ES2329651T3 - Metodo para detectar la presencia de una bacteria objetivo y un antigeno de carbohidrato de la misma. - Google Patents

Abstract

Un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae, que consiste en los siguientes pasos: (a) poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira: (i) una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas; (ii) una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color; (b) dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona; (c) dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y (d) aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.

Description

Método para detectar la presencia de una batería objetivo y un antígeno de carbohidrato de la misma.

Introducción a la presente invención

La presente invención hace referencia a la consecución de diagnósticos rápidos y precisos, de elevada sensibilidad y especificidad, de infusiones bacterianas provocadas por bacterias del género Haemophilus infuenzae caracterizado por la posesión de antígenos de carbohidrato. En particular, la invención incluye la purificación inicial de tales antígenos de carbohidrato hasta conseguir un estado libre esencialmente de proteínas, seguido de la utilización de cada antígeno de carbohidrato purificado para purificar por afinidad los anticuerpos puros polivalentes a dicho antígeno y la utilización de dichos anticuerpos purificados en pruebas de diagnóstico de elevada precisión, especificidad y sensibilidad para detectar la presencia de la bacteria original.

La invención hace referencia a Haemophilus infuenzae que posee antígenos de carbohidrato, cuyas bacterias son negativas a la tinción de Gram. Los anticuerpos purificados tienen al menos el mismo orden de especificidad y sensibilidad que los anticuerpos monoclonales disponibles en el mercado y son más sencillos de producir y tratar que muchos anticuerpos monoclonales. Ofrecen varias oportunidades para pruebas de rápido diagnóstico, por ejemplo, a través de inmunoensayos ICT, para identificar bacterias que hasta el momento habían sido difíciles de identificar de manera rápida y precisa, por lo que los diagnósticos enfermedades bacterianas que provocaron con frecuencia llegaban tarde y de manera complicada, utilizando una metodología muy voluminosa.

Contexto de la invención

Las bacterias negativas a Gram son conocidas por tener en común la posesión de al menos un lipo-polisacárido u otro antígeno de lipo-policarbonato, mientras que las bacterias positivas a Gram son conocidas por poseer la característica común de tener al menos un antígeno de carbohidrato que es un ácido lipoteicoico o ácido teicoico o derivado de alguno de ellos. Tanto las bacterias positivas al Gram como las negativas también tienen antígenos de carbohidrato que son capsulares, es decir, aquellos antígenos que se encuentran en una capa capsular pesada en su estado nativo. Esta capa capsular constituye una sustancia del tipo baba que rodea la pared celular de la bacteria en la mayoría de las bacterias.

La Solicitud de Estados Unidos con número de serie 09/139,720, describe la purificación a un estado libre esencialmente de proteínas de antígenos lipo-carbohidratos de bacterias de la especie Legionella, que eran todas positivas a Gram. Aquí se subraya la purificación de antígenos de carbohidrato de serotipos Legionella pneumophila, incluyendo, sin limitación, el antígeno O-polisacárido de L. pneumophila serotipo 1, cuya purificación a un estado esencialmente libre de proteínas se describe con detalle.

La solicitud muestra que cuando el antígeno O-carbohidrato esencialmente libre de proteínas de L. pneumophila serotipo 1 (cuyo serotipo es conocido por ser el organismo causante de alrededor del 70% de las enfermedades similares a la neumonía provocadas por la Legionella que pueden ocurrir) está unido (a través de una molécula espaciadora) a una columna de afinidad como la descrita y los anticuerpos puros monoclonales al antígeno no purificado pasan sobre la columna descrita, los anticuerpos purificados resultantes son en un alto grado específicos al antígeno y fácilmente identificarán el mismo antígeno cuando esté presente en fluidos corporales tomados de paciente con la enfermedad causada por Legionella pneumophila serotipo 1. La orina demuestra ser un fluido corporal preferente para el fin diagnóstico porque:

(1)

El antígeno de L. pneumophila serotipo 1 aparece en la orina antes en el estado enfermo y persiste durante algunos días después de que se haya iniciado el apropiado tratamiento terapéutico;

(2)

La recogida de la muestra de test no es invasiva y es simple, provocando un mínimo trastorno para el paciente y no requiere personal especialmente formado o instrumentación especialmente diseñada; y

(3)

Las muestras de, por ejemplo, esputo pueden dar resultados falsos positivos o falsos negativos debido a las dificultades para obtener y cultivar la muestra, la posible presencia de colonias de bacterias en la nariz o garganta del paciente que se encuentran crónicamente presente y que no son la causa de la enfermedad, así como otras dificultades similares.

La bacteria de L. pneumophila serotipo 1 presente en la orina está muerta y tiene al menos en parte una pared celular rota cuando pasa a través del hígado; por ello, el antígeno se encuentra en un estado fácilmente accesible para los anticuerpos específicos al antígeno depositados en dos áreas sobre la tira del test ICT.

La eficacia de los anticuerpos específicos de antígenos descritos en la Solicitud de Estados Unidos con número de serie 09/139,720 al identificar bacterias completas y hasta cierto punto vivas en un medio acuoso que constituye muestras ambientales se demuestra además en la continuación en parte en la Solicitud con el número de serie 09/458,988, donde se describe un inmunoensayo con enzimas de elevada especificidad y sensibilidad. Este ensayo se basa en el uso del antígeno como agente detector de anticuerpos específicos al antígeno obtenidos tras la purificación de anticuerpos policlonales puros tal y como se describe con detalle en la solicitud relacionadas. La sensibilidad y la especificidad de los anticuerpos así purificados se ilustra en parte por los breves periodos de tiempo en los que el inmunoensayo con enzimas produjo resultados informativos, así como por las bajas concentraciones (0.05 \mug por test) de anticuerpos específicos de antígeno que dieron igualmente resultados informativos con un periodo de incubación más largo (1 hora).

La Solicitud de Estados Unidos con número de serie 09/397,110 describe la purificación hasta lograr un estado esencialmente libre de proteínas de un antígeno con pared celular C-polisacárido presente en la pared celular neumocócica de todos los serotipos S. pneumoniae. Este antígeno es un polisacárido que contiene fosfocolida derivado de ácido teicoico. La cepa Streptococcus pneumoniae de bacterias son positivas a la tinción Gram.

El antígeno esencialmente libre de proteínas (que contiene menos de aproximadamente 10% de las mismas) se enlaza covalentemente con una molécula espaciadora que a su vez se enlaza covalentemente con una columna de afinidad y la columna así preparadas se usa a continuación para purificar anticuerpos policlonales puros a S. pneumoniae. Los anticuerpos purificados resultantes específicos al antígeno mostraron una elevada sensibilidad y especificidad en un test ICT para identificar S. pneumoniae en fluidos corporales, incluyendo la orina en particular.

Se han realizado numerosos y varios esfuerzos en el pasado para usar anticuerpos polivalentes puros para carbohidratar antígenos, o anticuerpos monoclonales a tales antígenos, de varias bacterias infecciosas negativas o positivas a Gram, responsables de enfermedades del tracto bajo respiratorio en diversas pruebas, incluyendo ELISA, inmunoelectroforesis con contador y/o pruebas con aglutinación de látex para buscar la presencia de la bacteria específica buscada. Mientras que algunas de estas pruebas han sido útiles en algunos casos, ninguna de ellas ha conseguido la suficiente aceptación clínica en lo relativo a su fiabilidad para uso con independencia de las pruebas de cultivo celular. Los inconvenientes de las pruebas de cultivo celular y su vaga fiabilidad se han documentado con gran detalle en la técnica y se recogen en las solicitudes relacionadas 09/139,720 y 09/397,110.

Molokova et al. ("C-21. El desarrollo de un rápido test inmunocromatográfico (ICT) para la detección de Streptococcus pneumoniae en orina", Resúmenes del encuentro general de la Sociedad Americana de Microbiología, The Society, Washington, DC, Vol. 99, Mayo 31, 1999, p. 109) trata sobre el desarrollo de un rápido test para la detección de S. pneumoniae. Dicho test puede tener el formato de membrana de flujo lateral y se basa en los anticuerpos purificados por afinidad específicos a C-polisacáridos.

More et al. ("Desarrollo de un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de Legionella pneumo-phila", Resúmenes del encuentro general de la Sociedad Americana de Microbiología, Encuentro 98º, Atlanta, GA, Mayo 17-21, 1998) facilita información sobre el desarrollo de un ensayo con inmunodiagnóstico para el análisis de L. Pneumophila serogrupo I en especímenes clínicos y ambientales.

WO 98/55871 está relacionado con el método para la detección de una infección con E. Coli enterohemorrágica. Con este fin, anticuerpos anti-polisacáridos en una muestra reaccionan con lipo-polisacáridos de E. Coli enterohemorrágica inmovilizados en partículas portadoras. La infección se detecta a continuación por medio de pasos espectroscópicos determinando la extensión de la aglutinación.

WO 00/16803 trata de un ensayo inmunocromatográfico específicos y sensible ("ICT"), llevado a cabo durante aproximadamente 15 minutos, para la detección de Streptococcus pneumoniae en un fluido corporal. En el ensayo, los anticuerpos al antígeno C-polisacárido de S. pneumoniae cultivados en conejos se purifican por afinidad con antígeno aislado y purificado de C-polisacárido que tiene un contenido proteico inferior al 10%. Estos anticuerpos purificados por afinidad se conjugan a continuación con un agente que produce una reacción de color tras la formación de un sándwich con antígeno C-polisacárido de S. pneumoniae procedente de una muestra y anticuerpo adicional C-polisacárido purificado por afinidad inmovilizado sobre una matriz de nitrocelulosa.

Para conseguir la aprobación de L. pneumophila serogrupo I por parte de la Administración de Fármacos y Alimentos (FDA) de Estados Unidos, el test ICT primero descrito en la Solicitud de Patente Número 09/139,720, y el test ICT S. pneumoniae que el tema de la Solicitud relacionada Número 09/397,110 y sus solicitud relacionada Número 09/156,786, fue necesario que el encargado de estas solicitudes, Binax, Inc, llevar a cabo extensivos tests clínicos sobre cada asunto. Muchos de estos tests clínicos se describen en las dos solicitudes matrices. Uno de los puntos importantes sobre los tests clínicos e que las regulaciones de FDA requieren extensivas pruebas clínicas de tests de diagnóstico en casos en los que el test de diagnóstico es reconocido por presentar una sustancial partida científica y técnica de tests que ya son conocidos y que se usan a nivel comercial. Se cree que la sensibilidad y especificidad de cada uno de los dos tests son mucho más altas que las mostradas en las solicitudes matrices indicadas. La razón es que los números mostrados se basan en la comparación de resultados de tests clínicos con resultados paralelos obtenidos en las mismas muestras clínicas con otros procedimientos o técnicas de identificación (como tests en cultivos celulares) en ensayos anteriormente disponibles, cuyas pruebas disponibles eran conocidas por no ser muy fiables incluso cuando utilizaban los mejores métodos disponibles de identificación para detectar las bacterias implicadas o sus componentes antigénicos.

En resumen, esta invención presenta la oportunidad de proporcionar un test de diagnóstico rápido y elevadamente específico y sensible para la detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae.

Breve descripción de la invención

La invención pertenece a un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae, que consiste en los siguientes pasos:

(a)

poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira:

(i)

una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas;

(ii)

una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color;

(b)

dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona;

(c)

dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y

(d)

aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.

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En una realización preferente el componente antígeno de carbohidrato objetivo es un antígeno de carbohidrato capsular de la bacteria tipo b de Haemophilus influenzae, y el agente etiquetador es oro metálico finamente dividido.

En otra realización preferente los anticuerpos específicos de antígeno están presentes en una concentración de entre 7.7 nanogramos/mm^{2} de área superficial y 385 nanogramos/mm^{2} de área superficial en cada punto de un dispositivo de test cuya reacción antígeno: anticuerpo ocurre.

Aquí se describe con detalle un procedimiento ICT para detectar antígeno polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b.

Hasta el momento, no se ha reconocido que los antígenos lipo-policarbonato normalmente encontrados en bacterias negativas a Gram pueden detectarse por medio de un inmunoensayo rápido y elevadamente específico y sensible del tipo ICT que emplea anticuerpos específicos de antígeno como agentes detectores, cuyos anticuerpos específicos de antígeno se obtienen de acuerdo con los esquemas para purificar anticuerpos puros monoclonales a los antígenos de carbohidrato que se establecen en esta sección. El hecho de que los anticuerpos puros monovalentes a antígenos bacterianos de carbohidrato pueden ser muy sensibles y específicos de antígeno sometiéndolos a purificación por afinidad con un antígeno bacteriano de carbohidrato que esencialmente está libre de proteínas aún no ha sido apreciado hasta el momento. Así mismo, el hecho de que los antígenos de carbohidrato de bacterias positivas y negativas a Gram y/o de capas capsulares que rodean ambos tipos de bacterias pueden purificarse y usarse para purificar por afinidad anticuerpos de tales antígenos para producir anticuerpos específicos de antígenos aún no se ha reconocido, ni se ha apreciado que los antígenos bacterianos de carbohidrato pueden detectarse rápidamente con elevada precisión, sensibilidad y especificidad usando tales anticuerpos específicos de antígeno como agentes detectores.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 y sus Figuras relacionadas, 1A, 1B y 1C muestran un dispositivo típico ITC del tipo preferente en la realización de un ensayo para antígeno bacteriano de carbohidrato de acuerdo con esta invención.

Las Figuras 2, 3 y 4 son gráficos que muestran, en la Figura 2, la habilidad de los anticuerpos purificados específicos de antígeno de esta invención para detectar otros serotipos de H. influenzae tipo b diferentes al que cultivaron los anticuerpos. En las Figuras 4 y 4, los gráficos reflejan que los anticuerpos purificados específicos de antígeno de H. influenzae tipo b no reaccionaron con antígenos de H. influenzae tipo a, c, d o f (Fig. 3) o con otro no típico H. influenzae NT1, NT2, NT3 o NT4 o con H. para-influenzae.

Descripción detallada de la invención

La presente invención representa un avance excepcional en métodos para la detección de infección bacteriana por Haemophilus influenzae.

Es de particular importancia la oportunidad que esta invención brinda para un diagnóstico rápido y una rápida introducción de una terapia apropiada en situaciones donde aparece una enfermedad causada por bacterias que parece ser endémica a un grupo, ya sea un grupo pequeño o limitado, por ejemplo, en un colegio o un centro geriátrico, o en poblaciones extendidas, como un pueblo, ciudad o una región más grande.

Hablando en términos generales, el ensayo inmunocromatográfico preferentes ("ICT") de esta invención puede diseñarse y configurarse para que funcione sobre cualquier dispositivo ICT desechable incluido en la técnica. Preferiblemente, se diseña para llevarse a cabo, y se lleva a cabo, usando un dispositivo ICT del tipo descrito en la Solicitud de Patente copendiente con Número de Serie 07/706,639 de Howard Chandler, o una de sus solicitudes con parte de continuación, todas ellas asignadas a Smith-Kline Diagnostics, Inc., pero cuya licencia exclusiva la posee Binax, Inc. (que es el titular de esta solicitud), en una amplia área de campos entre los que se incluye el diagnóstico de enfermedades del sistema respiratorio humano.

El dispositivo preferente es adecuadamente impregnado en una región del mismo con anticuerpos purificados por afinidad y muy específicos del antígeno al antígeno objetivo de carbohidrato de Haemophilus influenzae sospechoso de provocar la enfermedad. Los anticuerpos específicos de antígeno etiquetados se aplican a otra área del dispositivo. La muestra del test sospechosa de contener la bacteria es puesta en contacto en primer lugar con los anticuerpos etiquetados específicos de antígeno, que a continuación fluyen con la muestra al área del dispositivo que contiene los anticuerpos específicos de antígeno no etiquetados, sobre los cuales si el antígeno objetivo autóctono de la bacteria sospechosa está presente en la muestra, el conjugado anticuerpo etiquetado: antígeno carbohidrato ya formado se enlaza tras el contacto con los anticuerpos específicos de antígeno no etiquetados e inmovilizados, con lo cual se produce una reacción visible con color. La etiqueta puede ser cualquier sustancia conocida en la técnica para producir un color visible tras la reacción de un complejo anticuerpo etiquetado: antígeno con los anticuerpos enlazados no etiquetados. Tales etiquetas incluyen varios metales finamente divididos, varias moléculas orgánicas y varias combinaciones moleculares como combinaciones de enzima con otras moléculas productoras de color. En esta invención, las partículas de oro coloidal constituyen la etiqueta preferente.

En el diseño del dispositivo preferente de test, es muy importante que la concentración de anticuerpo específico de antígeno presente en cada uno de los dos puntos del dispositivo del test donde la reacción tiene lugar sea suficiente para asegurar que el antígeno presente en la muestra del test sea capturado por los anticuerpos etiquetados específicos de antígeno cuando la muestra del test entra en contacto con ellos y que el conjugado anticuerpo etiquetado específico de antígeno: antígeno se capture y mantenga fácilmente por los anticuerpos enlazados en la línea de captura de la muestra. El trabajo experimental realizado en relación con esta invención ha demostrado que el anticuerpo específico de antígeno activo para el antígeno de carbohidrato objetivo debe estar presente en cada lugar de un dispositivo de test en el que ocurre la reacción antígeno: anticuerpo en una concentración de entre 7.7 nanogramos/sq. mm de área superficial y 385 nanogramos/sq. mm de área superficial. Si concentraciones de anticuerpo específico de antígeno inferiores a 7.7 nanogramos/sq. mm están presentes en un lugar donde se pretende que tenga lugar una reacción, es muy posible que se obtengan resultados falsos negativos.

Tal y como se conoce en la técnica, las bacterias infecciosas con frecuencia tienen múltiples componentes antigénicos. Por ejemplo, se sabe que S. pneumoniae tiene un antígeno capsular además del antígeno de pared celular polisacárido que es el objetivo del ensayo descrito en las solicitudes matrices con Números de serie 09/156,486 y 09/397,110. El segundo antígeno se seleccionó como el antígeno objetivo para el test ahora aprobado por FDA que se describe en estas solicitudes porque ese antígeno se encuentra presente en todos los serotipos conocidos de S. pneumoniae y su mínima reactividad tal y como se describe en la solicitud aquí incorporada con Número de Serie 09/397,110 es de tal naturaleza que permite una sencilla diferenciación clínica de infección provocada por S. pneumoniae con respecto a otras infecciones. Hay que señalar que los intentos previamente publicados para detectar S. pneumoniae en fluidos corporales, en el mejor de los casos, han producidos sistemas que tienen sensibilidad y especificidad en un 60-70% con anticuerpos policlonales y monoclonales, lo que supone un índice inaceptable para fines fiables de diagnóstico.

Entre los fluidos de mamíferos en los que los antígenos de carbohidrato objetivo han demostrado ser detectados con éxito en actuales trabajos clínicos con respectivos tests de ICT descritos y aprobados por FDA para L. pneumophila serogrupo 1 y S. pneumoniae son, además de la preferente orina, esputo, exudados nasofaringeales, fluido del oído medio y fluido cerebroespinal. Otros fluidos en los que estos tests detectan antígenos objetivo de carbohidrato, cuando están presentes, incluyen sangre y fluido bronquial.

La selección del antígeno carbohidrato objetivo para cualquier bacteria particular se basa necesariamente en consideraciones sobre las características de la reacción cruzada del antígeno, se sepa que está presente en todos o la mayor parte de los serotipos de una cepa bacteriana, o se sepa que es peculiar a un serotipo particular de la cepa, el serotipo es la fuente más común de enfermedad causada por la bacteria.

Los anticuerpos policlonales que se purificarán se introducen empleando métodos convencionales, inyectando a un animal, por ejemplo, conejo o cabra, el antígeno objetivo crudo del ensayo. Preferiblemente, la preparación de antígeno se somete a una eliminación celular por calor antes de inyectarse en el animal. Tras un apropiado lapso de tiempo, se provoca el sangrado del animal para obtener el suero que contiene los anticuerpos deseados, a lo que le sigue una purificación de los mismos. Este suero puede tener un paso intermedio de purificación, por ejemplo, con sulfato de amonio o con una resina de intercambio de iones para producir un corte de IgG o puede purificarse directamente.

Con el fin de conseguir una purificación por afinidad, se cultiva el mismo antígeno objetivo carbohidrato objetivo empleado para inmunizar al animal y a continuación se purifica de manera correcta hasta conseguir un estado esencialmente libre de proteínas. Tal y como aquí se emplea, la expresión "estado esencialmente libre de proteínas" significa un estado que contiene no más de, y preferiblemente menos de, aproximadamente un 10% (peso/peso) de proteína.

Después de purificar el antígeno hasta conseguir un estado esencialmente libre de proteínas, se enlaza con una molécula espaciadora a través de un enlace covalente. Ejemplos de moléculas espaciadoras adecuadas incluyen hidracina, albúmina de suero bovino ("BSA"), el conjugado de BSA e hidracina y moléculas similares que son capaces de enlazarse covalentemente con antígenos purificados de carbohidrato en unos extremos mientras que conservan otro extremo reactivo que es capaz de enlazarse covalentemente con un gel de afinidad.

El conjugado antígeno purificado de carbohidratos: molécula espaciadora se conjuga a continuación con un gel de afinidad y el gel se usa para purificar los anticuerpos polivalentes puros en suero obtenido por medio del sangrado del animal previamente inmunizado, o un corte IgG del mismo. Los anticuerpos puros (o su corte IgG) se aplican de manera múltiple al gen de afinidad y se eluyen del mismo como anticuerpos purificados y elevadamente específicos del antígeno.

Los siguientes ejemplos ilustran el modo de purificación de anticuerpos de Haemophilus influenzae tipo b, incluyendo la separación preliminar y la purificación del antígeno de carbohidrato capsular empleado en la purificación. La bibliografía cuenta con muchos métodos para efectuar estos pasos de separación y purificación y pueden sustituirse por aquellos aquí descritos, siempre y cuando el antígeno purificado obtenido esté esencialmente libre de proteínas.

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Ejemplo 1 Condiciones de Cultivo para Cultivar el Antígeno de Carbohidrato Objetivo

Se cultivó Haemophilus influenzae tipo b (ATCC # 10211) en un caldo complementado Mueller Hinton a 37ºC, con un 5% de CO_{2} durante 24 horas sin agitación.

La composición del caldo, por litro, fue:

Hidrolizado ácido de caseína

17.5 g

Extracto de corazón de vaca

3.0 g

Almidón

1.5 g

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También se presentaron los siguientes complementos:

Hematina

15 mg/mL

NAD (dinucleótido de adenina y nicotina)

15 mg/mL

Extracto de levadura

5 mg/mL

El pH de esta mezcla fue 7.3 \pm 0.1 medido a 25ºC.

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Ejemplo 2 Purificación de Antígeno de Carbohidrato

Después de 24 horas, se disolvió 1.82 g. de bromuro cetiltrimetilamonio CAS # 57-09-0 en 30 mL de agua destilada y la solución se añadió a 500 mL de sobrenadante del caldo para producir una concentración final de 0.01 M bromuro cetiltrimetilamonio. La mezcla se incubó en un baño de hielo con agitación durante una hora y se dejó a 4ºC durante la noche.

La mezcla del Ejemplo 1 se centrifugó a 12,000 rpm a 4ºC durante 20 minutos para producir una bolita y un sobrenadante. Ambas se recogieron y trataron, respectivamente, del siguiente modo:

(1)

La bolita se volvió a suspender en 0.5 M NaCl con sonicación y a continuación se precipitó en forma de gotas a 4ºC en diez veces el volumen de la resuspensión en etanol. La solución resultante se almacenó durante la noche a 4ºC para provocar la precipitación.

A continuación, la solución se centrifugó a 12,000 rpm durante 20 minutos. La bolita se disolvió en agua destilada y a continuación se dializó con agua destilada en un tubo de diálisis con un peso molecular cortado de 3,500.

(2)

El sobrenadante de la mezcla del Ejemplo 1 se almacenó a 40ºC durante la noche, y a continuación se observó la formación de un precipitado. Todos los contenidos del envase se centrifugaron a 12,000 rpm durante 20 minutos. Se recuperó una bolita y se volvió a suspender en 0.5 M NaCl con sonicación. La solución resultante se precipitó en forma de gotas en diez veces el volumen de la resuspensión en etanol a 4ºC. La solución se almacenó durante la noche a 4ºC y se volvió a formar un precipitado. La solución y el precipitado se centrifugaron a 12,000 rpm durante 20 minutos y se recuperó una bolita. La bolita se disolvió en agua destilada y dializó con agua destilada en un tubo de diálisis con un peso molecular cortado de 3,500.

Después, las soluciones dializadas (1) y (2) mencionadas se colocaron en un fondo común y se liofilizaron. S obtuvieron 90 mg. de antígeno polisacárido Haemophilus influenzae tipo b.

Se preparó una solución de este antígeno de concentración 5.3 \mug/ml y se sometió a un ensayo Lowry de proteínas y se descubrió que contenía un 5% de proteínas (peso/peso). La solución también fue sometida a un test de carbohidrato mediante el método fenol-ácido sulfúrico y demostró tener un 36% (peso/peso). La solución fue sometida a un test de actividad con el método ELISA y con el inmunoblot SDS-PAGE y resultó tener la actividad necesaria.

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Ejemplo 3 Preparación de Columna de Afinidad

Se disolvieron cinco mg. de antígeno polisacárido Haemophilus influenzae tipo b liofilizado en 4.52 ml de agua destilada y el pH se ajustó a 5-6 con HCl; a continuación, se añadieron 15.64 mg de un conjugado albúmina de suero bovino-hidracina de pH 5.6, y a continuación se mezcló durante tres minutos.

Se disolvieron 2.6 \mug de 1-etilo-3-(3-dimetilpropilo)carbodiimido ("EDAC") en 100 \mul de agua destilada. Se añadieron 50 \mul de esta solución a la solución conjugada antígeno/BSA-hidracina y a continuación se mezclo durante tres minutos. El balance de la solución EDAC se añadió a continuación a la mezcla y posteriormente se mezcló durante dos horas a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 8 con NaOH y se mezcló durante una hora a temperatura ambiente almacenándose más tarde durante la noche a 4ºC.

Al día siguiente, el pH de la mezcla almacenada se ajustó a 7 con HCl y una porción fue sometida al test de ELISA, lo que confirmó su actividad.

2.12 mg de conjugado de antígeno tratado con EDAC/hidracina BSA se mezclaron con 2.4 g de gel Spherilose^{TM} lavada y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante dos horas bajo condiciones completas de mezcla. A continuación se disolvieron 33.6 g de cianoborohidruro sódico en 480 \mul de agua disuelta y la mitad de esta solución se añadió a la mezcla de conjugado antígeno/hidracina BSA y gel Spherilose^{TM}. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 3.5 horas bajo condiciones completas de mezcla. Un antígeno/BSA hidracina/gel Spherilose^{TM} se separó y se lavó con 20 volúmenes de agua destilada, lo que le siguió la resuspensión en 4.8 ml de 0.2 M búfer bloqueador Tris-HCl de pH 7. Los restantes 240 \mul de la solución de cianoborohidruro sódico anteriormente descrita se añadió a la suspensión y esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante una hora y después durante la noche a 4ºC bajo condiciones completas de mezcla.

El gel enlazado y bloqueado se separó y lavó sucesivamente con 20 a 30 volúmenes de agua destilada, salina con búfer de fosfato con triple fuerza de pH 7.2, salina con búfer de fosfato con fuerza estándar de pH 9.2 y tiocianato sódico en salina con búfer de fosfato de pH 7.5 para estimular un simulacro de purificación de anticuerpo y se empaquetó en una columna de afinidad.

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Ejemplo 4 Purificación de Anticuerpos Haemophilus influenzae tipo b

Al suero de conejo-\alpha-Haemophilus influenzae tipo b, se añadió NaCl hasta conseguir una concentración final de 0.5 NaCl y se disolvió en suero. La mezcla se centrifugó a 5,000 XG durante 20 minutos y s filtró a través de algodón hidrófilo. El gel de afinidad del Ejemplo 3 se equilibró con salina con búfer de fosfato con fuerza normal y el filtrado de suero se aplicó a este gel cuatro veces. El gel se lavó a continuación con salina con búfer de fosfato con fuerza triple, seguido de salina con búfer de fosfato con fuerza normal para retirar los componentes de suero que no se habían acoplado.

Después, los anticuerpos se eluyeron del gel con 3 M tiocianato sódico en salina con búfer de fosfato (pH = 7.5), que fue seguido por 3 M tiocianato sódico en agua destilada (pH 5 a 6). Los anticuerpos purificados recuperados fueron sometidos a diálisis en salina con búfer de fosfato con fuerza normal de pH 7.2.

Ejemplo 5 Ensayo ICT para Haemophilus influenzae tipo b A. Preparación del Dispositivo del Test

Se preparó un dispositivo de test consistente en una caja de cartón con bisagras equipada con una ventana para dejar ver los resultados del test y los resultados control tal y como se muestra en la Figura 1. El dispositivo tiene una ranura donde se coloca un pozo para el hisopo preformado de plástico en el lado de la derecha (etiquetado con 1 en el dibujo) para recibir el hisopo húmedo con la muestra. Una etiqueta mostrada en la Figura 1A se coloca a continuación sobre todo el lado derecho del dispositivo. La etiqueta ha sido equipada con dos agujeros, uno inferior (macado con B en la Figura 1A) en el que se inserta el hisopo saturado y uno superior (marcado con A en la Figura 1A) hacia el que el hisopo se empujará tras la inserción del mismo en el agujero B. La colocación de la etiqueta con sus agujeros, A y B, y el pozo del hisopo cooperan en la sujeción del hisopo en la posición apropiada durante el ensayo y ayudan en la expulsión de la muestra de test absorbida.

Una tira de test pre-montada (marcada con B en la Figura 1) descrita a continuación, se inserta en la ranura en el lado izquierdo (etiqueta 2 en la Figura 1) y se mantiene en su lugar con una adhesivo aplicado a la parte inferior de la misma. Una etiqueta mostrada en la Figura 1B se coloca sobre el lado izquierdo. Se ha equipado con un único agujero (marcado con D en la Figura 1B) que coincide con el agujero A del lado derecho cuando el dispositivo se cierra para llevar a cabo el ensayo.

El dispositivo montado se almacena en una bolsa sellada con un producto secante hasta que se use. Antes de sellar y almacenar la bolsa, se coloca una cinta ligeramente adhesiva en el borde externo de la mitad derecha del dispositivo.

B. Preparación y Construcción de la Tira del Test

Tal y como se muestra en la Figura 1C, la tira del test para el ensayo está formada por una almohadilla de material absorbente que ha sido impregnada con un conjugado de partículas de oro y anticuerpos purificados por afinidad de conejo anti-Haemophilus influenzae tipo b. En la práctica, este conjugado puede fluir cuando entra en contacto con la muestra líquida del test. La almohadilla con el conjugado entra en contacto con una almohadilla de nitrocelulosa en la que se ha establecido una línea de captura para la muestra que ha reaccionado con el conjugado de oro insertando en ella anticuerpos purificados por afinidad de conejo anti-Haemophilus influenzae B. La almohadilla de nitrocelulosa también incluye una línea descendente de control establecida arrancando la almohadilla con inmunoglobulina anti-conejo de cabra (IgG). Tras pasar por la almohadilla de nitrocelulosa, el residido de la muestra pasa a una almohadilla absorbente que sirve como una reserva para el líquido.

La almohadilla de conjugado puede ser poliéster no tejido o acetato de celulosa extrudido. Al preparar la almohadilla para uso en este ensayo, se conjugan partículas de oro de 45 mm de diámetro, de acuerdo con el método de DeMay, "The Preparation and Use of Gold Probes" en Immunochemistry; Modern Methods and Application (J. M. Polar y S. Van Norden, eds, Wright, Bristol, England, 1986) o cualquiera de otros métodos conocidos, con anticuerpos purificados por afinidad Haemophilus influenzae B. La purificación por afinidad preferiblemente se consigue tal y como se ha descrito anteriormente. Ver también P. Tyssen, "Affinity chromatography of Immunoglobulins or Antibodies", contenido en Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (R. H. Burden y P. H. Van Knippedberge, eds., Elsevier, Nueva York (1985). Cualquier método conocido de purificación por afinidad puede sustituirse por el método preferente sin partir de los límites de la presente invención.

Las partículas conjugadas de oro se mezclan con agente secante y se insertan en una almohadilla conjugada. El agente secante es 5 mM sodio tetraborato líquido, pH 8.0, que contiene 0.1% de albúmina de suero bovino, 0.1% Triton X-100, 2% Tween 20, 8.0% sacarosa, y 0.02% de azida sódica. La almohadilla se calienta lo suficiente como para retirar todo el líquido presente y se almacena en un ambiente de bajo humedad en espera del montaje del dispositivo del test.

Especialmente se eligen estas almohadillas para sujetar el conjugado seco y para liberarlo cuando se humedece por la muestra.

En primer lugar, la almohadilla de nitrocelulosa se trata insertando anticuerpos purificados por afinidad anti-Haemophilus influenzae b en una primera parte de la almohadilla. Estos anticuerpos actúan como líneas de captura. Se establece una línea de control desmontando IgG de cabra anti-conejo sobre la superficie de la almohadilla. Para las líneas que se encuentran desmontadas sobre la almohadilla de nitrocelulosa, se usa una solución consistente en 5 mM fosfato sódico, pH 7.4, que contiene 5% de metanol y 0.102% de tinte Intrawhite como fluido portador para los anticuerpos. La almohadilla de nitrocelulosa se deseca a continuación a una temperatura de 18-25ºC para producir una absorción permanente de proteína en la misma.

La almohadilla absorbente empleada es de material celulósico disponible en comercios como Ahlstrom 243. No requiere un tratamiento especial. Todas las almohadillas se montan en el orden mostrado en la Figura 1C sobre una tira adhesiva cuando el dispositivo del test se une para enviarlo al cliente.

C. Procedimiento de Inmunoensayo

En la realización del ensayo de acuerdo con la invención, se utilizan los dispositivos de test finalizados que tienen el pozo del hisopo, las sobrecapas con agujeros y la tira de test colocada tal y como se muestra en las Figuras. Un hisopo del tipo Dacron fibroso se sumerge un poco en la muestra de orina y a continuación se retira de la muestra en inmediatamente se inserta, a través de un agujero de capa B en el lado derecho del dispositivo, en el pozo de la muestra del dispositivo del test. Se añaden dos o tres gotas de "Reagente A", en este caso una solución de 2.0% Tween 20, 0.05% azida sódica y 0.5% sulfato dodecil sódico en 0.05 M de búfer citrato sódico-fosfato sódico de pH 6.5 a la muestra a través del mismo orificio. La tira adhesiva sobre el borde del lado derecho se levanta y el dispositivo se cierra. La muestra inmediatamente entra en contacto con la almohadilla de conjugado y fluye a lo largo de la tira inmunocromatográfica. Después de 15 minutos, se ven las ventanas de la muestra del test y el control y se anotan los resultados.

D. Resultados de la Prueba con la Muestra

Se analizaron varios especimenes de orina de dos tipos en dispositivos de test como los descritos anteriormente. Los dos tipos de muestras de orina evaluados fueron orina de pacientes sin ninguna infección del tipo neumonía y orina que contenía Haemophilus influenzae b. Todas las muestras se testaron por duplicado. La siguiente tabla resume los resultados del test:

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1

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Los resultados mostrados fueron consistentes tanto para almohadillas de poliéster no cosidas como para almohadillas conjugadas con acetato celulosa extraídas. No se observaron diferencias cuando se echaron dos o tres gotas de "Reagente A".

Ejemplo 6 Reactividad Cruzada/Compatibilidad de Anticuerpos específicos de Antígeno para H. influenzae Tipo b

Una preparación comercial de H. influenzae tipo b vendida bajo la etiqueta "ACT-HIB" por los laboratorios Pasteur-Merieux-Connaught como vacuna de conjugado H. influenzae tipo b se inyectó en un conejo y se provocó que el conejo sangrara tras un lapso de tiempo de aproximadamente 60 días.

El antígeno purificado capsular esencialmente libre de proteínas tal y como se describe en el Ejemplo 2 se conjugó covalentemente con un conjugado hidracina-BSA tal y como se muestra en el Ejemplo 3 y a su vez, el conjugado antígeno: hidracina-BSA se enlazó covalentemente con el mismo gel de afinidad utilizado en el Ejemplo 3.

El suero de conejo que contenía anticuerpos puros policlonales de H. influenzae tipo b se purificó con gel de afinidad antígeno purificado:BSA-hidracina del modo descrito en el Ejemplo 4. Los anticuerpos específicos de antígeno eluídos del gel se utilizaron a continuación en pruebas de compatibilidad y reacción cruzada, cuyos resultados se reflejan en gráficos en las Figuras 2, 3 y 4.

A. Pruebas de Compatibilidad

Las pruebas de compatibilidad se llevaron a cabo usando un método modificado de ELISA del siguiente modo:

Placas de microtítulo de poliestireno con 96 pozos de Dynex Technologies, Inc. se cubrieron con 100 mcl. alícuotas de varias cepas de suspensión celular H. influenzae (0.5-0.7 x 108 células/ml.). Las placas se incubaron a 37ºC durante dos horas y se lavaron cuatro veces con PBS de pH 8.0 que contenía 0.02% de Tween 20 ("PBST"). Los pozos de microtítulo se bloquearon con 200 mcl. de PBS de pH 7.2 que contenía BSA en una concentración de 1 mg/ml durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a lavar cuatro veces con PBST.

Los anticuerpos purificados específicos de antígeno obtenidos del conejo inmunizado con ACT-HIB disponible en el mercado tal y como se ha descrito previamente en estos ejemplos se diluyeron dos veces a través de las placas comenzando en una concentración de 0.5 mcg/ml y acabando en 0.008 mcg/ml.

La primera línea horizontal de las palcas se usó como control. En lugar de la solución de anticuerpo, se añadieron 100 mcl. de PBS a cada pozo de esta fila. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y a continuación se lavaron cuatro veces con PBST.

A continuación, se añadieron 100 ml. de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, con dilución 1:6000 en PBST a cada pozo y las placas se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se volvieron a lavar con PBST, y se añadieron 100 mcl. de Sistema Sustrato Peroxidasa TMB de Laboratorios KPL, Gaithersburgo (Maryland).

La reacción en cada pozo fue frenada con 50 mcl. de H_{2}SO_{4} después de tres a cinco minutos del desarrollo de color. Las placas se contabilizaron en una longitud de onda de 450 nm en un lector espectométrico ELISA.

Las varias cepas de H. influenzae tipo b testadas fueron productos disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo bajo los números de acceso # 10211 (siendo ésta la cepa utilizada en los Ejemplos 1-5), # 43335, # 43334. Los resultados de las pruebas, que se reflejan en gráficos en la Figura 2, muestran que los anticuerpos específicos de antígeno obtenidos al inyectar a un conejo con ACT-HIB, hacer sangrar al conejo, y purificar el suero resultante del conejo que contiene anticuerpos con antígeno capsular purificado de ATCC # 10211 de acuerdo con los procedimientos de los Ejemplos 2 y 3 (designados como "[Hib-Ab]" en la Figura 2), fueron más específicos y reactivos con ATCC # 10211, pero también elevadamente específicos y reactivos con el antígeno capsular de ATCC # 43335, de ATCC # 51654 y # 43334 en concentraciones que oscilan entre 0.063 mcg/ml y 0.5 mcg/ml, en comparación con el control. Además, usando la detección instrumental de la reacción antígeno-anticuerpo, el anticuerpo específico de antígeno de esta invención produjo una reactividad discernible con antígeno en relación con el control a concentraciones inferiores como a 0.008 mg/mcl.

B. Pruebas de Reactividad Cruzada

En estas pruebas, los antígenos purificados específicos de antígeno H. influenzae tipo b de este ejemplo se volvieron a testar con otras especies de H. influenzae, en dos lotes, siguiendo el protocolo de test descrito para las pruebas de compatibilidad de la Figura 2, usando los mismos controles descritos para esas pruebas.

Para el primer lote, la Figura 3 es un gráfico que compara la reactividad de los anticuerpos específicos de antígeno de esta invención con el antígeno de ATCC # 10211 con el que son específicos, con anticuerpos de H. influenzae ("Hi" en la figura) tipos a, c, d y f. Demuestra una falta de reactividad cruzada con todos los tipos a, c, d y f, en comparación con la elevada reactividad y especificidad para el tipo b antígeno H. influenzae de ATCC # 10211, en concentraciones de 0.008 mcg/ml a 0.063 mg/ml. Se observa una apenas perceptible reactividad cruzada con solamente H. influenzae tipo f en concentraciones de anticuerpo ligeramente superiores a 0.063 mcg/ml pero incluso en las concentraciones más elevadas de 0.05 mcg/ml, la reactividad con antígeno del tipo f es inferior a la del tipo ATCC # 10211 en la concentración más baja de anticuerpo de 0.008 mcg/ml. La ligera reactividad cruzada del tipo f con el anticuerpo específico de antígeno fue considerada como menor.

Para el segundo lote, la Figura 4 es un gráfico que compara la reactividad de los anticuerpos purificados específicos de antígeno de esta invención con cada una de las cuatro especies sin tipificar de H. influenzae (NT1, NT2, NT3 y NT49 más H. parainfluenzae con H. influenzae tipo b cepa ATCC # 10211. La Figura 4 demuestra la falta de reactividad cruzada de los anticuerpos específicos de antígeno de la invención con todas las especies sin tipificar de H. parainfluenzae 1, 2, 3 y 4 y una ligera reactividad cruzada con H. parainfluenzae en concentraciones de anticuerpo de 0.125 mcg/ml a 0.5 mcg/ml. Sin embargo, esta reactividad cruzada es de menor orden que la reactividad de los anticuerpos en una concentración de 0.008 mcg/ml con cepas H. influenzae tipo b ATCC # 10211 y se consideró que apenas tenía importancia. La Figura 4 también confirma la fuerte especificidad de los anticuerpos de la invención con el antígeno capsular H. influenzae tipo b.

Claramente, los anticuerpos purificados específicos de antígeno de antígenos bacteriales de carbohidratos pueden utilizarse de manera beneficiosas para detectar el correspondiente antígeno puro objetivo de carbohidratos en cualquier tipo de inmunoensayo y no solamente en los aquí descritos. Claramente también, la sustitución de estos anticuerpos purificados específicos de antígeno por anticuerpos policlonales puros en ensayos previamente descritos para el mismo antígeno de carbohidratos dará como resultado una mayor fiabilidad, sensibilidad y especificidad de cada uno de estos ensayos. Además, y a pesar de que no se ha demostrado aún, se cree que la sustitución de estos anticuerpos purificados específicos de antígeno por anticuerpos monoclonales en ensayos descritos en la técnica anterior darán resultados al menos igualmente buenos y, se espera que en muchos caos se obtengan resultados mejores y más fiables que los presentados.

Se señala que los principios de esta invención tal y como aquí se establece conducen por sí mismos a una plétora de adaptaciones, permutaciones y combinaciones con técnicas de ensayos previamente presentadas por otros. Muchos de los pasos aquí descritos pueden llevarse a cabo usando diferentes reagentes o condiciones a los aquí específicamente descritos. Otros métodos para purificar los antígenos de carbohidrato hasta conseguir un estado esencialmente libre de proteínas pueden fácilmente concebirse. Una amplia bibliografía, patentada y no patentada, habla sobre el diseño y uso de dispositivos en pruebas de inmunoensayos desechables, de un solo uso y fiables que podrían sustituirse por el dispositivo ICT preferentes aquí descrito y recomendado. No se pretende que la presente invención esté limitada con respecto a los dispositivos sustituibles para ensayos, materiales, ingredientes o procesos en la medida que lo limiten las siguientes reivindicaciones.

Claims (3)

1. Un ensayo inmunocromatográfico (ICT) para la detección de un componente objetivo antígeno de carbohidrato de Haemophilus influenzae, que consiste en los siguientes pasos:

(a)

poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria objetivo o su componente antígeno de carbohidrato con un dispositivo inmunocromatográfico (ICT) que cosiste en una tira de un material altamente absorbente, teniendo la tira:

(i)

una zona en la que se coloca un conjugado de: (1) un agente etiquetador que muestra un visible cambio de color tras la reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace antigénico, y (2) anticuerpos purificados específicos de antígeno para el componente antígeno de carbohidrato objetivo, habiendo sido purificados dicho anticuerpos mediante un paso sobre una columna de afinidad cromatográfica con la cual se conjugan a través de una molécula espaciadora con el componente antígeno de carbohidrato purificado libre esencialmente de proteínas;

(ii)

una segunda zona a la que se unen los mismos anticuerpos purificados específicos de antígeno en forma no conjugadas, cuya zona está equipada con una ventana para ver los cambios de color;

(b)

dejar que la muestra fluya lateralmente a lo largo de la tira hasta la primera zona;

(c)

dejar que la muestra, junto con el conjugado de anticuerpos purificados por afinidad y la etiqueta, fluya a lo largo de la tira hasta la segunda zona; y

(d)

aproximadamente a los 15 ó 20 minutos desde el comienzo del paso (a), observar a través de la ventana si ha aparecido una línea de color en la segunda zona, lo que indicaría la presencia en la muestra de Haemophilus influenzae, o si no ha aparecido una línea de color, lo que indicaría ausencia de Haemophilus influenzae.

2. El método de la Reivindicación 1 cuyo componente objetivo antígeno de carbohidrato es un antígeno de carbohidrato capsular de bacteria Haemophilus influenzae tipo b, y el agente etiquetador es oro metálico finamente dividido.

3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que los anticuerpos específicos de antígeno están presentes en una concentración de entre 7.7 nanogramos/mm^{2} de área superficial y 385 nanogramos/mm^{2} de área superficial en cada punto de un dispositivo de test cuya reacción antígeno: anticuerpo ocurre.