforo es lenta, con una semivida de > 24 h a temperatura ambiente. La DsRed recién sintetizada desarrolla una fluorescencia verde débil formando el mismo cromóforo que está presente en GFP. Una segunda reacción de oxidación genera entonces el cromóforo rojo. Esta maduración lenta se ha puesto en uso con una variante de DsRed denominada "reloj fluorescente", en la que se potencia la fluorescencia de la especie verde inicial. Sin embargo, para la mayoría de aplicaciones, la maduración lenta de DsRed no es deseable. En la formación de imágenes de doble marcaje con GFP, la fluorescencia verde inicial de DsRed produce superposición en el canal de GFP. Más generalmente, el lento desarrollo de la fluorescencia roja limita la intensidad de la señal de DsRed, particularmente con organismos de crecimiento rápido tales como levaduras. Una variante denominada DsRed2 madura más rápida que DsRed1, pero DsRed2 sigue requiriendo varias horas para alcanzar una fluorescencia total. Se usó aquí mutagénesis aleatoria y dirigida para crear variantes mejoradas de DsRed. Estas nuevas variantes maduran rápidamente y son más solubles que la DsRed de tipo
silvestre.

Para identificar a variantes de DsRed de maduración rápida, se modificó un procedimiento anterior para visualizar fluorescencia de GFP en colonias microbianas. Se produce DsRed marcada con hexahistidina a altos niveles en Escherichia coli. Se excita la fluorescencia de las colonias bacterianas disponiendo un filtro de paso de banda de 520 \pm 20 nm sobre la lente de un retroproyector, y se detecta la emisión mediante gafas cubiertas con un filtro Kodak Wratten nº 22, que deja pasar longitudes de onda >550 nm. Esta técnica es sencilla y eficaz.

Se generó una colección de plásmidos de expresión mutantes usando PCR con tendencia al error para amplificar el molde de DsRed1. Se transformó esta colección en E. coli y se examinaron más de 100.000 colonias transformantes. Las colonias productoras de proteína DsRed1 de tipo silvestre requirieron dos días para desarrollar una fluorescencia significativa, pero tres colonias mutantes mostraron una fuerte fluorescencia después de un día de crecimiento. La secuenciación reveló que los tres plásmidos mutantes eran distintos, pero que todos ellos contenían un cambio de codón N42H. Por lo tanto, se generó una variante que tenía sólo la sustitución N42H.

Se purificó la variante N42H en paralelo con DsRed1, y se analizaron las dos proteínas mediante espectrofluorometría. Como se observa anteriormente, los espectros de DsRed1 purificada cambiaron durante un periodo de días a medida que la proteína maduraba (datos no mostrados). En contraposición, los espectros de la variante N42H purificada permanecieron estables con el tiempo (datos no mostrados), consistentemente con una maduración rápida. Desgraciadamente, además de acelerar la maduración, la sustitución N42H alteraba las propiedades espectrales de la proteína madura (Fig. 1A). Se cree que la DsRed1 está en una mezcla en equilibrio de moléculas fluorescentes rojas y algunas moléculas fluorescentes verdes que son espectralmente similares a GFP. La especie similar a GFP tiene un pico de excitación azul aproximadamente a 480 nm y un pico de emisión verde aproximadamente a 500 nm, pero la DsRed es un tetrámero, de modo que la excitación de las moléculas verdes a menudo da como resultado la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) con las moléculas rojas vecinas, produciendo emisión roja. Este efecto FRET, junto con el porcentaje relativamente bajo de moléculas verdes en la DsRed1 madura, proporciona un pico muy pequeño de emisión verde respecto a la emisión roja (Fig. 1A). En la variante N42H, los picos de excitación azul y emisión verde se potenciaban drásticamente (Fig. 1A), indicando que el equilibrio se había desplazado de modo que un mayor porcentaje de moléculas maduras contenía el cromóforo
verde.

Debido a que la sustitución N42H aumenta considerablemente el tamaño de la cadena lateral, se intentó también una sustitución N42Q más conservativa. Esta mutación requería dos cambios de base y probablemente no habría estado presente en la colección de mutantes originales. La variante N42Q retenía la propiedad de maduración rápida de la variante N42H, pero mostraba menos excitación azul y emisión verde (Fig. 1A). Por lo tanto, se eligió la variante N42Q como el punto de partida para estudios adicionales.

La mutagénesis adicional (véase a continuación) proporcionó variantes de DsRed que mostraban una maduración aún más rápida y menor emisión verde que la variante N42Q original. Después de 6 rondas de mutagénesis, se seleccionaron tres variantes optimizadas y se denominaron DsRed.T1, DsRed.T3 y DsRed.T4 (Tabla 1). Las propiedades espectrales de DsRed.T4 (Fig. 1B) son virtualmente idénticas a las de DsRed.T1 (datos no mostrados) y muy similares a las de DsRed1 de tipo silvestre (Fig. 1A). En comparación con DsRed.T1 y DsRed.T4, la DsRed.T3 es algo más brillante (véase a continuación), pero tiene un pico significativamente mayor de excitación azul y un pico marginalmente mayor de emisión verde (Fig. 1B).

Se examinaron las variantes de DsRed optimizadas tanto in vivo como in vitro. A juzgar por la fluorescencia de colonia, el tamaño de colonia y la estabilidad de plásmido, estas variantes eran menos tóxicas para E. coli que DsRed1, y desarrollaron fluorescencia más eficazmente a temperaturas de crecimiento de 37ºC y mayores (datos no mostrados). Como la DsRed de tipo silvestre, las variantes optimizadas parecían ser tetraméricas: exhibían FRET entre las moléculas verdes y rojas (Fig. 1B) y, en PAGE-SDS no desnaturalizante, migraban en la posición esperada para tetrámeros (véase a continuación). Con la DsRed1 purificada, se midió un coeficiente de extinción de 52.000 M^{-1}cm^{-1} y un rendimiento cuántico de aproximadamente 0,7 (Tabla 1).

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TABLA 1 Propiedades de las variantes de DsRed maduras^{a}

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Un estudio anterior de DsRed de tipo silvestre reseñó un rendimiento cuántico similar, pero un coeficiente de extinción mayor de 75.000 M^{-1}cm^{-1}; la razón de esta discrepancia no está clara. La DsRed2 muestra ligeras reducciones tanto en el coeficiente de extinción como en el rendimiento cuántico, dando como resultado un brillo relativo de 0,68 en comparación con la DsRed1 (Tabla 1). La DsRed.T3 es casi tan brillante como la DsRed1. Sin embargo, DsRed.T1 y DsRed.T4 son dímeros, con brillos relativos de 0,36-0,38 en comparación con la DsRed1. Para cuantificar la cinética de maduración de las variantes de DsRed, se efectuó un análisis de seguimiento de pulso in vivo con cultivos de E. coli cultivados a 37ºC (Fig. 2). Después de un pulso de inducción de 30 min, se añadieron inhibidores de la síntesis de proteína y se tomaron muestras de los cultivos en diversos tiempos de seguimiento. Se midió la fluorescencia celular media para cada muestra por citometría de flujo usando un láser de excitación a 488 nm.

La Figura 2A muestra los datos brutos, mientras que la Figura 2B muestra los datos normalizados a una fluorescencia máxima del 100%. En estas condiciones, la DsRed1 madura con una semivida de aproximadamente 11 h, aunque las medidas exactas son difíciles debido a que los valores de fluorescencia no alcanzan una meseta (Fig. 2) y debido a que parte de la proteína DsRed1 se degrada durante el periodo de seguimiento (datos no mostrados). La DsRed2 madura algo más rápido, con una semivida de aproximadamente 6,5 h. Las velocidades de adquisición de fluorescencia para DsRed1 y DsRed2 aumentan después de una fase de latencia pronunciada, indicando que están implicadas múltiples etapas lentas. La DsRed.T3 madura con una breve fase de latencia y una semivida de aproximadamente
1,3 h.

DsRed.T4 y DsRed.T1 maduran sin fase de latencia detectable y con semividas de 0,7 h, aproximadamente 15 veces más rápidas que la DsRed1 (Fig. 2, y datos no mostrados). Con este protocolo de pulso-seguimiento, las diferentes variantes de DsRed mostraban reproduciblemente distintos valores de meseta de fluorescencia celular media (Fig. 2A). La alta señal de DsRed.T3 puede explicarse por la excitación relativamente fuerte de esta proteína a 488 nm (véase la Fig. 1B). DsRed1, DsRed2 y DsRed.T4 tienen todas espectros de fluorescencia similares, aunque la fluorescencia de meseta de células que expresan DsRed.T4 es 4 veces mayor que la de células que expresan DsRed1 y 10 veces mayor que la de células que expresan DsRed2. Este resultado es sorprendente porque la DsRed.T3 purificada es menos brillante que DsRed1 o DsRed2 (Tabla 1). Se especula que la DsRed1 inmadura es inestable en E. coli, y que este problema se exacerba con DsRed2, de modo que se pierde una gran fracción de las moléculas de DsRed1 y DsRed2 recién sintetizadas mediante agregación y/o degradación. Consistentemente con esta idea, un estudio anterior reseñó que la mayoría de las moléculas de DsRed1 recién sintetizadas se degradan en células de E. coli o Drosophila. De forma interesante, la DsRed2 da una señal de fluorescencia más brillante que la DsRed1 en células de mamífero, sugiriendo que la eficacia de la expresión para una variante de DsRed dada puede ser específica del tipo
celular.

Los beneficios de una maduración acelerada deberían ser particularmente evidentes cuando se producen variantes de DsRed en un organismo de crecimiento rápido. Para ensayar esta predicción, se orientaron diferentes variantes de DsRed a mitocondrias de levadura. La cepa de levadura original contenía también un marcador marcado con EGFP para cisternas de Golgi. Con DsRed1 marcada mitocondrialmente, la fluorescencia era extremadamente débil en células de cultivos en crecimiento, y sólo se volvió visible en un subconjunto de células una vez los cultivos alcanzaron la fase estacionaria (datos no mostrados). En contraposición, la DsRed.T4 orientada a mitocondria dio consistentemente una señal de fluorescencia fuerte en células de cultivos en crecimiento (Fig. 3). Como se muestra en la imagen adjunta, no se observó una superposición detectable de la fluorescencia de DsRed.T4 en el canal verde o de fluorescencia de EGFP en el canal rojo. Se obtuvieron resultados similares con DsRed.T3 orientada mitocondrialmente (datos no mostrados). Sin embargo, con otros constructos de fusión, se encontró que cuando se concentraba una gran cantidad de DsRed.T3 en una región pequeña de la célula, aparecía algo de superposición en el canal verde (no mostrada). Por lo tanto, la DsRed.T4 es la proteína de elección para obtener una separación limpia de señales de fluorescencia roja y
verde.

Estos resultados confirman que la mutagénesis aleatoria seguida de cribado es un potente procedimiento para crear proteínas fluorescentes mejoradas. El descubrimiento clave es que las sustituciones Asn42 tales como N42Q aceleran drásticamente la formación de cromóforo.

Es un efecto secundario de las sustituciones Asn42 un aumento pronunciado de la excitación azul y la emisión verde (Fig. 1A). La DsRed de tipo silvestre madura parece estar en una mezcla en equilibrio de una especie roja y una especie verde, y las sustituciones Asn42 desplazan evidentemente el equilibrio, proporcionando un porcentaje mayor de la especie verde. Al introducir una serie de sustituciones adicionales en el fondo de N42Q, podía suprimirse casi toda la excitación azul y emisión verde que se confería por N42Q conservando la maduración rápida (Fig. 1 y Tabla 1).

Se consiguió otra mejora frente a la DsRed de tipo silvestre reduciendo la carga neta cerca del extremo N. Las variantes de DsRed resultantes muestran una agregación reducida in vitro (véase a continuación) e in vivo. La DsRed de tipo silvestre es desacostumbradamente básica, con un pI predicho de 8,0, y probablemente se asocia no específicamente con componentes celulares aniónicos. Además, los parches básicos sobre la superficie de un tetrámero de DsRed pueden interaccionar con parches ácidos en un segundo tetrámero, causando agregación de mayor orden. Esta interacción de DsRed con otras macromoléculas se reduce evidentemente eliminando el agrupamiento de cargas positivas cerca del extremo N.

El resultado final del trabajo es un par de variantes optimizadas denominadas DsRed.T3 y DsRed.T4. La DsRed.T3 madura rápidamente, y la proteína purificada es casi tan brillante como la DsRed de tipo silvestre (Tabla 1), haciendo a esta variante bien adecuada para formación de imágenes de un color de fluorescencia roja. La DsRed.T3 tiene un pico mayor de excitación azul y un pico ligeramente menor de emisión verde que la DsRed de tipo silvestre (Fig. 1B), dando como resultado cierta contaminación de la señal de GFP en experimentos de dos colores. Sin embargo, esta contaminación es habitualmente menor. La excitación azul potenciada de DsRed.T3 puede ser realmente ventajosa, por ejemplo, si la fluorescencia se excita por un láser a 488 nm (Fig. 2). La DsRed.T4 tiene espectros de fluorescencia muy similares a los de la DsRed de tipo silvestre (Fig. 1B) y proporciona una contaminación despreciable de la señal de GFP (Fig. 3). Aunque la DsRed.T4 purificada es sólo aproximadamente la mitad de brillante que DsRed.T3, este efecto se cancela parcialmente in vivo debido a que la DsRed.T4 madura casi dos veces más rápido que la DsRed.T3 (Tabla 1). Por tanto, la DsRed.T4 es probablemente la mejor variante para la mayoría de aplicaciones. La DsRed.T1 es esencialmente idéntica a la DsRed.T4 (Tabla 1) excepto porque la DsRed.T1 carece de residuos de cisteína y por lo tanto podría plegarse más eficazmente en el entorno oxidante de la ruta
secretora.

La DsRed.T4 es un molde adecuado para mutagénesis adicional para producir variantes adicionales.

La generación de variantes de DsRed nuevas es probable que implique tanto mutagénesis aleatoria como dirigida. Para estudios de mutagénesis dirigida, merece la pena observar que cinco de las sustituciones presentes en DsRed.T4 (R2A, H41T, N42Q, A145P y T217A) reemplazan un residuo dado por un residuo que está más generalmente conservado en la familia de homólogos de DsRed. Por tanto, las comparaciones de secuencia entre DsRed y sus parientes pueden sugerir mutaciones que es probable que produzcan variantes útiles.

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IV. Variantes de maduración rápida de la proteína fluorescente roja de Discosoma (DsRed)

Esta sección describe la estrategia de mutagénesis multietapa que se usó para obtener las variantes de DsRed optimizadas. Se proporciona una visión general en la tabla suplementaria 2.

Uno de los mutantes que contienen N42H originales producía una fluorescencia de colonia más brillante que los otros dos. Este brillo aumentado era debido a una segunda mutación: H41L. El residuo 41 es una treonina es varios homólogos de DsRed, y se encontró que una sustitución H41T da colonias ligeramente más brillantes que H41L. En el contexto de N42Q, H41T no causa cambios significativos en las propiedades de la proteína purificada (no mostrado), pero parece proporcionar un aumento adicional de la velocidad de maduración. Por tanto, después de la primera ronda de mutagénesis, se habían incorporado las dos sustituciones H41T y N42Q (tabla suplementaria 1). La variante de primera ronda genera una banda de peso molecular alto difusa cuando se analiza mediante PAGE-SDS no desnaturalizante (Fig. suplementaria 4A), sugiriendo que sigue siendo tetramérica.

Se emprendieron rondas adicionales de mutagénesis para acelerar la maduración adicionalmente. Usando la variante de primera ronda como molde, se obtuvieron tres mutantes que producían colonias más brillantes en E. coli después de un día de crecimiento. Los tres mutantes contenían la sustitución V44A. Además de acelerar la formación de cromóforo, la V44A reduce la excitación azul y la emisión verde respecto a la variante de primera ronda (no mostrado). Uno de los tres mutantes de V44A contenía también una sustitución 21S, que reduce adicionalmente la excitación azul y la emisión verde (no mostrado). Por tanto, la variante de ronda 2 contenía las cuatro sustituciones T21S, H41T, N42Q y V44A (tabla suplementaria 2). La tercera ronda de mutagénesis produjo varios mutantes con un aumento adicional de la fluorescencia de colonia. Sorprendentemente, la mutación relevante no alteró la proteína DsRed misma, sino que en lugar de ello fue un cambio de codón de prolina a leucina en posición -4 en el ligador entre el marcaje de hexahistidina y la metionina iniciadora. Este resultado indica que las secuencias añadidas al extremo N de DsRed pueden afectar al plegamiento de proteína y/o la maduración de cromóforo. Se incorporó la sustitución P(-4)L, proporcionando la variante de tercera ronda (tabla suplementaria 2).

Cuando se purificaron las proteínas fluorescentes, se observó que la DsRed y sus variantes se extraían ineficazmente de células de E. coli en condiciones de lisis que extraen la mayoría de la EGFP. Esta observación se ajusta a las reseñas de que la DsRed agrega en las células. La cuarta ronda de mutagénesis se diseñó para reducir esta agregación. Se ideó un ensayo en el que se cultivaron clones bacterianos mutantes en placas de 96 pocillos, se lisaron con un tampón detergente y se centrifugaron para separar las proteínas extraídas de los sedimentos celulares. Los mutantes de interés mostraron una relación aumentada de fluorescencia roja soluble a insoluble. De las más de 25 proteínas mutantes identificadas, casi todas tenían una reducción de la carga neta cerca del extremo N. Después de ensayar una serie de combinaciones mutantes, se incorporó el trío de sustituciones R2A, K5E y N6D para proporcionar la variante de cuarta ronda (tabla suplementaria 2).

Para comparar las solubilidades de las diferentes variantes de DsRed, se expresó cada proteína en E. coli, se lisaron las células en tampón detergente y se cuantificó el porcentaje de moléculas de proteína que se extraían (Fig. 4B suplementaria). Virtualmente un 100% de las moléculas de EGFP se solubilizan en estas condiciones. Sólo un \sim25% de las moléculas de DsRed1 se solubilizan. La DsRed2 es sustancialmente más soluble (\sim55%) que la DsRed1. La variante de tercera ronda es también más soluble (\sim52%) que la DsRed1, pero la variante de cuarta ronda muestra una solubilidad aún mayor (\sim73%). Cuando se analiza mediante PAGE-SDS no desnaturalizante, la variante de tercera ronda genera una banda difusa que puede reflejar la formación de oligómeros de orden superior, mientras que la variante de cuarta ronda genera una banda estrecha en la posición predicha para un tetrámero (Fig. 4A suplementaria). Estos resultados sugieren que reducir la carga neta cerca del extremo N de DsRed suprime la agregación de los tetrámeros.

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La variante de cuarta ronda sigue dando una fluorescencia superpuesta observable con juegos de filtro de GFP (no mostrados). Por lo tanto, se emprendió la quinta ronda de mutagénesis para reducir adicionalmente la emisión verde. Se usó citometría de flujo para seleccionar células de E. coli que mostraran una fluorescencia brillante con una relación aumentada de emisión de rojo a verde. Los siete mutantes resultantes contenían una sustitución T217A: además de reducir la excitación azul y la emisión verde, la T217A invierte el ligero desplazamiento espectral al rojo observado con N42Q (véase la Fig. 4A en el texto principal). La T217A se incorporó para proporcionar la variante de quinta ronda (tabla suplementaria 2).

Finalmente, se aprovecharon observaciones fortuitas de experimentos de mutagénesis no relacionados. La sustitución C117S reduce adicionalmente la excitación azul y la emisión verde. Por tanto, la variante optimizada designada DsRed.T1 contiene las siguientes sustituciones: P(-4)L, R2A, K5E, N6D, T21S, H41T, N42Q, V44A, C117S y T217A. La sustitución A145P es similar a C117S en su efecto sobre los espectros de fluorescencia, pero en algunos fondos de mutante DsRed, la fluorescencia de colonia se redujo ligeramente por C117S y aumentó ligeramente por A145P (no mostrado). Por lo tanto, se creó una segunda variante optimizada denominada DsRed.T4, que es idéntica a DsRed.T1 excepto porque la sustitución C117S se ha reemplazado por A145P. Análisis posteriores revelaron que las ventajas conferidas por T217A están acompañadas por una modesta reducción del brillo, de modo que se creó un tercer mutante optimizado denominado DsRed.T3, que es idéntico a DsRed.T4 excepto porque DsRed.T3 carece de la sustitución T217A.

La excitación azul y la emisión verde se reducen por las sustituciones T21S, V44A, C117S, A145P y T217A. Val44 y Thr217 se enfrentan al interior de la proteína DsRed y están cercanos al residuo 42, indicando que las sustituciones V44A y T217A alivian las limitaciones estéricas causadas por N42Q. En contraposición, Thr21, Cys117 y Ala145 se enfrentan a la superficie del monómero de DsRed, de modo que T21S, C117S y A145P están indicadas para alterar el empaquetamiento global de la proteína. T21S y A145P pueden influir en la estructura de DsRed al modificar las interfases del tetrámero.

Resulta evidente por los resultados y discusión anteriores que la presente invención proporciona una importante nueva clase de proteínas fluorescentes que maduran rápidamente. Como tal, la invención en cuestión representa una contribución significativa a la técnica.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente memoria como referencia como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora como referencia. La citación de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe considerarse como admisión de que la presente invención no está facultada a antedatar dicha publicación en virtud de la invención anterior.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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Claims (23)

1. Polinucleótido que codifica un mutante cromo- o fluorescente de DsRed de tipo silvestre, en el que el mutante comprende una mutación en N42 de DsRed de tipo silvestre y en el que el mutante madura más rápidamente que la DsRed de tipo silvestre.

2. Polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el mutante madura al menos 5 veces más rápido que la DsRed de tipo silvestre.

3. Polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, en el que el mutante madura al menos 10 veces más rápido que la DsRed de tipo silvestre.

4. Polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el mutante madura al menos 15 veces más rápido que la DsRed de tipo silvestre.

5. Polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el mutante madura en menos de 10 horas.

6. Polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el mutante madura en menos de 8 horas.

7. Polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mutante comprende adicionalmente una mutación seleccionada de: H41L, H41T.

8. Polinucleótido de la reivindicación 7, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q y H41T.

9. Polinucleótido de la reivindicación 8, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T y V44A.

10. Polinucleótido de la reivindicación 9, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T, V44A y T21S.

11. Polinucleótido de la reivindicación 10, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T, V44A, T21S, R2A, K5E y N6D.

12. Polinucleótido de la reivindicación 11, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T, V44A, T21S, R2A, KSE, N6D y T217A.

13. Polinucleótido de la reivindicación 12, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T, V44A, T21S, R2A, KSE, N6D, T217A y C117S.

14. Polinucleótido de la reivindicación 12, en el que el mutante comprende las mutaciones N42Q, H41T, V44A, T21S, R2A, K5E, N6D, T217A y A145P.

15. Polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, ligado operativamente a un promotor.

16. Célula que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Procedimiento de producción de un mutante cromo- o fluorescente de DsRed de tipo silvestre, comprendiendo dicho procedimiento cultivar la célula de la reivindicación 16 de tal modo que se exprese el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, produciendo el mutante cromo- o fluorescente.

18. Organismo transgénico no humano que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

19. Fragmento de polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, comprendiendo dicho fragmento la mutación en N42 de DsRed de tipo silvestre.

20. Anticuerpo capaz de unirse específicamente al fragmento de la reivindicación 19.

21. Kit que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

22. Uso de un polipéptido según la reivindicación 19 en una aplicación que emplea una proteína cromo- o fluorescente, no siendo dicho uso un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

23. Uso de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que codifica un polipéptido según la reivindicación 19 en una aplicación que emplea ácido nucléico que codifica una cromo proteína o proteína fluorescente, no siendo dicho uso un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.