ES2327703A1 - Metodos y reactivos para la deteccion de salmonella sp. - Google Patents
Metodos y reactivos para la deteccion de salmonella sp. Download PDFInfo
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Abstract
La invención se relaciona con un método in vitro para la detección de bacterias del género Salmonella sp. mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa empleando cebadores específicos para dicho patógeno a partir de muestras de ADN y de ARN de dicho microorganismo. Dicho método resulta de utilidad en la detección de microorganismos viables y no viables de Salmonella sp. en muestras ambientales, clínicas y alimentarias. Asimismo, la invención también se relaciona con un kit para la puesta en práctica de dicho método.
Description
Métodos y reactivos para la detección de
Salmonella sp.
La invención se relaciona con un método in
vitro para la detección de bacterias del género
Salmonella sp. mediante una reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa empleando cebadores específicos para dicho
patógeno a partir de muestras de ADN y de ARN de dicho
microorganismo. Dicho método resulta de utilidad en la detección de
microorganismos viables y no viables de Salmonella sp. en
muestras ambientales, clínicas y alimentarias. Asimismo, la
invención también se relaciona con un kit para la puesta en
práctica de dicho método.
La salmonelosis es una de las enfermedades
alimentarias más comunes y más ampliamente extendida, producida por
las bacterias del género Salmonella sp. Se ha estimado que
Salmonella sp. es responsable de más de 1,4 millones de casos
de enterocolitis y de más de 500 muertes al año en Estados
Unidos.
El sistema taxonómico actual de
Salmonella sp. ha reagrupando todas las cepas de
Salmonella sp. (patógenas o no) en dos únicas especies: S.
enterica y S. bongori. Ésta última (previamente
subespecie V) parece no ser patógena para el ser humano.
La especie S. entérica tiene seis
subespecies (a veces como subgrupos bajo numeración romana):
enterica (I); salamae (II); arizonae (IIIa);
diarizonae (IIIb); houtenae (IV); S. bongori
(V), ya incluida en una especie distinta; e indica (VI).
Cada subespecie a su vez, está formada por
diversos serotipos, habiéndose identificado hasta la fecha más de
2.500. Una de ellas es S. enterica subsp. enterica (o
subgrupo I) se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. A su
vez, cada serogrupo comprende múltiples componentes, dando lugar a
las serovariedades (serotipos).
Con importancia clínico epidemiológica, las más
de 2500 serovariedades de Salmonella sp. pueden agruparse en
tres divisiones ecológicas (sp. son subespecies):
- 1.
- Salmonella sp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. Typhi, S. Paratyphi A, B y C;
- 2.
- Salmonella sp. adaptadas a hospederos no humanos, que circunstancialmente pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S. Dublin y S. Choleraesuis;
- 3.
- Salmonella sp. sin adaptación específica de hospedero, que incluye a unas 1.800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, las cuales causan la mayoría de las salmonelosis en el mundo.
La detección habitual de este patógeno incluye
procedimientos basados en el cultivo y la identificación bioquímica
de las colonias. El procedimiento normalizado de trabajo basado en
el cultivo requiere siete días para confirmar la presencia de este
patógeno en la muestra analizada. Estos procedimientos, aunque
eficientes, son demasiado lentos como para poder ser empleados de
forma sistemática en un gran número de muestras.
Alternativamente a los procedimientos basados en
el cultivo y la identificación bioquímica de las colonias de
Salmonella sp., existen numerosas técnicas para la detección
de dicho patógeno basadas en la tecnología PCR (reacción en cadena
de la polimerasa). Además, mediante dicha tecnología también es
posible detectar células vivas si se parte de ARN para realizar la
PCR o células vivas y muertas si se parte de ADN genómico.
La solicitud de patente US6893847 describe
oligonucleótidos especialmente diseñados para detectar el ARNm del
gen invA de Salmonella sp.
Fey et al. (Applied and Enviromental
Microbiology, 2004 vol. 70(6): 3618-3623) han
desarrollado un método para la detección de ARN bacteriano en
muestras de agua basado en el empleo de una PCR a tiempo real. Para
poner a prueba el método desarrollado, emplean el gen invA y
el ARNr 16S de Salmonella enterica serovariante
Thyphimurium.
Fukushima, H. et al. (Journal of Clinical
Microbiology, 2003, vol. 41(11): 5134-5146)
describen un ensayo de PCR a Tiempo Real Duplex empleando SYBR Green
para la detección de 17 especies de patógenas presentes en agua y
comida partiendo de ADN genómico. Entre las especies patógenas
detectadas se encuentra Salmonella sp. Para su detección
emplean cebadores dirigidos a amplificar el gen invA de
Salmonella sp.
Por otro lado, en el estado de la técnica
también se han desarrollado métodos que permiten la detección de
múltiples especies y serovariantes de Salmonella sp. mediante
una única reacción de PCR:
Nam, H. et al. (International Journal of
Food Microbiology, 2005, vol. 102: 161-171)
describen un ensayo de PCR a Tiempo Real empleando SYBR Green para
la detección de distintas especies de Salmonella sp. (ver
Tabla 1 de dicha publicación) a partir de ADN. Para ello han
diseñado una pareja de cebadores que amplifica de forma específica
un fragmento de 119 pb del gen invA de Salmonella.
La solicitud de patente EP0739987 describe un
método para la detección de distintas especies de Salmonella
sp. a partir de ADN mediante una PCR que comprende el empleo de
unos oligonucleótidos dirigidos de forma específica al gen
invA de Salmonella sp.
Rahn et al. (Molecular and Cellular
probes, 1992 vol. 6: 271-279) describen un método
de detección de múltiples especies de Salmonella sp. a partir
de ADN que comprende la amplificación de la secuencia del gen
invA de Salmonella sp. mediante una reacción en
cadena de la polimerasa.
Por tanto, existe en el estado de la técnica la
necesidad desarrollar un método de detección de Salmonella
sp. que permita detectar el mayor número serovariantes de dicho
patógeno y que sea, a la vez que eficaz, rápido y económico.
En un aspecto la invención se relaciona con un
método in vitro para la detección de Salmonella sp.
en una muestra que comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método in vitro para la detección de Salmonella
sp. en una muestra que comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R]; y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación mediante el empleo de una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE].
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un oligonucleótido cuya secuencia se selecciona del grupo de
secuencias SEQ ID NO: 2 [cebador INVAVITWO F], SEQ ID NO: 3
[cebador INVAVITWO R], SEQ ID NO: 4 [sonda INVAVITWO], SEQ ID NO: 7
[sonda INVAVITONE].
En otro aspecto la invención se relaciona con un
kit que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar una
región del gen invA de Salmonella sp. que comprende
la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre
los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada
en SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit que comprende (i) la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID
NO: 6 [INVAVITONE F/R] y (ii) una sonda marcada, en donde dicha
sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su
extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE].
Por último, el uso de los kits de la invención
en la detección de Salmonella sp. constituyen aspectos
incluidos dentro del contexto de la presente invención.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona
con el uso de un kit según se ha descrito en la presente invención
para la detección de Salmonella sp. en una muestra.
La Figura 1 es una gráfica que muestra los
resultados de amplificación del genoma de Salmonella por
RT-PCR en las muestras analizadas. Los trazos en los
que se observan valores superiores al Ct corresponden a distintas
cepas de Salmonella. Los trazos en los que se observan
inferiores al Ct corresponden a cepas de géneros distintos a
Salmonella.
La Figura 2 es un alineamiento múltiple de
secuencias. Las secuencias alineadas corresponden al gen
invA de Salmonella sp., en donde la secuencia que
aparece bajo el nombre "LT2" es la secuencia de nucleótidos
que comprende la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y
1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1. La
secuencia marcada con subrayado sencillo corresponde a la secuencia
de nucleótidos de los cebadores INVAVITWO-F e
INVAVITWO-R; la secuencia marcada con subrayado
doble corresponde a la secuencia de nucleótidos de la sonda
INVAVITWO. El resto de secuencias que aparecen en el alineamiento
corresponde a las siguientes especies de Salmonella sp. (en
negrita se muestra el número de acceso a la base de datos de
secuencias de nucleótidos del EMBL):
DQ644615: Salmonella enterica
subsp. Enterica cepa CNM-3685-03;
DQ644616: Salmonella enterica subsp. Salamae cepa
CNM-5936-02; DQ644617:
Salmonella enterica subsp. Salamae cepa
CNM-176; DQ644618: Salmonella enterica
subsp. Salamae cepa CNM-169; DQ644620:
Salmonella enterica subsp. Arizonae cepa
CNM-771-03; DQ644621:
Salmonella enterica subsp. Arizonae cepa
CNM-247; DQ644622: Salmonella
enterica subsp. Arizonae cepa CNM-259;
DQ644623: Salmonella enterica subsp. Diarizonae cepa
CNM-834-02; DQ644624:
Salmonella enterica subsp. Diarizonae cepa
CNM-750-02; DQ644625:
Salmonella enterica subsp. Diarizonae cepa
CNM-2667-02; DQ644627:
Salmonella enterica subsp. Houtenae cepa
ST-22; DQ644629: Salmonella enterica
subsp. Indica cepa CNM-186; DQ644630:
Salmonella enterica subsp. Indica cepa
CDC-811; DQ644631: Salmonella enterica
subsp. Indica cepa CDC-1937; U43237:
Salmonella enterica cepa RKS4194; U43238:
Salmonella enterica cepa RKS3333; U43239:
Salmonella enterica cepa RKS3057; U43240:
Salmonella enterica cepa RKS3044; U43241:
Salmonella enterica cepa RKS3041; U43242:
Salmonella enterica invasión cepa RKS3027; U43243:
Salmonella enterica cepa RKS3015; U43244:
Salmonella enterica cepa RKS3014; U43245:
Salmonella enterica cepa RKS3013; U43246:
Salmonella enterica cepa RKS2995; U43247:
Salmonella enterica cepa RKS2993; U43248:
Salmonella enterica cepa RKS2985; U43249:
Salmonella enterica cepa RKS2983; U43250:
Salmonella enterica cepa RKS2980; U43251:
Salmonella enterica cepa RKS2979; U43252:
Salmonella enterica cepa RKS2978; U43271: Salmonella
enterica cepa RKS 1280; U43272: Salmonella
enterica cepa RKS1518; U43273: Salmonella Gallinarum cepa
RKS2962; DQ644619: Salmonella enterica subsp.
Arizonae cepa CNM-822-02;
DQ644626: Salmonella enterica subsp. Houtenae cepa
CNM-2556-03; DQ644628:
Salmonella enterica subsp. Houtenae cepa
ST-15; EU348366: Salmonella enterica
subsp. Enterica serovar Gallinarum cepa S9873; EU348368:
Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Pullorum cepa
1794; EU348369: Salmonella enterica subsp. Enterica
serovar Senftenberg cepa JXS-04#01. Los nucleótidos
que aparecen con letra mayúscula indican coincidencia de
nucleótidos entre las secuencias comparadas; los nucleótidos en
letra minúscula indican no coincidencia entre las secuencias
comparadas. Al final del alineamiento, se muestra mediante
asteriscos la secuencia consenso entre todas las secuencias
comparadas.
Sorprendentemente, los investigadores han
diseñado unas parejas de cebadores que permiten la detección
específica de los microorganismos del género Salmonella sp.,
debido a que amplifican una región del genoma de Salmonella
sp. muy conservada entre todas las especies del género, e incluso a
nivel de variante, lo que permite la detección de múltiples
especies y serovariantes de Salmonella sp. con un único
ensayo.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona
con un método in vitro para la detección de
Salmonella sp. en una muestra (método 1 de la invención) que
comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i).
En la presente invención, se entiende por
"ácido nucleico" a la repetición de monómeros llamados
nucleótidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Existen dos
tipos de ácidos nucleicos: ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN
(ácido ribonucleico). Adicionalmente, de forma artificial, a partir
de ARN se puede obtener ADN complementario (ADNc) que también se
considera un ácido nucleico.
Por tanto, en la presente invención, se entiende
por "preparación de ácidos nucleicos" al conjunto de ácidos
nucleicos, es decir, ADN y/o ADNc procedente de la
retrotranscripción del ARN presentes en una preparación que va a ser
sometida a una reacción de amplificación.
En la presente invención se entiende por
"ADN" ó "ADN genómico" al material genético de los
organismos vivos que controla la herencia y se localiza en el núcleo
de las células.
En la presente invención se entiende por
"ARN" a la molécula resultado de la transcripción de una
secuencia de ADN.
En la presente invención, se entiende por
"ADNc" al ADN obtenido a partir del ARNm por acción de la
retrotranscriptasa inversa.
Como entiende el experto en la materia, la
detección de Salmonella sp. a partir del ARN implica la
existencia de células viables de Salmonella sp. en la muestra
analizada. Por tanto, la puesta en práctica del método de la
invención permite no sólo detectar Salmonella sp. (si la
muestra de partida es una preparación de ADN genómico), sino también
detectar exclusivamente células viables de Salmonella sp.
presentes en la muestra analizada (si la muestra de partida es una
preparación de ADNc obtenida a partir de una preparación ARN de
Salmonella sp.).
El método de la invención requiere la extracción
del ácido nucleico de una muestra. Las distintas técnicas de la
extracción de ácidos nucleicos son ampliamente conocidas en el
estado de la técnica, por ejemplo, cromatografia de penetrabilidad,
cromatografia de intercambio iónico, cromatografía de adsorción,
ultrafiltración, empleo de bolas magnéticas a las que los ácidos
nucleicos se unen selectivamente, etc. (Sambrook et al.,
2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3).
Adicionalmente, existen kits de extracción de ácidos nucleicos
comercialmente disponibles para realizar dicha extracción.
Si el ácido nucleico es ADN, la extracción puede
realizarse, por ejemplo, mediante el uso de resinas quelantes (e.g.
CHELEX 100) y de intercambio iónico. Éstas resinas pueden ser
naturales (aluminosilicatos) como zeolitas, arcillas minerales y
feldespatos. O de naturaleza sintética como óxidos metálicos
hidratados (óxido de titanio hidratado), sales insolubles de
metales polivalentes (fosfato de titanio), sales insolubles de
heteropolisacáridos (molibdofosfato amónico), sales complejas
basadas en hexacianoferratos insolubles y zeolitas sintéticas.
Éstas resinas poseen una elevada afinidad por los iónes metálicos
polivalentes y se emplean para superar los inhibidores de PCR
presentes en el ADN de la muestra.
En el caso de que el ácido nucleico que se
quiere extraer de la muestra sea ARN, existen kit comerciales
exclusivamente diseñados para este propósito que contienen los
componentes adecuados para extraer en perfectas condiciones el ARN:
altas concentraciones de sales caotrópicas en el tampón de lisis
para inactivar las ARNasas, membranas de sílica que favorecen la
adsorción del ARN, DNasas que eliminan el ADN para alcanzar un
aislado de ARN de gran pureza, etc. Un kit comercial que reúne las
características antes citadas es, por ejemplo, y sin limitarse a,
Nucleospin® RNA.
El método de la invención comprende una reacción
de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos.
Como entiende el experto en la materia, una reacción de
amplificación consiste, básicamente, en la multiplicación
exponencial de una molécula de ADN diana (o de una región diana de
una molécula de ADN) mediante el empleo de oligonucleótidos que
hibridan con las regiones que flanquean la región diana que se
quiere amplificar. Las diferentes técnicas o procedimientos de
llevar a cabo reacciones de amplificación están ampliamente
descritas en el estado de la técnica, por ejemplo, en Sambrook
et al., 2001. (supra.). Ejemplos de reacciones de
amplificación son, sin limitarse a, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y variaciones de la misma [amplificación regional
de la reacción en cadena de la polimerasa (RA-PCR,
del inglés Regional Amplification PCR), la reacción en cadena de la
polimerasa a Tiempo Real (RT-PCR del inglés Real
Time PCR, etc.] El protocolo seguido para llevar a cabo una PCR es
ampliamente conocido en el estado de la técnica y actualmente,
existen kits comerciales que contienen los materiales necesarios
para llevar a cabo dicha amplificación. Asimismo, las condiciones
de temperatura, tiempo, concentraciones de reactivos y número de
ciclos de la PCR dependerán de la ADN polimerasa utilizada en la
reacción de amplificación, de la especificidad de los cebadores,
etc. Si se emplea un kit comercial, las condiciones de la reacción
serán las especificadas por el fabricante del kit.
Así, en una realización particular de la
invención, la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante
una reacción en cadena de la polimerasa a Tiempo Real. Una reacción
de PCR a Tiempo Real es, básicamente, una PCR convencional en la
que los equipos de amplificación (termocicladores) llevan
incorporados un sistema de detección de fluorescencia, basándose
dicha detección en la utilización de unas moléculas específicas
denominadas fluoróforos y quenchers.
Como entiende el experto en la materia, una
reacción de amplificación requiere el empleo de una pareja de
oligonucleótidos, denominados cebadores, que van a hibridar con la
región/secuencia diana que se quiere amplificar. En el caso concreto
del presente método, la región diana a amplificar es una región del
gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de
dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los
nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en
SEQ ID NO: 1. En la Figura 2 que acompaña a la presente
descripción, se muestran la región del gen invA de distintas
especies de Salmonella sp. que corresponden a la región
comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Como entiende el experto en
la materia, todas las secuencias mostradas en la Figura 2 son
secuencias homólogas (que comparten una secuencia consenso) que
serán detectadas al poner en práctica el método de la invención,
permitiendo así la detección de las distintas
especies/serovariantes de Salmonella sp. Asimismo, el experto
en la materia apreciará que el método de la invención es adecuado
para la detección de otras especies y cepas de Salmonella no
recogidas en la figura 2 siempre que la región del gen invA
correspondiente a la región recogida en dicha figura muestra una
similitud de secuencia sustancial con la secuencia consenso
deducida de dicho alineamiento y, en particular, con la región
central del mismo frente a la que se dirige la sonda de
hibridación.
En una realización particular de la invención,
la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación
para amplificar dicha región diana comprende las secuencias SEQ ID
NO: 2 y 3 [INVAVITWO F/R].
Adicionalmente, la reacción de amplificación
puede llevarse a cabo empleando un sistema de amplificación que
permite eliminar la contaminación con amplificados provenientes de
anteriores ciclos de amplificación. Éste es el caso, por ejemplo,
del master de amplificación AmpErase®
uracil-N-glicosidasa, tal como se
muestra en el Ejemplo que acompaña a la presente descripción
(apartado B, sección 2). La
uracil-N-glicosidasa es una enzima
que degrada el ADN que lleva dUTPs incorporados en lugar de los
dTTPs del "ADN natural". De esta manera se impide la aparición
de falsos positivos debido a la citada contaminación.
Una vez llevada a cabo la reacción de
amplificación es necesario detectar los productos de amplificación
o amplicones. Nuevamente, las técnicas para detectar los productos
de amplificación están ampliamente descritos en el estado de la
técnica, como por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 (citado
at supra). En dicha detección puede emplearse cualquiera de
los procedimientos de identificación de fragmentos de amplificación
conocidos del estado de la técnica, tales como hibridación con
sondas marcadas (por ejemplo con un fluoróforo), tinción, por
ejemplo, tinción de plata, con agentes intercalantes, como bromuro
de etidio o SYBR Green®, etc.
Como es conocido del estado de la técnica, si el
método de amplificación elegido es una PCR a tiempo real, la
detección del producto de amplificación se realiza simultáneamente
a la reacción de amplificación. Para ello, pueden emplearse tanto
mecanismos de detección no específicos como específicos.
Los mecanismos de detección no específicos
detectan todos los ADN de doble cadena producidos durante la
reacción de amplificación (ya sea un producto específico, un
producto inespecífico o dímeros de cebadores). Este mecanismo es el
método estándar y básicamente consiste en añadir un agente
intercalante de la doble cadena o un fluoróforo que emite
fluorescencia cuando se une a esta. Agentes adecuados para este
propósito incluyen SYTO 15, SYTO 25, SYTO 13, SYTO 9, SYBR Green I,
SYTO 16, SYTO 17, SYTO 17, SYTO 21, SYTO 59, SYTO 16, SYTOX, SYTO
BC, DAPI, Hoechst 33342, Hoechst 33258, y PicoGreen.
Preferiblemente, se utiliza SYBR Green ® que se excita a 497 nm y
emite a 520 nm.
Así, en una realización particular, la detección
del producto de amplificación se lleva a cabo mediante un agente
intercalante fluorescente que, en otra realización todavía más
particular, dicho agente intercalante es SYBR Green.
Por otro lado, los mecanismos de detección
específicos son capaces de distinguir entre la secuencia de interés
y las amplificaciones inespecíficas. Todos ellos se basan en la
utilización de quenchers (pigmento quencher o extinguidor no
fluorescente -NFQ- que incrementa la eficacia de detección y señal
al no emitir fluorescencia) y sondas marcadas con un amplio rango
de fluoróforos (pigmento reportero) con diferentes espectros de
excitación y emisión.
En la presente invención se entiende por
"fluoróforo" a una molécula capaz de emitir una radiación
electromagnética en respuesta a la absorción de una radiación de
excitación en donde la longitud de onda de la radiación emitida es
distinta que la longitud de onda de la radiación de excitación y en
donde la emisión de radiación persiste únicamente mientras se
mantiene la radiación de excitación. Ejemplos ilustrativos pero no
limitativos de marcadores fluorescentes que pueden ser usados en el
contexto de la presente invención incluyen:
En la presente invención se entiende por
"quencher" a la molécula que acepta energía de un fluoróforo y
la disipa en forma de calor o fluorescencia. Ejemplos de quenchers
son, sin limitarse a, Methyl Red, ElleQuencher, Dabcyl, Dabsyl,
TAMRA, etc.
Así, en una realización particular, la detección
del producto de amplificación se lleva a cabo mediante una sonda
marcada que, en otra realización todavía más particular, comprende
en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un
pigmento quencher. Ejemplos de sondas que llevan este tipo de
marcaje son, por ejemplo, sondas TaqMan, balizas moleculares
(sondas del tipo "Molecular Beacon"), sondas Scorpions, sondas
Amplifluor, sondas Eclipse, etc.
Adicionalmente, si se desea, la sonda puede
comprender en su extremo 3' una molécula MGB entre la secuencia de
nucleótidos y el pigmento quencher. Un MGB (enlazante al surco
menor, del inglés, "minor groove binder") es una pequeña
molécula en forma de media luna que encaja muy bien en el surco
menor del ADN bicatenario. Así, cuando la sonda hibrida a la
secuencia diana, el MGB estabiliza el apareamiento incorporándose al
surco menor del ADN bicatenario creado entre la sonda y dicha
secuencia diana. La estabilización es mucho más eficaz cuando las
secuencias coinciden perfectamente (es decir, no hay
desparejamiento). Además del superior potencial discriminador, la
mayor estabilidad permite que las sondas sean muy cortas
(normalmente de 13 a 20 bases) en comparación con las sondas
estándar (de 18 a 40 bases), sin detrimento de las diretrices en el
diseño de los cebadores. El Ejemplo que ilustra la presente
invención, en el apartado B, secciones 1 y 2 (desarrollo de las
sondas INVAVITONE e INVAVITWO respectivamente) muestra el uso de
dichas moléculas MGB.
En una realización particular, el producto de
amplificación es detectado mediante una sonda que comprende la
secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4 [INVAVITWO], que
detectará de forma específica la región diana empleada en el método
de detección de Salmonella sp. de la presente invención, es
decir, la región del gen invA de Salmonella sp. que
comprende la región de dicho gen que corresponde a la región
comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
En la presente invención se entiende por "la
región del gen invA de Salmonella sp. que comprende
la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre
los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada
en SEQ ID NO: 1", a la región o secuencia del gen invA de
cualquier especie o variante de Salmonella sp. que es
homóloga a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069
de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En la presente invención se entiende por
"secuencias homólogas" a aquellas secuencias que tienen una
identidad de secuencia entre sí de al menos el 50%, al menos el 60%,
al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 91%,
al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%,
al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el
99%. La expresión "identidad de secuencia" se refiere al grado
en que son idénticas dos secuencias de polinucleótidos en una base
de nucleótido a nucleótido a lo largo de una región en particular
de comparación. El porcentaje de identidad de secuencia puede
calcularse, por ejemplo, comparando dos secuencias alineadas de
forma óptima a lo largo de una región de comparación, determinando
el número de posiciones en las que se encuentran bases de ácidos
nucleicos idénticas (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas
secuencias para dar el número de posiciones coincidentes,
dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número
total de posiciones en la región de comparación (es decir, el tamaño
de la ventana) y multiplicando el resultado por
100.
100.
La homología entre varias secuencias de
nucleótidos puede determinarse por métodos convencionales, por
ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento múltiple de
secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por
ejemplo, ClustalW (Chenna, et al. 2003 Nucleic Acids Res,
31:3497-3500). En la Figura 2 que acompaña a la
presente descripción se muestra un alineamiento múltiple de
secuencias en la que puede verse alineadas las secuencias del gen
invA de distintas especies de Salmonella sp. que son
homólogas entre sí.
Adicionalmente, una realización particular de la
invención es la inclusión de un control interno de amplificación en
los métodos de detección de Salmonella sp descritos en la
presente descripción. De este modo, es posible llevar a cabo una
reacción de amplificación en presencia de un ADN exógeno que sirva
como control interno de la amplificación, de tal forma que se pueda
asegurar que un resultado negativo en la detección del
microorganismo (en la presente invención Salmonella sp.) no
se debe a la inhibición de la Taq polimerasa por la
presencia de sustancias inhibidoras, si no a la falta de
complementariedad entre la sonda y los productos de amplificación o
a la ausencia de amplificación por ausencia de anillamiento de los
cebadores. La inclusión del control interno de amplificación
permitirá identificar fácilmente los resultados falsos negativos.
En la solicitud de patente WO2007/085675 y en la publicación de
Alvarez, J. et al. 2004 (J. Clin. Microbiol.,
42:1734-1738) se describe la elaboración de un
control interno de amplificación.
Por tanto, en una realización particular, la
amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos
extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando
los mismos cebadores que los usados para amplificar una región del
gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de
dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los
nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en
SEQ ID NO: 1.
En otra realización todavía más particular, el
ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
Entre las parejas de cebadores identificadas por
los inventores que permiten la detección específica de los
microorganismos del género Salmonella sp. e incluso a nivel
de variante, se encuentra la pareja de cebadores formada por las
secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R].
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con un método in vitro para la detección de
Salmonella sp. en una muestra (método 2 de la invención) que
comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R]; y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación mediante el empleo de una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE].
Tal como se ha indicado en párrafos anteriores,
en la presente invención se entiende por "preparación de ácidos
nucleicos" al conjunto de ácidos nucleicos, es decir, ADN, ARN
y/o ADNc presentes en una muestra.
Las diferentes técnicas de extracción de ácido
nucleicos, de detección de productos de amplificación, marcaje de
sondas, etc. anteriormente descritos para el método 1 de la
invención, son aplicables al presente método 2 de la invención.
Al igual que en el método 1 de la invención, la
reacción de amplificación puede realizarse en presencia de un ADN
exógeno que sirva como control interno de la amplificación. Por
tanto, en una realización particular, la amplificación se lleva a
cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen
secuencias que pueden ser amplificadas usando pareja de cebadores
que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6
[INVAVITONE F/R].
En otra realización todavía más particular, el
ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
Como entiende el experto en la materia,
Salmonella sp. es un microorganismo ampliamente distribuido
que puede sobrevivir en multitud de ambientes distintos. Así, en la
puesta en práctica de los métodos de detección de Salmonella
sp. descritos en la presente invención, puede emplearse cualquier
tipo de muestra donde se tenga sospecha de contaminación por
Salmonella sp. Típicamente, la muestra es una población
bacteriana asociada a un procedimiento industrial de producción de
bienes de consumo como por ejemplo industrias papeleras, industrias
heladeras, industrias petroleras, industrias aceiteras, cerveceras
y de tratamiento de aguas residuales o asociada a un procedimiento
de manipulación de fluidos biológicos en el entorno sanitario como
sistema de perfusión entéricos, sistemas de diálisis, catéteres y
similares. Alternativamente, la muestra puede ser de origen
biológico y comprender tejidos, células, extractos celulares,
homogenados celulares, fracciones proteicas, fluidos biológicos
(sangre, suero, plasma, orina, líquido sinovial, líquido
cefalorraquídeo, heces, sudor, etc.). Alternativamente, la muestra
puede consistir en órganos enteros tales como músculo, ojo, piel,
gónadas, nódulos linfáticos, corazón, cerebro, pulmón, hígado,
riñón, bazo, tumores.
Por tanto, en una realización particular de la
invención, la muestra se selecciona del grupo que comprende una
muestra ambiental (como por ejemplo, una muestra de agua o tierra),
una muestra clínica (fluidos biológicos, heces, etc.) y una muestra
alimentaria (productos alimentarios perecederos, carne de pollo,
huevos, cremas, etc). De forma preferida, la muestra a analizar
será una muestra alimentaria.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
inventores han desarrollado un conjunto de cebadores y sondas que
permiten la detección específica de Salmonella sp.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un oligonucleótido cuya secuencia se selecciona del
grupo de secuencias SEQ ID NO: 2 [cebador INVAVITWO F], SEQ ID NO:
3 [cebador INVAVITWO R], SEQ ID NO: 4 [sonda INVAVITWO], SEQ ID NO:
7 [sonda INVAVITONE].
Los kits que comprenden los reactivos y agentes
necesarios para la puesta en práctica de los métodos descritos en
la presente invención constituyen aspectos adicionales de la
misma.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con un kit (kit 1 de la invención) que comprende una pareja de
cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de
Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que
corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y
1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
En una realización particular del kit, la pareja
de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3 [INVAVITWO
F/R].
En otra realización particular, dicho kit
comprende, además, una sonda marcada capaz de detectar el producto
de amplificación.
En otra realización particular, la sonda
comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3'
un pigmento quencher.
En otra realización particular, la sonda
comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4
[INVAVITWO].
En otra realización particular, el kit
comprende, además, un agente intercalante fluorescente, que en una
realización todavía más particular, es SYBR Green.
En otra realización particular, el kit de la
invención comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos
contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos
cebadores que los usados para amplificar una región del gen
invA de Salmonella sp. que comprende la región de
dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los
nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en
SEQ ID NO: 1.
En otra realización todavía más particular de
dicho kit, el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del
fago \lambda.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit (kit 2 de la invención) que comprende (i) la pareja de
cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R] y (ii) una
sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un
pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y
presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7
[INVAVITONE].
En una realización particular, dicho kit
comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen
secuencias que pueden ser amplificadas usando la pareja de
cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R] que, en una
realización todavía más particular, dicho ADN exógeno comprende un
fragmento del genoma del fago \lambda.
Por último, el uso de los kits 1 y 2 de la
invención constituyen aspectos adicionales de la misma.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona
con el uso de un kit según se ha descrito e la presente invención
para la detección de Salmonella sp. en una muestra.
En una realización particular, la muestra se
selecciona del grupo que comprende una muestra ambiental, una
muestra clínica y una muestra alimentaria.
El siguientes Ejemplo es ilustrativo de la
invención y no pretende ser limitativo de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina CHELEX 100-6% se
preparó mediante resuspensión de 1,5 gramos de Chelex 100 en 25 ml
de agua bidestilada y manteniendo bajo agitación moderada. La
solución de Chelex 100-6% se conservó a 4ºC.
Para la extracción del ADN a partir de
Salmonella sp., las muestras con 1 ml de cultivo
pre-enriquecido se centrifugaron en un tubo
eppendorf de 1,5 ml durante 5 minutos a 13.000 rpm. Se eliminó el
sobrenadante con pipeta y se resuspendió el pellet en 300 \mul de
CHELEX 100-6, utilizando vortex. Las muestras se
incubaron a 56ºC durante 15-20 minutos y se
agitaron usando un vortex durante 10 segundos. Las muestras se
incubaron en un baño a 100ºC durante 5 minutos, se mezclaron usando
vortex durante 10 segundos y fueron transferidas de forma inmediata
los tubos a hielo. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos
a 13.000 rpm. 200 \mul del sobrenadante (que contiene DNA) fue
transferido a otro tubo en donde se conservó a 4ºC si iba a ser
utilizado en pocos días o a -20ºC para su conservación durante
periodos más prolongados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener un control interno, se utilizaron
los cebadores invA ICF (SEQ ID NO: 8) e invA ICR (SEQ
ID NO: 9) de secuencia:
invA ICF (SEQ ID NO: 8):
\vskip1.000000\baselineskip
invA ICR (SEQ ID NO: 9):
Las secuencias subrayadas pertenecen a los
cebadores 139 y 141 que amplifican el gen invA de
Salmonella (Malorny et al., 2003, Appl. Environ.
Microbiol. 69:290-296), mientras que las secuencias
en negrita pertenecen al fago \lambda que se incorporan para que
formen parte de los cebadores y puedan amplificar un fragmento de
fago \lambda para convertirlo en control interno. Con estos
cebadores se amplifica un fragmento de 348 pb de fago \lambda
(SEQ ID NO: 10):
Este fragmento corresponde al control interno,
que en la PCR a tiempo real con SYBR-GREEN permite
amplificar un fragmento del fago lambda con los mismos cebadores
que se utilizan para detectar Salmonella (cebadores 139 y
141).
Para obtener el control interno se realizó una
PCR convencional usando como molde una preparación de fago
\lambda digerida con EcoRI y HindIII (SIGMA) usando la siguiente
mezcla de reacción
y las siguientes condiciones de
PCR:
Una vez realizada la PCR, se comprobó que hubo
amplificación de los productos. Para eso se realizó una
electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se cargó parte de las
muestras en los pocillos del gel, por ejemplo: 5 \mul muestra + 5
\mul de tampón de carga. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y
se comprobó que apareciera la banda del tamaño deseado.
Posteriormente se realizó una purificación del
ADN obtenido en la PCR utilizando el resto de la muestra que no se
había cargado en el gel. La purificación se hizo con kit específico
para ello, como el kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN),
siguiendo el protocolo establecido por la casa comercial.
El producto obtenido fue el control interno, que
se guardó a -20ºC como stock. Partiendo del stock se utilizó la
dilución 10^{-5} en la PCR a tiempo real con
SYBR-GREEN.
La detección de Salmonella mediante PCR
en tiempo real usando SYBR-Green se llevó a cabo
usando la mezcla de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
y las siguientes condiciones de
amplificación
Durante la primera parte de la invención se
llevó a cabo un estudio genómico del género Salmonella sp.
para la selección de dianas adecuadas para detección de este
patógeno en muestras alimentarias. La diana genómica elegida fue el
gen invA, ya propuesto por varios autores (Malorny et
al., supra). Este gen desempeña un papel imprescindible
en los mecanismos de invasión y supervivencia de Salmonella
sp., por lo que la secuencia de dicho gen tenía que encontrarse
transcrita en el ARN mensajero en la mayoría de los serotipos del
género. A continuación se puso a punto la metodología de PCR
convencional (ya publicada, cebadores 139 y 141) (Malorny et
al., supra.) en base al gen invA de
Salmonella sp. Así mismo, se puso a punto la metodología de
extracción de ADN basado en la resina de sílice comercial CHELEX
100 (ver apartado 1).
La amplificación se realizó utilizando un equipo
ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) de
PCR a tiempo real. Esta técnica permitió la detección específica y
rápida de ADN de Salmonella sp. (véase Tabla 1).
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En la segunda parte de la invención se extrapoló
la metodología desarrollada para el ADN para la detección de ARN
mensajero, con el fin de que el ensayo permitiera discernir entre
la detección de células vivas y muertas de Salmonella y por
lo tanto, dar un valor añadido al sistema de detección desarrollado
en la presente invención. Para ello, se diseñaron cebadores y una
sonda teniendo en cuenta su inclusión en el gen invA. En el
diseño de la sonda y de los cebadores que la flanquean, se
analizaron las bases genéticas donde existe la información conocida
de Salmonella sp. y así generar unas secuencias específicas
que estuvieran presentes en todos los serotipos de
Salmonella sp. Finalmente y mediante el programa Primer
Express® se diseñó una sonda que se denominó INVAVITONE.
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El ensayo de detección de Salmonella sp.
mediante la utilización de sonda TagMan-MGB®
(INVAVITONE) y los cebadores que la flanquean
(INVAVITONE-F e INVAVITONE-R) se
realizó utilizando el equipo ABI PRISM® 7000 Sequence Detection
System (Applied Biosystems), de PCR a tiempo real. La sonda
TaqMan-MGB®, sintetizada por Applied Biosystems,
presenta el fluoróforo VIC en su extremo 5' que actúa como
"reporter" y en su extremo 3' un extinguidor no fluorescente
(NFQ) y una cola terminal MGB (minor
groove-binder).
Se analizaron diferentes serotipos de
Salmonella sp., además de otra serie de microorganismos
relacionados que se utilizaron como controles negativos de
detección. La inclusión de estos controles negativos sirvió también
para comprobar la especificidad de la sonda. Todos los aislamientos
se analizaron en repetidas ocasiones para comprobar la
reproducibilidad de la técnica. Estos microorganismos y sus valores
Ct (Cycle threshold) aparecen reflejados en la Tabla 2. Este
valor de Ct es el ciclo en el que la muestra atraviesa o supera un
nivel de fluorescencia que separa la fluorescencia de fondo o
"background" de la fluorescencia propia de la amplificación.
Cuando se trabaja con extracciones de ADN reales, en las que se
desconoce la cantidad de moléculas de partida, el valor de Ct varía
en función de esta cantidad (Figura 1). Los resultados de la
detección se muestran en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Como se observa en la Tabla 2, la sonda diseñada
fue capaz de detectar los serotipos de Salmonella sp. más
comunes en nuestro entorno. No obstante, algún ensayo con serotipos
foráneos no comunes en nuestra zona no dieron el resultado positivo
esperado. Con el fin de asegurar un resultado óptimo en la detección
de Salmonella sp., se propuso el diseño de una nueva sonda
de las mismas características que la testada, pero con la capacidad
de detectar un mayor número de serotipos.
La sonda INVAVITONE también se utilizó para
detectar Salmonella sp. en muestras reales de alimentos
procedentes de Laboratorios Bromatológicos Araba. Las muestras se
obtuvieron de diversas matrices alimentarias reales. El ADN fue
extraído mediante el protocolo de extracción con Chelex y se realizó
la hibridación en el termociclador. Se analizó en paralelo la
detección mediante inmunoconcentración con el equipo MiniVidas® de
la empresa Biomerieux. El número de muestras analizado fue de 170,
incluyendo en algunas ocasiones réplicas del mismo alimento o
colonias pertenecientes a la misma muestra.
Así mismo, la sonda INVAVITONE se utilizó para
comprobar la detección de ARN mensajero en matrices alimentarias
inoculadas con serotipos de Salmonella sp. Tras su incubación
en caldos de enriquecimiento durante 24 horas a 37ºC, el ARN fue
extraído mediante un kit comercial
(Nalgery-Machinery®). La aplicación de la
retrotranscripción del ARN procedente de las diferentes pruebas de
extracción a ADNc, mediante el uso del kit comercial de
Applied-Biosystems, permitió su detección a tiempo
real tras la amplificación e hibridación con la sonda INVAVITONE en
el termociclador ABI-PRISM 7000 SDS® (Applied
Biosystems).
Durante esta fase de la invención se ha abordado
la mejora de la sonda específica de Salmonella sp.
INVAVITONE, controles internos de amplificación así como el
desarrollo de otra sonda con capacidad para detectar al control
interno, con el objetivo de obtener los reactivos necesarios y
suficientes para el desarrollo de un kit comercial de detección de
este patógeno. Tomando como base la secuencia genética invA,
se diseñaron cebadores flanqueadores de la región correspondiente a
la amplificación e hibridación de la sonda INVAVITONE, que
generarian un fragmento de aproximadamente 300 pares de bases que
podría ser secuenciado por procesos automáticos. Una vez
sintetizados los cebadores por la empresa
Qiagen-Izasa, se utilizaron para amplificar por PCR
la citada secuencia en los serotipos de Salmonella sp. con
hibridación negativa a la sonda INVAVITONE, junto con controles
positivos. Se obtuvieron bandas de ADN de los tamaños esperados qué,
tras su purificación mediante kit comercial, fueron enviados para
su secuenciación a la empresa Sistemas Genómicos. Las secuencias
genéticas obtenidas fueron analizadas mediante el programa de
alineamiento ClustalW con el objetivo de determinar los motivos que
provocaban la falta de amplificación e hibridación con la sonda
INVAVITONE. Se encontraron polimorfismos genéticos a nivel de
nucleótido que justificaban con claridad la ausencia de reactividad.
Es decir, aunque el gen esté presente en la mayoría de los
serotipos, no es posible su detección debido a mutaciones silentes
que pudieran invalidar esta secuencia para su utilización
diagnóstica por su falta de hibridación con la sonda. Un problema
añadido es la existencia de varios miles de serotipos distintos de
este microorganismo, de los cuales solo unos pocos están
completamente secuenciados y sus secuencias depositadas en bases de
datos internacionales a disposición de la comunidad científica.
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Partiendo de la información obtenida mediante la
secuenciación de los serotipos que no reaccionaban con la sonda
INVAVITONE más la información disponible en aquel momento en las
bases genéticas, se desarrolló una nueva versión de sonda
específica de Salmonella sp., buscando un lugar dentro del
gen invA más estable y con menor alteración a nivel de
nucleótido.
Para el desarrollo de la segunda sonda, se
adquirió un equipo de PCR a tiempo real denominado iQcycler® de la
casa comercial Bio-Rad que no presentaba el filtro
necesario para la lectura con el fluoróforo VIC (empleado en la
sonda INVAVITONE), lo que determinó la selección de fluoróforos
para el marcaje de la segunda sonda. Ésta se diseñó mediante el
programa Primer Express® y se solicitó a la empresa Applied
Biosystems su marcaje en 5' con el fluoróforo 6-FAM,
compatible para su detección en ambos equipos de PCR a tiempo
real.
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda sonda desarrollada por nuestro equipo
fue denominada INVAVTTWO. La secuencia de los nuevos cebadores y de
la nueva sonda TaqMan-MGB® es la siguiente:
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Así mismo, se optimizaron las concentraciones de
nueva sonda TagMan-MGB® así como la concentración
de los dos cebadores. Las concentraciones óptimas de los cebadores
y de la sonda TaqMan-MGB® por reacción aparecen en
la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las reacciones de amplificación se llevaron a
cabo usando la siguiente mezcla de reacción
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y las siguientes condiciones de la
amplificación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se eligió una master de amplificación que
tuviera AmpErase®
uracil-N-glicosilasa (UNG). UNG es
un enzima recombinante de 26-kDa, que permite
eliminar la contaminación con amplificados provenientes de
anteriores ciclos de amplificación el enzima degrada el ADN que
lleva dUTPs incorporados en lugar de los dTTPs del "ADN
natural". Esto va a impedir la aparición de falsos positivos por
la mencionada contaminación.
La sonda INVAVITWO fue evaluada en cuanto a los
test de inclusividad como de exclusividad con una amplia colección
de ADNs procedentes de la colección de serotipos de
Salmonella sp. disponibles en la Facultad de Farmacia de la
UPV/EHU, junto con cepas de otros microorganismos pertenecientes a
otras especies. Como puede observarse en la tabla adjunta (Tabla
4), los resultados mejoraron notablemente con respecto a la sonda
INVAVITONE, ya que detectó la práctica totalidad de los serotipos
probados (inclusividad), junto con una gran exclusividad, ya que no
se detectaba ningún falso positivo en otros microorganismos
estudiados (Tabla 4).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La sonda INVAVITWO fue probada con muestras
reales en Laboratorios Bromatológicos Araba mediante la extracción
de ADN utilizando el protocolo de Chelex y en paralelo con la
técnica de inmunoconcentración con el equipamiento MiniVidas de la
casa Biomerieux, y utilizando el equipo iQcycler de la casa
Bio-Rad. El número de muestras alimentarias
analizado con ambos procedimientos supera las 200.
El estudio de la PCR para la detección de
patógenos en alimentos puede verse afectada por la presencia de
sustancias presentes en las matrices alimentarias con capacidad
para la inhibición de la enzima Taq polimerasa presente en la
reacción. Por este motivo se diseñó un ADN control que pueda
co-amplificarse, de tal manera que se pueda
asegurar que un resultado negativo con la sonda específica del
microorganismo no se debe a inhibición de la Taq polimerasa,
si no a falta de complementariedad entre la sonda y la secuencia o
a ausencia de amplificación por ausencia de anillamiento de los
cebadores.
Se diseñó una estrategia de obtención mediante
PCR de un ADN quimérico generado por amplificación de un fragmento
específico del bacteriófago \lambda modificado mediante la
adición de extremos complementarios a los cebadores
INVAVITWO-F e INVAVITWO-R. Tras su
detección mediante electroforesis y purificación mediante kit
comercial, el control interno se diluyó hasta 1/10.000 para su
incorporación como ADN control positivo en las muestras.
Posteriormente se realizó una purificación del
ADN que se había obtenido en la PCR utilizando el resto de la
muestra que no se ha cargado en el gel. La purificación se hizo con
un kit específico para ello [kit QIAquick PCR Purification Kit
(QIAGEN)] siguiendo las instrucciones del fabricante.
El producto obtenido es el control interno, que
se guardó a -20ºC como stock.
La amplificación del ADN del fago lambda se
llevó a cabo con la pareja de cebadores CI
INVAVITWO-F (SEQ ID NO: 11) y CI
INVAVITWO-R (SEQ ID NO: 12) de secuencia:
CI INVAVITWO-F (SEQ ID NO:
11):
CI INVAVITWO-R (SEQ ID NO:
12):
Las secuencias subrayadas pertenecen a los
cebadores INVAVITWO-F e INVAVITWO-R
que amplifican el gen invA de Salmonella, mientras que
las secuencias en negrita pertenecen al fago \lambda que se
incorporan para que formen parte de los cebadores y puedan
amplificar un fragmento de fago \lambda convirtiéndolo en control
interno.
La reacción de PCR para la generación del
control interno se lleva a cabo mediante amplificación de una
muestra de ADN del fago lambda digerido con EcoRI y HindIII (SIGMA)
usando la siguiente mezcla de reacción:
\newpage
y las siguientes condiciones de
PCR
Una vez realizada la PCR, se comprobó que había
habido amplificación de los productos. Para eso se realizó una
electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se cargó parte de las
muestras en los pocillos del gel (5 \mul muestra + 5 \mul de
tampón de carga.) y se tiñó el gel con bromuro de etidio para
comprobar que aparecía la banda del tamaño deseado. Con estos
cebadores se amplificó un fragmento de 150 pb de fago \lambda
(SEQ ID NO: 13):
Este fragmento será el control interno, que en
la PCR a tiempo real amplificará con los mismos cebadores que se
utilizan para detectar Salmonella
(INVAVITWO-F e INVAVITWO-R). El
producto de amplificación del control interno se detecta mediante
el uso de una sonda específica de secuencia TGCGGTTATAGCGGTCCGGCTG
(SEQ ID NO:14) marcada en 5' con el fluoróforo TAMRA y en 3' con
DDQI (Deep Dark Quencher I) de forma que la sonda tiene la
secuencia
5'TAMRA-TGCGGTTATAGCGGTCCGGCTG-DDQI
3'
en donde la zona del control
interno donde hibridará la sonda se muestra en negrita y
subrayado.
El ADN bacteriano tras ser sometido a
tratamientos de pasteurización, esterilización o radiación puede
ser detectado por PCR. Esto es un hecho constatado que ha sido
observado al someter diferentes extracciones de ADN a diferentes
tratamientos de pasteurización y esterilización. Esto implica, que
una bacteria muerta, podría ser detectada (su ADN) y considerarse,
como un resultado positivo, dando lugar a un falso positivo. Parece
entonces claro que la estrategia para detectar células vivas, o en
fase de replicación, puede pasar por la detección del ARNm.
Una vez aislado el ARNm, éste se transformó en
ADNc mediante la enzima transcriptasa inversa en el proceso
denominado retrotranscripción mediante PCR
(RT-PCR). Una vez transformado en ADNc se detectó
por PCR a tiempo real mediante la sonda INVAVITWO (SEQ ID NO: 4)
marcada con fluorescencia.
A continuación, se procedió a extraer ARN de
Salmonella con métodos comerciales (NucleoSpin®
Machery-Nagel for ARN) (ver protocolo en la sección
4.1) tras lo cual se trató con DNsa para eliminar el posible ADN
contaminante que puediese dar origen a un falso positivo. El ARN se
almacenó a -80ºC para su conservación o a - 20ºC si el análisis
posterior va a ser realizado inmediatamente.
Las extracciones de ARN se midieron en un
espectrofotómetro NanoDrop® ND-100 y se obtuvieron
buenas medidas. Los ratios obtenidos 260/280 fueron 2 o valores
cercanos a 2. La cantidad de ARN extraído fue baja por lo que no se
pudo visualizar ARN al hacer geles de agarosa desnaturalizantes con
formaldehído. Sin embargo la cantidad de ARN fue suficiente para
ser utilizado como diana en una RT-PCR. En las
RT-PCRs la eficacia de transferencia desde ARN a
cADN, no es alta, aun así, la posterior detección con sondas
TaqMan-MGB® fue lo suficientemente sensible como
para solventar este inconveniente. Se utilizó un protocolo de
RT-PCR de la casa comercial Applied Biosystems con
5 \mul de muestra inicial de ARN (ver protocolo en la sección
4.1).
La extracción del ADN se llevó a cabo mediante
el kit NUCLEOSPIN®. Para ello, se centrifugaron muestras de 1 ml de
cultivo en un tupo de 1.5 ml durante 5 min a 13000 rpm. El pellet
se resuspendió en 50 \mul de TEL (TE buffer que contiene 0,2
mg/ml de lisozima) y se incubó 10 minutos a 37ºC. A continuación se
añadieron 350 \mul de buffer RA1 y 3,5 \mul de
\beta-mercaptoetanol. El contenido se transfirió a
las unidades NucleoSpin® Filter que fueron centrifugadas durante 1
minuto a 11.000 r.p.m. Se añadieron 350 \mul de etanol (70%) al
filtrado y se transfirió a las columnas NucleoSpin® RNA II column,
se centrifugó durante breves segundos a 8.000 rpm. y se transfirió
la columna a un nuevo colector. A continuación se añadieron 350
\mul de MDB (Membrane Desalting Buffer), se centrifugaron las
columnas durante 1 minuto a 11000 rpm.
A continuación, se añadió a cada columna 95
\mul de una solución patrón de DNase formada por 10 \mul de
DNasa I y 90 \mul de tampón de reacción de DNasa. Las columnas se
incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación,
se añadieron a cada columna 200 \mul de buffer RA2 y se dio un
pulso con la la centrifuga a 8.000 rpm. Las columnas fueron
transferidas a un nuevo colector. A continuación, se añadieron 600
\mul de buffer RA3, se dio un pulso en la centrifuga a 8000 rpm,
se descartó el líquido filtrado y se volvió a poner la columna en
ese mismo colector. A continuación se añadieron 250 pl de buffer
RA3. Se centrifugaron las columnas durante 2 minutos a 11.000 rpm
para secar el filtro por completo. La columna se transfirió a un
tubo de 1,5 ml y, a continuación, se añadieron 60 \mul de
H_{2}O (RNase-free) y se centrifugaron las
columnas durante 1 minuto a 11.000 rpm. Se recogió el contenido del
tubo.
La reacción de retrotranscripción se llevó a
cabo usando la siguiente mezcla de reacción:
usando las siguientes
condiciones:
Las extracciones de ARN se guardaron congeladas,
aunque si se iban a utilizar en breve se guardaron a -20ºC y si se
iban a utilizar más tarde a -80ºC.
Los resultados obtenidos fueron válidos,
detectando ADNc en todos los ensayos realizados y no se detectó
ningún tipo de ADN contaminante en las extracciones de ARN. Esto
implicó que el ADNc detectado era copia del ARN extraído, que a su
vez es indicador de la actividad bacteriana. Se han realizaron
ensayos de RT-PCR a tiempo real en el que se han
empleando cultivos puros de varias especies bacterianas diferentes
del genero Salmonella procedentes del archivo de aislamiento
del Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología de
la UPV/EHU. Paralelamente, se realizaron pruebas con muestras de
cultivo puro de varias cepas de Salmonella hervidas,
esterilizadas y pasteurizadas. Como controles negativos se
emplearon muestras de E. coli cepa CECT 679 y Shigella
sp cepa CECT 583. Los resultados obtenidos fueron muy
satisfactorios, de forma que las diferentes muestras de
Salmonella testadas fueron detectadas. Los controles
negativos y las muestras pasteurizadas y hervidas dieron también el
resultado esperado. La especificidad y la resolución de la
tecnología TaqMan MGB demostró ser capaz de detectar cantidades muy
bajas de ARNm, por lo que la técnica de RT-PCR a
tiempo real testada es válida para la detección de células viables
de Salmonella sp.
La finalidad del ensayo fue comprobar los
métodos de detección de ADN y ARN mensajero, la retrotranscripción,
la hibridación con sondas a tiempo real y la detección de los
controles internos de amplificación en distintas matrices
alimentarias, inoculando todas ellas de manera artificial con la
cepa control Salmonella enterica serotipo Typhimurium nº 75
del cepario de la UPV/EHU.
Las matrices alimentarias que se utilizaron en
este ensayo, numeradas de esta misma forma, fueron las
siguientes:
- 1.
- Pollo autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas.
- 2.
- Pescado autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas.
- 3.
- Bollo autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas.
- 4.
- Medio TSB inoculado con la cepa control, incubado a 37ºC, durante 24 horas.
Se utilizaron dos métodos para extraer el
material genético:
- -
- Extracción de ADN con el protocolo Chelex.
- -
- Extracción de ARN con el kit comercial NucleoSpin.
Una vez obtenidas las extracciones de ADN de
cada una de esas muestras, se guardaron a 4ºC para su uso
posterior. En el caso del ARN, una vez realizados los protocolos de
extracción, se realizó la retrotranscripción para convertir así el
ARN en ADNc. Una vez conseguidas las muestras de ADN y cADN, se
realizó la amplificación/detección con la sonda INVAVITWO en una
PCR a tiempo real. Esta sonda está marcada con el fluoróforo FAM y
se encarga de detectar la presencia de Salmonella. También
se añadió en cada muestra un Control Interno de Amplificación que
es detectado por una sonda marcada en TAMRA, que sirve como
indicador de que no se ha producido inhibición en la
amplificación.
Además de las muestras de ADN y ADNc procedentes
de las distintas matrices alimentarias también se amplificó un
Control Positivo que se trataba de una muestra de ADN de la
Salmonella serotipo Typhimurium nº 75 obtenida por hervido y
un Control Negativo (NTC) en el que en vez de ADN se añade agua
estéril.
Tanto los controles positivos como los negativos
dieron resultados esperados: el Control Positivo dio un resultado
positivo y en el Control Negativo el resultado fue negativo. No se
produjo inhibición de la PCR ya que se obtuvo amplificación del
Control Interno de Amplificación.
Los resultados que se obtuvieron tras la PCR a
tiempo real con las matrices alimentarias se muestran en la Tabla
5.
<110> UNIVERSIDAD DEL PAÍS VASCO
\vskip0.400000\baselineskip
<110> LABORATORIOS ARABA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA
DETECCIÓN DE SALMONELLA SP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3640ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1950
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enterica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador INVAVITWO directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaggaaggg acgtcgttag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador INVAVITWO inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtggtacg gtctctgtag aaac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda INVAVITWO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgattggcg atctc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador INVAVITONE directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaaattccg tgaagcaaaa cgta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador INVAVITONE inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccagcaaa ggcgagca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda INVAVITONE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaggcacg cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador invA ICF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaaattat cgccacgttc gggcaagcag aacgaaaaag gtgagc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador invA ICR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcgcacc gtcaaaggaa ccctgcactg ctcaatgcgc ca
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de 348 pb de fago lambda
amplificado con los cebadores SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CI INVAVITWO directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaggaaggg acgtcgttag ggtgcggtta tagcggtc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CI INVAVITWO inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagtggtac ggtctctgta gaaacttcgg aacttacaac c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de 150 pb del fago lambda
amplificado con los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda empleada para detectar el
producto de amplificación de los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID
NO: 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcggttata gcggtccggc tg
\hfill22
Claims (30)
1. Método in vitro para la detección de
Salmonella sp. en una muestra que comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en donde la
pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en donde la reacción de amplificación se
lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa a
tiempo real.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la detección del producto de
amplificación se lleva a cabo mediante un agente intercalante
fluorescente.
5. Método según la reivindicación 4, en donde el
agente intercalante es SYBR Green.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la detección del producto de
amplificación se lleva a cabo mediante una sonda marcada.
7. Método según la reivindicación 6, en donde la
sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su
extremo 3' un pigmento quencher.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, en donde la sonda comprende la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde la amplificación se lleva a cabo
en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias
que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores que los
usados para amplificar una región del gen invA de
Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que
corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y
1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
10. Método según la reivindicación 9, en donde
el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
11. Método in vitro para la detección de
Salmonella sp. en una muestra que comprende
- (i)
- realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando una pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; y
- (ii)
- detectar el producto de amplificación mediante el empleo de una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Método según la reivindicación 11, en donde
la amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno
cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas
usando la pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID
NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
13. Método según la reivindicación 12, en donde
el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en donde preparación de ácidos nucleicos
comprende ADN genómico y/o ADNc obtenido a partir del ARN.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde la muestra es se selecciona del
grupo que comprende una muestra ambiental, una muestra clínica y
una muestra alimentaria.
16. Un oligonucleótido cuya secuencia se
selecciona del grupo de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7.
17. Un kit que comprende una pareja de cebadores
capaz de amplificar una región del gen invA de
Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que
corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y
1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
18. Kit según la reivindicación 17, en donde la
pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3.
19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
17 ó 18 que comprende, además, una sonda marcada capaz de detectar
el producto de amplificación.
20. Kit según la reivindicación 19, en donde la
sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su
extremo 3' un pigmento quencher.
21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
19 ó 20, en donde la sonda comprende la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID NO: 4.
22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
17 ó 18 que comprende, además, un agente intercalante
fluorescente.
23. Kit según la reivindicación 22, en donde el
agente intercalante es SYBR Green.
24. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 23 que comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos
contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos
cebadores que los usados para amplificar una región del gen
invA de Salmonella sp. que comprende la región de
dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los
nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en
SEQ ID NO: 1.
25. Kit según la reivindicación 24, en donde el
ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
26. Un Kit que comprende (i) la pareja de
cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 y (ii) una sonda marcada, en
donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero
y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7.
27. Kit según la reivindicación 26 que
comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen
secuencias que pueden ser amplificadas usando la pareja de
cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6.
28. Kit según la reivindicación 27, en donde el
ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago
\lambda.
29. Uso de un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 28 para la detección de Salmonella sp.
en una muestra.
30. Uso según la reivindicación 29, en donde la
muestra se selecciona del grupo que comprende una muestra
ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.
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| ES200801267A ES2327703B1 (es) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | Metodos y reactivos para la deteccion de salmonella sp. |
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| CN104673887A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-06-03 | 大连民族学院 | 生鲜果蔬食品中致病菌检测试剂盒及检测方法 |
| CN106047994A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-10-26 | 靳木子 | 沙门氏菌Southern印记杂交检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1233073A2 (en) * | 2001-01-17 | 2002-08-21 | Tosoh Corporation | Oligonucleotide for detecting salmonella and method of detecting salmonella |
| WO2004046375A2 (en) * | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Pharmacia Italia S.P.A. | Method for the detection of microorganisms in pharmaceutical products |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669989A1 (en) * | 1991-08-22 | 1995-09-06 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| JP2792462B2 (ja) | 1995-04-28 | 1998-09-03 | 株式会社島津製作所 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| US6060240A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
| US6617137B2 (en) * | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| ES2300174B1 (es) | 2006-01-27 | 2009-05-01 | Universidad Del Pais Vasco-Euskal-Herrico Unibertsitatea | Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1233073A2 (en) * | 2001-01-17 | 2002-08-21 | Tosoh Corporation | Oligonucleotide for detecting salmonella and method of detecting salmonella |
| WO2004046375A2 (en) * | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Pharmacia Italia S.P.A. | Method for the detection of microorganisms in pharmaceutical products |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ALVAREZ, J. et al. Development of a Multiplex PCR Technique for Detection and Epidemiological Typing of $\mathit{Salmonella}$ in Human Clinical Samples. Journal of Clinical Microbiology, Abril 2004. Vol. 42, No. 4 páginas 1734-1738. En particular, página 1734, columna 2. * |
| ALVAREZ, J. et al. Development of a Multiplex PCR Technique for Detection and Epidemiological Typing of Salmonella in Human Clinical Samples. Journal of Clinical Microbiology, Abril 2004. Vol. 42, No. 4 páginas 1734-1738. En particular, página 1734, columna 2. * |
| FIDELMA BOYD, E. et al. Comparative Genetics in the $\mathit{Inv}$-$\mathit{Spa}$ Invasion Gene Complex of $\mathit{Salmonella \ enterica}$. Journal of Bacteriology. Marzo 2007. Vol. 179, No. 6, páginas 1985-1991. En particular, página 1987 y figura 2. * |
| FIDELMA BOYD, E. et al. Comparative Genetics in the Inv-Spa Invasion Gene Complex of Salmonella enterica. Journal of Bacteriology. Marzo 2007. Vol. 179, No. 6, páginas 1985-1991. En particular, página 1987 y figura 2. * |
| GALÁN, J. E. et al. Molecular and Functional Characterization of the $\mathit{Salmonella}$ Invasion Gene $\mathit{InvA}$: Homology of $\mathit{InvA}$ to members of a New Protein Family. Journal of bacteriology, Julio 1992, Vol. 174, No. 13, páginas 4338-4339. En particular, figura 5. * |
| GALÁN, J. E. et al. Molecular and Functional Characterization of the Salmonella Invasion Gene InvA: Homology of InvA to members of a New Protein Family. Journal of bacteriology, Julio 1992, Vol. 174, No. 13, páginas 4338-4339. En particular, figura 5. * |
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