ES2328217T3

ES2328217T3 - Metodos para el aumento de la proliferacion de celulas vegetales mediante la inhibicion funcional de un gen inhibidor de la ciclina vegetal.

Info

Publication number: ES2328217T3
Application number: ES00932464T
Authority: ES
Inventors: James Roberts; Beth Kelly
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2020-05-15
Also published as: CA2372323A1; AU5018500A; AU2005203616B2; AU781259B2; CN100387717C; HK1049845A1; CA2372323C; ATE433990T1; JP2002543823A; EP1179003A1; US20120096590A1; CN101285068A; AU2005203616A1; HK1049845B; DE60042404D1; CN1379783A; WO2000069883A1; EP1179003B1; EP1179003A4; US7230089B1

Abstract

Método para producir una variante de planta que tiene un mayor número de nódulos laterales en relación con una planta de tipo natural, comprendiendo el método la inactivación funcional de la expresión de un gen inhibidor de la ciclina parecida a D en dicha variante de planta, en el que dicho gen inhibidor de la ciclina parecida a D comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 8.

Description

Métodos para el aumento de la proliferación de células vegetales mediante la inhibición funcional de un gen inhibidor de la ciclina vegetal.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud Provisional de Estados Unidos de número de serie 60/134.373, solicitada el 14 de mayo de 1999.

Antecedentes de la invención

Las células eucariotas se desplazan de un estado proliferante a un estado inactivo sólo durante una ventana breve del ciclo celular. Temin. J. Cell. Phys. 78: 161 (1971). De este modo, dependiendo de su posición en el ciclo celular, las células privadas de mitógenos, tales como los presentes en el suero cuando se examinan células de mamífero, experimentarán una detención del ciclo celular inmediato, o completarán la mitosis y se detendrán en el siguiente ciclo celular. La transición desde la dependencia de mitógeno a la independencia de mitógeno tiene lugar en la fase media a tardía de G1 del ciclo celular. Pardee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1286 (1974), demostraron que muchas señales antimitogénicas diferentes provocan la detención del ciclo celular en un punto cinéticamente común y demostraron además que el ciclo celular se vuelve insensible a todas estas señales aproximadamente a la vez en la fase media a tardía de G1. Este punto se denominó el punto e restricción o punto R.

La cinematografía con el transcurso del tiempo de células individuales mitóticamente proliferantes también se ha utilizando para mapear de manera precisa la evolución temporal de la transición del ciclo celular a la independencia de mitógeno. Esto confirmó que la depleción de mitógeno u otras señales inhibidoras de crecimiento provocan que las células en la fase G1 temprana post-mitóticas dejen inmediatamente el ciclo celular y que el compromiso con el ciclo celular (autonomía de las señales mitogénicas) tiene lugar en la fase media de G1 (Larsson et al., J. Cell. Phys. 139: 477 (1989) y Zetterberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5365 (1985)). Estas observaciones conjuntas muestran que los controles dependientes de mitógeno en la proliferación celular están unidos a la progresión del ciclo celular.

El tránsito a través de la fase G1 y la entrada en la fase S requiere la acción de quinasas dependientes de ciclina (Cdks) (Sherr, Cell 79: 551 (1994)). Se ha observado que las señales inhibidoras de crecimiento previenen la activación de estas Cdks durante G1 (Serrano et al., Nature 366: 704 (1993); Hannon y Beach, Nature 371: 257 (1994); El-Deiry et al., Cell 75: 89 (1993); Xiong et al., Nature 366: 701 (1993); Polyak et al., Cell 78: 59 (1994); Toyashima y Hunter, ibid., p. 67; Lee et al., Genes & Dev. 9: 639 (1995); Matsuoka et al., ibid., p. 650; Koff et al., Science 260: 536 (1993)). Se sabe que la actividad catalítica de Cdks está regulada por dos mecanismos generales, la fosforilación de proteínas y la asociación con subunidades reguladoras (Gould et al., EMBO J. 10: 3297 (1991); Solomon et al., ibid., 12: 3133 (1993); Solomon et al., Mol. Biol. Cell 3: 13 (1992); Jeffrey et al., Nature 376: 313 (1995); Morgan, Nature 374: 131 (1995)). Entre las subunidades reguladoras, la asociación de Cdks con subunidades CKI inhibidoras (Inhibidores de quinasa dependientes de ciclina) se ha correlacionada más estrechamente con en efecto de la depleción de mitógeno en la proliferación celular y la actividad de Cdk.

Se utilizaron células vegetales en los estudios previos de crecimiento y división celular para establecer las fases del ciclo de células eucariotas. (Howard et al., Heredity 6 (suppl.): 216-273 (1953)), pero poco se sabe sobre los mecanismos moleculares de la regulación del ciclo de las células vegetales. Las células vegetales que cesan su división in vivo debido a la dormancia, o in vitro debido a la privación de nutrientes, se detienen en los puntos de control principales en G1 y G2. (van't Hof et al., in The Dynamics of Meristem Cell Populations, Miller et al. eds., Plenum, New York, pp 15-32 (1972), Gould et al., Protoplasma 106: 1-13 (1981)). En general, este patrón está en concordancia con el observado en otros sistemas eucariotas. Se han aislado homólogos de cdc2 quinasa a partir de una serie de especies vegetales, incluyendo guisante (Feller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5397-5401 (1990)), alfalfa (Hirt et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 1636-1640 (1991) y Hirt et al., Plant J. 4: 61-69 (1993)), y a partir de A. thaliana. (Ferreira et al., Plant Cell 3: 531-540 (1991), Hirayama et al., Gene 105: 159-165 (1991)), entre otros. Además, se han aislado de varias especies una serie de secuencias de ADNc que codifican ciclinas vegetales con características del tipo A, B o D o que tienen características del tipo a y B mixtas, incluyendo zanahoria y soja (Hata et al., EMBO J. 10: 2681-2688 (1991)), y Arabidopsis (Hemerly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3295-3299 (1992), y Soni et al., Plant Cell 7: 85-103 (1995)), entre otros.

Recientemente, se han identificado secuencias de ADN que codifican inhibidores de quinasa dependientes de ciclinas de plantas de Arabidopsis (WO 99/14331; Wang et al., Plam J. 15: 501-510 (1998)). Se ha sugerido las proteínas codificadas por las secuencias de ADN como moduladores de la división de células vegetales debido a su unión a ciclinas y efectos inhibidores in vitro similares sobre quinasas. También se ha sugerido que la eliminación parcial y/o total de un gen o la reducción de la expresión de un gen que codifica un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina vegetal podría influir y probablemente inhibiría la división celular (WO 99/14331).

La modificación genética de plantas, que supone el aislamiento y manipulación de material genético, y la posterior introducción de ese material en una planta, tejido vegetal o células vegetales, ha cambiado el cultivo de plantas y la agricultura de manera considerable durante los últimos años. Unas cantidades de alimentos de cosecha elevados, mayores rendimiento, cantidad de alimento, menos costes de producción, resistencia a las plagas, tolerancia al estrés, resistencia a la sequía y la producción de productos farmacéuticos y moléculas biológicas, así como otras características beneficiosas son todas potencialmente conseguibles mediante técnicas de modificación genética.

La capacidad de manipular la expresión de un gen proporciona un medio de producción de nuevas características en plantas transformadas. Por ejemplo, la capacidad de aumentar el tamaño del sistema de raíces de la planta permitiría la mayor asimilación de nutrientes de la tierra. Además, la capacidad de aumentar el crecimiento de las hojas, es decir, un aumento del tamaño de las hojas y/o el número de hojas, aumentaría la capacidad de una planta de asimilar energía solar. Obviamente, la capacidad de controlar el crecimiento de toda una planta, u órganos diana específicos de una planta, sería muy deseable.

Se pueden utilizar genes de control del ciclo celular para mejorar el crecimiento y desarrollo en las partes económicamente valiosas de las plantas de cosecha, incluyendo tanto plantas dicotiledóneas como plantas monocotiledóneas. En monocotiledóneas, el uso adicional de genes o proteínas de control del ciclo celular puede se útil para mejorar su regenerabilidad a partir de callos.

Además, los genes del control del ciclo celular son sitios potenciales para influir en la división celular y el comportamiento en las etapas de desarrollo de platas cuando el número de células influye en el rendimiento final de tejido económicamente valioso. Un ejemplo específico es el número de rondas de división nuclear en la etapa multinucleada del desarrollo de la endoesperma en granos cereales o en la etapa de desarrollo del fruto o la flor.

En base a lo anterior, está claro que existe una necesidad por métodos para modular la división celular de células vegetales, tejidos vegetales, y plantas que albergan uno o más genes inhibidores de ciclina endógena funcionalmente inactivados y que también albergan opcionalmente un transgén que codifica un polipéptido inhibidor de ciclina heterólogo o una variante mutante del polipéptido inhibidor de ciclina que se expresa en por lo menos un subgrupo de células huésped. Los métodos y composiciones pueden aumentar la división celular mediante la inhibición funcional de la expresión o actividad de inhibidores de ciclina vegetal.

Además, la presente descripción proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína BRO4 de unión a ciclina del tipo D vegetal. Los transgenes de reconocimiento pueden inactivar un gen inhibidor de ciclina endógena, particularmente los genes que codifican proteínas que tienen motivos de unión para ciclina parecida a D vegetal y quinasas dependientes de ciclina. Los métodos pueden producir células vegetales transgénicos, tejidos vegetales transgénicos y plantas transgénicas que albergan un transgén correctamente reconocido de la invención. Los métodos también se pueden utilizar para inactivar genes inhibidores de ciclina en células explantadas de una planta (por ejemplo, para la inserción ex vivo), tal como para comunicar a las células reconocidas resultantes un fenotipo que resulta de un fenotipo de mayor proliferación celular.

Descripción resumida de la invención

Un aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una variante de planta tal como se establece en la reivindicación 1.

Los métodos pueden modular el ciclo celular de células vegetales, de manera que se aumenta el crecimiento y/o rendimiento de una planta en comparación con una planta de tipo natural. El método comprende inactivar funcionalmente un gen inhibidor de ciclina parecida a D vegetal. La inactivación funcional se pude inducir mediante modificación genética del gen inhibidor de ciclina, tal como mediante la modificación física del gen inhibidor de ciclina, la inserción de un gen que codifica una molécula antisentido específica para una secuencia que codifica un gen inhibidor de ciclina, o el silenciamiento inducido por ARN de doble cadena, es decir (ARNi) y similares. El ciclo celular también se puede modular mediante la disposición de un inhibidor de la formación de un complejo ciclina/quinasa dependiente de ciclina, es decir, moléculas pequeñas, anticuerpos, policlonales y monoclonales, proteínas recombinantes de unión a antígeno, y similares.

Un método para producir células vegetales transgénicas que tienen una mayor velocidad de crecimiento y/o rendimiento en comparación con una planta de tipo natural correspondiente puede comprender, poner en contacto las células vegetales con secuencias de ácido nucleico que pueden desunir funcionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína inhibidora de ciclina para obtener células vegetales transformadas; producir plantas a partir de las células vegetales transformadas y seleccionar plantas que muestran una mayor velocidad de crecimiento o rendimiento en comparación con una planta de tipo natural. El gen que codifica el inhibidor de ciclina es el gen BRO4.

Un método para producir una planta caracterizada por tener una mayor velocidad de crecimiento y/o rendimiento en comparación con una planta de tipo natural puede comprender poner en contacto una planta con un agente que es un inhibidor de un inhibidor de ciclina. El agente evita que el inhibidor de ciclina interaccione con un complejo de ciclina parecida a D/quinasa dependiente de ciclina de plantas y, por lo tanto, permite que la célula continúe su división. Agentes adicionales pueden inducir la expresión de un inhibidor de la proteína inhibidora de ciclina.

Las poblaciones de células vegetales aisladas y plantas aisladas se pueden tratar con un inhibidor de un inhibidor de ciclina parecida a D vegetal y, por tanto, presentan una mayor proporción de células divisoras con respecto a células no divisoras en relación con la proporción en una población de células no tratadas. Las células divisoras, protoplastos transgénicos, son particularmente útiles en la generación de plantas completas transgénicas.

Las secuencias de polinucleótidos aisladas pueden codificar una proteína de unión a ciclina parecida a D vegetal designada como BRO4. En una realización particular, la proteína también es capaz de unirse e inactivar un complejo ciclina/quinasa dependiente de ciclina de plantas, es decir, un inhibidor de ciclina parecida a D vegetal, y se puede utilizar para aumentar la proliferación de células vegetales.

Una proteína inhibidora de ciclina parecida a D vegetal sustancialmente purificda puede ser purificada por la secuencia de polinucleótidos BRO4.

Los vectores pueden comprender la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del inhibidor de ciclina BRO4, o el complemento de la misma. También se proporcionan sistemas vectores huésped para la expresión de un inhibidor de ciclina, donde el inhibidor es capaz de unir una ciclina parecida a D vegetal y un complejo de ciclina parecida a D/cdk de plantas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la medición de la anchura (mm) de la hoja más grande de roseta de varias líneas de plantas transgénicas ICK-IR y plantas de control.

La figura 2 representa la medición del peso de la primera hoja de caulina de varias líneas de plantas transgénicas ICK-IR y plantas de control.

La figura 3 representa la medición de las alturas del tallo (mm) de varias líneas de plantas transgénicas ICK-IR y plantas de control.

La figura 4 es una representación ilustrada de una unidad de metámero y la estructura en una planta.

Descripción de las realizaciones específicas

Antes de establecer la invención, puede ser de ayuda para la comprensión de la misma el establecimiento de definiciones de ciertos términos a utilizar en la presente.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado tal como se entiende habitualmente por un técnico en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente invención para la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Para los objetivos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

"Proteína inhibidora de ciclina" o "polipéptido inhibidor de ciclina", tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína o polipéptido que se une a e inactiva una quinasa dependiente de ciclina (CDK) o una proteína relacionada en el mecanismo de la ciclina en una célula. Las proteínas BRO3 y BRO4 son ejemplos de proteínas inhibidoras de ciclina vegetal. Un gen inhibidor de ciclina tal como se utiliza en la presente invención es una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína o polipéptido inhibidora de ciclina incluyendo todas las secuencias de nucleótidos que comprenden nucleótidos alternativos que codifican la misma secuencia de aminoácidos debido a la degeneración del código genético.

Tal como se utiliza aquí, el término "gen inhibidor de ciclina" o "locus del gen inhibidor de ciclina" se refiere a una región de un cromosoma que abarca todos los exones que potencialmente codifican un polipéptido inhibidor de ciclina y que se extienden a través de secuencias flanqueantes (por ejemplo, que incluyen promotores, potenciadores y similares) que participan en la expresión de proteínas inhibidoras de ciclina. Una realización particular de la presente invención comprende el gen BRO4, que pueden estar desunido y, si se desea, puede ser sustituido por un gene o minigén heterólogo cognado, es decir, mediante una desunión estructural o silenciamiento.

El término "desunido", tal como se utiliza aquí, significa que un locus de gen puede estar "estructuralmente desunido" para comprender por lo menos una mutación o alteración estructural, de manera que el gen desunido es incapaz de dirigir la expresión eficaz de un producto génico funcional o el gen puede estar "funcionalmente inactivado", de manera que un locus de gen no se expresa o es incapaz de expresar un producto génico funcional. La inactivación funcional puede resultar de una desunión estructural y/o interrupción de la expresión al nivel de transcripción o traducción. La inactivación funcional de un gen inhibidor de ciclina endógena, tal como gen Bro3 (FL39), BRO4 o ICK1, también se puede producir mediante otros métodos, por ejemplo, supresión del gen de polinucleótidos antisentido, silenciamiento del gen inducido por ARN de doble cadena, y similar.

El término "correspondiente a" se entiende aquí como una secuencia de polinucleótidos que comparte identidad con toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. El término "complementario a" se entiende aquí como la secuencia que es complementarias a toda o parte de la secuencia de polinucleótidos de referencia.

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Los términos "sustancialmente corresponde a", "sustancialmente homóloga" o "identidad sustancial", tal como se utiliza aquí, indica una característica de una secuencia de ácidos nucleicos, donde la secuencia de ácidos nucleicos tiene por lo menos aproximadamente un 70 por ciento de identidad en la secuencia en comparación con una secuencia de referencia, habitualmente por lo menos aproximadamente un 85 por ciento de identidad en la secuencia, y preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad en la secuencia en comparación con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad en la secuencia se calcula excluyendo pequeñas eliminaciones o adiciones que representan menos de un 25 por ciento de la secuencia de referencia. La secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más grande, tal como una parte de un gen o secuencia flanqueante o una parte repetitiva de un cromosoma. Sin embargo, la secuencia de referencia tiene por lo menos 18 nucleótidos de largo, habitualmente por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos de largo y preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 a 100 nucleótidos de largo. "Sustancialmente complementaria", tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia que es complementaria a una secuencia que sustancialmente corresponde a una secuencia de referencia.

La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith et al., Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), o mediante inspección visual.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por parejas de manera progresiva para mostrar la relación y el porcentaje de identidad en la secuencia. También permite la representación de un árbol o dendrograma que muestra las relaciones por agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng et al., J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El método utilizado es similar al método descrito por Higgins et al., CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por parejas de las dos secuencias más relacionadas. Este grupo se alinea a continuación con la siguiente secuencia más relacionada o grupo de secuencias alineadas. Se alinean dos grupos de secuencias mediante una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones progresivas por parejas. El programa se desarrolla mediante la designación de secuencias específicas y sus aminoácidos o nucleótidos se coordinan para la comparación con regiones de secuencias y mediante la designación de parámetros de programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias de prueba para determinar el porcentaje de identidad en la secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso de espacio defecto (3,00), peso de la longitud del espacio defecto (0,10) y espacios en los extremos ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad en la secuencia y de similitud en la secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar parejas de secuencias con una valoración elevada (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia en cuestión, que coincide o satisface parte de la valoración umbral T valorada de forma positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere como la valoración umbral de palabras en la región (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabras en la región iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden a continuación en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia de manera que se puede aumentar la valoración de la alineación acumulada. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detuvo cuando: la valoración de la alineación acumulada disminuye en una cantidad X desde su valor máximo conseguido; la valoración acumulada cae a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos que se valoran en negativo; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de alineación. El programa BLAST utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones (B) de la matriz de valoración de BLOSUM62 (véase, Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1015 (1989)) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje en la identidad de secuencias, el algoritmo BLAST también realiza análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de la suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual un emparejamiento ente dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos tendría lugar por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de la suma en una prueba de comparación es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01 y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.

En general, la eficacia de reconocimiento aumenta con la longitud de la parte transgén de reconocimiento (es decir, la región de homología) que es sustancialmente complementaria a una secuencia de referencia presente en el ADN diana (es decir, la secuencia diana de cruzamiento). En general, la eficacia de reconocimiento se optimiza con el uso de pinzas de homología de ADN isogénicas, aunque se reconoce que la presencia de varias recombinasas puede reducir el grado de identidad en la secuencia requerida para una recombinación eficaz.

El término "secuencia no homóloga", tal como se utiliza aquí, tiene un significado tanto general como específico; se refiere en general a una secuencia que no es sustancialmente idéntica a una secuencia de referencia específica, y, cuando no se identifica explícitamente una secuencia de referencia concreta, se refiere específicamente a una secuencia que no es sustancialmente idéntica a una secuencia de por lo menos aproximadamente 50 bases contiguas en un gen inhibidor de ciclina endógeno reconocido, tal como un gen BRO4.

La hibridación específica se define aquí como la formación de híbridos entre una secuencia de transgén de reconocimiento (por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína inhibidora de ciclina parecida a D vegetal que puede incluir sustituciones, eliminaciones y/o adiciones) y una secuencia de ADN diana específica (por ejemplo, una secuencia del gen BRO4), donde una secuencia de transgén de reconocimiento marcada se hibrida preferencialmente a la diana, de manera que, por ejemplo, se puede identificar una única banda correspondiente a un fragmento de restricción de un gen inhibidor de ciclina genómica en una transferencia Southern de ADN preparado a partir de células utilizando dicha secuencia de transgén de reconocimiento marcada como sonda. Es evidente que las condiciones óptimas de hibridación variarán dependiendo de la composición de la secuencia y la longitud o longitudes del transgén o transgenes de reconocimiento y la diana o dianas endógenas y el método experimental seleccionado por el experto. Se pueden utilizar varias directrices para seleccionar las condiciones de hibridación apropiadas (véase, Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual (1989) 2ª Ed., Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San diego, CA.).

El término "natural", tal como se utiliza aquí cuando se aplica a un objeto, se refiere a un objeto que se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se puede modificar intencionadamente por el hombre en el laboratorio es natural. Tal como se utiliza aquí, las cepas de plantas de laboratorio que se pueden reproducir selectivamente según la genética clásica se consideran plantas naturales.

El término "homólogo" tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia génica que está relacionada evolutivamente y funcionalmente ente especies.

Tal como se utiliza aquí, el término "construcción de reconocimiento" se refiere a un polinucleótido que comprende: (1) por lo menos una región de homología que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o sustancialmente complementaria a una secuencia presente en un locus de gen endógeno de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal de una célula huésped, y (2) una región de reconocimiento que se integra en un locus de gen endógeno de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal de una célula huésped mediante la recombinación homóloga entre una región de homología de la construcción de reconocimiento y dicha secuencia del locus del gen endógeno de inhibidor de ciclina. Si la construcción de reconocimiento es una construcción del tipo "hit-and-run" o "in-and-out" (Valancius y Smithies, Mol. Cell Biol. 11: 1402 (1991); Donehower et al., Nature 356: 215 (1992), la región de reconocimiento sólo se incorpora de manera transitoria en el locus del gen endógeno del inhibidor de ciclina y se elimina del genoma huésped mediante selección. Una región de reconocimiento puede comprender una secuencia que es sustancialmente homóloga a una secuencia de gen endógeno de inhibidor de ciclina y/o puede comprender una secuencia no homóloga, tal como un marcador seleccionable (por ejemplo, neo, tk, gpt). El término "construcción de reconocimiento" no indica necesariamente que el polinucleótido comprende un gen que se integra en el genoma huésped, ni indica necesariamente que el polinucleótido comprende una secuencia génica estructural completa. Tal como se utiliza en la técnica, el término "construcción de reconocimiento" es sinónimo con el término "transgén de reconocimiento" tal como se utiliza aquí.

El término "región de homología" o "pinza de homología", tal como se utiliza aquí, se refiere a un segmento (es decir, una parte) de una construcción de reconocimiento que tiene una secuencia que se corresponde sustancialmente o es sustancialmente complementaria a una secuencia génica endógena de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal predeterminada, la cual puede incluir secuencias que flanquean dicho gen inhibidor de ciclina. Una región de homología tiene en general por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos de largo, preferiblemente por lo menos aproximadamente de 250 a 500 nucléótidos de largo, habitualmente por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos de largo o más largos. Aunque no existe una longitud mínima teóricamente demostrada para una pinza de homología para mediar en la recombinación homologa, se cree que la eficacia de la recombinación homóloga aumenta generalmente con la longitud de la pinza de homología. De manera similar, la eficacia de recombinación aumenta con el grado de homología de secuencia ente una región de homología de la construcción de reconocimiento y la secuencia diana endógena, teniendo lugar una óptima eficacia de recombinación cuando la pinza de homología es isogénica con la secuencia diana endógena.

Los términos "pinza de homología" y "región de homología" tal como se utilizan aquí son intercambiables y la terminología alternativa se utiliza por claridad, a la luz del uso inconsistente de términos similares en la técnica. Una pinza de homología no connota necesariamente la formación de una estructura híbrida de pares de bases con una secuencia endógena. Las secuencias de genes endógenos del inhibidor de ciclina parecida a D vegetal que corresponden sustancialmente o son sustancialmente complementarias a una región de homología de transgén se refieren aquí como "secuencias diana de cruzamiento" o "secuencias diana endógenas".

Tal como se utiliza aquí, el término "construcción correctamente reconocida" se refiere a una parte de la construcción de reconocimiento que está integrada en una secuencia diana endógena de cruzamiento o adyacente a la misma, tal como una parte de un locus del gen endógeno BRO4. Es posible generar células que presenten tanto un transgén o transgenes correctamente reconocidos como un transgén o transgenes incorrectamente reconocidos. Las células y plantas que tienen un transgén o transgenes correctamente reconocidos y/o un transgén o transgenes incorrectamente reconocidos se pueden identificar y aislar mediante PCR y/o análisis de transferencia Southern de ADN genómico.

Tal como se utiliza aquí, el término "región de reconocimiento" se refiere a una parte de una construcción de reconocimiento que se integra en una localización cromosómica endógena después de la recombinación homóloga entre una pinza de homología y un gen endógeno de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal, tal como una secuencia génica BRO4. Habitualmente, una región de conocimiento está flanqueada en cada lado por una pinza de homología, de manera que una recombinación de doble cruzamiento entre cada una de las pinzas de homología y sus correspondientes secuencias de genes endógenos de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal da lugar a una sustitución de la parte del locus del gen endógeno de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal por la región de reconocimiento; en dichas construcciones de reconocimiento por sustitución génica de doble cruzamiento, a la región de reconocimiento se puede hacer referencia como "región de sustitución". Sin embargo, algunas construcciones de reconocimiento pueden utilizar sólo una única pinza de homología (por ejemplo, algunos vectores del tipo "hit-and-run", véase Bradley et al., Bio/Technology 10:534 (1992).

El término "agente" se utiliza aquí para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuesto químicas, una macromolécula biológica, es decir, un anticuerpo, policlonal o monoclonal, específico de un inhibidor de ciclina parecida a D vegetal, o un extracto fabricado a partir de materiales biológicos, tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos de animales (particularmente plantas).

El término "fenotipo knockout de inhibidor de ciclina" se refiere a una característica fenotípica presente en plantas +/- y -/- de genes inhibidores de ciclina (por ejemplo, Arabidopsis hemizigótica u homozigótica para alelos de inhibidores de ciclina funcionalmente inactivados, es decir, un gen de la familia BRO4) y ausente en plantas de tipo natural de la misma especie, cepa y edad cuando se desarrollaron en las mismas condiciones. Entre los ejemplos se incluyen los descritos aquí, por ejemplo, hiperplasia, hipertrofia general, características hiperplásicas, hipercelulares y otras características fenotípicas indicas aquí cuando se comparan con el fenotipo de tipo natural.

El término "célula vegetal" tal como se utiliza aquí se refiere a protoplastos, células productoras de gametos y células que pueden regenerar las plantas completas. Tal como se utiliza aquí, el término "planta" se refiere a una planta completa, una célula vegetal o un grupo de células vegetales, tales como tejido vegetal o semilla vegetal. Las plaquetas también se incluyen en el significado de "planta". Las plantas incluidas en la presente invención son cualquier planta, particularmente plantas económicamente importantes, susceptibles de técnicas de transferencia génicas, incluyendo gimnoespermas y angioespermas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.

Ejemplos de angioespermas monocotiledóneas incluyen, pero sin limitación, espárrago, maíz de campo y maíz dulce, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo, centeno y avena y otros granos de cereales. Ejemplos de angioespermas dicotiledóneas incluyen, pero sin limitación, tomate, tabaco, algodón, colza, judía, soja, pimiento, lechuga y similares. Ejemplos de especies amaderadas incluyen álamo, pino, cedro, roble y similares.

El término "modificación genética", tal como se utiliza aquí, se refiere a la introducción de una o más secuencias de ácido nucleico exógenas (es decir, un gen heterólogo), por ejemplo, una secuencia codificante de inhibidor de ciclina parecida a D vegetal, así como secuencias reguladoras en una o más células vegetales, que pueden generar plantas viables completas sexualmente competentes. El término "modificado genéticamente" tal como se utiliza aquí se refiere a una planta que se ha generado a través del proceso mencionado anteriormente.

Un método preferido de introducción de las secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo un gen heterólogo deseado, en células vegetales es infectar una célula vegetal, un explante, un meristema o una semilla con Agrobacterium tumefaciens transformada previamente con la secuencia de ácido nucleico. Bajo condiciones apropiadas conocidas en la técnica, las células vegetales transformadas crecen a partir de brotes, raíces y se desarrollan posteriormente a plantas. La secuencia de ácido nucleico se puede introducir en células vegetales apropiadas, por ejemplo, mediante el plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido Ti o Ri se transmite a las células vegetales tras la infección por Agrobacterium tumefaciens y se integra de manera estable en el genoma de la planta (Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983). Un método con Agrobacterium es la transferencia génica mediada por Agrobacterium in planta por infiltración, por ejemplo, de plantas Arabidopsis thaliana adultas; Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. Life Sciences 316:1194-1199 (1993).

Todas las células vegetales que se pueden infectar y posteriormente transformar por Agrobacterium y las plantas completas regeneradas a partir de las células transformadas también se pueden transformar según la presente invención para producir plantas completas transformadas que contienen la secuencia de ácidos nucleicos transferida. Las células vegetales se pueden transformar con Agrobacterium de varias maneras, incluyendo: co-cultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados, transformación de células o tejidos con Agrobacterium o transformación de semillas, ápices o meristemas con Agrobacterium.

En la transformación de plantas con A. Tumifaciens, un ADN transformante (T-ADN) se modifica habitualmente para incorporar una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen heterólogo deseado. El T-ADN recombinante contiene el gen heterólogo deseado entre secuencias reguladoras no codificantes flanqueantes y las regiones límites izquierda y derecha del plásmido (Ti) inductor de tumores de tipo natural. El T-ADN recombinante se puede disponer como una parte de un plásmido integrador que se integra en un plásmido Ti de tipo natural mediante recombinación homóloga. Habitualmente, sin embargo, el T-ADN recombinante se dispone en un vector binario y se transfiere en una célula vegetal a través de la acción de genes vir que actúan en trans en un plásmido Ti auxiliar. El ADN-T se integra aleatoriamente en el genoma nuclear con algunos de los transformantes que permiten la expresión de la proteína deseada. La selección de transformantes también se puede realizar mediante la selección de un marcador fenotípico. Estos marcadores fenotípicos incluyen, pero sin limitación, resistencia a antibiótico, resistencia a herbicida u observación visual. Se conocen otros marcadores fenotípicos en la técnica y se pueden utilizar en la presente
invención.

Si es eligen métodos de introducción de ácido nucleico desnudo, entonces el vector no necesita ser más de la secuencia de ácido nucleico mínima necesaria para conferir las características deseadas sin necesidad de otras secuencias adicionales. De este modo, los posibles vectores incluyen los vectores plásmidos Ti, vectores lanzadera diseñados únicamente para maximizar el rendimiento de cantidades elevadas de copias, vectores episomales que contienen secuencias mínimas necesarias para la replicación final una vez ha tenido lugar la transformación, vectores transposones, vectores de recombinación homólogos, vectores mini-cromosoma, y vectores virales, incluyendo la posibilidad de formas de ARN de secuencias génicas. La selección de vectores y métodos para construirlos son normalmente conocidos para personas expertas en la materia y se describen en referencias técnicas generales (Bai et al., Methods in Enzymology, supra).

Sin embargo, cualquier secuencia de vector adicional que confiera resistencia a la degradación de la secuencia de ácidos nucleicos a introducir y que ayude en el proceso de integración genómica o proporcione un medio para seleccionar fácilmente aquellas células o plantas que están, en realidad, transformadas son ventajosas y disminuyen ampliamente la dificultad de seleccionar transgenotas utilizables.

Todas las plantas transformables a partir de las cuales pueden generarse las plantas completas regeneradas son útiles en la presente invención. Las monocotiledóneas se pueden transformar con Agrobacterium mediante electroporación (Fromm et al., Nature 319: 791-793 (1986); Rhodes et al., Science 240: 204-207 (1988)); mediante transferencia génica directa (Baker et al., Plant Genetics 201-211 (1985)): mediante la utilización de vectores mediados por polen (EP 0 270 356); y mediante inyección de ADN en vástagos florales (de la Pena et al., Nature 325: 274-276 (1987)).

Otro método para introducir una fragmento de ácido nucleico que codifica un gen inhibidor de ciclina en una célula vegetal es la penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con la secuencia de ácidos nucleicos a introducir contenida en la matriz de dichas partículas o en la superficie de las mismas. (Klein et al., Nature 327:70 (1970). También se describen métodos de transformación por bombardeo en Sanford et al. (Techniques 3: 3-16 (1991) y Klein et al., Bio/Tecniques 10:286 (1992)). Aunque habitualmente sólo se requiere una única introducción de una nueva secuencia de ácidos nucleicos, este método proporciona particularmente introducciones múltiples.

Para insertar fragmentos de ácidos nucleicos también se pueden utilizar otros virus que infectan ciertos tipos de plantas. Por ejemplo, también se puede utilizar el virus del mosaico de coliflor (CaMV). (Patente de Estados Unidos No. 4.407.956). El genoma del ADN viral de CaMV se inserta en un plásmido bacteriano parental que crea una molécula de ADN recombinante que se puede propagar en bacterias. Después de la clonación, el plásmido recombinante se puede clonar de nuevo y modificar adicionalmente mediante la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos deseada. La parte viral modificada del plásmido recombinante se escinde a continuación del plásmido bacteriano parental y se utiliza para transformar o transfectar las células vegetales o plantas.

Normalmente, se regenera una célula vegetal para obtener una planta completa a partir del proceso de transformación. Al producto intermedio de la transformación se hace referencia como una "transgenota". La regeneración a partir de protoplastos varía de especie a especie de plantas, pero generalmente, se realiza en primer lugar una suspensión de protoplastos. En ciertas especies, la formación de embriones se puede entonces inducir a partir de la suspensión de protoplastos. El medio de cultivo contendrá generalmente varios aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y la regeneración. Ejemplos de hormonas utilizadas incluyen auxinas y citoquininas. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si estas variables están controladas, la regeneración es reproducible.

La regeneración también tiene lugar a partir de callos, órganos y partes de la planta. La transformación se puede realizar en el contexto de la regeneración de partes de la planta. (véase, Methods in Enzymology 118, y Klee et al. Ann. Rev. Plant. Physiol. 38: 467 (1987)). Utilizando del método de transformación-regeneración de discos de hoja de Horsch et al., Science 227: 1229 (1985), los discos se cultivan en medios selectivos, seguido de la formación de brotes en aproximadamente 2-4 semanas. Los brotes que se desarrollan se escinden de los callos y se transplantan a un medio selectivo adecuado inductor de raíces. Las plántulas con raíces se transplantan en la tierra tan pronto como es posible después de aparecer las raíces. Las plántulas se pueden replantar según sea necesario hasta alcanzar la madurez.

En cosechas propagadas de manera vegetativa, las plantas transgénicas maduras se pueden propagar mediante la utilización de esquejes o técnicas de cultivo de tejido para producir múltiples plantas idénticas. Se realiza la selección de transgenotas deseables y se obtienen nuevas variedades y de propagan de manera vegetativa para uso comercial.

En cosechas propagadas por semilla, las plantas transgénicas maduras se pueden autocruzar para producir una planta homocigótica endocriada. La planta endocriada resultante produce semillas que contienen el gen o genes extraños recién introducidos. Estas semillas se pueden desarrollar para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado, por ejemplo, mayor tamaño y/o rendimiento.

Las partes obtenidas a partir de plantas regeneradas, tales como flores, semillas, hojas, ramas, raíces, fruto y similares están comprendidas como parte de la presente invención, siempre que estas partes comprendan células vegetales que han sido transformadas tal como se ha descrito. La progenie y variantes y mutantes de las plantas regeneradas también están incluidas en el alcance de la presente invención, siempre que estas partes comprendan las secuencias de ácidos nucleicos introducidas.

Un ácido nucleico, polinucleótido o polipéptido "aislado" es un ácido nucleico, polinucleótido o polipéptido que está sustancialmente separado de otros contaminantes que lo acompañan de manera natural, por ejemplo, proteínas, lípidos y otras secuencias de ácidos nucleicos y/o polinucleótidos. El término comprende secuencias de ácidos nucleicos y/o polinucleótidos que han sido extraídas o purificadas de su medio natural o biblioteca de clones e incluye aislados de ADN recombinantes o clonados y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

Una familia de genes, designada aquí como BRO, codifican productos proteicos capaces de unirse a una ciclina vegetal. El producto gen proteína es capaz de unirse a una ciclina vegetal y de inhibir la actividad de un complejo ciclina/quinasa dependiente de ciclina de plantas.

Los miembros de la familia del gen BRO codifican un dominio de secuencia de aminoácidos que comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, donde dicho dominio es el dominio de unión a ciclina vegetal. El dominio de unión de consenso para una ciclina parecida a D vegetal comprende la secuencia

: Glu Xaa_{1} Xaa_{2} Xaa_{3} Xaa_{4} Phe,

donde Xaa_{1} puede ser Leu, Ile u otro residuo de aminoácido hidrofóbico, Xaa_{2} puede ser Glu o Asp, Xaa_{3} puede ser Leu, Arg, Asp o cualquier otro residuo de aminoácido, y Xaa_{4} puede ser Phe, Leu, u otro residuo de aminoácido hidrofóbico (SEC ID No. 9). Este dominio se localiza de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos desde el dominio de unión a quinasa dependiente de ciclina descrito aquí a continuación, cuando está presente el dominio de unión a quinasa dependiente de ciclina.

Los miembros de la familia del gen BRO codifican además una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se une específicamente a una quinasa dependiente de ciclina y que es capaz de inhibir la actividad del complejo ciclina/cdk en la regulación del ciclo celular. La secuencia de aminoácidos que codifica el motivo de quinasa dependiente de ciclina es homóloga a la de una quinasa dependiente de ciclina de células de mamífero y comprende generalmente la secuencia de residuos de aminoácidos:

: Lys Tyr Asn Phe Asp Xaa_{1} Xaa_{2} Xaa_{3} Xaa_{4} Xaa_{5} Pro Leu

: Xaa_{6} Xaa_{7} Gly Arg Tyr Xaa_{8} Trp Xaa_{9} Xaa_{10} Leu Xaa_{11};

donde Xaa_{1} puede comprender Phe o Ile, Xaa_{2} puede comprender Glu o Val, Xaa_{3} puede comprender Lys o Asn, Xaa_{4} puede comprender Asp o Glu, Xaa_{5} puede comprender Glu o Lys, Xaa_{6} puede comprender Gly o Glu, Xaa_{7} puede estar ausente o puede comprender Gly, Xaa_{8} puede comprender Glu o Lys, Xaa_{9} puede comprender Val o Asp, Xaa_{10} puede comprender Lys o Arg, Xaa_{11} puede comprender Asn o Glu (SEC ID No. 10). Son aceptables otras sustituciones en la secuencia siempre y cuando la proteína sea capaz de unirse a una ciclina vegetal y sea capaz de inhibir la actividad del complejo ciclina/cdk.

La inhibición de la activación de un complejo ciclina/cdk de plantas se puede medir, por ejemplo, utilizando ensayos para (a) la fosforilación específica de sitio del grupo cdk o el complejo ciclina/cdk de plantas, y (b) la actividad de proteína quinasa. Dichos ensayos se describen de manera detallada en la presente invención. Estos ensayos se pueden realizar de un modo cinético, es decir, midiendo la velocidad de fosforilación o como ensayos estáticos cualitativos o cuantitativos, es decir, mediciones realizadas en puntos de tiempo seleccionados. Los expertos en la materia entenderán que se pueden utilizar un conjunto de enzimas y condiciones en dichos ensayos.

Se pueden obtener genes inhibidores de ciclina parecida a D vegetal, a modo de ejemplo, mediante la utilización de un cribado de dos híbridos en levadura. Los métodos para realizar un cribado de dos híbridos en levadura se describen en, por ejemplo, Fields y Sternglanz Trends in genetics 10: 286-292 (1994), y Bai et al., Methods in Enzymology 273: 331-347 (1996). En general, el cribado de dos híbridos en levadura se ideó para identificar genes que codifican proteínas que se asocian físicamente con una proteína diana in vivo. En una realización preferida, la construcción "cebo" comprende un vector de expresión que codifica un dominio de unión a ADN, es decir, el vector del dominio de unión a ADN de GAL4 pAS1, pAS2, pGBT9, o similares, fusionado a la secuencia de nucleótidos que codifica una ciclina vegetal. En una realización particularmente preferida, la construcción "cebo" codifica una ciclina parecida a D vegetal. A continuación, se puede producir una biblioteca de ADNc de fusión a partir de la planta de interés, es decir de Arabidopsis thaliana con el dominio de activación de GAL4, es decir, el vector del dominio de activación de GAL4 pACT1, pACT2, o similares. Los dos plásmidos de fusión se pueden transformar a continuación en una cepa informadora de levadura. Se realiza la identificación de aquellas células de levadura que contienen secuencias de nucleótidos de la biblioteca de Arabidopsis que interaccionan con una ciclina parecida a D vegetal y similares. A continuación, los fragmentos de ADNc que codifican miembros de la familia de genes inhibidores de ciclina BRO se pueden aislar e identificar.

Alternativamente, se puede ensayar una biblioteca genómica de una planta completa, un tejido vegetal o células vegetales con, por ejemplo, un cebador de oligonucleótidos híbridos degenerados de consenso (CODEHOP) para la amplificación de secuencias poco relacionadas tal como se describe por Rose et al. (Nuc. Acids Res. 26: 1628-1635 (1998)). Brevemente, se utiliza un cebador que comprende una región central degenerada 3' corta y una región pinza consenso 5' más larga para la amplificación PER. Con este método son necesarios sólo 3-4 residuos de aminoácidos altamente conservados para diseñar la secuencia central, la cual se estabiliza por la pinza durante la hibridación a moléculas molde. Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ciclina de un gen de la familia BRO para generar una región pinza consenso 5' de desde aproximadamente 18 a aproximadamente 25 pares de bases. Se puede diseñar una región central 3' degenerada de aproximadamente 11 a 12 pares de bases en base a una de las secuencias del gen BRO proporcionadas como SEC ID No. 1, SEC ID No. 3, SEC ID No. 5 y SEC ID No. 7. El programa CODEHOP está disponible en http://blocks.fhcrc.org/codchop.html y se relaciona directamente a partir de la alineación de secuencias múltiples BlockMaker para la predicción de cebadores híbridos empezando con un grupo de secuencias de proteínas relacionadas.

Los cebadores se pueden sintetizar mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. El ADN genómico se puede extraer de una fuente vegetal, por ejemplo, utilizando kits disponibles comercialmente diseñados para ADN vegetal. Los productos de PCR completos se pueden clonar utilizando cualquiera de una serie de vehículos plasmídicos de clonación y se pueden analizar mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa y la secuenciación de ADN utilizando métodos estándar (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Nueva York (1994). Se pueden producir dendrogramas utilizando procedimientos "neighbor-joining" y "bootstrapping" en ClustraIW (Thompson et al., Nuc. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)) tal como se implementa en la página web de BLOCKS (Lisitsyn et al., Science 259: 946-951 (1993); http://blocks.fhcrc.org).

En general, la secuencia de polinucleótidos del inhibidor de ciclina parecida a D vegetal trasncribable o su complemento inverso contienen un promotor unido operativamente capaz de actuar en la célula vegetal en la que se transfiere el polinucleótido. Entre los ejemplos de promotores funcionales en plantas se incluyen, sin limitación, CaMV 35S, E8 de tomate, patatina, ubiquitina, manopina sintasa (mas), actina 1 de arroz, glicina de proteína de semilla de soja (Gyl) y la proteína de almacenamiento vegetativo de soja (vsp). Muchos promotores híbridos, tales como Mac, que comprende elementos de la CaMV 35S combinados con la región 3' del promotor de manopina sintasa (Comai et al., Plant Mol, Biol. 15: 373-381 (1990)) son también útiles en la presente invención.

La secuencia de polinucleótidos del inhibidor de ciclina parecida a D vegetal transcribable tiene habitualmente por lo menos 25 nucleótidos de largo, más habitualmente por lo menos 50-100 nucleótidos de largo, frecuentemente por lo menos 100-200 nucleótidos de largo, a menudo por lo menos 500 nucleótidos de largo, o más largos, hasta la longitud del gen endógeno completo (que se extiende desde el promotor hasta la secuencia de terminación de la transcripción/sitio de poliadenilación). La secuencia del inhibidor de ciclina transcribable está situada en relación al promotor, de manera que un transcrito de ARN de la secuencia transcribable tiene la misma polaridad o del complemento inverso que el transcrito de ARNm del gen endógeno (es decir, orientación de sentido o antisentido).

El polinucleótido que codifica el inhibidor de ciclina parecida a D vegetal puede ser parte de un polinucleótido más grande, tal como un transgén que tiene un marcador seleccionable para identificar células que tienen integrado el transgén, o una construcción de recombinación homóloga que tiene un marcador o marcadores seleccionables y regiones de homología para dirigir el polinucleótido del inhibidor a una posición predeterminada en el genoma de las células. Los polinucleótidos que codifican el inhibidor pueden estar en forma de un cassette de expresión heteróloga en una célula transfectante o célula transgénica. Frecuentemente, el polinucleótido que codifica el inhibidor se obtiene como un vector producido con ADN aislado de una copia clonada (o parte de la misma) del gen endógeno diana. La secuencia de polinucleótidos del inhibidor se aísla normalmente como parte de un clon del gen genómico, aunque en algunas realizaciones se puede utilizar un clon de ADNc (o parte de la misma) de la proteína diana a inhibir (para métodos generales de ADNc, véase Goodspeed et al., Gene 76:1 (1989); Dunn et al., J. biol. Chem. 264: 13057 (1989)).

Los vectores que contienen una secuencia de polinucleótidos del inhibidor se desarrollan habitualmente en bacterias, tales como E. coli, y a continuación, se aíslan utilizando métodos estándar de biología molecular. O se pueden sintetizar como oligonucleótidos. La síntesis directa de polinucleótidos y la unión se pueden llevar a cabo (si es necesario) sin necesitar de vectores procariotas o eucariotas. Los polinucleótidos (y transgenes que comprenden a los mismos) se pueden transferir a células huésped mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo infiltración al vacío de células transformadas en una planta intacta (Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. La Vie/Life Sci. 316: 1194-1199 (1993)), microinyección, electroporación, lipofección, biolística, precipitación con fosfato cálcico y vectores de base viral, entre otras (por ejemplo, las patentes de estados Unidos 5.442.052, 5.354.854, 5.278.057, 5.262.316, 5.137.817 y 4.962.028).

Inhibidores de ciclina

Los inhibidores de ciclina que evitan la activación de un complejo ciclina/cdk de plantas se pueden identificar en una serie de formatos de ensayo de cribado. Se pueden cribar los inhibidores de ciclina que mediaban en la activación de un complejo ciclina/cdk de plantas, por ejemplo, utilizando un ensayo en el que se exponen sustancias de prueba a una cantidad adecuada de ciclina vegetal, es decir, una ciclina parecida a D vegetal y una quinasa dependiente de ciclina vegetal bajo condiciones que permiten la formación de complejos activos de ciclina/cdk de plantas. El complejo activo de ciclina/cdk de planta formado se cuantifica a continuación y se compara con los complejos inactivos formados en ausencia de la sustancia de prueba. Las sustancias de prueba que dan lugar a complejos menos activos en comparación con complejos activos en ausencia de la sustancia de prueba son inhibidores de ciclina.

También se pueden detectar inhibidores de inhibidores de ciclina. El cribado de dichas sustancias comprende, por ejemplo, utilizar un ensayo en el que las sustancias de prueba se exponen a cantidades adecuadas de inhibidor de ciclina, ciclina vegetal, es decir, una ciclina parecida a D vegetal y una quinasa dependiente de ciclina en condiciones que permiten la formación de complejos activos de ciclina/cdk de plantas en ausencia de inhibidor de ciclina. Los complejos activos de ciclina/cdk formados a continuación se pueden cuantificar y comparar con la cantidad de complejos activos formados en ausencia de la sustancia de prueba. Las sustancias de prueba que dan lugar a complejos más activos en comparación con complejos activos en ausencia de la sustancia de prueba son inhibidores del inhibidor de ciclina.

Las sustancias que pueden servir como inhibidores de la actividad de un inhibidor de ciclina de la familia BRO incluyen, pero sin limitación, a) compuestos capaces de inhibir la inhibición mediada por BRO de la activación del complejo ciclina parecida a D/cdk de plantas, que se pueden identificar tal como se ha descrito anteriormente, b) compuestos que inhiben específicamente la interacción entre una proteína de la familia de BRO el complejo ciclina/cdk de plantas, pero no la fosforilación específica de sitio del grupo cdk del complejo ciclina/cdk en ausencia de un inhibidor de ciclina de BRO, c) compuestos que degradan o inactivan la proteína inhibidora de ciclina BRO, y d) compuestos que interfieren con la expresión de la proteína inhibidora de ciclina BRO, y similares. Dichos agentes pueden incluir compuestos químicos inhibidores de una proteína inhibidora de ciclina BRO, incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, miméticos de péptidos y similares, antagonistas de inhibidores de ciclina y moléculas que inhiben la expresión de un inhibidor de ciclina de la familia BRO, tales como oligonucleótidos formadores de cadenas triples, oligonucleótidos antisentido, por ejemplo, molécula antisentido genómicas y sintéticas, ribozimas, ARNi, y similares.

Para su uso como inhibidor de la familia de genes BRO para mediar la progresión del ciclo celular, los oligonucleótidos formadores de cadenas triples son agentes de unión a ADN específicos de secuencia de BRO que interfieren con la transcripción de un gen de la familia de BRO. Los oligonucleótidos formadores de cadenas triples se describen en general en Maher, Bioassays 14: 807-815 (1992); Gee et al., Gene 149: 109-114 (1994); Noonberg et al., Gene 149: 123-126 (1994); Song et al., Ann. NY Acad. Sci. 761: 97-108 (1995); Westin et al., Nuc. Acids. Res. 23: 2184-2191 (1995); y Wand y Glazer, J. Biol. Chem. 207: 22595-22901 (1995). Estos oligonucleótidos forman complejos helicoidales triples, bajo condiciones fisiológicas, sobre ADN de doble cadena que inhiben selectivamente la transcripción de un gen inhibidor de ciclina mediante el bloqueo físico del acceso de la ARN polimerasa o el factor de transcripción al ADN molde del gen inhibidor de ciclina. Véase también, por ejemplo, WO95/25818; WO 95/20404; WO 94/15616; WO 94/04550; y WO 93/09788. Los oligonucleótidos formadores de cadenas triples dirigidos al gen BRO4 o al gen ICK1 pueden contener una cola de nucleótidos o no nucleótidos para aumentar la inhibición de la unión al factor de transcripción.

Los oligonucleótidos antisentido que interfieren con la expresión de un gen inhibidor de ciclina de la presente invención y permiten la progresión a través del ciclo celular, tal como se ejemplifica en los ejemplos descritos a continuación, son particularmente útiles en la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido del gen inhibidor de ciclina, específicamente para BRO4 o ICK1, se identifican utilizando métodos, por ejemplo, tal como se describe con detalle en los Ejemplos. El uso de oligonucleótidos antisentido y sus aplicaciones se describen en general en, por ejemplo, Mol y Van der Krul, eds., Antisense Nucleic Acids and Proteins Fundamentals and Applications, Nueva York, NY, 1992.

Las moléculas antisentido tal como se utilizan en la presente invención incluyen moléculas antisentido tanto genéticas como sintéticas tal como se disponen a continuación. Los oligonucleótidos antisentido adecuados tienen por lo menos 11 nucleótidos de longitud y hasta e incluyendo secuencias codificantes asociadas y no traducidas en dirección 5' de un gen inhibidor de ciclina. Tal como será evidente para un experto en la materia, la longitud óptima de oligonucleótidos antisentido depende de la fuerza de la interacción entre los oligonucleótidos antisentido y su secuencia complementaria en el ARNm, la temperatura y el medio iónico en que tiene lugar la traducción, las secuencias de bases del oligonucleótidos antisentido y la presencia de estructura secundaria y terciaria en el ARNm y/o en el oligonucleótido antisentido.

Las secuencias diana adecuadas para oligonucleótidos antisentido incluyen uniones intrón-exón (para evitar el "splicing"), regiones en las que los híbridos ADN/ARN evitarán el transporte de ARNm desde el núcleo al citoplasma, los sitios de unión al factor de iniciación, sitios de unión a ribosoma y sitios que interfieren con la progresión de los ribosomas. Una región diana particularmente preferida para el oligonucleótido antisentido es la región no traducida 5' de un gen inhibidor de ciclina.

Además, se puede utilizar el silenciamiento del gen de ARN de doble cadena (ARNi) para inhibir o silenciar funcionalmente la expresión de un inhibidor de ciclina parecida a D vegetal. Los genes se pueden modificar de manera que contengan una repetición invertida de un inhibidor de ciclina parecida a D vegetal, es decir, BR04 o ICK1, que contiene una estructura de tallo ("stem") de 100 a 300 pares de bases, una estructura de bucle que comprende de 200 a 500 pares de bases que codifican un segmento del inhibidor de ciclina y la región de repetición invertida de la estructura de tallo complementaria a la estructura de tallo que formará el tallo de doble cadena. La construcción se puede cortar y empalmar en un plásmido que comprende un promotor funcional de planta, es decir, caMV 35S, E8 de tomate, patatina, ubiquitina, manopina sintasa, actina 1 de arroz, glicina de proteína de semilla de soja (Gyl) y la proteína de almacenamiento vegetativo de soja. Además, los promotores híbridos, tales como Mac, comprenden elementos de la región 3' de la CaMV 35 y la manopina sintasa, o un promotor específico de tejido. Después de la amplificación, la construcción se puede introducir en un vector de transferencia, tales como un vector de Agrobacterium, que se utiliza para transformar plantas o células vegetales.

Se pueden utilizar métodos de control de la expresión de ciertos genes de plantas para modificar un fenotipo de la planta según se desee, tales como controlar la velocidad o tiempo en el que tiene lugar la maduración de la fruta o incluso la velocidad de crecimiento de una planta, tejido vegetal, o células. Una manera de controlar la expresión de genes endógenos de plantas es la inhibición de la expresión de genes específicos mediante la supresión de oligonucleótidos antisentido (Patentes de Estados unidos 5.457.281, 5.453.566, 5.365.015, 5.254.800, 5.107.065 y 5.073.676) y un método alternativo para inhibir la expresión de genes específicos es la supresión de oligonucleótidos de sentido (Patentes de Estados Unidos 5.283.184, 5.231.020 y 5.034.323).

Los polinucleótidos antisentido dirigidos a un gen inhibidor de ciclina vegetal se preparan mediante la inserción de una molécula de ADN que contiene la secuencia de ADN diana en un vector de expresión adecuado, de manera que la molécula de ADN se inserta en dirección 3' de un promotor en una orientación inversa en comparación con el propio gen. El vector de expresión a continuación se puede transducir, transformar o transfectar en una célula adecuada que da lugar a la expresión de polinucleótidos antisentido.

Alternativamente, los oligonucleótidos antisentido se pueden sintetizar utilizando técnicas manuales estándar o de síntesis automatizadas. Los oligonucleótidos sintetizados se pueden introducir en células adecuadas mediante una serie de medios, incluyendo la electroporación (por ejemplo, tal como se describe en Yang et al. Nucl. Acids. Res. 23: 2803-2810 (1995)), precipitación fosfato de calcio, microinyección, poli-L-ornitina/DMSO (Dong et al., Nucl. Acids. Res. 21: 771-772 (1993)). La selección de un método de administración de oligonucleótidos antisentido adecuado será evidente para un experto en la materia. Con respecto a oligonucleótidos sintetizados in vitro, la estabilidad de los híbridos oligonucleótidos antisentido-ARNm se puede incrementar mediante la adición de agentes estabilizantes al oligonucleótido. Los agentes estabilizantes incluyen agentes intercalantes que están unidos covalentemente a alguno o ambos extremos del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden hacer resistentes a nucleasas mediante, por ejemplo, modificaciones al esqueleto fosfodiéster mediante la introducción de fosfotriésteres, fosfonatos, fosforotioatos, fosforoselenoatos, fosforamidatos o fosforoditioatos. Los oligonucleótidos también se pueden hacer resistentes a nucleasas mediante la síntesis de los oligonucleótidos con anómeros alfa de los desoxirribonucleótidos, tal como se describen en general en Mol y Van der Krul, supra.

Para inhibidores basados en oligonucleótidos, la elección de una secuencia adecuada estará dirigida por, por ejemplo, el tipo de inhibidor (es decir, oligonucleótidos u oligonucleótidos antisentido formadores de cadenas triples) y las especies a tratar. Puede ser preferible elegir secuencias que se conservan entre especies para permitir su uso en modelos fácilmente disponibles. Para el uso en los modelos se pueden elegir oligonucleótidos antisentido para secuencias en el gen BRO que se conservan.

Las composiciones y métodos para inhibir la expresión de un miembro de la familia del gen BRO y permitir así la progresión del ciclo celular puede utilizar ribozimas. Los ribozimas se pueden administrar de varias maneras, incluyendo por genes dirigidos a una célula deseada. Un ribozima reconoce los transcritos de ARN de un gen de la familia BRO. Cada molécula de ribozima contiene un segmento catalíticamente activo capaz de dividir un ARN inhibidor de ciclina, y comprende además secuencias flaqueantes que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria a partes del ARN dirigido. Las secuencias flanqueantes sirven para hibridar el ribozima al ARN de una manera específica de sitio. No es necesaria la complementariedad absoluta de las secuencias flanqueantes a la secuencia inhibidora de ciclina diana, sin embargo, sólo es necesaria una cantidad complementariedad suficiente para formar una doble cadena con el ARN diana y para permitir que el segmento catalíticamente activo de la ribozima se divida en los sitios diana. De este
modo, sólo se requiere complementariedad suficiente para permitir que el ribozima sea hibridable con el ARN diana.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ribozima" significa una molécula de ARN que presenta una actividad enzimática que es capaz de dividir o empalmar otras moléculas de ARN separadas de una manera específica de la secuencia de bases del nucleótido. En referencia a la molécula de ARN catalítica o enzimática se entiende una molécula de ARN que presenta complementariedad en una región de unión a sustrato a un ARN diana específico de BRO4 y también presenta actividad enzimática que es activa para dividir y/o empalmar el ARN en esa diana, alterando de este modo la molécula diana.

La molécula de ARN enzimática se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, pero el ribozima también se puede formar en el motivo en el motivo de horquilla, virus hepatitis delta, intrón grupo I o ARN de ARNasa P (en asociación con una secuencia guía de ARN). Ejemplos de motivos de cabeza de martillo se describen por Rossi et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 183 (1992), los motivos de horquilla se describen por Hampel et al., Biochem. 28: 4929 (1989) y Hampel et al., Nucl. Acids. Res. 18: 299 (1990), el motivo del virus de la hepatitis delta se ejemplifica en Perrotta y Been, Biochem 31:16 (1992), un motivo de ARNasa P se describe en Guerrier-Takada et al., Cell 35: 849 (1983) y ejemplos del motivo de intrón del grupo I se describen en Cech et al., Patente de Estados Unidos No. 4.987.071.

Estos motivos específicos no son limitantes en la presente invención y los expertos en la materia entenderán que una molécula de ARN enzimática de la presente invención tiene un sitio de unión a sustrato específico que es complementario a una o más regiones de ARN dianas inhibidoras de ciclina y que tiene secuencias de nucleótidos en ese sitio de unión a sustrato o alrededor del mismo que transmiten una actividad de división del ARN a la molécula.

Las secuencias flanqueantes en dirección 5' y 3' respecto al sitio catalítico del ribozima puede comprender segmentos de cualquier longitud que transmiten de manera eficaz el grado deseado de especificidad de reconocimiento para el ribozima. Preferiblemente, una secuencia flanqueante comprende desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 24 nucleótidos, más preferiblemente desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 15 nucleótidos y habitualmente desde aproximadamente 9 hasta 12, y da lugar a un emparejamiento de bases con la secuencia del sustrato inmediatamente en dirección 5' y 3' de las secuencias de ARN inhibidoras de ciclina, es decir BRO4, que comprende el sitio de división.

Las mutaciones que proporcionan una reducción de la función de las proteínas inhibidoras de ciclina parecida a D vegetal también se pueden identificar mediante métodos, tales como TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes; Nat Biotechnol. 18: 455-457 (2000)), donde las plantas se pueden mutagenizar con, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), y las plantas que muestran un fenotipo hiperplásico, es decir, hojas, flores, estructuras que contienen semillas, frutos y similares más grandes, se pueden cribar por las mutaciones en los genes inhibidores de ciclina parecida a D vegetal de secuencia conocida mediante, por ejemplo, la formación de cadenas dobles heterogéneas.

Los siguientes ejemplos se proporciona a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1

En este ejemplo, se utiliza un cribado de dos híbridos en levadura para aislar ADNc que codifican proteínas que interaccionan con ciclinas de tipo D de Arabidopsis thaliana, D1 y D2. Los cribados de dos híbridos en levadura se revisan tal como se ha descrito en Fields y Stemglanz (Trends in Genetics 10: 286-292 (1994)). Los métodos utilizados se describen brevemente a continuación.

Se aislaron proteínas que codifican ADN complementario capaces de interacciona con las ciclinas de tipo D de Arabidopsis thaliana, D1 y D2, designadas CycD1_{At}yCycD2_{At} utilizando el método del cribado de dos híbridos descrito esencialmente por Fields y Song (Nature 340:245 (1989) y la Patente de Estados Unidos No. 5.283.173 modificada tal como se describe en la presente invención. Las construcciones "cebo" contenían un vector de expresión que codificaba una proteína de fusión GAL4-CycD1_{At} o GAL4-CycD2_{At}. Para construir el plásmido "cebo" GAL4-CycD1_{At}, pGBT9CycD1_{At}, se obtuvo el inserto de CycD1 del plásmido pJG8(D1) (Soni et al., The Plant Cell 7: 85-103 (1995)) mediante amplificación por PCR con cebadores de oligonucleótidos diseñados para añadir un sitio BamHI a cada extremo del gen. El fragmento de PCR amplificado que codifica los aminoácidos 1 a 334 de CycD1_{At,} que comprende la secuencia codificante entera, se digirió con BamHI y se unió en el vector pGBT9 (Clontech Laboratories, Inc. y Bartel et al. en Cellular Interaction in Development: a Practical Approach, Ed. Hartley, Oxford University Press, Oxford, ENGLAND, pág. 153-179 (1993)), digerido previamente con BamHI para obtener una secuencia de polinucleótidos que codifica una fusión GAL4-CycD1_{At} El plásmido pGBT9 es un vector portador de 2 \muM de levadura que contenía un vector de expresión de GAL4 que contenía el promotor ADH1 de S. cerevisiae, el dominio de unión a ADN de GAL4, un sitio polienlazador y una secuencia terminadora que contiene un codón de terminación en todos los marcos seguido del terminador ADH1 de S. cerevisiae

La biblioteca de fusión de ADNc de Arabidopsis thaliana (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11786-11791 (1997)) que contenía ADNc de oligo-dT aleatorios y el dominio de activación de GAL4, se preparó tal como se ha descrito por Kim et al. (supra). Brevemente, el ARN total se aisló de Arabidopsis etiolada de 3 días de vida mediante la solubilización de los embriones en isotiocinanato de guanidinio seguido de la agrupación del ARN mediante gradiente de protección de cloruro de cesio.

Se sintetizó la primera cadena de ADNc a 37ºC a partir de 5 \mug de ARN poli(A) con oligo(dT) y 1.000 unidades de SUPERSCRIPT (BRL). Después de la reacción de la segunda cadena, el ADNc se precipitó con espermina y se lavó con tampón de lavado de espermina. El ADNc se disolvió en 40 \mul de tampón TE y se alineó con T4 ADN polimerasa según las instrucciones de los proveedores (New England Biolabs). Después de la inactivación de la enzima mediante la adición de 5 \mul de EDTa 0,5 M, las muestras se extrajeron con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol. El ADNc se resuspendió en 12 \mul de tampón TE y, a continuación, se unión con 3 \mul de igual mezcla de adaptadores fosforilados (100 \muM) en un volumen total de 20 \mul a 4ºC durante toda la noche. Las secuencias adaptadoras (Elledge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1731-1735 (1991) se hibridaron mediante calor durante 2 minutos a 88ºC, 10 minutos a 65ºC, 10 minutos a 37ºC y 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la unión, las muestras se precipitaron mediante la adición de espermina y se lavaron tal como se ha descrito (Elledge, supra).

El ADNc adaptado se resuspendió en 20 \mul de TE y se pasó por electroforesis en un gel de agarosa al 1% de temperatura de fusión baja. Los ADNcs de más de 570 pares de bases de longitud se purificaron en gel para la unión a brazos \lambda-ACT. El ADNc preparado a partir de ARN poli(A) se unió a 2 \mug de ADN plasmídico con \lambda-ACT relleno de T en un volumen de 5 \mul a 4ºC durante toda la noche y se empaquetó utilizando el extracto de empaquetamiento GIGApack Gold (Stratagen). La conversión por subclonación automática de la biblioteca de ADNc de Arabidopsis en la biblioteca de plásmidos se realizó tal como se ha descrito (Harper et al., Cell 75: 805-816 (1993)).

La biblioteca de fagos se amplificó en E. coli y se almacenó a -80ºC en presencia de dimetilsulfóxido al 7% hasta su uso.

El cribado de dos híbridos se realizó tal como se ha descrito previamente (Vijtek et al., Cell 74: 205-214 (1993); y Hollenberg et al., Mol. Cell. Biol. 15: 3813-3822 (1995);) con algunas modificaciones. La cepa Y190 de S. cerevisiae (MATa, leu2-3, 112, ura3-52, trp1-901, his3-200, ade2-101, GAL4-fa180, URA3 GAL-lacZ, LYS GAL-HIS3, cyh') se utilizó como cepa huésped para el cribado. La cepa huésped se transformó con pGBT9cycD1_{At} o pGBT9cycD2_{At}. La cepa huésped transformada se transformó posteriormente con la biblioteca de fusiones de Arabidopsis. Los transformantes se seleccionaron en un medio que contenía 3-amino-1,2,4-triazol (25 mM) y carecía de histidina. Las células positivas en histidina se ensayaron por la actividad de \beta-galactosidasa.

Se utilizó el ADN aislado de la levadura transformada que mostraba un crecimiento vigoroso sobre medio con His y sobre medio que contenía 3-aminotriazol y también niveles elevados de actividad de \beta-galactosidasa para transformar E. coli. El ADN plasmídico de E. coli se transformó de nuevo en levadura. A partir de aproximadamente 2 x 10^{6} clones transformados con ciclina D1 como cebo, se seleccionaron tres clones designados como BRO2 (que comprendía la secuencia de oligonucleótidos para BRO2, SEC ID No. 3), BRO3 (que comprendía la secuencia de oligonucleótidos para BRO3, SEC ID No. 5) y BRO4 (que comprendía la secuencia de oligonucleótidos para BRO4, SEC ID No. 7) y se secuenciaron mediante métodos de rutina.

La secuencia de aminoácidos de cada uno de los marcos de lectura abiertos que contenían un gen BRO se predijo a partir de la secuencia de nucleótidos determinada de los clones. El examen del marco de lectura abierto que codifica BRO2 reveló una proteína de aproximadamente 128 residuos de aminoácidos con la Met de iniciación en el residuo 20 de la SEC ID No. 4 y la terminación con la Arg en el residuo de aminoácido 147. Un examen similar de BRO3 reveló una proteína de aproximadamente 183 residuos de aminoácidos que empieza con la Met en la posición 20 (SEC ID No. 6) y termina con la Pro en el residuo de posición 202. Bro 4 comprende una proteína de aproximadamente 196 aminoácidos que se inicia en el residuo de aminoácido de posición 13 (SEC ID No. 8) y que termina con Leu en la posición 208. La inspección visual de las secuencias de aminoácidos de BRO3 (SEC ID No. 6) y BRO4 (SEC ID No. 8) reveló una región de aproximadamente 22 aminoácidos que eran sustancialmente homólogos con el dominio de unión a quinasa dependiente de ciclina de consenso de mamífero. El examen de las secuencias de aminoácidos de BRO2, BRO3 y BRO4 (SEC ID No.4, SEC ID No. 6 y SEC ID No. 8, respectivamente) reveló una región conservada de aproximadamente 6 residuos de aminoácidos aproximadamente de 17 a veinte aminoácidos en dirección 5' del dominio de unión a cdk. En las células de mamíferos, se sabe que el dominio de unión a ciclina se encuentra aproximadamente a esta distancia del dominio de unión a cdk. A medida que se aislaron los tres clones en base a la unión a la ciclina parecida a D vegetal, se determinó que esta región de 6 aminoácidos es probablemente el dominio de unión a ciclina. Por lo tanto, se identificaron BRO2, BRO3 y BRO4 como fragmentos de ADNc que codifican proteínas de unión a ciclina que presentan el motivo de unión definido.

Se cribaron aproximadamente 7,2 x 10^{5} clones transformados con ciclina D2 como cebo, se seleccionó un clon designado como BRO1 (que comprendía la secuencia de oligonucleótidos de BRO1, SEC ID No. 1) para un análisis posterior. El clon se secuenció y se predijo la secuencia de aminoácidos a partir de la secuencia de ADN del clon (SEC ID No. 2). El examen de la secuencia de aminoácidos reveló un polipéptido de aproximadamente 135 residuos de aminoácidos que empiezan con la Met en la posición 1 (SEC ID No. 2) y que termina con la Arg en la posición 135. La inspección visual de la supuesta secuencia de aminoácidos reveló un motivo del dominio de unión a ciclina con una secuencia de siete aminoácidos similar al determinado para BRO2, BRO3 y BRO4. El fragmento de ADNc de BRO1 se identificó por tanto como que codifica una proteína de unión a ciclina.

Inicialmente pareció a partir de la inspección visual de las secuencias de aminoácidos de BRO1 y BRO2 que los correspondientes fragmentos de ADNc podrían estar incompletos. El resto del marco de lectura abierto que codifica el gen completo para estas proteínas se determinó mediante el sondeo de una biblioteca genómica de hipocótilo de Arabidopsis en un vector \lambda. La biblioteca se sondó para los genes BRO2 y BRO1 y las secuencias completas son tal como se proporcionan en la presente invención. Se determinó que sólo la secuencia para BRO1 había sido incompleta.

Ejemplo 2

En este ejemplo se ha clonado cada una de las secuencias de ácidos nucleicos identificadas para codificar un inhibidor de proteína quinasa dependiente de ciclina a partir del vector pACT utilizado en el cribado de dos híbridos de levadura, se ha insertado en un plásmido pCGN1547 en la orientación inversa y se ha utilizado para transformar plantas Arabidopsis. Se examinan las plantas transgénicas para moléculas antisentido a los genes BRO por los cambios fenotípicos característicos de la modulación de la regulación del ciclo celular, incluyendo, es decir, la velocidad del crecimiento de la raíz, hoja y tallo, el incremento en la producción de biomasa, y similares

Brevemente, se clonaron las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la familia BRO a partir de los vectores pACT en el plásmido pLAY112 que contiene un promotor de planta quimérica que comprende los elementos CaMV 35s y MAS combinados. (Comai et al., Plant Mol. Biol. 15:373-381 (1990)). Se digirieron BRO1 y BRO2 con BgIII y a continuación se clonaron en el sitio BamHI de pLAY 112. Se cortó BRO3 con XhoI y se rellenaron los extremos con fragmento Klenow. Se ligó el fragmento XhoI que contenía la secuencia que codifica BRO3 en pLAY112 previamente digerido con SmaI. Se digirió BRO4 con HincII (romo) y EcoRI. Se rellenaron los extremos de FcoRI con dNTPs y Klenow. Se aisló el fragmento BRO4 y se ligó en pLAY112 previamente digerido con SmaI. Se transformaron las mezclas de unión en E. coli y se seleccionaron los transformantes en los medios apropiados. Se desarrollaron los transformantes seleccionados en medios LB líquidos con antibióticos. Se aisló el ADN plasmídico de cada transformante y se evaluó el ADN por la inserción apropiada.

Se cortaron los plásmidos pLAY112BRO1, pLAY112BR03 y pLAY112BR04 con PstI y se clonaron en el sitio PstI del plásmido pCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol. 14:269-276 (1990)). Se cortó el plásmido pLAY112BRO2 con BglII y se clonó en el sitio BamHI de pCGN1547. Se transformaron las mezclas de unión en E. coli y se seleccionaron los transformantes en los medios apropiados. Se desarrollaron los transformantes seleccionados en medios líquidos con antibióticos. Se aisló el ADN plasmídico de cada transformante y se evaluó el ADN por la inserción apropiada.

Se utilizaron los plásmidos pCGN1547BRO1 y pCGN1547BRO2 para transformar Agrobacterium tumefaciens. Se transformó Arabidopsis thaliana con cada miembro de la familia BRO mediante infiltración al vacío (Bechtold et al., Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316:1194 (1993)), y se seleccionaron plantas de semillero transgénicas (generación T0) en placas AB con canimicina 50 \mug/ml y se compararon con las de tipo natural.

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Ejemplo 3

En este ejemplo se examinó el efecto de la supresión de los genes inhibidores de ciclina parecida a D vegetal en la proliferación celular.

Brevemente, se manipularon los genes de manera que contuvieran "repeticiones invertidas" de regiones que codifican ICK1 (tallo de 244 pares de bases, bucle de 420 pares de bases) y BRO4 (tallo de 203 pares de bases y bucle de 303 pares de bases) (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:13959-135964 (1998)). Para construir las Repeticiones Invertidas de ICK1 y BRO4 se amplificaron los fragmentos diana mediante PCR utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 1. Cada cebador contiene un sitio de restricción apropiado que puede cortarse para permitir el ensamblaje de los productos de PCR individuales en la repetición invertida.

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TABLA 1 Cebadores de PCR utilizados para construir estructuras de repeticiones invertidas

1

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Se empalmaron las construcciones en pLAY112, un plásmido que combina los elementos de CaMV 35S y la región 3' de manopina sintasa para formar el promotor híbrido Mac (Comai et al., Plant Mol. Biol. 15:373-381 (1990)), y se introdujeron en el vector binario pCGN1547 (McBride y Summerfelt, Plant Mol. Biol. 14:269-276 (1990)) utilizando procedimientos estándar. Se transformó el vector binario en la cepa At503 de Agrobacterium tumefaciens. Se transformaron los genes en los ecotipos Ler y Col-0 de Arabidopsis (Bechtold y Pelletier, Methods Mol. Biol. 82:259-266 (1998)). Se identificaron las plantas transgénicas por su fenotipo de resistencia a la canamicina y se examinaron por su fenotipo morfológico.

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Fenotipo de ICK1-IR

Las plantas transgénicas para ICK-IR demostraron tres signos de mayor crecimiento: hojas más anchas y más grandes (tanto caulinares como en racimo), de 3 a 4 carpelos en lugar de 2, y grietas en el tallo principal, como si los tejidos internos del tallo crecieron excesivamente y no correspondían por el crecimiento en las capas de tejidos externas. Las mediciones de tamaño de la hoja y el carpelo y los números de varias líneas de plantas transgénicas y plantas de control se representan en las Figuras 1 a 3 y la Tabla 2. El fenotipo se ha medido mediante dos experimentos diferentes.

El fenotipo de múltiples carpelos es particularmente importante en la interpretación de los efectos de la supresión de ICK1. Ese fenotipo ha sido bien estudiado porque es similar al causado por mutaciones de los genes CLAVATA 1, 2 y 3 (Chen et al., Genesis 26:42-54 (2000); Clark et al., Development 122:1567-1575 (1996); Fletcher et al., Science 283:1911-1914 (1999)).

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TABLA 2 Número de carpelo ICK1-IR y control (1547 plantas)

2

Los meristemas son los órganos apicales responsables del brote y crecimiento de la raíz. En mutantes de clavata, las divisiones celulares en exceso forman meristemas más grandes, los cuales a su vez forman carpelos supernumerosos. Los genes de CLAVATA codifican los componentes de un sistema de comunicaciones de célula a célula. El fenotipo de ICK1-IR es la primera evidencia directa de que se pueden formar meristemas más grandes mediante el control de reguladores de la división celular. Esto proporciona evidencias que se pueden usar las manipulaciones de ICK1 para modificar las propiedades de crecimiento de las plantas.

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Fenotipo de BRO4

Las plantas transgénicas para BRO4-IR eran más espesas, es decir, tenían más coflorescencias y más hojas en cada coflorescencia. Las plantas parecen haber desarrollado este fenotipo al haber formado más metámeros, las unidades básicas de desarrollo. Cada metámero consiste en un internódulo y un nódulo que porta el órgano (Figura 4). Los metámeros se forman por la acción del meristema apical. Cada crecimiento lateral (órgano primordial) en el ápice de meristema forma un nódulo. Cada nódulo lleva una hoja y en la axila de la hoja existe un brote lateral. Por lo tanto, una planta con más nódulos se vuelve más espesa al formar más brotes laterales. Es posible que la supresión de BRO4 de lugar a una formación acelerada de órganos laterales, y por lo tanto, más nódulos.

Deposito de Material Biológico

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo los términos del Tratado de Budapest.

3

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los objetivos de claridad o comprensión, será evidente que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet WO 9309788 A [0076]

\bullet US 5457281 A [0081]

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\bullet US 5283184 A [0081]

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Documentos no relacionados en la descripción

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<110> Roberts, James A

\hskip1cm

Kelly, Beth L.

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<120> MÉTODOS PARA EL AUMENTO DE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES MEDIANTE LA INHIBICIÓN FUNCIONAL DE UN GEN INHIBIDOR DE LA CICLINA VEGETAL

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 14538A-#45-1

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/134,373

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<151> 1999-05-14

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 22

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 408

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 135

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 639

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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6

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 213

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 809

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 626

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

13

130

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip1cm

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\hskip1cm

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\hskip1cm

150

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip1cm

19

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<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\hskip1cm

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\hskip1cm

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\hskip1cm

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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<400> 19

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\hskip1cm

23

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<210> 20

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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<400> 20

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\hskip1cm

24

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<210> 21

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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<400> 21

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25

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<210> 22

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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<400> 22

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26

Claims

1. Método para producir una variante de planta que tiene un mayor número de nódulos laterales en relación con una planta de tipo natural, comprendiendo el método la inactivación funcional de la expresión de un gen inhibidor de la ciclina parecida a D en dicha variante de planta, en el que dicho gen inhibidor de la ciclina parecida a D comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 8.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gen inhibidor de la ciclina parecida a D comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 7.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho gen inhibidor de la ciclina parecida a D inactivado funcionalmente está estructuralmente desunido en dicha variante de planta.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la expresión de dicho gen inhibidor de la ciclina parecida a D está funcionalmente inactivada por un polinucleótido antisentido o de repetición invertida.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el polinucleótido de repetición invertida es amplificado utilizando como cebador un oligonucleótido que tiene la secuencia mostrada en SEC ID No. 17, SEC ID No. 18, SEC ID No. 19, SEC ID No. 20, SEC ID No. 21 o SEC ID No. 22.

6. Método según la reivindicación 3, en el que el gen inhibidor de la ciclina parecida a D vegetal inactivado funcionalmente está estructuralmente desunido por recombinación homóloga con una construcción de reconocimiento.

7. Método para producir una variante de planta que tiene un mayor número de nódulos laterales, que comprende expresar en dicha planta un polinucleótido antisentido o de repetición invertida que inhibe un inhibidor de la ciclina parecida a D en una cantidad suficiente para producir dicha variante de planta, siendo el mayor número de nódulos laterales en relación con una planta no tratada, en el que dicho inhibidor de la ciclina parecida a D comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 8.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el inhibidor de la ciclina parecida a D comprende un polinucleótido codificado por un ácido nucleico que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 7.

9. Método según la reivindicación 7, en el que el polinucleótido de repetición invertida es amplificado utilizando como cebador un oligonucleótido que tiene la secuencia mostrada en SEC ID No. 17, SEC ID No. 18, SEC ID No. 19, SEC ID No. 20, SEC ID No. 21 o SEC ID No. 22.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la planta se forma mediante la transformación de progenitores de la planta que comprenden protoplastos, semillas, células de la raíz, células de los meristemas o células de las hojas.

11. Inhibidor de un inhibidor de la ciclina parecida a D vegetal que es un oligonucleótido que se une específicamente a ADN que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 8 o un ARN transcrito a partir del mismo, e inhibe la expresión del inhibidor de la ciclina parecida a D vegetal para producir una planta que tiene un mayor número de nódulos laterales; en el que dicho inhibidor de la ciclina parecida a D vegetal tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 8.

12. Inhibidor según la reivindicación 11, en el que el oligonucleótido se une específicamente a ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID No. 7.

13. Inhibidor según la reivindicación 19 o la reivindicación 11, en el que el oligonucleótido comprende una repetición invertida amplificada utilizando como cebador un oligonucleótido que tiene la secuencia mostrada en SEC ID No. 17, SEC ID No. 18, SEC ID No. 19, SEC ID No. 20, SEC ID No. 21 o SEC ID No. 22.