ES2329651T3 - Metodo para detectar la presencia de una bacteria objetivo y un antigeno de carbohidrato de la misma. - Google Patents
Metodo para detectar la presencia de una bacteria objetivo y un antigeno de carbohidrato de la misma. Download PDFInfo
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Abstract
Un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae, que consiste en los siguientes pasos: (a) poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira: (i) una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas; (ii) una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color; (b) dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona; (c) dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y (d) aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.
Description
Método para detectar la presencia de una batería
objetivo y un antígeno de carbohidrato de la misma.
La presente invención hace referencia a la
consecución de diagnósticos rápidos y precisos, de elevada
sensibilidad y especificidad, de infusiones bacterianas provocadas
por bacterias del género Haemophilus infuenzae caracterizado
por la posesión de antígenos de carbohidrato. En particular, la
invención incluye la purificación inicial de tales antígenos de
carbohidrato hasta conseguir un estado libre esencialmente de
proteínas, seguido de la utilización de cada antígeno de
carbohidrato purificado para purificar por afinidad los anticuerpos
puros polivalentes a dicho antígeno y la utilización de dichos
anticuerpos purificados en pruebas de diagnóstico de elevada
precisión, especificidad y sensibilidad para detectar la presencia
de la bacteria original.
La invención hace referencia a Haemophilus
infuenzae que posee antígenos de carbohidrato, cuyas bacterias
son negativas a la tinción de Gram. Los anticuerpos purificados
tienen al menos el mismo orden de especificidad y sensibilidad que
los anticuerpos monoclonales disponibles en el mercado y son más
sencillos de producir y tratar que muchos anticuerpos monoclonales.
Ofrecen varias oportunidades para pruebas de rápido diagnóstico,
por ejemplo, a través de inmunoensayos ICT, para identificar
bacterias que hasta el momento habían sido difíciles de identificar
de manera rápida y precisa, por lo que los diagnósticos
enfermedades bacterianas que provocaron con frecuencia llegaban
tarde y de manera complicada, utilizando una metodología muy
voluminosa.
Las bacterias negativas a Gram son conocidas por
tener en común la posesión de al menos un
lipo-polisacárido u otro antígeno de
lipo-policarbonato, mientras que las bacterias
positivas a Gram son conocidas por poseer la característica común
de tener al menos un antígeno de carbohidrato que es un ácido
lipoteicoico o ácido teicoico o derivado de alguno de ellos. Tanto
las bacterias positivas al Gram como las negativas también tienen
antígenos de carbohidrato que son capsulares, es decir, aquellos
antígenos que se encuentran en una capa capsular pesada en su estado
nativo. Esta capa capsular constituye una sustancia del tipo baba
que rodea la pared celular de la bacteria en la mayoría de las
bacterias.
La Solicitud de Estados Unidos con número de
serie 09/139,720, describe la purificación a un estado libre
esencialmente de proteínas de antígenos
lipo-carbohidratos de bacterias de la especie
Legionella, que eran todas positivas a Gram. Aquí se subraya
la purificación de antígenos de carbohidrato de serotipos
Legionella pneumophila, incluyendo, sin limitación, el
antígeno O-polisacárido de L. pneumophila
serotipo 1, cuya purificación a un estado esencialmente libre de
proteínas se describe con detalle.
La solicitud muestra que cuando el antígeno
O-carbohidrato esencialmente libre de proteínas de
L. pneumophila serotipo 1 (cuyo serotipo es conocido por ser
el organismo causante de alrededor del 70% de las enfermedades
similares a la neumonía provocadas por la Legionella que
pueden ocurrir) está unido (a través de una molécula espaciadora) a
una columna de afinidad como la descrita y los anticuerpos puros
monoclonales al antígeno no purificado pasan sobre la columna
descrita, los anticuerpos purificados resultantes son en un alto
grado específicos al antígeno y fácilmente identificarán el mismo
antígeno cuando esté presente en fluidos corporales tomados de
paciente con la enfermedad causada por Legionella
pneumophila serotipo 1. La orina demuestra ser un fluido
corporal preferente para el fin diagnóstico porque:
- (1)
- El antígeno de L. pneumophila serotipo 1 aparece en la orina antes en el estado enfermo y persiste durante algunos días después de que se haya iniciado el apropiado tratamiento terapéutico;
- (2)
- La recogida de la muestra de test no es invasiva y es simple, provocando un mínimo trastorno para el paciente y no requiere personal especialmente formado o instrumentación especialmente diseñada; y
- (3)
- Las muestras de, por ejemplo, esputo pueden dar resultados falsos positivos o falsos negativos debido a las dificultades para obtener y cultivar la muestra, la posible presencia de colonias de bacterias en la nariz o garganta del paciente que se encuentran crónicamente presente y que no son la causa de la enfermedad, así como otras dificultades similares.
La bacteria de L. pneumophila serotipo 1
presente en la orina está muerta y tiene al menos en parte una
pared celular rota cuando pasa a través del hígado; por ello, el
antígeno se encuentra en un estado fácilmente accesible para los
anticuerpos específicos al antígeno depositados en dos áreas sobre
la tira del test ICT.
La eficacia de los anticuerpos específicos de
antígenos descritos en la Solicitud de Estados Unidos con número de
serie 09/139,720 al identificar bacterias completas y hasta cierto
punto vivas en un medio acuoso que constituye muestras ambientales
se demuestra además en la continuación en parte en la Solicitud con
el número de serie 09/458,988, donde se describe un inmunoensayo
con enzimas de elevada especificidad y sensibilidad. Este ensayo se
basa en el uso del antígeno como agente detector de anticuerpos
específicos al antígeno obtenidos tras la purificación de
anticuerpos policlonales puros tal y como se describe con detalle
en la solicitud relacionadas. La sensibilidad y la especificidad de
los anticuerpos así purificados se ilustra en parte por los breves
periodos de tiempo en los que el inmunoensayo con enzimas produjo
resultados informativos, así como por las bajas concentraciones
(0.05 \mug por test) de anticuerpos específicos de antígeno que
dieron igualmente resultados informativos con un periodo de
incubación más largo (1 hora).
La Solicitud de Estados Unidos con número de
serie 09/397,110 describe la purificación hasta lograr un estado
esencialmente libre de proteínas de un antígeno con pared celular
C-polisacárido presente en la pared celular
neumocócica de todos los serotipos S. pneumoniae. Este
antígeno es un polisacárido que contiene fosfocolida derivado de
ácido teicoico. La cepa Streptococcus pneumoniae de
bacterias son positivas a la tinción Gram.
El antígeno esencialmente libre de proteínas
(que contiene menos de aproximadamente 10% de las mismas) se enlaza
covalentemente con una molécula espaciadora que a su vez se enlaza
covalentemente con una columna de afinidad y la columna así
preparadas se usa a continuación para purificar anticuerpos
policlonales puros a S. pneumoniae. Los anticuerpos
purificados resultantes específicos al antígeno mostraron una
elevada sensibilidad y especificidad en un test ICT para
identificar S. pneumoniae en fluidos corporales, incluyendo
la orina en particular.
Se han realizado numerosos y varios esfuerzos en
el pasado para usar anticuerpos polivalentes puros para
carbohidratar antígenos, o anticuerpos monoclonales a tales
antígenos, de varias bacterias infecciosas negativas o positivas a
Gram, responsables de enfermedades del tracto bajo respiratorio en
diversas pruebas, incluyendo ELISA, inmunoelectroforesis con
contador y/o pruebas con aglutinación de látex para buscar la
presencia de la bacteria específica buscada. Mientras que algunas
de estas pruebas han sido útiles en algunos casos, ninguna de ellas
ha conseguido la suficiente aceptación clínica en lo relativo a su
fiabilidad para uso con independencia de las pruebas de cultivo
celular. Los inconvenientes de las pruebas de cultivo celular y su
vaga fiabilidad se han documentado con gran detalle en la técnica y
se recogen en las solicitudes relacionadas 09/139,720 y
09/397,110.
Molokova et al. ("C-21.
El desarrollo de un rápido test inmunocromatográfico (ICT) para la
detección de Streptococcus pneumoniae en orina", Resúmenes
del encuentro general de la Sociedad Americana de Microbiología, The
Society, Washington, DC, Vol. 99, Mayo 31, 1999, p. 109) trata sobre
el desarrollo de un rápido test para la detección de S.
pneumoniae. Dicho test puede tener el formato de membrana de
flujo lateral y se basa en los anticuerpos purificados por afinidad
específicos a C-polisacáridos.
More et al. ("Desarrollo de un ensayo
inmunocromatográfico (ICT) para la detección de Legionella
pneumo-phila", Resúmenes del encuentro general de la
Sociedad Americana de Microbiología, Encuentro 98º, Atlanta, GA,
Mayo 17-21, 1998) facilita información sobre el
desarrollo de un ensayo con inmunodiagnóstico para el análisis de
L. Pneumophila serogrupo I en especímenes clínicos y
ambientales.
WO 98/55871 está relacionado con el método para
la detección de una infección con E. Coli enterohemorrágica.
Con este fin, anticuerpos anti-polisacáridos en una
muestra reaccionan con lipo-polisacáridos de E.
Coli enterohemorrágica inmovilizados en partículas portadoras.
La infección se detecta a continuación por medio de pasos
espectroscópicos determinando la extensión de la aglutinación.
WO 00/16803 trata de un ensayo
inmunocromatográfico específicos y sensible ("ICT"), llevado a
cabo durante aproximadamente 15 minutos, para la detección de
Streptococcus pneumoniae en un fluido corporal. En el
ensayo, los anticuerpos al antígeno C-polisacárido
de S. pneumoniae cultivados en conejos se purifican por
afinidad con antígeno aislado y purificado de
C-polisacárido que tiene un contenido proteico
inferior al 10%. Estos anticuerpos purificados por afinidad se
conjugan a continuación con un agente que produce una reacción de
color tras la formación de un sándwich con antígeno
C-polisacárido de S. pneumoniae procedente
de una muestra y anticuerpo adicional C-polisacárido
purificado por afinidad inmovilizado sobre una matriz de
nitrocelulosa.
Para conseguir la aprobación de L.
pneumophila serogrupo I por parte de la Administración de
Fármacos y Alimentos (FDA) de Estados Unidos, el test ICT primero
descrito en la Solicitud de Patente Número 09/139,720, y el test
ICT S. pneumoniae que el tema de la Solicitud relacionada
Número 09/397,110 y sus solicitud relacionada Número 09/156,786,
fue necesario que el encargado de estas solicitudes, Binax, Inc,
llevar a cabo extensivos tests clínicos sobre cada asunto. Muchos
de estos tests clínicos se describen en las dos solicitudes
matrices. Uno de los puntos importantes sobre los tests clínicos e
que las regulaciones de FDA requieren extensivas pruebas clínicas
de tests de diagnóstico en casos en los que el test de diagnóstico
es reconocido por presentar una sustancial partida científica y
técnica de tests que ya son conocidos y que se usan a nivel
comercial. Se cree que la sensibilidad y especificidad de cada uno
de los dos tests son mucho más altas que las mostradas en las
solicitudes matrices indicadas. La razón es que los números
mostrados se basan en la comparación de resultados de tests
clínicos con resultados paralelos obtenidos en las mismas muestras
clínicas con otros procedimientos o técnicas de identificación
(como tests en cultivos celulares) en ensayos anteriormente
disponibles, cuyas pruebas disponibles eran conocidas por no ser
muy fiables incluso cuando utilizaban los mejores métodos
disponibles de identificación para detectar las bacterias
implicadas o sus componentes antigénicos.
En resumen, esta invención presenta la
oportunidad de proporcionar un test de diagnóstico rápido y
elevadamente específico y sensible para la detección de un
componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus
influenzae.
La invención pertenece a un ensayo
inmunocromatográfico (ICT) para la detección de un componente
objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae,
que consiste en los siguientes pasos:
- (a)
- poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira:
- (i)
- una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas;
- (ii)
- una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color;
- (b)
- dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona;
- (c)
- dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y
- (d)
- aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferente el componente
antígeno de carbohidrato objetivo es un antígeno de carbohidrato
capsular de la bacteria tipo b de Haemophilus influenzae, y
el agente etiquetador es oro metálico finamente dividido.
En otra realización preferente los anticuerpos
específicos de antígeno están presentes en una concentración de
entre 7.7 nanogramos/mm^{2} de área superficial y 385
nanogramos/mm^{2} de área superficial en cada punto de un
dispositivo de test cuya reacción antígeno: anticuerpo ocurre.
Aquí se describe con detalle un procedimiento
ICT para detectar antígeno polisacárido capsular de Haemophilus
influenzae tipo b.
Hasta el momento, no se ha reconocido que los
antígenos lipo-policarbonato normalmente
encontrados en bacterias negativas a Gram pueden detectarse por
medio de un inmunoensayo rápido y elevadamente específico y
sensible del tipo ICT que emplea anticuerpos específicos de
antígeno como agentes detectores, cuyos anticuerpos específicos de
antígeno se obtienen de acuerdo con los esquemas para purificar
anticuerpos puros monoclonales a los antígenos de carbohidrato que
se establecen en esta sección. El hecho de que los anticuerpos puros
monovalentes a antígenos bacterianos de carbohidrato pueden ser muy
sensibles y específicos de antígeno sometiéndolos a purificación
por afinidad con un antígeno bacteriano de carbohidrato que
esencialmente está libre de proteínas aún no ha sido apreciado
hasta el momento. Así mismo, el hecho de que los antígenos de
carbohidrato de bacterias positivas y negativas a Gram y/o de capas
capsulares que rodean ambos tipos de bacterias pueden purificarse y
usarse para purificar por afinidad anticuerpos de tales antígenos
para producir anticuerpos específicos de antígenos aún no se ha
reconocido, ni se ha apreciado que los antígenos bacterianos de
carbohidrato pueden detectarse rápidamente con elevada precisión,
sensibilidad y especificidad usando tales anticuerpos específicos
de antígeno como agentes detectores.
La Figura 1 y sus Figuras relacionadas, 1A, 1B y
1C muestran un dispositivo típico ITC del tipo preferente en la
realización de un ensayo para antígeno bacteriano de carbohidrato
de acuerdo con esta invención.
Las Figuras 2, 3 y 4 son gráficos que muestran,
en la Figura 2, la habilidad de los anticuerpos purificados
específicos de antígeno de esta invención para detectar otros
serotipos de H. influenzae tipo b diferentes al que
cultivaron los anticuerpos. En las Figuras 4 y 4, los gráficos
reflejan que los anticuerpos purificados específicos de antígeno de
H. influenzae tipo b no reaccionaron con antígenos de H.
influenzae tipo a, c, d o f (Fig. 3) o con otro no típico H.
influenzae NT1, NT2, NT3 o NT4 o con H.
para-influenzae.
La presente invención representa un avance
excepcional en métodos para la detección de infección bacteriana
por Haemophilus influenzae.
Es de particular importancia la oportunidad que
esta invención brinda para un diagnóstico rápido y una rápida
introducción de una terapia apropiada en situaciones donde aparece
una enfermedad causada por bacterias que parece ser endémica a un
grupo, ya sea un grupo pequeño o limitado, por ejemplo, en un
colegio o un centro geriátrico, o en poblaciones extendidas, como
un pueblo, ciudad o una región más grande.
Hablando en términos generales, el ensayo
inmunocromatográfico preferentes ("ICT") de esta invención
puede diseñarse y configurarse para que funcione sobre cualquier
dispositivo ICT desechable incluido en la técnica. Preferiblemente,
se diseña para llevarse a cabo, y se lleva a cabo, usando un
dispositivo ICT del tipo descrito en la Solicitud de Patente
copendiente con Número de Serie 07/706,639 de Howard Chandler, o
una de sus solicitudes con parte de continuación, todas ellas
asignadas a Smith-Kline Diagnostics, Inc., pero cuya
licencia exclusiva la posee Binax, Inc. (que es el titular de esta
solicitud), en una amplia área de campos entre los que se incluye
el diagnóstico de enfermedades del sistema respiratorio humano.
El dispositivo preferente es adecuadamente
impregnado en una región del mismo con anticuerpos purificados por
afinidad y muy específicos del antígeno al antígeno objetivo de
carbohidrato de Haemophilus influenzae sospechoso de
provocar la enfermedad. Los anticuerpos específicos de antígeno
etiquetados se aplican a otra área del dispositivo. La muestra del
test sospechosa de contener la bacteria es puesta en contacto en
primer lugar con los anticuerpos etiquetados específicos de
antígeno, que a continuación fluyen con la muestra al área del
dispositivo que contiene los anticuerpos específicos de antígeno no
etiquetados, sobre los cuales si el antígeno objetivo autóctono de
la bacteria sospechosa está presente en la muestra, el conjugado
anticuerpo etiquetado: antígeno carbohidrato ya formado se enlaza
tras el contacto con los anticuerpos específicos de antígeno no
etiquetados e inmovilizados, con lo cual se produce una reacción
visible con color. La etiqueta puede ser cualquier sustancia
conocida en la técnica para producir un color visible tras la
reacción de un complejo anticuerpo etiquetado: antígeno con los
anticuerpos enlazados no etiquetados. Tales etiquetas incluyen
varios metales finamente divididos, varias moléculas orgánicas y
varias combinaciones moleculares como combinaciones de enzima con
otras moléculas productoras de color. En esta invención, las
partículas de oro coloidal constituyen la etiqueta preferente.
En el diseño del dispositivo preferente de test,
es muy importante que la concentración de anticuerpo específico de
antígeno presente en cada uno de los dos puntos del dispositivo del
test donde la reacción tiene lugar sea suficiente para asegurar que
el antígeno presente en la muestra del test sea capturado por los
anticuerpos etiquetados específicos de antígeno cuando la muestra
del test entra en contacto con ellos y que el conjugado anticuerpo
etiquetado específico de antígeno: antígeno se capture y mantenga
fácilmente por los anticuerpos enlazados en la línea de captura de
la muestra. El trabajo experimental realizado en relación con esta
invención ha demostrado que el anticuerpo específico de antígeno
activo para el antígeno de carbohidrato objetivo debe estar
presente en cada lugar de un dispositivo de test en el que ocurre la
reacción antígeno: anticuerpo en una concentración de entre 7.7
nanogramos/sq. mm de área superficial y 385 nanogramos/sq. mm de
área superficial. Si concentraciones de anticuerpo específico de
antígeno inferiores a 7.7 nanogramos/sq. mm están presentes en un
lugar donde se pretende que tenga lugar una reacción, es muy
posible que se obtengan resultados falsos negativos.
Tal y como se conoce en la técnica, las
bacterias infecciosas con frecuencia tienen múltiples componentes
antigénicos. Por ejemplo, se sabe que S. pneumoniae tiene un
antígeno capsular además del antígeno de pared celular polisacárido
que es el objetivo del ensayo descrito en las solicitudes matrices
con Números de serie 09/156,486 y 09/397,110. El segundo antígeno
se seleccionó como el antígeno objetivo para el test ahora aprobado
por FDA que se describe en estas solicitudes porque ese antígeno
se encuentra presente en todos los serotipos conocidos de S.
pneumoniae y su mínima reactividad tal y como se describe en la
solicitud aquí incorporada con Número de Serie 09/397,110 es de tal
naturaleza que permite una sencilla diferenciación clínica de
infección provocada por S. pneumoniae con respecto a otras
infecciones. Hay que señalar que los intentos previamente
publicados para detectar S. pneumoniae en fluidos corporales,
en el mejor de los casos, han producidos sistemas que tienen
sensibilidad y especificidad en un 60-70% con
anticuerpos policlonales y monoclonales, lo que supone un índice
inaceptable para fines fiables de diagnóstico.
Entre los fluidos de mamíferos en los que los
antígenos de carbohidrato objetivo han demostrado ser detectados
con éxito en actuales trabajos clínicos con respectivos tests de
ICT descritos y aprobados por FDA para L. pneumophila
serogrupo 1 y S. pneumoniae son, además de la preferente
orina, esputo, exudados nasofaringeales, fluido del oído medio y
fluido cerebroespinal. Otros fluidos en los que estos tests
detectan antígenos objetivo de carbohidrato, cuando están
presentes, incluyen sangre y fluido bronquial.
La selección del antígeno carbohidrato objetivo
para cualquier bacteria particular se basa necesariamente en
consideraciones sobre las características de la reacción cruzada
del antígeno, se sepa que está presente en todos o la mayor parte
de los serotipos de una cepa bacteriana, o se sepa que es peculiar
a un serotipo particular de la cepa, el serotipo es la fuente más
común de enfermedad causada por la bacteria.
Los anticuerpos policlonales que se purificarán
se introducen empleando métodos convencionales, inyectando a un
animal, por ejemplo, conejo o cabra, el antígeno objetivo crudo del
ensayo. Preferiblemente, la preparación de antígeno se somete a una
eliminación celular por calor antes de inyectarse en el animal.
Tras un apropiado lapso de tiempo, se provoca el sangrado del
animal para obtener el suero que contiene los anticuerpos deseados,
a lo que le sigue una purificación de los mismos. Este suero puede
tener un paso intermedio de purificación, por ejemplo, con sulfato
de amonio o con una resina de intercambio de iones para producir un
corte de IgG o puede purificarse directamente.
Con el fin de conseguir una purificación por
afinidad, se cultiva el mismo antígeno objetivo carbohidrato
objetivo empleado para inmunizar al animal y a continuación se
purifica de manera correcta hasta conseguir un estado esencialmente
libre de proteínas. Tal y como aquí se emplea, la expresión
"estado esencialmente libre de proteínas" significa un estado
que contiene no más de, y preferiblemente menos de, aproximadamente
un 10% (peso/peso) de proteína.
Después de purificar el antígeno hasta conseguir
un estado esencialmente libre de proteínas, se enlaza con una
molécula espaciadora a través de un enlace covalente. Ejemplos de
moléculas espaciadoras adecuadas incluyen hidracina, albúmina de
suero bovino ("BSA"), el conjugado de BSA e hidracina y
moléculas similares que son capaces de enlazarse covalentemente con
antígenos purificados de carbohidrato en unos extremos mientras
que conservan otro extremo reactivo que es capaz de enlazarse
covalentemente con un gel de afinidad.
El conjugado antígeno purificado de
carbohidratos: molécula espaciadora se conjuga a continuación con
un gel de afinidad y el gel se usa para purificar los anticuerpos
polivalentes puros en suero obtenido por medio del sangrado del
animal previamente inmunizado, o un corte IgG del mismo. Los
anticuerpos puros (o su corte IgG) se aplican de manera múltiple al
gen de afinidad y se eluyen del mismo como anticuerpos purificados
y elevadamente específicos del antígeno.
Los siguientes ejemplos ilustran el modo de
purificación de anticuerpos de Haemophilus influenzae tipo
b, incluyendo la separación preliminar y la purificación del
antígeno de carbohidrato capsular empleado en la purificación. La
bibliografía cuenta con muchos métodos para efectuar estos pasos de
separación y purificación y pueden sustituirse por aquellos aquí
descritos, siempre y cuando el antígeno purificado obtenido esté
esencialmente libre de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Haemophilus influenzae tipo b
(ATCC # 10211) en un caldo complementado Mueller Hinton a 37ºC, con
un 5% de CO_{2} durante 24 horas sin agitación.
La composición del caldo, por litro, fue:
- Hidrolizado ácido de caseína
- 17.5 g
- Extracto de corazón de vaca
- 3.0 g
- Almidón
- 1.5 g
\vskip1.000000\baselineskip
También se presentaron los siguientes
complementos:
- Hematina
- 15 mg/mL
- NAD (dinucleótido de adenina y nicotina)
- 15 mg/mL
- Extracto de levadura
- 5 mg/mL
El pH de esta mezcla fue 7.3 \pm 0.1 medido a
25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 24 horas, se disolvió 1.82 g. de
bromuro cetiltrimetilamonio CAS #
57-09-0 en 30 mL de agua destilada y
la solución se añadió a 500 mL de sobrenadante del caldo para
producir una concentración final de 0.01 M bromuro
cetiltrimetilamonio. La mezcla se incubó en un baño de hielo con
agitación durante una hora y se dejó a 4ºC durante la noche.
La mezcla del Ejemplo 1 se centrifugó a 12,000
rpm a 4ºC durante 20 minutos para producir una bolita y un
sobrenadante. Ambas se recogieron y trataron, respectivamente, del
siguiente modo:
- (1)
- La bolita se volvió a suspender en 0.5 M NaCl con sonicación y a continuación se precipitó en forma de gotas a 4ºC en diez veces el volumen de la resuspensión en etanol. La solución resultante se almacenó durante la noche a 4ºC para provocar la precipitación.
A continuación, la solución se centrifugó a
12,000 rpm durante 20 minutos. La bolita se disolvió en agua
destilada y a continuación se dializó con agua destilada en un tubo
de diálisis con un peso molecular cortado de 3,500.
- (2)
- El sobrenadante de la mezcla del Ejemplo 1 se almacenó a 40ºC durante la noche, y a continuación se observó la formación de un precipitado. Todos los contenidos del envase se centrifugaron a 12,000 rpm durante 20 minutos. Se recuperó una bolita y se volvió a suspender en 0.5 M NaCl con sonicación. La solución resultante se precipitó en forma de gotas en diez veces el volumen de la resuspensión en etanol a 4ºC. La solución se almacenó durante la noche a 4ºC y se volvió a formar un precipitado. La solución y el precipitado se centrifugaron a 12,000 rpm durante 20 minutos y se recuperó una bolita. La bolita se disolvió en agua destilada y dializó con agua destilada en un tubo de diálisis con un peso molecular cortado de 3,500.
Después, las soluciones dializadas (1) y (2)
mencionadas se colocaron en un fondo común y se liofilizaron. S
obtuvieron 90 mg. de antígeno polisacárido Haemophilus
influenzae tipo b.
Se preparó una solución de este antígeno de
concentración 5.3 \mug/ml y se sometió a un ensayo Lowry de
proteínas y se descubrió que contenía un 5% de proteínas
(peso/peso). La solución también fue sometida a un test de
carbohidrato mediante el método fenol-ácido sulfúrico y demostró
tener un 36% (peso/peso). La solución fue sometida a un test de
actividad con el método ELISA y con el inmunoblot
SDS-PAGE y resultó tener la actividad necesaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron cinco mg. de antígeno
polisacárido Haemophilus influenzae tipo b liofilizado en
4.52 ml de agua destilada y el pH se ajustó a 5-6
con HCl; a continuación, se añadieron 15.64 mg de un conjugado
albúmina de suero bovino-hidracina de pH 5.6, y a
continuación se mezcló durante tres minutos.
Se disolvieron 2.6 \mug de
1-etilo-3-(3-dimetilpropilo)carbodiimido
("EDAC") en 100 \mul de agua destilada. Se añadieron 50
\mul de esta solución a la solución conjugada
antígeno/BSA-hidracina y a continuación se mezclo
durante tres minutos. El balance de la solución EDAC se añadió a
continuación a la mezcla y posteriormente se mezcló durante dos
horas a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 8 con NaOH y se
mezcló durante una hora a temperatura ambiente almacenándose más
tarde durante la noche a 4ºC.
Al día siguiente, el pH de la mezcla almacenada
se ajustó a 7 con HCl y una porción fue sometida al test de ELISA,
lo que confirmó su actividad.
2.12 mg de conjugado de antígeno tratado con
EDAC/hidracina BSA se mezclaron con 2.4 g de gel Spherilose^{TM}
lavada y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente
durante dos horas bajo condiciones completas de mezcla. A
continuación se disolvieron 33.6 g de cianoborohidruro sódico en
480 \mul de agua disuelta y la mitad de esta solución se añadió a
la mezcla de conjugado antígeno/hidracina BSA y gel
Spherilose^{TM}. La mezcla resultante se incubó a temperatura
ambiente durante 3.5 horas bajo condiciones completas de mezcla. Un
antígeno/BSA hidracina/gel Spherilose^{TM} se separó y se lavó
con 20 volúmenes de agua destilada, lo que le siguió la
resuspensión en 4.8 ml de 0.2 M búfer bloqueador
Tris-HCl de pH 7. Los restantes 240 \mul de la
solución de cianoborohidruro sódico anteriormente descrita se
añadió a la suspensión y esta mezcla se incubó a temperatura
ambiente durante una hora y después durante la noche a 4ºC bajo
condiciones completas de mezcla.
El gel enlazado y bloqueado se separó y lavó
sucesivamente con 20 a 30 volúmenes de agua destilada, salina con
búfer de fosfato con triple fuerza de pH 7.2, salina con búfer de
fosfato con fuerza estándar de pH 9.2 y tiocianato sódico en salina
con búfer de fosfato de pH 7.5 para estimular un simulacro de
purificación de anticuerpo y se empaquetó en una columna de
afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Al suero de
conejo-\alpha-Haemophilus influenzae tipo
b, se añadió NaCl hasta conseguir una concentración final de 0.5
NaCl y se disolvió en suero. La mezcla se centrifugó a 5,000 XG
durante 20 minutos y s filtró a través de algodón hidrófilo. El gel
de afinidad del Ejemplo 3 se equilibró con salina con búfer de
fosfato con fuerza normal y el filtrado de suero se aplicó a este
gel cuatro veces. El gel se lavó a continuación con salina con
búfer de fosfato con fuerza triple, seguido de salina con búfer de
fosfato con fuerza normal para retirar los componentes de suero que
no se habían acoplado.
Después, los anticuerpos se eluyeron del gel con
3 M tiocianato sódico en salina con búfer de fosfato (pH = 7.5),
que fue seguido por 3 M tiocianato sódico en agua destilada (pH 5 a
6). Los anticuerpos purificados recuperados fueron sometidos a
diálisis en salina con búfer de fosfato con fuerza normal de pH
7.2.
Se preparó un dispositivo de test consistente en
una caja de cartón con bisagras equipada con una ventana para dejar
ver los resultados del test y los resultados control tal y como se
muestra en la Figura 1. El dispositivo tiene una ranura donde se
coloca un pozo para el hisopo preformado de plástico en el lado de
la derecha (etiquetado con 1 en el dibujo) para recibir el hisopo
húmedo con la muestra. Una etiqueta mostrada en la Figura 1A se
coloca a continuación sobre todo el lado derecho del dispositivo.
La etiqueta ha sido equipada con dos agujeros, uno inferior (macado
con B en la Figura 1A) en el que se inserta el hisopo saturado y
uno superior (marcado con A en la Figura 1A) hacia el que el hisopo
se empujará tras la inserción del mismo en el agujero B. La
colocación de la etiqueta con sus agujeros, A y B, y el pozo del
hisopo cooperan en la sujeción del hisopo en la posición apropiada
durante el ensayo y ayudan en la expulsión de la muestra de test
absorbida.
Una tira de test pre-montada
(marcada con B en la Figura 1) descrita a continuación, se inserta
en la ranura en el lado izquierdo (etiqueta 2 en la Figura 1) y se
mantiene en su lugar con una adhesivo aplicado a la parte inferior
de la misma. Una etiqueta mostrada en la Figura 1B se coloca sobre
el lado izquierdo. Se ha equipado con un único agujero (marcado con
D en la Figura 1B) que coincide con el agujero A del lado derecho
cuando el dispositivo se cierra para llevar a cabo el ensayo.
El dispositivo montado se almacena en una bolsa
sellada con un producto secante hasta que se use. Antes de sellar y
almacenar la bolsa, se coloca una cinta ligeramente adhesiva en el
borde externo de la mitad derecha del dispositivo.
Tal y como se muestra en la Figura 1C, la tira
del test para el ensayo está formada por una almohadilla de
material absorbente que ha sido impregnada con un conjugado de
partículas de oro y anticuerpos purificados por afinidad de conejo
anti-Haemophilus influenzae tipo b. En la práctica, este
conjugado puede fluir cuando entra en contacto con la muestra
líquida del test. La almohadilla con el conjugado entra en contacto
con una almohadilla de nitrocelulosa en la que se ha establecido
una línea de captura para la muestra que ha reaccionado con el
conjugado de oro insertando en ella anticuerpos purificados por
afinidad de conejo anti-Haemophilus influenzae B. La
almohadilla de nitrocelulosa también incluye una línea descendente
de control establecida arrancando la almohadilla con
inmunoglobulina anti-conejo de cabra (IgG). Tras
pasar por la almohadilla de nitrocelulosa, el residido de la
muestra pasa a una almohadilla absorbente que sirve como una
reserva para el líquido.
La almohadilla de conjugado puede ser poliéster
no tejido o acetato de celulosa extrudido. Al preparar la
almohadilla para uso en este ensayo, se conjugan partículas de oro
de 45 mm de diámetro, de acuerdo con el método de DeMay, "The
Preparation and Use of Gold Probes" en Immunochemistry;
Modern Methods and Application (J. M. Polar y S. Van Norden,
eds, Wright, Bristol, England, 1986) o cualquiera de otros métodos
conocidos, con anticuerpos purificados por afinidad Haemophilus
influenzae B. La purificación por afinidad preferiblemente se
consigue tal y como se ha descrito anteriormente. Ver también P.
Tyssen, "Affinity chromatography of Immunoglobulins or
Antibodies", contenido en Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays (R. H. Burden y P. H. Van Knippedberge, eds.,
Elsevier, Nueva York (1985). Cualquier método conocido de
purificación por afinidad puede sustituirse por el método
preferente sin partir de los límites de la presente invención.
Las partículas conjugadas de oro se mezclan con
agente secante y se insertan en una almohadilla conjugada. El agente
secante es 5 mM sodio tetraborato líquido, pH 8.0, que contiene 0.1%
de albúmina de suero bovino, 0.1% Triton X-100, 2%
Tween 20, 8.0% sacarosa, y 0.02% de azida sódica. La almohadilla se
calienta lo suficiente como para retirar todo el líquido presente y
se almacena en un ambiente de bajo humedad en espera del montaje
del dispositivo del test.
Especialmente se eligen estas almohadillas para
sujetar el conjugado seco y para liberarlo cuando se humedece por
la muestra.
En primer lugar, la almohadilla de nitrocelulosa
se trata insertando anticuerpos purificados por afinidad
anti-Haemophilus influenzae b en una primera parte de la
almohadilla. Estos anticuerpos actúan como líneas de captura. Se
establece una línea de control desmontando IgG de cabra
anti-conejo sobre la superficie de la almohadilla.
Para las líneas que se encuentran desmontadas sobre la almohadilla
de nitrocelulosa, se usa una solución consistente en 5 mM fosfato
sódico, pH 7.4, que contiene 5% de metanol y 0.102% de tinte
Intrawhite como fluido portador para los anticuerpos. La
almohadilla de nitrocelulosa se deseca a continuación a una
temperatura de 18-25ºC para producir una absorción
permanente de proteína en la misma.
La almohadilla absorbente empleada es de
material celulósico disponible en comercios como Ahlstrom 243. No
requiere un tratamiento especial. Todas las almohadillas se montan
en el orden mostrado en la Figura 1C sobre una tira adhesiva cuando
el dispositivo del test se une para enviarlo al cliente.
En la realización del ensayo de acuerdo con la
invención, se utilizan los dispositivos de test finalizados que
tienen el pozo del hisopo, las sobrecapas con agujeros y la tira de
test colocada tal y como se muestra en las Figuras. Un hisopo del
tipo Dacron fibroso se sumerge un poco en la muestra de orina y a
continuación se retira de la muestra en inmediatamente se inserta,
a través de un agujero de capa B en el lado derecho del
dispositivo, en el pozo de la muestra del dispositivo del test. Se
añaden dos o tres gotas de "Reagente A", en este caso una
solución de 2.0% Tween 20, 0.05% azida sódica y 0.5% sulfato
dodecil sódico en 0.05 M de búfer citrato
sódico-fosfato sódico de pH 6.5 a la muestra a
través del mismo orificio. La tira adhesiva sobre el borde del lado
derecho se levanta y el dispositivo se cierra. La muestra
inmediatamente entra en contacto con la almohadilla de conjugado y
fluye a lo largo de la tira inmunocromatográfica. Después de 15
minutos, se ven las ventanas de la muestra del test y el control y
se anotan los resultados.
Se analizaron varios especimenes de orina de dos
tipos en dispositivos de test como los descritos anteriormente. Los
dos tipos de muestras de orina evaluados fueron orina de pacientes
sin ninguna infección del tipo neumonía y orina que contenía
Haemophilus influenzae b. Todas las muestras se testaron por
duplicado. La siguiente tabla resume los resultados del test:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados mostrados fueron consistentes
tanto para almohadillas de poliéster no cosidas como para
almohadillas conjugadas con acetato celulosa extraídas. No se
observaron diferencias cuando se echaron dos o tres gotas de
"Reagente A".
Una preparación comercial de H.
influenzae tipo b vendida bajo la etiqueta
"ACT-HIB" por los laboratorios
Pasteur-Merieux-Connaught como
vacuna de conjugado H. influenzae tipo b se inyectó en un
conejo y se provocó que el conejo sangrara tras un lapso de tiempo
de aproximadamente 60 días.
El antígeno purificado capsular esencialmente
libre de proteínas tal y como se describe en el Ejemplo 2 se
conjugó covalentemente con un conjugado
hidracina-BSA tal y como se muestra en el Ejemplo 3
y a su vez, el conjugado antígeno: hidracina-BSA se
enlazó covalentemente con el mismo gel de afinidad utilizado en el
Ejemplo 3.
El suero de conejo que contenía anticuerpos
puros policlonales de H. influenzae tipo b se purificó con
gel de afinidad antígeno purificado:BSA-hidracina
del modo descrito en el Ejemplo 4. Los anticuerpos específicos de
antígeno eluídos del gel se utilizaron a continuación en pruebas de
compatibilidad y reacción cruzada, cuyos resultados se reflejan en
gráficos en las Figuras 2, 3 y 4.
Las pruebas de compatibilidad se llevaron a cabo
usando un método modificado de ELISA del siguiente modo:
Placas de microtítulo de poliestireno con 96
pozos de Dynex Technologies, Inc. se cubrieron con 100 mcl.
alícuotas de varias cepas de suspensión celular H.
influenzae (0.5-0.7 x 108 células/ml.). Las
placas se incubaron a 37ºC durante dos horas y se lavaron cuatro
veces con PBS de pH 8.0 que contenía 0.02% de Tween 20
("PBST"). Los pozos de microtítulo se bloquearon con 200 mcl.
de PBS de pH 7.2 que contenía BSA en una concentración de 1 mg/ml
durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a
lavar cuatro veces con PBST.
Los anticuerpos purificados específicos de
antígeno obtenidos del conejo inmunizado con
ACT-HIB disponible en el mercado tal y como se ha
descrito previamente en estos ejemplos se diluyeron dos veces a
través de las placas comenzando en una concentración de 0.5 mcg/ml
y acabando en 0.008 mcg/ml.
La primera línea horizontal de las palcas se usó
como control. En lugar de la solución de anticuerpo, se añadieron
100 mcl. de PBS a cada pozo de esta fila. Las placas se incubaron
durante una hora a temperatura ambiente y a continuación se lavaron
cuatro veces con PBST.
A continuación, se añadieron 100 ml. de IgG de
cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de
rábano picante, con dilución 1:6000 en PBST a cada pozo y las
placas se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. A
continuación, se volvieron a lavar con PBST, y se añadieron 100
mcl. de Sistema Sustrato Peroxidasa TMB de Laboratorios KPL,
Gaithersburgo (Maryland).
La reacción en cada pozo fue frenada con 50 mcl.
de H_{2}SO_{4} después de tres a cinco minutos del desarrollo
de color. Las placas se contabilizaron en una longitud de onda de
450 nm en un lector espectométrico ELISA.
Las varias cepas de H. influenzae tipo b
testadas fueron productos disponibles en la Colección Americana de
Cultivos Tipo bajo los números de acceso # 10211 (siendo ésta la
cepa utilizada en los Ejemplos 1-5), # 43335, #
43334. Los resultados de las pruebas, que se reflejan en gráficos
en la Figura 2, muestran que los anticuerpos específicos de
antígeno obtenidos al inyectar a un conejo con
ACT-HIB, hacer sangrar al conejo, y purificar el
suero resultante del conejo que contiene anticuerpos con antígeno
capsular purificado de ATCC # 10211 de acuerdo con los
procedimientos de los Ejemplos 2 y 3 (designados como
"[Hib-Ab]" en la Figura 2), fueron más
específicos y reactivos con ATCC # 10211, pero también elevadamente
específicos y reactivos con el antígeno capsular de ATCC # 43335,
de ATCC # 51654 y # 43334 en concentraciones que oscilan entre
0.063 mcg/ml y 0.5 mcg/ml, en comparación con el control. Además,
usando la detección instrumental de la reacción
antígeno-anticuerpo, el anticuerpo específico de
antígeno de esta invención produjo una reactividad discernible con
antígeno en relación con el control a concentraciones inferiores
como a 0.008 mg/mcl.
En estas pruebas, los antígenos purificados
específicos de antígeno H. influenzae tipo b de este ejemplo
se volvieron a testar con otras especies de H. influenzae, en
dos lotes, siguiendo el protocolo de test descrito para las pruebas
de compatibilidad de la Figura 2, usando los mismos controles
descritos para esas pruebas.
Para el primer lote, la Figura 3 es un gráfico
que compara la reactividad de los anticuerpos específicos de
antígeno de esta invención con el antígeno de ATCC # 10211 con el
que son específicos, con anticuerpos de H. influenzae
("Hi" en la figura) tipos a, c, d y f. Demuestra una falta de
reactividad cruzada con todos los tipos a, c, d y f, en comparación
con la elevada reactividad y especificidad para el tipo b antígeno
H. influenzae de ATCC # 10211, en concentraciones de 0.008
mcg/ml a 0.063 mg/ml. Se observa una apenas perceptible reactividad
cruzada con solamente H. influenzae tipo f en
concentraciones de anticuerpo ligeramente superiores a 0.063 mcg/ml
pero incluso en las concentraciones más elevadas de 0.05 mcg/ml, la
reactividad con antígeno del tipo f es inferior a la del
tipo ATCC # 10211 en la concentración más baja de anticuerpo de
0.008 mcg/ml. La ligera reactividad cruzada del tipo f con
el anticuerpo específico de antígeno fue considerada como
menor.
Para el segundo lote, la Figura 4 es un gráfico
que compara la reactividad de los anticuerpos purificados
específicos de antígeno de esta invención con cada una de las
cuatro especies sin tipificar de H. influenzae (NT1, NT2,
NT3 y NT49 más H. parainfluenzae con H. influenzae
tipo b cepa ATCC # 10211. La Figura 4 demuestra la falta de
reactividad cruzada de los anticuerpos específicos de antígeno de
la invención con todas las especies sin tipificar de H.
parainfluenzae 1, 2, 3 y 4 y una ligera reactividad cruzada con
H. parainfluenzae en concentraciones de anticuerpo de 0.125
mcg/ml a 0.5 mcg/ml. Sin embargo, esta reactividad cruzada es de
menor orden que la reactividad de los anticuerpos en una
concentración de 0.008 mcg/ml con cepas H. influenzae tipo b
ATCC # 10211 y se consideró que apenas tenía importancia. La Figura
4 también confirma la fuerte especificidad de los anticuerpos de la
invención con el antígeno capsular H. influenzae tipo b.
Claramente, los anticuerpos purificados
específicos de antígeno de antígenos bacteriales de carbohidratos
pueden utilizarse de manera beneficiosas para detectar el
correspondiente antígeno puro objetivo de carbohidratos en
cualquier tipo de inmunoensayo y no solamente en los aquí
descritos. Claramente también, la sustitución de estos anticuerpos
purificados específicos de antígeno por anticuerpos policlonales
puros en ensayos previamente descritos para el mismo antígeno de
carbohidratos dará como resultado una mayor fiabilidad,
sensibilidad y especificidad de cada uno de estos ensayos. Además,
y a pesar de que no se ha demostrado aún, se cree que la
sustitución de estos anticuerpos purificados específicos de
antígeno por anticuerpos monoclonales en ensayos descritos en la
técnica anterior darán resultados al menos igualmente buenos y, se
espera que en muchos caos se obtengan resultados mejores y más
fiables que los presentados.
Se señala que los principios de esta invención
tal y como aquí se establece conducen por sí mismos a una plétora
de adaptaciones, permutaciones y combinaciones con técnicas de
ensayos previamente presentadas por otros. Muchos de los pasos aquí
descritos pueden llevarse a cabo usando diferentes reagentes o
condiciones a los aquí específicamente descritos. Otros métodos
para purificar los antígenos de carbohidrato hasta conseguir un
estado esencialmente libre de proteínas pueden fácilmente
concebirse. Una amplia bibliografía, patentada y no patentada,
habla sobre el diseño y uso de dispositivos en pruebas de
inmunoensayos desechables, de un solo uso y fiables que podrían
sustituirse por el dispositivo ICT preferentes aquí descrito y
recomendado. No se pretende que la presente invención esté limitada
con respecto a los dispositivos sustituibles para ensayos,
materiales, ingredientes o procesos en la medida que lo limiten las
siguientes reivindicaciones.
Claims (3)
1. Un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la
detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de
Haemophilus influenzae, que consiste en los siguientes
pasos:
- (a)
- poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira:
- (i)
- una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas;
- (ii)
- una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color;
- (b)
- dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona;
- (c)
- dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y
- (d)
- aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.
2. El método de la Reivindicación 1 cuyo
componente objetivo antígeno de carbohidrato es un antígeno de
carbohidrato capsular de bacteria Haemophilus influenzae
tipo b, y el agente etiquetador es oro metálico finamente
dividido.
3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1
en el que los anticuerpos específicos de antígeno están presentes
en una concentración de entre 7.7 nanogramos/mm^{2} de área
superficial y 385 nanogramos/mm^{2} de área superficial en cada
punto de un dispositivo de test cuya reacción antígeno: anticuerpo
ocurre.
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